Développement d’une stratégie d’inhibition

de la 4’-Phosphopantétheinyl transférase

(PPTase) impliquée dans la synthèse d’acides

mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis.

Projet de recherche

BENOIT Christelle BRIHOUM Meryem

Année universitaire 2006/2007

Projet tutoré par DEMANGE Pascal

RÉSUMÉ

La tuberculose est une maladie transmise par l’intermédiaire d’une bactérie :

Mycobacterium tuberculosis. De nombreux traitements existent mais les bactéries acquièrent

une résistance naturelle envers ces médicaments. Dans ce projet de recherche, nous avons

voulu cibler une voie nécessaire à la virulence de la paroi de cette bactérie : la voie de

synthèse des acides mycoliques, et plus particulièrement l’enzyme multi-domaine qui réalise

la dernière étape de condensation, la polykétide synthase 13 (Pks13) qui fait l’objet de

nombreuses études. Des approches par domaines ont montré une difficulté à la cristalliser.

Cette enzyme nécessite une modification post-traductionnelle, afin d’être active : la

phospantethéinylation réalisée par la phosphopantethéinyl transferase qui catalyse le transfert

du bras P-pant du CoenzymeA sur les domaines ACP de Pks13. Il a été montré qu’une

inhibition de l’activation de Pks13 entraîne la mort de M. tuberculosis. C’est la raison pour

laquelle PptT constitue une cible judicieuse pour le criblage d’inhibiteurs.

Pour cela, dans un premier temps nous produirons ACP et PptT recombinantes.

Ensuite nous mettrons au point un test d’activité de la PptT pouvant être miniaturisable afin

de cribler à haut-débit des inhibiteurs. A long terme, cette étude pourrait permettre de trouver

de nouveaux traitements anti-tuberculeux.

ABBRÉVIATIONS

ACP : Acyl Carrier Protein

acpS : gène acpS

AcpS : protéine AcpS

ARN : Acide RiboNucléotide

AT : Acyl transferase

CCM : chromatographie en couche mince

cm : centimètre

CoA : Coenzyme A

DMACA : 7-diméthylaminocoumarin-4-acetic acid

E. Coli : Escherichia Coli

FAS : Fatty Acid Synthase

GC : chromatographie en phase gazeuse

GFP : Green Fluorescent Protein

GST : Gluthation S transférase

His : Histidine

HPLC : Hight Pressure Liquid Chromatography

kDa : kilodalton

KO : knockout

KS : β-keto-acyl synthase

M : molaire, mole par litre

Mtb : Mycobacterium tuberculosis

nm : nanomètre

NTA : Nitriloacétique

pb : paire de base

PCR : Polymerase Chain Reaction

Pks13 : Polykétide synthase 13

P-pant : Phosphopantethéinyl

PPTase : Phosphopantethéinyl transférase

pptT : gène pptT

PptT : protéine PptT

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

TE : thioesterase

UV : Ultra-violets

SOMMAIRE

RÉSUMÉ

ABBRÉVIATIONS

I) INTRODUCTION ...............................................................................................................1

1) La tuberculose .....................................................................................................................1

2) Mycobacterium tuberculosis ................................................................................................1

3) Synthèse des acides mycoliques .........................................................................................2

4) Pks13 ....................................................................................................................................3

5) Modification post-traductionnelle et PPTase ...................................................................4

6) Traitements anti-tuberculeux ............................................................................................6

II) RESULTATS .....................................................................................................................7

1) Expression de domaines de Pks13 : Thèse Stéphanie Cabantous ..................................7

2) Caractérisation d’une transférase : Chalut C. et al. .......................................................9

III) PROJET DE RECHERCHE .........................................................................................13

1) Production et purification de PptT et des domaines ACP de Pks13 ............................14

2) Test de l’activité enzymatique de PptT ...........................................................................15

3) Criblage à haut débit d’inhibiteurs de PptT ..................................................................17

4) Validation de la cible ........................................................................................................18

IV) CONCLUSION ET PERSPECTIVES .........................................................................20

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................21

I) INTRODUCTION

1) La tuberculose

La Tuberculose est une infection bactérienne pouvant toucher de nombreux organes :

voies respiratoires, système nerveux, voies cardio-vasculaires. L’agent pathogène responsable

est une bactérie nommée Mycobacterium tuberculosis (Mtb) découverte par Robert Koch en

1882 qui infecte uniquement l’Homme. Cette maladie est en recrudescence dans le monde à

savoir une nouvelle infection chaque seconde. Un tiers de la population mondiale est

actuellement infecté ; 22 pays dans le monde concentrent à eux seuls 80% des cas. Cette

maladie fait aujourd’hui encore plusieurs victimes : 1,7 million de personnes sont mortes de la

tuberculose et 8,5 millions de nouveaux cas chaque année [données OMS 2006].

2) Mycobacterium tuberculosis

Mtb est un bacille qui ne se colore pas facilement et qui est dit « acido-alcoolo-

résistant ». C’est une mycobactérie entourée d’une paroi riche en acides gras complexes

rendant cette dernière peu perméable aux substances hydrophiles et naturellement résistante

aux agents anti-tuberculeux. Son enveloppe est constituée de trois couches de constituants liés

par des liaisons covalentes : le peptidoglycane, l’arabinogalactane et les acides mycoliques

(Figure 1) [Daffe et Draper, 1998 ; McNeil et Brennan, 1991].

Membrane

Paroi

Acides mycoliques

Membrane

Paroi

Acides mycoliques

Figure 1 : Structure de la paroi de Mtb.

