N° 2005-ISAL-0012 Année 2005

THESE

Rôle des gangliosides dans les perturbations de la prolifération des péricytes

rétiniens et des cellules mésangiales rénales : implication dans le développement

de la rétinopathie et de la néphropathie diabétiques

Présentée devant

L'institut National des Sciences Appliquées de Lyon

Pour obtenir

Le grade de Docteur en biochimie

Par Elodie MASSON

Ingénieur Agronome (ENSA de Rennes)

DEA de Biologie et Production Animales (Université de Rennes / ENSAR)

Soutenue publiquement le 2 février 2005 devant la commission d'examen

Jury:

Dr Jean-Claude MICHALSKI (rapporteur)

Pr Philippe ZAOUI (rapporteur)

Dr Jacques PORTOUKALIAN

Dr Nicolas WIERNSPERGER

Pr Michel LAGARDE

Dr Samer EL BAWAB

Thèse préparée au sein de l'Unité Thématique de Microangiopathie Diabétique MERCK Santé /

INSERM UMR 585, à l'INSA de Lyon.

Ecoles doctorales SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE DE LYON M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 sinou@univ-lyon1.fr

E2MC

ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS

M. Alain BONNAFOUS Université Lyon 2 14 avenue Berthelot MRASH Laboratoire d’Economie des Transports 69363 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 Alain.Bonnafous@mrash.fr

E.E.A.

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

M. Daniel BARBIER INSA DE LYON Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.64.43 Daniel.Barbier@insa-lyon.fr

E2M2

EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive Equipe Dynamique des Populations Bactériennes Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS Tél : 04.78.86.31.50 Jean-Pierre.Flandrois@biomserv.univ-lyon1.fr

EDIIS

INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis

M. Lionel BRUNIE INSA DE LYON EDIIS Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 lbrunie@if.insa-lyon.fr

EDISS

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTEhttp://www.ibcp.fr/ediss

M. Alain Jean COZZONE IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 Tél : 04.72.72.26.75 cozzone@ibcp.fr

MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml

M. Jacques JOSEPH Ecole Centrale de Lyon Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des Surfaces 36 Avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél : 04.72.18.62.51 Jacques.Joseph@ec-lyon.fr

Math IF

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE http://www.ens-lyon.fr/MathIS

M. Franck WAGNER Université Claude Bernard Lyon1 Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 wagner@desargues.univ-lyon1.fr

MEGA

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html

M. François SIDOROFF Ecole Centrale de Lyon Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 Francois.Sidoroff@ec-lyon.fr

Novembre 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AMGHAR Y. LIRIS AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASKURT A. LIRIS BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSE P. LAMCOS BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** BUREAU J.C. CEGELY* CAMPAGNE J-P. PRISMA CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHAMPAGNE J-Y. LMFA CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COURBON GEMPPM COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUBUY-MASSARD N. ESCHIL DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES FAZEKAS A. GEMPPM FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLEURY E. CITI FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE

GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** NELIAS D. LAMCOS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORMAND B. GEMPPM NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PECORARO S. GEMPPM PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RICHARD C. LGEF RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE

Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : KOBAYASHI T. PLM PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

REMERCIEMENTS

Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont été menés au sein de l’Unité Thématique de

Microangiopathie Diabétique (UTMD) Merck Santé / INSERM UMR 585 co-dirigée par le Docteur

Nicolas WIERNSPERGER et le Professeur Michel LAGARDE. Je leur suis reconnaissante de

m'avoir accueillie au sein de leur unité de recherche.

Je remercie en premier lieu le Docteur Samer EL BAWAB pour m'avoir encadrée dans ce travail

de thèse et pour avoir accompagné mes premières armes dans le monde de la recherche en me

faisant partager son expérience et ses connaissances scientifiques, et aussi pour m'avoir supportée

durant ces années, dans tous les sens du terme.

Je témoigne ma gratitude au Professeur Michel LAGARDE pour sa bienveillance à mon égard,

ainsi que pour l'attention et l'intérêt qu'il a porté à mes travaux en tant que co-directeur de thèse.

Je remercie le Docteur Nicolas WIERNSPERGER pour l'intérêt qu'il a accordé à mon travail

malgré son caractère biochimique et pour avoir financé mes travaux par l'intermédiaire de Merck

Santé.

J'exprime ensuite mon estime et mes remerciements aux membres de mon jury :

Le Professeur Philippe ZAOUI et le Docteur Jean-Claude MICHALSKI qui m'ont fait l'honneur

de juger ce travail de thèse et de me faire ainsi bénéficier de leur expertise dans les domaines

respectifs de la néphropathie diabétique et des gangliosides.

