R EPUBLIQUE ALGERIENNE DE MOCRATIQUE MINISTERE DE

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE LARBI BEN M’HIDI– OUM EL-BOUAGHI

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE

LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Mémoire présenté pour l’obtention du diplôme de Master

Filière : Sciences Biologiques

Spécialité : Microbiologie Appliquée

N° d’ordre :…………

N° de série :…………

Thème

Soutenu le : 15-07-2021

Présenté par :

Moussaoui Mouna Laib Khawla Benhizia Karima

Devant le jury :

Président : Mr DJABALLAH Chamsseddine M.C.B Université OEB.

Rapporteur : Mr HAMAMES Mokhtar M.A.A Université OEB.

Examinateur : Mr CHEKARA Bouziani Mohammed M.A.A Université OEB.

Année Universitaire: 2020 - 2021

Activités antimicrobiennes des Streptomyces isolés

de différents écosystèmes

Remerciements

Tout d’abord, nous remercions alah tout puissant de nous avoir donné le

courage et la patience pour terminer ce travail.

Nous souhaitons adresser nos remerciements les plus sincères à notre encadrant

Monsieur HAMAMES MOKHTAR Maître-Assistant à l’université Larbi Ben

M’Hidi Oum El Bouaghi

pour avoir dirigé ce travail, pour son aide, ses précieux conseils, sa

compréhension et son soutien moral.

Nous tenons à remercier également les membres du jury pour nous avoir fait

l’honneur de juger et de corriger ce travail. Que monsieur DJABALLAH Ch, et

Bouziani M

Nous remercions tous nos chers professeurs qu’on a pu rencontrer pendant

notre parcours universitaire

Dédicace

À l’être le plus cher de ma vie, à la femme qui a souffert sans me

laisser souffrir qui n’a épargné aucun effort pour me rendre

heureuse : Ma mère. Quoi que je fasse ou que je dise, je ne saurai

point te remercie comme il se doit

A mon très cher père, pour ses encouragements, son soutien,

surtout pour son amour et son sacrifice afin que rien n’entrave le

déroulement de mes études

A mon frère Mounir

A toute ma famille et à mes amies je dédie ce mémoire

MOUNA

Dédicaces

Au nom du tout puissant

Je dédie ce travail

A mes très chers parents

A`

Mes sœurs et à mes frères

A`

Tous ceux qui me sont chers à tout ma famille et

mes amis

A`

Mes deux binôme Khawla et Mouna.

DEDICACE

J’ai l’'honneur de dédier ce modeste travail réalisé grâce à l'aide de

dieu tout

puissant.

Spécialement à mon père

A ma très chère mère

A mes sœurs

A mes très chers frères

A tous les membres de ma famille Laib, petits et grands.

A mes binômes : Karima et Mouna

A toute la promotion master II 2020-2021 /Option Microbiologie du

Département biologie.

Et enfin à toutes les personnes qui intervenues dans ma

Vie à un moment ou à un autre et qui m’ont accompagné et soutenue.

Khawla

Remerciement

Dédicace

Liste des abréviations

Liste des figures

Listes des tableaux

Introduction………………………………………………………………………………….1

Chapitre 01 : généralité sur les actinomycetes

1-definition et caractéristiques……....……………………………………………………...2

2-Ecologie ……………………………...……………………………………………………..3

3-Classification ………………………...………………………………………………….....4

3-1-Classification morphologique…….…………..…………………………………….......6

3-2- Classification moléculaire……………………………………………………………...6

3-3-Classification chimique………………………………………………………………....6

4-Morphologie………………………………………………………………………………..6

5-Physiologie………………………………………………………………………………….7

6-Les Streptomyces …………………………………………………………………………...8

6-1-Classification…………………………………………………………………………….9

6-2-Cycle de développement.………………………………..……………………………...10

Chapitre 02 : Isolement et criblage des activités antimicrobiennes des Streptomyces

1-Nature des échantillons……………………………………………………………………11

2-Prétraitement des échantillons…………………………..………………………………..12

2-1-Prétraitement physique………………….……………………………………………..13

2-2-Prétraitement Chimique………………………………………………………………..14

2-3-Combinaison de prétraitement physique et chimique…………………………………..15

3-Isolement des actinomycètes…………………………..…………………………………..15

3-1-La sélection nutritionnelle.........................……………………………………………..15

3-2-L’inhibition sélective.........................………………………………………………….17

4-Criblage de l’activité antimicrobienne…………………………………………………...21

4-1- Méthode de diffusion……………………………………………………..…………....21

4-1-1- Méthode de diffusion de disques…………………….........................................21

4-1-2-Méthode de diffusion des cylindres d’agar……………………………..............22

4-1-3-Méthode de diffusion de puits...………………………………..........................22

4-2-Méthodes de fermentation……………………………………………………………...23

4-2-1- Fermentation solide…………………………………………………………….23

4-2-2-Fermentation submergée………………………….…………………………….24

4-3-Extraction des molécules bioactives (Extraction liquide-liquide : ELL)……………....25

4-3-1-Principales méthodes d’extraction liquide-liquide…………………...................25

4-3-1-1- Extraction simple……………………………………………………..25

4-3-1-2- Extraction multiple……………………………...................................26

Conclusion générale

Références bibliographique

Résumé

Liste des abréviations

ADN : Acide Désoxyribonucléique

CCA : Colloïdales Chitine Agar

ELL : Extraction Liquide -Liquide

HA : Acide Humique

ME : Mercapto-Ethanol

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SmF : Fermentation Submergée

SSF : Solide-State Fermentation

TSB : Bouillon de Soja Tryptic

VA : Valine

YA : Extrait de Levure

YEME : Extrait de levure difco bactério-peptone, extrait de malt d’oxion, glucose, saccharose

Liste des figures

Figure 1 : Croissance d’un isolat actinomycétale sur gélose de caséine et d’amidon. Mycélium

aérien (a) et mycélium de substrat (b) (Harir, 2018)…………………………………………..7

Figure 2 : Classification chimiotaxonomique de Streptomyces (Lee et al.,2015)……………..9

Figure 3 : Cycle de développement des Streptomyces griseus (Loucif, 2011)……………….10

Figure 4 : Influence du traitement par ondes ultrasoniques sur les UFC des actinomycètes et

d'autres bactéries. (Jiang et al., 2016)……………………………………….………………..14

Figure 5 : Méthode de diffusion. A : diffusion des disques ; B : diffusion des puits ; C : diffusion

des cylindres d’agar (Balouiri et al., 2016)…………………………………………………...23

Liste des tableaux

Tableau 1 : Fréquence des divers genres d’actinomycètes dans le sol d’après l’étude de 16

types de sols (Belyagoubi, 2014)……………..………………………………………………..3

Tableau 2 : Classification des Actinobacteria (Goodfellow et al., 2012)……………………..5

Tableau 3 : Nature des échantillons étudiés dans les articles analysés……………………….11

Tableau 4 : Les différents types de prétraitements utilisés sur les échantillons de sols étudiés.12

Tableau 5 : Les prétraitements thermiques sélectifs pour l'isolement des actinomycètes (Jiang

et al., 2016)……………………………………………………………………………………13

Tableau 6 : Prétraitements chimiques pour l'isolement des actinomycètes (Jiang et al., 2016)14

Tableau 7 : Composition des milieux de culture utilisés pour l’isolement des actinomycètes

dans les articles analysés………………………………………………………………………16

Tableau 8 : Modifications des milieux de culture pour l’isolement sélectif des actinomycètes

dans les articles analysés………………………………………………………………………18

Introduction

générale

Introduction

1

Depuis les temps anciens, l'Homme a exploité des micro-organismes pour fabriquer

des vêtements, des boissons, des aliments. Au tournant du siècle dernier, Les micro-

organismes, à mesure de leur découverte, se sont révélés à l'homme surtout comme ses pires

ennemis, menaçant sa santé, son alimentation, ses biens. Ils le demeurent dès lors qu'existent

des défaillances humaines d'hygiène, de prévention. Avec le progrès de connaissance, il

paraît que les micro-organismes peuvent aider l'homme en agriculture, dans l'environnement,

dans les industries. Des réalisations telles que la biosynthèse de substances à visé

thérapeutique (les antibiotiques…,) ou des vaccins antiviraux, révolutionnent certains

traitements en médecine (Zouaghi, 2007).

