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Rapport pour le cours "Mise en situation expérimentale" à la faculté des sciences de Nancy.
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Belhaffef Amira Driencourt Benoit Fert Mathieu
RAPPORT D’ÉTUDE SUR LE POTENTIEL PROBIOTIQUE DE STREPTOCOCCUS SALIVARIUS
Devoir réalisé dans le cadre de l’UE 7u04 « Mise en Situation Expérimentale »
du Master BioMANE
Décembre 2013
Professeur encadrant: Mme Virgine Libante
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SOMMAIRE I/ Introduction 3 II/ Matériel et méthodes 7 1. Activité inhibitrice de Streptococcus salivarius sur d'autres espèces de bactéries 7 1.1. Étude du spectre de l'activité inhibitrice de S. salivarius 7 1.2. Recherche de gène de régulation de la production de bactériocines 8 1.3. Extraction de bactériocines chez S. salivarius 10 2. Activité acidifiante de S. salivarius sur son milieu 10 2.1. Étude quantitative de l'acidification du milieu à pH initial 7 10 2.2. Étude quantitative de l'acidification du milieu à pH initial 5,5 11 III/ Résultats 12 1/ Activité inhibitrice de S. salivarius sur d'autres espèces de bactéries 12 1.1. Étude du spectre de l'activité inhibitrice de S. salivarius 12 1.2. Recherche de gène de régulation de la production de bactériocine 15 1.3. Extraction de bactériocines chez S. salivarius 16 2. Activité acidifiante de S. salivarius sur son milieu 18 IV/ Discusssion 21 V/ Bibliographie 22
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I/ Introduction Les traitements médicaux et notamment à travers l'alimentation ont pris de plus en
plus d'importance au fil de l'histoire. La recherche en médecine est toujours
d'actualité, luttant contre des pathogènes qui s'adaptent en permanence.
1/ Les bactéries probiotiques Les bactéries probiotiques sont au centre de nombreuses recherches aujourd'hui. Un
probiotique est un organisme vivant qui a un effet positif pour la santé de celui qui
l'ingurgite (en quantités suffisantes), souvent un micro-organisme. Consommé par
voie orale, ils agissent surtout dans l'intestin où est présente une majeure partie de la
flore digestive et où se déroule l'absorption des nutriments.
Beaucoup de probiotiques se trouvent à la base sur les aliments que nous
consommons mais en disparaisse à cause des traitements de conservation. C'est pour
cela que de nos jours, les probiotiques sont étudiés pour être ingérés comme
médicament ou rajoutés aux aliments. Les quelques probiotiques les plus courants sur
le marché regroupent quelques Lactobacillus sp et Bifidobacterium lactus.
Les effets des probiotiques sont variés mais reprennent toutes le même sens :
améliorer l'état de santé du consommateur en aidant au transit intestinal avec des
sécrétions d'enzymes ou des stimulations de la paroi intestinale, en synthétisant des
vitamines, des molécules anticancéreuses et en stimulant le système immunitaire.
Pour être jugé efficace, un probiotique doit résister aux conditions intestinales, aux
procédés alimentaires ainsi que d'être inoffensif et apte à une colonisation efficace.
2/ Streptococcus salivarius Nous nous sommes intéressés à Streptococcus salivarius pour notre étude, dans le but
d'estimer son potentiel probiotique, sa capacité à améliorer l'état de santé des
individus qui l'ingurgiteraient. L'état de santé d'une personne est quelque chose de
vaste et les manières de l’améliorer sont nombreuses, ainsi nous nous sommes fixés
4
sur la capacité d'antagonisme de S.salivarius à l'encontre d'éventuelles bactéries
pathogènes de la flore intestinale humaine.