Le Docteur Jacques PORTOUKALIAN pour m'avoir fait l'honneur d'accepter la présidence de ce

jury et m'avoir aimablement apporté une aide technique dans le domaine des gangliosides.

Je remercie également le Docteur Daniel Ruggiero pour avoir encadrer, avec toute sa sympathie,

ma première année de thèse.

Je remercie le Professeur Philippe LEGRAND pour les encouragements, les conseils et l'attention

qu'il m'a témoignés depuis ma sortie d'école tout comme pendant mon cursus à l'ENSAR ainsi que

pour m'avoir encouragée à choisir cette formation "par la recherche", et je l'espère aussi "pour la

recherche", qu'est la thèse.

Je tiens aussi à témoigner mon amitié à feu l'équipe Merck qui m'a accompagnée au quotidien:

Karen, compagne de thèse, je lui souhaite beaucoup de bonheur; Pierre, ancien collègue thésard à

qui je souhaite bonne chance pour l'avenir; Lysiane que je remercie vivement pour son aide

précieuse et sa gentillesse; Anne-Marie et sa bonne humeur, Brigitte que je remercie pour sa

sympathie et son soutien logistique très appréciable (c'est surtout quand elle n'est plus là qu'on s'en

rend compte), et Corinne que je remercie pour la sympathie et les encouragements qu'elle m'a

témoignés.

Je remercie enfin l'ensemble des membres du laboratoire "Physiopathologie des Lipides et

Membranes" INSA/INSERM pour la sympathie ou l'aide qu'ils m'ont témoignées durant ces trois

années, notamment Patrick, Martine, Madeleine et Madeleine, Evelyne et Catherine, Véronique,

André, Salim et l'indispensable informaticien Fabien. J'adresse particulièrement mes remerciements

aux anciens thésards (les Dr Caroline, Laurent, Pierre, Sandrine, Olivier, Hiba) qui m'ont fait

profiter de leur expérience, et mes encouragements et vœux de réussite aux futurs docteurs (Nelly,

Saïda, Bader, Caroline, Deborah).

Je n'oublie pas M. Raymond Brut, de la société STA des abattoirs de Corbas, que je remercie pour

sa serviabilité et sa bonne humeur matinale.

J'adresse pour finir mon attachement et mes remerciements à

Mes parents, grâce auxquels j'en suis arrivée là aujourd'hui.

Jérôme, pour son écoute, son soutien essentiel et son aide.

Ma famille et mes amis pour leur écoute et leurs encouragements très précieux.

TABLE DES MATIERES

AVANT-PROPOS ....................................................................................................... 1

ABREVIATIONS ........................................................................................................ 3

RESUME ...................................................................................................................... 6

ABSTRACT ................................................................................................................. 7

INTRODUCTION ....................................................................................................... 8

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................... 11

LE DIABETE ...............................................................................................................................12

I. LE DIABETE SUCRE 12

1. Les differents types de diabéte.......................................................................................13

1.1. Le diabète de type 1 ...............................................................................................13

1.2. Le diabète de type 2 ...............................................................................................14

2. Les complications liées au diabète.................................................................................15

2.1. Les complications aiguës .......................................................................................15

2.2. Les complications chroniques ................................................................................15 2.2.1 La macroangiopathie diabétique ........................................................................16 2.2.2 La microangiopathie diabétique.........................................................................16

II. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE ET DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUES 17

1. Les microvaisseaux au sein de leur structure.................................................................18

1.1. La rétine..................................................................................................................18 1.1.1 L’œil et la rétine.................................................................................................18 1.1.2 Les microvaisseaux............................................................................................19 1.1.3 Les cellules.........................................................................................................20

(a) Les cellules endothéliales 20 (b) Les péricytes 21

1.2. Les reins .................................................................................................................21 1.2.1 Le système urinaire et les reins..........................................................................21 1.2.2 Les glomérules, site de filtration........................................................................24 1.2.3 Les cellules.........................................................................................................25

(a) Les cellules endothéliales 25 (b) Les podocytes, cellules epithéliales spécialisées 25 (c) Les cellules mésangiales 26

2. Deux pathologies évolutives ..........................................................................................27

2.1. Rétinopathie diabétique..........................................................................................28 2.1.1 Les différentes phases de la maladie..................................................................28

(a) Phase non-proliférative 28 (b) Phase pré-proliférative 28 (c) Phase proliférative 28

2.1.2 Les facteurs de risque.........................................................................................29 2.1.3 Le traitement ......................................................................................................29

2.2. Néphropathie diabétique (ND) ...............................................................................29 2.2.1 Les différents stades de la maladie ....................................................................29

