Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin

Modifications chimiques et semi-synthèses des protéines

● 2 Cours– 16 septembre (10H-12H) et 18 septembre (10H-12H)

Présentations d'articles

● Lundi 29 septembre à 14 h– articles à récupérer sur le serveur Biointeractif :

● http://biologie.univ-mrs.fr/view-data.php?id=70● Utilisateur=***** mot de passe=****

http://biologie.univ-mrs.fr/view-data.php?id=70

Introduction

● Génome humain : 30-40000 gènes– 70 à 90 % contiennent 1 ou plusieurs exons– Epissage alternatif des pre- mARNs

● Protéome : – Modifications post-traductionnelles

● ex: Phosphorylation : 1/3 des protéines des mammifères

Nbre astronomique de combinaisons de protéines

Modifications chimiques et semi-synthèses des protéines

Introduction

● Inventaire ?– expression-modifications

● Tissu● Type cellulaire● Temps

– minute : transduction du signal– années : développement

– 10aines-100aines de milliers de type protéiques● Dans notre corps● Au cours d'une vie

Comprendre ces modifications : échelle Protéomique ?

● Très long terme● But (influence sur les fonctions) très stimulant

– Essor de nouvelles technologies– En provenance des domaines d'investigation les plus

dynamique● Protéomique● Bioinformatique● Génomique structurale● Et Chimie Biologique

=> Champs d'action largement multidisciplinaires

Introduction

La chimie et l'étude des processus biologiques

● Compréhension des fonction propre– Ex : catalyse enzymatique

● Maîtrise des fonctions pour des application non-biologiques– Ex : réactions de catalyse non physiologique

Introduction

Voies de préparation non Ribosomal

● Protéine avec résidus non naturels ou modifiés● Protéine avec modification post-traductionnelle

Purification à homogénéité très difficile– Ex PDB : 20000 structure / 150 avec 1 phosphorylation– Moins encore avec lipidation/glycosylation

Introduction

Besoins de protéines spécifiquement marquées

● Utilisation de méthode d'ingénierie des protéines– Technique classique de marquage in vitro– Mutagenèse à suppression de non sens / frame shift– Ligation des Proteines Exprimées (EPL)

● Les 2 dernières approches:– Élimination de la plupart des difficultés propres au marquage– Interdisciplinarité Chimie-Biologie

Combinaison de la puissance de la synthèse organique et des technologies de l'ADN recombinant

Introduction

Non-sens suppression mutagenesis

● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement

par l'Aa non naturel– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in

vitro

Mutagenèse à suppression de non sens

Synthèse in vitro de la protéine modifiée


● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– UAG, codon stop le moins utilisé– Souches Coli avec des mutations suppresseurs naturelle

n'empêchent pas la croissance (t-RNAsynthase mutée)


Non-sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus


Synthèse in vivo de la protéine modifiée

Non-sens suppression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre (UAG) – Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement

par l'Aa non naturel– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in

vitro


Améliorations

Non-sens suppression mutagenesis● Codon frameshift (codons à 4 bases)

– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel


Non-sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus

● ex :


Synthèse in vivo de la protéine modifiée


● Difficultés– Préparation (chimie )

– Adressage du tRNA préchargé● Solution : E. coli modifiée

– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des

Aa non naturels Science. 2001 Apr 20;292(5516):498-500.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/entrez/utils/fref.fcgi?itool=AbstractPlus-def&PrId=3051&uid=11313494&db=pubmed&url=http://www.sciencemag.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=11313494


● Solution : E. coli modifiée– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des

Aa non naturels– Stratégies d'évolution dirigée : génération d'un nouveau t-RNA


N'est reconnu que par la tRNAsyntase de M. jannaschii


● Solution : E. coli modifiée– Système de traduction natif– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des

Aa non naturels– Stratégies d'évolution dirigée :

● génération d'un nouveau t-RNA● permettre le chargement d'autres résidus


Non-sens suppression mutagenesis● Solution : E. coli modifiée

● permettre le chargement d'autres résidus



● Solution : E. coli modifiée● permettre le chargement d'autres résidus


Non-sens suppression mutagenesisMutagenèse à suppression de non sens




Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids


● Approches in vitro.– Screening : tRNA + tRNA synthétase + spectro de masse – Quelles molécules chargeables ?





Très grosse diversité ...

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesMutagenèse à suppression de non sens

● Approches in vitro.– Chargement chimique des AAnon naturels– selon un code génétique modifié

Expressed Protein Ligation

● Résumé : Liaisons entre differents segments/blocs– Synthétiques– Recombinants– Recupération d'un produit avec des propriété inédite

● Principe énoncé in vitro– Retrouvé in vivo (intéines)– Incorporation de 'velcros moléculaires' chimiques à l'extrémité

des fragments

Expressed Protein Ligation

● INTRODUCTION

● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Protein Semisynthesis

– Chemical Ligation of Unprotected Peptides

– Native Chemical Ligation

– Protein Splicing and Trans-Splicing

– Expressed Protein Ligation

● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL

– Résumé

– Production des fragments

– Un kit commercial

● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Introduction of Fluorescent Probes

– Introduction of Posttranslational Modifications

– Introduction of Stable Isotopes.

