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Thèse de doctorat présentée par
Clémence RESTINO
En vue de l’obtention du grade de :
Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne
Spécialité : Microbiologie Industrielle
Soutenue publiquement le 5 décembre 2012 devant le jury :
Présidente : S. BOUQUILLON, Professeur – URCA, Reims
Rapporteurs : J. BOUDRANT, Directeur de Recherche – CNRS, Nancy
R. CACHON, Professeur – AgroSup, Dijon
Examinateur : A. BRESIN, Recherche et développement – ARD, Pomacle-Bazancourt
Directeur de thèse : F. DUCHIRON, Professeur – INRA/URCA, Reims
Production d’acide itaconique par des souches
d’Aspergilli par fermentation en milieu solide
Thèse de doctorat présentée par
Clémence RESTINO
En vue de l’obtention du grade de :
Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne
Spécialité : Microbiologie Industrielle
Soutenue publiquement le 5 décembre 2012 devant le jury :
Présidente : S. BOUQUILLON, Professeur – URCA, Reims
Rapporteurs : J. BOUDRANT, Directeur de Recherche – CNRS, Nancy
R. CACHON, Professeur – AgroSup, Dijon
Examinateur : A. BRESIN, Recherche et développement – ARD, Pomacle-Bazancourt
Directeur de thèse : F. DUCHIRON, Professeur – INRA/URCA, Reims
Production d’acide itaconique par des souches
d’Aspergilli par fermentation en milieu solide
Face à la roche, le ruisseau l’emporte toujours,
non pas par la force mais par la persévérance.
H. Jackson Brown
REMERCIEMENTS
Une telle expérience n’est réalisable que par le soutien physique et moral de
personnes que je tenais à remercier.
Je tiens à adresser tous mes remerciements à mon directeur de laboratoire
et directeur de thèse, Monsieur le Professeur Francis Duchiron, pour m’avoir
accueillie au sein de son laboratoire, pour m’avoir proposé un sujet si intéressant
et pour la confiance qu’il m’a accordée tout au long de ses trois années. Merci de
m’avoir fait découvrir la fermentation solide même si la production s’est avérée
plus difficile que prévue. Finalement, on apprend beaucoup avec peu de
bibliographie et en se heurtant aux difficultés. Je vous suis également très
reconnaissante de m’avoir autorisée à mener, en parallèle et en complément de
mon sujet de thèse, une étude de biologie moléculaire.
Je remercie sincèrement Madame le Professeur Sandrine Bouquillon,
coordinatrice du programme Pentoraf, pour avoir accepté de présider le jury. Je
tiens à vous remercier pour nos nombreuses discussions, vos conseils et vos
encouragements lors du grand sprint final (qui n’ont pas cessé, même après la
soutenance). Un grand merci pour le temps que vous m’avez consacré.
J’exprime toute ma gratitude à Monsieur le Directeur de Recherche Joseph
Boudrant (CNRS, Nancy), ainsi qu’à Monsieur le Professeur Rémy Cachon
(AgroSup, Dijon) pour avoir accepté de juger ce travail. Je vous remercie pour les
corrections apportées à ce manuscrit, pour la discussion que vous avez animée lors
de ma soutenance et pour le temps que vous m’avez gentiment accordé.
Je remercie également le Docteur Anthony Bresin (Société ARD, Pomacle-
Bazancourt) pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse en tant
qu’examinateur.
J’adresse tous mes remerciements au Conseil Général de la Marne pour
avoir financé ces travaux.
Je tiens à remercier Monsieur le Directeur de Recherche Bernard Kurek,
Directeur de l’UMR FARE 614, pour m’avoir acceptée au sein de son unité.
Je remercie chaleureusement Mesdames les Docteurs Parissa Alimardani-
Theuil et Angélique Gainvors-Claisse pour m’avoir aidée dans mes travaux de
biologie moléculaire sans rien attendre en retour. Vous avez renforcé, sans le
vouloir, ma passion pour la biologie moléculaire. Merci pour vos conseils, votre
soutien inconditionnel, votre bonne humeur, c’était « super ! » (Parissa, tu mettras
l’intonation qu’il faut, seule toi c’est le faire). Ce fut un plaisir d’apprendre à vos
côtés et de partager cette aventure (et d’autres entre 12h-14h !). Vous me manquez
déjà. Angélique, vous savez tout le bien que je pense de vous (professionnellement
et humainement) et je sais tout ce que je vous dois…
Je tiens à remercier les stagiaires qui m’ont aidée au cours de mes travaux
et que j’ai encadrés : Mélissa, Hanane, Ambre, Loïc, Marie (à 4 mains c’est plus
facile qu’à 2 surtout quand ça ne marche pas !) ou partagés : Timothée, Julien et
Dexu et celle que je n’ai pas encadrée directement mais qui a contribué à
l’avancement du projet de biomol : Florence (Garde ta bonne humeur, tout paraît
plus simple !).
Je remercie toutes les personnes qui, à leur manière, ont contribué à ce
travail. Merci à Mademoiselle Véronique Gaillet, Assistante Ingénieur, pour l’aide
apportée au cours de ces années. Merci aux différents laboratoires (Microbiologie
Générale et Moléculaire, Signalisation et Récepteurs Matriciels et Institut de
Chimie Moléculaire de Reims) qui m’ont permis de me servir de certains appareils
ou encore qui m’ont fourni gracieusement certains produits. Merci à Monsieur le
Docteur Dominique Harakat pour les analyses de spectrométrie de masse.
Bien qu’incapables de comprendre, merci à « mes » champignons,
Aspergillus itaconicus et Aspergillus terreus, qui m’ont appris la patience et la
ténacité.
Mes remerciements ne seraient pas complets si je ne citais pas celle par qui
mon « aventure scientifique » a commencé lors d’un stage de Master 1 :
Mademoiselle le Docteur Elise Lambert. Vous avez su me faire partager votre
passion pour la Recherche. Je vous remercie pour vos conseils et le soutien sans
faille que vous avez pu m’apporter depuis toutes ces années. Merci d’avoir cru en
moi !
Merci à mes « vieilles » amies du lycée Elodie et Manu, celles qui ont
toujours été présentes dans les bons et les mauvais moments, malgré la distance.
A Anthony, tu as su être, dans cette épreuve, ma certitude dans mes doutes,
mon rire dans mes larmes, ma force dans mes faiblesses, mon calme dans mes
tempêtes… merci d’être à mes côtés et de m’accepter telle que je suis.
Je n’oublie pas mes parents et ma famille qui ont soutenu chacun de mes
choix et notamment ma mère qui a partagé le bon et supporté le moins bon, depuis
ma première heure. Maman, que tu trouves ici la preuve de tout mon amour.
« L’amour maternel n’est point chose éphémère ; il ne trompe jamais, et jamais ne
finit. » Evariste Boulay-Paty
Une pensée pour mon oncle Michel…
Je clos cette aventure en dédiant cette thèse à mes grands-parents, et plus
particulièrement à ma grand–mère qui aurait voulu voir l’aboutissement de toutes
ces années. Je sais que vous étiez fiers de mes études mais la « richesse » des
personnes ne passent pas uniquement par un diplôme… moi aussi je suis fière de
vous.
RESUME
Depuis quelques années, un des défis de la Recherche est de valoriser les
co-produits agro-industriels. Une des voies permettant la valorisation de ces co-
produits est la fermentation en milieu solide.
Le but de ce travail est de produire de l’acide itaconique par des souches
d’Aspergilli (Aspergillus itaconicus et Aspergillus terreus) à partir de ressources
renouvelables. Le substrat choisi dans cette étude est le son de blé, coproduit
largement disponible en Champagne-Ardenne.
L’acide itaconique a été classé dans le TOP 12 des molécules plateformes par le
Department Of Energy Américain. Ces molécules plateformes peuvent être
produites à partir de biomasse ligno-cellulosique et peuvent être utilisées
à la place de molécules d’origine pétrochimique.
Dans notre étude, nous n’avons pas mis en évidence de production d’acide
itaconique par la souche Aspergillus terreus NRRL 1960 mais nous avons
observé, pour la première fois, la production d’acide fumarique par fermentation
en milieu solide. L’acide fumarique est tout aussi intéressant que l’acide
itaconique puisqu’il fait également partie du TOP 12 des molécules plateformes.
La production maximale obtenue est de 0,44 mg/g de matière sèche par
fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3, après
5 jours d’incubation à 30°C.
De plus, nous avons montré qu’Aspergillus itaconicus NRRL 161 est capable de
produire 6,77 mg d’acide itaconique/g de matière sèche par fermentation en
milieu solide sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à
400 g/L et à pH 3, après 4 jours d’incubation à 30°C.
Dans une dernière partie, nous avons mis en évidence, chez Aspergillus
itaconicus NRRL 161, la présence potentielle du gène codant pour la Cis-Aconitic
acid Decarboxylase, enzyme clé dans la production d’acide itaconique.
Mots clés : Acide itaconique, Acide fumarique, Aspergillus itaconicus,
Aspergillus terreus, Fermentation en milieu solide, Gène CAD1
ABSTRACT
Since a few years, one of research’s challenges is to valorise agro-industrial by-
products. One of the ways permitting the valorisation of these “wastes” is
solid-state fermentation.
The aim of this work is to produce itaconic acid with Aspergilli (Aspergillus
itaconicus and Aspergillus terreus) strains from renewable resources. The chosen
substrate in this study is wheat bran, by-product widely available in Champagne-
Ardenne.
Itaconic acid is classified among the TOP 12 of building blocks by the American
Department Of Energy. Building blocks can be produced from ligno-cellulosic
biomass and can be used instead of petrochemical-based molecules.
In our study, we have not highlighted itaconic acid production by Aspergillus
terreus NRRL 1960, but we have observed, for the first time, fumaric acid
production by solid state fermentation. Fumaric acid is as interesting as itaconic
acid since it also belongs to the TOP 12 of building blocks. Maximal production of
fumaric acid is 0.44 mg/g dry matter by solid-state fermentation on wheat bran
moistened at 70% and at pH 3, after 5 days of incubation at 30°C.
Furthermore, we have shown that Aspergillus itaconicus NRRL 161 is able to
produce 6.77 mg of itaconic acid/g dry matter by solid state fermentation on
wheat bran moistened at 60% with sucrose solution at 400 g/L and at pH 3, after
4 days of incubation at 30°C.
In a last part, we have highlighted, in Aspergillus itaconicus NRRL 161, the
potential presence of the Cis-Aconitic acid Decarboxylase encoding gene, key
enzyme in itaconic acid production.
Key words: Itaconic acid, Fumaric acid, Aspergillus itaconicus, Aspergillus
terreus, Solid-state fermentation, CAD1 gene.
SOMMAIRE
Liste des abréviations 1
Liste des figures 4
Liste des tableaux 7
INTRODUCTION GENERALE 8
SYNTHESE DES CONNAISSANCES 12
I. Les acides organiques 13
A. Généralités 13
B. Production non fermentaire 13
C. Production par fermentation 13 1. Production par fermentation en milieu liquide 13
2. Production par fermentation en milieu solide 14
a. L’acide citrique 14
b. L’acide lactique 15
c. L’acide gluconique 16
D. L’acide itaconique 17 1. Généralités 17
2. Historique 18
3. Méthodes de production 19
a. Synthèse chimique 19
b. Production biotechnologique 19
i. Micro-organismes utilisés 19 ii. Voie de biosynthèse et conditions de production 22 iii. L’enzyme Cis-Aconitic acid Decarboxylase 24
4. Applications 28
E. L’acide fumarique 28 1. Généralités 28
2. Historique 29
3. Méthodes de production 30
a. Synthèse chimique et conversion enzymatique 30
b. Production biotechnologique 30
i. Micro-organismes utilisés 30 ii. Voie de biosynthèse et conditions de production 31
4. Applications 32
II. La Fermentation en Milieu Solide 33
A. Définition 33
B. Origine et applications ancestrales 34
C. Historique européen 35
D. Organismes utilisés 36
E. Facteurs influençant la fermentation en milieu solide 37 1. Le type d’inoculum 37
2. L’humidité 37
3. La température 38
4. Le pH 39
5. L’aération et le brassage 40
6. L’oxygène et le dioxyde de carbone 40
7. Les facteurs nutritionnels 41
8. Les substrats 41
a. Généralités 41
b. Le son de blé 43
i. Généralités 43 ii. Rôle et propriétés 43
9. La taille des particules 44
F. Les équipements 45
1. Les équipements de laboratoire 45
2. Les équipements aux échelles pilote et industrielle 46
a. Le réacteur en couche profonde 46
b. Le réacteur à plateau 47
G. Applications 49 1. La production d’enzymes 49
2. La production de métabolites secondaires 51
3. La biorémédiation 51
H. Inconvénients et avantages de la fermentation en milieu solide 52
III. Les Aspergilli 52
A. Généralités 52
B. Reproduction 53
C. Caractéristiques 53
D. Applications 54
E. Aspergillus itaconicus 55
F. Aspergillus terreus 56
MATERIEL ET METHODES 59
I. Etude de la production d’acide organique par fermentation en milieu solide par des souches d’Aspergilli 60
A. Micro-organismes utilisés 60
B. Culture des souches 60 1. Milieux de culture 60
2. Ensemencement en conditions stériles et culture des souches 60
a. Milieux gélosés 60
b. Milieux liquides 61
C. Matières premières utilisées 61
D. Préparation des fermentations en milieu solide 61
E. Milieux de pré-humidification utilisés 62
F. Inoculation des fermentations en milieu solide 63 1. Inoculation par une suspension de conidies 63
2. Inoculation avec du mycélium 63
G. Extraction et analyse des fermentations en milieu solide 64 1. Mesure du taux d’humidité 64
2. Mesure de la matière totale et de la matière sèche 64
3. Extraction, mesure du pH et préparation des échantillons avant analyse 64
H. Détection et dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique 65 1. Dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique par Chromatographie Liquide
Haute Performance 65
2. Spectrométrie de masse 66
II. Recherche du gène codant pour la Cis-Aconitic acid Decarboxylase chez A. itaconicus NRRL 161 68
A. Micro-organismes et plasmide utilisés 68 1. Escherichia coli JM109® 68
2. Escherichia coli E. cloni 10G® 68
3. Le plasmide pGEM-4Z® 68
B. Milieux de culture, milieux de sélection et conditions de croissance des bactéries 69 1. Milieux de culture 69
2. Milieux de sélection 70
C. Extraction d’ADN génomique et plasmidique 70 1. Préparation du matériel biologique 70
2. Extraction d’ADNg d’A. itaconicus et A. terreus 71
3. Extraction d’ADN plasmidique (ADNpl) d’E. coli 72
D. Amplification d’ADN par réaction de polymérisation en chaîne et purification 72 1. Détermination des amorces à partir du gène CAD1 d’A. terreus 72
2. Conditions de « PCR » 74
3. Purification des produits de « PCR » 74
E. Analyse de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose 75
F. Analyse des ADN et construction de molécules recombinées 76 1. Coupure enzymatique de l’ADNg et de l’ADNpl par des endonucléases de restriction 76
2. Extraction d’un fragment d’ADN d’un gel d’agarose 76
3. Ligation des molécules d’ADN 77
a. Déphosphorylation des extrémités 5’phosphate de l’ADNpl 77
b. Précipitation alcoolique 77
c. Ligation 77
G. Hybridation ADN-ADN 78 1. Hybridation par la technique des tâches 78
a. Marquage et vérification du marquage des sondes 78
b. Préparation d’un ADN « Dot-Blotting » 78
2. Hybridation par la technique de « Southern-Blot » 79
H. Techniques de transformation 80 1. Transformation au CaCl2 80
a. Obtention de bactéries compétentes 80
b. Transformation par un plasmide 81
2. Transformation par électroporation 81
I. Séquençage de fragment d’ADN 81
RESULTATS et DISCUSSION 82
Première partie : Criblage de souches d’Aspergilli productrices d’acide itaconique et Production d’acide organique par fermentation en milieu solide par des souches d’Aspergilli 83
I. Criblage de souches d’Aspergilli productrices d’acide itaconique 84
II. Etude de la production d’acide fumarique par A. terreus NRRL 1960 par fermentation en milieu solide 89
A. Effet du pH initial et de la durée d’incubation sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide 89
B. Effet de l’ajout de milieux de production d’acide organique au son de blé sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide 92
C. Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en présence ou en absence de la souche A. terreus 95
III. Etude de la production d’acide itaconique par A. itaconicus NRRL 161 101
A. Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en présence ou en absence de la souche A. itaconicus 101
B. Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 105
C. Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 108
D. Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 109
E. Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 111
F. Effet du maintien du milieu à pH acide au cours d’une fermentation en milieu solide avec A. itaconicus 113
G. Effet de tampons et de solutions d’acide sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 115
H. Effet de la concentration de saccharose sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 118
I. Effet des sources de carbone sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 120
J. Effet des substrats sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 121
K. Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 121
L. Effet d’un inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide 124
Deuxième partie : Recherche du gène codant pour la Cis-Aconitic acid
Decarboxylase chez A. itaconicus NRRL 161 129
I. Amplification partielle du gène CAD1 chez A. terreus NRRL 1960 par « PCR » 130
II. Essais d’amplification de fragment du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus NRRL 161 par « PCR » 134
III. Mise en évidence du gène « CAD1 » chez A. itaconicus par utilisation de sondes d’A. terreus 135
A. Essais d’hybridation par « Dot-Blot » 135 B. Essais d’hybridation par « Southern-Blot » 136
IV. Construction d’une mini banque d’ADNg d’A. itaconicus 139
CONCLUSION GENERALE et PERSPECTIVES 143
BIBLIOGRAPHIE 143
ANNEXES 143
1
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNg : ADN génomique
ADNpl : ADN plasmidique
AF : Acide fumarique
AI : Acide itaconique
ARD : Agro-industrie Recherche et Développement
ARN : Acide RiboNucléique
BEt : Bromure d’Ethidium
CAD : Cis-Aconitic Acid Decarboxylase
CIAP : Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
CECT : Colleción Española De Cultivos Tipo
CSL : Corn Steep Liquor
°C : Degré Celsius
DIG : Digoxygénine
dNTP : désoxyNucléoside TriPhosphate
DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
dUTP : désoxyuracile triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
FARE : Fractionnement des Agro-Ressources et Environnement
FML : Fermentation en milieu liquide
FMS : Fermentation en milieu solide
g : gramme
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
IFO : Institue for Fermentation, Osaka
2
IPTG : IsoPropyl β-D-ThioGalactopyranoside
INRA : Institut National de la Recherche Agronomique
kb : kilobase
kV : kiloVolt
L : Litre
M : Marqueur de taille
M : Molaire
MH : Milieu de Harrold
M40Y : Malt 40 Yeast
µF : microFarraday
µg : microgramme
µL : microLitre
µM : microMolaire
mM : milliMolaire
mol : mole
Mb : Mégabase
MS : Matière Sèche
MT : Matière Totale
NBT/BCIP : NitroBlue Tetrazolium chloride / 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate
ng : Nanogramme
NRRL : Northern Regional Research Laboratory
NTG : N-Méthyl-N’-Nitro-N-Nitrosoguanidine
Ω : Ohm
pb : paire de base
PCR : Polymerase Chain Reaction
PDA : Potato Dextrose Agar
3
p/p : poids/poids
p/v : poids/volume
RNase : Ribonucléase
rpm : rotation par minute
TAE : Tris Acetate EDTA
TBE : Tris Borate EDTA
U : Unité
UV : Ultra Violet
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
4
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure chimique de l’acide itaconique ................................................................ 17
Figure 2 : Structure chimique de l’acide acrylique et méthacrylique ...................................... 17
Figure 3 : Voie de biosynthèse de l’acide itaconique .............................................................. 23
Figure 4 : Schéma représentant la localisation de l’aconitase, de la Cis-Aconitic acid Decarboxylase (CAD) et de l’acide itaconique ....................................................... 25
Figure 5 : Electrophorèse SDS-PAGE des préparations enzymatiques au cours des étapes de purification de la CAD ............................................................................................. 26
Figure 6 : Séquence nucléotidique du gène CAD1 codant pour la CAD et séquence protéique déduite ...................................................................................................................... 27
Figure 7 : Structure chimique de l’acide fumarique ................................................................ 29
Figure 8 : Réacteur colonne de laboratoire ............................................................................. 46
Figure 9 : Réacteur pilote en cuve profonde, INRA Dijon ..................................................... 47
Figure 10 : Fermenteur semi-pilote de type koji, Laboratoire de Microbiologie Industrielle de l’UFR Sciences de Reims ...................................................................................... 48
Figure 11 : Fermenteur industriel automatisé de type Koji, Société Fujiwara Japon.............. 48
Figure 12 : Schéma représentant la structure microscopique des Aspergilli ........................... 54
Figure 13 : Observations macroscopiques d’A. itaconicus, mycélium non sporulé (A), totalement sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C) ................... 56
Figure 14 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. itaconicus ...................... 56
Figure 15 : Observations macroscopiques d’A. terreus, mycélium non sporulé (A), en partie sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C) ..................................... 57
Figure 16 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. terreus ........................... 57
Figure 17 : Représentation schématique de l’inoculation et de l’analyse d’une fermentation en milieu solide .......................................................................................................... 67
Figure 18 : Carte de restriction du plasmide pGEM-4Z .......................................................... 69
Figure 19 : Position des amorces cad1, 2a, b et c sur le gène CAD1, décrit par Kanamasa et al. 2008 ............................................................................................ 73
5
Figure 20 : Marqueurs de taille 1 kb et 100 bp utilisés ........................................................... 75
Figure 21 : Schéma du montage permettant le transfert d’ADN à partir d’un gel d’agarose sur membrane de nylon chargée positivement ...................................................... 80
Figure 22 : Spectres de masse du standard d’acide fumarique (A) et de l’échantillon obtenu par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3 après 3 jours d’incubation à 30°C (B) ............................................................................... 88
Figure 23 : A. terreus sur son de blé acidifié ou non ............................................................... 89
Figure 24 : Effet du pH initial sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation .................. 90
Figure 25 : Effet du pH initial sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide ................................................................................ 91
Figure 26 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de blé sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation........................................... 92
Figure 27 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de blé sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide ..................................................................................................................... 93
Figure 28 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculés ou non par A. terreus .................................................................................................. 96
Figure 29 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence d’A. terreus ............................................................................................................ 97
Figure 30 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculé ou non par A. itaconicus ........................................................................................... 102
Figure 31 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence d’A. itaconicus ..................................................................................................... 103
Figure 32 : Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .............................................................................. 106
Figure 33 : Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide ........................................................................ 108
Figure 34 : Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .................................................. 110
Figure 35 : A. itaconicus cultivé sur différentes quantités de son de blé .............................. 111
Figure 36 : Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .................................................. 112
6
Figure 37 : A. itaconicus sur son de blé maintenu à pH acide .............................................. 113
Figure 38 : Effet du maintien du pH acide sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .................................................. 114
Figure 39 : A. itaconicus sur son de blé en présence de différents tampons et/ou de solutions d’acide ................................................................................................................. 116
Figure 40 : Effet de l’ajout de tampons et/ou d’acides sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .................................................. 117
Figure 41 : Effet de la concentration en saccharose sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide ...................................................... 119
Figure 42 : Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide ........................................................................ 122
Figure 43 : Effet de l’âge de l’inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide .................................................. 125
Figure 44 : Extraction d’ADNg d’A. terreus ......................................................................... 131
Figure 45 : Schéma représentant le gène codant pour la CAD ainsi que la localisation des fragments attendus après amplification par « PCR » chez A. terreus NRRL1960 ................................................................................. 131
Figure 46 : Amplification des fragments cad1, cad2a, cad2b et cad2c chez A. terreus NRRL 1960 ..................................................................................................................... 132
Figure 47 : Hybridation par « Dot-Blot » de la sonde cad1 (A) et cad2a (B) avec l’ADN génomique d’A. itaconicus .................................................................................. 135
Figure 48 : Hybridation par « Southern-Blot » de la sonde cad1 (B) et cad2b (D) avec l’ADN génomique d’A. itaconicus .................................................................................. 137
Figure 49 : Localisation schématique des sondes cad1 et cad2b et du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus après digestion par BamHI ou par EcoRI .................... 139
Figure 50 : ADNg d’A. itaconicus coupé par BamHI et localisation de la zone 6000-8000pb découpée .............................................................................................................. 140
Figure 51 : Profil de restriction des vecteurs recombinants contenant le fragment d’ADNg d’A. itaconicus codant potentiellement pour la CAD .......................................... 141
Figure 52 : Hybridation de la sonde cad2b marquée à la DIG avec l’ADNpl extrait des clones contenant potentiellement le gène codant pour la CAD chez A. itaconicus ........ 143
7
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Principaux acides organiques produits par fermentation liquide ......................... 14
Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique .................................. 18
Tableau 3 : Micro-organismes utilisés pour la production d’acide itaconique et les concentrations obtenues ........................................................................................ 20
Tableau 4 : Souches d’Aspergillus terreus utilisées pour la production d’acide itaconique .. 21
Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide fumarique ................................... 29
Tableau 6 : Souches de Rhizopus utilisées pour la production d’acide fumarique et les concentrations obtenues ........................................................................................ 31
Tableau 7 : Exemples d’aliments produits par fermentation en milieu solide ........................ 34
Tableau 8 : Exemple de micro-organismes utilisés en fermentation en milieu solide et leurs applications ............................................................................................................ 36
Tableau 9 : Exemples d’enzymes produites par fermentation en milieu solide ...................... 50
Tableau 10 : Exemples de molécules produites par différentes espèces d’Aspergilli ............. 55
Tableau 11 : Amorces utilisées pour les réactions d’amplification par « PCR » .................... 73
Tableau 12 : Production d’acide itaconique par différentes souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide en fonction du pH initial ..................................... 86
Tableau 13 : Taille approximative des inserts (pb) obtenus pour chaque clone ................... 142
8
INTRODUCTION GENERALE
9
D’hier à aujourd’hui
Dès l’Antiquité, l’idée d’un monde vivant invisible à l’œil nu a été émise par
Aristote.
Cette pensée fut reprise maintes fois mais aucune preuve ne fut apportée.
Dans les années 1670, Antony Van Leeuwenhoek, drapier néerlandais et chercheur
amateur, développa le premier microscope. Ainsi fut découvert le monde des
micro-organismes.
Méconnus jusqu’au XVIIème siècle, ces organismes sont pourtant la première forme
de vie apparue sur Terre, il y a environ 4 milliards d’années.
Principalement reliés aux maladies infectieuses telles que la tuberculose, le
choléra, la peste… Louis Pasteur montre, au milieu du XIXème siècle, le rôle de ces
êtres vivants dans la fermentation alcoolique. Ce terme faisait alors référence à un
procédé en milieu liquide. Suite à cette découverte, de nombreuses applications
industrielles et la construction de fermenteurs permettant la culture de
micro-organismes anaérobies ont vu le jour. Rapidement les industriels ont
découvert que les micro-organismes aérobies étaient capables de produire des
molécules d’intérêt. Les fermenteurs ont donc été adaptés à la culture de
micro-organismes aérobies et le terme de fermentation s’est alors étendu aux
processus faisant intervenir des micro-organismes aérobies ou anaérobies en
milieu liquide ou en milieu solide.
La fermentation en milieu solide correspond à la culture de micro-organismes sur
matrice solide servant de support et/ou de substrat en absence ou presque d’eau
libre.
La fermentation en milieu solide est utilisée, en Extrême-Orient, depuis des
millénaires notamment pour la production de saké et de tofu grâce à des souches
fongiques.
10
Longtemps délaissée au profit de la fermentation liquide, la fermentation solide
connait un regain d’intérêt depuis quelques années. Ce processus permet, en plus
du développement de produits alimentaires (pain, fromage), la production
d’enzymes, d’antibiotiques mais aussi d’acides organiques.
Depuis le XXème siècle, les recherches s’orientent vers le développement de la
technique de fermentation solide afin de produire ces métabolites. Parallèlement à
ceci, l’objectif des recherches est aussi de valoriser les co-produits agricoles qui
peuvent servir de substrat dans les fermentations solides. La région Champagne-
Ardenne est la deuxième région française productrice de céréales où le blé est la
céréale la plus cultivée. Ceci entraîne une quantité importante de co-produits pour
l’industrie qui peuvent, cependant, être valorisés par voie fermentaire. De plus, la
raréfaction des ressources pétrolières et le réchauffement climatique appuient
également la recherche et le développement d’alternatives à la pétrochimie.
En 2004, le Département de l’Energie Américain a établi un classement de douze
molécules dites « plateformes » (1,4-diacides (succinique, fumarique, malique) ;
acide 2,5-furane-dicarboxylique ; acide-3-hydroxy-propionique ; acide aspartique ;
acide glucarique ; acide glutamique ; acide itaconique ; acide lévulinique ;
3-hydroxybutyrolactone ; glycérol ; sorbitol ; xylitol/arabinitol) pouvant être
produites par voie fermentaire et ayant des applications dans l’industrie
chimique.
Dans ce contexte scientifique et dans le cadre du Contrat de Projets Etat-Région
2007-2013, le programme de recherche PENTORAF a été mis en place. Il a pour
objectif la valorisation non alimentaire de la biomasse afin de produire des
biomolécules, bioénergies et biomatériaux et ainsi maintenir l’évolution de
l’agriculture régionale.
L’objectif de ce travail de thèse est la production d’une molécule
plateforme tel que l’acide itaconique par fermentation. D’un point de vue
économique et environnemental, la technique de production utilisée est
11
la fermentation en milieu solide. Afin de valoriser la biomasse ligno-
cellulosique régionale, nous avons choisi comme principal substrat de
fermentation le son de blé, agro-ressource fortement disponible en
Champagne-Ardenne.
Dans la première partie des résultats, nous recherchons les souches
d’Aspergilli capables de produire de l’acide itaconique puis nous
présentons les travaux de mise en évidence et d’essais d’amélioration de
la production d’acide fumarique par Aspergillus terreus NRRL 1960.
Nous continuons par la présentation des essais de production d’acide
itaconique par fermentation en milieu solide par Aspergillus itaconicus
NRRL 161. Dans la seconde partie, nous présentons les travaux réalisés
sur la recherche du gène codant pour l’enzyme Cis-Aconitic Acid
Decarboxylase, enzyme clé dans la production d’acide itaconique, chez
Aspergillus itaconicus NRRL 161.
SYNTHESE DES CONNAISSANCES
13
I. Les acides organiques
A. Généralités
Les acides organiques ont été découverts par Scheele en 1784 (Tomic 2010). Ce sont des
composés chimiques de faibles poids moléculaires se caractérisant par la présence d’au moins
une fonction carboxylique (Plassard et Fransson 2009). Ces acides sont produits naturellement
par tous les organismes tels que les micro-organismes, les plantes, les animaux et les êtres
humains. Les acides organiques les plus courants sont les acides carboxyliques qui sont
principalement employés dans l’industrie alimentaire comme additifs alimentaires et sont
utilisés comme agent de conservation, acidulant ou antioxydant.
B. Production non fermentaire
La production industrielle des acides organiques a débuté avec la production d’acide citrique à
partir de citrons ainsi que la production d’acide malique à partir de pommes (Tomic 2010).