Membrane lipidique

Peptidoglycane

Porine

Acyls gras

Acides mycoliques

Arabinogalactane

Lipoarabinomannane

1

3) Synthèse des acides mycoliques

La particularité de la paroi de ces bactéries réside dans la présence d’acides

mycoliques. Ce sont des acides gras particuliers constitués d’un acide β-hydroxylé et une

longue chaîne carbonée (60-90 carbones). Leur voie de biosynthèse est complexe et se

déroule en 6 étapes (Figure 2) [Barry, Lee et al. 1998]. Tout d’abord, la polyenzyme FAS I

(Fatty Acid Synthase I) synthétise les acides gras précurseurs à partir d’acétyl-CoA et de

malonyl-CoA. L’élongation de la chaîne d’acides gras se fait par un complexe protéique FAS

II : AcpM, KasA, KasB, InhA, MabA, FabD, AccB à partir de Malonyl-CoA pour former

l’acide α-méromycolique. Ensuite ce dernier va être modifié par l’ajout d’insaturations cis

grâce à deux Désaturases. Les enzymes CMAS-1, CMAS-2 et deux SAM vont remplacer ces

doubles liaisons par des groupes cyclopropanes qui contribuent à l’intégrité de la paroi de la

cellule et confèrent à la bactérie une protection contre le stress oxydatif [Takayama, Wang et

al. 2005]. L’étape de condensation de l’acide méromycolique avec un acyl-CoA à 26

carbones est réalisée par la polykétide synthase 13 (Pks 13) [Portevin et al., 2004]. Enfin, une

réductase va hydroxyler le groupement carboxyle de la chaîne néoformée.

Figure 2 : Voie de biosynthèse des acides mycoliques. L’enzyme FAS I va synthétiser un acyl-CoA à partir de malonyl-CoA et d’acétyl-CoA. Le complexe enzymatique FAS II va allonger la chaîne d’acides gras néoformée. Deux désaturases vont apporter les insaturations. Pks13 va permettre la condensation de l’acide α-méromycolique préformée avec un acyl-CoA. Une réductase va réduire l’acide gras formé en acide mycolique.

Pks13

2

Les polykétides synthases impliquées dans la synthèse d’acides mycoliques, essentiels à la

virulence de Mycobacterium tuberculosis, sont des cibles envisageables pour le

développement de nouveaux anti-tuberculeux.

Les médicaments ciblant la voie de synthèse des acides mycoliques inhibent les enzymes

FAS (voir paragraphe 6)). Les mycobactéries ont acquis des systèmes de résistance leur

permettant d’échapper à leur actions. En effet, elles subissent des mutations au niveau des

gènes codant pour les cibles pharmacologiques entraînant la non-reconnaissance des drogues

(Veziris, et al 2005). C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de nous intéresser à la

protéine responsable de la modification post-traductionnelle de la protéine.

4) Pks13

Nous allons nous intéresser à l’enzyme impliquée dans l’étape de condensation de la

chaîne méromycolique, la polykétide synthase 13 (Pks13). Il s’agit d’une protéine multi-

domaines (Figure 3) de type I, c'est-à-dire que les domaines se trouvent sur la même chaîne

polypeptidique, composée de 1733 acides aminés et d’un poids moléculaire de 186 kDa dont

la localisation cellulaire n’est encore pas élucidée. Dans la partie N-terminale (aa 16-91) de la

protéine, le domaine Acyl Carrier Protein (ACP) est le domaine sur lequel va venir se fixer la

chaîne méromycolique via une liaison faisant intervenir un soufre après avoir été

« sélectionné » et transférer par le domaine Acyl transferase (AT, 305 aa) [Takayama, Wang

et al. 2005] (Figure 4). Un domaine identique, situé entre les acides aminés 1228 et 1276,

intervient également pour la fixation de l’acyl CoA à 26 carbones. Après l’ancrage des deux

chaînes, la délocalisation de l’acide méromycolique sur le domaine β-keto-acyl synthase (KS,

422 aa) va permettre la réaction de décarboxylation et donc de condensation pour former

l’acide mycolique après réduction. Enfin un dernier domaine est présent sur la chaîne

peptidique au niveau de l’extrémité C-terminale, il s’agit du domaine thioesterase (TE, 75aa)

qui catalyse la libération du produit.

ACP KS AT ACP TEN C

15 aa 28 aa 172 aa 210 aa 217 aa 166 aa

76 aa 422 aa 304 aa 49 aa 74 aa

Figure 3 : Localisation et taille des différents domaines catalytiques présents sur la protéine Pks13 par analyse bioinformatique. ACP : Acyl Carrier Protein ; KS : β-keto-acyl synthase ; AT : Acyl transferase ; TE : thioesterase. On note 2 domaines ACP1 et ACP2 situés en N-terminal et en C-terminal de Pks13 respectivement

3

Des essais de cristallographie ont été tentés sur cette protéine sans aucun résultat.

L’hypothèse serait que la majorité de cette protéine, comme la plupart des protéines de

Mycobaterium tuberculosis qui sont exprimées chez E. Coli, serait localisée dans des corps

d’inclusion. Ainsi, une approche par domaine a été réalisée afin d’obtenir les domaines de

Pks13 solubles et cristallisables et de pouvoir remonter jusqu’à la structure de la protéine

entière [thèse Stéphanie Canbantous, 2005].

Pour trouver ces domaines solubles, l’approche du « domaine trapping » a été utilisée. Il s’agit

d’une stratégie de fragmentation de la protéine entière suivi d’un criblage de solubilité par la

méthode du Split-GFP. Les fragments ainsi obtenus ont été séquencés et superposés à la

séquence de la protéine Pks13. La démarche ainsi que les résultats seront développés dans la

partie « résultats ». Les auteurs espèrent donc pouvoir cristalliser ces domaines et avoir accès

à la structure de la protéine. Les domaines ACP de Pks13 ont été purifiés associés à d’autres

domaines (KS ou TE). Des études ont été menées sur ce domaine ACP et il a été montré qu’il

subit une modification post-traductionnelle : la 4’-phosphopantéthéinylation.

5) Modification post-traductionnelle et PPTase

Mycobacterium tuberculosis contient environ 20 enzymes qui requierent une

activation afin d’être fonctionnelles. Les domaines ACP des acides gras synthases (FAS) et

ACP ACP ACP ACP

ACP ACP ACPACP

ACP ACP ACP ACP

ACP ACP ACPACP

Figure 4 : Etape de condensation et de réduction lors de la synthèse d’acides mycoliques par Pks13. (1) : liaison de la chaîne d’acides gras préformée (α-Meroacyl-AMP) sur le domaine ACP1 activée de Pks13. Un acyl CoA (2-Carboxyl-C26-S-CoA) se fixe sur l’ACP2. (2) : délocalisation de l’acide méromycolique greffée du domaine ACP1 sur la Sérine du domaine KS. (3-4) : condensation (-CO2) et réduction (+2H) des deux chaînes.

