Prosedur Pcr

5/20/2018 Prosedur Pcr

1/26

BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan

makhluk hidup (bakteri,fungi,virus,dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup

(enzim,alkohol)dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi

secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi.

Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan

menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.

Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk

beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari

berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu

diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya

atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual.

Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan

genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana

informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode

in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan duaprimer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target

DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang

diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

1.

B. Rumusan masalah

Apa pengertian dari PCR ?

Apa komponen-komponen dari PCR ?

Bagaimana proses PCR ?

Bagaimana aplikasi dari PCR ?

C. Tujuan

Untuk mengetahui pengertian dari PCR

Untuk menjelaskan komponen-komponen dari PCR

Untuk menjelaskan proses PCR Untuk mengetahui aplikasi dari PCR

BAB II

PEMBAHASAN

A. Pengertian PCR

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagaiPolymerase Chain Reaction (PCR),

merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida

tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis padatahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi
http://id.wikipedia.org/wiki/Bakterihttp://id.wikipedia.org/wiki/Bakterihttp://id.wikipedia.org/wiki/Bakterihttp://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttp://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttp://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttp://id.wikipedia.org/wiki/Virushttp://id.wikipedia.org/wiki/Virushttp://id.wikipedia.org/wiki/Virushttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Alkoholhttp://id.wikipedia.org/wiki/Alkoholhttp://id.wikipedia.org/wiki/Alkoholhttp://id.wikipedia.org/wiki/Alkoholhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Virushttp://id.wikipedia.org/wiki/Fungihttp://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri


2/26

dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk

melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat

digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.

Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan

jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yangdiamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n

kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan

bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi

urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam

jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5g,

oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam

volume 50-100 l. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu

sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam

genom bakteri.

PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yangdilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda

DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan

dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan

kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin

thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan

bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.

PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)

DNAsecaraenzimatiktanpa menggunakanorganisme.Dengan teknik ini, DNA dapat

dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagaiteknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis olehKary Mullispada tahun 1983

dan ia memperolehhadiah Nobelpada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan

PCR banyak dilakukan di bidangbiokimiadanbiologi molekularkarena relatif murah dan

hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi

berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens

tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita

yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat

kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas

penggunaannya.

Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akandilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat

dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu

sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi

berantai polimerasi.

B. KomponenKomponen PCR

Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:

1. 1. DNA cetakan
http://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Hadiah_Nobelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Hadiah_Nobelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Hadiah_Nobelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Biokimiahttp://id.wikipedia.org/wiki/Biokimiahttp://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekularhttp://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekularhttp://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekularhttp://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekularhttp://id.wikipedia.org/wiki/Biokimiahttp://id.wikipedia.org/wiki/Hadiah_Nobelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasi


3/26

DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di

dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang

sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA

apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.

Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNAtemplate (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah

menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan

panas selama 12 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan

menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer

akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer

dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada

dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu

yang lebih rendah.

1. 2. Oligonukleotida primer

Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (1525 basa nukleotida)

yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR

ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai

DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen

pada ujung 3OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama

12 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu

inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan

melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada

DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan

hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatanhydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi

selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA

yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi

berikutnya.

Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 2530 klai (siklus)

sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru

hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan

yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di

dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin

sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung,misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA

polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 2530 siklus amplikasi.

1. 3. Deoksir ibonukleotida tri fosfat (dNTP)

Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP

adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-

masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan

merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan

reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.

1. 4. DNA Polimerase


4/26

Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen

Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989).

Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5

3)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak

tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara

terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNApolymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek

primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu

perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida

tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

1. a. Taq DNA Polimerase

Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain

yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu

rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai

kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitaseksonuklease 3 5. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas

optimumnya sekitar 750C800C.

Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi

yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini

maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus

dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand

dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya

yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen

Klenow.

Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 5

0 C. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 50 nukleotida

per detik per molekul enzim. aktu paruh (half-time) aq DNA polymerase pada suhu 95 C

adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat

digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang

juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin,

gliserol, dan ammonium sulfat.

Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai

potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada

kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengankondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti

misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi

30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen -globin (14990 nukleotida).

Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X

kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.

Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan

satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3 fragmen DNA hasil polimerasi meskipun

tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode

PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada

kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNAhasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu


5/26

tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA

hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended

ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul

dengan menggunakan aktivitas polymerase 5 3 fragmen Klenow.

Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas TaqDNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi

dNTP yang digunakan adalah 0,70,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan

menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini

juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.

1. b. Tth DNA polimerse

Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth

DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8.

Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas

eksonuklease 3 5. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi padapH 9 (pada suhu 25)dan suhu sekitar . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas

transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion

mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas

serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada

Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang

dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan

radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.

Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi

pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbulakibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat

digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang

diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan

menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk

melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.

1. c. Pwo DNA polymerase

Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei.

Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini

mempunyai prosesivitas polimerasi 5 3 yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease ,dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease . Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas

thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim

ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu

paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3 5 (aktivitas proof-reading dalam

proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan

(fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang

dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk

mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih

56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika

enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk

amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in


6/26

vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat

penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.

Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung

pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul

secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Olehkarena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:

1) Cloning produk PCR

2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual

3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan

4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal

5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

1. d. Pfu dan Tli DNA polymerase

DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli

DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat

molekul 92 kD, aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini

diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA

polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul

DNA dengan ujung tumpul.

Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap

panas, aktivitas optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu .

Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease .

1. 5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM

MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer

dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk

PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena

kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA

template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat

rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi

chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+yang bebas bila terlalu

rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila

terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

1. C. Tahapan Proses PCR

PCR merupakan tehnik amplifikasi DNA selektif in vitroyang meniru fenommena replikasiDNA in vivo. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA


7/26

sebagai cetakan, primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri akhiran sekuens

cetakan DNA yang sudah ditentukan), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dan enzim

TAQ polimerase yaitu enzim dari bakteri Termovilus aquatikus.

Sejak ditemukannya struktur DNA untai ganda, kita mulai memahami prinsip replikasi DNA

terutama kaitannya dengan mekanisme transfer materi genetik. Seperti yang telah dijelaskandalam materi Asam Nukleat dalam struktur DNA untai ganda tersebut, basa A dan T , juga C

dan G , memiliki ikatan hidgrogen yang mudah dirusak dan mudah dibentuk kembali. Untuk

melakukan replikasi, mula-mula ikatan hidrogen tersebut harus dirusak dahulu agar DNA

untai ganda berubah menjadi untai tunggal. Kemudian karena A selalu berpasangan dengan

T, dan C selalu berpasangan dengan G, maka jika kita memiliki satu untai DNA dengan

sequens ACTAG, misalnya, maka kita dapat mencetak untai komplementernya, yaitu

TGATC, begitu juga sebaliknya.

Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) membutuhkan tiga tahap :

1.

1. Denaturasi

Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi

DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 9295 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1

3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai

tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNAterputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim

polimerase.

1. 2. Annealing

Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap

terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan

mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang

mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu

rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan

suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap

annealing hingga mencapai 7074oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA

polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu

72oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu

dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-

ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah.Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin

banyak.

1. 3. Elongasi

Elongasi merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA,

enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap

untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus

selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.

Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklusberikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus.


8/26

Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan

menjadi milyaran amplifikasi DNA target.

Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus

pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada

siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakansehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya

akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan

disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan

seterusnya. Pada akhir siklus, DNA cetakan akan digandakan secara eksponensial sehingga

dihasilkan DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam waktu yang relatif singkat

sekitar 3-4 jam.

1. D. Aplikasi PCR

Aplikasi PCR utama dibidang klinis adalah untuk diagnosis, dan kloning. Yang paling sering

dipakai di bidang klinis saat ini adalah untuk diagnosis, yaitu untuk deteksi patogen infeksiusdan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit.

Untuk aplikasi PCR dibidang klinis tersebut, telah dikembangkan berbagai macam teknis

berbasis PCR, antara lain :

1.

RFLP-PCR (restriction fragment lenght polymorphisms)

Pada prinsipnya, teknik ini dimanfaatkan untuk deteksi polimorfisme. Secara umum teknik

ini menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui adanya polimorfisme (RFLP), dan produk

hasil digesti tersebut diamplifikasi dengan PCR (RFLP-PCR).

Teknik PCR yang mirip dengan teknik diatas AFLP-PCR (amplification fragment lenght

polymorphisme) yang digunakan untuk membedakan isolat atau spesies yang berbeda

berdasarkan daerah enzim restriksi (polimorfisme daerah restriksi)

1.

VNTR-PCR (variable number of tandem repeat sequence), dan STR-PCR (short

tandem repeats). Teknik ini sering digunakan untuk tujuan forensi. Dengan

menggunakan primer yang tepat, variasi sekuens pengulangan berurutan yang terdapat

pada DNA sampel dapat diketahui.

2. Skreening / deteksi mutasi berbasis PCR

Dahulu, skreening/ deteksi mutasi dapat dilakukan dengan PCR konvensional (misalnya

dengan BESS-T-Scan (Base Excision Sequence Scanning)) untuk mendeteksi mutasi T/A

atau T / A, atauAmplification refractory mutation system(ARMS) untuk mendeteksi point

mutation melalui priming oligonukleotida kompetitif.

1.

PCR kuantitatif

Untuk keperluan diagnosis dan penilaian kemajuan tetapi kadang membutuhkan pemeriksaan

yang bersifat kuantitatif.