Photographie d'une observation microscopique de S.salivarius
Caractéristiques S. salivarius est une bactérie lactique, celles-ci sont des bactéries gram+, non-
sporulantes,acidophiles, non-mobiles, catalase- et chimioorganotrophes. Les bactéries
lactiques sont caractérisées par leur capacité à faire la fermentation lactique et
S. salivarius est homofermentaire. Elles n'a pas de chaîne respiratoire et est d'ailleurs
incapable de respirer, ce qui lui impose une croissance lente et de nombreuses
auxotrophies. Comme tous les Streptococcus sp., S.salivarius est une coque, gram+,
catalase- et anaérobie facultative.
Ses cellules sont sphériques ou ovoïdes et mesurent de 0,7 à 0,9µm. Elle est
chimioorganotrophe et tire son azote d'acides aminés ou de peptides. Elle est
thermophile, acidophile et ses souches ont, souvent, entre 1 et 3 plasmides.
Elle fait partie de la flore intestinale humaine et y vit en compétition permanente car
de nombreuses bactéries franchissent la barrière acide du tube digestif pour y trouver
un milieu chaud, stable et riche en nutriments.
Moyen de lutte : l’amensalisme Pour pouvoir survivre et colonier le tube digestif humain, S. salivarius a pu
développer des mécanismes pour survivre malgré la compétition. Les bactéries
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lactiques ont deux principales manières de lutter contre leurs compétiteurs, nous
allons vérifier au cours de cette étude si S. salivarius les possède aussi. Ces processus
impliquent une action négative pour la survie d'autres organismes dans leur milieu par
la production de composés toxiques/nocifs directement relâchés dans le milieu, c'est
le principe de relations d'amensalisme.
A cause de leur croissance lente, les bactéries lactiques ont développé des
mécanismes de lutte contre les micro-organismes compétiteurs notamment avec la
libération de certains composés dans le milieu. Elles rejettent de l'acide lactique qui
acidifie le milieu et tue les micro-organismes non-acidophiles.
De plus, de nombreuses bactéries lactiques produisent aussi des bactériocines. Ce sont
des peptides qui empêchent la croissance voir tuent les bactéries proches d'elles d'un
point de vue phylogénétique. Ils agissent pour la plupart sur la membrane plasmique
après avoir traversé la paroi.
Ainsi, cette étude va porter sur l'hypothèse de la production de bactériocines et ses
effets sur d'autres bactéries ainsi que sur la production d'acide lactique. Car, c'est
grâce à ces systèmes de lutte contre ses compétiteurs que S. salivarius pourrait
remplir son rôle de probiotique avec ces composés qui attaqueraient directement les
bactéries pathogènes de l'intestin.
Pour ce faire, nous avons suivi deux axes d’étude :
Le premier porte sur l’activité inhibitrice de Streptococcus salivarius sur différentes
espèces bactériennes. Cette activité est caractérisée par son spectre, sa capacité à agir
sur des espèces bactériennes plus ou moins proches sur l’arbre phylogénique de
S. salivarius. Nous avons choisi d’étudier ce paramètre hors situation de compétition
en isolant les métabolites de S. salivarius sur le milieu ensuite ensemencé avec les
bactéries indicatrices, ou en situation de faible compétition en la laissant croître
24 heures avant l’ensemencement des bactéries indicatrices. Aussi,
Streptococcus thermophilus possède un système de régulation de la production de
bactériocines. Cette production est activée ou sur-activée par l’introduction du peptide
BlpC dans son milieu de croissance. Nous avons cherché si nous pouvions activer la
production de bactériocines chez S. salivarius avec le peptide BlpC en cherchant des
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séquences ADN analogues à celles de Streptococcus thermophilus. Enfin, nous avons
appliqué un protocole d’extraction de bactériocines sur S. salivarius pour en
confirmer la production et comparer leur masse moléculaire avec les bactériocines
d’autres espèces bactériennes.
Le deuxième axe d’étude porte sur le potentiel de S. salivarius à acidifier son milieu.
Nous avons choisi d’étudier ce potentiel avec un pH initial neutre (pH 7) ou acide
(pH 5,5).
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II/ Matériel et méthodes Choix des souches bactériennes Nous avons sélectionné trois souches de Streptococcus salivarius dans la collection de
l’Université Henri Poincaré pour leur sensibilité aux antibiotiques classiques et leur
innocuité. Ces souches sont S. salivarius S7-1, S3-12 et S6-4.