4

des polykétides synthases (Pks), et notamment Pks13, subissent une modification post-

traductionelle afin de passer d’une forme inactive (apo-ACP) en forme active (holo-ACP).

Cette modification se fait au niveau de la sérine (55 pour le premier domaine ACP, 1266 pour

le deuxième) conservée d’un motif GX(D/H)S(L/I)(D/K) par une 4’-phosphopantethéinyl

transferase (PPTases) [Mofid et al., 2002]. Cette dernière va catalyser le transfert du

groupement 4’-phosphopantethéine du coenzyme A (CoA) [Lambalot et al ; 1997] par une

attaque nucléophile du groupement hydroxyle de la sérine vers le lien 5’-β-pyrophosphate du

coenzyme A (Figure 5). Cette réaction est magnésium-dépendante [Lambalot et al ; 1996] et

fait intervenir deux substrats, le Coenzyme et le domaine ACP.

Les PPTases sont classées en 2 groupes en fonction de leur séquence primaire et de

leurs substrats : les AcpS et les Sfp [Reuter et al ; 1999]. Les AcpS ont une taille de 120

acides aminés, sont hétérotrimères et sont impliquées dans la modification des enzymes FAS ;

alors que les Sfp (PptT), découvertes chez Bacillus subtilis, ont une taille de 240 acides

aminés, agissent en monodimère et sont impliquées dans la modification des Pks de type I et

donc de Pks13.

Il a été montré qu’une délétion du gène codant pour l’enzyme PptT (Rv2794) chez

Mtb abolissait la synthèse d’acides mycoliques ce qui démontrerait que Pks13 serait un

substrat de PptT. La mutation a de plus entraîné la mort de la bactérie, ce qui suggère un rôle

essentiel de cette enzyme pour la viabilité de la bactérie [Chalut et al. ; 2005]. Les résultats de

cette publication seront repris dans le chapitre « résultats ».

Figure 5 : Activation de l’apo-carrier protéine en holo-carrier protéine. La 4’-phospantethéinyl transferase (PPTase) va transférer le groupement 4’-Phospho-pantethéine (bras P-pant) du CoenzymeA sur le groupement OH de la Sérine du domaine ACP, entraînant un incrément de masse de 340 unités de masse (holo-carrier protéine). Cette réaction est magnésium dépendante etentraîne une libération de 3’,5’-ADP.

5

De part ces observations, il s’avère que PptT est une cible très intéressante dans la

découverte de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.

6) Mode d’action des antibiotiques anti-tuberculeux

De nos jours, il existe quatre antituberculeux principaux : l’isoniazide, la Rifampicine,

le Pyrazinamide et l’éthambutol [Veziris, Cambau et al. 2005]. Le traitement de la tuberculose

nécessite la prise quotidienne durant 6 mois de isoniazide et de rifampicine complémentés

durant les deux premiers mois des deux autres antibiotiques.

L’isoniazide (hydrazide de l’acide nicotinique) agit sur la synthèse des acides mycoliques en

inhibant une enzyme du complexe protéique FAS II, InhA impliquée dans l’élongation de la

chaîne d’acides gras et favorise la formation de radicaux libres toxiques pour la bactérie. Il

n’est actif que chez les mycobactéries. La rifampicine (famille des rifamycines) inhibe

l’initiation de la transcription en se fixant sur la sous-unité β de l’ARN polymérase empêchant

ainsi la synthèse protéique. Le pyrazinamide (dérivé du nicotinamide) n’est actif que sur deux

souches de Mycobacterium dont Mtb. Il nécessite un pH acide et une enzyme pour le

transformer en produit bactéricide l’acide pyrazinoïque qui agirait sur FAS I (synthèse des

acides gras précurseurs). La cible de l’éthambutol est une enzyme, l’arabinosyl transferase

intervenant dans la liaison arabinose-galactane. De ce fait, les acides mycoliques ne pourront

pas venir se lier sur le motif arabinogalactane (constituant de la paroi).

Les mycobactéries ont acquis des systèmes de résistance à ces antibiotiques dus aux

mutations des gènes codant pour leurs cibles. C’est la raison pour laquelle il serait

envisageable de cibler des protéines intervenant dans l’activation des enzymes essentielles à

la synthèse des acides mycoliques.

6

II) RESULTATS

1) Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basées sur

la GFP. Application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase Pks13

de Mycobacterium tuberculosis [thèse de l’Université Paul Sabatier Toulouse Cabatous,

2005].

La polyketide synthase 13 est une enzyme multi-domaine difficile à cristalliser. La

stratégie mise en place par les travaux de thèse de S. Cabantous a pour objectif de solubiliser

chaque domaine afin de pouvoir les cristalliser. Pour cela, elle a mis au point un test de

criblage de solubilité des protéines par la technique du Split-GFP.

Génération des domaines de Pks13

Après avoir amplifié le gène codant pour Pks13 (Rv3800) inséré dans le plasmide

pWM35 une digestion à la DNase I a été réalisée. Cette enzyme coupe généralement après des

bases pyrimidiques et ainsi, trois librairies de fragments ont été obtenus (librairie I contenant

les plus petits fragments 300-1500 pb, librairie II avec des fragments de 1000-3000 pb et la

librairie III comprenant les plus longs fragments 1500-400 pb). Ces trois librairies ont été

ensuite clonées dans des plasmides chez E. Coli afin de sélectionner les clones en phase.

Test de solubilité par la méthode du Split-GFP

La méthode du Split-GFP utilise la propriété de complémentation de fluorescence de

la Green Fluorescent Protein (GFP). Cette protéine a un poids moléculaire de 30 kDa et

comporte 11 feuillets β et une hélice α qui forme le chromophore. La GFP peut être clivée en

deux fragments, un qui contient les feuillets β 1 à 10 qui va pouvoir venir complémenter le

11ème feuillet β fusionné à une protéine (Figure 6).

