1

FormationGénome2k18CetteformationneremplacepasleCoursMagistraldelaFaculté.

1. Orientationd’unADNcdansunplasmideLesséquencesreconnuesparlesenzymesderestrictionsontsemi-palindromiques.

Extrémitéscompatibles:→ Coupureduplasmideetdufragmentparunemêmeenzymede

restriction

→ Coupureduplasmideetdufragmentpardesenzymesàboutsfrancs:

→ Coupureduplasmidepardesenzymesàextrémitéssortantescomplémentairesetcoupuredufragmentparcesmêmesenzymes:

Extrémitésnoncompatibles:Coupureduplasmidepardesenzymesàextrémitéssortantesnoncomplémentairesetcoupuredufragmentparcesmêmesenzymes:

2. ExpressionetpurificationdesprotéinesdefusionProtéinehybride=protéinedefusion=protéined’intérêt+étiquette(GST)But:Purificationd’uneprotéined’intérêt(pourutilisationmédicaleparex(ex:insuline))Insertiondel’ADNcdelaprotéined’intérêtdansE.Coligrâceàunplasmide→Transcription→Traductiondelaprotéinedefusion→Purification:

→ Chromatographied’affinité:PassagedulysatbactériendansuntubeavecdesbillesmagnétiquesdeGSH→Laprotéinedefusions’accrocheauGSHvial’étiquetteGST.Elutiondurestedulysatbactérien.

→ ElutionavecunexcèsdeGSHlibre→Laprotéinedefusionsedécrochedesbilles.

→ ActiondelaTEVprotéase:coupuredel’étiquetteGSTqu’onrécupèreavecdesbillesGSH→Onseretrouveaveclaprotéined’intérêt+laTEVprotéasedansletube.

→ Chromatographied'affinitépourretenirlaTEVproteaseparsonétiquettepoly-histidine(chargée-)quis'accrocheàduNickel(chargé+)surlesparoisdutube→Onseretrouveaveclaprotéined’intérêtseule!

FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain

àInsertionnon-orientée

à insertionorientée

Maispasforcémentdanslebonsens!!(selonoùestsituél’ATGetleSTOP)

2

3. Expressioninductible:opéronlactoseBut:Permettrelaproductiondeprotéinedemanièreinductible.

Transformationduplasmide:Ajoutd’IPTG(=induction)→Activationdel’opéronà Transcriptionpuistraduction→ Sélectiondesbactériesquiontintégréunplasmide:

ajoutd’ampicilline.Seuleslesbactériespossédantlegènederésistanceàl’ampicilline(surleplasmide)survivent.

→ Sélectiondesbactériesquiontintégréunplasmidecontenantl’ADNc:ajoutd’X-GALo Pasd’insertiondel’ADNc→βgalactosidasefonctionnelle→ clivagedeX-GAL→Emissiondelumièrebleue→Coloniesbleues.

o Insertiondel’ADNc→βgalactosidasenonfonctionnelle→ pasdeclivagedeX-GAL→Pasd’émissiondelumière→Coloniesblanches.

Attention!Unplasmideayantintégrél'ADNcnegarantitpasuneprotéinefonctionnellecarilfautquel'insertionrespectelecadredelectureetl'orientation!(1chancesur6)

4. TransgénèsesBut:Réaliserl’étuded’unesurexpressionoud’uneinactivation(KO)d’ungèneTransgénèseadditive:Ajoutd’unfragmentd’ADNétranger(→étudedesurexpressiond’ungène)Transgénèsederecombinaison:Remplacementd’unfragmentd’ADN(→étuded’inactivation(KO)d’ungène)

• Pasd’insertiondufragment:absencedesgènesNeoRetTK→cellulessensiblesauG418→mortdescellules=sélectionpositive

• Insertiondufragmentauhasard:présencedesgènesNeoRetTK→cellulesinsensiblesauG418maissensiblesauganciclovir→mortdescellules=sélectionnégative

• Insertiondufragmentparrecombinaisonhomologue:présencedugèneNeoRmaisabsencedugèneTK→cellulesinsensiblesauG418etauganciclovir→surviedescellules

FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain

3

5. LesystèmeCre-LoxAutreméthodepourl’invalidationd’ungèneCroisementdedeuxsouris:

§ Sourisn°1:possèdelegèned’intérêtflanquédesitesLoxP,quiontétéintégrépartransgénèsederecombinaison.

§ Sourisn°2:possèdelegènedelarecombinaseCreetsonpromoteur,quiontétéintégrépartransgénèseadditive.

à Obtentiond’unelignéedesourisaveclegèned’intérêtflanquédesitesLoxP+legènedelarecombinaseCreetsonpromoteur.

ActivationdelarecombinaseCre→ invalidationdugèned’intérêtflanquédessitesLoxP.LegènedelarecombinaseCreestsouslecontrôledesonpromoteurquipeutêtre:inductible/tissu-spécifique/contrôlespatio-temporel(inductible+tissu-spécifique).

5. LesystèmeCRSPR-Cas9

Quefaut-ilretenir?→ Ciseauxmoléculaire2.0dufutur→ ComplexeCas9:

- ARNguide- Endonucléase

→ Utilité?àmodificationdel’ADNàdesendroitsprécisdanscertainespathologies

→ Commentçamarche?à Cassuredoublebrinà Recombinaisonhomologue:ajouts/modificationsdeséquencesà Recombinaisonnon-homolgue(NEHJ):Inactivationdugène

FormationGénomePurpan2018-2019TousdroitsréservésauTutoratAssociatifToulousain