PURIFICATION ET CARACTERISATION DES … · fait appel à de nombreuses techniques physico-chimiques et ... Institut des Sciences de la Nature, ... Elle est complétée par une caractérisation

Archives de l’Institut Pasteur d’Algérie Tome 63-1999

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PURIFICATION ET CARACTERISATION DES FRAGMENTS F(AB’)2

A PARTIR D’UN SERUM ANTI-SCORPIONIQUE

ISOLATION AND CARACTERIZATION OF F(AB4)2 FROM AN ANTI-VENOM OF SCORPION

Fatima Laraba-Djebari1 et Djélila Hammoudi-Triki2

RESUME

Dans le but d’accroître encore la pureté des anticorps anti-scorpioniques et leur sécurité d’emploi, la purification d’un anti-venin fait appel à de nombreuses techniques physico-chimiques et immunologiques.

L’une des premières étapes fait appel à un traitement usuel des sérums équins prélevés par des sels d’ammonium selon les cahiers de l’IPA avec de légères modifications.

Les autres étapes de purification font appel :

- A une maîtrise du clivage enzymatique par la pepsine pour obtenir un maximum d’anticorps sous forme de fragments F(ab)’2 et l’élimination de toutes autres protéines sériques et surtout d’anticorps sous forme d’IgG pouvant être la cause des effets secondaires du sérum anti-scorpionique.

- A une analyse régulière des fragments obtenus par différentes techniques chromatographiques et électrophorétique.

- A une analyse de la spécificité et du titre des anticorps par chromatographie d’affinité et par des tests immunologiques.

Des études comparatives de différents échantillons sériques font l’objet de cette étude.

Mots clés : Purification, sérum anti-scorpionique, fragments F(ab’)2, titre des anticorps.

1 Laboratoire de Recherche et Développement sur les venins, Institut Pasteur d’Algérie 2 Laboratoire de Biochimie, Institut des Sciences de la Nature, Université des Sciences et de la

Technologie « Houari Boumedienne », Alger, Algérie.

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SUMMARY

In order to further increase the homogeneity and the safety of scorpionic antibodies, purification of anti-venom consists in combinated immunologic, physical and chemical technics.

The first step consists in a precipitation of equin sera in ammonium salts as described by IPA modified texts.

The other steps of purification consist in the control of :

- Hydolysis of IgG by pepsin which leads to a maximum of antibodies as F(ab’)2 fragments.

- Elimination of all no specific residual components of animal sera by chromatography.

- Analysis of these fragments by SDS-PAGE.

The specificity of this anti-venom was also analysed by immunologic tests and by immuno-affinity.

A comparative analysis of some seric samples was described in this study.


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INTRODUCTION En présence d’une envenimation scorpionique, la thérapie vise à ralentir la diffusion du venin, à neutraliser les toxines et à traiter les désordres cliniques observés. La sérothérapie représente le seul moyen rationnel pour combattre l’envenimation scorpionique et surtout les symptômes cliniques engendrés [De Rezende et coll., 1995, Ismaïl et coll., 1992, Revelo et coll., 1996]. L’efficacité d’un anti-venin dépend de plusieurs paramètres : il y a d’une part, l’immunisation de l’animal devant se faire avec l’antigène le plus homogène possible ; d’autre part, l’efficacité du sérum doit également tenir compte de la pureté des anticorps spécifiques produits.

Ces étapes consistent en :

L’immunisation des chevaux avec des doses croissantes d’antigène qui provoquent une réponse immunitaire caractérisé par une production d’anticorps anti-venin dans leur sérum [Laraba-Djebari et Hammoudi 1998]. L’obtention d’un sérum équin devant ensuite subir plusieurs étapes de purification visant à éliminer des protéines sériques non spécifiques au venin pouvant être responsables de la majorité des incidents anaphylactiques (Alouf, 1984).

L’élimination des protéines non spécifiques n’est pas suffisante pour éviter les incidents, les immunoglobulines peuvent également présenter des risques pour la victime. Pour cela, le clivage enzymatique des immunoglobulines par la pepsine ne permet de conserver que les fragments F(ab’)2 doués de l’activité anticorps.

Cette étude décrit les différentes étapes requises pour l’obtention de ces fragments f(ab’)2. Elle est complétée par une caractérisation physico-chimique et immunologique des sérums traités.

II- MATERIELS ET METHODES II.1- Matériels II.1.1- Matériels biologiques : II.1.1.1- Les scorpions Androctonus australis Hector provenant de certaines

régions du Sud Algérien dont notamment Ksar-Chellala, sont ramassés et livrés à l’Institut Pasteur d’Algérie (IPA).