(a) ND silencieuse et hyperfiltration glomérulaire 30 (b) ND débutante et microalbuminurie 30 (c) ND confirmée et protéinurie 30 (d) Insuffisance rénale terminale 31

2.2.2 Les facteurs de risque.........................................................................................31 2.2.3 Le traitement ......................................................................................................31

3. Altérations structurales et fonctionnelles.......................................................................32

3.1. Membrane basale et matrice extracellulaire...........................................................32

3.2. Altérations cellulaires.............................................................................................34 3.2.1 Cellules microvasculaires rétiniennes................................................................34

(a) Les péricytes 34 (b) Les cellules endothéliales 35

3.2.2 Cellules glomérulaires .......................................................................................36 (a) Les cellules mésangiales 36 (b) Les podocytes 38 (c) Cellules épithéliales tubulaires 38 (d) Cellules endothéliales 39

3.3. Modifications des paramètres sanguins..................................................................39

3.4. Modifications des parois capillaires.......................................................................39

III. LES MECANISMES 40

1. L'hypothèse hémodynamique ........................................................................................41

2. La voie des polyols ........................................................................................................41

3. L'activation de la pkc .....................................................................................................42

4. La glycosylation non enzymatique ................................................................................43

4.1. Formation des AGE................................................................................................43

4.2. Caractérisation et mesure .......................................................................................45

4.3. Mécanismes d’action et conséquences pathologiques ...........................................45 4.3.1 Glycation des protéines à durée de vie courte : protéines circulantes,

intracellulaires et acides nucléiques...................................................................46 4.3.2 Glycation des protéines de la matrice ................................................................47 4.3.3 Interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques ...............................48

(a) Macrophage "scavenger" récepteurs 48 (b) Complexe AGE-récepteur 48 (c) RAGE 50

4.4. AGE et rétinopathie diabétique ..............................................................................52

4.5. AGE et néphropathie diabétique ............................................................................54

5. La voie des hexosamines ...............................................................................................56

5.1. Définition ...............................................................................................................56

5.2. Mécanismes d’action..............................................................................................58 5.2.1 Apport de précurseurs glycosidiques .................................................................59 5.2.2 O-glycosylation simple de protéines..................................................................59

5.3. Conséquences pathologiques .................................................................................61 5.3.1 Insulino-résistance .............................................................................................61 5.3.2 Néphropathie diabétique ....................................................................................62

6. Le stress oxydant ...........................................................................................................64

LES GANGLIOSIDES ................................................................................................................66

I. STRUCTURE ET LOCALISATION 66

1. Structure.........................................................................................................................66

1.1. Les glycosphingolipides.........................................................................................66

1.2. Les gangliosides .....................................................................................................68

2. Localisation....................................................................................................................69

2.1. Localisation tissulaire.............................................................................................69

2.2. Localisation cellulaire ............................................................................................69

II. LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES 71

1. Biosynthèse....................................................................................................................71

1.1. Les premières étapes: formation du précurseur commun, le lactosylcéramide......72

1.2. La chaîne d'assemblage ..........................................................................................72

2. Catabolisme ...................................................................................................................73

3. Régulation du metabolisme ...........................................................................................75

3.1. Equipement enzymatique et disponibilité des substrats.........................................75

3.2. Régulation au niveau transcriptionnel....................................................................76

3.3. Mécanismes de régulation épigénétiques...............................................................76 3.3.1 Au niveau post-transcriptionnel .........................................................................76 3.3.2 Rétrocontrôle négatif .........................................................................................77 3.3.3 Le pH .................................................................................................................78

III. FONCTIONS 78

1. Double fonction des gangliosides ..................................................................................79

1.1. Reconnaissance cellulaire ......................................................................................79 1.1.1 Propriétés antigéniques ......................................................................................80 1.1.2 Reconnaissance par des protéines de liaison aux hydrates de carbone..............81 1.1.3 Modulation des récepteurs intégrines ................................................................81 1.1.4 Interaction entre gangliosides et GSL................................................................82 1.1.5 Interaction avec des virus, bactéries ou toxines.................................................82

1.2. Modulation du signal transmembranaire................................................................83 1.2.1 Régulation des récepteurs à tyrosine kinase ......................................................83 1.2.2 Modulation de la protéine kinase C ...................................................................86

2. Importance biologique / physiologique des gangliosides ..............................................87

2.1. Développement, différenciation cellulaire et tissulaire, embryogenèse.................87

2.2. Oncogénèse ............................................................................................................88

2.3. Prolifération cellulaire............................................................................................89

IV. GANGLIOSIDES ET DIABETE 92

1. Gangliosides et auto-immunité ......................................................................................93