A la fin du XIXème siècle, des études portant sur les champignons filamenteux, et plus
particulièrement les Aspergilli, ont montré que ces micro-organismes étaient capables de
produire ces molécules. Avec cette découverte, les chercheurs et industriels se sont alors
tournés vers l’utilisation des micro-organismes tels que les champignons pour la production
d’acides organiques. Ces molécules sont vite devenues un domaine important d’étude pour
leurs diverses applications.
C. Production par fermentation
1. Production par fermentation en milieu liquide
La production, par fermentation, d’un acide organique dépend du micro-organisme utilisé
mais aussi de la régulation de paramètres physico-chimiques tels que l’oxygénation (procédé
aérobie ou non), la température, le pH et l’agitation/aération.
La production d’acides organiques est généralement réalisée par fermentation en milieu
liquide. La liste des principaux acides organiques produits par fermentation liquide ainsi que
les micro-organismes producteurs sont présentés dans le tableau 1.
14
Acide organique Micro-organisme
Acide acétique Acetobacter (b)
Acide citrique Aspergillus (m)
Acide fumarique Aspergillus
Acide gluconique Aspergillus
Acide itaconique Aspergillus
Acide lactique Rhizopus (m), Lactobacillus (b)
Acide malique Rhizopus
Acide oxalique Aspergillus
Acide succinique Aspergillus, Escherichia coli (b)
Tableau 1 : Principaux acides organiques produits par fermentation liquide (Magnuson et Lasure 2004) b : bactérie ; m : moisissure
2. Production par fermentation en milieu solide
Les acides organiques sont généralement produits par fermentation en milieu liquide (FML)
mais ils peuvent également être produits par fermentation en milieu solide (FMS).
Actuellement, les principaux acides organiques produits par FMS sont : l’acide citrique,
l’acide lactique et l’acide gluconique (Soccol 2008).
a. L’acide citrique
L’acide citrique (C6H8O7) est le principal acide organique produit et utilisé.
L’acide citrique est un intermédiaire du cycle de Krebs. Il est largement utilisé dans
l’alimentation, comme additif alimentaire, mais aussi dans la composition des détergents et
des cosmétiques (Krishna 2005). La production d’acide citrique par fermentation liquide à
l’échelle industrielle date de la fin du XIXème siècle. Depuis quelques années, les recherches
15
s’orientent vers une production d’acide citrique par FMS. Différents micro-organismes sont
utilisés mais Aspergillus niger reste le meilleur champignon producteur d’acide citrique
(Papagianni 2007).
L’acide citrique peut être produit à partir de canne à sucre, son de blé ou de riz ou encore de
grains de café, etc. Différents paramètres influencent cette production par Aspergillus niger.
En effet, la production d’acide citrique est fortement influencée par le type et la concentration
de la source de carbone. Cette source de carbone, principalement le saccharose, doit être
comprise entre 140 et 220 g/L. La source d’azote ne doit pas excéder 0,4 g/L. L’utilisation de
sels d’ammonium, comme le sulfate d’ammonium, est préférée pour la production d’acide
citrique. En effet, l’utilisation des ces sels comme source d’azote permet une diminution du
pH du milieu de fermentation qui est essentielle pour la production d’acide citrique. Celle-ci
est améliorée lorsque le pH est aux environ de 2. La température de fermentation est
généralement de 28 à 30°C et le meilleur taux d’humidité initiale est de 70%. Les métaux tels
que le cuivre, le zinc, le manganèse et le fer doivent être présents en faible quantité (Dhillon
et al. 2011). De plus, des chercheurs ont montré que l’ajout d’alcool (1 à 4% (v/p)), comme le
méthanol par exemple, est favorable à la production d’acide citrique. Il est important de noter
qu’une forte aération augmente la sporulation du champignon entrainant une diminution de
production d’acide citrique. Ainsi, il est nécessaire de maintenir le champignon à l’état de
mycélium (Soccol 2008).
Selon la souche sauvage d’Aspergillus niger utilisée et les conditions de fermentation, la
production d’acide citrique peut varier de 88 à 264 mg/g de matière sèche (Roukas 1999;
Vandenberghe et al. 2000). L’utilisation d’une souche d’Aspergillus niger mutée permet
d’obtenir 616,5 mg/g de matière totale (Rodrigues et al. 2009).
b. L’acide lactique
L’acide lactique (C3H6O3) est un acide organique très utilisé dans le domaine alimentaire et
pharmaceutique (Couto et Sanroman 2006). Depuis quelques années, il est utilisé dans la
fabrication de polymère biodégradable (« Poly Lactic Acid » ou PLA) (Magnuson et Lasure
2004). La production d’acide lactique est réalisée principalement par fermentation en milieu
liquide mais la production à grande échelle est limitée par le coût des matières premières
(Soccol 2008). Ainsi, l’utilisation de co-produits agro-industriels tels que l’extrait de jus de
16
datte pour la production d’acide lactique par fermentation liquide (Nancib et al. 2009) peut
être un moyen de diminuer ce coût de production. L’utilisation de co-produits solides, comme
la bagasse de canne à sucre ou la pulpe de manioc, semble également être une bonne
alternative pour la production d’acide lactique par la technique de fermentation en milieu
solide (FMS). Pour cela, des travaux de production de cet acide, par FMS, sont réalisés. Les
micro-organismes utilisés pour cette production peuvent être soit des bactéries telles que
Lactobacillus soit des champignons filamenteux comme Rhizopus. Le taux d’humidité initiale
joue un rôle important. En effet, l’augmentation du taux d’humidité initiale permet
d’augmenter la production d’acide lactique. De plus, en FMS, l’acidification du milieu au
cours de la fermentation entraîne une baisse de production de l’acide lactique, il est alors
nécessaire de maintenir le pH à 6 par ajout de soude. La température de production est
comprise entre 30°C et 37°C selon le micro-organisme utilisé. La production est également
influencée par la concentration en glucose qui doit être comprise entre 120 et 240 g/L (Soccol,
Marin et al. 1994). La production d’acide lactique est d’environ 500 mg/g de matière totale
quelque soit le type de micro-organisme utilisé (Rojan et al. 2005; Phrueksawan et al. 2012).
Cependant, Rhizopus a tendance à produire, en plus de l’acide lactique, de l’acide fumarique
et de l’éthanol (Magnuson et Lasure 2004). Ceci est un problème à contourner car la
production d’autres molécules entraîne une diminution de production d’acide lactique.
c. L’acide gluconique
L’acide gluconique (C6H12O7) est un acide organique utilisé dans l’industrie alimentaire et
pharmaceutique. De même que l’acide citrique et lactique, il est principalement produit par
fermentation en milieu liquide, par Aspergillus niger, mais il peut également être produit par
fermentation en milieu solide. Très peu d’études ont été publiées sur ce sujet. Cependant, des
travaux ont montré que la concentration en glucose est très importante dans le procédé de
production. En effet la concentration de glucose doit être comprise entre 120 et 200 g/L. Le
pH initial est de 7 mais diminue fortement au cours de la culture jusqu’à 1,5. La température
utilisée est comprise entre 25°C et 30°C. Au-delà, la concentration en acide gluconique
diminue (Ramachandran et al. 2006). Une forte humidité initiale (75%) permet d’améliorer la
production d’acide gluconique par rapport à une humidité initiale plus faible. Des études ont
montré une production d’acide gluconique de 490 mg/g de matière sèche. Cette production
17
augmente de 490 à 685 mg/g de matière sèche après ajout de 6% de méthanol (p/p) (Roukas
2000).
En 2004, le Département de l’Energie Américain a rédigé un rapport classant 12 molécules
différentes (parmi 300) appelées « building blocks » ou molécules « plateformes » qui ont une
forte valeur ajoutée et qui peuvent être produites à partir de ressource renouvelable.
Ces molécules « plateformes » sont définies comme des molécules élémentaires qui possèdent
le potentiel d’être transformées, par recombinaison chimique, en d’autres molécules plus
complexes et très utiles dans l’industrie des polymères. Parmi ces douze molécules, deux
acides organiques intéressants ont été listés : l’acide itaconique et l’acide fumarique (Werpy et
Petersen 2004).
D. L’acide itaconique
1. Généralités
L’acide itaconique est aussi nommé :
Acide méthylène butanedioïque
Acide méthylène succinique
Acide 2-méthylène-but-3-ènoïque
Acide propylène dicarboxylique
C’est un acide organique dicarboxylique insaturé de formule brute C5O4H6 (Figure 1),
cristallin blanc et de masse molaire 130,1 g/mol.
Il est considéré comme un acide acrylique ou méthacrylique substitué (Figure 2).
Actuellement, les acides acrylique et méthacrylique sont issus de la pétrochimie.
Figure 2 : Structure chimique de l’acide acrylique et méthacrylique
Figure 1 : Structure chimique de l’acide itaconique
Acide acrylique Acide méthacrylique
18
Les caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique sont listées dans le tableau 2.
Température de fusion 167-168°C
Température d’ébullition 268°C
Solubilité dans l’eau 83 g/L
Densité 1,632 (20°C)
pKa 3,84 et 5,55
Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique (Willke et Vorlop 2001)
Son insaturation lui confère un haut degré de polymérisation avec des applications très variées
que nous expliciterons ci-après.
En 2009, Okabe et al, précisent que 80 000 tonnes d’acide itaconique sont produits chaque
année à travers le monde avec un prix d’environ 2$ le kilogramme (Okabe et al. 2009). Le
prix a fluctué au cours du temps. Dans les années 1970, le prix du kilogramme était de 0,49$
(Willke et Vorlop 2001) pour atteindre 4,3$ en 2000 (Bressler et Braun 2000). Ce prix varie
en fonction du cours des matières destinées à sa fabrication, la principale étant le glucose. Le
prix du glucose étant indexé sur le prix des céréales qui a augmenté depuis 2009, le prix de
l’acide itaconique doit avoir augmenté également.
2. Historique
L’acide itaconique a été découvert, en 1837, par Baup comme produit de décomposition de
l’acide citrique (Baup 1837). En 1932, Kinoshita est le premier à décrire la production de cet
acide par une souche de champignon osmophile nommé Aspergillus itaconicus à partir de
glucose ou de saccharose (Kinoshita 1932). Quelques années après, Calam et al. (1939)
arrivent à produire de l’acide itaconique, en quantité plus importante, à partir d’une autre
souche fongique : Aspergillus terreus.
19
La première production d’acide itaconique par fermentation liquide à l’échelle industrielle a
débuté en 1955 (Okabe et al. 2009). La production d’acide itaconique a beaucoup été étudiée
jusque dans les années 1960 puis son intérêt a diminué pendant une quinzaine d’années,
comme le montre le peu de littérature sur le sujet. A partir des années 1980, l’acide itaconique
redevient attractif.
3. Méthodes de production
a. Synthèse chimique
La première méthode employée pour la production d’acide itaconique est la pyrolyse de
l’acide citrique puis l’hydrolyse des anhydrides (Baup 1837). Une seconde méthode a été
développée. Elle consiste en la décarboxylation de l’acide aconitique (Willke et Vorlop 2001).
D’autres méthodes chimiques ont été étudiées mais aucune n’a pu, jusqu’à présent, réellement
rivaliser avec la production d’acide itaconique par fermentation liquide (Okabe et al. 2009).
C’est pourquoi, aujourd’hui, aucune production commerciale n’est assurée par une synthèse
chimique.
b. Production biotechnologique
La production d’acide itaconique à l’échelle commerciale se fait par fermentation en milieu
liquide, majoritairement avec Aspergillus terreus mais d’autres micro-organismes peuvent
être employés.
i. Micro-organismes utilisés
Différents micro-organismes peuvent être utilisés pour la production d’acide itaconique
comme les levures ou encore les champignons filamenteux. Les souches utilisées et leur
production sont décrites dans le tableau 3
20
Micro-organisme Concentration d’acide
itaconique en g/L
Référence
LEVURES
Candida sp. 35 Okabe et al.
2009
Candida
(micro-organisme
muté)
42
Okabe et al.
2009
Pseudozyma
antarctica 16,7
Levinson et al.
2006
Rhodoturola 15 Okabe et al.
2009
CHAMPIGNONS
FILAMENTEUX
Ustilago zeae 15 Okabe et al.
2009
Ustilago maydis 53 Okabe et al.
2009
Aspergillus terreus
TN-484 82
Okabe et al.
2009
Aspergillus terreus
DSM 23081 90
Kuenz et al.
2012
Tableau 3 : Micro-organismes utilisés pour la production d’acide itaconique et les concentrations obtenues
Dans la littérature, le micro-organisme le plus étudié appartient à l’espèce Aspergillus terreus
(Willke et Vorlop 2001). A. terreus NRRL 1960 est la souche la plus particulièrement utilisée
(Larsen et Eimhjellen 1955; Gyamerah 1995). D’autres souches sauvages ou mutantes sont
également utilisées. Ces souches sont répertoriées dans le tableau 4.
21
Souche Référence
Aspergillus terreus NRRL 1960 (Eimhjellen et Larsen 1955; Pal 1964;
Kautola et al. 1985)
Aspergillus terreus NRRL 1961
(Welter 2000)
Aspergillus terreus NRRL 1963
Aspergillus terreus NRRL 1969
Aspergillus terreus NRRL 265
Aspergillus terreus NRRL 680
Aspergillus terreus IFO 6365 (Okabe et al. 1993)
Aspergillus terreus TN-484 (Yahiro et al. 1995)
Aspergillus terreus K26 (Kobayashi et Nakamura 1966)
Aspergillus terreus SKR 10 (Reddy et Singh 2002)
Aspergillus terreus G-026 (Horitsu et al. 1983)
Aspergillus terreus TKK 200-5-1 (Kautola et al. 1991)
Aspergillus terreus CECT 20365 (Vassilev et al. 2012)
Aspergillus terreus DSM 23081 (Kuenz et al. 2012)
Tableau 4 : Souches d’Aspergillus terreus utilisées pour la production d’acide itaconique
Il existe peu de littérature concernant l’amélioration de souches d’Aspergilli pour la
production d’acide itaconique, la plupart des travaux sont réalisées avec des souches
sauvages. Cependant, des chercheurs ont mis en évidence que la production d’acide
itaconique par la souche sauvage Aspergillus terreus IFO 6365 diminuait considérablement
dès que la concentration en acide itaconique dans le milieu atteignait un seuil de 20 g/L
22
(Yahiro et al. 1995). D’autres études ont mis en évidence que la production d’acide itaconique
inhibait la croissance d’Aspergillus terreus (Okabe et al. 2009). Ainsi, il semble nécessaire de
travailler avec une souche résistante à de fortes concentrations en acide itaconique. La souche
A. terreus IFO 6365 a donc été mutée par un traitement au NTG (N-Méthyl-N’-Nitro-N-
Nitrosoguanidine) et après culture sur gélose à l’acide itaconique, 670 colonies résistantes à
de haute concentration en acide itaconique ont été sélectionnées. Parmi ces colonies, une
souche nommée TN-484 s’est montrée très productive. La souche mutée TN-484 était,
jusqu’à présent, la meilleure productrice d’acide itaconique avec une concentration de 82 g/L
après 6 jours de culture en milieu liquide en présence de 160 g/L de glucose (Yahiro et al.
1995; Okabe et al. 2009) mais Kuenz et al. (2012) ont montré la production de 90 g/L par
fermentation en milieu liquide avec la souche sauvage DSM 23081 après 7 jours de culture en
présence de 180 g/L de glucose.
Il existe très peu de littérature concernant la production d’acide itaconique par A. itaconicus
(référencée NRRL 161 à l’Agricultural Research Service). Les premiers travaux ont été
réalisés en 1931 par Kinoshita. En 1961, Kinoshita et Tanaka dépose un brevet sur la
production d’acide itaconique par des souches d’A. itaconicus, cependant, il n’est pas précisé
si la souche A. itaconicus NRRL 161 est utilisée dans leur étude (Kinoshita et Tanaka 1961).
Il faudra attendre les travaux de thèse de Welter en 2000 pour que la souche A. itaconicus
NRRL 161 soit à nouveau testée en fermentation en milieu liquide.
ii. Voie de biosynthèse et conditions de production
Plusieurs voies de biosynthèse de l’acide itaconique ont été proposées.
Lors de la description de la production d’acide itaconique par Aspergillus itaconicus,
Kinoshita décrivait également sa voie de biosynthèse selon le schéma suivant :
Par la suite, des études ont permis de montrer que l’acide itaconique est produit par
dégradation du glucose via la glycolyse puis par la décarboxylation de l’acide aconitique
(Eimhjellen et Larsen 1955; Bentley et Thiessen 1957; Winskill 1983). Ceci est en accord
avec la voie de biosynthèse proposée par Kinoshita, présentée ci-dessus.
Glucide Acide itaconique Acide aconitique Acide citrique
23
Cependant, d’autres hypothèses ont été proposées concernant la voie de signalisation de
l’acide itaconique.
Shimi et Nour el Dein ont émis l’hypothèse que l’acide itaconique était produit par
décarboxylation du 1,2,3-tricarboxypropanoate, ce dernier étant formé à partir de succinate et
d’acétylCoA (Shimi et Nour El Dein 1962).
Nowakowska-Waszczuk (1973) a étudié l’effet d’intermédiaires du cycle de Krebs sur la
croissance d’Aspergillus terreus et sur la production de métabolites. D’après ses études, elle
conclut que la production d’acide itaconique ne se déroule probablement pas via le cycle de
Krebs mais plutôt par la déshydratation de l’acide citramalique.
Des études de marquage du glucose au 14C, réalisées par Bonnarme et al. (1995), ont permis
de montrer que l’acide itaconique ne dérivait ni du 1,2,3-tricarboxypropanoate ni de l’acide
citramalique. Les auteurs montrent clairement que la production d’acide itaconique se fait via
le cycle de Krebs. De plus, ils mettent en évidence que la dégradation du glucose se produit
via la glycolyse et que la voie des pentoses phosphates n’est pas impliquée. Le schéma de la
voie de signalisation est présenté dans la figure 3.
GLYCOLYSE
CYCLE DE KREBS
Figure 3 : Voie de biosynthèse de l’acide itaconique (Bonnarme et al. 1995)
24
La meilleure production d’acide itaconique Aspergillus terreus et par fermentation en milieu
liquide est obtenue en présence de 100 à 200 g/L de glucose (Magnuson et Lasure 2004),
ainsi que des taux adéquats de fer, cuivre et zinc et en conditions limitantes de phosphate
(Lockwood et Nelson 1946). La source de carbone préférée est le glucose ou le saccharose
(Magnuson et Lasure 2004). Cependant, d’autres sources peuvent être utilisées telles que la
mélasse de canne à sucre ou de betterave, et de l’amidon hydrolysé (Yahiro et al. 1997;
Petruccioli et al. 1999). Le pH initial doit être faible (3 à 5) et diminuer pendant la phase de
production aux alentours de 2 (Magnuson et Lasure 2004). Le procédé étant hautement
aérobie, il est donc nécessaire d’avoir un taux d’oxygénation élevé (Park et al. 1993; Willke et
Vorlop 2001).
Des essais d’immobilisation d’Aspergillus terreus ont été réalisés et les auteurs ont montré
une amélioration de la production d’acide itaconique (Kautola et al. 1985; Kautola et al.
1989; Kautola et al. 1991; Iqbal et Saeed 2005), qui reste, cependant, moins importante que
la production obtenue avec la souche A. terreus DSM 23081 (Kuenz et al. 2012).
iii. L’enzyme Cis-Aconitic acid Decarboxylase
En plus des conditions citées ci-dessus, la production d’acide itaconique requiert la synthèse
de protéines de novo et plus précisément de la Cis-Aconitic acid Decarboxylase ou CAD (EC
4.1.1.6), qui permet la décarboxylation de l’acide cis-aconitique pour former l’acide
itaconique (Bentley et Thiessen 1957). Les auteurs montrent également que la CAD,
provenant d’extrait brut, est instable et que la purification est donc difficile.
Des chercheurs se sont donc intéressés à la purification de cette enzyme ainsi qu’à ses
propriétés. Pal et Krishnan (1961) réussissent une purification partielle de cette enzyme et
mettent en évidence quelques caractéristiques. Ils montrent que la CAD est active à pH
inférieur à 5 et qu’à pH neutre, elle est inactivée. Les ions métaux tels que le zinc et le cuivre
inhibent complètement la CAD et son activité diminue d’environ 25% en présence des ions
cobalt, calcium, magnésium et manganèse. La température influence également l’activité de
l’enzyme. En effet, à 50°C la CAD perd 45% de son activité, 66% à 60°C et 90% à 70°C.
Quelques années plus tard, Pal (1964) améliore son processus de purification afin de séparer
la CAD et l’aconitase. Il montre que la CAD est très sensible aux méthodes de conservation
telles que la congélation et la lyophilisation.
25
Jaklitsch et al. (1991) s’intéressent à la localisation de cette enzyme (Figure 4). Ils mettent en
évidence que la production d’acide itaconique se fait via le cycle de Krebs en présence de la
CAD. D’après leurs résultats, ils montrent que la production d’acide itaconique se déroule
dans le cytosol. En effet, ils démontrent que l’aconitase est située dans la mitochondrie mais
que la CAD est uniquement cytosolique.
Selon leurs travaux, ils proposent le schéma suivant :
En 2002, l’équipe de Dwiarti réussit à améliorer le protocole de purification de la CAD et
obtient ainsi, après purification à homogénéité, une seule bande protéique en SDS-PAGE de
55 kDa (Figure 5).
Figure 4 : Schéma représentant la localisation de l’aconitase, de la Cis-Aconitic acid Decarboxylase (CAD) et de l’acide itaconique La partie grisée correspond au cytoplasme, la partie blanche correspond à la mitochondrie
26
Par comparaison entre deux souches d’Aspergillus terreus, l’une hyper-productrice et l’autre
non, les auteurs montrent que la production d’acide itaconique est dépendante de la présence
de la CAD. De plus, la production d’acide itaconique est reliée à l’activité de l’enzyme. Ainsi,
plus la CAD a une activité élevée, plus la production d’acide itaconique est importante
(Dwiarti et al. 2002).
L’activité optimale de la CAD est obtenue à pH 6,2 et à 45°C. En plus du zinc et du cuivre,
Dwiarti et al. montrent qu’elle est complètement inactivée par les ions mercure.
Les travaux suivants ont été consacrés à la recherche du gène codant pour la CAD. Pour cela,
les auteurs ont utilisé les souches d’Aspergillus terreus utilisées par Dwiarti et al (2002) pour
la purification de la CAD. Leur étude a permis de mettre en évidence le gène codant pour la
CAD, enzyme clé de la production d’acide itaconique. Le gène nommé CAD1 (accession
number AB 326105) est composé de deux exons et d’un intron. Il comporte 1529 pb codant
pour une protéine de 490 acides aminés. La séquence du gène ainsi que la séquence déduite
des acides aminés sont présentées dans la figure 6 (Kanamasa et al. 2008).
Figure 5 : Electrophorèse SDS-PAGE des préparations enzymatiques au cours des étapes de purification de la CAD (Dwiarti et al. 2002) M : Marqueur de masse molaire en kDa, a : solution enzymatique brute, b : fraction saturée en sulfate d’ammonium, c : dessalage, d : passage sur colonne de gel DEAE-toyopearl 650M, e : passage sur colonne de butyl toyopearl 650M, f : après ultrafiltration, g : CAD purifiée
27
Figure 6 : Séquence nucléotidique du gène CAD1 codant pour la CAD et séquence protéique déduite (Kanamasa et al. 2008)
Numéro des paires de base
Numéro des acides aminés
28
4. Applications
L’insaturation de l’acide itaconique lui confère un haut degré de polymérisation, donc une
utilisation très variée. En effet, la double liaison carbone-carbone est un site très réactif, riche
en électrons polarisables qui lui confère des propriétés nucléophiles. Sur cette double liaison
peut donc avoir lieu des réactions d’addition, ce qui est une propriété très recherchée dans
l’industrie des polymères. L’acide itaconique est donc utilisé dans ce type d’industrie où il est
employé comme co-monomère (1 à 5%) (Magnuson et Lasure 2004), mais aussi dans
l’industrie textile, dans les matières plastiques, les peintures, les adhésifs, le ciment (Werpy et
Petersen 2004). Il est aussi utilisé dans la fabrication de lentille de contact ou encore dans les
composites dentaires (Okabe et al. 2009).
Parallèlement à la production d’acide itaconique, Bonnarme et al. (1995) ont mis en évidence
la production d’acide fumarique, comme produit minoritaire, par fermentation en milieu
liquide par la souche Aspergillus terreus NRRL 1960. Tout comme l’acide itaconique, l’acide
fumarique est potentiellement intéressant (Werpy et Peterson 2004).
E. L’acide fumarique
1. Généralités
L’acide fumarique est aussi appelé :
Acide (2 E)-but-2-èn-1,4-dioïque
Acide trans-1,2-éthylènedicarboxylique
Tout comme l’acide itaconique, l’acide fumarique fait partie des 12 molécules « plateformes »
les plus importantes (Werpy et Peterson 2004). C’est un acide di-carboxylique insaturé de
formule brute C4O4H4 (Figure 7) et de masse molaire 116 g/mol.
29
Les caractéristiques physico-chimiques de l’acide fumarique sont listées dans le tableau 5.
Température de fusion 287°C
Température d’ébullition 200°C
Solubilité dans l’eau 7 g/L
Densité 1,63
pKa 3,03 et 4,44
Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide fumarique (Roa Engel et al. 2008)
De même que pour l’acide itaconique, l’insaturation de l’acide fumarique lui confère un haut
degré de polymérisation avec des applications très variées que nous détaillerons ci-après.
En 2007, le marché de l’acide fumarique représentait 90 000 tonnes par an (Roa Engel et al.
2008).
2. Historique
Initialement, l’acide fumarique est issu d’une plante appelée : Fumaria officinalis. L’acide
fumarique, intermédiaire du cycle de Krebs, est naturellement produit par les champignons. Il
est donc possible de le retrouver en petite quantité dans les produits de fermentation des
champignons.
Figure 7 : Structure chimique de l’acide fumarique
30
3. Méthodes de production
a. Synthèse chimique et conversion enzymatique
L’acide fumarique actuellement commercialisé est issu de l’isomérisation de l’acide maléique
qui dérive lui-même de l’anhydride maléique. Ce dernier est produit à partir de dérivé du
pétrole.
La réaction se déroule à haute température (90-100°C) et entraîne une diminution du
rendement attendu. Des chercheurs se sont donc tournés vers une conversion enzymatique de
l’acide maléique en acide fumarique par la maléate isomérase.
Cependant, l’augmentation constante du prix du pétrole pousse la communauté scientifique à
trouver des alternatives à l’utilisation des processus pétrochimiques pour faire face à la
demande des consommateurs, industriels ou politiques.
b. Production biotechnologique
La production d’acide fumarique par fermentation est connue depuis les années 1940.
Cependant, ce procédé a été délaissé au profit de la synthèse chimique. Aujourd’hui,
beaucoup d’études portent sur l’amélioration de la production d’acide fumarique par
fermentation en milieu liquide (Fu et al. 2010; Huang et al. 2010; Kang et al. 2010;
Roa Engel et al. 2011).
i. Micro-organismes utilisés
L’acide fumarique est produit majoritairement par Rhizopus et plus précisément R. oryzae. Le
tableau 6 présente les différentes souches de Rhizopus utilisées pour la production d’acide
fumarique ainsi que les concentrations obtenues.
31
Souche Production d’acide fumarique en g/L Productivité en g/L/h
Rhizopus nigricans 45 20 0,25
Rhizopus arrhizus
NRRL 2582 107 2
Rhizopus arrhizus
NRRL 1526 97,7 1,02
Rhizopus oryzae
ATCC 20344 92 4,25
Rhizopus formasa
MUCL 28422 21,3 0,89
Tableau 6 : Souches de Rhizopus utilisées pour la production d’acide fumarique et les concentrations obtenues (Roa Engel et al. 2008)
La meilleure espèce productrice n’est pas R. arrhizus mais R. oryzae, contrairement à ce que
nous pourrions penser à la lecture du tableau. En effet, il faut également prendre en compte la
productivité en g/L/h. Ainsi, la productivité de R. oryzae est de 4,25 g/L/h contrairement à
R. arrhizus qui n’est que de 2 g/L/h.
Des chercheurs ont montré qu’une souche d’Aspergillus terreus était capable de produire
2 g/L d’acide fumarique en présence de phosphate tricalcique (Akintokun et al. 2007). En
1999, Hofrichter et al. montrent, pour la première fois, la production d’acide fumarique par
FMS sur son de blé par l’espèce fongique Nematoloma frowardii (Hofrichter
et al. 1999).
ii. Voie de biosynthèse et conditions de production
La production d’acide fumarique se déroule via la glycolyse et le cycle de Krebs. L’acide
fumarique est produit à partir de l’acide succinique grâce à l’enzyme succinate
déshydrogénase. En général, le glucose est utilisé comme source de carbone mais d’autres
substrats peuvent être utilisés comme les déchets de pomme de terre (Zhang et al. 2007) ou la
32
paille de maïs (Xu et al. 2010). Le saccharose peut être utilisé mais il est faiblement
métabolisé par Rhizopus (Roa Engel et al. 2008). Le ratio carbone/azote est également très
important. En effet, il a été montré que la souche R. arrhizus NRRL 2582 nécessitait un ratio
initial de 200 afin d’obtenir un rendement élevé (Riscaldati et al. 2000).
L’acide fumarique étant produit à pH acide à neutre (5 à 7), il est donc nécessaire d’utiliser
des agents neutralisants pour éviter la variation de pH au cours du procédé (Roa Engel et al.
2008). Une étude réalisée par Oda et al. (2003) montre que la présence de carbonate de
calcium permet, non seulement, de maintenir le pH mais également d’améliorer la production
d’acide fumarique. D’autres agents ont été testés mais le carbonate de calcium reste le plus
efficace. La production d’acide fumarique peut être aussi améliorée par mutation de souche
aux UV et/ou un traitement au NTG (Fu et al. 2010; Huang et al. 2010).
Bien que Rhizopus soit un bon producteur d’acide fumarique par fermentation liquide, le
développement du champignon pose des problèmes techniques. Il a tendance à se développer
le long des parois et autour des hélices des systèmes d’agitation. Ceci entraîne des difficultés
d’oxygénation et donc une diminution du taux de production. Or, comme tout procédé aérobie
l’oxygénation est un paramètre important (Fu et al. 2010).
Pour contourner ce problème, la formation de petits pellets est préférée aux longs mycéliums.
Pour cela, une stratégie permettant de diminuer le pH initial (de 5 à 3) favorisant la formation
de petits pellets (inférieures à 1mm) a été développée. Ceci permet également d’éviter la
formation de sels de fumarate, formés en raison de la faible solubilité de l’acide fumarique
(Roa Engel et al. 2011).
Des essais d’immobilisation de Rhizopus sont testés afin de réduire les problèmes
d’oxygénation. Cette technique a permis d’améliorer la production d’acide fumarique
(Roa Engel et al. 2008).
4. Applications
L’acide fumarique est utilisé dans différents domaines tels que l’industrie alimentaire, la
médecine, l’alimentation du bétail. Son application la plus importante est la production
d’acide maléique et succinique. L’acide fumarique est aussi utilisé comme additif dans les
33
boissons et l’alimentation, il est le moins cher des additifs alimentaires (Goldberg et al. 2006).
Il est également employé dans la fabrication de résines et de matières plastiques.