II.1.1.2- Les souris de type Swiss (20 ± 2g) proviennent de l’élevage de l’annexe de l’IPA (Kouba).

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II.1.1.3- Les lapins proviennent de l’élevage de l’annexe de l’IPA (Kouba).

II.1.14- Le venin Androctonus australis Hector est obtenu par stimulation électrique et délivré par le service des sérums thérapeutiques sous forme lyophilisé.

II.1.1.5- Les sérums : Des échantillons provenant de lots de sérums anti-scorpioniques commercialisés (n° 4552, 4562 et 4566) ainsi que des échantillons de prélèvements d’immun-sérum expérimental anti-Ftox G-50 ont été utilisés dans cette étude.

II.1.2- Produits chimiques : Les produits chimiques utilisés proviennent de différents fournisseurs (Merck, Sigma et Pharmacia).

II.2- Méthodes II.2.1- Première étape de purification du sérum : Précipitation du sérum

par le sulfate d’ammonium

Les sérums prélevés sont dans un premier temps centrifugés à 4 500 trs/min pendant 30 minutes. Cette étape est suivie d’une précipitation à 50% avec du sulfate d’ammonium saturé.

Les anticorps obtenus sont soumis à un clivage enzymatique par la pepsine (2mg/100mg d’anticorps) à pH 4,5 et 37°C pendant une nuit suivi d’une dialyse pendant 48 heures à 4°C.

Les fragments F(ab)’2 obtenus sont soumis à une deuxième précipitation par les sels à 40%.

Toutes ces étapes sont suivies d’une centrifugation à 4 500 trs/min pendant 30 minutes.

Après une dialyse dans les conditions poussées, le sérum est soumis à plusieurs techniques chromatographiques pour vérifier l’homogénéité des anticorps spécifiques. II.2.2- Dosage des protéines :

Le dosage des protéines anticorps présents dans les différents échantillons est entrepris par trois méthodes, une évaluation de la densité optique à 280 nm est rapportée à chaque étape de la préparation de l’échantillon. Un dosage des protéines est également établi par la méthode de Lowry (1951). La concentration des protéines des échantillons est également vérifiée par la méthode de Bradford (1972) utilisant une micro-méthode de dosage.


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II.2.3- Chromatographie par filtration moléculaire :

Le sérum (10 ml) est soumis à une colonne Pharmacia (50 x 7,5 cm) contenant du Sephadex G-200. L’émulsion est réalisée avec un tampon acétate d’ammonium 0,1 M, pH 8,5 avec un débit constant de 60 ml/heure. II.2.4- Chromatographie sur DEAE Sephadex A-50 :

Le gel utilisé est tout d’abord dégazé, coulé sur une colonne Wathman (25 x 2,5 cm) et équilibré avec un tampon acétate d’ammonium 0,0175 M, pH 8.

L’échantillon sérique (279 UDO) traité au préalable est ensuite déposé à la surface du gel.

L’émulsion est effectuée dans un premier temps à l’équilibre dans le tampon acétate d’ammonium 0,0175 M, pH 8, suivie d’un gradient discontinu de force ionique (0,04 ;0,1 à 0,5 M). La lecture de la densité optique des fractions collectées (5 ml) est effectuée à 280 nm. Les fractions poolées sont ensuite dialysées et lyophilisées. II.2.5- Chromatographie par affinité sur Sepharose 4 B activé au BrCN :

La première étape de cette technique correspond à une réaction d’immobilisation selon le protocole de Avrameas (1971) du venin d’Androctonus australis Hector ou de la fraction toxique G-50 isolée à partir du même venin sur un gel Sepharose 4B activé au BrCN.

Après avoir contrôlé toutes les étapes de cette réaction, le gel est coulé sur une colonne Wathman (20 x 1 cm) à 4°C. Il est ensuite équilibré avec un tampon PBS 0,1 M pH 7,4.

L’échantillon sérique traité au préalable est déposé à la surface du gel.

Une première élution est effectuée à l’aide d’un tampon PBS 0,1 M ; pH 7,4, elle est suivie après une ligne de base par une élution avec un tampon glycine-HCI 0,1 M, pH3. La dernière élution est effectuée avec le tampon Glycine-HCI 0,1 M, pH2. La lecture de la densité optique est effectuée à 280 nm. II.2.6- Electrophorèse sur SDS-PAGE (Laemmeli, 1970) : L’analyse électrophorétique de nos échantillons est réalisée sur un appareil d’électrophorèse Phast-System (Pharmacia).

