1. REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE POPULAIRE Ministre de Lenseignement et de RechercheUniversit Mohamed Khidher BISKRAFacult des sciences exacte et des sciences de la nature et de la vie Dpartement des sciences de la nature et de la vie1re Anne Master Biochimie et Biologie Molculaire Module : notion de gn gntiquegroupe: 01 Prsent par: -AOUN DALLAL -BACHIR Besma-Ben abbes kaltoume hanane -BOUGHDIRI HINDharg de module :BENCHARIF -Boukhalfa Achouak -Lebbal Moufida-OULD AMMAR Soumia

2. Espace rserv du contenu 3 Thme :Llctrophorse et ses applicationsur les protines 3. Plan de travail 1/ Gnralit sur llctrophorse et les protines2/ Matriels et mthodes 3/ Les applications de llectrophorse sur les protines 4. Introduction : Comme il est possible de sparer les types cellulaires vivantsqui constituent un tissu, il est possible de sparer les organitesfonctionnels et les macromolcules dune cellule.Dans notre expos, on va vous expliquer les mthodes qui permettent de sparer et analyser biochimiquement les protines, alors comment raliser la sparation des protines ? 5. Historique:ar S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirs des travaux dHerman, Tiselius introduit llctrophorse pour sparer les protines eelm Kaurin Tiselius, met au point la premire lectrophorse: l En 1959, Raymond introduit les gels de polyacrylamide 6. Dfinition: Llectrophorse en grec => transportme lune des mthodes danalyse les plus avantageuses de la chimse verticale le dplacement de lion dans un champ lectrique pour sparer 7. But:- sparer les protines.- dterminer les fractions protiques. 8. Principe:Figure n1: schma reprsente le Principe dlctrophorse verticale 9. Les montages::en actate de cellulose ou en en papier. Le support se prsente sous forme dplongent dans un tampon dlectrode, crant une mince couche deau sa sut souvent prpar peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Du 10. structure des protinesFigure2: les diffrents structure des protines 11. Matriels1/ Appareillage: 12. Les produits chimiques et ractifs: Solvant usuels: acide actique, mthanol, glycrol, isopropanol, 2-marcaptothanol, etc. Sels et tampons : glycine,trishydroxymthyl aminaminomthane (Tris).Ractifs spcifiques : acrylamide, N, N-mthylne-bis acrylamide, N, N, N, N-ttramthylthylne-diamine (TEMED), dodcyl sulfate de sodium (SDS),Blue de Coomassie R250etc 13. Les gels delectrphorese ;Gel de polyacrlamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis): Figure n3 : structure de gel de polyacrlamide 14. Gel dagarose:ose form par lhydrogne non covalente et hydrophobe liens entre les polym 15. Prparation de lchantillon1-Extraction des protines (sriques) 16. *on prend 1ml de l extrait de protine par une pipette ,on le met dans un eppendorf*on le plac dans un VORTEX ( 15min).er dans une centrifugeuse ( 10 min) a 4C.ait transfrer le surnageant dans un nouveau tube dans lequel on ajout 0.2ml de chlorofor*on agit c tube( 15 scd) incuber temprature ambiante( 3 min).*une 2 eme centrifugation (15 min). *on obtient un contenu en 3 phases (aqueuse-interphase et organique). *le surnageant sera jet. *on ajout 0.3ml de lthanol. *agitation (15 scd)-incubation(3min). *3 eme centrifugation (05min).*Le surnageant sera rparti dans 2 tubes dune faon quivalente.*ajouter 0.75ml de lisopropanol dans chaque tube 17. tation (15scd)-incubation a t ambiante (10min)-centrifugation (10min)-jeter le surnagage par lactone froid (vortex 1min-centrifugation 10min jeter lactone)tition de lavage.vrir les bouchons des tubes pour lvaporation des rsidus de lacetone. 18. La prparation des gels :st une matrice de sparation utilise en lectrophorse de biomopeuvent varier en composition.ux types de gels : Un gel de sparation et un gel de concentration 19. 1/Un gel de sparation :arer 10 ml (par exp) dune solution mre 10 % de polyacrylamide (en spar Composant Volume ddH20 4,0 ml mlange dacrylamide 30 % 3,3 ml 1,5M Tris pH 8.82,5 ml 10 % SDS0,1 ml 10 % ammonium persulfate0,1 ml TEMED 0,004 ml 20. 2/Un gel de concentration :prparer 10 ml dune solution mre 5 % de polyacrylamide (staComposant VolumeddH204,0 mlmlange 30 % dacrylamide3,3 ml1,0M Tris pH 6.8 2,5 ml10 % SDS 0,1 ml10 % ammonium persulfate 0,1 mlTEMED0,004 ml met le polyacrylamide dans la cuve. met le peigne dans le gel dlicatement pour raliser les puits.rs polymrisation ; linsertion de la plaque dans lappareil de llectrophor 21. Elle ncessite une cuve lectrophorse et une alimentation continue la moins coteuseLe protocole de gel dagarose =de polyacrlamGel la plus aise dagarose une meilleure sensibilit peu utilise dans une meilleure rsolutionle cas des protinesdes fractions protiques.20/04/12 22. PH discontinutampon du rservoir suprieur contient un acide faible: GlycinepH prs du PH de rservoir infrieurgel de concentration PH du tampon du gel de concentration< 2 gel de sparation PH de gel de sparation Tampon du rservoir du bas = tampon du gel de sparation 20/04/12 23. 