– Introduction of Unnatural Amino Acids

– Topology Engineering of Proteins

● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY

Manipulations Chimiques des Protéines

● Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. Annu Rev Biochem. 2003;72:249-89. TW Muir– Expressed protein ligation. Eur. J. Biochem 2004;271:663-77

R David, MPO Ritcher AG Beck-Sickinger– Manipulating proteins with chemistry: a cross-section of

chemical biology Trends Biochem Sci. 2005;30,26-34 ME Hahn and TW Muir

Développement de la ligation des Protéines Exprimées « EPL »

●Semi-synthèse des protéines●Ligation Chimique des peptides non-protégés●Ligation Chimique Native (NCL)●Epissage des protéines et Trans-épissage●Ligation des Protéines Exprimées (EPL)

Semi-synthèse des protéines● Historiquement :

– Blocs : fragments de protéines (clivage)● Clivage Chimique (CNBr)● Clivage Protéolytique

● Obervation ancienne (Dyckes Nature 1974)

– Clivage chimique (CNBr) : Pancreatic Trypsine inhibitor / Cytochrome c

– Repliement coopératif– Proximité des extrémités : Homosérine lactone /Amine Term Libre

– Réaction chimique spontanée, recondensation spontanée, liaison native

● => Incorporation d'Aa non naturels dans le cytochrome C– (Wallace Biochemistry 1997)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi-synthèse des protéinesSemi-synthese : Tout processus spécifique de modification d'une

protéine naturelle (# bioconjugaison : pas suffisamment spécifique)

● I - Marquages : modérément à hautement spécifique

– Exemples 1● Introduction d'une Cys (Mutagenèse standard)● Dérivation du thiol / réactif – sonde chimique

– Incorporation d'un « Cross linker photoactivable– Inc. Fluorophores– Préparation d'enzymes «photocagées »– Optimisation de l'affinité de la Maltose Binding Protéin


Semi-synthèse des protéines● I -Marquages : modérement à hautement spécifique

– Exemples 1– Exemple 2

● Marquage modérément spécifique de l'amine Nterm vs amines Lys/Arg– 'pKa différents– Réaction d'un groupement activé sous condition légerement acide (Wetzel

Bioconjugate Chem. 1990)


Semi-synthèse des protéines● I -Marquages :

– Exemple 3 (Zou JACS 2002)

● ATPγS + Enzyme kinase (Thr197-ThioPhosphate)

● S-alkylation du ThioPhosphate (4-hydroxyphenacyl bromide)

Version photocagée de la kinase A– Liberation par UV

– Cofilin (mobilité cellulaire) Ghosh 2002, 2004 JACS


HO

Semi-synthèse des protéines● II - Stratégie de Protéolyse inverse :

– Enz protéolytique– Altération des conditions de réaction : favoriser l'aminolyse vs hydrolyse

– Hte C° de solvant organique : Glycérol, DMF, Acétonitryl

– Blocage de l'intermédiaire peptyl-Enz– Aminolyse avec Pep2 – Résultats probants : Subtilisine, Trypsine, Papaïne



– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B (Witte K, JACS 1997)

● Réac enz. Oligosaccaride / ligation peptidique Introduction de l'oligosaccaride Sialyl Lewis X/ 1 site spécifique



– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B

– Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin (Borodovski EMBO J 2001)

● Approche Chimio-Enz.● Estérification médiée/ Trypsine


hydrazine

Ac Nitreuxglycine vinyl sulfone

(20 %PEG 20000)


– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B

– Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin (Borodovski EMBO J 2001)

● Approche Chimo-Enz.● Estérification médiée/ TrypsineCaractérisation d'enzymes impliquée dans l'ubiquitination


(20 %PEG 20000)

Table 1: Deubiquitylating enzymes of S.cerevisiaeGene Mol. wt (kDa) UbVS labeling CharacterizationUbp1 93 ++ known UbpUbp2 146 ++ known UbpUbp3 110 - known UbpUbp4/Doa4 105 - known UbpUbp5 92 - known UbpUbp6 57 ++ known UbpUbp7 123 - putativeUbp8 54 - putativeUbp9 86 - putativeUbp10/Dot4 88 - known UbpUbp11 83 - known UbpUbp12 143 + putativeUbp13 77 ND putativeUbp14 91 - known UbpUbp15 143 ++ known UbpUbp16 57 ND putativeYuh1 26 ++ known Uch

I125

Semi-synthèse des protéines● III - Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi-

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytique

● Exemple Historique (Nakatsuka JACS 1987) : la trypsine– Ser (triade catalytique) -> Cys– Activité d'acétylation +++

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »– Ser->Cys : Acétylation de l'Enz / substrat Pep1-Cterm-Phenylalanylglycolate– Pro->Ala : suppression de l'encombrement stérique local : aminolyse efficace par

Nterm- Pep2– Reconstitution de Pep1-Pep2– Synthèse chimique de protéines entières – Prep de pep cycliques– Prep de protéines semi-synthetiques ...