7

Figure 6 : Principe du Split-GFP La protéine recombinante X est liée au petit fragment de la GFP (s11 : feuillet β 11) par un linker L. Si X est soluble alors s11 va se complémenter avec le grand fragment de la GFP (1-10 : feuillet β 1 à 10) co-exprimée, ainsi une émission de la fluorescence est visualisée. Si la protéine est agrégée (insoluble), la complémentation ne se fera pas et donc il n’y aura pas émission de fluorescence.

X Aggrégation

Cette méthode permet donc de tester la solubilité des protéines in vivo. Dans sa thèse, S.

Cabantous utilise cette méthode pour cribler les clones qui expriment les fragments de Pks13

solubles.

D’après la Figure 7, peu de fragments de la troisième librairie apparaissent fluorescents. Ceci

s’explique en partie par le fait que cette librairie contient les fragments les plus longs et donc

peu solubles.

Caractérisation des fragments

Après le criblage, les fragments solubles sont récupérés par PCR sur colonies et

séquencés puis alignés sur la séquence de Pks13 par bio-informatique (Figure 8).

Figure 7 : Criblage de solubilité utilisant le Split-GFP des trois librairies. Images de colonies cellulaires fluorescentes après complémentation des fragments de GFP pour les 3 librairies.

Figure 8 : Carte des domaines solubles de Pks13 obtenus après la méthode du domaine trapping. Alignement des fragments solubles criblés par Split-GFP et séquencés sur la protéine Pks13.

8

La carte des domaines solubles révèle une hétérogénéité, en effet, la plupart des fragments

sont alignés avec la partie C-terminale et plus particulièrement au niveau des domaines ACP2

et TE. Peu de fragments solubles correspondant au domaine KS ont été trouvés. Dans la partie

N-terminale, quelques fragments s’alignent avec la séquence du domaine ACP1.

L’approche de l’étude par domaine de Pks13 par Split-GFP a permis de montrer d’une

part que les domaines structuraux de Pks13 ayant une taille de plus de 100 acides aminés sont

peu solubles. D’ou la difficulté de cristalliser cette dernière. Des 2 domaines ACP, il en

résulte que celui situé dans la partie C-terminale présente une solubilité supérieure à celui

situé en N-terminal. Cette différence s’expliquerait par leur différence de taille : ACP2 (49

acides aminés) est plus petit que ACP1 (76 acides aminés). Dans notre projet, nous nous

intéresserons aux domaines ACP pouvant être produits chez E. Coli sous forme solubles et

plus particulièrement le domaine ACP2.

2) Rôles non redondants de deux 4’-phosphopantetheinyl transferases chez Mycobacteria

[Chalut et al., 2006]

La 4’-phosphopantéthéinylation est catalysée par l’enzyme PPTase (cf introduction).

Dans le génome de la souche M. tuberculosis H37Rv (Cole et al, 1998) deux gènes codant

pour des enzymes de ce type ont été identifiés : acpS et pptT. Cependant aucune étude sur le

rôle de chacune de ces enzymes n’a été entreprise chez Mycobacteria. Dans des travaux

publiés par Chalut et al. en 2006, les auteurs ont rapporté que des orthologues de ces deux

PPTases ont été trouvés dans le génome des espèces Corynebacterinea. Ils ont démontré

qu’elles sont essentielles pour la viabilité des mycobactéries et qu’elles présentent des

fonctions identiques chez les mycobacteries et les corynebacteries : AcpS est responsable de

la modification post-traductionnelle de Fas-I, alors que PptT active l’enzyme Pks13 ainsi que

des polykétides synthases de type I.

AcpS et PptT sont impliquées dans la biosynthèse des acides gras et des acides mycoliques

respectivement, chez C. glutamicum

Des expériences de chromatographie en phase gazeuse (GC) et de chromatographie en

couche mince (CCM) ont démontré que des mutations de acpS par knockout (KO) chez C.

glutamicum entraînait l’absence de synthèse d’acides gras en C16-C18 et de l’activation de

Fas-I alors que la synthèse d’acides mycoliques et l’activation de Pks13 n’étaient pas

9

affectées. Par contre, la délétion de pptT abolissait la synthèse d’acides mycoliques et

l’activation de Pks13, mais n’avait aucun effet sur la production d’acides gras et sur

l’activation de Fas-I. Ces résultats démontrent que Pks13 est un substrat de PptT et que AcpS

est responsable de l’activation de Fas-I.

PptT catalyse la 4’-Phosphopantethéinylation des Pks de type I chez M. tuberculosis

Les auteurs ont coproduit les protéines recombinantes de M. tuberculosis Pks13 et

PptT à partir des plasmides pMW35 et pLSfp respectivement sous le contrôle du promoteur

T7. La souche transformée est une souche bactérienne de E.Coli BL21ΔentD, mutée en

PPTase endogène susceptible d’activer Pks13. Afin de visualiser le transfert du groupement

prosthétique, un pool de coenzymeA a été radiomarqué avec du β−[β−14C]alanine. Un

plasmide pWM35γ, porte le gène qui code pour une protéine Pks13 dont les 2 résidus sérines

(S55 et S1266) responsables de l’attachement du groupement P-pant du coenzymeA, ont été

mutés par des résidus alanine. Lorsque ce mutant est co-exprimé avec PptT, Pks13 ne porte

pas le groupement P-pant radioactif (Figure 9). Ce résultat indique que les 2 résidus sérines

sont essentiels à l’attachement du groupement prosthétique.

Des expériences similaires sur d’autres Pks de type-I (Mas et PpsA-D) impliquées dans la

biosynthèse des lipides nécessaires à la virulence de M. tuberculosis ont permis de démontrer

qu’elles sont également activées par PptT.

Les auteurs démontrent qu’ils arrivent à produire la PptT et Pks13. De plus, ces expériences

permettent de mettre en évidence que Pks13 est un substrat de PpT chez M.tuberculosis.