Depuis l’introduction des antibiotiques dans l’arsenal thérapeutique des maladies

infectieuses, les microorganismes ont développé des moyens de défenses leur conférant une

insensibilité aux antibactériens ces résistances aux antibiotiques au dose thérapeutiques

apparaissent plus au moins rapidement selon la complexité chimique des antibiotiques et du

patrimoine génétique de la bactérie (Genné et al., 2003).

Actuellement, les problèmes de la résistance aux antibiotiques et la sensibilité des

malades ont conduit à la recherche continue de nouvelles souches productrices

d’antibiotique. Les actinomycètes représentent une source biologique utile d’antimicrobiens

contre des bactéries pathogènes et des mycètes. Elles ont donc le troisième rang dans les

génomes bactériens les plus séquencés (Belyagoubi, 2014).

Les actinomycètes sont capables de produire des antibiotiques de différentes classes

chimiques et des activités biologiques. Les Streptomyces spp. ont été les sources les plus

abondantes de tous les types d’antibiotiques (Lee et Hwang, 2002).

Ce genre bactérien est à l’origine d’environ 70 % des molécules actives produites à

l’échelle industrielle pour les applications pharmaceutiques. Outre ces applications, les

molécules bioactives extraites à partir des bactéries du genre Streptomyces connaissent

diverses autres applications à savoir en agriculture et en agroalimentaire (Smaoui, 2010).

L’objectif principal de notre travail consiste à définir la démarche d’isolement des

Streptomyces provenant des différents écosystèmes. Ainsi, nous nous sommes intéressés

aux :

Conditions d’isolement des actinomycètes ;

Technique de criblage de l’activité antimicrobienne des Streptomyces ;

Techniques de fermentation et d’extraction des métabolites secondaires.

Chapitre 01 : généralité sur

les actinomycètes

Chapitre 1 : Généralité sur les actinomycètes

2

1-Définition et caractéristiques

Les actinobactéries sont des microorganismes dérivés de deux mots grecs ; aktis

signifiant « rayon » et mykes signifiant « champignon ». Elles ont été classées à l’origine

comme un groupe intermédiaire entre les champignons et les bactéries mais actuellement

elles sont classées dans le domaine des bactéries (Hazarika et al., 2020).

Le phylum Actinobacteria représente la plus grande composante taxonomique parmi

la communauté microbienne (Gohain et al., 2020). Elles peuvent être trouvés dans de

nombreux écosystèmes différents, tels comme le sol, l’eau de mer, la peau humaine, les

poumons et les voies gastro-intestinales (Moura et al., 2021).

Ce groupe est très hétérogène et comprend un large spectre de microorganismes

chimiquement, morphologiquement et physiologiquement très différents. Il existe de

nombreuse espèces d’actinomycètes appartiennent presque exclusivement à deux familles

Mycobacteriaceae, Actinomycetaceae (Polti et al., 2014).

Les actinomycètes sont des bactéries filamenteuses à Gram positif ; aérobies ou

anaérobies facultatives (Hazarika et al., 2020), qui possèdent un pourcentage élevé de

guanine-cytosine (70%) dans leur génome (Gohain et al., 2020). La majorité des

actinomycètes sont immobiles mais certains types sont dispersés dans les habitas aquatiques

grâce à leurs spores flagellées (Djaballah, 2010).

Elles possèdent une croissance lente (7 à 28 jours) par rapport à celle des autres

bactéries (24 heures) (Priyanka et al., 2018) et leur isolement est difficilement réalisable

(Djaballah, 2010). Elles ont une croissance radiale en raison de leurs filaments ramifiés. En

surface, la morphologie ressemble à celle des champignons filamenteux, mais avec des

filaments de très petit diamètre (1 μm) (Moura et al., 2021).

Ce groupe de bactéries est caractérisé aussi par l’hétérogénéité fonctionnelle et le

potentiel biotechnologique de ses espèces (Moura et al., 2021) en raison de leur

métabolisme polyvalent (Bramhachari et al., 2018).

Elles sont des producteurs fertiles d’antibiotiques et jouent un rôle important dans

production de différents enzymes et inhibiteurs d’enzymes. Elles ont aussi un rôle important

dans la dégradation ou la décomposition de substances organiques telles que les

polysaccharides, la cellulose, l’amidon, la chitine, les acides organiques, protéines, graisses,

etc. (Hazarika et al., 2020).


3

2-Ecologie

Les actinomycètes sont présentes dans des sols polaires, dans les sols désertiques

chauds et secs, dans le pétrole brut, les sols hautement contaminés avec des métaux lourds,

les lacs extrêmement alcalins et les lacs salés, dans les gastro-intestinal des animaux,

commensalisme avec les plantes (Van Bergeijk et al., 2020).

Dans la nature, elles jouent un rôle très importante dans les procédés de recyclage des

nutriments et aussi dans la dégradation des composés xénobiotiques (Moura et al., 2021).

Certaines espèces sont connues pour être pathogènes contre les animaux, les plantes

et les humains, en particulier Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia

asteroides, Tropheryma whipplei, Corynebacterium diphtheriae et Propionibacterium acnes

(Moura et al., 2021).

2-1-Les actinomycètes dans le sol

Le sol est l’habitat le plus important pour les actinomycètes. On en trouve entre106 à

109 cellules par gramme de sol, donc elles représentent de 10 à 50% de leur population

microbienne (Lee et Hwang, 2002).

Les actinomycètes les plus abondantes dans le sol sont des Streptomyces. Selon

Lechevalier et Lechevalier (1967), sur 5000 souches d’actinomycètes isolées à partir de 16

types de sols, plus de 95% étaient des Streptomyces et seulement un peu plus de 1% était des

Nocardia et des Micromonospora. D’autres genres ont été isolés mais à des pourcentages

faibles et variables (Tableau N°1) (Belyagoubi, 2014).

Tableau N°1 : Fréquence des divers genres d’actinomycètes dans le sol d’après l’étude de

16 types de sols (Belyagoubi, 2014).

Genres % des isolats

Streptomyces

Nocardia

Micromonospora

Thermomonospora

Actinoplanes

Microbispora

Mycobacterium

Streptosporangium

Actinomadura

Micropolyspora

Pseudonocardia

Microellobosporia

95,34

1,98

1,4

0,22

0,20

0,18

0,14

0,10

0,10

0,10

0,06

0.04


4

2-2-Les actinomycètes dans les milieux aquatiques

Dans les eaux douces

Parmi les genres les plus fréquents dans les eaux douces, on touve Actinoplanes,

Micromonospora, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces et Thermoactinomyces. Cette

fréquence est plus élevée dans les ruisseaux et les rivières que dans les lacs et les réservoirs

(Sillini, 2011). L’adaptation des Streptomyces disséminées dans les eaux douces est assurée par

la formation des spores résistantes caractérisées soit par une psychrophilie, soit par une

halophilie ou par une barotolerance (Aouar, 2006)

Dans les eaux marines

Comparativement aux habitats terrestres et aux eaux douces, les actinomycètes sont

moins nombreux dans les eaux marines. Parmi plusieurs genres qui ont été isolés de ces

eaux, on peut citer Streptomyces, Microbispora, Micropolyspora, Nocardia,

Streptoverticillium, Thermoactinomyces… Certains prédominent dans les eaux plus

profondes tel que Streptomyces bien que d’autres sont les plus nombreux dans les sédiments

profondes tel que Micromonospora (Sillini, 2011).

2-3- Les actinomycètes dans l’air

Pour les actinomycètes, l’air ne présente pas un habitat mais plutôt un moyen de

transport qui va assurer leur dissémination par des spores et des fragments de mycélium.

Plus la quantité de poussière dans l’air est importante, plus que la dissémination de ces

formes cellulaires est plus remarquable (Sillini, 2011).

3-Classification

La classification et la taxonomie des Actinobacteria étaient principalement basées sur

des critères phénotypiques, dans lesquels les caractéristiques morphologiques, chimiques et

physiologiques ont été étudiées. La morphologie de colonie, la chaine des sports, la

couleur du mycélium substrat et du mycélium aérien, les pigments diffusibles sont encore

des facteurs importants dans la différenciation des genres mais ne fournissent pas

d’informations adéquates pour la classification de ce phylum (Mohammadipanah et

Dehhaghi, 2017).

Selon le Bergey’s manual 2012, le phylum Actinobacteria englobe 06 classes, 23

ordres, 53 familles et 222 genres (Ruan, 2013) (Tableau N° 2).