L’acide fumarique incorporé à l’alimentation du bétail permet de réduire, jusqu’à 70%, les
émissions de méthane (Roa Engel et al. 2008). L’acide fumarique est employé dans le
domaine médical afin de traiter les personnes atteintes de psoriasis (Roa Engel et al. 2008).
Un des objectifs actuel de la Recherche est de produire les acides organiques par la technique
de fermentation en milieu solide.
II. La Fermentation en Milieu Solide
A. Définition
Initialement, la fermentation stricte est définie par Pasteur comme « la vie sans air ».
Dans ce contexte, le terme de fermentation s’applique aux réactions microbiennes en absence
d’oxygène se déroulant en milieu liquide. Suite à ces travaux, de nombreuses applications
industrielles ont été développées. Les industriels ont alors conçu des fermenteurs permettant
la culture de micro-organismes anaérobies. Rapidement, ils se sont aperçus que les
micro-organismes aérobies étaient également capables de produire des métabolites d’intérêt.
Ils ont donc modifié les fermenteurs afin d’y cultiver des micro-organismes aérobies. Ceci a
alors provoqué une dérive du sens « fermentation ». Ainsi, le terme de fermentation s’est
étendu aux processus microbiens à la fois aérobie ou anaérobie et en phase liquide ou solide
(Duchiron et Copinet 2011).
La Fermentation en Milieu Solide (FMS) est décrite comme un processus où les
micro-organismes sont cultivés sur une matrice solide, servant de support et/ou de substrat, en
absence ou presque d’eau libre (Pandey 2003). Cependant, la matrice doit contenir assez
d’eau pour permettre la croissance du micro-organisme. Le maximum d’humidité dépend de
la capacité d’absorption du substrat utilisé.
La FMS peut se dérouler, soit sur matrice naturelle servant directement de source de
nutriments (le plus souvent), soit sur matrice inerte imprégnée par un milieu liquide contenant
les nutriments nécessaires à la croissance de la souche utilisée (Krishna 2005).
34
B. Origine et applications ancestrales
La fermentation en milieu solide est très largement utilisée depuis des millénaires dans les
pays du Moyen-Orient. La première trace de l’utilisation de cette technique par l’Homme
remonte à 2600 avant Jésus-Christ pour la fabrication du pain en Egypte (Krishna 2005).
Dans les pays orientaux, les produits alimentaires, les enzymes et les métabolites sont produits
par FMS depuis des siècles. Un des exemples les plus connus où est employée cette technique
est le saké. En effet, la première étape de la préparation de cette boisson consiste à produire
des amylases par un champignon, Aspergillus oryzae, sur du riz cuit à la vapeur préalablement
étalé sur des claies en bambou (Duchiron et Copinet 2011).
Le tableau 7 décrit les principaux produits alimentaires obtenus par fermentation en milieu
solide dans les pays orientaux.
Produit Micro-organisme Substrat Application Origine
Miso
Aspergillus oryzae
ou
A. sojae
Soja Soupe, condiment Chine, Japon
Shoyu
Aspergillus oryzae
ou
A. sojae
Soja Soupe, condiment Extrême-Orient
Tome Koji Neurospora sitophila Riz ou soja Décoration alimentaire Japon
Tempeh Rhizopus oryzae Soja Friture Indonésie
Saké Aspergillus oryzae Riz Boisson Japon
Ontjom Neurospora sitophila Arachide Friture Indonésie
Tofu Actinomucor elegans Soja Fromage Chine
Tableau 7 : Exemples d’aliments produits par fermentation en milieu solide (Raimbault 1981; Duchiron et Copinet 2011)
35
Contrairement aux pays orientaux, dans les pays occidentaux, la fermentation en milieu solide
(FMS) doit rivaliser avec la facilité de la technique de fermentation en milieu liquide (FML).
Ainsi, la FMS est employée mais beaucoup moins développée que la FML.
C. Historique européen
La première production d’enzyme par fermentation en milieu solide date de 1896 par
Takamine (Duchiron et Copinet 2011). La période 1900-1940 voit l’apparition de la
production d’enzymes fongiques et microbiennes et des acides kojique, gluconique et citrique.
La période 1940-1960, appelée « l’Ere d’Or » (Krishna 2005), reflète l’explosion des
découvertes dans l’industrie de fermentation notamment pour la production d’antibiotiques
tels que la pénicilline et la transformation de stéroïdes.
Après la seconde Guerre Mondiale, la FMS est délaissée au profit de la fermentation en
milieu liquide à cause de la nécessité de production à grande échelle. Au cours des années
1960-1980, quelques études sont entreprises sur la production de mycotoxines par FMS mais
aucune avancée majeure n’a été développée. Les recherches des années 1980 sont orientées
vers la production de métabolites primaires et secondaires ainsi que le développement de
nouveaux fermenteurs solides.
Depuis la fin du XXème siècle, la FMS connaît un vif regain d’intérêt. Des bioprocessus tels
que la biorémédiation, la biodétoxification des déchets agro-industriels ainsi que la production
à grande échelle d’antibiotiques, d’enzymes, d’acides organiques et de biocarburant sont en
cours de développement (Couto et Sanroman 2006).
Parallèlement à ceci, la FMS est utilisée dans la production d’aliments tels que certains
fromages, comme entre autres le roquefort (Penicillium roquefortii), le camembert
(Penicillium camemberti), le brie (Penicillium caseicolum), mais aussi certains produits
charcutiers, comme le salami (Penicillium nalgiovensis) (Hölker et Lenz 2005), ou les
champignons de Paris (Agaricus bisporus) (Durand 1998).
36
D. Organismes utilisés
Les champignons, levures et bactéries peuvent être utilisés en FMS. Les bactéries sont
principalement utilisées dans le compostage, l’ensilage et les produits alimentaires. Les
levures sont employées dans la production de produits d’alimentation humaine et animale
(Tableau 8).
Micro-organisme Applications
BACTERIES
Bacillus sp. Compostage, production d’α-amylase
Clostridium sp. Ensilages, produits alimentaires
Lactobacillus sp. Ensilages, produits alimentaires
Pseudomonas sp. Compostage
Staphylococcus sp. Production d’inulinase
Streptococcus sp. Compostage
LEVURES
Saccharomyces cerevisiae Pain
Kluyverromyces marxiamus Production de composé aromatique et
d’enzyme
Tableau 8 : Exemple de micro-organismes utilisés en fermentation en milieu solide et leurs applications (Krishna 2005)
Les milieux solides sont l’habitat naturel des champignons, il est donc naturel que la FMS soit
mieux adaptée à leur culture par rapport aux micro-organismes unicellulaires (Durand 1998).
De part leurs propriétés biochimiques, enzymologiques et physiologiques, les champignons
permettent de produire des molécules très variées que nous détaillerons plus loin.
37
De plus, la croissance apicale des champignons permet une colonisation rapide du milieu
(Durand 1998).
Outre le choix du micro-organisme, il est nécessaire de prendre en compte les facteurs
physico-chimiques et environnementaux influençant la FMS, et d’essayer de les maintenir
tout au long du procédé.
E. Facteurs influençant la fermentation en milieu solide
1. Le type d’inoculum
Il existe deux types d’inoculum. L’inoculum sous forme de cellules végétatives (mycélium)
est obtenu après culture du champignon en milieu liquide. L’inoculum sous forme de spores
ou conidies est obtenu après « grattage » d’une culture fongique sporulée avec une solution de
Tween 80. Quelque soit la forme utilisée, l’inoculum est en solution ce qui permet, après
mélange, de le disperser dans le milieu de culture. Cependant, l’inoculum sous forme de
spores ou conidies est décrit, dans les procédés industriels, comme plus avantageux que
l’utilisation de cellules végétatives ou mycélium. En effet, l’utilisation de spores ou conidies
permet d’une part, une répartition plus homogène du micro-organisme au sein du milieu de
fermentation et d’autre part, une meilleure répétabilité de la production obtenue. Cependant,
l’utilisation de spores comme inoculum engendre un temps de latence plus long (Wolken et
al. 2003). En effet, les spores sont métaboliquement en dormance, la croissance fongique et
l’utilisation du substrat ne démarrera que lorsque l’équipement enzymatique nécessaire aura
été induit et synthétisé (Krishna 2005). De plus, il est préférable d’utiliser des cellules
végétatives pour certains micro-organismes qui sporulent peu ou pas du tout. Ceci est le cas
pour la souche Chaetomium cellulolyticum qui permet d’obtenir un contenu protéique plus
important grâce à la disponibilité immédiate des enzymes nécessaires (Abdullah et al. 1985).
2. L’humidité
De façon générale, le besoin en eau dépend du type de micro-organisme utilisé et de la
capacité de rétention d’eau du substrat solide. Ainsi, le taux d’humidité d’une fermentation
solide se situe dans une fourchette comprise entre 30 et 85% (Krishna 2005).
Il est nécessaire d’avoir une humidité suffisante pour la croissance du micro-organisme mais
elle ne doit pas être trop faible (inférieure à 30%) afin d’éviter tout problème de diffusion des
38
nutriments dû à un milieu trop sec. Au contraire, une humidité trop importante (supérieure à
85%) entraîne une agglomération des particules (milieu pâteux) ainsi qu’une limitation du
transfert gazeux. Les bactéries ont besoin d’un pourcentage d’humidité supérieur à 70% alors
que les champignons se développent à des humidités comprises entre 40 et 70%
(Rani Singhania et al. 2009). Le minimum d’humidité est de 12%, en-dessous de cette valeur
toute activité biologique cesse (Krishna 2005).
Le taux d’humidité va varier au cours de la FMS. La respiration, due au développement du
micro-organisme, entraîne une production d’eau qui va donc augmenter le taux d’humidité
dans le milieu selon l’équation :
Lors de cette réaction, seule 39,17% de l’énergie libérée par l’oxydation du glucose est
convertie en énergie métabolique (ATP), les 60,83% restants sont libérés sous forme de
chaleur qui s’accumule dans le milieu (Schlegel 1993).
L’augmentation de température ainsi que l’aération peut induire une diminution de la teneur
en humidité. Cette diminution ne doit pas être trop importante ou doit être compensée par un
apport hydrique pour pallier un ralentissement ou un arrêt du métabolisme cellulaire
(Duchiron et Copinet 2011).
Un des problèmes rencontrés dans le suivi de l’humidité pendant la FMS est l’absence de
sonde permettant de mesurer directement l’humidité dans le milieu de fermentation.
Le besoin en eau des micro-organismes est également défini en termes d’activité de l’eau
(activity water, aw). Elle est reliée à l’humidité relative (HR) suivant l’équation suivante :
aw = HR/100.
3. La température
La température est probablement l’un des paramètres les plus importants parmi les facteurs
physiques affectant la FMS. Cependant, le suivi de température est difficile à mettre en place
pour les cultures en erlenmeyer car la croissance du micro-organisme se fait en milieu clos et
il n’existe pas de sonde permettant de mesurer directement la température du milieu
contrairement aux fermenteurs solides.
6 H2O + 6 CO2 + 36 ATP Glucose (C6H1206) +6 O2 + 36 (ADP+Pi)
39
La température peut avoir une influence sur la croissance du micro-organisme mais également
sur la production d’enzyme et de métabolites qui peuvent être très sensibles aux variations de
température. Les champignons se développent, généralement, de 20 à 55°C (cette température
peut diminuer jusqu’à -18°C) mais la température optimale de croissance peut être différente
de celle de la production.
La régulation et le contrôle de la température sont très difficiles car la conductivité thermique
est très faible dans un milieu solide. Ceci est dû à un manque d’eau libre qui facilite le
transfert de chaleur. La combinaison humidité-espaces vides disponibles peut conduire à des
gradients thermiques. Le problème est aggravé en système à grande échelle car
l’accumulation de chaleur est encore plus importante avec une hauteur de couche beaucoup
plus élevée. L’augmentation peut atteindre 20°C de plus que la température d’incubation
(Pandey 2003). Ceci entraîne une diminution de l’humidité et donc une diminution de
l’activité fongique. L’augmentation de température peut induire une dénaturation des
protéines, une inhibition enzymatique ou encore l’arrêt de la croissance du mycélium
induisant la formation des conidies et l’arrêt de production de métabolites. Ceci peut être
intéressant si le but est de produire des conidies pour la lutte biologique, dans les autre cas
cette accumulation de chaleur est un frein à la production des molécules désirées. La clé du
problème est donc d’éliminer le surplus de chaleur. En fermenteur solide, la régulation
thermique est réalisée par un brassage « doux » du milieu afin de ne pas endommager le
mycélium. En combinaison ou parallèlement à ceci, le milieu peut être refroidi grâce au
passage d’un flux d’air humidifié et refroidi à travers le milieu (Duchiron et Copinet 2011).
Des études portent actuellement sur la conception de bioréacteur permettant l’élimination de
la chaleur métabolique produite au cours de la culture (Krishna 2005).
4. Le pH
Chaque micro-organisme a une gamme de pH propre à sa croissance et à son activité
métabolique. Les champignons sont capables de se développer à des pH compris entre 2 et 9,
avec un optimum entre 3 et 6, ce qui permet donc de débuter une FMS à un pH acide. Ceci
peut être un atout afin d’éviter la contamination bactérienne. En effet, un pH initial acide
augmente le temps de latence chez une grande partie des bactéries (excepté les bactéries
acidophiles) alors qu’il le réduit chez les champignons. La production de métabolites peut
faire varier le pH au cours d’une FMS. En règle générale, la production d’acides organiques
40
entraîne une acidification du milieu alors qu’une assimilation de ces molécules induit une
alcalinisation.
Le pH est également un paramètre difficile à maîtriser en FMS. Le contrôle est pratiquement
impossible en raison de l’hétérogénéité du milieu en absence d’homogénéisation et d’agitation
au cours de la FMS. Nous notons qu’il n’existe pas de sonde de pH directement utilisable en
milieu solide.
La variation du pH peut aussi être liée à la source d’azote utilisée. Le choix de cette dernière
est donc une voie possible pour le contrôle du pH.
5. L’aération et le brassage
L’aération a une influence significative en fermentation en milieu solide à cause de la
demande continue en oxygène nécessaire à la croissance fongique. L’aération est assurée par
un flux d’air qui permet, d’une part, d’apporter l’oxygène et, d’autre part, d’éliminer le
dioxyde de carbone, la chaleur ainsi que les composés volatiles produits par le développement
du champignon. Cependant, il est nécessaire d’humidifier le milieu car l’aération entraîne un
assèchement du substrat. Cet apport d’eau doit être réalisé de façon la plus homogène
possible. Ceci peut être assuré par une agitation du milieu qui facilite également le transfert de
masse et de chaleur (Krishna 2005).
Le brassage du milieu est un facteur très important en fermentation aérobie. Il faut qu’il soit
bien approprié pour éviter de fractionner le mycélium en morceaux trop petits et entraîner une
perte du contenu cytoplasmique provoquant la mort du champignon. Le brassage du milieu
sert également à « casser » les « chemins préférentiels » qui se créent dans le milieu de culture
lorsqu’il est aéré, permettant ainsi une meilleure répartition de l’air dans le milieu (Duchiron
et Copinet 2011).
6. L’oxygène et le dioxyde de carbone
Les gaz influencent le développement fongique ainsi que la production enzymatique.
Comme nous venons de le voir précédemment, l’aération et le brassage assurent l’apport
d’oxygène nécessaire au maintien des conditions aérobies et l’élimination du dioxyde de
carbone. La quantité en oxygène doit être suffisante pour ne pas limiter le développement des
champignons. La technique de fermentation en milieu solide facilite l’accès du
41
micro-organisme à l’oxygène (Krishna 2005) contrairement à la fermentation en milieu
liquide où le transfert d’oxygène est très souvent un facteur limitant.
La mesure de la consommation d’oxygène et de la production de dioxyde de carbone fournit
une réponse rapide sur le métabolisme du micro-organisme. Elle permet de calculer le
quotient respiratoire définit comme le ratio entre le dioxyde de carbone produit et l’oxygène
consommé (Bellon-Maurel et al. 2003). Le quotient respiratoire théorique des
micro-organismes aérobies est de 1, en dessous de cette valeur le transfert d’oxygène est
insuffisant et reflète un faible développement du micro-organisme (Krishna 2005).
7. Les facteurs nutritionnels
Le carbone sert à la fois de source d’énergie et de nutriments pour la croissance du
micro-organisme. La source de carbone peut être un glucide simple, comme le glucose, ou des
glucides complexes tels que la cellulose ou l’amidon. D’autres sources de carbone telles que
le saccharose, le lactose, le glycérol mais encore l’extrait de malt ou la cellobiose peuvent
également être utilisées (Couto et Sanroman 2006).
Les sources d’azote telles que le tartrate d’ammonium, le sulfate et le nitrate de sodium, les
peptones ainsi que les éléments incluant le sodium, le calcium, le cuivre, le fer, le zinc
stimulent la sporulation des champignons.
Dans un milieu de culture, la biomasse cellulaire représente en moyenne 40 à 50% de
carbone, 30 à 50% d’oxygène, 6 à 8% d’hydrogène et 3 à 12% d’azote. Dans tous les cas, les
pourcentages sont un ratio poids/poids.
Le ratio carbone/azote de la biomasse et celui du milieu sont reliés au rendement et à la
biomasse. En général, un ratio de 16 est favorable à la fermentation (Krishna 2005).
8. Les substrats
a. Généralités
Les substrats utilisés en fermentation en milieu solide peuvent être des supports inertes
imprégnés par un milieu de culture mais sont, le plus généralement, des matrices naturelles
hétérogènes issues de produits ou co-produits agro-industriels (Mitchell et al. 2006).
42
Les supports inertes sont soit des matériaux minéraux comme, par exemple, la perlite ou le
pouzzolane, soit des matériaux synthétiques de type mousse de polyuréthane (Durand 1998).
De tels supports permettent principalement l’étude de la croissance fongique. Leur utilisation
facilite la récupération du produit d’intérêt.
Les substrats naturels employés sont très variés. Sous nos latitudes, pulpe de betterave et son
de blé sont les principaux. Bagasse (résidus de tige de canne à sucre), tourteaux (résidus de
fruits ou de graines), pulpes de café, peau d’agrumes sont utilisés dans les pays du Sud
(Durand 1998). Les résidus agro-industriels sont considérés comme de très bons substrats
puisqu’ils fournissent les nutriments nécessaires pour la croissance. Tous les substrats naturels
solides ont une caractéristique commune : leur structure macromoléculaire de base est
composée d’un ou plusieurs des polymères suivants : amidon, cellulose, ligno-cellulose,
pectines, saccharose et autres polysaccharides. Cependant, ces substrats nécessitent une
préparation et/ou un prétraitement afin de transformer le substrat brut en substrat accessible
aux enzymes et utilisable par les micro-organismes. Ceci comprend un broyage, une
hydrolyse physique, chimique ou enzymatique afin d’augmenter la disponibilité du substrat,
l’apport de nutriments, le réglage du pH et de l’humidité ainsi qu’un traitement thermique afin
de pré-dégrader la structure moléculaire et d’éliminer les contaminants (Duchiron et Copinet
2011).
Cependant, durant la croissance mycélienne, les substrats naturels peuvent changer de
caractéristiques physiques et géométriques réduisant les transferts de masse et de chaleur. Cet
inconvénient n’est pas rencontré lors de l’utilisation de support inerte.
Le choix du substrat est influencé par sa disponibilité et son coût. Les résidus agro-industriels
sont des ressources renouvelables naturelles et abondantes donc largement disponibles pour la
fermentation en milieu solide et dont le coût est peu élevé.
Comme nous l’avons vu précédemment, les substrats de FMS peuvent être très variés. En
Champagne-Ardenne, le blé est une céréale abondante fournissant une importante quantité de
co-produits tels que le son de blé, facilement utilisable en FMS.
43
b. Le son de blé
i. Généralités
Le son de blé regroupe les couches les plus extérieures du blé.
Il est constitué de plusieurs couches fines :
Le péricarpe extérieur et intérieur
Le tégument
La couche hyaline et la couche d’aleurone
Le péricarpe est riche en fibres insolubles comme la cellulose, en lignine et acide férulique.
Le tégument contient principalement des alkylrésorcinols (lipide phénolique). La couche
d’aleurone est riche en minéraux et en vitamine B. Elle représente 7% de la masse sèche du
grain de blé (Antoine et al. 2002).
ii. Rôle et propriétés
Beaucoup de co-produits issus de l’agriculture remplacent les substrats synthétiques
généralement plus onéreux. Parmi ces résidus, le son de blé est un des substrats le plus
attractif. Il a pour avantage de permettre une bonne circulation de l’air, de ne pas présenter
d’agglomération des particules entre elles, de faciliter la pénétration du mycélium dans le
substrat et d’être bon marché. Aujourd’hui, le son de blé est utilisé en fermentation en milieu
solide pour la production d’enzymes, de métabolites secondaires et autres produits d’intérêt
biotechnologiques.
Le son de blé a une bonne capacité de rétention de l’eau pouvant aller jusqu’à 80% (Abdullah
et al. 1985). Ainsi, il est possible de travailler avec une humidité importante permettant une
bonne croissance des champignons.
Le son de blé contient de la cellulose (13%), l’amidon (15-25%) et du xylane (12,65%) qui
induisent une bonne production de cellulases, d’amylases et de xylanases, respectivement. Le
son de blé est un substrat potentiellement intéressant pour la production de biocarburant. Des
études actuelles portent sur la saccharification et la fermentation simultanée de son de blé qui
44
permet de convertir les complexes polysaccharidiques en réserve de sucre facilement
transformable en éthanol (Javed et al. 2012).
Le son de blé a également un rôle dans le domaine médical. Les antioxydants contenus dans
ce co-produit peuvent réduire les risques de maladies telles que : le cancer du colon, la
maladie de Parkinson, les maladies cardio-vasculaires. Les fibres du son de blé sont connues
pour diminuer le taux de cholestérol (Javed et al. 2012).
Il est aussi utilisé comme additif dans l’alimentation humaine pour l’apport de vitamine B.
Le son de blé peut aussi être utilisé dans l’alimentation animale. Il a été montré que l’ajout
quotidien de son de blé dans l’alimentation des vaches permet d’augmenter la production de
lait de 14,65 litres par jour. Cependant, pour être efficace, le son de blé doit être
préalablement « déphytisé » car les phytates sont d’importants facteurs antinutritionnels.
De part l’abondance mondiale de ce co-produit, ses propriétés et ses nombreuses applications
en fermentation mais aussi en médecine, le son de blé est considéré comme « l’or marron » du
XXIème siècle (Javed et al. 2012).
9. La taille des particules
La taille et la forme des particules déterminent l’espace vide qui est occupé par l’air
permettant l’oxygénation du micro-organisme. Il est donc nécessaire d’avoir une taille de
particules convenable, ni trop petite ni trop grosse. En effet, des particules trop petites
entraînent une agglomération du substrat diminuant la respiration microbienne et donc le
développement. Au contraire, le substrat n’est pas suffisamment accessible si les particules
sont trop grosses (Krishna 2005).
Pour réaliser une fermentation en milieu solide, il est nécessaire d’avoir des équipements
appropriés. Le développement de la FMS a ainsi entraîné le développement de fermenteurs
solides. Cependant, le choix d’un fermenteur est délicat puisqu’il faut tenir compte de la
granulométrie et de la capacité de rétention d’eau du substrat utilisé et de différents
paramètres liés à la croissance du micro-organisme tels que : l’agitation, l’aération, la chaleur,
etc.
45
F. Les équipements
Il existe deux types d’équipements de taille différente (Durand 2003) :
Les équipements de laboratoire (quelques grammes à quelques kilogrammes de
substrat)
Les équipements aux échelles pilote et industrielle (plusieurs kilogrammes à plusieurs
tonnes de substrats)
1. Les équipements de laboratoire
Les essais de production d’un métabolite par FMS sont, tout d’abord, réalisés à petite échelle
avant le passage à grande échelle. Le matériel utilisé le plus couramment en laboratoire est
l’erlenmeyer à col large (Duchiron et Copinet 2011) fermé par du coton cardé permettant les
échanges gazeux. Il n’y a pas d’aération ni d’agitation forcées mais c’est un bon outil pour la
mise au point des paramètres les plus favorables à une production.
En plus des erlenmeyers, il est possible de trouver des réacteurs-colonnes (Figure 8). Ils sont
constitués d’une colonne de verre contenant le substrat traversé par un flux d’air humide. Ceci
permet un apport d’oxygène, une élimination du dioxyde de carbone et de la chaleur ainsi
qu’une humidification du milieu limitant son dessèchement. La température est maintenue par
un bain-marie dans lequel sont disposées les colonnes. Ce système peut, éventuellement, être
relié à un système de mesure de l’oxygène consommé et du dioxyde de carbone libéré par
chromatographie en phase gazeuse.
Dans ce système, l’échantillonnage n’est pas possible, il faut sacrifier à chaque fois une
colonne entière pour chaque analyse durant le procédé. Cependant, grâce à ses avantages
(aération forcée, possibilité de mesurer le dioxyde de carbone, faible coût et simplicité
d’utilisation), c’est un bon dispositif pour l’amélioration des conditions de FMS (Durand
2003).
46
Des réacteurs à tambour peuvent également être utilisés mais le système d’agitation
permanent peut endommager les champignons filamenteux.
Les équipements aux échelles pilote et industrielle sont plus élaborés. Pour concevoir de tels
équipements, il est nécessaire de tenir compte de la morphologie du champignon (résistance à
l’agitation) et la nécessité d’avoir un système stérile ou non. Les problèmes majoritairement
rencontrés lors d’une augmentation d’échelle sont l’augmentation de température ainsi que
l’hétérogénéité du système (Durand 2003).
2. Les équipements aux échelles pilote et industrielle
a. Le réacteur en couche profonde
Les essais en réacteur pilote sont très importants puisqu’ils permettent de valider les essais
préliminaires réalisés à l’échelle laboratoire. Ainsi, le fermenteur pilote de l’INRA de Dijon,
représenté dans la figure 9, a été mis au point (Durand et Chereau 1988).
Ce réacteur en couche profonde se compose d’une cuve en acier rectangulaire et peut contenir
jusqu’à une tonne de substrat sur un mètre d’épaisseur. Il est équipé d’un dispositif d’air pulsé
et d’un système d’agitation. Ce dispositif est géré informatiquement grâce à des sondes de
température et de débit d’air. Ceci permet de suivre et de réguler les paramètres de la FMS.
Figure 8 : Réacteur colonne de laboratoire (Raimbault 1981)
47
b. Le réacteur à plateau
Ce système très ancien est le plus simple (Durand 2003). Il a été utilisé par Takamine pour la
première production industrielle d’enzymes en 1894. Il est constitué d’une enceinte dans
laquelle l’air circule au travers de plateaux avec une température et une humidité contrôlées. Il
contient un à plusieurs plateaux. En général, les plateaux, perforés en dessous, sont disposés
les uns au dessus des autres et sont séparés de 5 à 15 cm.
Au sein du Laboratoire de Microbiologie Industrielle de l’Université Reims Champagne-
Ardenne, nous disposons d’un fermenteur semi-pilote à plateau de type koji conçu par la
société Fujiwara au Japon présenté dans la figure 10 (Duchiron et Copinet 2011).
Ce fermenteur est composé d’une cuve cylindrique, placée dans une enceinte de fermentation,
pouvant contenir jusqu’à 20 kilogrammes de substrat préalablement stérilisé. Il comporte un
système d’agitation (hélices à ruban) et d’aération (passage d’air refroidi et humidifié par le
dessous de la cuve). L’armoire de contrôle indique les valeurs théoriques de la température, et
de l’humidité. Les mesures pratiques de ces paramètres se font après prélèvement direct dans
la cuve de fermentation.
Figure 9 : Réacteur pilote en cuve profonde, INRA Dijon (Durand et Chereau 1988) 1 : moteur de déplacement du chariot ; 2 : moteur d’agitation ; 3 : valve pour inoculation et injection d’eau ; 4 : sonde de température ; 5 : pesons ; 6 : sonde d’humidité relative ; 7 : refroidisseur ; 8 : humidificateur par injection de vapeur ; 9 : débitmètre d’air ; 10 : ventilateur ; 11 : chauffage de l’air ; 12 : filtre à air ; 13 : refroidisseurs de l’air
48
Il existe très peu d’informations sur les fermenteurs industriels, principalement fabriqués au
Japon par diverses sociétés dont la société Fujiwara qui est la seule à exporter ces appareils.
La documentation fournie par cette société permet de décrire ce matériel qui est présenté dans
la figure 11.
La fermentation s’effectue dans une cuve cylindrique pouvant atteindre 15 mètres de diamètre
et 2 mètres de haut. Le substrat est convoyé automatiquement dans la cuve de fermentation et
réparti en une couche de hauteur homogène. Ce système régule la température et l’humidité.
Il possède un dispositif d’agitation rotatif. Différents capteurs sont disposés sur l’ensemble du
réacteur afin de gérer le contrôle et la régulation de la FMS en continu (Labeille 1997).
Armoire de contrôle
Enceinte de fermentation
Figure 10 : Fermenteur semi-pilote de type koji, Laboratoire de Microbiologie Industrielle de l’UFR Sciences de Reims
Figure 11 : Fermenteur industriel automatisé de type Koji, Société Fujiwara Japon 1 : cuve de fermentation ; 2 : milieu de culture ; 3 : système d’agitation rotatif ; 4 : dispositif de chargement automatique ; 5 : air conditionné ; 6 : ventilateur soufflant ; 7 : conduit d’évacuation d’air ; 8 : humidificateur ; 9 : plaque chauffante ; 10 : entrée pour le produit à fermenter ; 11 : sortie pour le produit fermenté ; 12 : centre de contrôle
49
G. Applications
En plus de la production d’acides organiques présentée précédemment, la fermentation en
milieu solide permet de produire des enzymes mais aussi des métabolites secondaires de type
antibiotiques. Elle est également utilisée pour la production de biocarburant.
1. La production d’enzymes
La production d’enzyme a débuté à la fin du XIXème siècle avec la takadiastase par Takamine.
En 2007, le marché industriel des enzymes représentait 4 milliards $ par an (Fernandes 2010).
De plus, ce marché est sous-estimé car il existe une production pour un usage interne par
certains industriels.
Il existe quatre grands types d’enzymes :
Les enzymes dites techniques utilisées dans la papeterie et les détergents…
Les enzymes alimentaires utilisées dans les confiseries et les édulcorants…
Les enzymes utilisées dans l’alimentation animale (bétail et animaux de compagnie)
Les enzymes utilisées dans le domaine de la santé et de la recherche
La fermentation en milieu liquide est la technique préférée pour la production d’enzymes. Les
micro-organismes employés sont généralement des souches génétiquement modifiées.
Cependant, il y a un intérêt grandissant pour la production d’une large gamme d’enzymes par
fermentation en milieu solide (FMS) car la concentration est plus importante. La stabilité des
enzymes est aussi un autre avantage de la production par FMS. De plus, les co-produits agro-
industriels sont considérés comme les meilleurs substrats (Krishna 2005).
Les principales enzymes produites par fermentation en milieu solide sont présentées dans le
tableau 9.