Les échantillons à analyser sont préparés dans un tampon de dénaturation contenant du Tris-HCI 10mM, pH8, SDS 10 % et du glycérol. Après chauffage, les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 12,5 % puis

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introduit dans une chambre d’électrophorèse selon les prescriptions du fournisseur. Après migration le gel est transféré dans une chambre de développement où il subit plusieurs étapes de coloration au nitrate d’argent et de décoloration selon les cahiers du fournisseur. II.2.7- Titre des anticorps par hémaglutination Les globules rouges de moutons formolés sont sensibilisés avec 1 mg/ml de venin en présence de 120 µl de glutaraldéhyde (25 %). Après une incubation pendant 1 heure à 56°C et une centrifugation à 2500 trs/min pendant 5 minutes, les globules rouges sont soumis à des lavages successifs avec un tampon glycine 0,1 M pH 8,2.

Le test d’hémaglutination est réalisé sur microplaques. Les échantillons sériques à titrer sont dilués au 1/40ième dans un tampon PBS 0,1 M ; pH 7,5 et déposés dans le premier puits (50 µl). Des dilutions au demi sont ensuite réalisées dans les puits suivants. Les globules rouges sensibilisés avec l’antigène sont ensuite déposés (25 µl). Après une agitation dans les conditions douces, la lecture de la réaction antigène-anticorps est effectuée à l’œil nu après 2 heures d’incubation à température ambiante. II.2.8- Titre des anticorps par ELISA : Le test ELISA est réalisé selon la méthodologie déjà citée (Laraba-Djebari et Hammoudi, 1998). II.2.9- Test de séroneutralisation Ce test a été réalisé selon le protocole déjà cité (Laraba-Djebari et Hammoudi, 1998).

III- RESULTATS ET DISCUSSION Après immunisation d’un cheval avec la fraction toxique majoritaire (Laraba-Djebari et Hammoudi, 1998), le sang est prélevé et les échantillons sériques sont analysés.

La purification des anticorps présents dans les immun-sérums anti-scorpioniques a été entreprise par de nombreuses méthodes comprenant un protocole de précipitation par les sels d’ammonium, un clivage enzymatique par la pepsine et des techniques de chromatographies variées.

L’homogénéité des différents échantillons sériques ayant une activité anti-venin ou anti-toxine a été vérifiée par différentes méthodes physico-chimiques.


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III.1- Dosage des protéines Une évaluation de la densité optique à 280 nm est rapportée à chaque étape de la préparation de l’échantillon ainsi que par la méthode de Lowry (1951). La concentration des protéines des échantillons est également vérifiée par la méthode de Bradford (1972) utilisant une micro-méthode de dosage. La comparaison de certains échantillons sériques expérimentaux avec des lots commercialisés montrent des concentrations protéiques de 40 ± 2 mg/ml pour les échantillons expérimentaux alors qu’ils sont de 23 ± 2 mg/ml pour les échantillons issus de lots commercialisés. III.2- Chromatographie par filtration moléculaire des anticorps anti-FToxG-50

La filtration moléculaire sur Sephadex G-200 a permis d’analyser plusieurs échantillons. Des échantillons de sérums commercialisés ainsi que des échantillons expérimentaux ont été soumis à ce type de chromatographie pour vérifier d’une part, l’homogénéité des anticorps et d’autre part, l’efficacité du clivage enzymatique par la pepsine. Le profil chromatographique obtenu montrent dans les préparations expérimentales que les fragments F(ab)’2 constituent la majorité des protéines présentes dans l’échantillon, il persiste très peu d’albumine résiduelle (figure 1). Cependant, il apparaît une importante hétérogénéité dans l’échantillon issu d’un lot de sérum commercialisé. Ce dernier échantillon semble être constitué d’une grande majorité d’immunoglobulines non clivées, de différents fragments d’immunoglobulines et d’une importante quantité d’albumine résiduelle (figure 2). Cette hétérogénéité est due probablement à un clivage enzymatique aléatoire. III.3- Chromatographie sur DEAE Sephadex A-50 :

Afin de mieux contrôler l’homogénéité des différents échantillons, une chromatographie échangeuses d’anions a été utilisée. Les résultats obtenus montrent que les anticorps spécifiques présents dans les échantillons commercial (figure 3) et expérimental (figure 4) sont élués à l’équilibre et au début de la chromatographie. Il persiste cependant une certaine hétérogénéité dans l’échantillon issu d’un lot commercialisé. Cette hétérogénéité serait probablement due à la présence de protéines sériques résiduelles. III.4- Chromatographie d’affinité sur Sepharose 4B activé au BrCN et

couplé au venin brut d’Androctonus australis Hector :

Deux types de chromatographies d’affinité ont été réalisés pour la purification des fragments F(ab)’2 présents dans différents échantillons : des échantillons obtenus à partir de lots commercialisés et des échantillons d’immun-sérums expérimentaux (figure 5 et 6).