PptT ne catalyse donc pas seulement l’activation de Pks13 mais de d’autres enzymes Pks de

type-I.

Figure 9 : Marquage de la 4’-Phosphopantetheinylation utilisant β-[β-14 C]alanine. Des extraits cellulaires de E .Coli ont été séparés par SDS-PAGE puis colorés au Bleu de Coomassie (gel du bas). Les flèches indiquent la présence de Pks13 à 186 kDa. Une autoradiographie a été réalisé afin de visualiser la radioactivité du bras P-pant au niveau de Pks13 (partie du haut). Pks13* : enzyme recombinante portant la mutation au niveau des 2 sérines S55 et S1266.

10

PptT est essentiel pour la viabilité de Mycobacterium Bovis

A présent, les auteurs ont voulu savoir si PptT serait essentielle à la survie d’une des

souches de M. tuberculosis. Pour cela, ils ont généré des mutants conditionnels ΔpptT d’une

souche du bacille M. bovis par knockout en utilisant le système d’expression TetR (Ehrt.S et

al ; 2005). Cette souche recombinante PMM99 (ΔpptT : pC-pptTmb) contient un plasmide de

complémentation pC-pptTmb codant pour le gène fonctionnel pptT de M. bovis sous le

contrôle du promoteur pmyc1tetO inductible à l’anhydrotetracycline (ATc). Les souches

sauvages WT et mutées PMM99 poussent normalement quand pptT est exprimé (+ATc)

(Figure 10) mais une inhibition de la croissance de PMM99 est observée en absence de pptT

(-ATc).

Ces résultats démontrent l’importance de pptT sur la viabilité des souches de M.

tuberculosis et que l’absence de pptT ne peut pas être complémentée par l’AcpS endogène.

Les auteurs proposent un modèle du métabolisme lipidique chez les mycobactéries et

les corynebactéries dans lequel AcpS est responsable des modifications post-traductionnelles

de Fas-I et de la sous-unité AcpM de FAS-II alors que PptT active de nombreuses polykétides

synthase de type-I impliquées dans la biosynthèse des lipides nécessaires à la virulence de M.

tuberculosis dont Pks13 (Figure 11). Les enzymes MbtB et MbtD-F, activées par PptT, sont

impliquées dans l’assemblement de mycobactines qui représentent des facteurs de virulence.

Ces résultats démontrent que les 2 PPTases ne sont pas redondantes et agissent sur des

répertoires de substrats différents.

L’intérêt d’inhiber la protéine PptT, dans ce projet de recherche, réside dans

l’importance du nombre de protéines qu’elle régule. De plus les mycobactéries ayant

développé des phénomènes de résistance aux antibiotiques (cf. introduction), il est judicieux

de cibler des modifications post-traductionnelles.

Figure 10 : Effet de la déplétion de PptT sur la croissance de M. Bovis Calmette-Guérin. Les souches sauvages WT et mutées PMM99 (ΔpptT : pC-pptTmb) ont été cultivées dans un milieu de croissance à 37°C pendant 20 jours supplémenté en anhydrotetracycline (+ATc) ou non (-ATc).

11

Figure 11

12

Figure 11 : Diagramme schématique du rôle de AcpS et PptT dans les voies de biosynthèses des acides gras, des acides mycoliques, des lipides contenant des méthyls branchés et des siderophores chez M. tuberculosis. Seules les protéines nécessitant une 4’-phosphopantethéinylation sont indiquées. Les protéines activées par PptT sont encadrées dans des rectangles et celles modifiées par AcpS sont encerclées. p-HBA : acide para-hydroxybenzoique ; SL-1 : sulfolipide ; PAT : polyacyltréhaloses.

III) PROJET DE RECHERCHE

Ce projet de recherche a pour objectif le développement d’une stratégie afin d’inhiber

l’activité post-traductionnelle de la 4’-Phosphopantétheinyl transférase (PPTase) impliquée

dans la synthèse d’acides mycoliques chez Mycobacterium tuberculosis à deux niveaux (FAS

I et Pks 13).

Tout d’abord, la protéine devra être produite dans un hôte où elle sera soluble et

active. La stratégie envisagée consistera à produire la protéine chez E. Coli. Chalut et al. ont

montré que la protéine recombinante produite chez E. Coli est fonctionnelle. Ensuite, un test

d’activité in vitro de la PPTase (PptT) sera mis en place en vue d’un criblage haut débit

d’inhibiteurs, en utilisant la réaction catalysée par cette enzyme, à savoir le transfert du motif

4’-p-pant du Coenzyme A, sur le domaine ACP de la polykétide synthase.

Production chez E.coli - domaines Acp-6His

- PptT-GST avec site de clivage à la thrombine

Purification des domaines ACP sur colonne Nickel NTA

de la PptT sur billes glutathion (achat sur catalogues)

Etapes de concentration ? (précipitation au sulfate d’ammonium, …)

Mise en place du test d’activité enzymatique avec le coenzymeA fluorescent

Miniaturisation du protocole du test d’activité sur plaques greffées avec NTA 96 puits

Criblage haut-débit plaques noires greffées avec NTA 384 puits avec chimiothèque du CNRS (3000 molécules)

Confirmation des inhibiteurs potentiels sur la protéine Pks13 en entière

Test de perméabilité de la paroi de M. tuberculosis

Détermination des paramètres biochimiques d’interactions

STRATEGIE EXPERIMENTALE

13

1) Production et purification de PptT et du domaine ACP2 de Pks13

Production et purification de PptT

Afin de produire l’enzyme d’intérêt, nous utiliserons le matériel et les conditions

utilisés par Chalut et al. en 2006. La séquence du gène d’intérêt pptT (Rv2794c) est

récupérée par PCR à partir de l’ADN génomique de la souche M. tuberculosis H37Rv. Le

gène est inséré dans un vecteur d’expression procaryote pET26b en aval d’un promoteur T7

inductible à l’IPTG. Afin de purifier la protéine recombinante PptT, une séquence codant pour

la GST (Glutathion S-transferase) sera clonée dans le vecteur de façon à se retrouver en C-

terminale de la PptT. Une séquence de coupure à la thrombine sera également insérée entre le

gène d’intérêt et le tag. La production s’effectuera dans une souche bactérienne d’expression

de E.Coli BL21. Après croissance bactérienne, induction et récupération du lysat cellulaire,

une étape de purification sera réalisée sur colonne glutathion.

