BIOCHIMIE, 1972, 54, 1377-1380.

Purification prdliminaire et propridtds de la transamidase des glandes sous-maxillaires de beeuf.

L i e n D o K H x c , G e n e v i 6 v e HERMAN, B e r n a r d ROSSIGNOL e t H u b e r t CLAUSER.

Institul de Biochimie, Unioersil,~ Paris-Snd, Centre d'Orsay (91). (19/9/1972).

La t r a n s a m i d a s e ( L - g l u t a m i n e - D f r u c t o s e - 6 - P a m i - n o t r a n s f S r a s e (EC. 2.6.16)) a 6t6 6 tud i6e p a r S. K o r n - fe ld et al. [1] d a n s le fo ie de r a t et p a r R. K o r n f e l d [2] d a u s le m ~ m e m a t d r i e l e t d a n s les e x t r a i t s de E. coli, de Bacillus subtilis et de c u l t u r e s de ce l lu l e s Hela.

Ces a u t e u r s o n t d ~ m o n t r 6 que l ' e n z y m e d ' o r i g i n e a n i m a l e (foie et ce l lu le Hela) (PM 340.000) es t s o u m i s e h u n e i n h i b i t i o n de t y p e a l l o s t 6 r i q u e p a r I ' U D P - N - A c 6 t y l - g l u e o s a m i n e (UDP-GlcNAc) qu i p e u t ~tre con- s id6rd c o m m e le m 6 t a b o l i t e t e r m i n a l de la s 6 q u ence b i o s y n t h 6 t i q u e des s u c r e s a m i n 6 s . Les e n z y m e s d ' o r i - g ine b a c t 6 r i e n n e (PM 90.000) ne p a r a i s s e n t p a s ~tre s o u m i s e s a u m ~ m e t y p e de r 6 g u l a t i o n . Les p rop r i6 t6 s c a t a l y t i q u e s et c i u 6 t i q u e s de la t r a n s a m i d a s e pur i f l6e de fo ie de r a t o u t 6t6 r 6 c e m m e n t pr6c is6es p a r W i n t e r - b u r n et P h e l p s [3-5].

Les r 6 s u l t a t s p r 6 1 i m i n a i r e s [6] c o n c e r n a n t l ' a ceu - m u l a t i o n d ' U D P - G l c N A c so i l h p a r t i r de g lucose , en p r e s e n c e de p u r o m y c i n e , so i t /t p a r t i r de g l u c o s a m i n e , d a n s les g l a n d e s s o u s - m a x i l l a i r e s de b r e b i s q u i s y n - t h 6 t i s e n t de f o r t e s q u a n t i t 6 s de m u c i n e c o n t e n a n t p l u s de 50 p. cen t de s u c r e s a m i n 6 s [7] o n t m o n t r 6 u n e i m p o r t a n t e a c c u m u l a t i o n de ce n u c l 6 o t i d e h p a r t i r de ]a g l u c o s a m i n e , a lo r s q u e sa q u a n t i t 6 res te p r a t i q u e - m e n t c o n s t a n t e l o r s q u e le p r 6 c u r s e u r e s t le g lucose . Ces r 6 s u l t a t s s u g g 6 r a i e n t q u ' u n e r 6 g u l a t i o n a n a l o g u e h celle m i s e en 6v idenee d a n s le fo ie de r a t [1, 2] p o u r r a i t opt~rer d a n s les g l a n d e s s o u s - m a x i l l a i r e s .

La p r ~ s e n t e no te d6cr i t u n e p u r i f i c a t i o n p r 6 1 i m i na i r e de l a t r a n s a m i d a s e h p a r t i r des g l a n d e s s o u s - m a x i l - l a i r e s de t~euf et m o n t r e q u e cet te e n z y m e es t i n h ib6e s p 6 c i f l q u e m e n t p a r I 'UDP-GlcNAc. I1 e s t 6 g a l e m e n t m o n t r 6 q u e I 'UDP-N-Ac6 ty l g a l a c t o s a m i n e (UDP- GalNAc) n ' a q u ' u n f a i b l c p o u v o i r i n h i b i t e u r et que la c o u r b e d ' i n h i b i t i o n de l ' e n z y m e p a r des c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s de n u c l 6 o t i d e r ~ g u l a t e u r c o m p o r t e u n p l a t e a u a n a l o g u e h c e u x d6cr i t s p a r K o s b l a n d [8, 9] d a n s le cas d ' i n t e r a c t i o n s h 6 t 6 r o t r o p e s n6ga t ives .