PCR konvensional dapat digunakan untuk mendapatkan data kuantitatif tersebut denganmenggunakan kompetitor (internal exogenous standard) atau dengan housekeeping


9/26

gene(internal endogenous standard). Namun saat ini, penggunaan PCR konvensional untuk

PCR kuantitatif telah digantikan real-time PCR.

PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian

biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai

macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telahmembeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang

ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk

diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh

virus yang sulit terdeteksi seperti HIV.

Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan

modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi

praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning

hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit

genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka

ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.

Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996)

yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia.

Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur

yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction)

melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping,

subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak

pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat

ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang

terbukti sangat akurat.

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

1. a. Isolasi Gen

DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia panjangnya sekitar 3

miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana fungsi utama DNA

adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA

ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai

asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan

protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA,DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi

gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Contoh, sebelumnya

mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat

diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin

dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa

genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu

menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin

juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan

sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah

ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi

gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa


10/26

nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR

menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

1. b. DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yangumum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah

dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi

PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa

menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.

Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak

diketahui bisa ditentukan.

1. c. Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban

kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak

mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil

dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-

bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik

bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki

pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangattinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu

yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang

anak jika sang orang tua merasa ragu.

1.

d. Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,

bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa

yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini

memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena

PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A

(H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas

terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:

1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

4.

Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan

sebelum dilahirkan.

5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi,

variasi dan mutasi dari gen.

6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana

spesies tersebut berasal.

7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print

1. E. Kelebihan dan Kelemahan PCR


11/26

Kelebihan

1. Memiliki spesifisitas tinggi

2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

3. Dapat membedakan varian mikroorganisme

4.

Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup5. Mudah di set up

Kelemahan

1. Sangat mudah terkontaminasi

2.

Biaya peralatan dan reagen mahal

3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi

(misalnya infeksi pasif atau laten)

4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk

melakukannya.

BAB III

PENUTUP

Kesimpulan

1.

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagaiPolymerase Chain Reaction (PCR),

merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens

nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik atau metode

perbanyakan (replikasi)DNAsecaraenzimatiktanpa menggunakanorganisme.2. Adapun komponen dari PCR yaitu DNA cetakan, Oligonukleutida primer, DNA

polymerase, Larutan Buffer, dan Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)

3. Prinsip dasar dari proses PCR yaitu Tahap pertama Denaturasi. Tahap 2 penempelan.

Tahap 3 elongasi. Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus

amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi

2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing

akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA

untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial,

dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi

1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya

4.

Contoh aplikasi PCR antara lain yaitu proses Isolasi Gen, DNA Sequencing, Forensikdan Diagnosa penyakit.

Aplikasi teknik PCR

Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan

mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk

berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen
http://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasi


12/26

Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja

panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu

apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai

panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNAkemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian

panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya

tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum

diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk

diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi

atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal

serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan

insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari

DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri

dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya

insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin

tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara

konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang

memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat

dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang

umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah

dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi

PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa

menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.

Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak

diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban

kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak

mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil

dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-

bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik

bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki

pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat

tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.


13/26

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang

tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa

yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa

dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah

tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh

virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel

menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya

9 tahun setelah penemuannya (1993).

Polymerase Chain Reaction (PCR

Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan

suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode

PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula.

Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci

utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada

urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

B. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:

1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal.

2. Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yangkomplemen dengan urutan primer.

3.

Reaksi polimerisasi (Extension)

Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan

penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

Gambar 01. Proses Amplikasi Secara Eksponensial.

Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

1. Pra-denaturasi


14/26

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan

mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot- start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih

dahulu).

2. Final elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70 oC -72oC) selama 5-15 menit untuk

memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.

Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

Gambar 02. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)

C. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain

(Mahmuddin, 2010):

1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi

2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)

3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM

(ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10

mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.

4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)

5. Minyak mineral ringan

6. Akrilamida (grade elektroforesis)

. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)

8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)

9. EMED (N, N, NN etramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)

Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:

1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler

3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)

D. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR) Mahmuddin (2010),

menyampaikan beberapa komponen-komponen PCR antara lain:

1. Enzim DNA polymerase


15/26

2. Primer

3. Reagen lainnya

E. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)

1. Alel-spesifik PCR atau kloning teknik diagnostic

2. Polymerase Cycling Assembly (PCA)

3. Asymmetric PCR

4. Amplifikasi tergantung helikase

5. Hot Start PCR

6. PCR spesifik Intersequence (ISSR)

7. Inverse PCR

8. Mediated PCR Ligasi

9. PCR spesifik Metilasi (MSP)

10. Miniprimer PCR

11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA)

12. Multiplex-PCR

13. Nested PCR

14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN)

15. Kuantitatif PCR (Q-PCR)

16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR)

17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR )

18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR)

F. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

1. Isolasi gen

2. DNA sequencing


16/26

3. Identifikasi forensic

4. Diagnosa penyakit

BAB III PENUTUPA.

SimpulanPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan untuk

mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang

menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.Tahapan-Tahapan

Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer,

dan polimerisasi (extension) rantai DNA.Komponen-Komponen Polymerase Chain

Reaction (PCR), Enzim DNA Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki

keaktifan pada suhu tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang

mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer

berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan

buffer yang mengandung MgCl2.Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) seperti:

Alel-spesifik PCR, Polymerase Cycling Assembly, Asymmetric PCR, Hot Start PCR, PCRspesifik Intersequence, Inverse PCR, Mediated PCR Ligasi, dll.Manfaat Polymerase Chain

Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida

suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang

dengan membandingkan DNA finger print.

E.Aplikasi PCRPCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian

biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai

macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah

membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang

ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk

diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh

virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395).

Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan

modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi

praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning

hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit

genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka

ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996)

yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia.

Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur

yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction)

melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping,

subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak

pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat

ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang

terbukti sangat akurat.

Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas

terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:


17/26

1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

2.

Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

4.

Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan

sebelum dilahirkan.

5.

Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi,variasi dan mutasi dari gen.

6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana

spesies tersebut berasal.

7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print"

F. Kelebihan dan Kelemahan PCR1. Kelebihan

1. Memiliki spesifisitas tinggi

2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

3. Dapat membedakan varian mikroorganisme

4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

5. Mudah di set up

2. Kelemahan

Sangat mudah terkontaminasi

Biaya peralatan dan reagen mahal

Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi

(misalnya infeksi pasif atau laten)

Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untukmelakukannya.

Saat ini proses analisis DNA banyak dilakukan dengan menggunakan teknik PCR

(polymerase chain reaction). Teknik PCR inilah yang memungkinkan proses analisis

DNA menjadi lebih cepat dibandingkan dengan melakukan tes DNA dengan cara

konvensional. Dengan PCR, urutan DNA dapat digandakan hanya dalam waktu

beberapa jam sampai kuantitasnya cukup untuk sebuah proses analisis. Suatu teknik

yang sangat menolong tentunya setelah dilakukan prosedur yang cukup rumit untuk

mendapatkan urutan DNA yang cukup.

Ditemukannya PCR atau reaksi rantai polimerase ini jelas merupakan sebuah angin

segar bagi kalangan ilmuwan yang bergerak di bidang genetika molekuler. BerkatPCR-lah, mereka lebih mudah mendiagnosis suatu penyakit maupun melakukan

analisis forensik. Bahkan studi DNA dari suatu fosil yang ditemukan oleh para

arkeolog akan lebih mudah dilakukan dengan bantuan PCR ini.

Untuk lebih jelasnya, berikut ini penerapan PCR yang telah meliputi berbagai bidang

kehidupan manusia dan membuka peluang baru untuk studi tentang gen.

Pertama, PCR digunakan untuk amplifikasi urutan DNA yang khas bagi manusia

sehingga DNA manusia dapat dilacak dan diisolasi dari DNA yang lain.

Kedua, deteksi mutasi dengan amplifikasi PCR. Mutasi biasanya terjadi pada kankerdan kelainan bawaan. Pengetahuan sifat mutasi pada pasien sangat penting untuk


18/26

diagnosis dan terapi. PCR dapat digunakan untuk mengikuti perkembangan sel kanker

setelah terapi. Berbagai kelainan bawaan juga telah berhasil didiagnosis dengan cara

PCR. Kemampuan untuk melacak lesi yang khas untuk sel tumor merupakan hal yang

sangat bernilai bagi ahli dalam mencoba untuk menentukan apakah seorang pasien

yang telah diobati terhadap leukemia sudah bebas dari sel malignan atau belum.

Ketiga, PCR juga dapat diterapkan dalam melacak infeksi virus dan bakteri.

Diagnosis konvensional didasarkan pada kemampuan untuk menumbuhkan agen pada

biakan atau untuk melacak keberadaan mereka pada pasien dengan antibodi. Uji

seperti itu dapat memerlukan waktu beberapa minggu sebelum diagnosis dapat

ditegakkan, sementara uji yang kedua relatif kurang peka. Hal tersebut juga

merupakan masalah penting untuk diagnosis AIDS atau untuk studi epidemiologi

infeksi HIV.