Production et purification des domaines ACP de Pks13

De même que précédemment, les conditions de production des domaines ACP seront

identiques à celles utilisées par les travaux de Chalut. La séquence du domaine ACP2 sont

récupérées à partir du gène pks13 (Rv3800) par PCR à partir de l’ADN génomique de M.

tuberculosis H37Rv. Les fragments sont insérés dans un vecteur d’expression procaryote

pET26b en aval d’un promoteur T7. Ce vecteur contiendra une séquence codant pour un tag

6-His. La production s’effectuera dans une souche d’expression E.Coli BL21ΔentD dont la

PptTase endogène est mutée, évitant ainsi l’activation des domaines ACP produits. La

purification sera réalisée par colonne de Nickel-NTA. De même, que précédemment, nous

nous attendrons à obtenir une production de l’ordre de 20mg/L.

Afin de s’assurer que les protéines récupérées correspondent bien à celles attendues,

nous allons réaliser un gel SDS-PAGE où nous déposerons dans un puits les marqueurs de

poids moléculaire (PM), dans un autre puits le domaine ACP2 que nous détecterons à un PM

de 5,4 kDa et dans un dernier puits la PPTase attendue à un PM de 25 kDa.

14

2) Mise en place d’un test d’activité enzymatique de PptT

PptT catalyse le transfert du bras P-pant du CoA sur la Sérine du domaine ACP de

Pks13. Les études réalisées jusqu’à présent pour détecter le transfert de ce groupement

prosthétique repose sur l’utilisation de techniques basées sur la radioactivité et sur la HPLC

[Liu Q. et al.]. Cependant, en vue d’un criblage à haut-débit, il est difficile voire impossible

de les miniaturiser. A présent, il est nécessaire de mettre en place un test d’activité

enzymatique permettant de visualiser ce transfert. La littérature rapporte que seule une équipe,

Meier J.L. et Burkart M.D., ont développé un test basé sur la synthèse d’analogues du CoA à

partir d’analogues de groupements pantethéines fluorescents. Ils ont ainsi visualisé in vitro la

phosphopantethéinylation du domaine VibB de Vibriobacter cholerea par l’enzyme Sfp

(PPTase) de Bacillus subtilis. Nous allons appliquer cette technique à notre projet de

recherche, afin de détecter l’activité enzymatique de PptT.

Synthèse de l’analogue du Coenzyme A

L ’analogue du CoA fluorescent est produit suivant la voie de biosynthèse du CoA

chez E.Coli selon le modèle suivant (Figure 12) : un analogue de la pantethéine contenant un

groupement fluorescent est synthétisé chimiquement et incorporé dans la cellule bactérienne

qui va l’intégrer dans la voie de biosynthèse du Coenzyme A. Tout d’abord, l’enzyme CoaA

réalise la phosphorylation de la pantethéine, ensuite le CoaD greffe un AMP au niveau du

groupement phosphate, enfin le CoaE va phosphoryler l’extrémité 3’ de l’AMP greffé pour

obtenir un analogue du CoA fluorescent.

Figure 12 : Voie de biosynthèse du Coenzyme A chez E. Coli. L’enzyme CoaA va phosphoryler l’analogue du bras P-pant fluorescent incorporée dans la cellule bactérienne à partir de l’ATP endogène. Le CoaD va rajouter un ADP au niveau du groupement phosphate. Le CoaE va phosphorylé l’ADP précedemment greffé grâce à de l’ATP pour obtenir l’analogue du coenzyme A fluorescent.

fluorophore. 15

Cette voie de synthèse va être appliquée in vitro en apportant les enzymes nécessaires (CoaA,

CoaD, CoaE) et l’analogue de pantethéine. Ce dernier va être synthétisé par voie chimique en

utilisant comme groupement fluorescent l’acide 7-diméthylaminocoumarin-4-acétique

(DMACA) (Figure 13). Il a la particularité d’absorber la lumière à une longueur d’onde de

370 nm (UV) et d’émettre une fluorescence bleue à un longueur d’onde de 459 nm. Son

coefficient d’extinction molaire a une valeur d’environ 22000 cm-1.M-1.

Les enzymes CoaA, E recombinantes (données par Suzanne Jackowski) et CoaD (donnée par

D. Drueckhammer) ainsi que de l’ATP vont être rajoutées à l’analogue de la pantethéine

fluorescente pour former l’analogue du CoA (Figure 14) que nous allons utiliser par la suite.

Meier et al. en 2006 ont testé la fluorescence de nombreux composés et l’analogue ci-dessus

PEG2 Linked DMACA Pantoic semble présenter une intensité de fluorescence plus

importante que les autres après quantification.

Figure 13 : Analogue de la pantethéine fluorescente utilisé contenant un groupement Coumarine fluorescent et un linker PEG2. PEG2 Linked DMACA Pantoic.

Figure 14 : Analogue du CoA fluorescent utilisé. PEG2 Linked DMACA Pantoic.

16

Test enzymatique

La réaction enzymatique va être réalisée in vitro en incubant 1µM de domaines ACP,

25nM de PPTase, analogue du CoA, 10mM de MgCl2 dans du Tris/HCl 50mM pH 7,5

pendant 30 min à 37°C selon le protocole de Mofid et al. en 2002.

Afin de déterminer la concentration nécessaire en Coenzyme A, nous allons tester une gamme

de concentrations entre 25 et 100µM.

La détection du transfert du bras P-pant sur le domaine ACP va être réalisée sous UV.

3) Criblage à haut débit d’inhibiteurs de PptT

Pour réaliser le criblage haut débit des inhibiteurs potentiels de la PPTase, il faut tout

d’abord passer par une étape de miniaturisation pour pouvoir ensuite cribler la chimiothèque

choisie.