Semi-synthèse des protéines● III - Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi-

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytiques

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »


● 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus

Protection-Déprotection

Synthèse totale de la Ribonucléase A + variants avec résidu(s) catalytique 4-fluorohistidine (153 Aa).

Décalage de l'activité vers les pH acide (4 vs 7)

Semi-synthèse des protéines● IV - Combinaison synthèse chimique et semi-synthèse

enzymatique– Réaction de type hydrazone-oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating

Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)– VALIDATION– Mutagénèse : insertion d'une séquence unique -Lys-Ser-– Protéolyse spécifique– Oxidation périodique du N-term Frag2 en aldéhyde– Formation d'un hydrazide C-term Fragm1 par protéolyse inverse– Mélange Frag1 et Frag2 : religation en protéine native – EXTENTION– Définition d'un fragment central– Remplacé par un pep de synthèse : « synthetic cassette mutagenesis »



enzymatique– Réaction type hydrazone-oxime


Factor » (analogue du G-CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)


Aldéhyde : réaction d'oxidation periodique

Fragment : digestion spécifique -K-S- par protease de Achromobacter






Insert

Hydrazide : réaction enzymatique (protease de Achromobacter)






Insert

(Augmentation de la flexibilité)

(hydrazone)






Insert






+

Insert


enzymatique



enzymatique– Extension à d'autres réactions basées sur les oximes– Incorporation de résidus non naturels (Simmons Science 1997)

● Exemple : Inhibiteur potentiel du HIV-1– Cible : β-Chemokine RANTES– ligand du corécepteur CCR-5 de HIV-1– RANTES : inhibiteur compétitif de l'infection par HIV-1 in vitro– RANTES : très pro-inflamatoire– Couplage de l'AminoOxyPentane sur RANTES-N-term (oxidation periodique

->Ser Nterm : groupe glyoxyl)– AOP-RANTES :

● inhibiteur sur Cell. Immunitaires● Pas d'effet inflamatoire


O-NH2

Semi-synthèse des protéines● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines

– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations● Exemple historique : synthèse totale de la HIV-1 Protéase (Schnölzer 1992

Sciences)

– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7

● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (1992-1994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (1994-2000)


Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire



– Kemp «prior thiol capture» (Kemp J Org Chem 1993)


4-hydroxy-6-mercaptodibenzofuran

Cys protégée


– Kemp «prior thiol capture» (Kemp J Org Chem 1993)

● Temps de transfert (t1/2) : 0,1 à 50 h● Pas de racémisation

– Cterm BPTI (29 résidus – 4 blocs, sans protection)– 39 résidus et 25 résidus -synthèse à haut rendement)-1993-

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)



– Kemp «prior thiol capture»– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)


N-terminal Cys

C-terminal α-thioesther● Améliorations

– Nterm # cys– Cofacteur thiol catalitique– Solution et phase solide– Ligation séquentielle

Énormément de développement ...


– Kemp «prior thiol capture» – Ligation totalement native (Dawson 1994 science)

● Ex de protéines complètes– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)

– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)

– human neutrophil pro α-defensin-1 (75 residues) (Wu J Pept Res

2003).● Protéines avec modifications post-traductionnelles

– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de

glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001).



– Kemp «prior thiol capture» )

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications post-traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)

– Le protooncogène H-Ras (166 residus) avec un Ras-binding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).

– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues) (Kochendoerfer Science 2003)

● Prolongation de demi-vie , ● Amélioration de l'activité biologique



– Kemp «prior thiol capture» – Ligation totalement native

● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications post-traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)

– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native


Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science)


Protéine recombinante avec Cys en Nterm

+

Peptide de synthèse comprenant l'α-thioesther

Peut-ont obtenir l'α-thioesther par protéine recombinate ?

=> Oui, grâce aux intéines ...

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)


– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)

– 444 intéines (02/08) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)

● Eukarya (Levures, Algues, champignons)

● Eubacteria, Archaea– Pas de contraintes de séquence sur les

Exteine sauf ...