2. Gangliosides et microangiopathie diabetique ................................................................94

3. Gangliosides et insulino-resistance................................................................................95

MATERIEL ET METHODES................................................................................. 97

I. CULTURES CELLULAIRES 98

1. Péricytes rétiniens de bœuf ............................................................................................98

1.1. Isolement des microvaisseaux et mise en culture...................................................98

1.2. Passages et traitements .........................................................................................100

2. Cellules mésangiales rénales de rat .............................................................................100

2.1. Isolement des glomérules et mise en culture........................................................100

2.2. Passages et traitements .........................................................................................102

II. TRAITEMENT DES CELLULES 102

1. Les AGE ......................................................................................................................102

1.1. Préparation des AGE............................................................................................103

1.2. Traitement ............................................................................................................103

2. La glucosamine ............................................................................................................103

3. Gangliosides exogènes.................................................................................................104

4. Anticorps anti-gangliosides .........................................................................................104

5. PPMP ...........................................................................................................................104

III. TRANSFECTION DES CELLULES AVEC LES SIRNA 105

IV. ANIMAUX DIABETIQUES 107

V. ANALYSE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE 107

1. Comptage des cellules .................................................................................................107

2. Dosage des protéines ...................................................................................................107

3. Mesure des quantités d'ADN .......................................................................................108

4. Analyse du cycle cellulaire ..........................................................................................109

5. Mesure de l’expression des protéines inhibitrices du cycle cellulaire.........................109

VI. ANALYSE DES GANGLIOSIDES 110

1. Marquage métabolique ................................................................................................110

2. Extraction, purification, séparation et détection des gangliosides...............................110

2.1. Extraction et séparation des gangliosides.............................................................110

2.2. Révélation et identification des gangliosides .......................................................111

3. Dosage des activités enzymatiques..............................................................................114

VII. ANALYSE STATISTIQUE DES RESULTATS 116

RESULTATS-DISCUSSION ................................................................................. 117

LES AGE DIMINUENT LA PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES: IMPLICATION DES GANGLIOSIDES .................................................119

I. EFFETS DES AGE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE 119

II. EFFETS DES AGE SUR LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES 121

1. Le profil basal en gangliosides ....................................................................................121

1.1. Effet des AGE sur la composition en gangliosides des péricytes ........................122

1.2. Effet des AGE sur la composition en gangliosides des cellules mésangiales......124

2. Effet des AGE sur l’activité des enzymes de biosynthèse des gangliosides................126

III. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA DIMINUTION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR LES AGE 128

1. Effet d’un traitement par des gangliosides exogènes sur la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales ..............................................................................................128

2. Effet d’un traitement avec les AGE en présence d’anticorps dirigés contre les gangliosides de la série-a .............................................................................................130

3. Effet d’un cotraitement AGE et PPMP........................................................................131

4. Effet de la transfection avec un SiRNA de GM3 synthase..........................................133

IV. DISCUSSION 134

L’ACTIVATION DE LA VOIE DES HEXOSAMINES DIMINUE LA PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES : IMPLICATION DES GANGLIOSIDES.......................................................................................................................138

I. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE 139

II. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES 140

1. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides des péricytes ............................141

2. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides des cellules mésangiales ..........141

III. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’ACTIVITE GM3 SYNTHASE 144

IV. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA DIMINUTION DE PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR LA GLUCOSAMINE 146

1. Effet d’un traitement par les gangliosides exogènes sur la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales ..............................................................................................146

2. Effet d’un cotraitement glucosamine et PPMP............................................................148

V. ETUDE DES MECANISMES CONDUISANT A L’INHIBITION DE PROLIFERATION DES CELLULES MESANGIALES PAR LA GLUCOSAMINE 150

1. Effet de la glucosamine sur l’hypertrophie des RMC..................................................150

2. Effet de la glucosamine sur le cycle cellulaire ............................................................152

2.1. Analyse du cycle par FACS .................................................................................152

2.2. Effet de la glucosamine sur l’expression des inhibiteurs de kinase cycline-dépendante............................................................................................................153

3. Effet de la glucosamine sur le profil en gangliosides ..................................................155

4. Effet de GM2 et GM1 sur l’hypertrophie et le cycle cellulaire des RMC...................156

4.1. Effet des gangliosides sur l’hypertrophie.............................................................156

4.2. Effet des gangliosides sur le cycle cellulaire .......................................................157

VI. DISCUSSION 159

METABOLISME DES GANGLIOSIDES DU CORTEX RENAL DE SOURIS DB/DB...164

I. MESURE DES ACTIVITES GM3 ET GD3 SYNTHASE 164

II. MESURE DES TAUX DE GM3 165

III. DISCUSSION 166

CONCLUSION ET PERSPECTIVES .................................................................. 168

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.............................................................. 174