Nous avons choisi des bactéries indicatrices pour leur proximité phylogénique plus ou
moins grande avec S. salivarius, et pour leur innocuité.
1. Activité inhibitrice de Streptococcus salivarius sur
d’autres espèces de bactéries. 1.1. Étude du spectre de l’activité inhibitrice de S. salivarius
1.1.1. Étude de l'activité inhibitrice des métabolites de
S. salivarius: Filtres et stries 1er jour :
Sur milieu M17 soft coulé en boite de Pétri déposer un filtre -Sartorius Stedim- au
bord de la boite.
A partir d’une culture liquide de S. salivarius en phase exponentielle, prélever 150 µl,
et centrifuger à 4000 tours pendant 5 min. Récupérer le culot dans 175 µl de milieu
M17 liquide.
Ensemencer les filtres avec 150µl de cette préparation (sans déborder).
Incuber les boites à 37°C (à 42°C pour les souches témoin utilisées) pendant 24h.
Réaliser l’expérience pour les 3 souches de S. salivarius, et les souches de :
S. thermophilus LMD9 (témoin positif connu pour sa forte activité inhibitrice)
S. thermophilus CNRZ 1066 (témoin négatif connu pour sa faible activité inhibitrice)
2ème jour :
Retirer les filtres ensemencés la veille. Ensemencer en stries de l’extérieur vers
l’intérieur les différentes bactéries indicatrices (Figure 1).
Incuber à 37°C pendant 24h.
8
Figure 1 : Schéma représentant le plan des stries sur boite vu de dessus. 1.1.2. Étude de l'activité inhibitrice de S. salivarius en situation
de compétition: Multi-couches 1er jour :
A partir d’une culture liquide (ensemencer à partir de 10-6 pour S. salivarius S7-1 et
S. salivarius S6-4 sauf S. salivarus S3-12, prendre 10-7) en phase stationnaire de
Streptococcus salivarius, prélever 100µl et ensemencer 2ml de milieu M17 soft en
surfusion. Bien agiter et les verser sur la couche de M17 solide préalablement coulée dans des
mini boites de Pétri (Figure 2).
Homogénéiser, incuber 24h à 37°C.
2ème jour :
Ensemencer 2ml de Milieu M17 soft avec 150µl de culture liquide de Bactéries
indicatrices (Escherichia coli, Lactobacillus lactis cremoris, Streptococcus
thermophilus)
Agiter, verser sur la couche de S. salivarius coulée la veille.
Homogénéiser, incuber 24h à température optimale de chaque souche (E. coli à 37°C,
L. lactis cremoris 30°C, S. thermophilus à 42°C)
> réaliser l’expérience en triplicata pour chaque souche indicatrice.
Bactériesindicatrices: 1 Bacillus subtilis 2 Escherichia coli 3 Streptococcus thermophilus LMG 18311 4 Lactococcus lactis MG 5 Lactococcus lactis cremoris Étalement sur filtre de : S. salivarius S6-‐4; S7-‐1; S3-‐12 S. thermophilus LMD9 (témoin positif) S. thermophilus CNRZ 1066 (témoin negatif)
1
2
3
4
5
9
M17 soft+bactérie indicatrice
M17 soft+ S. salivarius
M 17 solide Figure 2 : schéma de l’ensemencement des boîtes multi-couches
Bactéries cibles:
Escherichia coli
Streptococcus thermophilus LMG 18311 (témoin positif : souche productrice de
bactériocines)
Lactococcus lactis cremoris
1.2. Recherche de gènes de régulation de la production de bactériocines chez S. salivarius 1/ Buts
Nous avons voulu vérifier par PCR la présence de gènes permettant et/ou activant la
synthèse de bactériocines chez S. salivarius, pour cela nous avons effectué cette
expérience avec 4 souches : 3 souches de S. salivarius (7-1, 6-4 et 3-12) et la souche
S. thermophilus LMD9 qui sert de témoin positif comme nous savons qu'elle libère
des bactériocines. Nous comptons ainsi observer un profil ressemblant entre la
migration de l'ADN ciblé par la PCR entre LMD9 et une ou plusieurs des souches de
S. salivarius.
Pour les amorces, nous avons utilisé 4 couples : ThermA (r et f), TepA (r et f), BlpU
(r et f) et BlpuK/BlpD, chacune de ces amorces cible une séquence dans le génome de
S. thermophilus qui contient un gène de synthèse ou d’activation de bactériocine et
dont on connait la taille.