– Motifs conservés dans les Inteines

! Présence d'une Cys à la jonction des Extéines(ou S ou T ...)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Motifs concervés dans les Inteines


Intein Block C Block D Block E Block H Consensus LhG..hhaG .K.IP..h .L.GhFahDG p.S..hh..h..LL..hGI

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme


succinimide



– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit

par la stucture 3D


– Transfert de la C-Exteine


Intermédiaire branché

succinimide


– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)


(i) Excision de l'intéine (succinimide)(ii) Formation de la liaison peptidique Même réaction chimique que dans la

Ligation Chimique Native (S->N acyl transfert)


– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante ● Extéine N-term : séquence protéique d'intérêt● Extéine C-term pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée -> Ala de l'intéine



– Exploitation Biotechnologique : ● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :


– Blocage à la première étape ...– Substitution de la cyclisation

monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)

=> Préparation d'un dérivé α-thioesterOK pour ligation chimique natives

+ peptide synthétiqueProduit semi-synthétique


– Exploitation Biotechnologique : ● Trans-epissage :


– Intéine en 2 morceaux inactifs– Reconstitution intéine active

● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot

recombinantes)● Dénaturation-renaturation des 2

nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE (Synechocytis)

naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation

Purification

Reconstitution


– Exploitation Biotechnologique : ● Trans-epissage :


– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt.

(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des

segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)

● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)


– Exploitation Biotechnologique : ● Application récente :

– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)


=> Epitope scanning, kinase assays : sensibilité de la puce x 10000


– Exploitation Biotechnologique● Applications récentes :

– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)

– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)

– Plantes transgéniques (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)

● splitting entre noyaux et chloroplaste


=> Pas de transmission du gène fonctionnel au pollen


– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes :


– Processing normal

– Complémentation induite

– Self complémentation (mutant sans processing)


– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes : Molecular switches


– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans-splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)


– Exploitation Biotechnologique : ● Applications récentes : Molecular switches


– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans-splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)

Expressed Protein Ligation (EPL)

● INTRODUCTION

● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Protein Semisynthesis

– Chemical Ligation of Unprotected Peptides

– Native Chemical Ligation

– Expressed Protein Ligation

– Protein Splicing and Trans-Splicing

● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL

– Résumé

– Production des fragments

– Un kit commercial

● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Introduction of Fluorescent Probes

– Introduction of Posttranslational Modifications

– Introduction of Stable Isotopes.

– Introduction of Unnatural Amino Acids

– Topology Engineering of Proteins

● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY

RésuméMise en pratique de l'EPL

●Prot recombinante Cys N-term + Pep de synthèse α thio-Esther

ProtéineCys-Peptide-COSR

●Prot recombinante α thio-Esther + Pep de synthèse Cys Nterm

Cys-Peptide

●Pep de synthèse Cys N-term + Pep de synthèse α thio-Esther

●Prot recombinante α thio-Esther + Prot recombinane Cys Nterm

Peptide-COSR

Protéine -COSR Cys-Peptide

ProtéineCys-Protéine -COSR

- Synthèse chimique totale100 aA/bloc)

- In vitro ou in vivo

- Introduction de propriétés non natives / 100 aA C-term

- Introduction de propriétés non natives / 100 aA N-term

Autres possibilitésMise en pratique de l'EPL

ProtéineCys-Protéine -COSR Cys-Peptide-COSR

-COSR Cys-

RSOC--Cys

● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion

– Cyclisation

– ...=> Production des fragments + ligation

(in vitro ou in vivo)

Production des fragments (protéines recombinantes)● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité● Formation du dérivé α-thioesther :

– Petites molécules nucléophiles– Pénétration de la poche catalytique– Stabilité du α -thioester– Réactivité suffisante pour la ligation

● Alkyl-thioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2-mercaptoethansulfonique (MESNA)

Mise en pratique de l'EPL

Production des fragments (protéines recombinantes)

● Production de la Cys N-term– Expression directe avec Met-Cys-Prot

● Met aminopeptidase (mauvais rendements– Protéolyse

● Facteur Xa (Cterm de Ile-Glu-Gly-Arg, Ile-Asp-Gly-Arg et Ala-Glu-Gly-Arg. )

● TEV (protéase du tobacco etch virus Glu-X-X-Tyr-X-Gln- -Ser/Cys.)

– Intéines modifiées autoclivables● pH-température● Risque de clivages intempestifs ...


Un kit commercial● Le système IMPACT® (New England Biolabs)


– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln->Ala)

● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'α-thioester ou de

la Cys therminal– Vecteurs

– Colonne de Chitine

Documents

Présentations d'articles Lundi 29 septembre à 14 hofandeloule.free.fr/Hemisynth2008.pdf · 2008-09-16 · – Exemple 2 : Sonde vinyl Sulfone attachée en C-term de l'ubiquitin