Contoh lain, seperti pada kasus flu burung adalah mendeteksi keberadaan virus H5N1

pada penderita suspect flu burung. Seperti pada terapi kanker, tujuan utama diagnosis

adalah melacak sel-sel terinfeksi, yang biasanya terdapat dalam jumlah yang kecil darisuatu cuplikan jaringan atau darah. Penyakit bekteri juga dapat didiagnosis dengan

PCR. Salah satu yang penting misalnya tuberkulosis (TBC). Penyakit yang

disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis ini sering sulit didiagnosis karena hanya

sedikit mikroorganisme yang ada dalam material dari pasien untuk penegakan

diagnosis secara histologis. Untuk itu, patogen harus diidentifikasi setelah

ditumbuhkan pada biakan dan pengujian kepekaan antibiotika. Prosedur seperti itu

dapat memerlukan waktu sampai dua minggu. PCR telah terbukti dapat mengatasi

permasalahan tersebut.

Keempat, PCR digunakan untuk penentuan jenis kelamin pada sel prenatal.

Prosedur ini sekarang telah digunakan pada klinik bagi keluarga yang mempunyai

risiko kelainan genetik turunan yang terpaut pada kromosom X, dengan implantasi

embrio yang telah dibiopsi pada ibu-ibu. PCR memungkinkan biopsi, penentuan

kelamin, dan transfer janin ke rahim para ibu dapat dilakukan pada status reproduksi

yang sama. Jenis kelamin dari janin diperiksa dengan analisis karyologis dari sel-sel

vilus korionik.

Kelima, PCR digunakan dalam studi evolusi molekuler. Informasi genetika molekuler

telah semakin sering digunakan dalam studi evolusi untuk menentukan tingkat

kekerabatan antarspesies. Metode studi evolusi konvensional sering mengalami

hambatan, karena memerlukan spesies yang masih hidup sebagai sumber DNA.Dengan sumber tersebut, hubungan antarspesies yang masih hidup dapat diamati

secara langsung. Akan tetapi, hubungan dari organisme hidup dengan yang telah

punah sulit dilakukan. Cuplikan jaringan dari spesies yang sudah punah atau yang

populasinya jarang, yang tersimpan di museum di seluruh dunia adalah sumber DNA

yang baik. DNA dapat disolasi dari sumber-sumber secara beragam, seperti kulit,

mumi manusia, tanaman kering, bahkan jaringan lunak yang disimpan dalam

pengawet. Hanya, molekul DNA dari sumber seperti itu umumnya tinggal sebagai

fragmen-fragmen yang pendek akibat degradasi, rusak akibat mutagen dari

lingkungan seperti sinar ultra violet, serta tercemar hebat oleh DNA bakteri. DNA

yang seperti itu tidak dapat digunakan untuk studi dengan teknik pengklonan

konvensional. PCR telah mengubah situasi tersebut secara dramatis. Teknik ini dapatmengamplifikasi secara efisien fragmen DNA yang kecil yang masih tetap utuh dalam


19/26

terok sekalipun fragmen yang utuh tersebut terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit

sekali

Keenam, penggunaan PCR dalam bidang kehakiman. Potensi penggunaan sumber

DNA untuk meyakinkan identitas seseorang dalam ilmu kehakiman adalah bukti

akurat yang telah diakui secara nyata dan telah banyak digunakan. Hal inilah yangdilakukan dalam mengidentifikasi kelompok teroris Dr. Azahari dalam pengungkapan

identitas mayat terkena bom di Batu Malang.

DNA dapat diisolasi dari tetesan darah kering atau dari sperma dalam usapan kapas

vagina yang telah tersimpan sampai selama dua tahun. Pertimbangan utama dalam

penerapan PCR dalam forensik adalah cemaran dari contoh barang bukti oleh DNA

lain dari tempat kejadian kriminal maupun dari DNA lain yang telah pernah

diamplifikasi di laboratorium yang sama.***

Virus adalah makhluk hidup yang paling sederhana sebab hanya memiliki gen

penyandi protein terpenting untuk hidupnya saja. Sebagaimana perilaku parasit,

protein selebihnya dipinjam dari 'tuan rumah' yang diserangnya.Pada umumnya virusadalah patogen/organisme penyebab penyakit yang paling sulit pengobatannya. Hal

ini disebabkan oleh dua hal.

Pertama, protein virus yang menjadi target obat jumlahnya sedikit.

Kedua tabiat mutasi yang secara alamiah terjadi pada seluruh organisme, muncul

lebih sering karena kesederhanaan sifat genetiknya itu, sehingga virus paling mudah

berubah bentuk menjadi tak dikenali lagi oleh obat yang ada. Untuk itu, cara ampuh

memerangi virus tiada lain adalah dengan mencegah terjadinya 'pertautan ciuman

maut' tersebut.

Tonjolan pada virus influenza terdiri dari dua protein yaitu protein hemagglutinin

(disingkat HA) dan protein neuraminidase (NA). Protein HA mengenali molekul

sialic acid (SA) di permukaan sel target, selanjutnya protein NA memotong SA agar

virus dapat masuk ke dalam sel.