M A T E R I E L ET METHODES.

Les glandes sous-maxillaires de bceuf s o u t pr61ev6es 10 m i n u t e s apr6s la m o r t de l ' a n i m a l , eonse rv6es /~ 0 ° et u t i l i s 6 e s d a n s l ' h e u r e qu i su i t .

Produits employ~s : D - G l u c o s a m i n e HC1, D - f r u c t o s e - 6-P (S igma) ; L - c y s t 6 i n e (Roche) ; L - G l u t a m i n e (Cal- b i o c h e m ) ; AMP, ADP, ATP, GMP, CTP, UMP, UDP, UTP, U D P - G l u c o s e ( P a b s t L a b o r a t o r i e s B i o c h e m i - ca ls ;) U D P - G a l a c t o s e (Ca lb ioehem) ; U D P - N - A c 6 t y l - g l u c o s a m i n e (S igma) ; U D P - N - A c d t y l - g a l a e t o s a m i n e :

<< Ce t r a v a i l f a i t p a r t i e d ' u n e t h 6 s e de 3 e Cycle sou - t e n u e le 10 j u i n 1970 h O r s a y p a r F u n des a u t e u r s (L.D.K.) >>.

d o n d u D r C. J o u r d i a n , A n n Arbor , M i c h i g a n ; f i -mer- c a p t o 6 t h a n o l (A ld r i ch C h e m i c a l C o r p o r a t i o n ) ; Dowex 50 H + (Bio R a d L a b o r a t o r y ) .

Mesure de l'aetivitd transamidasique.

Le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n e o m p r e n d : t a m p o n p h o s - p h a t e 0,12 M, pH 7,5, 200 h 300 Ixg d ' e x t r a i t e n z y m a - t i que , des c o n c e n t r a t i o n s v a r i a b l e s de f r u c t o s e - 6 - P e t de g l u t a m i n e . Le v o l u m e f inal es t de 0,5 ml . Les t e m p s d ' i n c u b a t i o n (h 37°C) v a r i e n t s e lon les exp6r i enees . La r6ac t i on e n z y m a t i q u e es t a r r~t6e p a r 6 b u l l i t i o n (5 m i n u t e s ) au b a i n - m a r i e . Le pr6cipi t6 p r o t 6 i q u e es t 61imin6 p a r e e n t r i f u g a t i o n h 20 000 g. U n e p a r t i e a l l - quo t e dn s u r n a g e a n t (0,2 ml) es t pr~lev6e p o u r le dosage du g l u c o s a m i n e - 6 - P p a r la m 6 t h o d e de Re i s s i g [10!.

R E S U L T A T S ET DISCUSSION.

Purification de la transamidase.

La p u r i f i c a t i o n de la t r a n s a m i d a s e p r 6 s e n t e de g r a n - des d i f f icu l t6s qu i t i e n n e n t h l ' i n s t a b i l i t 6 de l ' e n z y m e et & la v i scos i t6 de l ' e x t r a i t due h u n e fo r t e t e n e u r en m u c i n e s o u s - m a x i l l a i r e de b (eu f (BSM). Di f f~ren ts proc6d6s : 6 1 i m i n a t i o n de la BSM p a r les c a t i o n s o rga - n i q u e s , f r a c t i o n n e m e n t de l ' e x t r a i t p a r le (NH,)oSO4 su iv i d ' u n e c h r o m a t o g r a p h i e s u r co lonnc de DEAE- S e p h a d e x o u t 6t(~ e s s a y 6 s s a n s succ6s. En r e v a n c h e , u n e pu r i f i c a t i on p r 6 1 i m i n a i r e s a t i s f a i s a n t e a 6t6 ob te - n u e p a r f r a c t i o n n e m e n t ~t l ' 6 t h a n o l ~ - - 9 °. Cet te m~- t h o d e ava i t 6t6 e m p l o y d e p a r Podge l l [11] p o u r pu - r i f ie r la t r a n s a m i d a s e de foie qu i p r6c ip i te e n t r e 14 p. c en t et 27 p. c en t d ' $ t h a n o l : on s a i l d ' a u t r e p a r t que les m u c o p r o t 6 i n e s s o u s - m a x i l l a i r e s p r 6 c i p i t e n t h des c o n c e n t r a t i o n s d 'a lcool s u p 6 r i e u r e s h 50 p. c en t [12].