2/Protocole
1er jour :
-Nous avons utilisé une micropipette (20µL) pour placer dans des tubes à PCR 1 µL
des cultures des différentes souches étudiées. Les cultures avaient été ré-ensemencé à
la dernière séance en milieu M17 liquide.
-Nous avons utilisé 1µL d’eau pure comme témoin négatif.
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-Nous avons ensuite ajouté dans chaque tube : 1µL de dNTP, 10µL d'eau et 2,5µL de
tampon.
-Ensuite, nous avons rajouté l'amorce ThermA dans les cinq puits qui lui étaient
attribué puis nous avons fait de même avec les trois autres couples d'amorces (5µL
des deux amorces).
-Nous avons utilisé une Taq polymérase (0,5µL).
2ème Jour :
- Après la PCR, nous sommes passés à l'électrophorèse sur gel d'agarose. Nous avons
placé les produits de PCR des amorces BlpU, ThepA et ThermA sur le gel d'agarose à
2% et les amorces BlpD/BlpuK sur le gel d'agarose à 1%, le gène ciblé par ces
amorces étant bien plus gros que les autres et donc plus lourd. De plus, nous avons
rajouté du marqueur de taille (5µL), entre les amorces du gel à 2% et à coté de
l'amorce sur le gel à 1%.
- Après la migration, nous avons récupéré les deux gels d'agarose et nous les avons
observé aux UV et photographié le résultat de la migration.
1.3. Extraction de bactériocines chez S. salivarius On prend des cellules en phase stationnaire pour leur production de bactériocines plus
importante qu’en phase exponentielle (Dortu 2008).
Purification :
- Centrifuger 50ml de culture en phase stationnaire (3 souches de S. salivariuset
témoin négatif : S. thermophilus CNRZ 1066 et témoin positif : S. thermophilus
LMD9) à 5000 rpm pendant 15min à 4°C.
- Répartir dans 2 tubes de 50ml : 20ml de surnageant et y ajouter 10ml de
chloroforme.
- Agiter vigoureusement pendant 45min.
- Centrifuger pendant 20min.
Dénaturation :
- Mettre 40µl d’échantillon (précipité, surnageant) après centrifugation dans des tubes
de PCR, lui ajouter 10µl de bleu dépôt.
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- Dans un thermocycleur : chauffer à 95°C pendant 5 min.
- Déposer les échantillons sur gel d’électrophorèse et observer le gel aux UV.
2. Activité acidifiante de Streptococcus salivarius sur son milieu Afin de démontrer l’acidité provoquée par les souches de S. salivarius, nous suivons
la variation du pH dans le bouillon M17 sans glycérophosphate (qui a un pouvoir
tampon). Les pH initial et final sont mesurés à l’aide d’un pH mètre.
2.1. Étude quantitative de l’acidification du milieu à pH initial = 7
par S. salivarius - Le pH initial correspond au pH du bouillon M17 sans inoculum (sans bactérie) qui
est égale à pH=7.
- Ensemencer le milieu avec 1 ml d’inoculum de S. salivarius (chaque souche
ensemencée dans trois tubes séparément)
- Refermer le tube ensemencé et l’incuber à 37°C pendant 48h.
- Le pH final est le pH mesuré après l’incubation de chacune des souches de
S. salivarius testée cultivée dans le bouillon M17 spécifique à sa croissance pendant
24 heures à 37ºC.