PUBLICATIONS..................................................................................................... 197

INDEX DES FIGURES

Figure 1: évolution des cas de diabète dans le monde. 12

Figure 2: structure de l'œil en coupe. 18

Figure 3:représentation schématique de la structure de la rétine. 19

Figure 4: structure d'un capillaire rétinien. 20

Figure 5: structure du système urinaire et du rein. 22

Figure 6: structure d'un néphron. 23

Figure 7: structure d'un corpuscule rénal et de la membrane de filtration glomérulaire. 25

Figure 8: coupe d'un glomérule rénal. 26

Figure 9: comportement biphasique des cellules mésangiales rénales au cours de la néphropathie diabétique. 37

Figure 10: différentes voies de formation des AGE. 44

Figure 11: le complexe récepteur aux AGE. 49

Figure 12: signalisation consécutive à la liaison des AGE au récepteur RAGE. 51

Figure 13: voie de biosynthèse des hexosamines. 57

Figure 14: mécanisme proposé pour l’induction de la voie des hexosamines par l’hyperglycémie. 58

Figure 15: différentes protéines O-glycosylées connues dans la cellule. 60

Figure 16: mécanisme d’action de la glucosamine proposé pour la surproduction de matrice extracellulaire. 63

Figure 17 : le stress oxydant, lien unificateur entre les différents mécanismes biochimiques issus de l'hyperglycémie.65

Figure 18 : structure d'un glycosphingolipide et position dans la membrane plasmique. 68

Figure 19 : structure d'un ganglioside. 69

Figure 20 : structure d'un microdomaine membranaire. 71

Figure 21 : schéma de biosynthèse des gangliosides. 73

Figure 22 : catabolisme des gangliosides. 74

Figure 23 : récapitulatif des différentes fonctions occupées par les gangliosides. 80

Figure 24 : mécanisme de l'interaction du GM1 avec la toxine cholérique. 83

Figure 25 : modulation de l'activité de différents récepteurs aux facteurs de croissance par les gangliosides. 84

Figure 26 : processus apoptotique impliquant le GD3 (SM, sphingomyélinase; ST8, sialyltransférase 8: GD3

synthase). 91

Figure 27 : mécanisme d'action proposé pour expliquer l'implication du GM3 dans l'insulino-résistance. 96

Figure 28 : croissance des péricytes depuis un microvaisseau rétinien (A) Péricytes rétiniens (B). 99

Figure 29 : croissance des cellules mésangiales à partir d'un glomérule rénal (A) Cellules mésangiales (B). 101

Figure 30 : mécanisme de l'interférence ARN. 105

Figure 31 : Exemple de plaque HPTLC révélée par autoradiographie (A) puis par révélation colorimétrique au

résorcinol (B). 112

Figure 32 : immunuodétection du GM2. 113

Figure 33 : détection du GM1 par la toxine cholérique. 114

Figure 34 : principe du dosage des activités enzymatiques GM3 et GD3 synthases. 115

Figure 35 : Les AGE inhibent la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. 120

Figure 36 : Profil en gangliosides des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales rénales. 122

Figure 37 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. 123

Figure 38 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 dans les péricytes. 124

Figure 39 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des cellules mésangiales. 125

Figure 40 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 et du GM1 dans les cellules mésangiales. 126

Figure 41 : Les AGE augmentent l'activité GM3 synthase et diminuent l'activité GD3 synthase. 127

Figure 42 : L’ajout exogène de gangliosides de la série a diminue la prolifération des BRP. 129

Figure 43 : L’ajout exogène de gangliosides de la série a diminue la prolifération des RMC. 130

Figure 44 : L’utilisation d’anticorps anti-GM2 et anti-GM1 protège partiellement de l’effet anti-prolifératif des

AGE. 131

Figure 45 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par les AGE dans les péricytes. 132

Figure 46 : La transfection avec un SiRNA spécifique de la GM3 synthase protège partiellement les RMC de

l’inhibition de prolifération causée par les AGE. 133

Figure 47 : La glucosamine diminue la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. 140

Figure 48 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. 141

Figure 49 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des cellules mésangiales. 143

Figure 50 : La glucosamine modifie l'activité GM3 synthase des péricytes et des cellules mésangiales. 145

Figure 51 : Le traitement par le GM1 et le GD3 diminue la prolifération des BRP. 147

Figure 52 : Le traitement par les GM2, GM1 et GD1a diminue la prolifération des RMC. 148