50
Enzyme Micro-organisme Application Référence
Amylases Aspergillus ou Rhizopus Alimentation,
saccharification de
l’amidon
Fernandes 2010
Cellulases Trichoderma Ethanol de seconde
génération, alimentation
du bétail
Krishna 2005
Galactosidases Aspergillus oryzae ou
A. niger
Industrie alimentaire
Industrie pharmaceutique
Krishna 2005
Lipases Aspergillus niger,
Penicillium camembertii ou
Candida lipolytica
Détergents Krishna 2005
Ligninases Pleurotus ou
Phanerochaete
chrysosporium
Production de
biocarburant
Krishna 2005
Pectinases Aspergillus niger ou
Saccharomyces cerevisiae
Production de boissons Alimardani-Theuil
et al. 2011
Phytases Aspergillus niger ou
Bacillus subtilis
Alimentation des
animaux monogastriques
Fernandes 2010
Protéases Aspergillus oryzae, A. flavus
ou Bacillus subtilis
Alimentation, médecine Krishna 2005
Xylanases Aspergillus niger,
Trichoderma reesei ou
Thermomyces lanuginosus
Industrie papetière Krishna 2005
Tableau 9 : Exemples d’enzymes produites par fermentation en milieu solide
51
Des essais de production d’autres enzymes telles que les inulases, tannase, chitinase, etc. ont
été réalisés par fermentation en milieu solide.
De toutes les enzymes présentées dans le tableau 9, seules les galactosidases, pectinases,
phytases, protéases, et xylanases sont produites industriellement par FMS. Dans la production
à grande échelle, le coût de récupération peut atteindre 80% du prix total, il est donc
nécessaire de concentrer l’extrait au maximum afin de réduire le coût de la production d’une
enzyme pure.
2. La production de métabolites secondaires
La production de métabolites secondaires est principalement réalisée par fermentation en
milieu liquide, cependant, les recherches s’orientent vers la production de ces métabolites par
la technique de fermentation en milieu solide. Il est décrit que cette dernière permet de
diminuer le temps de culture, d’augmenter le rendement ou encore de réduire le coût de
production (Krishna 2005).
Parmi ces métabolites, nous trouvons l’acide gibbérellique qui est un facteur de croissance
chez les plantes mais aussi les alcaloïdes de l’ergot dont la demande est en constante
augmentation car ils sont largement utilisés dans le traitement des maladies comme l’angine
de poitrine, la migraine, l’hypertension ou encore le glaucome.
Les antibiotiques, les mycotoxines, telles que l’aflatoxine et l’ochratoxine, peuvent être
produits par fermentation en milieu solide.
Cette méthode est également employée pour la production de spores utilisées pour la
protection des plantes afin de diminuer l’utilisation de pesticides.
3. La biorémédiation
Ce domaine est actuellement en plein essor. L’élimination des métaux lourds est un défi
majeur pour la dépollution des eaux usées. La présence de cuivre et de plomb est dangereuse
pour la santé humaine. L’utilisation de co-produit industriel est un filtre naturel pour la
décontamination. La fermentation en milieu solide peut être une alternative moins coûteuse
que la dépollution classique par des résines synthétiques (Javed et al. 2012).
52
H. Inconvénients et avantages de la fermentation en milieu solide
Comme nous l’avons vu précédemment, divers problèmes peuvent être rencontrés au cours
d’une fermentation en milieu solide. Les principaux obstacles rencontrés sont : la faible
capacité à réguler les paramètres influençant la FMS, la forte hétérogénéité du milieu, le
passage à grande échelle, l’estimation de la biomasse (Hölker et Lenz 2005).
La fermentation en milieu liquide semble alors être plus facile à contrôler et donc à utiliser
(Mitchell et al. 2006).
Cependant, la FMS possède de nombreux avantages par rapport à la FML. Tout d’abord, elle
se prête bien à la croissance de champignons filamenteux puisqu’elle mime les conditions
naturelles de développement de ces micro-organismes. Le procédé se déroulant à de faibles
taux d’humidité, le risque de contamination par les bactéries et les levures est moins
important. De plus, un ensemencement important permet de contourner une éventuelle
contamination par d’autres champignons. Les conditions de stérilité ne sont donc pas aussi
strictes qu’en FML. La FMS permet d’utiliser beaucoup moins de liquide par rapport à la
FML ce qui permet de réduire le volume d’eau à traiter entraînant ainsi une diminution du
coût de production global. Il est également décrit que la FMS permet d’obtenir de meilleurs
rendements pour la production d’enzymes. Un des avantages majeurs de la FMS est la
valorisation des co-produits solides agro-industriels. Ceci est très important au niveau
environnemental et économique (Durand 1998). Comme nous l’avons vu précédemment, la
fermentation en milieu solide est bien adaptée à la culture de champignons filamenteux
(Durand 1998). Les Aspergilli peuvent donc être utilisés en fermentation solide. De plus, ces
moisissures sont capables de produire des acides organiques tels que l’acide itaconique.
III. Les Aspergilli
A. Généralités
Les Aspergilli ont été décrits pour la première fois par Micheli en 1729.
Le nom est dû à leur structure portant les spores ressemblant à l’aspergillum.
Ce sont des champignons filamenteux, ou moisissures, ubiquitaires (Bennett 2009). Ils
regroupent 180 espèces officiellement reconnues. Parmi les Aspergilli, Aspergillus nidulans,
niger, oryzae et fumigatus sont les plus étudiés. Ce dernier est le principal champignon
53
pathogène pour l’Homme. Aspergillus terreus est également étudié cliniquement car il
entraîne des aspergilloses invasives, généralement résistantes à l’amphotéricine B,
antibiotique essentiellement utilisé dans le traitement des infections fongiques (Ward et al.
2006).
B. Reproduction
Les Aspergilli peuvent se reproduire de façon sexuée et/ou asexuée, les deux reproductions
pouvant coexister.
Le mode de reproduction asexuée (forme anamorphe) est la première manière de dispersion
cellulaire par formation de conidies. Ceci permet également de protéger le génome des
conditions défavorables. Les conidies formées sont issues de la mitose.
Le mode de reproduction sexuée (forme téléomorphe) est assuré par la formation
d’ascospores qui contiennent les spores issues de la méiose.
Dans le cas où la reproduction sexuée est connue, les Aspergilli appartiennent à la classe des
Ascomycètes.
Dans le cas où aucune reproduction sexuée n’est connue, ces champignons sont classés dans
les Deutéromycètes ou Fungi imperfecti.
La classification et la nomenclature des Aspergilli varient selon leur mode de reproduction.
Dans notre étude, nous avons choisi de garder le nom Aspergillus pour les souches étudiées.
C. Caractéristiques
Les Aspergilli sont d’abord identifiés macroscopiquement grâce à leur mycélium plus ou
moins duveteux et de couleurs différentes. Le mycélium est formé d’hyphe, filament végétatif
fin et cloisonné.
Au cours du développement mycélien, certaines cellules de l’hyphe s’élargissent pour donner
naissance à une structure longue et large appelée le conidiophore, visible en microscopie
(Figure 12). Ce conidiophore, perpendiculaire à l’hyphe, forme un renflement à son extrémité
appelé vésicule. Celle-ci porte les phialides qui donnent naissance aux spores mitotiques
appelées conidies ou conidiospores.
54
Les phialides, cellules ayant pour fonction la production de spores, peuvent être séparées par
une rangée de métules. L’ensemble formé par la vésicule, les phialides (portées ou non par
des métules) ainsi que les conidies est nommé : tête conidienne ou tête aspergillaire (Figure
12).
Si la tête conidienne ne supporte que les phialides, elle est dite unisériée. Si elle supporte les
métules et phialides, elle est dite bisériée.
Les métules et/ou phialides peuvent être disposées soit tout autour soit sur le haut de la
vésicule. L’observation microscopique permet de distinguer les différentes espèces
d’Aspergilli.
D. Applications
Les Aspergilli sont utilisés dans différents domaines tels que : la production d’enzyme ou
encore la production d’acide organique. Le tableau 10 présente les différentes molécules
produites par les Aspergilli.
Figure 12 : Schéma représentant la structure microscopique des Aspergilli (Chabasse et al. 2002)
55
Micro-organisme Produit Référence
Aspergillus niger Acide citrique, interleukine 6, phytase Grimm et al. 2005 ;
Ward et al. 2006
Aspergillus awamori Glucoamylase, chymosine Grimm et al. 2005 ;
Ward et al. 2006
Aspergillus oryzae Protéase, xylanase Ward et al. 2006
Aspergillus terreus Acide gluconique, itaconique, lovastatine Lai et al. 2007 ;
Dowdells et al. 2010
Tableau 10 : Exemples de molécules produites par différentes espèces d’Aspergilli
E. Aspergillus itaconicus
La souche Aspergillus itaconicus (A. itaconicus) a initialement été isolée de jus de prunes
macérées (Kinoshita 1931). Kinoshita montre que cette espèce est osmophile, c'est-à-dire
qu’elle se développe sur des milieux ayant une forte teneur en glucide. Il met en évidence
qu’A. itaconicus supporte des concentrations en saccharose allant jusqu’à 450 g/L mais,
qu’au-delà de 400 g/L de saccharose, le taux d’acide itaconique produit diminue (Kinoshita
1932). Il est donc préférable de cultiver ce champignon sur un milieu contenant 400 g/L de
saccharose. Ceci est également montré par Lee et al. (1977) qui mettent en évidence que le
milieu M40Y ou milieu de Harrold, contenant 40% de saccharose, est le milieu le plus adapté
à la culture d’A. itaconicus.
A. itaconicus possède un mycélium cotonneux blanc, qui prend une couleur verte lors de la
sporulation, et un revers jaune d’or (Figure 13).
56
Par observation microscopique, un conidiophore lisse, incolore de 1,5 à 3 mm est observé.
A son extrémité, la vésicule porte tout autour une rangée de phialides de 7 à 9 µm de longueur
donnant naissance aux conidies rondes de 3 à 5 µm. L’ensemble vésicule, phialides et
conidies, formant la tête conidienne unisériée, mesure entre 0,3 et 0,6 mm de diamètre
(Kinoshita 1931; Lee et al. 1977). L’observation microscopique est présentée dans la figure
14.
F. Aspergillus terreus
Aspergillus terreus (A. terreus) se retrouve principalement dans le sol et plus particulièrement
dans les sols chauds et secs.
Figure 14 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. itaconicus
Tête conidienne
Conidiophore
X400
Conidies
Figure 13 : Observations macroscopiques d’A. itaconicus, mycélium non sporulé (A), totalement sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C)
CB
BA
A
57
A. terreus possède un mycélium poudreux blanc, qui prend une couleur cannelle lors de la
sporulation, et un revers orange foncé/marron (Figure 15).
Un conidiophore lisse, incolore de 0,1 à 0,25 mm est observé par microscopie optique.
A son extrémité, la vésicule porte, uniquement sur le haut, une rangée de métules de 5 à 7 mm
de longueur qui supporte une rangée de phialides, de 5,5 à 7,5 µm de longueur, donnant
naissance aux conidies elliptiques de 1,8 à 2,4 µm. L’ensemble vésicule, phialides et conidies,
formant la tête conidienne bisériée, mesure entre 0,15 et 0,5 mm de diamètre (Figure 16)
Figure 16 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. terreus
X400
Conidies
Tête conidienne
Conidiophore
Figure 15 : Observations macroscopiques d’A. terreus, mycélium non sporulé (A), en partie sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C)
B C A
58
En résumé, l’acide itaconique est un synthon largement utilisé dans l’industrie des
polymères. Il est considéré comme un substitut des acides acrylique et méthacrylique qui
sont issus de la pétrochimie. Actuellement, l’acide itaconique est principalement produit
par des souches d’Aspergilli par fermentation en milieu liquide. L’objectif principal de
ses travaux est de produire cet acide par fermentation en milieu solide. Cette technique a
pour avantage une économie en eau et en énergie ainsi que la valorisation des
co-produits agro-industriels, servant de source de carbone à la place de sucres purs.
Cette étude permettra également de déterminer si la fermentation en milieu solide peut
être concurrentielle par rapport à la fermentation en milieu liquide.
MATERIEL ET METHODES
60
I. Etude de la production d’acide organique par fermentation en milieu solide par
des souches d’Aspergilli
A. Micro-organismes utilisés
Dans cette étude, nous avons utilisé une souche de l’espèce Aspergillus itaconicus et sept
souches de l’espèce Aspergillus terreus.
La souche Aspergillus itaconicus (A. itaconicus) NRRL 161 et les souches Aspergillus terreus
(A. terreus) NRRL 265, 680, 1960, 1961, 1963 et 1969 ont été gracieusement fournies par le
Service de Recherche Agricole Américain (Agricultural Research Service, ARS).
La souche A. itaconicus a été isolée à partir de jus de prunes macérées tandis que les souches
A. terreus ont toutes été isolées à partir du sol de différents états américains.
B. Culture des souches
1. Milieux de culture
La souche A. itaconicus est cultivée sur milieu de Harrold (MH) aussi appelé M40Y. Le
milieu MH est composé de (pour 1 L) : saccharose 400 g ; extrait de malt : 20 g ; extrait de
levure : 5 g et agar : 20 g pour un milieu gélosé. Le milieu est autoclavé à 110°C pendant
30 minutes.
Les souches A. terreus sont cultivées sur milieu gélosé Potato Dextrose Agar (PDA) (Biokar
Diagnostic, France). Le milieu PDA est un milieu prêt à l’emploi à 39 g/L, composé (pour
1 L) d’extrait de pomme de terre : 4 g ; glucose : 20 g et agar 15 g. Le milieu est autoclavé à
121°C pendant 15 minutes.
2. Ensemencement en conditions stériles et culture des souches
a. Milieux gélosés
L’ensemencement des milieux gélosés, coulés en boîte de Pétri, se fait par dépôt de conidies
au centre de la gélose à l’aide d’une pipette Pasteur stérile.
Les géloses inoculées sont ensuite incubées à 30°C. Les souches sont conservées (sur gélose
MH ou PDA selon l’espèce d’Aspergillus) à 4°C et sont repiquées tous les mois.
61
b. Milieux liquides
Les inocula servant à l’ensemencement des milieux liquides sont issus de cultures sporulées
cultivées sur gélose. 10 mL d’eau osmosée stérile additionnée de 0,2% de Tween 80 (p/v)
stérile sont déposés en surface afin d’obtenir, après mélange par un râteau, une suspension de
conidies. Le milieu liquide est inoculé avec 5% de cette suspension. Pour ce type de culture,
un erlenmeyer à col étroit et à baffles est utilisé. Ces derniers permettent une meilleure
aération de la culture et un « cassage » du mycélium par agitation. Ceci évite la formation de
gros pellets de champignon. Les cultures en erlenmeyer sont incubées dans une étuve avec un
plateau agitant (Infors, Suisse) à 30°C et à 120 rpm.
C. Matières premières utilisées
Le son de blé est la matière première principalement utilisée dans cette étude. Il nous a été
gracieusement fourni par le groupe Soufflet (Nogent-sur-Seine, France).
La pulpe de betterave, fournie par la société ARD (Pomacle-Bazancourt, France) a servi à
l’étude de l’influence des substrats.
La composition de ces deux substrats est présentée dans les annexes 1 et 2.
D. Préparation des fermentations en milieu solide
Les fermentations en milieu solide sont réalisées dans des erlenmeyers de 500 mL à col large.
Préalablement, les erlenmeyers sont pesés avec leur bouchon de coton cardé. Dans chaque
erlenmeyer, 10 g de son de blé ou 25 g de pulpe de betterave de matière totale dont le taux
d’humidité initiale est de 9 à 11% et 7 à 7,5%, respectivement, sont introduits et pré-
humidifiés soit avec de l’eau osmosée soit avec une solution de saccharose (200 ou 400 g/L
(A. itaconicus)), soit avec des tampons, soit avec des milieux de production d’acide organique
décrits dans la littérature. Ces milieux sont présentés dans la partie suivante : « Milieux de
pré-humidification utilisés ». Les milieux sont homogénéisés à l’aide d’une spatule puis les
erlenmeyers sont bouchés avec du coton cardé, recouverts avec du papier aluminium et
autoclavés à 110°C pendant 30 minutes.
62
E. Milieux de pré-humidification utilisés
Nous avons utilisé, en plus de l’eau osmosée ou de la solution de saccharose, trois milieux
décrits pour la production d’acide organique pour pré-humidifier le substrat ainsi que des
tampons.
Milieu décrit par l’équipe d’Akintokun (2007) pour la production d’acide fumarique
composé de (pour 1 L) : glucose : 10 g ; (NH4)2SO4 : 0,5 g ; NaCl : 0,2 g ; MgSO4, 7H2O :
0,1 g ; KCl : 0,2 g ; extrait de levure : 0,5 g ; FeSO4, 7H2O : 0,2 g ; Ca3(PO4)2 : 3 g ;
MnSO4 : 0,2 g. Le milieu est ajusté à pH 7 avec une solution de soude à 0,5 M.
Milieu décrit par l’équipe de Dwiarti (2002) pour la production d’acide itaconique
composé de (pour 1 L) : glucose : 140 g ; « Corn Steep Liquor » : 2,1 g ; NH4NO3 : 2,9 g ;
MgSO4, 7H2O : 1,8 g. Le milieu est ajusté à pH 2 avec une solution d’acide nitrique à 1M.
Milieu décrit par l’équipe de Petruccioli (1999) pour la production d’acide itaconique
composé de (pour 1 L) : glucose : 60 g ; (NH4)2SO4 : 2,36 g ; KH2PO4 : 0,11 g ;
MgSO4, 7H2O : 2,1 g ; CaCl2, 2H2O : 0,13 g ; NaCl : 0,074 mg ; CuSO4, 5H2O : 0,2 mg ;
FeSO4, 7H2O : 5,5 mg ; MnCl2, 4H2O : 0,7 mg ; ZnSO4, 7H2O : 1,3 mg. Le milieu est
ajusté à pH 3,4 avec une solution d’acide nitrique à 1 M.
Tampon aconitate (50 Mm final) : acide aconitique : 0,5 M ; soude : 0,2 M. Le tampon est
préparé dans de l’eau osmosée et le pH est ajusté à 2,5. (Effet tampon de 2,5 à 5,7).
Tampon citrate (50 mM final) : acide citrique : 0,1 M ; citrate de sodium : 0,1 M. Le
tampon est préparé dans de l’eau osmosée et le pH est ajusté 3. (Effet tampon de 3 à 6,2).
Tampon citrate phosphate (50 mM final) : acide citrique : 0,1 M ; phosphate de sodium
dibasique : 0,2 M. Le tampon est préparé dans de l’eau osmosée et le pH est ajusté à 2,6.
(Effet tampon de 2,2 à 8).
Ces milieux sont autoclavés à 121°C pendant 15 minutes.
63
F. Inoculation des fermentations en milieu solide
1. Inoculation par une suspension de conidies
Selon le pH initial désiré, une solution d’acide nitrique (1 M), stérilisée par autoclave à 121°C
pendant 15 minutes, est ajoutée au milieu après autoclavage et avant inoculation avec le
champignon.
Une suspension de conidies est préparée dans les mêmes conditions que pour les milieux
liquides (cf. section Matériel et Méthodes paragraphe I. B. 2. B, page 61). La suspension de
conidies est récupérée dans un flacon stérile et un comptage sur microscope optique (Optical
Technology, France) à la cellule de Thoma est réalisé. Les milieux de fermentation en milieu
solide sont inoculés par 2.107 conidies par gramme de matière sèche.
Selon le taux d’humidité initiale désiré, ce taux peut-être adapté par ajout d’eau osmosée
stérile.
Les milieux de fermentation en milieu solide sont homogénéisés et incubés à 25, 30 ou 35°C
pendant différents temps compris entre 1 et 8 jours, selon la souche utilisée. Pour chaque
échantillon, un erlenmeyer est réalisé. Un témoin noté T0 est réalisé à chaque fermentation en
milieu solide afin de déterminer le taux d’humidité ainsi que la matière totale et sèche de
départ (cf. page 64). Ce témoin est inoculé et extrait immédiatement après ; il n’est pas
incubé.
2. Inoculation avec du mycélium
Les milieux de fermentation en milieu solide peuvent être inoculés avec du mycélium.
4 ml d’une culture fongique sont ajoutés au milieu de fermentation. De même que pour
l’inoculation avec une suspension de conidies, le pH est ajusté avec une solution d’acide
nitrique à 1 M ainsi que le taux d’humidité avec de l’eau osmosée stérile. Le tout est
homogénéisé stérilement à l’aide d’une spatule stérilisée puis incubé à 30°C pendant
différents temps compris entre 1 et 4 jours. Chaque erlenmeyer correspond à un prélèvement
et donc à une durée de fermentation. Un témoin noté T0 est également réalisé à chaque
fermentation en milieu solide afin de déterminer le taux d’humidité ainsi que la matière totale
et sèche de départ (cf. page 64). Ce témoin est inoculé et extrait immédiatement après ; il n’est
pas incubé.
64
G. Extraction et analyse des fermentations en milieu solide
Plusieurs paramètres sont mesurés pendant et à la suite d’une fermentation en milieu solide.
D’une part, la matière totale et la matière sèche sont déterminées afin de calculer la
production d’acide organique. La matière sèche permet également d’avoir des indications
concernant la consommation du substrat. D’autre part, l’humidité et le pH sont des paramètres
permettant l’amélioration de la croissance du champignon et/ou de la production de la
molécule recherchée.
1. Mesure du taux d’humidité
L’humidité est un paramètre qui renseigne sur le développement du champignon au cours de
la culture. En effet, au cours de sa croissance, le champignon produit six molécules d’eau
pour une molécule de glucose consommée. De plus, la mesure du taux d’humidité permet de
déterminer la matière sèche, nécessaire pour le calcul de la production d’acide organique.
L’humidité du milieu, non régulée au cours de la fermentation, est mesurée, en fin de culture,
grâce à une balance à halogène (modèle MB 45, Ohaus, France) qui chauffe 0,5 à 1g de
milieu de fermentation à 170°C jusqu’à dessiccation complète de l’échantillon. La mesure est
exprimée en % (p/p).
2. Mesure de la matière totale et de la matière sèche
En fermentation en milieu solide, l’unité de production d’une molécule étant le g/g de matière
sèche, il est donc nécessaire de déterminer la matière sèche (MS) du milieu. La MS se calcule
de la façon suivante :
La matière totale (MT) est calculée en soustrayant la masse de l’erlenmeyer avec son milieu
de culture et son bouchon de coton cardé en fin d’incubation à celle de l’erlenmeyer vide et de
son bouchon de coton cardé, avant la préparation du milieu de culture.
3. Extraction, mesure du pH et préparation des échantillons avant analyse
100 mL (pour le son de blé) ou 300 mL (pour la pulpe de betterave) d’eau osmosée sont
ajoutés à la totalité du milieu de fermentation puis le tout est mixé au « warring-blender »
MS (g) = [(100-taux d’humidité (%))]/100 x MT (g)
65
(model 8010EB HGBTWT, Waring commercial, France) pendant 1 minute. Le mélange est
récupéré dans un tube de 50 mL et son pH est mesuré. Le mélange est ensuite centrifugé
(modèle 5804R, Eppendorf®, France) pendant 10 minutes à 10 000 g pour éliminer le son de
blé et le mycélium. 2 mL de surnageant sont placés dans un microtube (Eppendorf®, France)
et centrifugés une seconde fois pendant 10 minutes à 10 000 g puis le second surnageant
obtenu est filtré sur membrane de cellulose (VWR, France) de porosité 0,2 µm avant analyse
par Chromatographie Liquide Haute Performance (« HPLC »).
H. Détection et dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique
Outre l’acide itaconique, l’acide fumarique est également un métabolite produit par
Aspergillus terreus (Bonnarme et al. 1995). Ces deux acides ont donc été recherchés dans les
milieux de fermentation.
1. Dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique par Chromatographie Liquide
Haute Performance
Le principe de la Chromatographie Liquide Haute Performance (« HPLC ») est le passage
d’un liquide (phase mobile) au travers d’une colonne (phase stationnaire), la phase liquide
étant soumise à une pression. L’appareil de chromatographie utilisée est le modèle LaChrom
Elite (Hitachi distribuée par VWR, France). Les conditions de dosage sont établies par
Bonnarme et al (1995). Une colonne Spherisorb ODS-2 C18 en phase inverse de 25 cm de
long, 4,6 mm de diamètre, 5 µm de taille des particules est utilisée dans notre étude. Le
solvant utilisé est l’acide phosphorique à 20 mM (pH 2). La détection se fait par UV à
210 nm.
La colonne est thermostatée à 30°C dans un four (Croco-cil, France) afin d’éviter la variation
du temps de rétention au cours des passages d’échantillon. Le débit est de 1 mL/minute.
L’injection des échantillons est réalisée automatiquement et la boucle d’injection est de
20 µL.
Afin de déterminer la concentration en acide itaconique et acide fumarique des échantillons,
nous avons réalisé une gamme d’étalonnage (de 0,01 à 0,25 g/L) exprimant l’aire du pic
obtenu en fonction de la concentration en acide itaconique ou en acide fumarique (g/L).
66
La production d’acide organique en mg/g de matière sèche est calculée de la façon suivante :
2. Spectrométrie de masse
L’analyse a été réalisée en collaboration avec le Dr D. Harakat, UMR CNRS 7312, URCA,
Reims.
Le principe de la spectrométrie de masse réside dans la détection et l’identification de la
structure chimique des molécules selon leur rapport masse/charge (m/z). Plusieurs sources
d’ionisation existent. Celle qui a été utilisée est l’ionisation par électronébulisation ou
« ElectroSpray Ionisation » (ESI) (Micromass, Manchester, Royaume-Uni).
Toutes les expériences de spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation ont été
réalisées en utilisant un quadripôle en tandem hybride/temps de vol (Q-TOF) équipé d’une
source d’ion (Micromass, Manchester, Royaume-Uni) à électronébulisation assistée
pneumatiquement (Z-spray) fonctionnant en mode négatif. L’azote (Azote U, ultra-pur à
99,995%, Air liquide, France) a été utilisé comme gaz de nébulisation et les échantillons ont
été introduits dans la source ESI à l’aide d’une aiguille à un débit de 5 µL/min. Les conditions
d’analyse ont été ajustées pour assurer des conditions douces d’ionisation.
L’ensemble de ces explications est récapitulé dans la figure 17.
Production d’acide organique (mg/g de matière sèche) =
Concentration en acide organique (g/L) x volume d’eau utilisée pour l’extraction (L) x 1000 MS (g)
67
Figure 17 : Représentation schématique de l’inoculation et de l’analyse d’une fermentation en milieu solide
68
II. Recherche du gène codant pour la Cis-Aconitic acid Decarboxylase chez
A. itaconicus NRRL 161
A. Micro-organismes et plasmide utilisés
1. Escherichia coli JM109®
La souche commerciale E. coli JM109® a été utilisée pour l’amplification plasmidique
(Promega, France). Cette souche est recommandée pour l’amplification des plasmides de la
série pGEM. Son génotype est le suivant : endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17 (rk- mk
+) relA1
supE44 Δ (lac-proAB) [F’, traD36, proAB, laqIqZΔM15].
2. Escherichia coli E. cloni 10G®
La souche commerciale de bactérie électrocompétente E. cloni 10G® a été utilisée dans les
expériences de clonage (Euromedex, France). Son génotype est le suivant : F- mcrA Δ (mrr-
hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ (ara, leu) 7697 galU
galK rpsL nupGλ tonA.
3. Le plasmide pGEM-4Z®
Le plasmide pGEM-4Z (Promega), présenté dans la figure 18, est utilisé comme vecteur de
clonage. Il dérive du plasmide pUC18. Sa taille est de 2746 pb, il possède le gène de
résistance à l’ampicilline ainsi que le gène lacZ, utilisé dans le criblage blanc/bleu.
Ce plasmide, possédant le gène de résistance à l’ampicilline, permet de sélectionner les
bactéries ayant été transformées par celui-ci sur un milieu contenant cet antibiotique.
De plus, la présence du gène lacZ permet d’effectuer un criblage par la méthode blanc/bleu.
Brièvement, le gène lacZ code pour une enzyme appelée β-galactosidase qui hydrolyse le
X-gal. Cette hydrolyse permet de libérer un composé donnant une couleur bleue aux colonies
bactériennes ayant reçu le plasmide. Si le gène lacZ est interrompu par l’insertion d’un
fragment d’ADN, induisant un décalage du cadre de lecture, la β-galactosidase n’est pas
active. Dans ce cas, le X-gal n’est plus hydrolysé par la β-galactosidase, les colonies sont
donc blanches.
69
B. Milieux de culture, milieux de sélection et conditions de croissance des bactéries
1. Milieux de culture
E. coli JM109® et E. coli E. cloni 10G® sont cultivées sur milieu complet Luria Bertani (LB)
composé de (pour 1 L) : tryptone : 10 g ; extrait de levure : 5 g ; NaCl : 10 g ± agar : 20 g.
La bactérie E. coli JM109® possède un épisome qui est maintenu par culture sur milieu
minimum M9.
Site Multiple de Clonage :
Figure 18 : Carte de restriction du plasmide pGEM-4Z
70
Le milieu minimum M9 se prépare de la façon suivante :
Préparer une solution 5 X concentrée composé de (pour 1 L) : Na2HPO4, 7H2O :
37,5 g ; KH2PO4 : 15 g ; NaCl : 2,5 g ; NH4Cl : 5 g. Ajuster le pH à 7,4 avec une
solution de soude et autoclaver à 121°C pendant 15 minutes.
Préparer séparément une solution de MgSO4 : 1 M ; glucose : 20% ; CaCl2 : 1 M et
thiamine-HCl : 1 M. Chaque solution est filtrée stérilement sur un filtre stérile
(membrane de cellulose) de porosité 0,2 µm.
Préparer 750 mL de bacto-agar 2% et autoclaver à 121°C pendant 15 minutes.
Après refroidissement de la préparation de bacto-agar, ajouter 200 mL de solution 5 X
concentrée, 2 mL deMgSO4 1 M, 20 mL de glucose 20%, 0,1 mL de CaCl2 1 M et
1 mL de Thiamine-HCl 1 M. Mélanger et couler stérilement les géloses.
2. Milieux de sélection
Après transformation, les bactéries sont cultivées sur milieu de sélection composé de milieu
gélosé LB additionnée d’ampicilline à une concentration finale de 50 µg/mL et de X-gal à une
concentration finale de 40 µg/mL. L’isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), à une
concentration finale de 40 µg/mL, est également ajouté dans le cas où nous utilisons la
bactérie JM109®.
Les bactéries sont incubées à 37°C, quelque soit le type de milieu.
C. Extraction d’ADN génomique et plasmidique
1. Préparation du matériel biologique
Les souches A. terreus NRRL 1960 et A. itaconicus NRRL 161 ont été utilisées pour les
études de biologie moléculaire. Pour extraire l’ADN génomique (ADNg) de ces champignons,
des cultures liquides sont réalisées.
A. terreus est cultivé dans le milieu de Petruccioli et al. (1999) et A. itaconicus est cultivé
dans le milieu de Harrold (Matériel et Méthodes, I. Etude de la production d’acide organique
par fermentation en milieu solide par des souches d’Aspergilli, page 60), pendant 24 heures à
30°C sous une agitation constante de 120 rpm.
71
Les milieux de culture sont filtrés sur verre frité afin de récupérer le mycélium de chaque
souche. Le mycélium est congelé à -80°C avant utilisation.