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L’une des chromatographies utilise une colonne de gel couplé avec le venin brut d’Androctonus australis Hector, l’autre gel est couplé à la fraction FToxG50 du même venin.

Pour différentes élutions, les profils de chromatographie obtenus révèlent trois pics classiques pour ce type de chromatographie. Le premier pic correspond aux protéines n’ayant aucune affinité avec l’agent couplé au gel. Ces protéines pourraient être des protéines sériques n’ayant pas été éliminées au cours des différentes précipitations.

Le deuxième pic élué à pH3 correspondrait aux anticorps spécifiques de moyenne affinité, alors que le troisième pic est constitué des anticorps de haute affinité élué à pH2. La comparaison des profils obtenus avec des échantillons différents (lots commercialisés et échantillons expérimentaux) montrent que ces derniers sont plus riches en anticorps de très haute affinité avec venin brut ou avec la fraction isolée. Les échantillons provenant des lots commercialisés semblent renfermer en majorité plus d’anticorps de moyenne affinité, le reste des protéines appartient aux protéines non spécifiques. III.5- Analyse électrophorétique des fragments F(ab)’2 sur SDS-PAGE :

L’homogénéité des différents échantillons sériques a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12,5% en présence de SDS (figure 7). Les résultats montrent que les différents échantillons issus de lots commercialisés révèlent une certaine hétérogénéité avec au moins 4 bandes protéiques estimées à 160, 100, 67 et 20 kDa. Ces protéines correspondraient respectivement aux IgG non hydrolysés par la pepsine, aux fragments F(ab)’2, probablement à d’autres protéines sériques résiduelles dont notamment l’albumine (pistes 3 et 4). L’échantillon provenant de l’immun-sérum expérimental (prélèvement n° 65) montre une meilleure homogénéité, en effet, cet échantillon ne révèle qu’une seule bande protéique (piste 2) ayant une masse moléculaire estimée à 100 kDa qui correspondrait aux fragments F(ab)’2 spécifiques. La bande qui migre tout à fait au front de migration correspondrait aux fragments Fc résiduels non dialysables. III.6- Détermination du titre des anticorps par hémaglutination : Le titre des différents échantillons sériques contrôlé par hémaglutination utilisant des globules rouges sensibilisés avec comme antigène le venin Androctonus australis Hector montrent que les échantillons issus de lots commercialisés révèlent un titre allant de 320 à 640 alors que celui de l’échantillon expérimental varie entre 10 240 à 20 480.


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III.7- Détermination du titre des anticorps par ELISA et par Séro-

neutralisation chez la souris : Les titres des anticorps présents dans les différents échantillons contrôlés par ELISA simple montrent que les anticorps présents dans les échantillons issus de lots commercialisés présentent un titre variant entre 4000 et 8000, alors que celui de l’échantillon expérimental présente au titre de 32 000 à 64 000 (figure 8). Ce résultat est confirmé par ceux obtenus in-vivo chez la souris où le titre neutralisant (DL50/ml de sérum/kg d’animal) augmente de 7 à 10 fois chez l’immun-sérum expérimental (Laraba-Djebari et Hammoudi 1998). Cette augmentation des titres de l’échantillon expérimental est attribuée à de nombreux paramètres dont notamment l’utilisation de l’antigène adéquat. CONCLUSION La proposition de la sérothérapie comme moyen de lutte anti-scorpionique doit reposer sur plusieurs paramètres devant d’abord être maîtrisés par tout producteur de sérum anti-venimeux. Ces paramètres regroupent à la fois le mode d’immunisation mais surtout la purification des anticorps neutralisants. Au cours de cette étude, la purification des anticorps anti-venin de Androctonus australis Hector a été entreprise par différentes techniques physico-chimiques faisant appel à plusieurs étapes de précipitation par les sels d’ammonium, des techniques chromatographiques d’exclusion moléculaire mais surtout à celle ayant trait à la spécificité des anticorps. Les résultats obtenus montrent qu’à travers cette étude, les anticorps obtenus dans l’immun-sérum expérimental se présentent sous forme de fragments F(ab)’2 homogènes. Le titre de ces anticorps déterminés par différentes techniques immunologiques semble élevé en comparaison avec d’autres lots déjà commercialisés. Ces titres sont supérieurs de 4 fois à ceux des échantillons issus de lots commercialisés par dosage immuno-enzymatique. La capacité neutralisante de cet immun-sérum expérimental est de 6 à 10 fois supérieure à celle des autres échantillons analysés. Ces analyses confirment également la capacité neutralisante des sérums commercialisés qui quand ils sont utilisés dans les délais, peuvent protéger l’animal contre une dose de venin allant de 1000 à 2000 DL50/ml/kg.