Figure 53 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par la glucosamine sur les péricytes.149

Figure 54 : La glucosamine inhibe la croissance des cellules mésangiales. 151

Figure 55 : Le traitement avec la glucosamine induit l’hypertrophie des cellules mésangiales. 152

Figure 56 : La glucosamine bloque le cycle cellulaire des RMC de façon dose-dépendante. 153

Figure 57 : La glucosamine augmente l’expression de p21Waf1/Cip1. 154

Figure 58 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des RMC. 155

Figure 59 : GM2 et GM1 induisent l’hypertrophie des cellules mésangiales. 156

Figure 60 : GM2 et GM1 bloquent le cycle cellulaire des RMC en phase G0/G1. 157

Figure 61 : GM2 et GM1 augmentent l’expression de p21Waf1/Cip1. 158

Figure 62 : Les activités GM3 et GD3 synthase sont modifiées dans le cortex rénal de souris db/db. 165

Figure 63 : Le taux de GM3 est augmenté dans le cortex rénal de souris db/db. 166

Figure 64 : Bilan des modifications du métabolisme des gangliosides dans les péricytes et les cellules mésangiales en

réponse aux AGE et à la glucosamine, et dans les souris db/db. 172

AVANT-PROPOS

Les travaux menés au cours de ces trois années de thèse ont fait l'objet de communications

scientifiques : publications acceptées ou en révision, résumés ou posters ainsi que d'un brevet.

PUBLICATIONS :

MASSON E., TRONCY L., RUGGIERO D., WIERNSPERGER N., LAGARDE M., EL BAWAB

S. a-Series gangliosides mediate the effects of Advanced Glycation End-products on pericyte and

mesangial cell proliferation: a common mediator for retinal and renal microangiopathy ?. Diabetes

2005 Jan;54(1):220-7.

MASSON E., WIERNSPERGER N., LAGARDE M., EL BAWAB S. Involvement of gangliosides

in glucosamine-induced proliferation decrease of retinal pericytes. Accepté pour publication dans

Glycobiology 2004 Dec 29 (Advance Access).

MASSON E., WIERNSPERGER N., LAGARDE M., EL BAWAB S. Glucosamine induces cell

cycle arrest and hypertrophy of mesangial cells: implication of gangliosides. Accepté pour

publication dans Biochemical Journal 17 January 2005 (Immediate Publication).

MASSON E., RUGGIERO D., WIERNSPERGER N., LAGARDE M., EL BAWAB S. Advanced

glycation end-products decrease pericyte and mesangial cell proliferation: involvement of the a-

series gangliosides. Diabetes abstract book, June 2003, 63rd Scientific Sessions, New Orleans,

Louisiana.

1

COMMUNICATIONS AFFICHEES :

MASSON E., RUGGIERO D., WIERNSPERGER N., LAGARDE M., EL BAWAB S. Advanced

glycation end-products decrease pericyte and mesangial cell proliferation: involvement of the a-

series gangliosides, Congrès de Lipidomique, GERLI (Groupe d'Etude et de Recherche sur les

Lipides et les Lipoprotéines), Paris, septembre 2003.

MASSON E., RUGGIERO D., WIERNSPERGER N., LAGARDE M.. Ganglioside profile of

microvascular retinal and glomerular cells in the scope of diabetic microangiopathy, GERLI,

Nantes, avril 2002.

BREVET :

MASSON Elodie, RUGGIERO Daniel, TONCY Lysiane, WIERNSPERER Nicolas, LAGARDE

Michel, EL BAWAB Samer. GM3 synthase, comme cible thérapeutique dans les complications

microvasculaires du diabète. Brevet français n° 04 04971 déposé le 7 mai 2004.

2

ABRÉVIATIONS

AGE Advanced Glycation End-products

AIF Apoptose Induction Factor

AMPc Adénosine Monophosphate cyclique

ARNm Acide Ribo Nucléique messager

ATP Adénosine Triphosphate

bFGF basic Fibroblast Growth Factor

BRP Bovine Retinal Pericyte

BSA Bovine Serum Albumine

CDH Céramide Dihexoside

CDKI Cyclin Dependant Kinase Inhibitor

Cer céramide

CML carboxyméthyllysine

CREB cAMP responsive element binding

DAG Diacylglycérol

DCCT Diabetes Control and Complications Trial

DID Diabète Insulino-Dépendant

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO Diméthyl Sulfoxyde

DNID Diabète Non Insulino-Dépendant

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid

EGF Epithelial Growth Factor

EGFR EGF Receptor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FACS Flow Analysis

