Recherche de nouveaux bio-marqueurs diagnostiques du

Recherche de nouveaux bio-marqueurs diagnostiques du cancer de la prostate Etude du profil LC-MS de

métabolites oxygénés d'acides gras polyinsaturés (AGPI) urinaires

Clinique Beau Soleil, Service d’UrologieMontpellier

Equipe Synthèse de Lipides BioactifsIBMM UMR 5247 Montpellier

Dr Thierry Durand Dr Jean-Marie GalanoDr Camille OgerM Guillaume RéversatMme Amandine RocherDr Claire Vigor

Dr Xavier RébillardDr Grégoire PoinasDr Bruno SeguiDr Bruno BongrandDr Pierre-Jean Lamy

Matching day « Techno & Cancer »14 septembre 2017

Nouveaux bio-marqueurs diagnostiques du cancer de la prostate

Sources exogènes

Sources endogènes+

EOR

Défense enzymatique

Macromolécules (lipides, acides nucléïques, protéines)

Lésions

Maladiesneurodégénératives

Maladiescardiovasculaires

Cancers

Apoptose

EOR

Techno & Cancer, 14 Septembre 2017 1

Stress oxydant

Méthode directe « complexe »½ vie courte


Sources exogènes

Sources endogènes+

EOR



Lésions



Cancers

Apoptose

EOR



Méthode indirecte

Stress oxydant

Acides Gras Polyinsaturés (AGPI)

Isoprostanoïdes

MDA (malondialdéhyde)

HNE (4-hydroxynonenal)


Sources exogènes

Sources endogènes+

EOR



Lésions



Cancers

Apoptose

EOR



Méthode indirecte


Stress oxydant

Isoprostanoïdes


HNE (4-hydroxynonenal)



MDA (malondialdéhyde) Manque de spécificité = artéfacts de mesures

AGPI MDA + 2 TBAEOR

Pigment λ532 nmH+, Δ

Ac. ascorbique

Ac. aminés Désoxyribose

Saccharose+

Substrat peroxydasesRéactivités avec constituants plasma-

Molécules autres que le MDAréagissant avec le TBA



Isoprostanoïdes

MDA (malondialdéhyde) Manque de spécificité = artéfacts de mesures

3 études, 1 seul composé testé

AGPI MDA + 2 TBAEOR

Pigment λ532 nmH+, Δ

Ac. ascorbique

Ac. aminés Désoxyribose

Saccharose+

Substrat peroxydasesRéactivités avec constituants plasma-

Molécules autres que le MDAréagissant avec le TBA

15F2t-IsoP

Acides Gras Polyinsaturés

15-F2t-IsoP

AA; C20:3 ω-6

EOR

Isoprostanes série F24-(RS)-4-F4t-NeuroP5-F3t-IsoP

ALA; C18:3 ω-3 EPA; C20:5 ω-3 DHA; C22:6 ω-3

16-F1t-PhytoP

Phytoprostanes

EOR EOR EOR

Isoprostanes série F3 Neuroprostanes

C18 C22> 300 composés



PhytoPs, IsoPs, NeuroPs

Outil diagnostique ?

Pathologies neurologiques(syndrome de Rett)

Stress environnemental(hydrique, thermique, cuivrique,

rejet médicamenteux)

Cu2+

15F2t-IsoP pas toujours le meilleur marqueur !



Patients Epileptiques (urine)Acide adrénique

Medina, S. et al. Free Radic. Biol. Med., 2015, 79, 154-163

0

10

20

30

10

4

8

12

1

Controle

Alzheimer

Trouble cognitif léger

F2-dihomo-IsoPs

Maladies neurodégénératives (plasma)

Signorini C, unpublished result

4 F4t-NeuroPs

7(RS)-7-F2t-dihomo-IsoP(pg/

ml)

(pg/

ml)

5Techno & Cancer, 14 Septembre 2017


DiagnoCap : Cancer de la prostate (collab. Clinique Beau Soleil) → AAP Emergence 2017

4 groupes (X 30 volontaires)

Urine

PROFILAGE COMPLET DES DERIVES ISOPROSTANOIDES URINAIRESDécouverte de nouveaux marqueurs diagnostiques ou pronostiques (détection précoce, identification de sous groupes de population)

BUT

?• Patients sains• Patients à risques• Patients porteur d’1 cancer de la prostate

localisé• Patients porteur d’1 cancer de la prostate

localement avancé ou métastatique

Recrutement des patients

Traitement des

échantillons

Analyse des données

Valorisation des résultats

Etude préliminaire

-80°C + BHT

FOLCHEXTRACTION

-80°C + BHT

plasma

HYDROLYSE SPE

HYDROLYSE SPE

SPE

« -20°C »

6

DOSAGE: préparation des échantillons

cartouche plaque

Support mixteéchangeur d’ions

1 2 3 4

1. CONDITIONNEMENT2. CHARGEMENT3. LAVAGE4. ELUTION

Techno & Cancer, 14 Septembre 2017


7

DOSAGE: analyse LC-MS/MS

15(RS)-15-F2t-IsoP

T1: 353.2/193.0 T1: 353.2/247.0

m/z = 353.2Chambre de

collisionIon « père » Ion « fils »

m/z = 193m/z = 247

Sciex 5500 QTrap

• Détection MRM (multiple reaction monitoring )• ESI mode négatif

Spec

trom

étrie

de

mas

se

> 40 métabolites/1 analyse (<15 min)

Chro

mat

ogra

phie

Micro LC 200 Eksigent• Colonne: HALO C-18, 2.7μm, 90A, 0.5*100mm Eksigent• Injection volume: 5µL• Solvants: A = H20+0.1% ac. formique

B=ACN+0.1% ac. formique• Débit: 0.03mL/min min• Gradient:

Identification du composé- Temps de rétention- Transition 1: quantification- Transition 2: spécificité

Quantification du composé

… et de tous les autres

+ Courbesde calibration

Lipidomique ciblée


Techno & Cancer, 14 Septembre 2017


Sources exogènes

Sources endogènes+

EOR



Lésions



Cancers

Apoptose

EOR


Stress oxydant

Isoprostanoïdes


HNE (4-hydroxynonenal)x

OUTIL DIAGNOSTIQUEDU CANCER DE LA PROSTATE?


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Je vous remercie de votre attention

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