5

Tableau N° 2 : Classification des Actinobacteria (Goodfellow et al., 2012).

Classes Ordre Familles

Actinobacteria Actinomycetales

Actinopolysporales

Bifidobacteriales

Catenulisporales

Corynebacteriales

Frankiales

Glycomycetales

Jiangellales

Kineosporales

Micrococcales

Micromonosporales

Propionibacteriales

Pseudonocardiales

Streptomycetales

Streptosporangiales

Incertae sedis

Actinomycetaceae

Actinopolysporaceae

Bifidobacteriaceae

Catenulisporaceae, Actinospicaceae

Corynebacteriaceae, Dietziaceae,

Mycobacteriaceae, Nocardiaceae,

Segniliparaceae, Tsukamerullaceae

Frankiaceae, Acidothermaceae,

Cryptosporangiaceae, Geodermatophilaceae,

Nokamurellaceae

Glycomycetaceae

Jiangellaceae

Kineosporaceae

Micrococcaceae, Beutenbergiaceae,

Bogoriellaceae, Brevibacteriaceae,

Cellulomonadaceae, Dermabacteriaceae,

Dermacoccaceae, Dermatophilaceae,

Intrasporangiaceae, Jonesiaceae,

Micobacteriaceae, Promicomonosporaceae,

Rarobacteriaceae, Ruaniaceae,

Sanguibacteraceae

Micromonosporaceae

Propionibacteriaceae, Nocardidoidaceae

Pseudonocardiaceae

Streptomycetaceae

Streptosporangiaceae, Nocardiopcaceae,

Thermomonosporaceae

Acidimicrobiia Acidimicrobiales Actinomicrobiaceae, Lamiaceae

Coriobacteriia Coriobacteriales Coriobacteriaceae

Nitriliruptoria Nitriliruptorales

Euzebyales

Nitriliruptoraceae

Euzebyaceae

Rubrobacteria Rubrobacterales Rubrobacteraceae

Thermoleophilia Thermoleophilales

Solirubrobacterales

Thermophilaceae

Solirubrobacteraces, Conexibacteraceae,

Patulibacteracea


6

Classification morphologique

L’étude morphologique des actinomycetes se base essentiellement sur la présence ou

l’absence du mycélium de substrat et le mycélium aérien, la couleur du mycélium,

ornementation des spores, la formes des chaines de spores et la production de pigments

diffusibles et pigments mélanoïdes (Aouar, 2006)

Classification moléculaire

Ces dernières décennies, la biologie moléculaire s’est imposée comme un outil puissent

et incontournable en taxonomie. Les principales analyses moléculaires utilisées pour la

détermination des espèces sont (Loqman, 2009) :

Le séquençage de l’ADN ribosomal 16S.

Le pourcentage G+C n’est obligatoirement demandé que lors d’une proposition de

nouveau genre.

L’hybridation ADN-ADN est utilisée pour l’identification des espèces et leur

comparaison avec celles déjà décrites, deux espèces sont considérées différentes si

elles ont un taux de ressemblance inférieur à 70%.

4- Morphologie

Les colonies formées par les actinomycètes sur des milieux solides présentent

différents aspects macroscopiques qui peuvent être regroupés en trois types (Kalakoutskii,

1976) :

Des colonies poudreuses couvertes d'hyphes aériens fermement attachés au milieu.

Des colonies pâteuses qui peuvent être facilement détachées des milieux solides.

Des colonies exemptes de mycélium de substrat et se composent d'hyphes aériens

attachés au milieu par des crampons.

La plupart des actinomycètes présentent un mycélium de substrat et un mycélium

aérien. Le mycélium de substrat possède plusieurs tailles, formes et épaisseurs. Sa couleur

varie de blanc ou incolore à jaune, marron, rouge, rose, oronge, vert ou noir. Le mycélium

aérien est plus épais que le mycélium du substrat. Il constitue un critère très important de

classification des espèces, comprenant une structure (cotonnière, veloutée ou en poudre),

une formation d’anneaux ou de zones concentriques et de pigmentation (Figure 1)

(Hariri, 2018).


7

On rencontre des espèces dont le mycélium est rudimentaire au point d’être

inexistant (la plupart des Mycobacterium), d’autre au mycélium fugace qui se fragmente

(certaines Nocardia) et en fin des espèces au mycélium développé et persistant comme dans

le genre Streptomyces (Belyagoubi, 2014).

Figure N° 1 : Croissance d’un isolat actinomycétale sur gélose de caséine et d’amidon.

Mycélium aérien (a) et mycélium de substrat (b) (Hariri, 2018).

D’autre part, les spores représentent un critère fondamental dans la taxonomie des

actinomycètes. Chez les genres Micropolyspora et Micromonospora et les

Thermoactinomycètes, la formation des spores se fait directement sur le mycélium de

substrat. Chez les Streptomyces, les spores surmontent le mycélium aérien. Les spores

mobiles caractérisent le groupe des Actinoplanes et Actinosynnema, alors que

Thermoactinomyces présente des endospores uniques thermorésistants. Les spores flagellées

caractérisent les Oerskovia sp. (Loqman, 2009).

5-Physiologie

La majorité des actinomycètes sont des chimioorganotrophes, qui croissent le mieux

en aérobiose. Plusieurs paramètres physiologiques influencent leur croissance, en particulier

l’oxygène, le pH et la température (Avril et al., 1992).

5-1-L’oxygène

Selon le type respiratoire, on peut diviser les actinomycètes en deux groupes (Avril

et al., 1992) :

Les bactéries fermentatives anaérobies, qui sont des commensales obligatoires des

cavités naturelles de l’homme

Les bactéries oxydatives aérobies, abondantes dans la nature en particulier dans le

sol.


8

5-2-Le pH

La plupart des actinomycètes se comportent comme des bactéries neutrophiles et

font une croissance optimale dans un intervalle de pH compris entre 7-8, mais on peut

observer une croissance à des valeurs de pH inférieurs à 4 (McKinney, 2004).

5-3-La température

La température optimale de croissance des actinomycètes est généralement entre

25 à 30 C°, mais les espèces thermophiles peuvent croitre à des températures de 55 à 65 C°

(Rangaswami et al., 2004).

5-4-L’activité d’eau

La germination des spores de la plupart des actinomycètes, peut-être observée à des

valeurs d’activité d’eaux supérieures ou égales à 0,67. L’activité d’eau optimale pour la

croissance et le développement des actinomycètes est égale à 0,98 (Zvyagintsev et al.,

2005).

6- Les Streptomyces

Streptomyces, Du Grec Strepto.myces : « Streptos : tordu ou courbe » et « myces :

champignons », est un genre de bactéries à Gram positif dont le matériel génétique (ADN)

est riche en CG (70 %) lorsqu’il est comparé avec d’autres bactéries comme Escherichia coli

(50%) (Gopalakrishnan et al., 2020).

Il pousse dans divers environnements, avec une forme filamenteuse similaire aux

champignons. La différenciation morphologique des Streptomyces implique la formation

d’une couche d’hyphes qui peut différencier dans une chaîne de spores (Mahasneh

et al., 2021).

La propriété la plus intéressante de Streptomyces est la capacité de produire des

métabolites secondaires bioactifs tels que des antifongiques, antiviraux, antitumoraux,

antihypertenseurs, et principalement antibiotiques et immunosuppresseurs (Procópio et al.,

2012).

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1319562X21003107#!


9

6-1-Classification

Le genre Streptomyces a été décrit pour la première fois par Waksman et Henrici en

1943 et classé dans la famille des Streptomycetaceae en se basant sur la morphologie et la

composition de la paroi cellulaire. Le développement de la classification numérique a permis

la reclassification de six autres genres de cette famille (Actinopycnidium, Actinosporangium,

Chainia, Elytrosporangium, Kitasatoa et Microellobosporia) dans le genre Streptomyces.

Ces anciens systèmes numériques utilisant les caractères phénotypiques sont

fondamentalement changés par l’introduction des caractéristiques de la biologie moléculaire

dans les systèmes de classification (Anderson et al., 2001).

Les genres Streptomyces et Streptoverticillium étaient deux genres distincts possédant

des caractères morphologiques différents. En 1990, Witt et Stackebrandt ont conclu à partir

des comparaisons des séquences d’ARNr 16S et 23S que le genre Streptoverticillium doit

être considérer comme un synonyme de Streptomyces (Boughachiche, 2012).