2.2. Étude quantitative de l’acidification du milieu à pH initial = 5,5
par S. salivarius Les pH initial et final ont été mesurés à l’aide d’un pH mètre.
- Ensemencer le milieu avec 1 ml d’inoculum de S. salivarius (chaque souche
ensemencée dans trois tubes)
- Refermer le tube ensemencé et incuber à 37°C pendant 48h.
- Le pH final est le pH mesuré après l’incubation de chacune des souches de
S. salivarius testée cultivée dans le bouillon M17 spécifique à sa croissance pendant
24 heuresà 37ºC.
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III/ Résultats 1. Activité inhibitrice de Streptococcus salivarius sur
d’autres espèces de bactéries. 1.1. Étude du spectre de l’activité inhibitrice de S. salivarius
1.1.1. Étude de l'activité inhibitrice des métabolites de
S. salivarius: Filtres et stries
Figure 3 : isolement de bactériocines produites par S. salivarius sur filtres Sartorius (emplacement indiqué par un cercle en pointillés gris) et milieu M17 solide incubées 24h :(A) Témoin positif S. thermophilus LMD9, (B) S. salivarius S7-1, (C) S. salivarius S3-12, (D)S. salivarius S6-4.Inhibition de la croissance de bactéries indicatrices ensemencées en stries et incubées 24h : (1) L. lactis cremoris, (2) L. lactis MG, (3) S. thermophilus LMG 18311, (4) E. coli, (5) B. subtilis.
Le témoin positif S. thermophilus LMD9 montre une faible inhibition de L. lactis
cremoris (Figure 3, A) ; une inhibition moyenne de E. coli et de B. subtilis ; une
bonne inhibition de L. lactis MG et de S. thermophilus LMG 18311.
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Le témoin négatif S. thermophilus CNRZ 1066 a été contaminé durant
l’ensemencement des stries et n’est donc pas exploitable.
S. salivarius S3-12 montre une activité inhibitrice sur toutes les souches indicatrices
alors que S7-1 montre une faible activité inhibitrice hormis sur L. lactis MG et S.
thermophilus LMG 18311. S. salivarius S6-4 montre quant à elle des niveaux
d’inhibition intermédiaires avec toutefois une bonne inhibition de la croissance de L.
lactis MG et S. thermophilus LMG 18311.
Nous en déduisons suite à cette expérience que S. salivarius S3-12 présente l’activité
inhibitrice la plus forte et le spectre le plus large.
1.1.2. Étude de l'activité inhibitrice de S. salivarius en situation
de compétition: Multi-couches Nous avons observé une forte activité inhibitrice des souches de Streptococcus
salivarius S3-12 sur la souche de Lactococcus lactis cremoris testée (Figure 4 et
Table 1), et une activité moindre sur la souche d’E. coli ; par contre elle n’avait aucun
effet sur la souche de S. thermophilus LMG 18311 (témoin négatif).
La souche de S. salivarius S7-1 présente une activité inhibitrice sur la souche de
L. lactis cremoris et E. coli, mais elle est sans effet sur S. thermophilus LMG 18311.
L’expérience menée avec S. salivarius S6-4 n’a montré aucune activité inhibitrice sur
les différentes souches testées.
Remarque :
Lors de l’observation des résultats de cette expérience ; nous avons observé sur la
boite de S. salivarius S7-1/L. lactis cremoris une seule zone d’inhibition.
Les résultats de cette expérience montrent que la souche de S. salivarius S3-12 produit
des composés inhibiteurs qui agissent sur L. lactis cremoris ; par contre elle n’a eu
aucun effet sur S. thermophilusLMG 18311 qui est une souche productrice de
14
bactériocines, ceci peut être du à antagonisme entre les composés produits pas les
deux souches.
Figure 4 : exemple de résultats. (A) absence d’inhibition entre S. salivarius S7-1 et S. thermophilus. (B) forte inhibition entre S. salivarius S3-12 et L. lactis cremoris.
Table 1 : interprétation des résultats de l’expérience Multi-couches avec les souches de Streptococcus salivarius.