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4

3

2

1

00 100 200 300

N° de tubes

Abs

orba

nce

à 28

0 nm

Figure 1 : Filtration moléculaire sur Sephadex G-200 d’un sérum anti-scorpionique (IPA lot n° 4566), (2ml de sérum soit 342,2UDO) utilisant une colonne Pharmacia (100 x 2,5 cm), undébit de 25 ml/heure et un tampon d’élution AcNH4 0,1M ;pH 8,5.

* La flèche indique la fraction répondant positivement enhémaglutination avec des hématies sensibilisées avec la fractiontoxique majoritaires (FToxG50).


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Figure 2 : Filtration moléculaire sur Sephadex G-200 d’un sérum anti-scorpionique expérimental (2 ml soit 342,2 UDO) utilisant unecolonne (100 x 2,5 cm), un débit de 60 ml/heure et un tampond’élution AcNH4 0,1 M ; pH 8,5.

* La flèche indique la fraction répondant positivement en hémaglutination avecdes hématies sensibilisées avec la fraction toxique majoritaires (FToxG50).

4

3

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1

00 100 200 300

N° de tubes

Abs

orba

nce

à 28

0 nm

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Figure 3 : Chromatographie sur DEAE Sephadex A-50 d’un sérum anti-scorpionique IPA lot n° 4566) (3 ml soit 352 UDO) utilisantune colonne Watman (45 x 2,5 cm), un débit de 25 ml/heureet un tampon d’élution AcNH4 0,1 m ; pH 8,5. Gradient 0,1Mà 0,5M, pH 8,5.

1,0

0,5

0,0

0 100 200 N° de tubes

Abs

orba

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à 28

0 nm


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Figure 4 : Chromatographie sur DEAE Sephadex A-50 d’un immun-sérum anti-scorpionique expérimental (anti-FToxG50) (3mlsoit 352 UDO) utilisant une colonne Watman (45 x 2,5 cm),un débit de 25 ml/heure et un tampon d’élution AcNH40,1M ; pH 8,5. Gradient 0,1 M à 0,5 M, pH 8,5.

N° de tubes

Abs

orba

nce

à 28

0 nm

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Figure 5 : Chromatographie d’affinité d’un SAS-IPA sur une colonne deSépharose 4B activée au BrCN et couplée à la fractiontoxique majoritaire du venin. Colonne Pharmacia (1 cm x 20), débit 10 ml/heure.

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3

2

1

00 10 20 40

N° de tubes

Abs

orba

nce

à 28

0 nm

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Figure 6 : Chromatographie d’affinité d’un immun-sérum expérimentalanti- FToxG50 (sérum précipité et pepsiné) sur une colonne deSepharose 4-B activé au BrCN et couplée à la fractiontoxique majoritaire du venin d’Androctonus australis Hector. Colonne Pharmacia (1 cm x 20), débit 10 ml/heure.

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N° de tubes

Abs

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à 28

0 nm

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Figure 7 : Electrophorèse sur SDS PAGE (12,5 %) : Analyses de

l’homogénéité de différents échantillons de sérums anti-scorpionique. (Pistes 1 et 5 : Marqueurs de poids moléculaires ; Piste 2 : Immun-sérum expérimental ; Piste 3 et 4 : Echantillons de sérumscommercialisés).


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0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Titre 250 250 500 1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000 128000

P47 SAS4552

Figure 8 : Détermination des titres par ELISA d’échantillons issus de : Immun-sérum expérimental P47 (légende carré plein). Echantillon de sérum issu d’un lot commercialisé lot n° 4552(légende cercle plein).

Titre (inverse de dilutions)

Détermination des titres de sérums anti-scorpioniques, l’antigène utilisé est le venin d’Androctonus australis Hector

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BIBLIOGRAPHIE

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