20/04/12 24. 20/04/12 25. s sparation par lectrophorse en gel, les bandes obtenues peuvenises par diffrentes techniques.Les protines sont souvent rvles2 / C o m p t/ ig em u n o t r a n s f 3 a m/ C o lo r a t io n r a d i o ac t fw e s t e r n b l o t iB l et u ad e Ni r tf lu o r e s c a m in e c o o mg e n ti ed ar as s20/04/12 26. immunotransfertwesternblot a- Saturation de la membrane (blocage) Fixationdes protines de faon non spcifique sur la membrane b- Incubation avec Anticorps primaires c- Incubation avec Anticorps secondaires20/04/12 27. d- Dtection Autoradiographie 20/04/12 28. ApplicationsEn mdecine:leTestdlectrophorsedesprotinesestutilisspourvaluer,etcontrlerunegrandevaritdemaladiesetdeconditionsgrcelexamendesquantitsetdestypesdeprotinesdansunsang,durine,Identificationdesphnotypesmolculairesetdesgnotypesparlectrophorsedelhmoglobine.En gntique:Lavariationgntiquepeutaussitreidentifieenexaminantlavariationauniveaudesetlavrificationdestudesdexpressiondesprotinesinvivoetinvitro 20/04/12 29. En pharmacie :Permettantladcouvertedenouveauxmdicamentsetlavalidationdesciblespourlaconceptiondemdicaments.En biochimie:pourFournitdesinformationssurlastructurelataillemolculaire,leparamtrephysico-chimique,laquantitetlapuretdunchantillondeprotine.En biotechnologie :Lindustriedesbiotechnologiesaconnuunecroissancerapidecesderniresannesengrandepartieattribuableaudveloppementetausuccsdebasedeprotinesthrapeutiquespourunlargeventaildetroubles.Similairesauxproduitspharmaceutiquestraditionnels,lacaractrisationduneprotinethrapeutiquepoursespropritsphysico-chimiques,lasurveillanceduprocessusetlmissiondelotsestessentielle. 20/04/12 30. En immunologie, notamment pour confirmerle diagnostic de certaines atteintes du systme immunitaire. 20/04/12 31. 2- Exemple dutilisation dlectrophorse :LasparationetlidentificationdeprotinesparlectrophorsedeliquidesbiologiquesDespathologiesraresaffectantlaproductiondesanticorpscommelagammaglobulinmie,absencedescrtiondesgammaglobulinesetlhypogammaglobulinmie,scrtioninsuffisantedesgammaglobulines,peuventtredtectesparlectrophorsedesprotinessriques.Danslebutdidentifierlanaturedeleurpathologie,onasoumisllectrophorselesrumdedeuxpatientsatteintsdedysfonctionnementsdusystmeimmunitaire.Outrelesrumdesdeuxpatients(pistes2et3),onagalementsoumisllectrophorsedeuxchantillonsdesrumnormal(pistes1et5)ainsiquunchantillondimmunoglobulinespourservirderfrence(piste4).Lesrsultatsobtenusetleprofildensitomtriquedespistessontprsentsci-dessousdroite.20/04/12 32. Lexamen visuel des profils lectrophortiques compltr lanalyse densitomtrique permet didentifier certaines anomalies : Lindividu 2 prsente un srum particulirement concentrn immunoglobulines mais les autres protines sriques prsentent une concentration infrieure la normale.ersement, le srum de lindividu 3 est dpourvu de gamma globulines tandis que les autres bandes sont normales.Dans le premier cas, il sagit dune hypergammaglobulinmietandis que dans le second, il sagit dune agammaglobulinmie.Cinq pistes dlectrophorseProfils densitomtriques correspondants20/04/12 33. Avantage :-laquantitdeproduitncessaireesttrspetite-desprotinesnediffrantqueparunseulacideaminpeuventtrespares-desmthodesenzymatiquesetimmunologiquespermettentlarvlationdessubstances-ilestpossibledequantifierlesdiffrentesfractionsspares-cettemthodeestextrmementsimple,Lasimplicitetlesperformancesdecettemthodeluivalentdtreutilisequotidiennement. Inconvnient :-Lesbandesdeprotinessontlarges(causedudpt).-Onnepeutpasdterminerlamassemolculairedesprotines.-Rflchirsurlapolaritdellectrophorse(enfonctiondupH).20/04/12 34. Conclusion :Lamassemolculaireetlacompositiondessous-unitsduneprotine,mmeprsentenpetitesquantits,peuventtredterminesparlectrophorsesurgeldepolyacrylamideSDS.Lorsdlectrophorsebidimensionnellesurgel,lesprotinessontsparessousformedetachesparlafocalisationisolectriquedansunedimensionsuiviedellectrophorsesurgeldepolyacrylamideSDSdansladeuximedimension.Cettesparationlectrophortiquepeutaussitreappliquedesprotinesnormalementinsolublesdansleau.20/04/12