Ketika keluar dari sel pun, protein NA bertugas memotong SA yang banyak terdapat

di permukaan sel agar virus tidak 'tertambat' di situ saja sehingga dapat bergerak

bebas menyerang sel lainnya. Apabila umumnya virus memiliki sepotong genom

(baik dalam bentuk DNA atau RNA), virus influenza memiliki 8 potong genom. Hal

ini menyebabkan virus influenza sangat sering berganti rupa melalui kombinasi

potongan genom itu

Para peneliti dari Australia yaitu Laver dan Coleman berhasil memecahkan struktur

protein NA sampai tingkat atom pada tahun 1983. Informasi detail wajah protein NAini memberikan petunjuk penting bahwa bagian yang melakukan 'ciuman maut' itu

tidak pernah berubah walaupun bagian lainnya seringkali berganti.

Hal ini memberikan inspirasi pada Von Itzstein, juga dari Australia, untuk mensintesa

senyawa organik yang dapat menghambat pertautan protein NA dengan SA pada

tahun 1993. Senyawa organik yang menjadi obat influenza ini disebut Zanamivir yang

menunjukkan khasiatnya dengan meniru SA berinteraksi dengan protein NA.

Virus influensa pada umumnya baik pada manusia atau pada unggas adalah dari

kelompok famili orthomyxoviridae. Ada beberapa tipe virus influenza pada manusia

dan binatang yaitu virus influenza tipe A, B, dan C. Pada manusia Virus A dan B

dapat menjadi penyebab wabah flu yang cukup luas. Sementara virus C menyebar

secara periodik, ringan dan tidak menyebakan wabah. Pada permukaan virus A ada 2glikoprotein, Yaitu : hemaglutinin (H), dan neuraminidase (N), untuk


20/26

mengkasifikasikannya secara rinci, masing-masing tipe virus tersebut dabagi menjadi

subtipe berdasarkan kelompok H dan N, klasifikasinya adalah : H1-H15. dan N1-N9.

Perbedaan H merupakan dasar subtipe. Influenza pada manusia sejauh ini disebabkan

oleh virus H1N1, H2N2 dan H3N2 serta virus avian H5N1, H9N2 dan H7N7.

Sementara itu ada sekitar 15 subtipe virus influenza yang dapat terjadi pada unggas,

seperti H7N7, H9N2, dll. Subtipe infeksi virus ini menimbulkan berbagai gejala padaunggas mulai dari yang ringan sampai yang fatal dan menyebabkan epidemi luas (

Highly pathogenic avian influenza) dengan angka kematian pada unggas mencapai

100%. Kasus fluburung yang kini banyak dibicarakan disebabkan oleh virus influenza

tipe A subtipe H5N1.Laporan yang menyatakan bahwa virus H5N1 yang sekarang ada

ternyata berbeda dengan virus H5N1 yang pernah menyerang manusia dan unggas,

artinya virus tersebut telah bermutasi dan bukan tidak mungkin akan bermutasi

kembali di masa depan.Dengue dapat didiagnosis dengan isolasi virus, dengan tes serologis, atau dengan metode

molekuler. Diagnosis infeksi dengue akut (on-going) atau baru dapat dibentuk dengan

menguji sampel serum selama 5 hari pertama gejala dan / atau fase penyembuhan awal

(lebih dari 5 hari gejala). Infeksi akut dengan virus dengue dikonfirmasi ketika virus terisolasidari spesimen jaringan serum atau otopsi, atau genom virus dengue yang spesifik

diidentifikasi dengan reaksi sebaliknya transkripsi-polymerase chain (RT-PCR) dari serum

atau plasma, cairan serebrospinal, atau jaringan otopsi spesimen selama penyakit demam

akut. Metode seperti satu langkah, real time RT-PCR atau RT-PCR bersarang sekarang banyak

digunakan untuk mendeteksi gen virus dengue dalam sampel serum fase akut. Deteksi ini

bertepatan dengan viremia dan fase demam onset penyakit. Infeksi akut juga dapat

dikonfirmasi oleh laboratorium identifikasi antigen virus dengue atau RNA di otopsi

spesimen jaringan dengan analisis imunofluoresensi atau imunohistokimia, atau

serokonversi dari negatif ke antibodi IgM positif DBD atau demonstrasi peningkatan empat

kali lipat atau lebih dalam titer IgG antibodi dipasangkan spesimen (akut dan sembuh)

serum.

MERS disebabkan oleh virus dari genus coronavirus, genus coronavirus termasuk virus

visrus yang menyerang binatang. Pada manusia coronavirus biasanya menyebabkab flu, dan

SARS yang menghebokan China tahun 2003 lalu. Meskipun begitu, MERS-CoV adalah virus

korona yang berbeda dari SARS-Cov. Tidak adala laporan satupun mengenai MERS-CoV

sebelum tahun 2012. Meskipun belum dipastikan, MERS-CoV diduga berasal dari kelalawar

yang menular pada manusia dan cara penyebaran belum diketahui.