Les g l a n d e s s o n t h r o y 6 e s h 4 ° /i l ' a i de d ' u n U l t r a - T u r r a x d a n s t ro i s fo i s l e u r v o l u m e de KC1 125 mM, [~ -mercap to6 thano l 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. Les h o m o g 6 n 6 i s a t s s o n t e n s u i t e f i l t rds s u r gaze, m i s h c e n t r i f u g e r h 50 000 g p e n d a n t 90 m i n u t e s . Le s u r n a - g e a n t o b t e n u e s t filtr6 h n o u v e a u p o u r 61 imine r les l ip ides ; i l c o n s t i t u e l ' e x t r a i t b r u t et c o n t i e n t rou te la BSM et u n c e r t a i n n o m b r e d ' e n z y m e s qu i p e u v e n t i n t e r f 6 r e r avec la d d t e r m i n a t i o n des c o n s t a n t e s cin~- t i q u e s de la t r a n s a m i d a s e et l ' 6 tude de son i n h i b i t i o n p a r I 'UDP-GIcNAc : p h o s p h a t a s e , p y r o p h o s p h a t a s e et g l u t a m i n a s e .

Cet e x t r a i t b r u t es t d i lu6 7 fo i s p a r d u t a m p o n d ' h o m o g 6 n 6 i s a t i o n r e f ro id i h 0 ° e t a d d i t i o n n 6 d ' 6 t h a - nol h - - 2 0 ° j u s q u ' h u n e c o n c e n t r a t i o n f inale de 10 p. cen t en 6 thano l . Apr6s 30 m i n u t e s , le pr$cip i t6 e s t 61i- m i n 6 p a r c e n t r i f u g a t i o n h 27 000 g et l ' 6 t h a n o l es t a j o u t 6 a u s u r n a g e a n t d a n s les m ~ m e s c o n d i t i o n s

1 3 7 8 L. Do. Khac, G. Herman, B. Rossignol et H. Clauser.

j u s q u ' h une concen t r a t i on finale de 25 p. cent. Apr6s 30 minu te s , le pr6cipit6 c o n t e n a n t l 'act ivi t6 t r a n s a m i - das ique est recueil l i pa r cen t r i fuga t ion h 27 000 g. Ce prdcipit6 est d 6 p o u r v u de BSM, d 'act ivi t6 g l u t a m i n a - s ique (estim6e p a r f o r m a t i o n d 'acide g l u t a m i q u e h p a r t i r de la g lu t amine ) , d 'activit6 p y r o p h o s p h a t a s i q u e (estim6e p a r f o r m a t i o n d 'UDP h p a r t i r d 'UDP-GIcNAc). I1 cont ien t des t races d 'activit~ p h o s p h a t a s i q u e (esti- m6e p a r hyd ro lyse du p a r a n i t r o p h 6 n y l phospha t e ) , qui est d ' a i l l eu r s inhib6e pa r le p h o s p h a t e du mi l i eu d ' in- cuba t ion .

des zones de concen t r a t i on t o u j o u r s iden t iques de f rue tose-6-P 0,3 h 0,7 raM. Cette anoma l i e ava i t ~t6 interprSt6e p a r les a u t e u r s eit6s eomme i n d i q u a n t l 'exis tenee de for tes in t e rac t ions h o m o t r o p e s pos i t ives entre les sites sp6cifiques du f ructose-6-P.

La figure 4 inont re les pourcen tages d ' i nh ib i t i on ob tenus en fonc t ion de quant i t ( !s c ro i s san tes d 'UDP- GlcNAc en prSsenee de diff6rentes concen t r a t ions de f ruc tose-6-P et d 'une concen t r a t i on s a t u r a n t e de glu- t amine . I1 a p p a r a i t p o u r des concen t r a t ions de f rue-

.50

2 5 .

' ;1 -+,&m

e

• ¢

o o ~ b

7s

Fro. 1. - - Cin6t ique d ' i n h i b i t i o n de la t r a n s a m i d a s e en fonc t ion du f rue- tose-6-P p o u r diff6rentes concen t ra - t ions d 'UDP-GlcNAc :

a : nul le ; b : 0,025 m M ; e : 0,062 m M ; d : 0,086 r a M ; e : 0,248 mM ; f : 0,62 mM.

Coordonndes de L ineweaver et Burk. S est expr im6e en m m o l e s de f ruc-

t o se -6 -P / l i t r e ; V e s t expr im6e en na- uomoles de g lueosamine -6 -P form5 p a r m i n u t e dans 0,5 ml de mi l i eu d ' ineuba t ion .