2. Extraction d’ADNg d’A. itaconicus et A. terreus
L’extraction d’ADNg est réalisée à l’aide du kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, France).
Le mycélium est congelé dans de l’azote liquide afin de le broyer à l’aide d’un mortier et d’un
pilon. 100 mg de la « poudre » obtenue est utilisée pour l’extraction d’ADNg.
Le broyage cellulaire est réalisé de deux façons différentes :
A ces 100 mg de champignon, sont ajoutés 500 µL de tampon AP1 (contenant un
détergent), préalablement chauffé à 65°C et 4 µL de RNase A à 100 mg/mL, afin
d’éliminer les ARNs. Le mélange est agité vigoureusement et incubé à 65°C, le temps
a été allongé à 30 minutes afin d’améliorer l’extraction d’ADNg. Le tout est mélangé
de temps en temps pendant l’incubation.
Parallèlement à ceci, une autre méthode de broyage des cellules est également utilisée.
Pour cela, des billes de verre sont ajoutées au mélange mycélium - tampon AP1. Le
mélange est agité pendant 30 secondes, puis 4 µL de RNAse A sont ajoutés. Le
mélange est agité par retournement.
Après broyage, 130 µL de tampon AP2 sont ajoutés au lysat cellulaire, le tout est mélangé et
incubé pendant 5 minutes dans la glace afin de précipiter les détergents, protéines et
polysaccharides. Le lysat est centrifugé à 20 000 g pendant 5 minutes puis le lysat est déposé
sur une colonne « mini spin » placée sur un tube collecteur. Une centrifugation à 20 000 g
pendant 2 minutes est réalisée. Le filtrat est transféré dans un nouveau tube et 1,5 volume de
tampon AP3 sont ajoutés. 650 µL de ce mélange sont pipetés et déposés sur une colonne
« mini spin », placée sur un tube collecteur. Une centrifugation à 6000 g minimum pendant
1 minute est réalisée. Le filtrat est éliminé et l’étape précédente est répétée.
500 µL de tampon AW sont ajoutés. Le tout est centrifugé à 6000 g minimum pendant
1 minute. La colonne est placée sur un tube et 100 µL de tampon AE sont ajoutés. Le mélange
est incubé à température ambiante pendant 5 minutes. L’ADN est élué par centrifugation à
6000 g minimum pendant 1 minute. L’étape d’élution est répétée avec 50 µL.
72
L’ADNg (150 µL) est conservé à -20°C.
3. Extraction d’ADN plasmidique (ADNpl) d’E. coli
Après culture bactérienne dans 3 mL de LB additionné d’ampicilline à une concentration
finale de 50 µg/mL pendant une nuit à 37°C et sous agitation constante de 150 rpm, la
suspension est centrifugée à 12 000 g pendant 1 minute. Le surnageant est éliminé. 400 µL de
tampon STET (Saccharose : 8% ; Triton X100 : 5% ; EDTA pH 8,5 : 50 mM ;
Tris-HCl pH 8 : 50 mM) et 25 µL d’une solution de lysozyme à 10 mg/mL sont ajoutés. Le
mélange est agité puis laissé au repos à température ambiante pendant 5 minutes minimum
jusqu’à ce que la préparation devienne visqueuse. Les tubes sont plongés dans l’eau bouillante
pendant 1 minute. Le mélange est centrifugé immédiatement à 12 000 g pendant 10 minutes.
A l’aide d’un cure-dent, les culots visqueux sont éliminés. Le volume de surnageant récupéré
est mesuré et le volume est ajusté à 400 µL avec du TE (Tris-HCl : 10 mM ; EDTA : 1 mM
pH 8). 1/10ème d’acétate de sodium 3 M pH 5,2 et 1 volume d’isopropanol froid par culot sont
ajoutés. Le mélange est placé dans la glace pendant 15 minutes minimum, puis centrifugé à
12 000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est éliminé. 500 µL d’éthanol 70% par culot sont
ajoutés. Une centrifugation à 12 000 g pendant 10 minutes est réalisée. Le tube est retourné
sur un papier absorbant. Les culots obtenus sont séchés à l’air libre pendant quelques minutes
afin que l’alcool soit totalement évaporé. Les culots sont repris dans 150 µL de TE.
L’ADNpl est conservé à -20°C.
D. Amplification d’ADN par réaction de polymérisation en chaîne et purification
1. Détermination des amorces à partir du gène CAD1 d’A. terreus
A partir de la séquence du gène codant pour la CAD chez A. terreus publiée par l’équipe de
Kanamasa (2008), nous avons dessiné des amorces qui seront utilisées pour l’amplification
d’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (ou « PCR »).
73
Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 11.
Nom de
l’amorce Séquence (5’-3’) Localisation Tm (°C)
Nom de
l’amplicon
et taille
attendue
(pb)
cad1 F ACAATCTGCGGACAGCAA 9-26 54 cad1 :
229 cad1 R ATATCCAATCACCCTGCA 220-237 52
cad2a F TGCAGCAGCCATGACCA 314-330 54 cad2a :
310 cad2a R AGTTAGACCGAGGAGCTT 606-623 54
cad2b F AAGCTCCTCGGTCTAACT 606-623 54 cad2b :
607 cad2b R AAACTTCTGGCCTCTCCA 1195-1212 54
cad2c F AGTCACTGTGGATGGATA 1059-1076 52 cad2c :
457 cad2c R ATTTCACGGGGCAATTCA 1498-1515 52
Tableau 11 : Amorces utilisées pour les réactions d’amplification par « PCR » F : Forward et R : Reverse
Ces amorces ont été synthétisées par la société Eurogentec et leur localisation sur le gène
CAD1 est présentée dans la figure 19.
Figure 19 : Position des amorces cad1, 2a, b et c sur le gène CAD1, décrit
par Kanamasa et al. 2008
74
2. Conditions de « PCR »
A 50 ng de matrice (ADNg) sont ajoutés les amorces forward et reverse à une concentration
finale de 0,1 µM chacune, les dNTP à 200 µM, le MgCl2 à 1,5 mM, le tampon de réaction à
1 X et 2 U de Taq polymérase. Pour l’amplification du fragment cad1, nous doublons la
concentration finale de chaque amorce, soit 0,2 µM. Un témoin négatif est réalisé pour chaque
« PCR » dans lequel l’ADNg est remplacé par de l’eau.
La « PCR » se déroule dans un thermocycleur (Thermocycleur Gradient, Eppendorf®, France)
et comprend trois étapes : dénaturation (95°C), hybridation (température à déterminer selon
les amorces) et élongation (72°C). Le nombre de cycles et la température d’hybridation (Tm)
sont spécifiques à chaque cas d’amplification.
Les conditions de « PCR » pour les fragments cad1, 2a, b et c sont les suivantes :
cad1 : 95°C-5 minutes / (95°C-30 secondes/50°C-30 secondes/72°C-1 minute) répété
4 fois et (95°C-30 secondes/52°C-30 secondes/72°C-1 minute) répété 30 fois / 72°C-
2 minutes
cad2a, b et c : 95°C-5 minutes / (95°C-30 secondes/52°C-30 secondes/72°C-1 minute)
répété 30 fois / 72°C-2 minutes
3. Purification des produits de « PCR »
Les produits de « PCR » sont purifiés grâce au kit « EZ-10 Spin Column PCR Products
Purification BS 363» (Bio Basic Inc., distribué par Euromedex, France). A 1 volume de
produit de « PCR » sont ajoutés 3 volumes de tampon de liaison. Le mélange est transféré sur
une colonne et incubé pendant 2 minutes afin de fixer l’ADN à la membrane. Une
centrifugation à 12 000 g pendant 2 minutes est réalisée puis le surnageant est éliminé.
750 µL d’une solution de lavage sont ajoutés et le tout est centrifugé à 12 000 g pendant 2
minutes. L’étape est répétée une seconde fois. La colonne est transférée sur un nouveau tube
et 30 µL de tampon d’élution, préalablement chauffé à 55°C, sont ajoutés. Le mélange est
incubé pendant 2 minutes à température ambiante et l’ADN est élué par centrifugation à
12 000 g pendant 2 minutes. L’ADN purifié est conservé à 4°C.
75
E. Analyse de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose
La qualité de l’ADN extrait et les résultats d’amplification des fragments d’ADN sont vérifiés
par électrophorèse (Mini cuve MT-108, Major Science distribué par Dutscher, France) sur gel
d’agarose de 0,8 à 1,4% (selon la taille de l’ADN étudié) dans du tampon Tris Borate EDTA
(TBE) 0,5 X (Tris-Borate : 50mM ; Acide borique : 50 mM ; EDTA : 0,5mM), additionné de
bromure d’éthidium (BEt) à une concentration finale de 0,5 mg/mL. Les échantillons sont
chargés sur le gel après ajout de tampon de charge (glycérol : 40% ; bleu de bromophénol :
0,25%) à une concentration finale de 1 X. L’électrophorèse est réalisée dans du tampon TBE
0,5 X sous une tension constante de 100 V.
L’ADN est visualisé par fluorescence sous UV (GelDoc 2000, Bio-rad, France) par excitation
du BEt.
Afin d’estimer la quantité d’ADN obtenue, l’intensité des bandes obtenues est comparée à
celles du marqueur de taille utilisé de concentrations connues. Dans cette étude deux
marqueurs de taille ont été utilisés (Euromedex, France) selon la taille attendue de l’ADN
étudié (Figure 20).
Figure 20 : Marqueurs de taille 1 kb et 100 bp utilisés
76
F. Analyse des ADN et construction de molécules recombinées
1. Coupure enzymatique de l’ADNg et de l’ADNpl par des endonucléases de restriction
Les coupures sont réalisées à partir d’1 µg de matrice dans un volume réactionnel de
15-20 µL (ADNpl) ou 25 µL (ADNg). 2 U d’enzyme de restriction sont ajoutées par réaction.
Le mélange est incubé pendant 1 heure à la température optimale de chaque enzyme.
2. Extraction d’un fragment d’ADN d’un gel d’agarose
Un gel d’agarose à 0,8% dans du tampon Tris Acétate EDTA (TAE) 1 X (Tris-acétate :
40 mM ; Acide acétique : 40 mM ; EDTA : 1 mM), additionné de BEt à une concentration
finale de 0,5 mg/mL est réalisé. Après coupure enzymatique, l’ADN digéré est déposé sur le
gel après ajout de tampon de charge (glycérol : 40%, bleu de bromophénol : 0,25%) à une
concentration finale de 1 X. L’électrophorèse est réalisée dans du tampon TAE 1 X sous une
tension constante de 100 V.
L’ADN est visualisé par fluorescence sous UV par excitation du BEt. La zone d’intérêt est
découpée à l’aide d’une lame de scalpel et prélevée.
L’extraction d’ADN est réalisé selon le protocole « Wizard SV Gel and PCR clean-up
System » (Promega France).
A 10 mg de gel précédemment découpé, 10 µL de tampon de dissolution sont ajoutés.
Le mélange est agité par retournement puis incubé à 65°C jusqu’à dissolution complète du
gel. Ce mélange est transféré sur une colonne et incubé pendant 1 minute afin de fixer l’ADN
à la membrane. Une centrifugation à 16 000 g pendant 1 minute est réalisée puis l’éluant est
jeté. L’ADN est lavé deux fois avec 500 µL de solution de lavage et centrifugé à 16 000 g
pendant 1 minute. La colonne est transférée sur un nouveau tube, 50 µL d’eau « Nuclease
Free » sont ajoutés. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 1 minute. L’ADN
est élué par centrifugation à 16 000 g pendant 1 minute. L’ADN extrait constituant l’insert est
conservé à -20°C.
77
3. Ligation des molécules d’ADN
L’ADN ligase de T4 catalyse la formation d’une liaison phosphodiester covalente entre deux
fragments d’ADN. Cette liaison permet de reconstituer une molécule d’ADN circulaire à
partir de fragments d’ADN linéaires.
a. Déphosphorylation des extrémités 5’phosphate de l’ADNpl
Afin d’améliorer l’efficacité de ligation, une déphosphorylation des extrémités 5’phosphate
du plasmide est réalisée. L’ADNpl est déphosphorylé par la phosphatase alcaline d’intestin de
veau (CIAP) à 5 U finale en présence du tampon correspondant à 1 X. La réaction se déroule
pendant 1 heure à 37°C. La CIAP est inactivée grâce à l’utilisation du kit « Wizard SV Gel
and PCR clean-up System » (Matériel et Méthodes partie II. F. 2. Extraction d’un fragment
d’ADN d’un gel d’agarose, page 76)
b. Précipitation alcoolique
Afin de concentrer l’ADNpl et l’insert, une précipitation alcoolique est réalisée.
200 µL d’ADNpl, d’insert et d’eau sont mis en présence de 1/10ème de volume d’acétate de
sodium 3 M pH 5,2 et 3 volumes d’éthanol absolu. Après avoir été placé à -20°C pendant
4 heures, le mélange est centrifugé à 12 000 g pendant 20 minutes et à 4°C. Le surnageant est
éliminé et le culot d’ADN est lavé par 500 µL d’éthanol 70% puis centrifugé à 12 000 g
pendant 20 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé. Le tube est retourné sur un papier
absorbant, puis les culots sont séchés à l’air libre quelques minutes afin que l’alcool soit
totalement évaporé. La ligation se fait directement sur le culot ADNpl/insert.
c. Ligation
Sur le culot d’ADN précédemment obtenu, 3 U de l’ADN ligase de T4 et le tampon
correspondant, à une concentration finale de 1 X, sont ajoutés. Le volume est ajusté à 25 µL
avec de l’eau. La réaction se déroule une nuit à 4°C. 2 µL de ce jus de ligation sont utilisés
pour une transformation par électroporation.
78
G. Hybridation ADN-ADN
1. Hybridation par la technique des tâches
La technique utilisée dans cette partie est la méthode des tâches aussi appelée « Dot-Blot ».
a. Marquage et vérification du marquage des sondes
Dans un premier temps, nous effectuons un marquage aléatoire à la digoxygénine-dUTP
(DIG), avec l’enzyme de Klenow, des fragments d’ADN amplifiés par « PCR » et purifiés,
selon le protocole « DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter KitI » (Roche,
France). La réaction se déroule à 37°C pendant une nuit et est arrêtée par ajout d’EDTA. Les
sondes marquées sont conservées à -20°C.
L’efficacité de marquage et l’estimation de la concentration des sondes sont réalisées par
comparaison à une gamme de concentration connue (de 0,01 à 10 pg/µL). Pour cela, 1 µL de
sonde marquée (dilué ou non dans le tampon de dilution fourni avec le kit) est dénaturé par
chauffage à 100°C pendant 10 minutes puis déposé sur une membrane de nylon chargée
positivement (Roche, France). L’ADN est fixé à la membrane par chauffage à 120°C pendant
30 minutes. La membrane est incubée dans du tampon d’acide maléique (acide maléique :
0,1 M ; NaCl : 0,15 M ; Tween 20 : 0,3% (p/v) pH 7,5) pendant 2 minutes puis dans une
solution bloquante et dans la solution contenant l’anticorps anti-digoxygénine couplé à une
phosphatase alcaline. La membrane est rincée 2 fois pendant 15 minutes avec la solution de
lavage et équilibrée pendant 5 minutes dans le tampon de détection (Tris-HCl : 0,1 M ; NaCl :
0,1 M pH 9,5). La révélation se fait par incubation de la membrane en présence du substrat
NBT/BCIP pendant 1 heure minimum dans l’obscurité. Ce substrat réagit avec la phosphatase
alcaline si l’anticorps s’est fixé à la sonde marquée. Ceci produit une tâche d’intensité
proportionnelle à la quantité de sonde marquée.
b. Préparation d’un ADN « Dot-Blotting »
L’ADN à étudier, dilué ou non, est dénaturé par chauffage à 100°C pendant 10 minutes.
1 µL d’ADN dénaturé est déposé sur membrane de nylon chargée positivement et fixé à la
membrane par chauffage à 120°C pendant 30 minutes. La membrane est pré-hybridée avec le
tampon d’hybridation, préalablement chauffé à 40°C. Une solution d’hybridation contenant la
79
sonde marquée dénaturée à une concentration finale de 25 ng/mL est préparée. La membrane
est incubée à 40°C pendant une nuit avec cette solution.
La membrane est ensuite lavée 2 fois dans une solution 2 x SSC additionnée de 0,1% de SDS
pendant 5minutes puis 2 fois dans une solution de 0,5 x SSC additionnée de 0,1% de SDS.
Elle est ensuite incubée dans une solution bloquant les sites aspécifiques puis avec l’anticorps
anti-digoxygénine couplé à une phosphatase alcaline. Après passage dans la solution de
lavage puis la solution de détection, pendant 15 minutes et 5 minutes respectivement, la
membrane est incubée en présence du substrat NBT/BCIP dans l’obscurité jusqu’à ce que les
tâches apparaissent.
2. Hybridation par la technique de « Southern-Blot »
Le gel d’agarose, sur lequel les fragments d’ADN ont été séparés, est placé dans une solution
de HCl 0,25 M pendant 15 minutes pour augmenter l’efficacité du transfert. Il est ensuite
immergé à deux reprises dans une solution de dénaturation (NaOH : 0,5 M ; NaCl : 1,5 M)
pendant 15 minutes. Deux incubations de 30 minutes dans une solution de neutralisation
(NaCl : 1,5 M ; Tris-HCl pH 8 : 0,5 M) permettent de rééquilibrer le pH. Le transfert de
l’ADN, sur membrane de nylon chargée positivement, s’effectue par capillarité pendant une
nuit en présence de tampon de transfert 20 x SSC (Figure 21). Après cette étape, l’efficacité
du transfert d’ADNg est vérifiée en exposant le gel aux UV. L’ADN est ensuite fixé à la
membrane par chauffage à 120°C pendant 30 minutes. La pré-hybridation, l’hybridation (à
45°C) et la révélation sont réalisées à l’aide du kit « DIG High Prime DNA Labelling and
Detection Starter KitI » selon le protocole décrit dans la partie G. 1. « Hybridation par la
technique des tâches » (page 78).
80
Le montage du transfert se fait selon le schéma suivant :
H. Techniques de transformation
1. Transformation au CaCl2
a. Obtention de bactéries compétentes
Les bactéries E. coli JM109® sont utilisées pour l’amplification du plasmide pGEM-4Z. Elles
sont cultivées en milieu LB à 37°C sous agitation constante de 150 rpm. Elles sont récoltées
en phase exponentielle de croissance (Absorbance à 600 nm entre 0,2 et 0,4) par
centrifugation à 5000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le culot est repris dans la moitié du
volume de culture par du tampon de transformation (Tris-HCl pH 8 : 10 mM et CaCl2 :
50 mM) et les bactéries sont incubées pendant 1 heure dans la glace. Elles sont centrifugées à
5000 g pendant 10 minutes et à 4°C puis le culot est resuspendu dans 1/10ème de volume de
tampon de transformation.
Les bactéries compétentes sont conservées à -80°C.
Figure 21 : Schéma du montage permettant le transfert d’ADN à partir d’un gel d’agarose sur membrane de nylon chargée positivement
81
b. Transformation par un plasmide
Les bactéries sont décongelées sur glace. 200 µL de bactéries compétentes sont incubées en
présence de 10 µL de jus de ligation (0,5 µg d’ADN) pendant 30 minutes dans la glace. Après
un choc thermique de 2 minutes à 42°C puis 2 minutes dans la glace, le mélange de
transformation est étalé sur gélose LB additionné d’ampicilline, de X-gal et d’IPTG.
Les clones (blancs/bleus) apparaissent après une nuit à 37°C.
2. Transformation par électroporation
Les bactéries E. coli E. cloni 10G®, utilisées dans les expériences de clonage, sont
électrocompétentes. Les cellules sont décongelées sur glace. A 25 µL de bactéries
électrocompétentes sont ajoutés 2 µL de jus de ligation (0,1 µg d’ADN). Le mélange est
transféré dans une cuve d’électroporation froide dont les électrodes sont distantes de 0,2 cm
(Mirus Bio, Ingenio TM Cuvettes, Euromedex). La cuve est placée dans l’électroporateur
(Gene pulser, Bio-Rad) et le mélange bactéries-ADN subit une impulsion électrique
décroissante de 2,4 à 0 kV, générée par un condensateur de 25 µF et régulée par une
résistance de 750 Ω. La durée du choc est comprise entre 14,9 et 17 ms. 975 µL de milieu de
récupération (fourni avec les bactéries électrocompétentes) sont ajoutés. Les cellules sont
incubées à 37°C pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite centrifugées à 5000 g pendant
5 minutes. 600 µL de surnageant sont éliminés et le culot est repris dans les 400 µL restant.
100 µL de bactéries transformées sont étalées sur milieu LB additionné d’ampicilline et de
X-gal.
Les clones (blancs/bleus) apparaissent après une nuit à 37°C.
I. Séquençage de fragment d’ADN
Le séquençage, réalisé par la méthode de Sanger, a été confié à la société Genoscreen.
RESULTATS et DISCUSSION
Première partie :
Criblage de souches d’Aspergilli
productrices d’acide itaconique
et
Production d’acides organiques
par fermentation en milieu solide
par des souches d’Aspergilli
84
I. Criblage de souches d’Aspergilli productrices d’acide itaconique
L’acide itaconique, molécule plateforme très intéressante dans l’industrie des polymères, est
uniquement produite par fermentation en milieu liquide avec une production maximale de
90 g/L, soit 476 mg/g de matière sèche, après 10 jours de culture (Kuenz 2012).
La fermentation en milieu solide (FMS) est décrite comme une technique permettant une
économie en eau et en énergie, présentant un faible coût d’investissement, de fonctionnement
de l’appareil et de traitement des produits obtenus. Déjà utilisée pour la production d’acide
citrique (Rodrigues et al. 2009), la FMS pourrait être potentiellement intéressante pour la
production d’autres acides organiques.
L’objectif de ce travail est donc de produire de l’acide itaconique par fermentation en milieu
solide grâce à des souches d’Aspergilli et de déterminer si cette technique pourrait être
concurrentielle par rapport à la fermentation en milieu liquide. Nous nous sommes alors
demandé à quoi servait l’acide itaconique pour un micro-organisme et pourquoi il était
produit. Ainsi pour favoriser cette production et l’améliorer, il semble important de connaître
les conditions favorisant la production d’acide itaconique et la raison de cette accumulation.
Goldberg et al. (2006) décrivent que l’accumulation d’acides organiques, chez les
micro-organismes, se déroule généralement en réponse à un stress. D’autres études montrent
que l’acide itaconique est détecté dans des lignées tumorales de cellules de mammifères
mettant en jeu une réponse immunitaire régulée par les macrophages (Strelko et al. 2011). Ces
résultats appuient l’idée d’un phénomène « pathologique » induisant une production d’acide
itaconique.
Dans la littérature, différentes souches sauvages d’Aspergilli sont décrites pour produire de
l’acide itaconique par fermentation liquide. La première souche décrite pour la production de
cet acide est Aspergillus itaconicus NRRL 161 (Kinoshita 1931). En 1939, Calam et al.
montrent qu’Aspergillus terreus NRRL 1960 produit de l’acide itaconique en quantité plus
importante. D’autres souches telles qu’Aspergillus terreus NRRL 265, 680, 1961, 1963 et
1969 ont également été testées (Welter 2000).
Nous allons donc, dans un premier temps, réaliser un criblage de ces différentes souches
d’Aspergilli sauvages décrites pour produire de l’acide itaconique par fermentation en milieu
85
liquide et, donc, déterminer si elles sont capables de produire cet acide par fermentation en
milieu solide dans nos conditions expérimentales, puis nous étudierons différentes conditions
de production d’acide organique.
Les souches d’Aspergilli utilisées pour le criblage sont :
Aspergillus terreus NRRL 265
Aspergillus terreus NRRL 680
Aspergillus terreus NRRL 1960
Aspergillus terreus NRRL 1961
Aspergillus terreus NRRL 1963
Aspergillus terreus NRRL 1969
Aspergillus itaconicus NRRL 161
Chacune de ces sept souches est testée par fermentation en milieu solide composée d’un
milieu de culture sans ajustement de pH (6,5) ou d’un milieu acidifié à pH 3, pH le plus
favorable à la production d’acide itaconique (Willke et Vorlop 2001), et à un taux d’humidité
initiale de 70%.
Les résultats de la production d’acide itaconique de chaque souche, après 3 jours d’incubation
à 30°C, sont présentés dans le tableau 12.
86
Souches utilisées Acide itaconique (mg/g MS)
pH initial : 3 pH initial : 6,5
Aspergillus terreus NRRL 265 0 0,12 ± 0,009
Aspergillus terreus NRRL 680 0 0,11 ± 0,00175
Aspergillus terreus NRRL 1960 0 0
Aspergillus terreus NRRL 1961 0,16 ± 0,012 0
Aspergillus terreus NRRL 1963 0,11 ± 0,03 0,11 ± 0,0014
Aspergillus terreus NRRL 1969 0,12 ± 0,017 0,075 ± 0,004
Aspergillus itaconicus NRRL 161 0,2 ± 0,009 0,09 ± 0,01
Tableau 12 : Production d’acide itaconique par différentes souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide en fonction du pH initial Fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70%, à pH 3 ou 6,5, après 3 jours d’incubation à 30°C
D’après le tableau 12, nous montrons que les souches A. terreus NRRL 265 et 680 produisent
de l’acide itaconique uniquement à pH non acidifié (6,5). Ces résultats sont fortement
surprenants puisque les travaux de thèse de Welter (2000) ont montré que ces deux
moisissures produisaient de l’acide itaconique par fermentation liquide à pH 3,1.
De plus, Willke et Vorlop (2001) rapportent que la production par fermentation liquide
d’acide itaconique avec A. terreus est améliorée à pH acide.
A. terreus NRRL 1960, souche sauvage la plus utilisée pour la production d’acide itaconique
par fermentation en milieu liquide, n’est pas capable de produire cet acide par fermentation
solide que ce soit à pH 3 ou 6,5, dans les conditions utilisées. Ce résultat est également fort
étonnant mais toutes les études étant réalisées en fermentation liquide il n’est pas possible de
savoir si elle a la capacité à produire de l’acide itaconique par fermentation solide et donc de
comparer nos résultats.
87
La souche A. terreus NRRL 1961 ne produit de l’acide itaconique qu’à pH 3.
Les souches A. terreus NRRL 1963 et 1969 ainsi qu’A. itaconicus NRRL 161 produisent de
l’acide itaconique quelque soit le pH initial (3 ou 6,5).
Le pH n’a pas d’influence significative sur la production d’acide itaconique par A. terreus
NRRL 1963. L’acidification du milieu à un pH initial de 3 améliore la production d’acide
itaconique par les souches A. terreus NRRL 1969 et A. itaconicus NRRL 161 par rapport à la
production obtenue à pH non acidifié (6,5).
A. itaconicus NRRL 161 est donc la meilleure souche productrice avec 0,2 ± 0,009 mg
d’acide itaconique/g de matière sèche à pH 3. Cette souche, jamais utilisée jusqu’à présent en
fermentation en milieu solide, sera donc utilisée dans les essais d’amélioration de la
production d’acide itaconique.
Dans ses travaux de thèse, Welter (2000) compare la production de ces sept souches
d’Aspergilli par fermentation liquide à pH 3 et classe les souches dans l’ordre décroissant de
production suivant : A. terreus NRRL 1963 (8 g/L), 1969, 1961, 1960, 680, 265 et enfin, en
moins bonne productrice, A. itaconicus NRRL 161 (2 g/L). Nos travaux ne sont donc pas en
accord avec ceux de Welter puisqu’à pH 3, nous montrons que la souche A. itaconicus
NRRL 161 est la meilleure productrice d’acide itaconique. Cette différence peut s’expliquer
par le fait que nos études sont réalisées par fermentation solide et que celles de Welter sont
réalisées par fermentation liquide.
L’observation, par chromatographie liquide haute performance, des molécules organiques
produites lors de ces fermentations, a permis de mettre en évidence, chez la souche
A. terreus NRRL 1960, un pic majoritaire qui n’était pas l’acide itaconique. Cette molécule
correspond au pic identifié comme étant de l’acide fumarique. La production d’acide
fumarique, parallèlement à la production d’acide itaconique, a déjà été décrite par
fermentation liquide lors de travaux antérieurs (Bonnarme et al. 1995) mais la production
d’acide fumarique, comme produit majoritaire de FMS, par A. terreus NRRL 1960 n’a jamais
été montrée. Rhizopus est généralement utilisé pour la production d’acide fumarique (Roa
Engel et al. 2008), car actuellement ce champignon reste le meilleur producteur.
88
La production d’acide fumarique a été confirmée par spectrométrie de masse. Les résultats
sont présentés dans la figure 22.
Deux pics sont observés pour le standard d’acide fumarique dont les rapports masse/charge
(ou m/z) sont de : 114, 9 et 132,9. Les analyses ayant été réalisées dans de l’eau (+H2O) et en
mode négatif (-H+), il est normal d’obtenir deux pics. Le premier dont le rapport m/z est de
114,9 correspond à une molécule d’acide fumarique déprotonée et le second dont le rapport
m/z est de 132,9 correspond à une molécule d’acide fumarique hydratée.
Par comparaison du pic obtenu par spectrométrie de masse pour le standard d’acide fumarique
(Figure 22A) et celui de l’échantillon (Figure 22B), nous montrons que la souche A. terreus
NRRL 1960 produit de l’acide fumarique. En effet, les deux pics caractéristiques de l’acide
fumarique sont retrouvés dans l’échantillon testé. Ceci confirme le résultat obtenu par
Figure 22 : Spectres de masse du standard d’acide fumarique (A) et de l’échantillon obtenu par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3 après 3 jours d’incubation à 30°C (B)
A
B
89
« HPLC » où la production d’acide fumarique obtenue est de 0,27 ± 0,023 et
0,1 ± 0,04 mg/g de matière sèche à pH 3 et 6,5, respectivement.
Bien que ce ne soit pas l’objectif de ces travaux de thèse, nous avons tout de même souhaité
approfondir cette particularité de la souche A. terreus NRRL 1960 à produire de l’acide
fumarique et nous avons testé la capacité de cette souche à produire cet acide dans des
conditions décrites pour la production d’acide itaconique.
II. Etude de la production d’acide fumarique par A. terreus NRRL 1960 par
fermentation en milieu solide
A. Effet du pH initial et de la durée d’incubation sur la production d’acide
fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide
La même fermentation solide que précédemment à pH initial 3 ou 6,5 est réalisée. Un pH
initial de 2 est également testé. Le temps de fermentation est allongé de 3 à 5 jours afin de
vérifier si la production d’acide organique est améliorée.
Les analyses sont réalisées après 5 jours d’incubation à 30°C. Le développement de la souche
est présenté dans la figure 23 et le suivi du taux d’humidité et du pH sont présentés dans la
figure 24.
Après 5 jours de culture, la souche ne se développe pas sur le milieu acidifié à pH 2.
Dans le cas où le pH initial est de 3 ou 6,5, le substrat est totalement colonisé par A. terreus.
La souche a énormément sporulé comme présenté dans la figure 23B et C. Dans nos différents
essais, la sporulation du champignon est observée à l’œil nu dès le 3ème jour de culture.