E. coli L. lactis cremoris S. thermophilus
S. salivarius S3-12 + +++ -
S. salivarius S7-1 + + -
S. salivarius S6-4 - - - (+++) inhibition forte, (+) inhibition faible mais significative, (-) pas d’inhibition.
La souche de S. salivarius S3-12 semble produire de composés à activité inhibitrice
agissants sur nos souches indicatrices.
La souche S6-4 n’a montré aucune activité inhibitrice vis-à-vis des différentes souches
testées, nous en déduisons qu’elle ne produit pas de composés inhibiteurs, du moins
ils n’ont pas d’effet sur les bactéries indicatrices.
A B
15
1.2. Recherche de gènes de régulation de la production de
bactériocines chez S. salivarius Avec l'amorce ThermA, on n'obtient pas de résultat significatif (figure 5 A). A part
d'énormes bandes de moins de 75pb, il n'y a rien d'autre et donc pas de fragment
d'environ 178pb, comme attendu. On n'a rien obtenu non plus avec LMD9.
Figure 5 A : résultats de migration de la PCR par les amorces ThermA, TepA et BlpU.
Figure 5 B : résultats de migration de la PCR par les amorces BlpuK/BlpD.
L'amorce TepA a donné de grandes bandes de moins de 75pb mais également une
bande pour la souche S6-4 de 350pb environ, elle ne correspond pas à la taille attendue
mais s'en rapproche.
L'amorce BlpU n'as pas montré de bandes de 188pb mais une bande de 1000pb pour
LMD9 et une de 1200pb pour la souche S6-4. Il y a également une bande de 800pb
environ qui se retrouve pour toutes les souches et même pour l'eau.
16
Enfin, les amorces BlpuK et BlpD ont donné de grandes bandes à moins de 200pb et
une bande à 1200pb pour la souche S6-4, plutôt que le fragment de 705pb attendu
(Figure 5 B).
L'expérience avec les amorces ThermA n'a rien donné, aucun fragment qui se détache
des autres : l'amas d'ADN de moins de 75pb n'est pas interprétable.
Celle avec Tep A est plus intéressante, elle montre que la souche S6-4 a un fragment
de 350pb environ. Cela ne correspond pas, apparemment, à au fragment recherché
avec cette amorce, mais une différence de migration dû au gel ou au fragment lui-
même est envisageable, l'écart de taille observé n'étant pas très grand. Ainsi, on peut
dire que la souche S6-4 a peut-être le gène de production de bactériocine ciblé par
l'amorce TepA.
Cela se remarque aussi avec le couple d'amorces BlpuK/BlpD où la souche S6-4 ne
présente pas de fragment de 705pb comme cela est attendu, mai une bande de 1200pb.
La différence étant faible, cela montre peut-être la présence du gène ciblé par
BlpuK/BlpD.
L'expérience avec BlpU, elle, montre une bande qui se retrouve pour toutes les
souches et pour l'eau. Si l'on retrouve une bande avec l'eau, alors qu'elle ne doit pas
contenir d'ADN, cela montre que les puits des amorces BlpU ont été contaminés et
que l'on voit là un fragment d'ADN d'un contaminant. A part cela, on retrouve ces
deux fragments pour LMD9 et la souche S6-4, bien qu'ils ne correspondent
apparemment pas au fragment attendu (188pb), le fait de retrouver chez LMD9 un
fragment de taille presque identique que celui vu pour la souche S6-4 confirme que
cela doit être le fragment recherché que l'on a retrouvé sur LMD9 (témoin positif) et
sur la souche S6-4.
1.3. Extraction de bactériocines chez S. salivarius
Le profil du témoin positif S. thermophilus LMD9 montre deux bandes bien marquées
et de taille différente et une bande moins intense assez proche de l’une des deux
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bandes intenses (Figure 6). Il y a aurait donc au moins deux séquences peptidiques
isolées.