Figure N° 2 : Classification chimiotaxonomique de Streptomyces (Lee et al.,2015).


10

6-2-Cycle de développement

Pour les Streptomyces le cycle de développement commence par la germination

d’une spore qui va donner naissance à un mycélium primaire sous forme d’hyphes ramifiés

non séptées et plurinucléés et qui sont ancré dans le milieu solide. Ensuite, le mycélium

aérien se développera sur la base du mycélium primaire. Les extrémités des hyphes aériens

se cloisonnent pour former des chaînes de spores uninucléées (figure 3). Environ 60 % des

Streptomyces produisent, pendant la phase de limitations nutritionnelles, une famille de

protéines du type γ- butyrolactone qui constituent des intermédiaires entre les modifications

du milieu de culture et la synthèse des antibiotiques (Loucif, 2011).

Figure N° 3 : Cycle de développement des Streptomyces griseus (Loucif, 2011).

Chapitre 02 : isolement et

criblage des activités antimicrobiennes des

Streptomyces


11

1-Nature des échantillons

Sur l’ensemble des articles analysés, nous avons constaté que la quasi-totalité des

échantillons sont des échantillons de sol de différentes origines (Tableau N° 3).

Tableau N° 3 : Nature des échantillons étudiés dans les articles analysés.

Nature de

l’échantillon Description Référence

Sol Sédiments du sol dans des forêts de mangroves Al Farraj et al., 2020

Sol Milieu marin à trois endroits différents Al Ansari et al., 2020

Sol Sol forestier Charousova et al., 2018

Sol ND Sharma et al., 2014

Sol Sol salin Joze et al., 2011

Sol Sédiments du chantier maritime Ray et al., 2013

Plante Submergé sur le rivage Saldaña et al., 2020

Sol Sol saharien Smaoui et al., 2011

Sol Rhizosphère de pois chiches Amini et al., 2016

Sol Sol saharien Aouichi et al., 2011

Sol Rhizosphère de soja Fatmawati et al., 2019

Sol Différentes localités Sharma et al., 2011

Sol Sédiments lacustres, sédiments fluviaux,

les zones forestières et des sources salées.

Ningthoujam et al.,

2009

Sol Sédiments Sunaryanto et al., 2010

Sol Sol de vallée El Karkouri et al., 2010

Sol Sol de rivière Senguptal et al., 2015

Sol et eau Sol d’une ferme agricole Ekundayo et al., 2014

Sol Sédiments marines Nandhini et al., 2012

Sol Sol des mines de charbon Sarika et al., 2021

Sol Sol forestier Arasu et al., 2009

Les actinomycètes constituent une composante importante de microorganismes dans

la plupart des sols (plus d'un million par gramme). Le sol est également la source la plus

prolifique des actinomycètes dont beaucoup produisent des antibiotiques et d'autres

métabolites utiles. C'est donc l'habitat le plus intensément étudié et le plus exploité pour la

recherche des actinomycètes, mais malgré cela il existe encore de nombreuses lacunes dans

nos connaissances sur les processus joués par les actinomycètes dans le sol. Plus de 20 genres

ont été isolés et les Streptomyces étant omniprésent et les plus nombreuses (Goodfellow,

1983). Dans les habitats naturels du sol, les Streptomyces sont communs et sont

généralement une composante majeure de la population totale d'actinomycètes (Hayakawa,

2008).


12

2- Prétraitement des échantillons

Sur l’ensemble des articles analysés, nous avons remarqué que la majorité des auteurs

ont utilisé des prétraitements physiques, d’autres ont utilisé des prétraitements chimiques,

ou une combinaison entre les deux, alors que certains n’ont utilisé aucun prétraitement de

leurs échantillons (Tableau N° 4).

Tableau N° 4 : Les différents types de prétraitements utilisés sur les échantillons de sols

étudiés.

Prétraitement Référence

Physique (séché à l’air pendant une journée, puis chauffé à 40

± 2 °C pendant cinq jours) Al Ansari et al., 2020

Chimique (suspendus dans de l’eau stérile contenant 3 % de

NaCl (p/v))

Joze et al., 2011

Physique par chaleur sèche (chauffage à 100° C pour 1 h) +

humide (chauffage à 70° C dans une eau bain pendant 15

min)

Sharma et al., 2011

Physique (séché à l'air pendant 1 semaine) Ningthoujam et al., 2009

Physique (chauffage à 60° C pendant 4h) et chimique

(acidification à pH=2 pendant 3 h) Sunaryanto et al., 2010

Physique (chauffage à 50° C pendant 10min) El Karkouri et al., 2010

Physique (chauffage à 70° C pendant 20 min) et chimique

(chloramine-T + phénol) Sengupta et al., 2015

Physique (séché à l’aire libre pendant une semaine) +

chauffer dans un four à 45° C pendant 1 h Nandhini et al., 2012

Physique (séché à l’air libre pendant 3 jours) Arasu et al., 2009

Le prétraitement est très important pour l'isolement sélectif des actinomycètes, qui

se développent plus lentement que d'autres bactéries et champignons. En générale, ce

processus peut favoriser ou sélectionne la croissance des actinomycètes cibles en inhibant

ou éliminant la plupart des bactéries à Gram-négatif indésirables (Jiang et al., 2016).

Plusieurs techniques de prétraitement ont été développées pour isoler différents

genres d’actinomycètes : des prétraitements physiques, chimiques ou combinaison des deux

prétraitements (Shivabai et Gutte, 2019).


13

2-1-Prétraitement physique

Les spores d'actinomycètes sont plus résistantes à la dessiccation que la plupart des

bactéries. Par conséquent, il suffit de sécher le sol à l'air à température ambiante pour

éliminer la plupart des bactéries à Gram négatif indésirables, qui pourraient autrement

envahir les milieux d’isolement. Le séchage des sols à l’air chauffé ou un traitement

thermique de suspensions de sol peut être utilisé pour isoler sélectivement des taxons

spéciaux d’actinomycètes (Tableau N° 5) (Jiang et al., 2016).

Tableau N° 5 : Les prétraitements thermiques sélectifs pour l'isolement des actinomycètes

(Jiang et al., 2016).

Prétraitement Cibles

Sol séché à l’air chauffé à 120°C pendant une heure Microbispora

Streptosporangium

Dactylosporangium

Streptosporangium spp.

Sol séché à l’air chauffé à 100°C pendant 15 minutes Actinomadura spp.

Suspension d’eau ou de sol chauffée à 45°C ou 50°C pendant

10 minutes

Streptomyces spp.

Suspension d’eau ou de sol chauffée à 60°C pendant 30 minutes Micromonospora spp.

Sol séché à l’air chauffé à 28°C pendant une semaine Herbidospora cretea

Suspension de sol chauffée à 110°C pendant une heure Microtetraspora glauca

Les suspensions d'échantillons peuvent être traitées avec des ondes ultrasoniques à

180W pendant 40 minutes. Il peut libérer les saprophytes fixés par les granulés de sol dans

la suspension, augmenter la prise en compte des actinomycètes et réduire les bactéries dans

l'échantillon (Figure N° 4) (Jiang et al., 2016).


14

Figure N° 4 : Influence du traitement par ondes ultrasoniques sur les UFC des

actinomycètes et d'autres bactéries. UFC = unités formant colonie (Jiang et al., 2016).

2-2-Prétraitement Chimique

Sur la base de la capacité différentielle des spores actinomycétales à résister au

traitement avec des produits chimiques, tels que le gluconate de chlorhexidine, le phénol, le

chlorure de benzéthonium, le SDS et divers antibiotiques. Ces derniers ont été utilisés pour

isoler des taxons spécifiques d’actinomycètes (Tableau N° 6). Un traitement avec ces agents

pendant 30 minutes à 30 °C peut augmenter la fréquence des actinomycètes et réduire les

autres bactéries (Jiang et al., 2016).

Tableau N° 6 : Prétraitements chimiques pour l'isolement des actinomycètes (Jiang et al., 2016).

Prétraitement UFC (x105/g)

Actinomycètes Bactéries

Control 117 100% 152 100%

YE, 2% 192 164% 169 110%

HA, 2% 183 156% 92 60%

CA, 1% 170 145% 165 109%

VA, 0,2% 159 136% 178 117%

ME, 0,2% 163 139% 136 87%

SDS + YE, 6% 183 157% 22 14%

SDS + HA, 1% 173 148% 9 5%

SDS + CA, 1,5% 153 131% 15 9%

SDS + VA, 0,6% 147 126% 19 12%

SDS + ME, 0,2% 158 135% 14 8%

YA= yeast extrat (extrait de levure) ; HA= acide humique ; VA= valine ; SDS= sodium

dodecyl sulfate ; ME= mercaptoéthanol.