Figure 23 : A. terreus sur son de blé acidifié ou non A. terreus sporulé (B et C) sur son de blé humidifié à 70% acidifié à pH 2 (A) ou pH 3(B) ou non acidifié pH 6,5(C) puis incubé pendant 5 jours à 30°C
90
Le suivi du taux d’humidité est un paramètre important car le champignon a besoin d’un
environnement humide (40-70% d’humidité) pour se développer. Il permet également
d’apporter des informations concernant la production d’eau par le champignon lors de sa
respiration. Le champignon consomme une molécule de glucose pour produire six molécules
de dioxyde de carbone et six molécules d’eau, lorsqu’il respire. Le taux d’humidité est donc
corrélé au développement fongique. Dans le cas où le milieu est acidifié (pH 3) ou non
acidifié (pH 6,5), nous notons que l’humidité a légèrement augmenté après 5 jours (figure
24A), indiquant que le champignon s’est développé.
Le pH augmente jusqu’à 8, quelque soit le pH initial (3 ou 6,5) (Figure 24B). Cette
augmentation de pH pourrait être dépendante du substrat utilisé. En effet, il a été montré que
la culture de champignon filamenteux comme Aspergillus sur substrats ligno-cellulosiques
tels que le son de blé entraîne une augmentation du pH (El-Naggar et El-Hersh 2011). Il est
également décrit qu’Aspergillus oryzae produit des protéases par fermentation solide sur son
de blé et que cette production est maximale pour un pH de 7,5 (Chutmanop et al. 2008).
Dans notre expérience, cette augmentation est probablement due à la mise en place de voies
métaboliques permettant la dégradation des substrats ligno-cellulosiques par fermentation
solide.
Figure 24 : Effet du pH initial sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) avant (T0) et après 5 (T5) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 70%, à pH 3 ou 6,5
A B
91
L’allongement du temps de culture de 3 à 5 jours ne permet pas de mettre en évidence de
production d’acide itaconique au cours de cette étude, cependant, nous notons, à nouveau, la
production d’acide fumarique. Les résultats de cette production sont présentés dans la figure
25 qui reprend également les résultats obtenus après 3 jours d’incubation (cf. page 87).
L’absence de production d’acide fumarique à pH 2 s’explique par le fait que la souche ne
s’est pas développée.
A pH 3 et 6,5, le champignon produit de l’acide fumarique quelque soit le temps d’incubation
testé. L’allongement du temps de culture de 3 à 5 jours améliore la production d’acide
fumarique que ce soit à pH 3 (de 0,27 à 0,44 mg/g MS) ou à 6,5 (de 0,1 à 0,24 mg/g MS).
La meilleure production est obtenue à un pH initial de 3 après 5 jours d’incubation avec
0,44 mg d’acide fumarique/g de matière sèche.
Il est décrit que la production d’acide fumarique par Rhizopus se déroule à des pH compris
entre 5 et 7 (Roa Engel et al. 2011). L’acidification du milieu de fermentation permet donc
d’augmenter la production d’acide fumarique par A. terreus NRRL 1960.
Figure 25 : Effet du pH initial sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide Suivi de la production d’acide fumarique en mg/g de matière sèche (MS) après 3 (T3) ou 5 (T5) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 70%, à pH 2, 3 ou 6,5
92
Face à la production d’acide fumarique et l’absence de production d’acide itaconique, nous
avons décidé d’utiliser différents milieux de production d’acide itaconique ou fumarique
employés en fermentation liquide afin de tester leur influence sur la production de ces acides.
B. Effet de l’ajout de milieux de production d’acide organique au son de blé sur la
production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide
Différents milieux sont utilisés pour la production d’acide itaconique (Petruccioli et al. 1999
et Dwiarti et al. 2002) et d’acide fumarique (Akintokun et al. 2007). Il est décrit que l’ajout
de phosphate tricalcique à une concentration de 10 g/L permet d’améliorer la production
d’acide fumarique par fermentation liquide (Akintokun et al. 2007). Ces trois milieux ainsi
que le milieu de Petruccioli supplémenté de phosphate tricalcique à une concentration de
10 g/L sont ajoutés au son de blé dans le but d’apporter les éléments nécessaires à la
production d’acide itaconique ou fumarique et d’induire ces productions.
Les analyses de l’humidité et du pH sont réalisées après 5 jours d’incubation à 30°C et les
résultats sont présentés dans la figure 26.
Quelque soit le milieu de production d’acide organique utilisé, le champignon sporule comme
présenté dans la figure 23.
L’humidité est constante au cours du temps. Le pH augmente de 5 unités (3 à 8) quelque soit
le milieu de production utilisé.
Figure 26 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de blé sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation Suivi de l’humidité en % (A) et du pH (B) avant (T0) et après 5 (T5) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 70% avec les milieux « Petruccioli, Dwiarti, Akintokun et Petruccioli + phosphate tricalcique », à pH 3
A B
93
Aucune production d’acide itaconique n’est observée mais la production d’acide fumarique
est mise en évidence. Cette production est présentée dans la figure 27.
En présence des milieux de production décrits par Dwiarti et al. 2002 ou Akintokun et al.
2007, les productions d’acide fumarique sont de 0,41 ± 0,0148 et 0,39 ± 0,01 mg/g de matière
sèche, respectivement. L’ajout du milieu de Petruccioli et al. 1999, supplémenté en phosphate
tricalcique ou non permet d’obtenir 0,47 ± 0,015 et 0,49 ± 0,0152 mg/g de matière sèche
d’acide fumarique après 5 jours d’incubation.
L’utilisation de ces quatre milieux de production ne permet pas d’améliorer de façon
significative la production d’acide fumarique par rapport à la production obtenue sur son de
blé humidifié à 70% avec de l’eau osmosée après 5 jours d’incubation à 30°C (0,44 ± 0,034
mg/g de matière sèche).
L’apport d’éléments nécessaires à la production d’acide fumarique par fermentation liquide
(milieu d'Akintokun et al. 2007) ne permettent pas d’améliorer cette production par
fermentation solide.
Figure 27 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de blé sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide Suivi de la production d’acide fumarique en mg/g de matière sèche (MS) après 5 jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 70% par les milieux « Petruccioli, Dwiarti, Akintokun et Petruccioli + phosphate tricalcique », à pH 3
94
Akintokun et al. 2007 ont montré, qu’en présence de phosphate tricalcique (maximum
2,65 g/L), la production d’acide fumarique par fermentation liquide est multipliée par 10.
Cependant, dans cet essai, l’apport de phosphate tricalcique ne permet pas d’améliorer la
production d’acide fumarique par fermentation solide.
De plus, nous avons comparé l’effet du milieu de Dwiarti et Petruccioli sur la production
d’acide itaconique et fumarique. La principale différence entre ces deux milieux est la
présence ou l’absence de « Corn Steep Liquor » (CSL) respectivement. Le CSL est une
importante source de carbone (acide lactique), d’azote et de vitamines. Il est souvent utilisé
pour la production d’acide itaconique en fermentation liquide (Elnaghy et Megalla 1975;
Yahiro et al. 1995; Dwiarti et al. 2002). Ici, la présence de CSL (Milieu de Dwiarti et al.
2002) ne permet pas d’induire la production d’acide itaconique par fermentation solide.
L’apport de CSL n’améliore pas non plus la production d’acide fumarique. Ceci a également
été mis en évidence pour la production d’acide fumarique par Rhizopus arrhizus NRRL 52918
par fermentation solide (West 2008).
Contrairement à cela, des études ont montré que l’apport de CSL permet d’améliorer la
production d’acide citrique (Lotfy et Ghanem 2007). Bien que les acides fumarique et citrique
soient des intermédiaires du cycle de Krebs, impliquant donc la même voie métabolique,
l’apport de CSL n’a pas le même effet selon l’acide organique produit.
Par cette étude, nous montrons donc que la meilleure production d’acide fumarique par
A. terreus NRRL 1960 est de 0,44 ± 0,034 mg/g de matière sèche sur son de blé humidifié à
70% et à pH 3 après 5 jours d’incubation à 30°C.
Des chercheurs ont mis en évidence la production d’acide fumarique par fermentation solide
par une souche d’Aspergillus niger isolée de paille de riz en décomposition et ont montré que
cette production est de 0,375 mg/g de matière sèche après 4 semaines d’incubation à 28°C
(Saber et al. 2010).
De plus, des essais de production d’acide fumarique par Rhizopus arrhizus NRRL 52918 ont
montré que cette souche est capable de produire 5 mg d’acide fumarique /g de grains de maïs,
prétraités par une solution d’acide sulfurique à 1%, par fermentation solide, après 10 jours
d’incubation à 25°C (West 2008). La production que nous avons obtenue peut sembler faible,
cependant, elle est du même ordre que celles observées dans les travaux de Saber et al. 2010
95
et West. 2008, évoqués ci-dessus. De plus, le temps de fermentation de nos essais est moins
long que ceux des travaux cités précédemment qui sont de 4 semaines ou 10 jours. A. terreus
NRRL 1960 semble être une souche prometteuse. Elle pourrait potentiellement être utilisée
pour la production d’acide fumarique, cependant cette production nécessite d’être améliorée.
Il a été rapporté que les travaux portant sur la production d’acide itaconique par A. terreus
NRRL 1960, souche sauvage principalement utilisée pour la production d’acide itaconique,
présentent très souvent des variabilités dans cette production et que des problèmes de
répétabilité sont rencontrés lors de ce procédé (Kuenz et al. 2012). Cependant, l’absence
totale de production d’acide itaconique par A. terreus NRRL 1960 et les faibles valeurs de
production obtenues avec les autres souches au cours de ces essais et du criblage nous
surprennent fortement.
Les hypothèses suivantes sont alors émises :
l’acide itaconique pourrait-il être adsorbé par le substrat ?
la souche consommerait-elle l’acide itaconique produit ?
pourrait-il y avoir une production concomitante ?
Pour vérifier ces hypothèses, des fermentations en milieu solide en présence ou en absence
d’acide itaconique et en présence ou en absence d’A. terreus NRRL 1960 sont réalisées.
C. Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en
présence ou en absence de la souche A. terreus
Des fermentations en milieu solide, composées d’un milieu de culture sur son de blé
humidifié à 70%, à pH 3, sont réalisées selon les quatre conditions suivantes :
1) Avec acide itaconique et avec A. terreus
2) Avec acide itaconique et sans A. terreus
3) Sans acide itaconique et avec A. terreus
4) Sans acide itaconique et sans A. terreus
96
Dans les conditions 1 et 2, nous avons ajouté 5,5 mg d’acide itaconique/g de matière sèche.
Les conditions expérimentales ont été choisies pour permettre, d’une part, la croissance du
champignon en présence ou en absence d’acide itaconique et, d’autre part, la production de
cet acide. En effet, il a été montré qu’en présence d’acide itaconique à 20 g/L, la production
de cet acide par la souche A. terreus IFO 6365, par fermentation liquide, était
significativement diminuée (Yahiro et al. 1995; Okabe et al. 2009).
Le suivi du taux d’humidité, de la matière sèche, du pH et de la production d’acide itaconique
est réalisé après 3, 7 ou 8 jours d’incubation à 30°C. Les résultats de cette expérimentation en
fermentation solide sont présentés dans les figures 28 et 29.
Dans les milieux inoculés avec A. terreus en présence ou non d’acide itaconique (conditions 1
et 3), les phases de développement de la moisissure sont « similaires » et dans les deux cas, la
souche sporule dès le 3ème jour de culture, temps moyen de sporulation de cette souche dans
nos conditions de culture (Figure 28).
Figure 28 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculés ou non par A. terreus Son de blé humidifié à 70%, à pH 3 en présence ou absence d’acide itaconique et en présence ou absence d’A. terreus, après 3 jours d’incubation à 30°C
Condition 1 Condition 2 Condition 3 Condition 4
97
A
C
D
B
Figure 29 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence d’A. terreus Suivi de l’humidité en % (A), de la matière sèche (MS) en g (B), du pH (C) et de la quantité d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (D) avant (T0) et après 3 (T3), 7 (T7) ou 8 (T8) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 70%, à pH 3 en présence ou en absence d’acide itaconique et en présence ou en absence d’A. terreus Condition 1 (bleu) : avec acide itaconique et avec A. terreus ; 2 (rouge) : avec acide itaconique et sans A. terreus ; 3 (vert) : sans acide itaconique et avec A. terreus ; 4 (violet) : sans acide itaconique et sans A. terreus
98
La figure 29A (conditions 1 et 3) montre une légère variation du taux d’humidité au cours du
temps. En présence de champignon et d’acide itaconique (condition 1), une augmentation de
2,8% du taux d’humidité par rapport au taux de départ est observée (69,2 à 72% après 8 jours
d’incubation). Dans le cas où le milieu est inoculé par A. terreus mais que nous n’ajoutons pas
d’acide itaconique (condition 3), la diminution du taux d’humidité n’est que de 0,8% (70,2 à
69,4% après 8 jours de culture). Ces valeurs indiquent qu’il n’y a pas eu de perte d’eau
importante dans le milieu même après sporulation mais que la quantité d’eau, après 8 jours,
est différente en présence ou non d’acide itaconique.
Dans le cas où les milieux ne sont pas inoculés (conditions 2 et 4), aucun développement
fongique n’est observé. Le taux d’humidité diminue. Cette baisse est plus importante dans le
cas où l’acide itaconique n’est pas ajouté au milieu de fermentation et que le milieu n’est pas
inoculé par le champignon (11% contre 4,5% avec acide itaconique après 8 jours de culture).
Cette perte d’eau est due à une évaporation de l’eau contenue dans le milieu mais aussi à une
absence de production d’eau issue de la respiration fongique.De plus, la présence d’acide
itaconique semble jouer un rôle sur le maintien du taux d’humidité du milieu de culture. Il est
décrit que l’ajout d’acide itaconique (1 à 5%) dans des polymères d’acrylamide entraine une
augmentation de l’absorption de l’eau de façon dose dépendante (Foungfung et al. 2011).
Nous pouvons supposer que l’ajout d’acide itaconique dans les milieux de culture permet de
« piéger » l’eau, expliquant ainsi la perte d’eau plus importante en absence d’acide itaconique
(condition 4) par rapport à la perte d’eau du milieu ayant reçu cet acide (condition 2).
La figure 29B montre que la matière sèche (MS) ne varie pas de façon significative dans le
cas où les milieux ne sont pas inoculés avec A. terreus (conditions 2 et 4). Cette MS diminue
de 50,6% (10,27 à 5,07 g après 8 jours de culture) en présence de champignon et d’acide
itaconique (condition 1). En présence du champignon uniquement (condition 3), la MS
diminue de 40,9% (8,72 à 5,16 g) après 8 jours de culture. Cette diminution est due à une
consommation du substrat par le champignon.
D’après la figure 29C, aucune variation significative du pH n’est observée en absence de
champignon (conditions 2 et 4). Dans le cas où les milieux sont inoculés par A. terreus
(conditions 1 et 3), le pH augmente jusqu’à 8 après 8 jours d’incubation. La hausse de pH est
liée à l’activité fongique puisque le pH n’évolue pas lorsque les milieux ne sont pas inoculés
par le champignon (conditions 2 et 4). Nous montrons clairement que cette hausse de pH est
99
reliée à la production de métabolites par le champignon au cours de la fermentation.
Toutefois, cette activité ne semble pas être celle attendue puisqu’un pH acide (2-3) est plus
favorable à la production d’acide itaconique qu’un pH neutre ou basique (Willke et Vorlop
2001).
L’acide itaconique est initialement introduit à 5,5 mg/g de matière sèche. D’après la figure
29D, nous notons, qu’en présence d’acide itaconique et en absence de champignon (condition
2), la quantité d’acide itaconique récupérée est de 4,5 mg/g de matière sèche avant toute
incubation (T0). Cette différence de 18% peut être due à des erreurs de manipulation et/ou à la
mesure par « HPLC » et/ou à une adsorption de l’acide itaconique par le son de blé.
Cependant, la quantité d’acide itaconique ne varie pas (4,5 à 4,6 mg/g MS) au cours du temps
en présence d’acide itaconique et en absence de champignon (condition 3). Ceci démontre
que, s’il y a phénomène d’adsorption de l’acide itaconique par le son de blé avant incubation,
ce phénomène n’est pas observé au cours de l’incubation (3 à 8 jours de culture).
Par analyse « HPLC » des milieux ne contenant ni d’acide itaconique ni de champignon
(condition 4), nous montrons, de façon logique, l’absence de production d’acide itaconique
mais surtout l’absence de molécule ayant un temps de rétention identique à celui de l’acide
itaconique.
Dans le cas où le milieu ne contient pas d’acide itaconique mais qu’il est inoculé par
A. terreus (condition 3), aucune production d’acide itaconique n’est mise en évidence,
confirmant ainsi les résultats obtenus lors du criblage des souches d’Aspergilli.
De plus, en présence d’acide itaconique et du champignon (condition 1), la quantité d’acide
itaconique diminue fortement dès 3 jours d’incubation (51%) pour être nulle en fin de
fermentation. Ces résultats rappellent ceux de Kuenz et al. (2012), qui décrivent qu’au cours
de fermentation avec des souches d’Aspergillus terreus, le taux d’acide itaconique diminue
après 4 jours de culture pour des raisons inconnues. Il semblerait donc que la souche
consomme l’acide itaconique présent dans le milieu.
Grâce à cette étude et dans ces conditions, aucune production d’acide itaconique par la souche
A. terreus NRRL 1960 n’a pu être mesurée. De plus, nous pensons que même si cette souche
produit de l’acide itaconique, il est possible que cet acide soit utilisé par la souche. En effet, il
a été montré, qu’après consommation totale du glucose présent dans le milieu, A. niger est
100
capable d’utiliser des acides organiques (acides citrique, succinique et lactique) comme
sources de carbone alternatives (Meijer et al. 2009). Il a également été décrit que la
production d’acide citrique, après avoir atteint un maximum, diminue puis l’acide citrique
disparaît complètement. Deux hypothèses sont émises : soit l’acide citrique est oxydé en
dioxyde de carbone et en eau soit il est converti en glycogène, cette dernière hypothèse étant
la plus probable (Bennet-Clark et La Touche 1935). Pour confirmer cette éventuelle
« consommation » d’acide itaconique et réduction de cet acide en glycogène, il serait
intéressant de réaliser un marquage de l’acide itaconique au 13C et de suivre l’évolution de cet
acide au sein du milieu mais surtout au sein de la cellule.
Il est également très important de noter qu’en présence d’acide itaconique et de champignon
(condition 1), A. terreus ne produit qu’une très faible quantité d’acide fumarique (à l’état de
traces). Il semble donc que la production d’un de ces acides bloque la production de l’autre.
Ceci a également été mis en évidence par des chercheurs qui ont montré que la production
d’acide itaconique par fermentation liquide fait suite à la production d’acide fumarique par
une souche d’A. terreus et que la production de ces deux acides organiques n’est pas
concomitante (Shimi et Nour El Dein 1962).
En résumé :
Dans ce chapitre, nous décrivons pour la première fois que la souche A. terreus
NRRL 1960 est capable de produire de l’acide fumarique par fermentation solide, sur un
milieu de culture composé de son de blé humidifié à 70%, avec un maximum de 0,44 ±
0,034 mg/g de matière sèche après 5 jours d’incubation à 30°C. Un pH initial de 3 permet une
augmentation de la production d’acide fumarique. L’ajout, au son de blé, d’un milieu décrit
pour la production d’acide fumarique (Akintokun et al. 2007) n’améliore pas cette production.
Nous avons poursuivi notre travail concernant la production d’acide itaconique avec la souche
A. itaconicus NRRL 161.
101
III. Etude de la production d’acide itaconique par A. itaconicus NRRL 161
A. itaconicus est une souche décrite pour la production d’acide itaconique par fermentation
liquide (Kinoshita 1932) et il a été montré, lors du criblage de souches d’Aspergilli
productrices d’acide itaconique, qu’A. itaconicus NRRL 161 est la meilleure souche
productrice de cet acide par fermentation en milieu solide (0,2 mg/gMS). Ainsi, la souche
A. itaconicus NRRL 161 a été retenue pour les essais d’amélioration de production d’acide
itaconique. Cependant, A. terreus NRRL 1960 pourrait consommer l’acide itaconique ajouté
dans le milieu et pourrait donc utiliser l’acide qu’elle produit. Ainsi, avant tout essai
d’amélioration, il a été vérifié si la souche A. itaconicus NRRL 161 consomme également
l’acide itaconique présent. Pour cela, nous avons suivi l’évolution de l’acide itaconique en
présence ou en absence d’A. itaconicus NRRL 161.
A. Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en
présence ou en absence de la souche A. itaconicus
Des fermentations en milieu solide, composées d’un milieu de culture sur son de blé
humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3, avec ajout ou non de
4,3 mg d’acide itaconique /g de matière sèche, sont réalisées.
Quatre conditions sont testées:
1) Avec acide itaconique et avec A. itaconicus
2) Avec acide itaconique et sans A. itaconicus
3) Sans acide itaconique et avec A. itaconicus
4) Sans acide itaconique et sans A. itaconicus
Le développement de la souche est présenté dans la figure 30 et les paramètres de la
fermentation en milieu solide tels que l’humidité, la matière sèche (MS), et le pH ainsi que la
production d’acide itaconique obtenue, après 3, 4 et 7 jours d’incubation à 30°C, sont
présentés dans la figure 31.
102
La figure 30 montre que les milieux non inoculés (conditions 2 et 4) ne présentent aucun
développement fongique après 3 jours d’incubation. Dans le cas où les milieux ont été
inoculés par A. itaconicus NRRL 161 (conditions 1 et 3), le mycélium est blanc et duveteux et
la souche colonise tout le milieu, après 3 jours de culture. De légères zones de sporulation
sont observées (indiquée par une flèche, Figure 30, condition 1 après 3 jours d’incubation) en
présence d’acide itaconique et de champignon, ce qui n’est pas le cas en absence d’acide
itaconique et en présence de champignon (condition 3). Après 4 jours d’incubation, il n’y a
pas de différence de développement mycélien à l’œil nu par rapport aux observations réalisées
après 3 jours d’incubation. Après 7 jours d’incubation, la souche a sporulé (indiqué par les
flèches, Figure 30, conditions 1 et 3 après 7 jours d’incubation) en présence et en absence
d’acide itaconique.
Figure 30 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculés ou non par A. itaconicus Son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L à pH 3 en présence ou absence d’acide itaconique et en présence ou absence d’A. itaconicus, après 3 ou 7 jours d’incubation à 30°C. Les flèches indiquent les zones de sporulation
Condition 1 Condition 2 Condition 3 Condition 4
Condition 1 Condition 3
3 jours d’incubation
7 jours d’incubation
103
Figure 31 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence d’A. itaconicus Suivi de l’humidité en % (A), de la matière sèche (MS) en g (B), du pH (C) et de la quantité d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (D) avant (T0) et après 3 (T3), 4 (T4) ou 7 (T7) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3 en présence ou en absence d’acide itaconique et en présence ou en absence d’A. itaconicus. Condition 1 (bleu) : avec acide itaconique et avec A. itaconicus ; 2 (rouge) : avec acide itaconique et sans A. itaconicus ; 3 (vert) : sans acide itaconique et avec A. itaconicus ; 4 (violet) : sans acide itaconique et sans A. itaconicus
B
C
D
A
104
La figure 31A montre que le taux d’humidité augmente dans les conditions avec champignon
(conditions 1 et 3) et que cette hausse est de 10,1% (64,2 à 74,3%) en présence d’acide
itaconique et de 3,26% (59,94 à 63,1%) en absence d’acide itaconique. Cette hausse est
nettement plus importante que celle observée dans la partie Résultats II. C. Evolution de la
quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en présence ou en absence de la
souche A. terreus NRRL 1960 (page 98). De même, la baisse du taux d’humidité dans le
milieu ne contenant ni champignon ni acide itaconique (condition 4) est plus importante que
la baisse observée dans le milieu sans champignon mais en présence d’acide itaconique
(condition 2) semblant confirmer que cet acide permet de retenir l’eau contenue dans le
milieu.
En ce qui concerne le suivi de la matière sèche (Figure 31B) et du pH (Figure 31C), nous
observons les mêmes tendances que celles observées dans les expériences réalisées avec
A. terreus NRRL 1960.
Lors de la préparation de cet essai, 4,3 mg d’acide itaconique/g de matière sèche ont été
introduits dans les conditions 1 et 2. En présence d’acide itaconique et en absence de
champignon (condition 2), 4,18 mg d’acide itaconique/g de matière sèche sont récupérés
avant toute incubation (T0). Une perte de récupération d’acide itaconique de
2,8 % est observée. Une fois de plus, les erreurs peuvent être dues au manipulateur, à la
détection par « HPLC » ou encore à une adsorption de l’acide par le son de blé. La quantité
d’acide itaconique est stable (4,18 à 4,24 mg/g de matière sèche maximum) au cours du temps
quelque soit le temps d’incubation (3 à 7 jours). Ce résultat met en évidence l’absence
d’adsorption de l’acide itaconique par le son de blé au cours de l’incubation (Figure 31D).
Grâce à ces essais, nous mettons en évidence que la souche A. itaconicus est capable de
produire de l’acide itaconique par fermentation solide avec un maximum de 4,08 ± 0,5 mg/g
de matière sèche après 3 jours d’incubation à 30°C (condition 3) puis cette production
diminue de 73,5% dès le 4ème jour d’incubation (1,08 mg/g de matière sèche). Cette
diminution d’acide itaconique est corrélée à une augmentation du pH de 4 à 5,3 entre le 3ème
et le 4ème jour d’incubation.
De plus, cette souche est capable de produire de l’acide itaconique même en présence de cet
acide volontairement ajouté au milieu (condition 1). Cependant, la quantité d’acide itaconique
105
est maximale après 4 jours d’incubation avec 6,6 mg/g de matière sèche au lieu de 3 jours en
présence de champignon uniquement (condition 3) puis cette production diminue fortement
après 7 jours d’incubation (condition 1). En effet, une perte de 94% d’acide itaconique est
observée entre le 4ème et le 7ème jour (0,5 mg/g de matière sèche après 7 jours) en présence de
champignon et d’acide itaconique. Cette perte pourrait être due à une consommation de
l’acide itaconique par la souche, comme évoqué dans la partie Résultats II. C. Etude de
l’évolution de l’acide itaconique dans un milieu de fermentation en présence ou en absence de
la souche A. terreus NRRL 1960 (page 99). La diminution de production d’acide itaconique
est également reliée à une augmentation du pH entre le 4ème et le 7ème jour.
L’augmentation du pH semble avoir une influence négative sur la production d’acide
itaconique. La production d’acide organique induit généralement une diminution du pH, nous
pensons donc que la production d’acide itaconique n’est pas assez importante pour permettre
une diminution du pH et que la diminution de la quantité d’acide itaconique entraîne
également une augmentation du pH.
Il a été mis en évidence, qu’avec l’augmentation de pH au cours du temps, la production
d’acide itaconique diminue, mais nous avons souhaité approfondir notre étude par
l’évaluation de l’effet du pH initial sur la production d’acide itaconique.
B. Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide
Des essais de fermentation en milieu solide, selon 3 pH initiaux différents : un milieu à pH 6,5
qui correspond à un milieu non acidifié et deux milieux acidifiés à pH 2 et 3, sont réalisés.
Les résultats obtenus après 3, 4 et 6 jours d’incubation à 30°C sont présentés dans la
figure 32.
106
Figure 32 : Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) avant (T0) et après 3 (T3), 4 (T4) ou 6 (T6) jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 2 (vert), 3 (bleu) ou 6,5 (rouge)
C
A
B
107
A pH 2, aucun développement fongique n’est observé. Lorsque le pH est acidifié à pH 3 ou
non acidifié (6,5), un très bon développement de la souche A. itaconicus comparable à celui
présenté dans la figure 30 (condition 3 après 3 jours d’incubation) est observé.
Dans le cas où le pH est acidifié à 3, une augmentation du taux d’humidité, indiquant un bon
développement mycélien, est mise en évidence (Figure 32A). La figure 32B montre que le pH
augmente de 3,5 unités (3,4 à 6,9). L’augmentation de pH pourrait être liée à la production
d’enzymes nécessaires à la dégradation du substrat. L’augmentation de pH serait donc liée à
la mise en place d’une voie métabolique autre que celle de la production d’acides organiques.
La moisissure A. itaconicus ne s’étant pas développée sur le milieu à pH 2, aucune production
d’acide itaconique n’est observée sur ce milieu. Une production d’acide itaconique d’environ
3,1 mg/g de matière sèche après 3 jours de fermentation en milieu solide à pH 3 est obtenue
(Figure 32C). Ce résultat confirme le résultat obtenu lors de l’essai précédent (condition 3).
Une fois de plus, la production d’acide itaconique diminue à partir du 4ème jour d’incubation
lorsque le pH augmente à 5.
Dans le cas où le pH n’est pas acidifié, l’humidité et le pH varient faiblement (Figure 32A et
B) et la production d’acide itaconique est faible par rapport à la production obtenue à pH 3
(Figure 32C). Le maximum de production est obtenu après 4 jours de fermentation en milieu
solide (0,87 mg/g de matière sèche).
La production la plus importante est obtenue à pH 3 après 3 jours d’incubation puis diminue à
partir du 4ème jour, ainsi les essais d’amélioration de la production d’acide itaconique par
A. itaconicus seront évalués après 3 jours de fermentation en milieu solide.
Cette étude montre que la production d’acide itaconique est améliorée lorsque le milieu de
fermentation en milieu solide est acidifié à pH 3. Ces travaux rejoignent ceux obtenus par
fermentation en milieu liquide montrant que la production d’acide itaconique par fermentation
en milieu liquide par A. terreus est améliorée à pH acide (Horitsu et al. 1983; Kautola et al.
1985; Yahiro et al. 1997; Petruccioli et al. 1999; Dwiarti et al. 2007). Kinoshita et Tanaka
(1961) montrent que le pH diminue naturellement de 5,8 à 3 au cours du procédé de
production d’acide itaconique par FML par A. itaconicus. De plus, il a été décrit que la
production d’acide organique tend à diminuer naturellement le pH du milieu (Goldberg et al.
108
2006), cependant l’inverse est observé dans notre étude. Ceci peut s’expliquer par le fait que
la production d’acide itaconique n’est pas assez importante pour acidifier le milieu.
C. Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus
par fermentation en milieu solide
Chaque champignon possède un taux d’humidité initiale optimal pour la production d’acide
organique. Lors du criblage, il a été montré que la souche A. itaconicus produit 0,2 mg
d’acide itaconique/g de matière sèche à 70% d’humidité initiale (Tableau 12). Dans
l’expérience précédente, cette production est augmentée à 3,1 mg/g de matière sèche lorsque
le taux d’humidité initiale est de 60%. Dans cet essai, l’influence du taux d’humidité initiale
(50, 60, 65 et 70%) sur la production d’acide itaconique est évaluée (Figure 33).
Figure 33 : Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation à 30°C sur son de blé avec une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3
B A
C
109
Le développement mycélien est comparable à celui présenté dans la figure 30 (condition 3
après 3 jours d’incubation).
Les figures 33A et B montrent, respectivement, que l’humidité augmente de 3% à 5% au
cours du temps, quelque soit l’humidité initiale testée et le pH augmente d’une unité (3 à 4).