FGF Fibroblast Growth Factor

GAD Glutamic Acid Decarboxylase

GalCer Galactosylcéramide

GalNAc N-Acétylgalactosamine

GalNAcT Galactosyl-N-Acétylamine Transférase

GalT-II Galactosyltransférase II

3

GAPDH Glyceraldéhyde-3-Phosphate Dehydrogénase

GD Disialoganglioside

GFAT Glutamine Fructose-6-P Amidotransférase

GlcN Glucosamine

GlcN-6-P Glucosamine-6-P

GlcNAc N-Acétylglucosamine

GM Monosialoganglioside

GOLD Glyoxal-lysine dimer

GPI Glycosyl-Phosphatidylinositol

GSL Glycosphingolipide

GT Trisialoganglioside

HBSS Hanks' Balanced Salt Solution

HDL High Density Lipoprotein

HEPES Acide (Hydroxy-2-Ethyl)-4-Pipérazinyl-1-2-Ethansulfonique

HGF Hepatocyte Growth Factor

HPLC High Pression Liquid Chromatography

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography

ICA Islet Cell Antibodies

ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule-1

Ig Immunogloguline (G, M)

IGF1 Insulin Growth Factor 1

IL-1 Interleukine

IRS1 Insuline Receptor Substrate 1

Laccer Lactosylcéramide

LDL Low Density Lipoprotein

MAG Myelin Associated Glycoprotein

MAM Membranes Associées aux Mitochondries

MAP-kinase Mitogen Activated Protein kinase

MOLD Methyl glyoxal-lysine dimer

MRS Macrophage Scavenger Receptor

NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

ND Néphropathie Diabétique

NeuAc Acide N-Acétylneuraminique

NeuGc Acide N-Glycolylneuraminique

NF-κB Nuclear Factor-κB

4

NGF Nerve Growth Factor

OGT O-GlNAc Transférase

OMS Organisation Mondiale de la Santé

PAF Platelet Activating Factor

PAI-I Plasminogen Activator Inhibitor

PBS Phosphate-Buffered Saline

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PDGFR PDGF Receptor

PDMP DL-threo-1-Decanoylamino-3-morpholino-1-propanol

PG Prostaglandine (E1, H2, I2…)

PKA Protein Kinase (A, C, Cβ1…)

PLC Phospholipase C

PPMP DL-threo-1-Phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol

RAGE AGE Receptor

RD Rétinopathie Diabétique

RMC Renal Mesangial Cell

ROS Reactive Oxygen Species

SAP Sphingolipid Activator Protein

SBP Sugar Binding Protein

SiRNA Small interfering Ribo Nucleic Acid

ST Sialyltransférases (IV et V)

STZ Streptozotocine

SVF Serum de Veau Foetal

TGFβ Transforming Growth Factor β

TLCK Tosyle de Lysinechlorométhylcétone

TNF-α Tumor Necrosis Factor-α

tPA Tissular Plasminogen Activator

TxA2 Thromboxane A2

UDP Uridine Diphosphate

VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VLDL Very Low Density Lipoprotein

VPF Vascular Permeability Factor

5

RESUME

La perte des péricytes rétiniens est une des premières altérations de la rétinopathie diabétique.

L’arrêt du cycle cellulaire, l’hypertrophie puis la disparition des cellules mésangiales rénales sont

des caractéristiques typiques de la néphropathie diabétique. La voie de la glycation (formation des

produits avancés de glycation ou AGE) et la voie de l’hexosamine sont deux hypothèses

biochimiques proposées pour expliquer les altérations cellulaires des microcomplications du

diabète. D’autre part, bien que les gangliosides aient souvent été décrits pour moduler la

prolifération cellulaire, leur rôle potentiel dans les perturbations de prolifération caractéristiques de

la rétinopathie et de la néphropathie diabétiques a été très peu étudié. L’objectif de ce travail de

thèse a été de déterminer les effets des AGE et d’une activation de la voie de l’hexosamine, mimée

par la glucosamine, sur la prolifération et le métabolisme des gangliosides des péricytes et de

cellules mésangiales puis d’établir l’implication des gangliosides dans ces processus de régulation

de la prolifération.

Nos résultats ont montré que les AGE et la glucosamine inhibent la prolifération des deux types

cellulaires étudiés. De plus, ils ont révélé que la glucosamine bloque le cycle cellulaire et induit

l’hypertrophie des cellules mésangiales. D’autre part, les AGE comme la glucosamine sont capables

de modifier le profil en gangliosides des cellules, en modulant les activités de leurs enzymes de

biosynthèse. Enfin, nos observations suggèrent que les gangliosides sont impliqués dans l’inhibition

de la prolifération et l’hypertrophie causée par les AGE et la glucosamine dans les péricytes et les

cellules mésangiales. Elles présentent ainsi les gangliosides comme un nouveau mécanisme

d’action des AGE et de la voie de l’hexosamine et permettent de proposer les gangliosides, en

particulier ceux de la série-a, et la GM3 synthase, comme un mécanisme potentiel commun au

développement de la rétinopathie et de la néphropathie diabétiques.