MERS-CoV menyebar dari manusia ke manusia dengan cara terpapar langsung ingus atau

kotoran lain dari pernafasan dari manusia yang telah terinfeksi MERS-CoV.MERS sering

menjangkiti orang yang merawat individu yang mengidap Mers.

MERS-CoV didiagnosa dengan menggunakan PCR test (transcriptase polymerase chain

reaction)

MERSCOV terdeteksi menggunakan reverse transcriptase polymerase chain reaction (

PCR) . Pada tanggal 5 Juni 2013, FDA (BPOM nya amerika) mengeluarkan emergency use

authorization ( EUA ) untuk CDC Novel Coronavirus 2012 Real-time RTPCR Assay . Tes

ini mendeteksi MERSCOV , sebelumnya dikenal sebagai coronavirus baru 2012 atau NCV-2012 , pada pasien dengan tanda dan gejala MERS dan faktor risiko yang tepat . Assay ini


21/26

disebarluaskan oleh CDC untuk laboratorium yang berkualitas . PCR dilakukan pada sampel

sekresi pernapasan atau darah.

Tes-tes lain mungkin abnormal , tetapi mereka tidak spesifik untuk SARS atau MERS . Dada

Xray menunjukkan pneumonia , yang mungkin terlihat tambal sulam pada awalnya .

Biasanya , infiltrat mungkin terlihat seperti kaca tanah pada C scan namun dapatberlanjut ke putih keluar penampilan . Biasanya , limfosit dan jumlah trombosit yang

menurun sedangkan kreatinin fosfokinase ( CPK ) dan serum laktat dehidrogenase ( LDH )

tingkat dapat ditingkatkan .

MERS harus dicurigai pada orang dengan gejala yang sesuai, terutama bila seseorang yang

barus saja kembali dari timur tengah.

PROSEDUR PCR

Vivantis DNA amplification kit

1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70%

2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih

(seringlah mengganti sarung tangan)

3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT

4. Penyiapan primer

a. Proses pengenceran primer

RNAse

Dipipeting supaya homogen dan divortex

b. Proses aliquot primer

Diambil 10 L masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan

dilabel

5. Labeli 200 L PCR tube sesuai jumlah sampel


22/26

Label 1 = K14P label 2 = K24P




Label 9 = K94P

Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer Jagged dan tinta hitam

_actin (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut)

6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi

Ikutilah prosedur pada table dibawah ini

Prosedure PCR Reaction

Tabel 1. Mix Reaksi

Catatan :

a. Untuk menentukan x reaksi:

1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya

(Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,

2. kemudian kalikan dengan jumlah sampel ditambah 3 atau 4, contoh 12 x reaksi =

9

sampel + 3


23/26

b. untuk Taq DNA polymerase harus segera di aliquot 20 L pada beberapa ependdof,

labellah dan segera disimpan dalam -20

o

C

7. Siapkan/masukkan 6,943 L Mix reaksi PCR kedalam masing tube eppendorf (v 200 L)

sampel yg telah disiapkan (no. 5)

8. Pipetlah 0,2 L DNA template atau DNa Sampel

9. Campurlah dengan mix reaksi PCR yang sidah siap dalam tube eppendorf dengan

cara

dipepeting (jangan divortex) kemudian spin down

10. Bawalah tube pada mecin PCR dan gunakan mengikuti kondisi siklus pada table 2

11. Setelah proses PCR sampel bisa disimpan dalam 4oC, atau langsung di

elektroforesis Horisontal/DNA.

Penyakit

LEPTOSPIROSIS

Penyakit leptospirosis disebabkan oleh bakteri Leptospira dan tersebar di seluruh dunia

terutama di negara tropis dengan kelembaban yang tinggi. Ada berbagai teknik


24/26

laboratorium yang dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit leptospirosis

diantaranya, (1) mendeteksi Leptospira secara langsung menggunakan mikroskop lapangan

gelap atau mendeteksi bakteri Leptospira dengan membiakkan; (2) mendeteksi gen spesifik

Leptospira menggunakan PCR; (3) mendeteksi antibodi terhadap Leptospira secara serologis

menggunakan metode MAT, ELISA, RIA, IHA, dll. Semua metode ini mempunyai kelebihan

dan kekurangan

3.a. Teknologi PCR

Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode amplifikasi segmen DNA Leptospirayang

terdapat di dalam sampel klinik. Jadi, adanya Leptospiradipastikan dengan menemukan

segmen DNA Leptospirayang spesifik. Metode ini sangat berguna untuk mendiagnosis

leptospirosis terutama pada fase permulaan penyakit. Alat ini dapat mendeteksi

Leptospirabeberapa hari setelah munculnya gejala penyakit. Akan tetapi, alat ini belum

tersedia secara luas terutama di negara yang sedang berkembang.