15

2-3-Combinaison de prétraitement physique et chimique

Une procédure modifiée pour le prétraitement d'échantillons de sol avec du carbonate

de calcium dans des conditions humides pour l’isolement des actinomycètes a été étudiée.

Cette procédure s'est avérée efficace pour augmenter le nombre d'isolats, y compris des

représentants de genres rares. Il a été constaté à partir cette étude que le nombre de

microorganisme isolés des échantillons de sol traités avec du carbonate de calcium dans des

conditions humides était deux fois plus élevé que celui des échantillons de sol non traités. Il

a été conseillé d'utiliser la procédure en combinaison avec d'autres méthodes d'isolement

sélectif pour isoler de différents genres d'actinomycètes à partir du sol (Tiwari et Gupta,

2013).

Une approche alternative qui a également été utilisée par différents chercheurs

consiste à rendre leur procédure d'isolement plus sélective en ajoutant des produits

chimiques tels que le phénol et la chloramine-T à la suspension du sol. Seong et ses

collaborateurs (2001) ont affirmé que le prétraitement de l'humidification pendant 15

minutes à 70°C ainsi que le traitement au phénol de la suspension du sol étaient les méthodes

les plus efficaces pour l'isolement des actinomycètes (Tiwari et Gupta, 2013).

3-Isolement des actinomycètes

L'isolement des actinomycètes dans un mélange de microflore présente dans la nature

est compliqué à cause de leur croissance lente par rapport à celle d'autres bactéries du sol.

Cela a entraîné le développement de procédures d'isolement sélectif basées principalement

sur l'une des approches suivantes (Hirsch et Christensen, 1983) :

3-1-La sélection nutritionnelle

Dans cette approche, les milieux sont formulés avec des nutriments qui sont

préférentiellement utilisés par les actinomycètes car l'échantillon contient d'autres genres de

microorganismes. Ainsi, les milieux d'isolement doivent être conçus pour réduire le

développement de microbes concurrents sans affecter négativement la croissance des

actinomycètes (Hirsch et Christensen, 1983 ; Kumar et Jadeja, 2016).


16

Les sources d'azote, tel que les protéines et les acides aminés, jouent un rôle crucial

dans l'isolement différentiel des actinomycètes. C’est l’exemple de la L-arginine utilisée

comme source sélective d'azote et favorise la croissance des actinomycètes par rapport aux

autres bactéries. Cet acide aminé peut être remplacé par la glycine pour les actinomycètes

non Streptomyces. Kuster et Williams (1964) ont examiné plusieurs sources de carbone et

d'azote et ont conclu que l'amidon (ou le glycérol), la caséine et le nitrate étaient le mélange

le plus sélectif. D’autre part, Lingappa et Lockwood (1962) recommandent l'utilisation de la

chitine comme seule source de carbone et d'azote. Plusieurs milieux sélectifs comme la

gélose à la vitamine et acide humique, la gélose de Kuster, la gélose à l'amidon et à la caséine,

la gélose au nitrate d'amidon, la gélose à l'amidon et aux sels inorganiques, la gélose au

glycérol et à la glycine, la gélose à la chitine est populaire pour l'isolement spécifique des

actinomycètes (Kumar et Jadeja, 2016).

Tableau N° 7 : Composition des milieux de culture utilisés pour l’isolement des

actinomycètes dans les articles analysés.

Milieu d’isolement Référence

Gélose de caséine + amidon Al Farraj et al., 2020

Agar de Bennet et gélose de caséine + amidon Al Ansari et al., 2020

Gélose de caséine + amidon Charousova et al., 2018

Gélose de nitrate de caséine et d’amidon Sharma et al., 2014

ISP4 Joze et al., 2011

ISP2 Smaoui et al., 2012

Colloïdale chitine agar (CCA) Ray et al., 2013

Gélose de caséine + amidon Amini et al., 2016

Gélose de Chitine + Vitamine Aouichi et al., 2011

ISP2 Fatmawati et al., 2019

Gélose de caséine + amidon Sharma et al., 2011

Gélose de caséine + amidon + nitrate Ningthoujam et al., 2009

ISP 3 Sunaryanto et al., 2010

Gélose de caséine + amidon Senguptal et al., 2015

Gélose de caséine + amidon El Karkouri et al., 2010

Gélose de caséine + amidon Nandhini et al., 2012

ISP 3 Ekundayo et al., 2014

Gélose de caséine + amidon Sarika et al., 2021

Gélose de caséine + amidon et ISP3 Arasu et al., 2009


17

En se basant sur les données mentionnées dans le tableau N° 7, on trouve que plus

de 50% des auteurs ont utilisé la gélose de caséine et d’amidon pour l’isolement des

actinomycètes ce qui est conforme avec les résultats de Kuster et Williams (1964) qui ont

conclu, après l’étude de plusieurs sources de carbone et d'azote, que l'amidon (ou le glycérol)

et la caséine étaient le mélange le plus sélectif.

Ray et al., (2013) ont suivi la recommandation de Lingappa et Lockwood (1962)

et utilisent la chitine comme seule source de carbone et d'azote alors que d’autres auteurs ont

utilisés d’autres milieux sélectifs comme l’ISP2, l’ISP3, l’ISP4, gélose de Bennet, etc.

3-2-L’inhibition sélective

Pour inhiber sélectivement les bactéries non actinomycètes, de nombreux chercheurs

ont utilisé des antibiotiques dans les milieux de culture. L'utilisation des antifongiques pour

améliorer l'efficacité des milieux d'isolement des bactéries a été rapportée. Les champignons

étaient capables de croître avec les actinomycètes et, par conséquent, les antifongiques se

sont révélés particulièrement utiles dans les études sur les actinomycètes. Plusieurs

chercheurs ont utilisé l’actidione (cycloheximide) alors que d’autres ont recommandé la

nystatine et la pimaricine comme agent antifongique puissant (Kumar et Jadeja, 2016).

La plupart des antibiotiques inhibent les actinomycètes ainsi que d'autres bactéries,

ce qui rend difficile la suppression des bactéries tout en permettant la croissance des

actinomycètes. Dulaney et al., (1955) ont recommandé un mélange d'antibiotiques et

d’antifongiques pour permettre le développement sélectif des actinomycètes. L'acide

nalidixique, capable d’inhiber la croissance des bactéries à Gram négatif et de certaines

bactéries à Gram positif, est recommandé pour l'isolement des actinomycètes du sol. L'acide

nalidixique et le cycloheximide inhibent la plupart des champignons et des bactéries à Gram

négatif et peuvent s'appliquer à l'isolement de divers genres d'actinomycètes (Kumar

et Jadeja, 2016).

Les principales difficultés avec chacune de ces approches sont qu'aucune n'est

strictement sélective pour les actinomycètes et que chacune a le potentiel inhérent d'inhiber

réellement la croissance de certains actinomycètes (Hirsch et Christensen, 1983).


18

Tableau N° 8 : Modifications des milieux de culture pour l’isolement sélectif des

actinomycètes dans les articles analysés.

Milieu de culture Modification du milieu Référence

Gélose de caséine +

amidon

Sulfate de gentamycine (25 mg/ml)

Nystatine (50 mg/ml)

Al Farraj et al., 2020

Agar de Bennet et

gélose de caséine +

amidon

Acide nalidixique (25 mg/ml)

Cycloheximide (25 mg/ml)

Al Ansari et al., 2020


amidon

Pas de modification Charousova et al., 2018

Gélose de nitrate de

caséine et d’amidon

Cycloheximide (50 ug/ml)

Nystatine (25 ug/ml)

Sharma et al., 2014

ISP4 Acide nalidixique (15μg/ml)

Cycloheximide (75 μg/ml)

Joze et al., 2011

ISP2 Pas de modification Smaoui et al., 2012

Colloïdale chitine

agar (CCA)

Nystatine (50 mg/l) Ray et al., 2013


amidon

Pas de modification Amini et al., 2016

Gélose de Chitine +

Vitamine Cycloheximide 80mg/l Aouichi et al., 2011

ISP2 Pas de modification Fatmawati et al., 2019


amidon

Cycloheximide Sharma et al., 2011


amidon + nitrate

Cycloheximide

Nystatine

Ningthoujam et al.,

2009

ISP 3 Acide nalidixique Sunaryanto et al., 2010


amidon

Acide nalidixique

Amphotéricine

Senguptal et al., 2015


amidon

Pas de modification El Karkouri et al., 2010


amidon

Cycloheximide (100 mg/l)

Acide nalidixique (2 mg/l)

Nandhini et al., 2012

ISP3 Nystatine (1ml) Ekundayo et al., 2014


amidon

Streptomycine (30 mg/l)

Amphotéricine (50 mg/l)

Sarika et al., 2021


amidon et ISP3

Actidione (20mg/l)

Acide Nalidixique

Arasu et al., 2009


19

Selon les résultats du tableau N° 8, plus de 66% des auteurs ont modifié les milieux

d’isolement en ajoutant soit des antibiotiques, soit des antifongiques ou les deux au même

temps. Les antibiotiques utilisés sont l’acide nalidixique, la streptomycine et la gentamycine.