Figure 6 : gel SDS-PAGEde bactériocines-like préparées avec la procédure d’extraction au chloroforme. (1066) témoin négatif S. thermophilus CNRZ 1066, (LMD9) témoin positif S. thermophilus LMD9, (S6-4) S. salivarius S6-4, (S3-12) S. salivarius S3-12, (S7-1) S. salivarius S7-1.
Le profil du témoin négatif S. thermophilus CNRZ 1066 montre deux bandes de faible
intensité.
Le profil de S. salivarius S6-4 ne présente pas de bandes d’intensité significative.
Le profil de S. salivarius S3-12 présente trois bandes intenses dont deux sont groupées
et correspondent à une bande du témoin positif.
Le profil de S. salivarius S7-1 présente trois groupes de bandes d’intensité moyenne.
Les différentes souches de S. salivarius ne produisent pas les mêmes séquences
polypeptidiques et n’en produisent pas les mêmes quantités. S. salivarius S6-4 ne
produit pas les polypeptides recherchés. Nous pouvons néanmoins conclure que
S. salivarius S3-12 et S7-1 produisent des séquences qui laissent présager la production
de bactériocines similaires à celles du témoin positif.
18
2. Activité acidifiante de Streptococcus salivarius sur son milieu
Nous observons une acidification du milieu dans tous les cas et on atteint un pH final
autour de 4 pour chaque souche, aussi que le pH final est plus faible lorsque le pH
initial est 7 que lorsqu’il est de 5,5 (Figure 7).
Figure 7 : mesure du pH après 48h sur M17 liquide avec un pH initial de 7 et de 5,5. (S6-‐4) S. salivarius S6-‐4, (S7-‐1) S. salivarius S7-‐1, (S3-‐12) S. salivarius S3-‐12, avec barres d’erreur standard.
La modification du pH initial à chaque expérience pour les différentes souches testées
montre qu’elles ont un potentiel d’acidification du milieu pouvant être exploité.
La souche S3-12 semble être la souche avec le potentiel d’acidification le plus élevé,
surtout quand elle est ensemencée au départ à un pH=7, ce potentiel peut être due à
son activité métabolique (fermentation du lactose en acide lactique).
Par ailleurs, la souche S7-1 semble avoir un potentiel d’acidification moindre,
notamment dans un milieu à pH initial de 5,5.
Pour déterminer si les souches avaient un effet différent sur le pH, nous avons
effectué des tests statistiques.
3,8 3,85 3,9
3,95 4
4,05 4,1
4,15 4,2
4,25 4,3
pH 7 pH 5,5 pH 7 pH 5,5 pH 7 pH 5,5
S6-4 S7-1 S3-12
pH final
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Comme nous avions trois échantillons, nous avons mené un test de Kruskal-Wallis
pour déterminer s’il y a une différence significative entre un et les autres :
Après avoir placé les valeurs des trois échantillons, on obtient les moyennes des rangs
pour chacun. On a un indice statistique (H) de 14. A coté, d'après la table du Khi2, on
obtient une valeur du c de 5,991, avec un ddl égal à 2 et un p de 0 ,05.
H étant supérieur au c, on refuse l'hypothèse nulle donc il y a une différence
significative entre un des échantillons et les deux autres.
Pour déterminer quel est l'échantillon différent, on fait un test de comparaisons
multiples avec les trois échantillons.
Test sur les trois couples d'échantillons possibles, avec un p de 0,05 :
-6-4/7-1 : Rm(différence des rangs)=5, indice statistique=6,7171 donc pas de
différence significative.
-6-4/3-12 : Rm=6,5, indice=6,7171 donc pas de différence significative (mais très
proche du contraire).
-7-1/3-12 : Rm=11,5, indice=6,7171 donc une différence significative.
L'échantillon S7-1 ou S3-12 semble présenter une différence avec les deux autres,
peut-être plus le 3-12.
Pour les départager, on fait les même tests mais avec un p de 0,1:
-6-4/7-1 : Rm=5, indice 5,964 donc pas de différence significative.
-6-4/3-12 : Rm=6,5, indice 5,964 donc une différence significative.