Miniaturisation de l’essai

Nous allons faire des essais de miniaturisation du test d’activité enzymatique décrit ci-

dessus. En effet, nous allons vérifier avec des volumes finaux de 25 µL que le fluorophore

présente la même sensibilité sur des plaques 384 puits (Invitrogen).

Criblage haut débit

Les plaques utilisées sont de couleur noire pour éviter une interférence de fluorescence

avec les puits voisins, elles seront greffées avec du nickel afin de pouvoir retenir le domaine

ACP2. Ensuite, après plusieurs lavages pour éliminer les protéines non attachées, l’analogue

du Coenzyme A fluorescent sera rajouté avec l’inhibiteur. Enfin, l’enzyme (PPTase) sera

incorporée au mélange. La réaction se fera durant 30 minutes. Les puits des plaques seront

lavés afin de retirer tous les fluorophores non fixés sur le domaines ACP, nous visualiserons

ainsi le transfert du bras P-pant sous UV à 370nm. Les concentrations (quantités) utilisées

seront déterminées lors de la miniaturisation.

Les contrôles de ce test se feront en mettant dans différents puits de chacune des plaques 384

puits : le domaine ACP2 avec l’analogue CoA seul et du Mg2+ ; le domaine ACP2 avec

l’enzyme seule et du Mg2+ ; le domaine ACP2, l’analogue du CoA, l’enzyme et le Mg2+.

L’inhibiteur provient de la chimiothèque que nous avons choisi à savoir celle du CNRS. Elle

est composée de plus de 3000 molécules (extraits naturels et produits de synthèse).

17

4) Validation de la cible

Une fois le criblage réalisé, les inhibiteurs « positifs » devront être validé c'est-à-dire

vérifier que se sont bien des inhibiteurs et non des faux-positifs.

Vérification de l’inhibiteur

Tout d’abord, il est nécessaire de vérifier si l’inhibiteur potentiels n’interfère pas dans

la mesure de fluorescence en faisant un spectre d’absorption et d’émission. Le spectre ne doit

pas se chevaucher avec celui de notre analogue fluorescent.

Confirmation des inhibiteurs potentiels sur la protéine Pks13 entière

Afin de s’assurer que les « hits » inhibent bien la phosphopantethéinylation, des tests

vont être réalisés in vitro.

Tout d’abord, les conditions du criblage vont être reproduites afin d’être confirmée. Ensuite,

le(s) inhibieur(s) sera (seront) testés sur la protéine Pks13. La polykétide sera produite chez E.

Coli. Le gène de Pks13 (Rv3800) sera amplifié par PCR à partir de l’ADN total de Mtb et

inséré dans un vecteur d’expression pET26b de E. Coli sous le contrôle du promoteur T7 pour

obtenir le plasmide pWM35 ; la souche E. Coli transfectée sera délétée de la PPTase

endogène pour ne pas interférer dans notre expérience (souche BL21ΔentD) . La protéine sera

fusionnée avec un tag poly-His qui permettra ensuite sa purification.

L’apoenzyme et l’holoenzyme ont une différence de taille de 340 uma ; cette différence est

détectable en HPLC. En effet, la polykétide synthase non activée a un volume d’élution plus

important que celui de l’holoenzyme. Ainsi, une expérience avec la polykétide synthase, la

PPTase, le Coenzyme A et l’inhibiteur potentiel pourra être menée pour vérifier si le transfert

du bras P-pant a eu lieu ou pas [Liu et al.].

Toutes ces expériences vont permettre de vérifier que la molécule criblée agit en tant

qu’inhibiteur de la phosphopantethéinylation de la Pks13.

Test de perméabilité de la paroi de Mycobacterium tuberculosis

L’inhibiteur potentiel devra être capable de franchir la paroi de la bactérie afin de

pouvoir agir sur la synthèse des acides mycoliques. Afin de tester la perméabilité de la

mycobactérie, des cellules de Mtb vont être cultivées pendant 21 jours (temps nécessaire

d’apparition des colonies) dans un milieu de culture liquide enrichie (milieu à l’œuf) Si

18

l’inhibiteur criblé est une molécule synthétique alors on pourra le marqué par un élément

radioactif 3H. Une étape de filtration est nécessaire afin d’éliminer le milieu de culture et de

récupérer les mycobactéries. Une analyse par scintillation liquide permettra de détecter la

radioactivité sur les bactéries lysées. Si l’inhibiteur est une molécule naturelle on pourra le

marquer par fluorescence.

Détermination des paramètres biochimiques d’interactions

A présent, il faut déterminer les paramètres biochimiques d’interactions de l’inhibiteur

avec les substrats. En effet, la réaction fait intervenir deux substrats : le domaine ACP et le

coenzyme A. Nous allons déterminer le type d’inhibition mis en jeu. Pour cela, nous

utiliserons la stratégie expérimentale suivante : dans une solution contenant une concentration

saturante en ACP, nous ferons varier la concentration en coenzymeA à une concentration

d’inhibiteur donnée. Une autre série d’expériences sera réalisée à une autre concentration

d’inhibiteur et ainsi de suite. L’allure du tracé de Lineweaver-Burk ((1/vi)=f(1/CoA))

permettra de déterminer le type d’inhibition avec une vitesse maximale d’inhibition (vmax).

La représentation en double inverse ((1/Kapp)=f(Inhibiteur)) nous informera sur la constante

d’inhibition. De même, nous allons nous placer en condition saturante en Coenzyme A et faire

varier la concentration en ACP à une concentration donnée en inhibiteur et déterminer le type

d’inhibition et la constante (Ki).

19

IV) PERSPECTIVES ET CONCLUSION

Ce projet de recherche a pour objectif de rechercher des inhibiteurs de la modification

post-traductionnelle de Pks13, la 4’-phosphopantethéinylation (transfert du bras P-pant), par

la PPTase.