Untuk mendeteksi DNA Leptospira, teknologi PCR membutuhkan sepasang primer

dengan sasaran gen spesifik, seperti gen rRNA 16S dan 23S, atau elemen

pengulangan. Di samping itu, ada juga yang disusun dari pustaka genom. Umumnya

teknologi ini sangat jarang dipakai untuk memeriksa spesimen klinik.

Dari hasil penelitian penderita yang sudah didiagnosis leptospirosis secara pasti, ternyata

yang menunjukkan hasil biakan positif sekitar 48%, sementara PCR 62%, sedangkan

pemeriksaan serologis 97%. Pada keadaan tertentu pemeriksaan PCR lebih

menguntungkan. Sebagai contoh, pemeriksaan ini dapat memberikan hasil positif pada 2

penderita yang meninggal sebelum terjadi serokonversi, dan juga memberi hasil positif

pada 18% penderita seronegatif pada permulaan fase akut.

Merien dkk. (1992) membuat sepasang primeryang dapat mengamplifikasi fragmen yang

panjangnya 331 pasang basa dari gen rrs (rRNA 16S) Leptospirapatogen dan non-patogen

oidengan harapan agar dapat mendeteksi seluruh serovar patogen. Gravekamp dkk.

(1993) membuat G1 dan G2. Primer ini mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat

mengamplifikasi serovar L. kirschneri. Kedua pasang primer ini sudah digunakan secara

luas untuk studi klinik.Keterbatasan PCR adalah tidak mampu untuk mendeteksi jenis

serovar yang menginfeksi. Walaupun demikian PCR bermanfaat untuk epidemiologi dan

kesehatan masyarakat. Agar lebih bermanfaat, maka hasil yang diperoleh dicerna dengan


25/26

enzim endonuclease restriksi, kemudian amplicon yang diperoleh disikuens langsung, atau

dianalisis dengan metode konformasi untai tunggal.

Keuntungan pemeriksaan PCR adalah, bila bakteri ada maka diagnosis dapat dipastikan

dengan cepat terutama pada fase dini penyakit sebelum titer antibodi dapat dideteksi.

Kelemahannya, memerlukan peralatan dan tenaga ahli yang khusus. Disamping itu,

PCR dapat memberikan hasil positif palsu, apabila terkontaminasi oleh DNA asing.

Dia juga dapat memberi hasil negatif palsu, karena spesimen klinik yang diperiksa sering

mengandung inhibitor seperti heparin dan saponin.

TUBERCuLOSIS

Salah satu faktor yang menghambat program pemberantasan tuberkulosis paruadalah belum tersedianya alat diagnosis cepat yang dapat menentukan adanya

bakteri Mycobacterium tuberculosis dalam sputum. Diagnosis cepat dan tepat

sangat penting untuk menentukan pengobatan dan memutus rantai penularan. PCR(Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip

kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis. TehnikPCR telah dikembangkan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi, seperti

Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M.tuberculosis.

Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan validitas PCR sebagai perangkatdiagnosis pada tersangka penderita tuberkulosis. Hasil penelitian ini diharapkan

dapat memberi manfaat bagi program pemberantasan tuberkulosis terutamasebagai informasi tentang validitas diagnosis dan kemungkinan penggunaan PCR

sebagai alat diagnosis.

Sebanyak 70 sampel sputum diambil dari tersangka penderita tuberkulosis,diperiksa menggunakan 3 jenis pemeriksaan: mikroskopis bakteri tahan asam

(BTA), uji PCR dan metode biakan yang berfungsi sebagai baku emas (gold

standard). Validitas diagnosis ditentukan dengan menghitung sensitifitas,

spesifisitas, nilai duga positif dan negatif, rasio kecenderungan positif dan negatif,akurasi dari masing masing hasil diagnosis (mikroskopis BTA dan PCR).

Sensitifitas dan spesifisitas pemeriksaan mikroskopis BTA adalah 77,2% (CI =95%; 0,7837- 0,7603) dan 95,8% (CI = 95%; 0,96361- 0,9523) dengan nilai duga

positif dan negatif 89,4% dan 90,1% dengan rasio kecenderungan (LR +) = 18,8

dan (LR -) = 0,23. Hasil uji PCR menunjukkan sensitifitas dan spesifisitaspemeriksaan sebesar 90% (CI = 95%; 0,90705 - 0,89295) dan 79% (CI = 95%;0,7995 - 0,78043) dengan nilai duga positif dan negatif 66% dan 95% dengan rasio

kecenderungan (LR +) = 3,18 dan (LR -) = 0,11.


26/26

Sebagai perangkat diagnosis TB paru, PCR valid dapat membedakan penderita TB

paru dan bukan penderita TB paru, akan tetapi kurang reliabel dibanding hasil

pemeriksaan mikroskopis BTA.

Documents

Prosedur Pcr