Les antifongiques utilisés sont la cycloheximide, la nystatine et l’amphotéricine.

L’antibiotique le plus utilisé est l’acide nalidixique, soit seul ou en association avec

la cycloheximide ou parfois avec l’amphotéricine. La cycloheximide est la plus utilisé, soit

seul ou le plus souvent en association avec la nystatine.

Pour les associations d’antibiotiques et d’antifongiques, la plus dominante est l’acide

nalidixique avec la cycloheximide. Les autres associations sont soit l’acide nalidixique avec

l’amphotéricine, soit de la streptomycine avec l’amphotéricine ou parfois la gentamycine

avec nystatine.

Ces résultats sont conformes avec les recommandations et les données mentionnées

dans l’article de Kumar et Jadeja, (2016).

Une autre remarque est la dominance de l’utilisation des antifongiques seuls dans les

milieux d’isolement par rapport à leur utilisation en association avec des antibiotiques ou même

par rapport à l’utilisation des antibiotiques seuls. Cela nous a permis de conclure et de confirmer

que l'utilisation des antifongiques améliore l'efficacement l'isolement des actinomycètes.

4- Criblage de l’activité antimicrobienne

Le criblage des isolats de Streptomyces permet de sélectionner les souches possédant

des activités antibactérienne et antifongique les plus intéressantes. Il comprend deux

étapes (Harir, 2017 ; Sapkota et al., 2020) :

Un criblage primaire réalisé sur des milieux gélosés et permet l’isolement et la

détection des microorganismes ayant des importantes applications industrielles. Il ne

détermine pas le rendement des microorganismes.

Un criblage secondaire où les isolats positifs du criblage primaire ont été testés par

plusieurs techniques.

4-1- Méthode de diffusion

4-1-1- Méthode de diffusion de disques

Cette méthode de diffusion de disque sur gélose, développée en 1940, est une

méthode officielle utilisée dans de nombreux laboratoires de microbiologie clinique pour les

tests de sensibilité aux antimicrobiens de routine (Balouiri et al., 2016).


20

Elle fait partie des méthodes de test de sensibilité les plus flexibles en termes d'agents

antimicrobiens pouvant être testés (Tenover, 2009).

Dans cette procédure, la surface de la gélose est inoculée avec un inoculum

standardisé du microorganisme test. Ensuite, des disques de papier filtre (environ 6 mm de

diamètre), contenant le composé à tester à la concentration souhaitée, sont placés sur la

surface de la gélose et les boîtes de Pétri sont incubées dans des conditions convenables.

Généralement, l'agent antimicrobien diffuse dans la gélose et inhibe la germination et la

croissance du microorganisme test, puis les diamètres des zones d'inhibition de la croissance

sont mesurés (Figure N° 5) (Balouiri et al., 2016).

Au début des années 1950, il y avait peu de standardisation du contenu des disques,

de la taille de l'inoculum ou des conditions d'incubation entre les laboratoires effectuant les

tests. Souvent, plusieurs disques, chacun avec une concentration différente du même agent

antimicrobien, ont été utilisés pour évaluer la sensibilité. Ericsson et ses collègues ont

développé une méthode de disque unique standardisée qui a été largement utilisée en

Scandinavie. Cela a servi de base à une étude collaborative internationale qui a finalement

produit une méthode de test de diffusion sur disque standardisée. Des études menées à

l'Université de Washington au milieu des années 1960 ont abouti à la technique souvent

appelée «méthode Kirby-Bauer», publiée par Bauer et ses collègues en 1966. Cette méthode

a standardisé les variables de la taille du disque, de la taille de l'inoculum, de la température

et du temps d'incubation. Les résultats ont été rapportés qualitativement comme sensibles,

intermédiaires ou résistants (Tenover, 2009).

4-1-2-Méthode de diffusion des cylindres d’agar

La méthode de diffusion des cylindres d'agar est souvent utilisée pour mettre en

évidence l'antagonisme entre les microorganismes. La procédure est similaire à celle utilisée

dans la méthode de diffusion sur disque. Elle consiste à réaliser une culture de la souche

d'intérêt sur son milieu de culture approprié par des stries serrées à la surface de la gélose.

Au cours de leur croissance, les cellules microbiennes sécrètent des molécules qui diffusent

dans le milieu gélosé. Après incubation, un cylindre de gélose est coupé de manière

aseptique avec un écorcheur stérile et déposé sur la surface d’une autre gélose préalablement

ensemencée par le microorganisme test. Les substances diffusent du cylindre vers le milieu

gélosé. Ensuite, l'activité antimicrobienne des molécules sécrétées est détectée par

l'apparition de la zone d'inhibition autour du cylindre (Figure N° 5) (Balouiri et al., 2016).


21

4-1-3-Méthode de diffusion de puits

Elle mesure une diffusion radiale de l’antimicrobien à partir d'un puits en donnant

une zone d'inhibition claire et facilement mesurable. Elle consiste à découper un tronc

circulaire vertical dans la gélose préalablement ensemencée par le microorganisme test et

d'y verser une solution de la substance antimicrobienne de concentration connue. La

substance diffuse radialement créant une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose

(Djenadi, 2011) (Figure N° 5).

Figure N° 5 : Méthode de diffusion. A : diffusion des disques ; B : diffusion des puits ;

C : diffusion des cylindres d’agar (Balouiri et al., 2016).

4-2-Méthodes de fermentation

La fermentation est la technique de conversion biologique de substrats complexes en

composés simples par divers microorganismes tels que les bactéries et les champignons. Au

cours de cette dégradation métabolique, ils libèrent également plusieurs composés

supplémentaires en dehors des produits habituels de la fermentation. Ces composés

supplémentaires sont appelés métabolites secondaires ou composés bioactifs. Le

développement de techniques telles que la fermentation à l'état solide (SSF) et la

fermentation submergée (SmF) a conduit à la production de composés bioactifs au niveau

industriel. Ces techniques ont été affinées en fonction de divers paramètres tels que les

substrats utilisés, les paramètres environnementaux et les organismes utilisés pour la

fermentation (Subramaniyam et Vimala, 2012).


22

4-2-1-Fermentation solide

La fermentation solide (fermentation de substrats solides, fermentation humide,

culture solide, etc. et en anglais : solid-state fermentation ou SSF) est généralement définie

comme une croissance microbienne sur des particules solides humides en l’absence d’eau

libre. En d’autre terme, les microorganismes se développent dans un système à trois

phases : une matrice solide, une phase liquide qui lui est liée et une phase gazeuse prise au

piège dans les particules ou entre celles-ci (Assamoi et al., 2009).

La sélection d'un substrat approprié est un autre aspect clé de la SSF. Il pourrait y

avoir deux considérations principales ; celui qu'il existe un substrat spécifique, qui nécessite

une valorisation et/ou une élimination appropriée. La seconde pourrait être liée à l'objectif

de produire un produit spécifique à partir d'un substrat approprié. Dans ce dernier cas, il

faudrait cribler, d’une part, différents substrats et sélectionner celui qui convient le mieux et

d’autre part cribler les micro-organismes appropriés et sélectionner celui qui convient le

mieux. Cependant, il n'est pas nécessaire de combiner le rôle de support et de substrat

(Pandy, 2003). Selon Pandey et al., qui ont distingué deux processus, la fermentation du

substrat solide comprend les processus dans lesquels le substrat lui-même agit comme source

de carbone, tandis que la fermentation à l'état solide est définie comme tout processus de

fermentation utilisant un substrat naturel ou un substrat inerte comme support solide

(Krishna, 2005).