Pks13 est une protéine clé dans la voie de synthèse des acides mycoliques [Portevin et

al., 2004]. L’équipe de Mofid a démontré que cette enzyme devait être modifiée post-

traductionnellement pour être active. Chalut et al., en 2006, ont confirmé que la PptT est

responsable de l’activation des domaines ACP de Pks13 de Mtb. Il a également démontré que

Pks13 inactive ne permet pas la synthèse d’acides mycoliques et entraîne la mort la bactérie.

De nos jours, il n’existe aucune donnée structurale sur Pks13, nous avons donc voulu inhiber

la modification post-traductionnelle responsable de son activation. Nous avons donc dû mettre

en place un test d’activité enzymatique pour visualiser le transfert du bras P-pant réalisé par la

PptT qui devait être optimiser pour être miniaturiser en vue d’un criblage haut débit

d’inhibiteurs potentiels.

De nos jours les traitements anti-tuberculeux sont lourds car nécessitent la prise

quotidienne pendant six mois voire plus de plusieurs antibiotiques. De plus, des formes

résistantes de Mtb apparaissent à cause de mutations des gènes codant pour les cibles

pharmacologiques. C’est pour cela que nous avons voulu cibler cette enzyme (PptT).

En vue d’un développement d’un médicament anti-tuberculeux, il est nécessaire de

vérifier que l’inhibiteur de la PptT n’est pas toxique pour les cellules humaines. Pour cela, un

comptage de la mortalité de plusieurs types cellulaires (cellules endothéliales, fibroblastes,

cellules épithéliales) pourra être réalisée après culture de ces dernières en présence

d’inhibiteur(s).

Des études sont menées afin de cristalliser la PptT. Une fois sa structure

cristallographique déterminée, il serait intéressant d’optimiser l’action de l’inhibiteur par

« Drug Design » en modifiant la composition chimique de la molécule inhibitrice lui

permettant une reconnaissance plus spécifique.

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BIBLIOGRAPHIE

Barry C.E 3rd., Lee R.E., Mdluli K., Sampson A.E., Schroeder B.G, Slayden R.A., and Yuan

Y. “Mycolic acids: structure, biosynthesis and physiological functions.” Progress in Lipid

Research, 1998. 37(2-3): 143-179.

Cabantous S. “Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines

basées sur la GFP. Application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase

Pks13 de Mycobacterium tuberculosis ” Thèse Université Paul Sabatier Toulouse III. 2005.

Chalut C., Botella L., de Sousa-D’Auria C., Houssin C. and Guilhot C. “The nonredundant

roles of two 4′-phosphopantetheinyl transferases in vital processes of Mycobacteria.” Proc

Natl Acad Sci U S A. 2006. 103(22): 8511–8516.

Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier

K., Gas S., and Barry C.E. 3rd. “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from

the complete genome sequence.” Nature, 1998. 393: 537-544.

Daffe M., and Drapper P. “The envelope layers of mycobacteria with reference to their

pathogenicity.” Advances in Microbial Physiology, 1998. 39: 131-203.

Ehrt S., Guo X.V., Hickey C.M., Ryou M., Monteleone M., Riley L.W., and Schnappinger D.

“Controlling gene expression in mycobacteria with anhydrotetracycline and Tet repressor.”

Nucleic Acids Research, 2005. 33: e21.

Lambalot R.H., and Walsh C.T., “Holo-[acyl-carrier-protein] synthase of Escherichia coli.”

Methods in Enzymology, 1997. 279: 254-262.

Lambalot R.H., Gehring A.M., Flugel R.S., Zuber P., LaCelle M., Marahiel M.A., Reid R.,

Khosla C. and Walsh C.T. “A new enzyme superfamily - the phosphopantetheinyl

transferases.” Chem Biol. 1996. 3(1): 923-936

21

Liu Q., Ma Y., Zhou L. and Zhang Y. “Gene cloning, expression and functional

characterization of an acyl carrier protein AcpV from Vibrio anguillarum” Arch. Microbiol.

2006. 185: 159–163.

Meier J.L., Mercer A.C., Rivera H. Jr. and Burkart M.D. “Synthesis and Evaluation of

Bioorthogonal Pantetheine Analogues for in vivo Protein Modification.” J. Am. Chem. Soc.

2006. 128: 12174-12184.

McNeil M.R., and Brennan P.J. “Structure, function and biogenesis of the cell envelope of

mycobacteria in relation to bacterial physiology, pathogenesis and drug resistance; some

thoughts and possibilities arising from recent structural information.” Research in

Microbiology, 1991. 142(4): 451-463.

Mofid M.R., Finking R. and Marahiel M.A. “Recognition of Hybrid Peptidyl Carrier

Proteins/Acyl Carrier Proteins in Nonribosomal Peptide Synthetase Modules by the 4’-

Phophopantetheinyl Transferases AcpS and Sfp.” The Journal Of Biological Chemistry. 2002.

277(19): 17023–17031.

Portevin D., De Sousa-D'Auria C., Houssin C., Grimaldi C., Chami M., Daffé M., and

Guilhot C. “A polyketide synthase catalyzes the last condensation step of mycolic acid

biosynthesis in mycobacteria and related organisms.” Proc Natl Acad Sci U.S.A, 2004. 101(1):

314-319.

Reuter K., Mofid M.R., Marahiel M.A. and Ficner R. “Crystal structure of the surfactin

synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase

superfamily.” EMBO J. 1999. 18(23): 6823–6831.

Takayama K., Wang C., and Besra G.S. “Pathway to synthesis and processing of mycolic

acids in Mycobacterium tuberculosis.” Clinical Microbiology Reviews, 2005. 18(1): 81-101.

Veyron-Churlet R., Bigot S., Guerrini O., Verdoux S., Malaga W., Daffé M., and Zerbib D.

“The biosynthesis of mycolic acids in Mycobacterium tuberculosis relies on multiple

specialized elongation complexes interconnected by specific protein-protein interactions.”

Journal of Molecular Biology, 2005. 353(4): 847-858.

22

Veziris N., Cambau E., Sougakoff W., Robert J. and Jarlier V. “Resistance to antituberculous

drugs”. Archives de pédiatrie, 2005. 12(Suppl 2): 102-109.

23