A. itaconicus est capable de produire de l’acide itaconique entre 50 et 70% (Figure 33C).
Nous montrons que la production est la plus importante à 60% d’humidité initiale avec
3,38 ± 0,3 mg/g de matière sèche d’acide itaconique produit après 3 jours d’incubation. Les
productions sont nettement diminuées à 50, 65 et 70%. Elles sont de 1,51 ± 0,19 et
1,22 ± 0,11 mg/g de matière sèche à 50 et 65% d’humidité initiale respectivement. La
production d’acide itaconique est très faible à 70% d’humidité initiale (0,1 ± 0,001 mg/g de
matière sèche).
Ceci peut s’expliquer par le fait que le taux d’humidité, augmentant jusqu’à 75%, entraîne la
formation d’une pellicule d’eau et donc une mauvaise aération. Or, il a été démontré que le
procédé de production d’acide itaconique est hautement aérobie (Willke et Vorlop 2001), il
est donc normal, qu’en absence d’aération correcte, la production d’acide itaconique soit
diminuée. Le taux d’humidité initiale de 60% est donc retenu pour la suite de nos expériences.
D. Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide
Les expériences précédentes ont été réalisées à 30°C, cependant chaque champignon possède
une température optimale de production. Ainsi, trois températures d’incubation différentes ont
été testées : 25°C, 30°C ou 35°C.
Les résultats sont présentés dans la figure 34.
110
Le développement mycélien observé à 25 et 30°C est comparable à celui de la figure 30
(condition 3 après 3 jours d’incubation). 35°C semble être une température trop élevée pour la
croissance du champignon car la souche ne s’est pas développée.
L’humidité ne varie pas de façon significative ou augmente de 3,7% dans les milieux incubés
à 25°C ou 30°C, respectivement (Figure 34A). Malgré une légère variation de 0,5 unité, le pH
reste acide après 3 jours (maximum 3,77) à 25° ou à 30°C (Figure 34B).
Figure 34 : Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation sur son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3
B A
C
111
A. itaconicus produit de l’acide itaconique à 25 et à 30°C (Figure 34C). La meilleure
production d’acide itaconique est observée à une température d’incubation de 30°C, avec un
maximum de 3,26 ± 0,2 mg/g de matière sèche. Ce résultat confirme celui obtenu
précédemment à 60% d’humidité initiale.
Il est décrit que la température de production peut parfois être différente de la température de
culture (Krishna 2005). Ici, la température de culture est la même que la température de
production, c’est-à-dire 30°C.
E. Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide
Les essais précédents étant réalisés avec 10 g de son de blé, nous avons souhaité augmenter la
quantité de son de blé afin de faire varier la hauteur de couche et étudier l’effet de cette
variation sur la production d’acide itaconique.
Des fermentations en milieu solide avec 10, 20 ou 30 g de son de blé correspondant à une
hauteur de couche de 1, 2 ou 3 cm, respectivement, sont réalisées.
Le développement fongique est présenté dans la figure 35 et les résultats des paramètres de
FMS sont présentés dans la figure 36.
La souche se développe dans les trois cas (Figure 35). Cependant, le développement est
différent selon la quantité de substrat utilisée. En effet, plus la quantité de son de blé
augmente moins le champignon colonise le milieu de fermentation.
Figure 35 : A. itaconicus cultivé sur différentes quantités de son de blé Les milieux sont humidifiés à 60% par une solution de saccharose à 400 g/L, acidifié à pH 3 puis incubés pendant 3 jours à 30°C. A : 10 g ; B : 20 g et C : 30 g de son de blé
112
La figure 36 montre que l’humidité augmente de 3%, 5% et 1% pour 10, 20 ou 30 g de son de
blé, respectivement. Ceci est lié à une production d’eau due à la respiration fongique.
L’augmentation du taux d’humidité est faible lorsque 30 g de son de blé sont utilisés. Ceci
traduit un faible taux de respiration fongique dû à un faible développement fongique comme
présenté dans la figure 35C. Le pH varie de 3,5 à 4,8 après 3 jours d’incubation.
La souche produit de l’acide itaconique quelque soit la quantité de substrat utilisée. La
production maximale, 4,85 ± 0,55 mg/g de matière sèche, est obtenue par FMS sur 10 g de
son de blé. Nous mettons également en évidence que l’augmentation de la hauteur de couche
n’induit pas d’augmentation de production d’acide itaconique, mais, au contraire, entraine une
diminution de production.
Figure 36 : Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation à 30°C sur 10, 20 ou 30g de son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400g/L, à pH 3
B A
C
113
Il est décrit que les problèmes rencontrés lors du passage du procédé de FMS à grande échelle
sont en partie dus à l’augmentation de la hauteur de couche, causée par une augmentation de
la quantité de substrat. Ceci peut entraîner une augmentation de la température au sein du
milieu de fermentation, une diminution du taux d’aération du milieu et donc une diminution
de l’oxygénation nécessaire au champignon.
L’absence d’augmentation de production d’acide itaconique après augmentation de la quantité
de substrat n’est donc pas un résultat surprenant. Cependant, si nous avions pu avoir une
aération suffisante avec 20 g de son de blé, nous aurions probablement eu une production
similaire à celle obtenue avec 10 g de son de blé.
F. Effet du maintien du milieu à pH acide au cours d’une fermentation en milieu
solide avec A. itaconicus
Le pH est un facteur très important pour la production d’acide itaconique. En effet, un pH
initial de 3 est plus favorable par rapport à un pH initial de 6,5. Dans nos travaux de
production de cet acide, le pH est ajusté à pH 3 en début de fermentation mais n’est pas ajusté
pendant l’incubation. Cependant, le pH a tendance à augmenter au cours du temps. Nous
avons donc souhaité maintenir le milieu à pH acide au cours de la fermentation, par ajout
d’une solution d’acide nitrique, afin de se placer dans des conditions favorables de production
d’acide itaconique. L’ajout de cette solution ne pouvant être réalisé par apport direct de
liquide dans le milieu au cours de la fermentation à cause d’une répartition hétérogène de
l’eau et de l’acide, une acidification par pulvérisation d’une solution d’acide nitrique a été
choisie. Cette technique permet, en plus, de ne faire qu’un mélange « grossier » du milieu à
l’aide d’une spatule afin d’endommager le moins possible le mycélium. Les milieux sont
acidifiés chaque jour (matin et soir).
Les résultats sont présentés dans les figures 37 et 38.
Figure 37 : A. itaconicus sur son de blé maintenu à pH acide A. itaconicus après 3 jours de culture à 30°C sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400g/L, maintenu à pH 3 par ajout d’acide nitrique chaque jour
114
D’après la figure 37, un faible développement fongique est observé après 3 jours
d’incubation. Le temps de FMS a donc été augmenté jusqu’à 6 jours afin que le champignon
envahisse le substrat. Malgré cet allongement de la durée d’incubation la souche ne s’est pas
plus développée. Ceci est très certainement dû à la vaporisation de la solution d’acide nitrique
directement sur le champignon.
Figure 38 : Effet du maintien du pH acide sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) avant (T0) et après 3 (T3), 4 (T4), 5 (T5) ou 6 (T6) jours d’incubation à 30°C sur du son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400g/L à pH 3
A B
C
115
Le taux d’humidité augmente de 12% (57,8 à 69,8%) après 6 jours d’incubation (Figure 39A).
L’augmentation du taux d’humidité est généralement reliée au développement fongique.
Ici, le développement ne semble pas suffisant pour induire une telle augmentation du taux
d’humidité. Cette hausse est très certainement due à l’acidification quotidienne entrainant un
apport hydrique dans le milieu.
Le maximum de production (0,9 mg d’acide itaconique/g de matière sèche) est observé après
3 jours de FMS. En effet, l’acidification et l’agitation deux fois par jour entraînent un faible
développement mycélien et très certainement des dommages au niveau du mycélium
engendrant une diminution de la production d’acide itaconique.
La méthode employée permet de maintenir le milieu à un pH acide (≤ 4) cependant, elle ne
semble pas adaptée pour le développement de la souche et la production d’acide itaconique. Il
pourrait être utile de développer un système d’acidification sans que la solution d’acide
nitrique soit vaporisée directement sur le milieu afin de permettre le maintien du pH acide
sans endommager le champignon.
L’acidification quotidienne du milieu semblant être trop « agressive » pour la croissance du
champignon, des milieux tamponnés ont alors été utilisés afin d’approfondir notre étude sur le
maintien du pH. Les milieux ont également été acidifiés avec d’autres solutions d’acide.
G. Effet de tampons et de solutions d’acide sur la production d’acide itaconique
par A. itaconicus par fermentation en milieu solide
A chaque milieu de fermentation solide est additionnée, à la pipette, une des solutions
suivantes (0,05M de chaque solution) :
tampon citrate ou citrate phosphate en présence ou en absence d’acide nitrique
tampon aconitate
acide aconitique
acide sulfurique
Le tampon aconitate et l’acide aconitique, précurseur de l’acide itaconique, ont été également
utilisés dans le but d’augmenter la production d’acide itaconique.
Le pH initial varie selon le tampon et/ou l’acide utilisé.
116
Les résultats sont présentés dans les figures 39 et 40.
En présence de tampon aconitate ou de l’acide aconitique, le champignon se développe très
bien et envahit totalement le substrat après 3 jours de culture (Figure 39E et F). En présence
de tampon citrate avec ajout ou non de phosphate, le champignon se développe un peu moins
bien que dans le cas précédent (Figure 39C et D). Après 3 jours d’incubation, un début de
sporulation est observé lors de l’utilisation de tampon citrate phosphate (Figure 39C). En
présence d’acide nitrique additionné de tampon citrate avec ajout ou non de phosphate et
d’acide sulfurique un faible développement mycélien est observé (Figure 39A, B et G). Le
champignon se présente sous forme d’amas.
Figure 39 : A. itaconicus sur son de blé en présence de différents tampons et/ou de solutions d’acide A. itaconicus sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400g/L ainsi qu’une solution d’acide nitrique/tampon citrate phosphate (A) ; acide nitrique/tampon citrate (B) ; tampon citrate phosphate (C) ; tampon citrate (D) ; tampon aconitate (E) ; acide aconitique (F) ; acide sulfurique (G) après 3 jours d’incubation à 30°C
117
Figure 40 : Effet de l’ajout de tampons et/ou de solutions d’acide sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation à 30°C sur son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L ainsi qu’une solution d’acide nitrique ± tampon citrate ± phosphate, de tampon aconitate, d’acide aconitique ou d’acide sulfurique
B
A
C
118
L’humidité varie faiblement au cours de la FMS (Figure 40A). L’utilisation de tampons
associés ou non à de l’acide nitrique ou de solutions d’acide aconitique ou sulfurique permet
de maintenir le milieu à un pH acide (≤ 5) (Figure 40B).
A. itaconicus produit de l’acide itaconique sauf en présence d’acide sulfurique (Figure 40C).
La meilleure production est obtenue en présence d’acide nitrique et de tampon citrate avec
ajout ou non de phosphate. La différence de production entre les deux conditions n’est pas
significative. En présence de tampon citrate avec ajout ou non de phosphate, de tampon
aconitate ou d’acide aconitique, la production d’acide itaconique est plus faible.
Dans le cas où le champignon se développe bien (Figure 39C, D, E et F), la production
d’acide itaconique est faible alors que, dans le cas où la production est plus importante (acide
nitrique additionné de tampon citrate avec ajout ou non de phosphate), le champignon se
développe moins bien (Figure 39A et B). La croissance fongique ne renseigne donc pas sur la
production d’acide itaconique.
De plus, notre hypothèse de travail est que l’ajout de tampon aconitate ou d’acide aconitique,
précurseur de l’acide itaconique, pouvait stimuler la production de cet acide mais l’apport
d’acide aconitique diminue cette production.
L’utilisation de tampons et/ou de solutions d’acide ne permet pas d’augmenter la production
d’acide itaconique par rapport à une fermentation sans ajout de ces différentes solutions. La
molarité des solutions tampons n’est peut-être pas suffisamment élevée. Ces conditions ne
sont donc pas retenues dans le procédé d’amélioration de production d’acide itaconique.
H. Effet de la concentration de saccharose sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide
Les études précédentes ont toutes été réalisées avec une solution de saccharose à 400 g/L. En
effet, il a été décrit qu’une concentration en saccharose de 400 g/L permet une bonne
croissance de la souche A. itaconicus et une amélioration de la production d’acide itaconique
(Kinoshita 1932). Cependant, nous avons souhaité diminuer la concentration de saccharose
dans le but de diminuer le coût de production. Pour cela, des fermentations en milieu solide
ont été réalisées sur son de blé humidifié avec de l’eau, une solution de saccharose à 200 g/L
119
ou une solution de saccharose à 400 g/L représentant 2 g ou 4 g dans les milieux de
fermentations.
Les analyses sont réalisées après 3 jours d’incubation à 30°C et les résultats sont présentés
dans la figure 41.
L’humidité ne varie pas de façon significative pas au cours du temps (Figure 41A). Le pH
augmente fortement jusqu’à 6,2, dans le cas où le milieu ne contient pas de saccharose (Figure
41B). L’ajout de saccharose à une concentration de 200 ou 400 g/L engendre une
augmentation de pH jusqu’à 5 maximum. Cette augmentation est moins importante en
Figure 41 : Effet de la concentration en saccharose sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation à 30°C sur du son de blé humidifié à 60% avec de l’eau, ou avec une solution de saccharose à 200 ou 400 g/L
B A
C
120
présence de saccharose. Cette source de carbone, n’étant pas décrite pour avoir un effet
tampon, la différence de variation du pH pourrait être due à la production d’acide itaconique.
Dans les trois conditions, la souche se développe bien sur le substrat (Figure 30, condition 3
après 3 jours d’incubation). Bien qu’A. itaconicus soit un champignon osmophile, nous avons
observé que cette moisissure est capable de se développer même sans apport de saccharose.
Cependant, l’absence de saccharose entraîne une absence de production d’acide itaconique.
L’ajout d’une solution de saccharose à 200 g/L permet d’obtenir 1,1 ± 0,06 mg/g de matière
sèche d’acide itaconique. Cette production est quasiment multipliée par 3 (3,25 mg/g de
matière sèche) lorsqu’une solution de saccharose à 400 g/L est utilisée.
Comme le saccharose ne présente pas d’effet tampon, la variation du pH semble donc être liée
à la production d’acide itaconique. En effet, en absence de saccharose, aucune production
d’acide itaconique n’est mesurée et le pH augmente de 3,7 à 6,2 (Figure 41B). Au contraire,
plus la concentration en saccharose est élevée, plus la production d’acide itaconique est
importante et moins le pH est augmenté (pH 5 maximum).
Ces résultats indiquent fortement qu’une pression osmotique élevée est nécessaire pour la
production d’acide itaconique et que la meilleure concentration en saccharose est de 400 g/L
soit 1,17 M. Ceci est en accord avec les travaux de Kinoshita et Tanaka (1961) qui ont montré
que la production d’acide itaconique nécessite une concentration élevée en sucre (maximum
20% de glucose soit 1,11 M). Nous pourrions penser que l’augmentation de la concentration
de saccharose pourrait augmenter la production d’acide itaconique, cependant, il est décrit
qu’au-delà de 400g/L de saccharose, cette production diminue (Kinoshita 1932).
I. Effet des sources de carbone sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide
A. itaconicus nécessite une forte concentration en saccharose pour la production d’acide
itaconique. Afin de valoriser les co-produits agro-industriels et de réduire les coûts de
production, des co-produits riches en glucides à la place du saccharose ont été utilisés : l’EP2
et le sirop de son de blé.
L’EP2 (Egout Pauvre de 2ème jet) est un résidu de sucrerie fortement chargé en saccharose,
issu des lavages dans le processus de cristallisation du sucre. Il est majoritairement composé
121
d’hexoses et le sirop de son de blé est riche en pentoses. Les milieux sont alors humidifiés par
une solution d’EP2 ou de sirop de son de blé.
Au cours de ces essais, A. itaconicus ne se développe pas, quelque soit le produit utilisé. La
durée d’incubation a donc été allongée de 3 à 8 jours, mais aucun développement fongique
n’a été observé. Ce résultat est étonnant puisque Kinoshita et Tanaka ont montré que
l’utilisation de mélasses (canne à sucre ou betterave), à la place du glucose, permet une
augmentation de rendement en acide itaconique de 25% par fermentation liquide par rapport à
l’utilisation de glucose.
J. Effet des substrats sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide
Le son de blé étant le seul substrat utilisé dans notre étude, nous avons donc souhaité tester
d’autres substrats afin de valoriser d’autre type de biomasse locale.
La pulpe de betterave, riche en saccharose, ainsi qu’un mélange de son de blé/pulpe de
betterave (50% / 50% (p/p)) ont été utilisés comme substrat.
Au cours de ces FMS, la souche ne se développe pas sur pulpe de betterave mais se développe
sur son de blé/pulpe de betterave. Nous supposons donc que la pulpe de betterave contient un
ou des élément(s) inhibiteur(s) de la croissance d’A. itaconicus et que le développement sur
son de blé/pulpe de betterave est dû à la présence de son de blé dans le milieu. Dans les deux
cas, il n’y a pas de production d’acide itaconique. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse
qu’en plus des éléments inhibiteurs de la croissance fongique, ces mêmes éléments ou
d’autres peuvent inhiber la production d’acide itaconique.
La pulpe de betterave étant riche en saccharose, ce co-produit aurait également pu être
intéressant pour la production d’acide itaconique nécessitant une forte concentration en
glucide. Le son de blé est donc le meilleur substrat testé dans ces travaux.
K. Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus
par fermentation en milieu solide
Après avoir étudié l’effet de l’apport d’une source de carbone, nous nous sommes intéressés à
l’effet de l’apport d’une source d’azote sur la production d’acide itaconique. Il est décrit que
122
la production d’acide itaconique par fermentation en milieu liquide par A. terreus est
améliorée en présence de source d’azote telle que l’extrait de levure, le nitrate de
d’ammonium ou la peptone (Elnaghy et Megalla 1975; Horitsu et al. 1983; Yahiro et al. 1997;
Tevz et al. 2010). Cependant l’apport d’azote doit être faible (0,1% (p/v)) pour améliorer la
production d’acide itaconique par fermentation liquide par A. itaconicus.
Les sources d’azote testées sont : l’extrait de levure, un mélange de source d’azote pour
levure (YNB, Yeast Nitrogen Base), le nitrate de potassium et la peptone de soja. Chaque
source d’azote est testée à 1 g/L.
Les analyses sont réalisées après 3 jours d’incubation à 30°C et les résultats sont présentés
dans la figure 42.
Figure 42 : Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en % (A), du pH (B) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (C) après 3 jours d’incubation à 30°C sur du son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L additionné d’extrait de levure, d’YNB, de nitrate de potassium ou de peptone de soja, à pH 3
B A
C
123
Quelque soit la source d’azote utilisée, une croissance mycélienne importante similaire à celle
présentée dans la figure 30 (condition 3 après 3 jours d’incubation) est observée. L’humidité
augmente de 5% maximum au cours du temps quelque soit la source d’azote utilisée. Cette
augmentation du taux d’humidité est corrélée à une production d’eau liée à la respiration
fongique.
Les milieux de culture ne sont volontairement pas acidifiés. En effet, l’acidification du milieu
se fait par une solution d’acide nitrique qui constitue déjà une source d’azote. De plus, il a été
montré que l’acidification du milieu de fermentation par une autre solution d’acide que l’acide
nitrique ne permet pas d’améliorer la production d’acide itaconique par rapport à celle
obtenue sur un milieu non acidifié. Dans cette étude, le pH initial est donc de 6,2 (Figure
42B). Le pH diminue jusqu’à 4,3, après 3 jours de culture, quelque soit la source d’azote
utilisée. Ceci pourrait s’expliquer par la consommation de la source d’azote par A. itaconicus.
En effet, des auteurs décrivent que la consommation de la source d’azote par A. niger, lors de
la production d’acide citrique par fermentation liquide, tend à diminuer le pH (Karaffa et
Kubicek 2003).
La souche est capable de produire de l’acide itaconique quelque soit la source d’azote. La
meilleure source d’azote testée est l’YNB avec une production d’acide itaconique de 0,26 ±
0,005 mg/g de matière sèche. Cependant, cette production est très faible par rapport à une
fermentation en milieu solide (FMS) sur son de blé humidifié à 60% avec une solution de
saccharose à 400 g/L, acidifié à pH 3 avec une solution d’acide nitrique et à 30°C. Ce résultat
peut également être comparé à celui obtenu par FMS sans acidification (Figure 32C) où une
production de 0,258 mg/g de matière sèche a été obtenue. L’ajout d’azote n’améliore pas la
production d’acide itaconique à pH non acidifié.
Il est décrit qu’un apport d’azote (0,1% (p/v)) permet une amélioration de la production
d’acide itaconique par fermentation liquide, cependant, dans ces essais, l’apport d’azote ne
permet pas d’améliorer la production d’acide itaconique par FMS. Ces résultats rejoignent
ceux de Rodrigues et al. (2009) qui ont également montré que l’apport d’azote n’améliore pas
la production d’acide citrique par FMS par A. niger. Ils précisent que ceci est très
certainement dû à l’hétérogénéité du milieu solide qui entraine une mauvaise diffusion de
l’azote.
124
L. Effet d’un inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide
Généralement, les milieux de fermentation en milieu solide sont inoculés par une suspension
de conidies (obtenue par « grattage » du champignon sporulé avec de l’eau stérile additionnée
de Tween 80 (0,2% p/v) stérile) qui permet une bonne répartition du micro-organisme au sein
du milieu de fermentation ainsi qu’une bonne reproductibilité des productions obtenues.
Cependant, l’utilisation de conidies, métaboliquement en dormance, entraine un temps de
latence plus long (Wolken et al. 2003). Ainsi, il est également intéressant d’utiliser des
cellules végétatives, ou mycélium, comme inoculum.
Dans les essais précédents, tous les milieux ont été inoculés par une suspension de conidies,
ici, les milieux sont inoculés par du mycélium (obtenu par culture liquide en erlenmeyer) afin
de réduire le temps de latence et vérifier si ce type d’inoculum permet une augmentation de la
production d’acide itaconique.
4 mL d’une culture liquide en milieu de Harrold d’A. itaconicus de 1, 3 ou 4 jours, soit,
respectivement, 12,7 ; 38 et 41,3 mg de biomasse sèche, sont employés comme inoculum. Ces
temps de « pré-culture » ont été déterminés de façon arbitraire.
Les analyses sont réalisées après 1, 2, 3 ou 4 jours d’incubation à 30°C et les résultats sont
présentés dans la figure 43.
125
Figure 43 : Effet de l’âge de l’inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide Suivi de l’humidité en %, du pH (A, B, C) et de la production d’acide itaconique en mg/g de matière sèche (D) avant (T0) et après 1 (T1), 2 (T2), 3 (T3) ou 4 (T4) jours d’incubation à 30°C sur du son de blé humidifié à 60% avec une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3 et inoculé avec du mycélium âgé de 1 (A), 3 (B) ou 4 (C) jours
D
Pré-culture de 1 jour
A
B
Pré-culture de 3 jours
C
Pré-culture de 4 jours
126
La souche A. itaconicus se développe très bien dans les cas où l’inoculum est âgé de 3 ou 4
jours. Le développement est semblable à celui présenté dans la figure 30 (condition 3 après 3
jours d’incubation). Lorsqu’un inoculum d’1 jour est utilisé, la souche se développe
faiblement (comme présenté dans la figure 39G).
L’humidité diminue pour l’inoculum d’1 jour alors qu’elle augmente lorsqu’une pré-culture
de 3 ou 4 jours est utilisée comme inoculum. Ceci reflète le faible développement mycélien
lorsque la pré-culture est âgée d’1 journée.
Le pH augmente dans tous les cas et plus particulièrement dans le cas où une pré-culture de 4
jours est utilisée (de 2,8 à 6,9). Dans les autres cas, le pH augmente jusqu’à 4 maximum.
En utilisant une pré-culture âgée de 1 jour, la production d’acide itaconique est très faible. Ce
résultat s’explique par le fait que le champignon s’est très peu développé au cours de la FMS.
Dans le cas où une pré-culture de 3 ou 4 jours est utilisée, la production d’acide itaconique est
augmentée. Lorsque l’inoculum est une culture âgée de 3 jours, la souche produit
6,77 ± 1 mg/g de matière sèche d’acide itaconique après 4 jours d’incubation. Ce résultat est
la meilleure production obtenue au cours de toutes nos expériences.
En utilisant une pré-culture âgée de 4 jours, la production d’acide itaconique est de 4,33 ±
0,89 mg/g de matière sèche après 3 jours d’incubation puis diminue le 4ème jour. Ce résultat
est corrélé à une forte augmentation de pH entre le 3ème et le 4ème jour.
En résumé :
Jusqu’à présent il existe très peu de littérature concernant la production d’acide itaconique par
A. itaconicus NRRL 161. De plus, toutes les études sont réalisées par fermentation liquide.
Grâce à cette étude nous montrons, pour la première fois, la production d’acide itaconique par
A. itaconicus NRRL 161 par fermentation en milieu solide.
Ces travaux mettent en évidence que le pH est un facteur très important pour la production
d’acide itaconique. En effet, la diminution de la production d’acide itaconique semble liée à
l’augmentation du pH. De plus, un pH initial de 3 est très important dans le procédé de
production d’acide itaconique par fermentation solide, tout comme pour la production par
127
fermentation liquide. Une forte pression osmotique (400 g/L de saccharose) semble nécessaire
pour une bonne production d’acide itaconique. Une humidité trop élevée (70%) entraîne la
formation d’une pellicule d’eau entre le substrat et le champignon réduisant ainsi le taux
d’aération nécessaire à la croissance fongique et à la production d’acide itaconique. L’apport
d’azote, bien que décrit pour améliorer la production d’acide itaconique par fermentation
liquide, ne permet pas d’augmenter la production de cet acide par fermentation solide dans
nos conditions expérimentales. Une température d’incubation trop haute (35°C) inhibe la
croissance du champignon et donc la production d’acide itaconique. Une hauteur de couche
de substrat trop élevée entraîne une diminution de la production d’acide itaconique.
Nous montrons que la meilleure production, 6,77 ± 1 mg/g de matière sèche, est obtenue sur
du son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400 g/L, à pH 3, inoculé par
une pré-culture mycélienne de 3 jours après 4 jours d’incubation à 30°C. Cette production
correspond à une productivité de 0,07 mg d’acide itaconique/g de matière sèche/heure. Ce
résultat est à comparer à la productivité obtenue par FML par l’équipe de Kuenz (2012) qui
est de 2,83 mg/g de matière sèche/heure. Le procédé de FMS peut donc être utilisé pour la
production d’acide itaconique. Ainsi, nous avons réussi à répondre en partie à l’objectif
demandé puisque le but de cette partie du programme PENTORAF était de produire de
l’acide itaconique par fermentation solide. Cependant, il est évident, qu’en l’état, la FMS ne
permet pas de rivaliser avec la FML. Cependant, le procédé de FMS peut être amélioré. En
effet, une forte variation de production d’acide itaconique est observée due à des variations
dans le prélèvement de la biomasse pour l’inoculation des milieux par du mycélium. Il semble
alors important de travailler sur la culture liquide du champignon pour en maîtriser sa
croissance et de produire cette moisissure sous forme de pellets afin que les milieux soient
inoculés avec la même quantité de biomasse dans le but d’augmenter la reproductibilité des
résultats.
Contrairement à l’équipe de Roehr (1992) qui rapporte que la souche A. itaconicus isolée par
Kinoshita (NRRL 161) a perdu sa capacité à produire l’acide itaconique, ce travail démontre
que la souche est toujours capable de produire de l’acide itaconique. De plus, nos travaux sont
en accord avec les travaux de thèse de Welter qui démontrent qu’A. itaconicus NRRL 161 est
encore capable de produire de l’acide itaconique par fermentation en milieu liquide (Welter
2000).
128
Généralement, il est décrit que les productions sont plus importantes par fermentation en
milieu solide (FMS) que par fermentation en milieu liquide (FML). Cependant, jusqu’à
présent, il n’existe aucune échelle ou méthode permettant de comparer les productions
obtenues par FML et FMS (Pandey 2003). Les travaux sur la production d’acide itaconique
ayant été réalisés principalement par FML, il est difficile de comparer les résultats que nous
avons obtenus. Toutefois, une étude a montré qu’une souche d’Aspergillus terreus mutée est
capable de produire un maximum de 742,5 mg d’acide itaconique/g de canne à sucre par
fermentation en milieu solide (Tsai et al. 2001). Cependant, il est important de noter que notre
étude a été réalisée avec des souches sauvages d’Aspergilli.
D’autres auteurs ont montré que la souche sauvage A. niger NRRL 2001 est capable de
produire 88 mg/g de matière sèche d’acide citrique par FMS (Vandenberghe et al. 2000). La
production d’acide citrique est connue et étudiée depuis très longtemps alors que la
production d’acide itaconique par FMS n’est qu’à ses débuts. Bien que la production puisse
sembler faible, nous pensons qu’elle est prometteuse.
Outre l’étude de la production, se pose également la question de l’extraction du produit
d’intérêt puisque, contrairement à la FML, la molécule n’est pas dissoute dans l’eau en FMS.
Cependant, l’extraction d’une molécule produite par FMS est relativement simple. En effet, le
pourcentage d’humidité étant assez élevé, il est possible d’utiliser une « ultrapresse » qui
permet d’extraire le produit dans un volume d’eau significativement réduit. Ceci a pour
avantage d’obtenir un produit plus concentré qui est ensuite purifié par passage sur résine
échangeuse d’ions. Dans le cas d’une production d’acide itaconique par FML, la récupération
et la purification de cet acide nécessitent l’utilisation de solvants ainsi que des traitements
coûteux (Willke et Vorlop 2001). L’extraction et la purification de l’acide itaconique par FMS
semblent donc relativement plus simples à mettre en place et moins coûteuse. Ainsi, après
amélioration du procédé, l’utilisation de la FMS pourrait être une perspective d’avenir pour la
production d’acide itaconique.
Deuxième partie :
Recherche du gène codant pour la
Cis-Aconitic acid Decarboxylase
chez A. itaconicus NRRL 161
130
L’étude du génome chez les moisissures du genre Aspergillus est un vaste champ
d’investigation. Actuellement, quelques espèces d’Aspergilli telles que A. fumigatus,
nidulans, oryzae et niger sont particulièrement bien étudiées et le séquençage de leur génome
est réalisé. Les recherches sur le génome d’A. terreus ne sont qu’à leur début et quelques
gènes ont été séquencés (NCBI, Genome, ID 53, 2012). Une étude récente, réalisée par
l’équipe de Kanamasa (2008), a permis d’isoler et de caractériser le gène codant pour la Cis-
Aconitic acid Decarboxylase (CAD), enzyme clé de la production d’acide itaconique
permettant la décarboxylation de l’acide aconitique, chez la souche A. terreus IFO 6365 et son
mutant TN-484. Ce gène, nommé CAD1 (accession number AB 326105), est constitué de
deux exons et d’un intron. Il comprend 1529 pb codant pour une enzyme de 490 acides
aminés. Ces travaux sont les seuls publiés sur le gène CAD1, ainsi dans notre étude nous nous
sommes basés sur cette unique séquence publiée.