-7-1/3-12 : Rm=11,5, indice 5,964 donc une différence significative.
L'échantillon 3-12 présente une différence entre ses valeurs et celles des deux autres
échantillons.
La souche 3-12 acidifierait plus son milieu, avec un risque d'erreur de 10%.
pH de départ :
Pour vérifier si le ph de départ influe sur le ph final après cultures, on a fait un test de
Mann-Whitney avec l'échantillon A, pH 5,5 et l’échantillon B, pH 7 (9 valeurs
chacun)
On a donc obtenu Ua=24 et Ub=57, on a choisi Ua pour valeur du U donc 24.
Sur la table de Mann-Whitney, avec deux échantillons à 9 et un p de 0,05 par défaut,
on a obtenu un C de 17.
20
Comme U est supérieur à c, Ho est accepté donc, à 5% de risque d'erreur, il n'y a pas
d'impact du pH de départ sur les pH finaux.
La modification du pH initial à chaque expérience pour les différentes souches testées
montre qu’elles ont un potentiel d’acidification du milieu pouvant être exploité.
La souche S3-12 semble être la souche avec le potentiel d’acidification le plus élevé,
surtout quand elle est ensemencée au départ à un pH=7, ce potentiel peut être du à son
activité métabolique (fermentation du lactose en acide lactique).
Par ailleurs, la souche S7-1 semble avoir un potentiel d’acidification moindre,
notamment dans un milieu à pH initial de 5,5.
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IV/ Conclusion À travers nos expériences, nous avons mis en évidence l’activité inhibitrice de
Streptococcus salivarius et son activité acidifiante. Ces activités sont potentiellement
exploitables dans le développement d’un probiotique intestinal. Parmi les souches
testées, S. salivarius S3-12 montre la plus forte activité inhibitrice sur le plus grand
nombre de bactéries indicatrices, et la plus forte acidification du milieu. Nous avons
également pu mettre en évidence une production de bactériocines, molécules
antibiotiques en vogue dans le domaine des biotechnologies modernes. Le fait que
nous n’ayons pas mis en évidence de locus lié aux bactériocines dans le génome de
S3-12 montre que des recherches sont encore à mener sur cette souche.
À la suite de ces expériences préliminaires, le travail de développement du
probiotique nécessiteront beaucoup de temps puisqu’il faudra démontrer la capacité
de S3-12 à coloniser l’intestin afin qu’elle prodigue ses effets bénéfiques sur la durée. Il
faudra enfin trouver un moyen de l’absorber qui maximisera ses effets.
Concernant le nom du produit, la troisième et la douzième lettre de l’alphabet sont C
et L. La souche S3-12 donne ainsi SCL : Solution Control Light.
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V/ Bibliographie http://brccbio205sp11.blogspot.fr/2011/07/natural-occurring-cavity-fighters.html consulté le 30/09/2013 Cohen-Hadria A. 2010. Les probiotiques: quelles perspectives en odontologie?. Thèse d'exercice : Chirurgie dentaire : Paris 7. Corrieu G. Luquet F.-M. 2008. Bactéries lactiques : De la génétique aux ferments. Collection sciences et techniques agroalimentires. Ed. TECH & DOC. Paris-France. Dartu C ; Thonart P. Les bactériocines des bactéries lactiques : Caractéristiques et intérêts pour la bioconservation des sols. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2009 13(1), 143-154. De Vos P ; Boone D. R. ; Garrity G. M. 2011. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes. 2e ed. Springer. New-York- USA. Leyral G ; Vierling E. 2007. Microbiologie et toxicologie des aliments: Hygiène et sécurité alimentaires. 4e ed. Reuil-Malmaison. Bordeaux-France. Prescott L.M; Harley J.-P; Klein D. A. 2003. Microbiologie. 2e ed. de boek. Bruxelles- Belgique. Pp. 702. Wilson M; et al. Clinical and Laboratory Features of Streptococcus salivariusMeningitis: A Case Report and Literature Review. Clin Med Res. Février 2012. 10(1) : 15-25.