L ' ex t ra i t e n z y m a t i q u e est s table h 0 ° ; ap.r6s incu- ba t ion en absence de s u b s t r a t (37 °, pH 7,5, 5 mn) , il S/vX,O8 perd 90 p. cent de son aetivit6. Le f rue tose-6-P 5. (12 raM) exeree dans ces condi t ions u n effet p ro tec t eu r abso lu a lors que la g l u t a m i n e (11 m~M) est sans effet. Ces r6su l t a t s sont ana logues h ceux ob t enus su r Fen- , zyme du foie [13].

Les K m mesu r6s son t de 9.10-4 M p o u r le f ruc tose- 6-P et 6.10-4 M p o u r la g lu tamine . Les va leurs t rouv~es a. p o u r l ' enzyme du foie sont p o u r le f ruc tose-6-P de 8.10-4 M s u i v a n t S. Korn fe ld et al. [11, de 2,2.10-4 M su ivan t R. Korn fe ld [2] et Phe lps et W i n t e r b u r n [3] et p o u r la g l u t a m i n e 6,9.10-4 M s u i v a n t Phe lps et 2 W i n t e r b u r n [3J. Les Km des enzymes a u m~me degr6 de pure t6 ex t ra i t s de foie de r a t et des g landes sous- m a x i l l a i r e s de bceuf son t donc iden t iques . '

Action de l'UDP-N-Acdtyl-glucosamine. Les figures 1 et 2 m o n t r e n t l ' i nh ib i t i on p a r des

quan t i t6s c ro i s san tes d 'UDP-GlcNAc de l 'activit~ t r a n - -Kin s a m i d a s i q u e l o r sque les s u b s t r a t s va r i ab le s sont r e spec t ivemen t le f rue tose-6-P et la g lu t amine , l ' au t r e s u b s t r a t d tant p re sen t en concen t ra t ion sa tu ran te . I1 a p p a r a i t qu ' en accord avec les r6su l t a t s de W i n t e r - b u r n et Phe lps [4] et Miyagi et Tsuik i [14], l ' i nh i - b i t ion est de type mix t e v is -h-vis du f ruc tose-6-P et non eompdti t ive vis-h-vis de la g lu t amine .

La f g u r e 3 qui u t i l i se la r e p r e s e n t a t i o n d 'Eadie m o n t r e e o m m e dans le cas de W i n t e r b u r n et Phe lps [4] des d i seon t inu i t6s en prdsence d 'UDP-GleNAe pour

BIOCHIMIE, 1972, 54, n ° 19.

(d)

(¢)

B

1 3 6 9 "S

Fro. 2. - - Cin6t ique d ' i nh ib i t i on de la t r a n s a m i d a s e en fone t ion de la g l u t a m i n e p o u r diff6rentes concen- t r a t i o n s d 'UDP-GlcNAe :

a : nnl le ; b : 0,025 mM ; e : 0,062 mM ; d : 0,086 mM.

Repr6sen ta t i on de Hanes .

S est expr im6e en m m o l e s de g l u t a m i n e / l i t r e ; V e s t expr im6e en n a n o m o l e s de g lucosamine -6 -P pa r mi- nu te dans 0,5 ml de mi l i eu d ' ineuba t ion .

T r a n s a m i d a s e des g landes sous -max i l l a i r e s . 1 3 7 9

tose -6-P v o i s i n c s du Km q u ' u n << p l a t e a u >> de la eou rbe d ' i n h i b i t i o n p a r le n u c l 6 o t i d e p e u t 6tre obse rv& Ce ph6nom~ne , h n o t r e c o n n a i s s a n c e n ' a j a m a i s 6t6 s i g n a l 6 ; i l p o u r r a i t i n d i q u e r so i t une h6t6rog~n6i t6 de l a p r 6 p a r a t i o n e n z y m a t i q u e , m a i s darts ce cas, l ' 6 1 i m i n a t i o n de l ' e f fe t h fo r t e c o n c e n t r a t i o n de f rnc - tose -6 -P s e r a i t d i f f i e i l e ~ e x p l i q u e r , so i t l ' e x i s t e n e e & i n t e r a c t i o n s h 6 t 6 r o t r o p e s n 6 g a t i v e s e n t r e les s i t es sp6ci f lques de I 'UDP-GlcNAc s u i v a n t l a d 6 f i n i t i o n donn6e p a r K o s h l a n d !8, 9]. I1 p a r a i t i n t 6 r e s s a n t de n o t e r que les zones de c o n c e n t r a t i o n d 'UDP-GlcNAc p o u r l e s q u e l l e s ce p h ~ n o m b n e a p p a r a i t son t p rocbes de la c o n c e n t r a t i o n p h y s i o l o g i q u e du n u c l 6 o t i d e d a n s l a e e l l u l e [6]. Ce p h 6 n o m ~ n e p o u r r a i t done c o n t r i b u e r