Au cours des travaux sur la production d’acide itaconique par fermentation en milieu solide, il
a été mis en évidence que cet acide est produit par la souche A. itaconicus NRRL 161. Nous
supposons donc que cette souche exprime la CAD et qu’elle possède le gène codant pour cette
enzyme. Nous avons donc souhaité isoler ce gène chez A. itaconicus NRRL 161, espèce chez
laquelle aucune étude sur le génome n’a été réalisée.
Dans la littérature, il est décrit qu’il existe des homologies de séquences entre différentes
espèces d’Aspergilli qui peuvent varier de 20 à 99% (Shi et al. 2010; Perrone et al. 2011).
Les deux souches utilisées étant des Aspergilli décrites pour produire de l’acide itaconique,
notre hypothèse de travail est basée sur l’idée que le gène putatif codant pour la CAD chez
A. itaconicus NRRL 161 pourrait présenter une forte homologie de séquence avec le gène
CAD1 chez A. terreus.
I. Amplification partielle du gène CAD1 chez A. terreus NRRL 1960 par « PCR »
Dans un premier temps, l’amplification par « PCR » du gène CAD1 chez A. terreus
NRRL 1960 est envisagée.
Afin de réaliser cette étude, nous devions disposer d’ADN génomique (ADNg) d’A. terreus.
L’extraction d’ADNg a été réalisée à l’aide d’un kit d’extraction employé généralement pour
les plantes (DNeasy Plant Mini kit, Qiagen). Nous avons adapté le protocole d’extraction en
131
augmentant le volume de tampon de broyage ainsi que le temps d’incubation afin d’améliorer
l’extraction d’ADNg. De plus, des billes de verre ont été utilisées afin d’améliorer le broyage
cellulaire (Plaza et al. 2004). L’efficacité de l’extraction et la qualité de l’ADN sont
visualisées sur gel d’agarose à 0,8% (Figure 44).
Pour réaliser les amplifications, 8 amorces ont été dessinées à partir de la séquence CAD1
publiée par Kanamasa et al. 2008, leur séquence et leur position sont indiquées dans la section
Matériel et Méthodes (page 73). Ces amorces permettent l’amplification par « PCR » de
4 fragments d’ADN que nous avons nommés : cad1, cad2a, cad2b et cad 2c. Les séquences
amplifiées sont présentées schématiquement dans la figure 45.
Figure 45 : Schéma représentant le gène codant pour la CAD ainsi que la localisation des fragments attendus après amplification par « PCR » chez A. terreus NRRL 1960
Figure 44 : Extraction d’ADNg d’A. terreus A : ADNg d’A. terreus extrait avec billes ; B: ADNg d’A. terreus extrait sans billes ; M : Marqueur de Taille 1 kb
A B M
10 000 pb 8 000 pb
1 000 pb
132
Cette étape a pour but de déterminer si ces 4 fragments présents chez les souches d’A. terreus
utilisées par l’équipe de Kanamasa (IFO 6365 et son mutant TN-484) sont également
retrouvés chez la souche A. terreus NRRL 1960 dont nous disposons pour notre étude.
L’amplification des fragments cad1, cad2a, cad2b et cad2c est réalisée avec les couples
d’amorces cad1F/cad1R, cad2aF/cad2aR, cad2bF/cad2bR, cad2cF/cad2cR.
Lors de l’amplification du fragment cad1, des difficultés ont été rencontrées. La concentration
en amorces a donc été doublée (0,2 µM au lieu de 0,1 µM) et diminuer la température
d’hybridation pour les quatre premiers cycles afin d’améliorer l’hybridation des amorces sur
la matrice.
Les résultats d’amplification sont observés sur gel d’agarose à 1,4% pour les fragments cad1
et cad2a et sur gel d’agarose à 1,2% pour les fragments cad2b et 2c (Figure 46).
Figure 46 : Amplification des fragments cad1, cad2a, cad2b et cad2c chez A. terreus NRRL 1960 A : Amplification du fragment cad1 ; 1 : Témoin négatif M : Marqueur de taille 100 pb ; 2 :
Amplifiat
B : Amplification du fragment cad2a ; 1 : Témoin négatif ; M : Marqueur de taille 100 pb ;
2 : Amplifiat
C : Amplification des fragments ca2b et 2c ; 1 : Amplifiat cad2b ; 2 : Témoin négatif
M : Marqueur de taille 100 pb ; 3 : Amplifiat cad2c ; 4 : Témoin négatif
1 M 2
300 pb 200 pb
A
1 2 M 3 4
400 pb
600 pb 500 pb
C
1 M 2
B
300 pb
133
D’après la figure 46A, l’amplification d’un fragment de taille comprise entre 200 et 300 pb
est mise en évidence. Ce fragment correspond au fragment cad1 dont la taille attendue est de
229 pb.
L’amplification d’un fragment de taille d’environ 300 pb correspondant au fragment cad2a de
310 pb est également mis en évidence (Figure 46B).
La figure 46C présente l’amplification de 2 bandes d’ADN dont la taille est de 600 pb et
450 pb environ, respectivement. Elles correspondent aux fragments cad2b et cad2c de 607 pb
et 457 pb, respectivement.
La taille des fragments obtenus est en accord avec la taille des fragments attendus déterminée
à partir de la séquence publiée chez A. terreus par Kanamasa et al. 2008.
Dans tous les cas, aucune amplification n’est observée en absence de matrice (témoin négatif).
Dans cette partie, l’amplification des quatre fragments du gène CAD1 est mise en évidence
grâce aux couples d’amorces que nous avons déterminés.
Avant de poursuivre l’étude, nous souhaitons nous assurer que les séquences amplifiées chez
A. terreus NRRL 1960 sont similaires aux séquences du gène CAD1 isolé par Kanamasa et al.
2008. Pour cela, des digestions enzymatiques par les endonucléases de restriction HaeIII,
HinfI et TaqI des différents fragments amplifiés par « PCR » (cad1, cad2a, b et c) ainsi qu’un
séquençage des 4 fragments obtenus ont été effectués.
Les coupures enzymatiques obtenues sont identiques aux coupures enzymatiques théoriques
réalisées in silico.
Les séquences nucléotidiques obtenues par séquençage ont été analysées par BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool). La séquence codante du gène CAD1 chez A. terreus NRRL
1960 est quasiment similaire (99%) à celle de la souche A. terreus IFO 6365 et son mutant
TN-484.
Nous disposons ainsi de bons outils pour continuer l’étude portant sur la recherche du gène
codant pour la CAD chez A. itaconicus.
134
II. Essais d’amplification de fragment du gène codant pour la CAD chez
A. itaconicus NRRL 161 par « PCR »
Comme nous l’avons montré précédemment, A. itaconicus NRRL 161 produit de l’acide
itaconique. Ces résultats laissent penser que cette souche exprime l’enzyme CAD et donc
qu’elle possède le gène codant pour cette enzyme. Des études ont montré qu’il existe de fortes
homologies de séquence entre différentes espèces d’Aspergilli (Shi et al. 2010; Perrone et al.
2011).
Notre hypothèse travail est que le gène codant pour la CAD chez A. terreus NRRL 1960
présente une forte homologie de séquence avec le gène codant pour la CAD chez
A. itaconicus NRRL 161. Les amorces utilisées pour l’amplification des quatre fragments
cad1, cad2a, b et c chez A. terreus sont donc utilisées dans des essais d’amplification, par
« PCR », du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus.
Malgré différentes modifications des conditions de « PCR » telles que la température
d’hybridation, la quantité de matrice, la concentration des amorces, aucune amplification
d’ADN n’a été observée avec les couples d’amorces cad1F/R et cad2bF/R. L’utilisation des
couples d’amorces cad2aF/R et cad2cF/R et la modification des conditions de « PCR »,
décrite ci-dessus, ont permis de mettre en évidence l’amplification de plusieurs fragments
d’ADN chez la souche A. itaconicus due à des problèmes d’aspécificité. Au cours de ces
essais, des difficultés de reproductibilité nt également été rencontrées.
Ces résultats n’étant pas probants, une autre stratégie a été employée. Cette dernière est
toujours basée sur le principe de l’homologie de séquence entre les deux souches d’Aspergilli
utilisées. Pour cela, les fragments cad1, cad2a, b et c amplifiés chez A. terreus vont servir de
sondes dans des essais d’hybridation afin d’isoler le gène codant pour la CAD chez
A. itaconicus et de le caractériser. Ces sondes, de taille comprise entre 229 et 607 pb, vont
permettre de contrecarrer les problèmes d’aspécificité rencontrés avec les amorces de petite
taille (maximum 18 pb).
135
III. Mise en évidence du gène « CAD1 » chez A. itaconicus par utilisation de sondes
d’A. terreus
A. Essais d’hybridation par « Dot-Blot »
Dans un premier temps, des expériences d’ADN « Dot-Blotting » entre l’ADNg
d’A. itaconicus et les sondes cad1, cad2a, b et c d’A. terreus marquées à la digoxygénine-
dUTP (DIG) sont réalisées. Ces essais d’ADN « Dot-Blotting », qui ont pour avantage d’être
fiables et rapides, vont permettre de vérifier la présence potentielle du gène codant pour la
CAD chez A. itaconicus.
Nous procédons aux essais d’hybridation entre l’ADNg d’A. itaconicus et les sondes cad1,
cad2a, b et c. Les résultats sont présentés dans la figure 47.
Figure 47 : Hybridation par « Dot-Blot » de la sonde cad1 (A) et cad2a (B) avec l’ADN génomique d’A. itaconicus
A B
136
Comme attendu, les sondes marquées s’hybrident avec l’ADNg d’A. terreus et la sonde
correspondante non marquée (Figure 47).
D’après la figure 47A, un signal positif est observé pour l’ADNg d’A. itaconicus dilué ou non
pour les essais avec la sonde cad1. La figure 47B met en évidence une tâche de faible
intensité avec la sonde cad2a.
Ainsi, la sonde cad1 présente une forte homologie avec l’ADNg d’A. itaconicus, cependant
cette homologie est moins importante avec la sonde cad2a. Ces résultats laissent penser que le
gène codant pour la CAD est présent chez A. itaconicus et qu’il existe une homologie de
séquence entre ce gène chez A. terreus et A. itaconicus.
Les mêmes expériences avec les sondes cad2b et c ont été réalisées mais aucune hybridation
entre ces sondes et l’ADNg d’A. itaconicus n’a été mise en évidence.
B. Essais d’hybridation par « Southern-Blot »
Après avoir montré que le gène codant pour la CAD était potentiellement présent chez
A. itaconicus, nous avons poursuivi l’étude par des expériences d’hybridation par « Southern-
Blot ». Cette étude permettra de déterminer la taille du fragment de restriction d’ADNg
d’A. itaconicus sur lequel est présent le gène codant potentiellement pour la CAD. De plus,
les résultats de cette étude permettront, ensuite, de cloner le gène recherché.
L’ADNg d’A. terreus et d’A. itaconicus a été digéré par trois endonucléases de restriction :
BamHI, EcoRI, HaeIII. Les sondes utilisées sont les fragments cad1, 2a, b et c marqués à la
DIG.
Les résultats de l’hybridation entre l’ADNg d’A. itaconicus et les sondes cad1 et cad2b sont
présentés dans la figure 48.
137
Nous observons, d’une part, que la sonde cad1 s’hybride avec l’ADNg natif et les fragments
de restriction d’A. terreus de 8000, 6000, 5000 et 3800 pb digérés par BamHI et de 7000,
5500, 4500 et 3800 pb digérés par EcoRI (Figure 48B). D’autre part, nous observons que
l’ADNg d’A. itaconicus s’hybride avec la sonde cad1 sur de nombreux fragments de
restriction digérés par BamHI, EcoRI et HaeIII (Figure 48B, entouré en blanc). Ceci peut-être
dû à une hybridation aspécifique entre cette sonde et l’ADNg d’A. itaconicus.
Figure 48 : Hybridation par « Southern-Blot » de la sonde cad1 (B) et cad2b (D) avec l’ADN génomique d’A. itaconicus A et C : Fragments de restriction séparés sur gel d’agarose avant transfert
B et D : Photographies de la membrane de nylon après révélation
M1 : Marqueur de taille 100 pb et M2 : Marqueur de taille 1 kb
138
D’après la figure 48D, la sonde cad2b s’hybride avec l’ADNg natif et les fragments de
restriction d’A. terreus de 8000 et 3500 pb après digestion par BamHI et EcoRI,
respectivement. De plus, la sonde cad2b s’hybride avec l’ADNg d’A. itaconicus coupé par
BamHI et EcoRI mais pas par HaeIII (Figure 48D, entouré en blanc).
L’hybridation entre les sondes et les fragments de restriction d’A. terreus digérés par HaeIII
s’est avérée difficile. Ceci peut s’expliquer par le fait que les fragments de restriction sont de
faible taille et nombreux.
Aucune hybridation croisée avec les autres sondes utilisées comme témoin n’est observée.
De même, ces essais ont été réalisés avec les sondes cad2a et cad2c mais aucune hybridation
de l’ADNg d’A. itaconicus avec ces sondes n’a été mise en évidence.
Cette étude permet de mettre en évidence que la sonde cad1 s’hybride avec l’ADNg
d’A. itaconicus digéré par BamHI sur un fragment d’environ 7000 pb et avec l’ADNg digéré
par EcoRI sur un fragment d’environ 3800 pb. La sonde cad2b s’hybride avec l’ADNg
d’A. itaconicus digéré par BamHI sur un fragment d’environ 7000 pb et elle est coupée par
la présence d’un site EcoRI formant un fragment de 5500 pb et un de 4000 pb.
Les résultats d’hybridation par « Southern Blot » permettent de proposer une localisation du
gène codant potentiellement pour la CAD chez A. itaconicus. Le schéma est présenté dans la
figure 49.
139
Par ces expériences d’hybridation (« Dot-Blot » et « Southern Blot »), il est mis en évidence
que les sondes cad1, cad2a et cad2b s’hybrident avec l’ADNg d’A. itaconicus digéré ou non
par les enzymes de restriction BamHI, EcoRI et HaeIII. Ces résultats confirment l’homologie
de séquence entre le gène CAD1 d’A. terreus et celui d’A. itaconicus et que les séquences
homologues sont situées sur un fragment de restriction BamHI de 7000 pb chez A. itaconicus.
Afin d’isoler et caractériser ce gène une mini-banque d’ADNg d’A. itaconicus est réalisée.
IV. Construction d’une mini banque d’ADNg d’A. itaconicus
Nous disposons d’un certain nombre d’éléments pour la recherche du gène codant pour la
CAD chez A. itaconicus. Le criblage est simplifié par la construction d’une mini-banque
d’ADNg de cette souche. Pour cela, l’ADNg d’A. itaconicus est digéré par BamHI et seuls les
fragments de restriction (insert) compris entre 6000 et 8000 pb (Figure 50) sont retenus afin
de cloner le fragment recherché dont la taille approximative a été évaluée à 7000 pb.
La construction de la mini-banque est faite dans le plasmide pGEM-4Z au site BamHI et par
électroporation d’E. coli E. cloni 10G®.
Figure 49 : Localisation schématique des sondes cad1 et cad2b et du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus après digestion par BamHI ou par EcoRI Les rectangles blancs représentent les sondes cad1 et 2b ; les rectangles bleus représentent le gène codant pour la CAD
140
Après transformation, les bactéries sont étalées sur milieu sélectif.
Nous n’obtenons que 15 clones dont 2 bleus (les clones bleus sont marqués par un
astérisque*) nommés : 3c, 4b1*, 4b2, 4d, 5a, 5c, 8c, 8d, 10b, 10c1, 10c2, 10c3*, 10d1, 10d2 et
10d3. Le nombre de bactéries recombinantes obtenu est très faible. En effet, la taille du
génome d’A. terreus étant de 23 Mb minimum (NCBI, Genome, ID 53, 2012), nous pouvons
considérer que nous aurions dû obtenir au moins 3300 clones pour A. itaconicus.
Malgré le peu de clones obtenu, nous poursuivons leur analyse. Une digestion enzymatique
par BamHI est réalisée sur chacun des vecteurs recombinants isolés et purifiés. Les profils de
restriction sont présentés dans la figure 51 (A et B).
Figure 50 : ADNg d’A. itaconicus coupé par BamHI et localisation de la zone 6000-8000pb découpée M : Marqueur de Taille 1 kb A et B : ADNg d’A. itaconicus coupé par BamHI en duplicate
8000 pb 6000 pb
4000 pb
2500 pb
M A B
Zone d’intérêt
141
Figure 51 : Profil de restriction des vecteurs recombinants contenant le fragment d’ADNg d’A. itaconicus codant potentiellement pour la CAD N : Natif ; C : Coupé par BamHI ; M : marqueur de taille 1 kb
M 3c 10d3 10c1 4d 4b1 8c 10d2 M MT
A
N C N C N C N C N C N C N C
10 000 pb
8 000 pb 6 000 pb
3 000 pb 2 500 pb
10b 4b2 10c3 10d1 5a 8d 10c2 5c M
B
N C N C N C N C N C N C N C N C
10 000 pb
8 000 pb 6 000 pb
3 000 pb 2 500 pb
142
Nous notons la présence de faux positifs (4b1, 8c, 4b2, 10c3, 10d1, et 8d) dépourvus d’insert.
Ces clones ne sont donc pas utilisés pour la recherche du gène codant pour la CAD chez
A. itaconicus.
Les ADNpl extraits des clones 3c, 10d3, 10c1, 4d, 10d210b, 5a, 10c2, et 5c, présentent tous,
après coupure par BamHI, une bande d’ADN d’une taille comprise entre 2500 et 3000pb
correspondant au plasmide pGEM-4Z linéarisé (2746pb) ainsi qu’un fragment d’ADN de
taille comprise entre 6000 et 9000pb correspondant à l’insert.
Le tableau 12 présente la taille de l’insert obtenu pour chacun de ces clones.
Nom des clones Taille approximative de l’insert (pb)
10b 5500
5a 7000
10c2 6500
5c 8000
3c 9000
10d3 8000
10c1 6000
4d 6500
10d2 8000
Tableau 13 : Taille approximative des inserts (pb) obtenus pour chaque clone
Après cette vérification, l’ADNpl non digéré des clones 10b, 5a, 10c2, 5c, 3c, 10d3, 10c1, 4d et
10d2 , est analysé par « Dot-Blot » afin de mettre en évidence le ou les clone(s) contenant le
gène codant pour la CAD chez A. itaconicus par hybridation avec la sonde cad2b, qui présente
moins d’aspécificité que la sonde cad1.Les résultats sont présentés dans la figure 52.
143
La présence de deux tâches au niveau des molécules d’ADN recombinées non diluées des
clones 5c et 10c1, entourées en noir sur la figure 52B, est mise en évidence.
Par contre, aucune tâche caractéristique d’une hybridation entre la sonde cad2b et l’ADN
recombiné dilué n’est observée.
Par ailleurs, la sonde cad2b marquée s’hybride bien avec la sonde cad2b non marquée et ne
s’hybride pas avec le plasmide pGEM-4Z.
Les clones 5c et 10c1 présentent donc une forte homologie de séquence avec la sonde cad2b
issue du gène CAD1 d’A. terreus.
Fort de ces résultats, nous avons alors souhaité faire séquencer les inserts contenus dans ces
deux clones. Le séquençage, réalisé par la société Genoscreen, est actuellement en cours.
Grâce à cette étude et pour la première fois, une homologie de séquence entre les souches
A. terreus NRRL 1960 et A. itaconicus NRRL 161 est mise en évidence. A. itaconicus
NRRL 161 porte potentiellement un gène codant pour la CAD mais seuls les résultats du
séquençage pourront confirmer cette hypothèse.
Figure 52 : Hybridation de la sonde cad2b marquée à la DIG avec l’ADNpl extrait des clones contenant potentiellement le gène codant pour la CAD chez A. itaconicus A : Schématisation des dépôts d’ADN sur la membrane de nylon ; B : Photographie de la membrane de nylon après révélation et agrandissement des deux tâches observées
A B
144
Cependant, le gène codant pour la CAD ne semble pas être l’unique gène impliqué dans la
production d’acide itaconique. En effet, il est également décrit que la production d’acide
itaconique pourrait être régulée par un ensemble de gènes comprenant notamment un gène
codant potentiellement pour une protéine qui assurerait le transport d’acide carboxylique de la
mitochondrie vers le cytoplasme (et inversement), un gène codant pour un transporteur de
petites molécules qui pourrait éventuellement être le transporteur de l’acide itaconique, ainsi
qu’un facteur de transcription spécifique aux champignons régulant l’activité de ces trois
gènes (Li et al. 2011). L’étude des gènes régulant la production d’acide itaconique n’étant
qu’à leur début, ceci suggère fortement que cette production pourrait être améliorée grâce à la
compréhension de la régulation des gènes contrôlant cette production
Dans cette étude, il a également été mis en évidence que le gène codant pour la CAD est
présent chez A. terreus NRRL 1960 et que sa séquence est similaire à 99% à la séquence du
gène CAD1 publiée chez A. terreus IFO 6365 et son mutant TN-484 par Kanamasa et al.
(2008). Face à ces résultats une question subsiste : pourquoi la souche A. terreus NRRL 1960,
possédant le gène codant pour la CAD, n’est-elle pas capable de produire d’acide itaconique
par fermentation solide ? Il est décrit que, lors de la production de lovastatine par une souche
d’A. terreus, le taux d’expression de gènes régulant cette production (lovE et lovF) est
augmenté en fermentation solide par rapport à la fermentation liquide. (Barrios-Gonzalez
et al. 2008). Nous pouvons supposer que ceci pourrait être l’inverse dans cette étude.
En effet, il est possible que, dans notre cas, la transcription du gène codant pour la CAD soit
inhibée en milieu solide. Pour approfondir cette hypothèse, il serait utile de vérifier
l’expression des ARN messagers et de la protéine CAD chez A. terreus NRRL 1960 afin de
déterminer si l’absence de production d’acide itaconique par cette souche est due à un défaut
de transcription ou de traduction bloquant la synthèse protéique.
Par ailleurs, il a été montré que la production d’amylases avec A. oryzae par fermentation
solide ne semble pas régulée par le même gène que celui contrôlant cette production par
fermentation liquide (Hata et al. 1997). Nous pouvons supposer que la culture
d’A. terreus NRRL 1960 sur milieu solide induit l’activation de gène régulant la production
d’acide fumarique. Ainsi, il serait intéressant de comparer l’expression de gènes impliqués
dans la production de cet acide en fermentations liquide et solide, grâce à la technique de
puces à ADN.
CONCLUSION GENERALE
et PERSPECTIVES
146
A mon arrivée au Laboratoire de Microbiologie Industrielle, la fermentation en milieu solide
(FMS) était largement utilisée pour la production d’enzymes (glucoamylases, xylanases,
protéases). Une nouvelle application venait de voir le jour, en relation avec le programme
PENTORAF, et consistait, initialement, à étudier la production d’acide itaconique par des
souches sauvages d’Aspergilli par FMS, dans le but de déterminer si la technique de FMS
était ou non susceptible d’être concurrentielle avec les autres procédés de production
existants.
Le sujet était novateur et ambitieux. Dans la littérature scientifique, un seul brevet avait été
publié sur la production d’acide itaconique par FMS et ces travaux avaient été réalisés avec
une souche mutée d’A. terreus, les autres études ayant été effectuées par fermentation liquide.
Pour mener à bien ce projet, deux espèces d’Aspergilli décrites pour produire l’acide
itaconique ont été retenues : A. terreus et A. itaconicus. Peu d’études étaient publiées sur la
croissance de ces champignons sur substrats ligno-cellulosiques tels que le son de blé pour la
production d’acides organiques. L’objectif était double. Il fallait, d’une part, sélectionner une
souche capable de produire de l’acide itaconique par FMS et, d’autre part, évaluer quels
facteurs influençaient sa croissance ainsi que sa production d’acide itaconique afin de
l’améliorer pour être compétitif par rapport à la fermentation en milieu liquide.
Dans un premier temps, nous avons réalisé un criblage de sept souches sauvages d’Aspergilli
décrites dans la littérature pour produire de l’acide itaconique par fermentation liquide :
Aspergillus terreus NRRL 265, 680, 1960, 1961, 1963 et 1969 ainsi qu’Aspergillus itaconicus
NRRL 161. Ceci a permis de mettre en évidence qu’A. itaconicus NRRL 161 est la meilleure
souche productrice d’acide itaconique par FMS. Cette souche a donc été sélectionnée pour les
travaux d’amélioration de la production d’acide itaconique.
Nous avons ensuite fait varier différents paramètres de culture (pH, humidité initiale,
température, quantité de son de blé, maintien du milieu à pH acide, ajout de tampons ou
solutions acides, type de substrat), différents facteurs nutritionnels (source de carbone et
d’azote, concentration en saccharose) ainsi que le type d’inoculum (mycélium ou suspension
de conidies). Grâce à ces essais, il a été mis en évidence que la meilleure production de
6,77 mg d’acide itaconique/g de matière sèche est obtenue sur un milieu composé de 10 g de
son de blé acidifié par une solution d’acide nitrique à pH 3, humidifié à 60% par une solution
147
de saccharose à 400 g/L après 4 jours de culture à 30°C et inoculé par 4 mL de mycélium,
préalablement cultivé en milieu liquide pendant 3 jours. Bien que faible, ce résultat montre
que l’utilisation de la FMS pour la production d’acide itaconique est possible mais que ce
procédé n’est pas concurrentielle par rapport à la FML. Cependant, cette production peut être
encore améliorée. En effet, nous avons montré que l’utilisation d’un inoculum végétatif
(mycélium) permettait de doubler la production d’acide itaconique par rapport à l’utilisation
d’une suspension de conidies comme inoculum. L’utilisation de mycélium semble donc être
une piste très intéressante dans l’amélioration du procédé de production. Les étapes
d’amélioration qui ont été réalisées avec une suspension de conidies comme inoculum devront
être reproduites en ensemençant le milieu avec du mycélium (taux d’humidité, pH,
température d’incubation, source de carbone et d’azote). Des études ont également montré
que l’apport d’éléments tels que le fer, le cuivre, le zinc et le manganèse augmente la
production d’acide itaconique par fermentation liquide (Li et al. 2012), nous pourrions
évaluer leur influence sur cette production par FMS. De plus, la mutation de la souche
A. itaconicus NRRL 161 par un traitement chimique (NTG) ou une méthode physique (UV)
permettrait de sélectionner un mutant hyper-producteur d’acide itaconique comme l’a réalisée
l’équipe de Yahiro (1995) pour améliorer la production de cet acide.
Lors du criblage, nous avons également montré, de façon inattendue, que la souche A. terreus
NRRL 1960, largement utilisée pour la production d’acide itaconique par fermentation
liquide, ne semblait pas capable de produire cet acide dans les conditions de FMS testées.
Cependant, il a été mis en évidence, pour la première fois, qu’elle est capable de produire de
l’acide fumarique. La meilleure production est obtenue sur un milieu composé de 10 g
de son de blé, acidifié à pH 3 par une solution d’acide nitrique, humidifié à 70% avec de l’eau
osmosée et inoculé par une suspension de conidies (2.107 conidies/g de matière sèche) après
3 jours de culture à 30°C. Cette production s’est avérée très faible (0,44 mg/g de matière
sèche), toutefois, il est important de noter qu’initialement, ce n’était pas le but de la thèse,
c’est pourquoi nous n’avons pas poussé les investigations plus loin. Les essais ont donc été
réalisés uniquement dans des conditions de production d’acide itaconique. Cette particularité
mériterait pourtant d’être approfondie. Nous pourrions alors faire varier des paramètres de
culture (taux d’humidité, pH, température d’incubation, type de support - substrat) ainsi que
des facteurs nutritionnels (source de carbone et d’azote) afin de déterminer les éléments
148
nécessaires à la croissance de la souche A. terreus NRRL 1960 et d’améliorer sa production
d’acide fumarique.
Ces travaux constituent une des premières étapes de mise en place d’un procédé de production
à l’échelle industrielle. Après avoir déterminé, à l’échelle laboratoire, les paramètres
influençant la production d’acide itaconique mais aussi celle d’acide fumarique, il pourrait
être intéressant de réaliser des essais de production à plus grande échelle. Pour cela, nous
disposons, au sein de notre laboratoire, d’un fermenteur pilote possédant une capacité de
substrat de 20 kg. Cet outil permettrait de faire la mise au point de cultures en gros volumes et
de régler les paramètres culturaux pour essayer de retrouver des taux de production similaires
aux essais réalisés à l’échelle laboratoire.
Après avoir montré la production d’acide itaconique par A. itaconicus NRRL 161, nous avons
émis l’hypothèse que cette souche exprime la Cis-Aconitic Acid Decarboxylase (CAD) et
qu’elle possède donc le gène codant pour cette enzyme. Des travaux réalisés par l’équipe de
Kanamasa (2008) ont permis d’isoler et de séquencer, chez A. terreus, le gène codant pour la
CAD, enzyme clé pour la production d’acide itaconique. Ces travaux nous ont servi de base
pour la recherche du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus NRRL 161.
Jusqu’à présent, aucune étude concernant le génome n’a été réalisée chez A. itaconicus
NRRL 161. Dans ces travaux, nous avons mis en évidence, pour la première fois, la présence
potentielle du gène codant pour la CAD chez cette souche par homologie de séquence avec
des sondes issues du gène CAD1 d’A. terreus. Le séquençage, actuellement en cours de
réalisation, nous permettra de vérifier la présence de ce gène chez A. itaconicus NRRL 161.
Si nous parvenons à séquencer le gène codant pour la CAD chez cette souche, il pourrait être
intéressant de l’exprimer chez A. niger comme l’a réalisée l’équipe de Li (2012) avec le gène
codant pour la CAD isolé à partir d’A. terreus afin d’étudier la production d’acide itaconique.
A. niger, largement utilisé en FMS, présente l’avantage de produire de l’acide citrique,
précurseur de l’acide itaconique, en grande quantité. Cette moisissure, non pathogène pour
l’Homme comme le traduit son statut GRAS (Generally Recognized As Safe), est un
microorganisme hôte attractif (Lubertozzi et Keasling 2009).
149
L’ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence, pour la première fois, que :
l’utilisation de la fermentation en milieu solide est une voie possible pour la
production d’acide itaconique et d’acide fumarique avec les souches A. itaconicus
NRRL 161 et A. terreus NRRL 1960 respectivement et nous encourage à poursuivre
les essais d’amélioration de ces productions
la souche A. itaconicus NRRL 161 possède potentiellement le gène codant pour la
CAD et si le séquençage permet de confirmer la présence de ce gène, celui-ci pourrait
être exprimé chez d’autres micro-organismes, possédant le statut GRAS, qui seront
ensuite testés pour la production d’acide itaconique par fermentation en milieu solide.
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ANNEXES
158
ANNEXE 1
Composition du son de blé : (d’après l’analyse technique fournie par le groupe Soufflet)
Pourcentage de matière sèche
Matières minérales 5,73
Protéines 18,34
Cellulose 13,23
Amidon 13,1
Sucres totaux 7,9
159
ANNEXE 2
Composition de la pulpe de betterave : (Coughlan, Considine et al. 1986)
Pourcentage de matière sèche
Cendres 3-4
Protéines 8-11
Lignine 3-4
Cellulose 22
Hémicellulose 24-32
Pectine 24-32
Glucides
Glucose 25
Galactose 5
Mannose 1
Rhamnose 1,3
Arabinose 20,1
Xylose 1,3