L’absence d’eau libre dans les processus de SSF est un avantage permettant une

réduction considérable du volume des installations de fermentation et des contaminations

bactériennes. Mais en parallèle, Les microorganismes utilisés sont limités et seuls qui se

développent bien aux basses humidités peuvent être employés. En plus, le taux d’humidité

faible peut créer des problèmes de surchauffe lorsque des masses importantes sont mises en

fermentation à cause d’un ralentissement des échanges de chaleur (Assamoi et al., 2009).

4-2-2-Fermentation submergée

La fermentation submergée (SmF) est défini comme la croissance de micro-

organismes dans un bouillon nutritif pouvant contenir environ 50 g/L de solutés qui sont soit

dissous soit en suspension sous forme de particules solides, et une teneur en eau de 95 %.

Ce système de fermentation permet d'obtenir une grande variété de produits à partir d'une

grande diversité de microorganismes et utilise des milieux de culture bien définis,

garantissant une bonne reproductibilité entre les expériences. SmF est une méthode utilisée


23

principalement dans les pays occidentaux pour produire des enzymes, des antibiotiques et

d'autres produits. Les principaux facteurs influençant la production de produits par ce

bioprocédé sont le type de fermenteur, l'inoculum, la composition du milieu de culture,

l'oxygène dissous, la température et le pH (Fahmia et al., 2019 ; Martinez-Medina et al.,

2019).

4-3-Extraction des molécules bioactives (Extraction liquide-liquide : ELL)

L'extraction par solvant extraction liquide-liquide (ELL) est un processus par lequel

un composé passe d'un solvant à un autre en raison de la différence de solubilité ou de

coefficient de distribution entre ces deux solvants non miscibles (ou légèrement solubles).

Comparé à d'autres méthodes de séparation, il donne un meilleur effet de séparation que la

précipitation chimique, et un degré de sélectivité plus élevé et un transfert de masse plus

rapide que la méthode d'échange d'ions. Par rapport à la distillation, l'extraction par solvant

présente des avantages tels qu'une faible consommation d'énergie, une grande capacité de

production, une action rapide, un fonctionnement continu facile et une facilité

d'automatisation (Chen et Wang, 2017).

Le procédé de l’extraction comporte trois étapes (Emuri et al., 2010) :

Mélange des deux liquides non miscibles, l’un d’entre eux contenant le soluté.

Obtention de l’équilibre physico-chimique, conduisant à une démixtion.

Séparation des deux nouvelles phases liquides obtenues basée sur la différence

des masses volumiques.

4-3-1-Principales méthodes d’extraction liquide-liquide

Ces méthodes permettent l’extraction de composés ayant des températures

d’ébullition voisines, l’extraction azéotrope (mélange binaire de liquides, homogènes et de

composition fixe, qui bout à une température constante), ou la séparation de molécules

thermosensibles. En biologie, elles permettent la concentration et la purification de très

nombreuses molécules comme les médicaments, pesticides, stéroïdes, lipides, vitamines,

métaux. Ces techniques permettent la récupération simultanée de plusieurs molécules

(Abe et al., 2010).


24

4-3-1-1- Extraction simple

L’extraction simple consiste à extraire en une seule étape le maximum de soluté

initialement présent dans la solution A par le solvant B. Le solvant B sera choisi en fonction

de son pouvoir dissolvant vis-à-vis de soluté, c’est-à-dire un coefficient de partage favorable

à B. En pratique, la solution A et le solvant B sont mis en contact dans un tube fermé de

manière étanche, puis une agitation énergique est pratiquée pendant un temps nécessaire à

l’établissement d’un équilibre de concentration entre les deux phases. L’agitation peut être

manuelle ou aidée d’un vortex ou mécanique (portoir rotatif) (Abe et al., 2010).

4-3-1-2- Extraction multiple

Les extractions multiples sont employées dans deux cas (Todd, 2014) :

Le rendement d’extraction simple n’est pas satisfaisant, ce qui signifie que le

coefficient de partage n’est pas suffisamment grand pour pouvoir extraire en une

seule fois la quasi-totalité du soluté. Dans cette situation, il peut être nécessaire de

réitérer l’opération d’extraction afin d’obtenir un rendement d’extraction satisfaisant.

On parle alors d’extraction par épuisement. Les différents extraits obtenus sont par

la suite mélangés puis concentrés pour isoler le soluté.

L’extrait n’est pas suffisamment purifié, la réextraction de ce premier est nécessaire

afin d’en éliminer les substances interférentes. Le soluté est en général resolubilisé

dans une phase aqueuse. Cette procédure est appelée communément back-extraction.

D’après les résultats d’analyse des différents articles en ce qui concerne les activités

antimicrobiennes des Streptomyces isolées, on trouve que :

Streptomyces sp. AS4 montre une forte activité contre Bacillus subtilis.

Streptomyces sp. AS11 montre une forte activité contre Micrococcus luteus et

Proteus mirabilis.

Streptomyces globosus DK15, Streptomyces ederensis ST13 présentent une activité

antimicrobienne élevée contre les bactéries à Gram positif et contre la bactérie à

Gram négatif Chromobacterium violaceum DSM30191, mais une faible activité

contre Escherichia coli DSM1116 et Pseudomonas aeruginosa PA14. La plus forte

activité antimicrobienne est exprimée contre Staphylococcus aureus (pour

Streptomyces ederensis ST-13) et contre Chromobacterium violaceum (pour

Streptomyces globosus DK-15).


25

Streptomyces amritsarensis sp. nov possède une forte activité antimicrobienne contre

Bacillus subtilis et contre Salmonella typhi, aussi une forte activité antifongique

contre Alternaria brassicicola.

Streptomyces sp. JAJ06 montre une forte activité antimicrobienne contre

Staphylococcus aureus résistant à la méticiline (SARM) et contre la bacterie à gram

négatif Proteus vulgaris, elle montre aussi une activité antifongique contre Candida

albicans.

Streptomyces sp. TN256 montre une forte activité antimicrobienne contre

Micrococcus luteus et contre E. coli, elle montre aussi une forte activité antifongique

contre Fusarium sp.

Streptomyces bottroprensis ne montre aucune activité antimicrobienne contre les

bactéries à gram négatif testés, par contre elle a une activité contre Enterococcus

casseliflavus et Bacillus cereus JCM2152.

Streptomyces violaceoruber montre une forte activité antimicrobienne contre la

Bacillus cereus JCM2152 mais ne montre aucune activité contre Bacillus cereus 183,

et les bacterie testés à Gram négatif.

Streptomyces griseus montre une forte activité antimicrobienne contre Bacillus

cereus JCM2152.

Streptomyces nigrescens ne montre aucune activité antimicrobienne contre les

bactéries testées à gram négatif et les bactéries à gram positif sauf Bacillus cereus

JCM2152.

D'après Amini et al., (2016), ils ont montré que Streptomyces spp. a une activité

antifongique forte contre Fusarium oxysporium.

D'après Aouichi et al., (2011), ils ont montré que Streptomyces PAL111 a une

activité antifongique forte contre toutes les champignons testés, alors que l'activité

antibactériens contre les bactéries Gram positif et aussi forte.

D’après Fatmawati et al., (2019), ils ont montré que Streptomyces ASR53 a une

activité antifongique forte contre Rhizoctonia solani.

D’après Sharma et al., (2011), ils ont montré que Streptomyces spp. a une activité

bactérienne très forte contre Bacillus megaterium HTCC428, alors que l'activité est

absente contre les champignons testés.


26

D’après Ningthoujam et al., (2009), ils ont montré que Streptomyces spp. a une

activité antifongique forte et une activité très forte contre les bactéries Gram positif

testés.

D'après Sunaryanto et al., (2010), ils ont montré que Streptomyces spj22 a une

activité forte vis-à-vis d’Escherichia coli ATCC25922, alors que l'activité

antifongique est absente

D'après El Karkouri et al., (2010), ils ont montré que Streptomyces cinerourberte a

une activité antibactérienne forte.

D'après Senguptal et al., (2015), ils ont montré que Streptomyces Gadhali a une

activité forte contre les bactéries Gram positif et Gram négatif testés, alors que

l'activité antifongique est très forte contre Aspergillus niger ATCC16404 et Candida

albicans ATCC0231.