ce l le o b t e n u e p a r I 'UDP-GalNAc. La sp6cif ici t6 de I 'UDP-GlcNAc p a r r a p p o r t h ce l le de I 'UDP-Ga lNAc n ' a v a i t , h no t r e c o n n a i s s a n c e , pas encore 6t~ 6 tab l ie .

I4 r i , I i i

60 {b i b

ao 4

o l , , I , , , I"

1' ..... i i I b 1 011 d 2 ~ 015 I

/

/

. ' b

o ~ 1'6

Fro. 3. - - C i n 6 t i q u e d ' i n h i b i t i o n de la t r a n s a m i d a s e en f o n c t i o n du f r n c t o s e - 6 - P p o u r d i f f6 ren tes concen- t r a t i o n s d 'UDP-GlcNAc :

a : n u l l e ; b : 0,025 m M ; c : 0,062 mM ; d : 0,086 mM ; e : 0,248 mM ; f : 0,62 mM.

R e p r 6 s e n t a t i o n d 'Ead ie . S es t e x p r i m 6 e en m m o l e s de f r u c t o s e - 6 - P / l i t r e ; V

es t e x p r i m 6 e e n n a n o m o l e s de g l u c o s a m i n e - 6 - P f o r m 6 p a r m i n u t e d a n s 0,5 m l de m i l i e u d ' i n c u b a t i o n .

/t m a i n t e n i r une a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e c o n s t a n t e lo r s de f a i b l e s v a r i a t i o n s d u l a u x de I 'UDP-GlcNAe i n t r a - c e l l u l a i r e .

Sp~eificit~ de l'inhibition. Le t a b l e a u I m o n t r e que ce t te i n h i b i t i o n es t spSci-

f ique des U D P - s u c r e s e t q u ' e l l e es t b e a u c o u p p i n s fo r t e l o r s q u e le suc re e s t u n suc re a m i n 6 que l o r s q u ' i l s ' ag i t du g lucose ou dn ga l ac tose . L ' o r i e n t a t i o n de l ' h y d r o - x y l e du c a r b o n e 4 es t 6 g a l e m e n t i m p o r t a n t e p u i s q u e l ' i n h i b i t i o n p a r UDP-GlcNAc es t t rbs s u p d r i e u r e "h

ut )P_ GI¢ ~g¢ (raM)

Fro. 4. - - P o u r c e n t a g e d ' i n h i b i t i o n de l a t r a n s a m i - dase p a r UDP-GlcNAc p o u r d i f f6 ren tes c o n c e n t r a t i o n s de f ruc tose -6 -P .

a : 0,3 mM ; b : 0,75 mM ; c : 1,5 m M ; d : 3 m M ; e : 6 m M ; f : 9 raM.

T A B L E A U I .

Nucl6otides

UD P-N-Ac6 ty l -g lueosaminc 10-3M . . . . 10-4M . . . .

UD P-N-Ac6 ty l_ga lac tosamine 10-aM . . . . 10-4M . . . .

U D P glucose 10-aM . . . . . . . . . . . . . . . U D P ga lac tose 10-"~M . . . . . . . . . . . . . . . UMP 10:{M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U D P 10-:{M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U T P 10-:*M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AMP ll}={M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A D P 10-:551 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A T P 10-:qXl. , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CTP 10=~M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GMP ll)-:{M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pourcentage d ' inhibit ion

93 60 31

6 26 20 16 11 16

0 0 0 0 0

Remerciements.

Ce t r a v a i l a b6n6fici6 d ' u n e c o n v e n t i o n de Reche r - ches C.N.R.S. (E.R.A. N ° 33), e t d ' u n e s u b v e n t i o n de la F o n d a t i o n p o u r la R e c h e r c h e M6dica le F r a n c a i s e , que n o u s t e n o n s h r e m c r c i e r .

Nous r e m e r c i o n s M me G ine t t e D e l a r b r e de sa pr~- c ieuse c o l l a b o r a t i o n t e c h n i q u e .

B IBLIOGRAPHIE .

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