D'après Nandhini et al., (2012), ils ont montré que Streptomyces rubrolavendulaes

Su1 QH234765 a une activité très forte contre Aspergillus flavus.

D'après Ekundayo et al., (2014), ils ont montré que Streptomyces griseoflavus a une

activité forte contre Trichoderma spp., alors que l'activité antibactériens est très forte

contre Salmonella typhi. Streptomyces parvus montre une activité forte contre

Staphylococcus aureus, alors que l'activité antifongique est forte contre Aspergillus

fumigatus. Streptomyces albidus également présente une activité forte contre

Aspergillus fumigatus et une activité contre Klebsiella pneumonia. Streptomyces

vinaceus et streptomyces globiosporus ne présente aucune activité antibactérienne

ou antifongique.

D'après Sarika et al., (2021), ils ont montré que Streptomyces felleus a une activité

très forte contre les bactéries testés et elle montre aussi une activité antifongique

contre Candida albicans.

D'après Arasu et al., (2009), ils ont montré que Streptomyces ERI-3 a une activité

très forte contre les bactéries Gram négatif testés et aussi contre Aspergillus flavus et

Aspergillus niger.

Conclusion générale

Conclusion

27

Après notre petite recherche bibliographique, nombreux points ont été discutés.

La classe Actinobacteria représente une composante importante de la population

microbienne des sols. Leur diversité métabolique et leurs caractéristiques de croissance

spécifiques bien adaptés comme agents de bioremédiation. Actinobacteria sont un groupe

omniprésent de microorganismes largement distribués dans divers écosystèmes naturels

(Polti et al., 2014).

Actinobacteria sont un groupe de bactéries gram positif qui forment de longs

filaments ramifiés comme le fil. À l’origine, ce phylum était considéré comme un

intermédiaire entre les champignons et les bactéries, mais ils sont maintenant reconnus

comme procaryotes organismes, ce sont des bactéries à gram positif aérobie anaérobie

facultatif avec un pourcentage élevé de CG % (Sharma et al., 2018). Ces dernières années,

les Streptomyces représentent environ 70 % de la production totale d’antibiotiques

(Al Ansari et al., 2020).

L’étude analytique de 20 articles scientifiques a révélé trois lignes essentielles. La

première est associée à l’isolement d’actinomycètes (l’échantillonnage, avec ou sans

prétraitement, ses milieux sélectifs et leurs conditions d’incubation). La seconde est liée à la

sélection des souches de Streptomyces (milieux sélectifs, incubation) alors que la dernière

est relative à la recherche des activités antimicrobiennes et antifongiques contre des souches

tests en utilisant des techniques précises.

Suite à cette étude nous avons constaté que le milieu le plus utilisé pour les

Streptomyces est la gélose de caséine et d’amidon avec pourcentage de 66%. L’acide

nalidixique et le cycloheximide jouent un rôle d’inhibiteurs d’autres bactéries et

champignons (des agents sélectifs). L’évaluation de l’activité antimicrobienne est assurée

par la technique de diffusion sur gélose ou par des techniques de fermentation et d’extraction

qui se font dans des conditions très précise.

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Résumé

Les actinobactéries ont pris beaucoup d’attention à cause de leur capacité à produire

diverse métabolites secondaires de valeur biotechnologique intéressante. Au cours de ce travail,

nous avons essayés de donner un avis général sur l’isolement des Streptomyces, une étude

bibliographique de 20 articles scientifiques sert à cette tâche. Nous avons parlés dans ce travail

de plusieurs points essentiels, en débutant par la nature des échantillons, les prétraitements

physiques et chimiques, les approches d’isolement sélectifs des actinomycètes (inhibition

sélective et sélection nutritionnelle), les méthodes de criblage des activités antimicrobienne des

Streptomyces et en terminant par une discussion sur les techniques de fermentation et

d’extraction les plus utilisées. Nous avons constaté que le milieu gélose de caséine et d’amidon

est le plus utilisé dans l’isolement des Streptomyces. L’acide nalidixique et le cycloheximide

jouent un rôle d’inhibiteurs d’autres bactéries et champignons (des agents sélectifs).

L’évaluation de l’activité antimicrobienne est assurée par la technique de diffusion sur gélose

ou par des techniques de fermentation et d’extraction.

Mots clés : Actinobactéries, Streptomyces, isolement, fermentation, criblage, extraction.

Abstract

Actinobacteria have received a lot of attention because of their ability to produce various

secondary metabolites of interesting biotechnological value. In the course of this work, we have

tried to give a general opinion on the isolation of Streptomyces, a bibliographic study of 20

scientific articles serves for this task. We spoke in this work of several essential points, starting

with the nature of the samples, the physical and chemical pretreatments, the selective isolation

approaches of actinomycetes (selective inhibition and nutritional selection), the screening

methods for the antimicrobial activities of Streptomyces and ending with a discussion of the

most used fermentation and extraction techniques. We have found that casein starch agar

medium is the most widely used in the isolation of Streptomyces. Nalidixic acid and

cycloheximide act as inhibitors of other bacteria and fungi (selective agents). Antimicrobial

activity is assessed by the agar diffusion technique or by fermentation and extraction

techniques.

Keywords: Actinobacteria, Streptomyces, isolation, fermentation, screening, extraction.

ملخص

على إنتاج عوامل أيض ثانوية مختلفة ذات قيمة ابسبب قدرتهالكثير من الاهتمام ب Actinobactéries تحظيقد

.تكنولوجية بيولوجية

هذه المهمة دراسة ببليوغرافية تضم وتخدم Streptomycesعزل طاء رأي عام بشأن حاولنا إع العمل،في سياق هذا

. Streptomyces استعمالا لعزلهو الوسط الأكثر والكازيين النشاءاجار أن وجدنا الدراسة هذه خلال مقالة علمية. 02

أيضا. والنيتروجين الكربون مصادر أفضل يمثلان والكازيين النشاء أن إلى الإشارة وتجدر

(،الفيزيائي والكيميائي) للعينات المسبقةة والمعالجبدءا بطبيعة العينات تحدثنا في هذا العمل عن عدة نقاط أساسية كما

وطرق الفرز للأنشطة المضادة (،)الانتقائي للكبح والانتقاء الغذائي Actinobactéries ل العزل الانتقائي وإجراءات

.لاصالتخمير والاستخ وننتهي مع ،للميكروبات

لاصالاستخ الفحص، التخمير، عزلة،ال, Actinobactéries, Streptomycesالكلمات الرئيسية:

Nom : Moussaoui Prénom : Mouna

Nom : Laib Prénom : Khawla

Nom : Benhizia Prénom : Karima

Date de soutenance : 15 / 07 / 2021

Diplôme de master en microbiologie appliquée

Activités antimicrobiennes des Streptomyces isolés de différents écosystèmes

Résumé

Les actinobactéries ont pris beaucoup d’attention à cause de leur capacité à produire diverse

métabolites secondaires de valeur biotechnologique intéressante. Au cours de ce travail, nous avons

essayés de donner un avis général sur l’isolement des Streptomyces, une étude bibliographique de 20

articles scientifiques sert à cette tâche. Nous avons parlés dans ce travail de plusieurs points essentiels,

en débutant par la nature des échantillons, les prétraitements physiques et chimiques, les approches

d’isolement sélectifs des actinomycètes (inhibition sélective et sélection nutritionnelle), les méthodes de

criblage des activités antimicrobienne des Streptomyces et en terminant par une discussion sur les

techniques de fermentation et d’extraction les plus utilisées. Nous avons constaté que le milieu gélose

de caséine et d’amidon est le plus utilisé dans l’isolement des Streptomyces. L’acide nalidixique et le

cycloheximide jouent un rôle d’inhibiteurs d’autres bactéries et champignons (des agents sélectifs).

L’évaluation de l’activité antimicrobienne est assurée par la technique de diffusion sur gélose ou par des

techniques de fermentation et d’extraction.

Mots clés : Actinobactéries, Streptomyces, isolement, fermentation, criblage, extraction.

Président : Mr DJABALLAH Chamsseddine M.C.B Université OEB.

Rapporteur : Mr HAMAMES Mokhtar M.A.A Université OEB.

Examinateur : Mr CHEKARA Bouziani Mohammed M.A.A Université OEB.

Documents

R EPUBLIQUE ALGERIENNE DE MOCRATIQUE MINISTERE DE