Ce travail est un des premiers à suggérer l’implication des gangliosides dans les complications

microvasculaires du diabète que sont la rétinopathie et la néphropathie diabétiques. Par

l’intermédiaire des gangliosides, il ouvre des perspectives thérapeutiques nouvelles et communes

pour le traitement des deux microcomplications.

6

ABSTRACT

Loss of retinal pericyte is one of the earliest alteration of diabetic retinopathy. Cell cycle arrest,

hypertrophy then death of renal mesangial cells are typical hallmarks of diabetic nephropathy.

Glycation (advanced glycation end-products, AGE, formation) and the hexosamine pathway are two

biochemical hypotheses proposed to explain cellular alteration occurring during diabetic vascular

complication. On the other hand, although gangliosides have often been described as modulators of

cellular proliferation, very few studies have explored their potential role in cell proliferation

alteration of diabetic retinopathy and nephropathy. The aim of the present study was to determine

the effects of AGE and hexosamine pathway activation, mimicked by glucosamine, on pericyte and

mesangial cell proliferation and ganglioside metabolism and then to establish the implication of

gangliosides in these regulation of proliferation process. Our result showed that AGE and

glucosamine inhibit the proliferation of both cell types studied. Moreover, they revealed that

glucosamine blocks the cell cycle and induces hypertrophy of mesangial cells. On the other hand,

both AGE and glucosamine are able to affect cellular ganglioside profile by modulating their

biosynthetic enzyme activities. Finally, our observations suggested that gangliosides are implicated

in the inhibition of cell proliferation and hypertrophy caused by AGE and glucosamine in pericyte

and mesangial cells. Thus, they present gangliosides as a novel mechanism of action of AGE and

the hexosamine pathway and lead to propose gangliosides, especially a-series gangliosides and

GM3 synthase, as a potential common mechanism of diabetic retinopathy and nephropathy

development. This work is one of the first suggesting the implication of gangliosides in diabetic

retinopathy and nephropathy. Through gangliosides, it offers new therapeutic prospects common to

both microvascular complications.

7

INTRODUCTION

8

L’hyperglycémie est le facteur initial essentiel menant aux complications microvasculaires

du diabète. Les mécanismes de la toxicité du glucose au niveau des tissus ciblés par ces

complications sont multiples. La formation des produits avancés de glycation (AGE) est connue

pour jouer un rôle important dans le développement de la rétinopathie et de la néphropathie

diabétiques. La voie des hexosamines, et notamment l’accumulation de glucosamine, est également

de plus en plus souvent mise en cause dans le développement des complications

microangiopathiques, en particulier de la néphropathie.

De nombreuses études ont mis en avant le rôle crucial des péricytes et des cellules

mésangiales, respectivement dans le développement de la rétinopathie et de la néphropathie

diabétiques. La perte des péricytes rétiniens est en effet une des premières altérations structurales

observées au cours de la rétinopathie diabétique. Après une première phase précoce et limitée de

prolifération, l’arrêt de croissance, l’hypertrophie et la disparition des cellules mésangiales sont des

évènements caractéristiques de la néphropathie diabétique. Il apparaît donc que la régulation de la

prolifération de ces deux types cellulaires est un processus pathologique clé des complications

microvasculaires. Cependant, les mécanismes soutenant ces altérations sont encore mal connus.

Les gangliosides sont connus pour jouer un rôle dans la différenciation cellulaire, la

régulation de la croissance ou l’apoptose. Des altérations des taux de gangliosides ont été associées

au processus d’oncogénèse ou à des maladies héréditaires comme la maladie de Farber, même si

peu de choses sont connues des mécanismes ou de la signification biologique de ces altérations.

Cependant, les modifications des gangliosides et leur implication potentielle dans la

microangiopathie diabétique, pathologie où la croissance cellulaire est également sévèrement

affectée, ont été très peu étudiées. Pourtant, il a été récemment décrit que les AGE pouvaient

induire des altérations spécifiques de glycoprotéines (Rellier N. et al., 1997) et de glycolipides

(Natalizio A. et al., 2001). De plus, il a été montré que la voie de l’hexosamine pouvait réguler de

nombreuses enzymes et voies biochimiques ainsi que fournir des intermédiaires glycosylés pour la

biosynthèse de glycoconjugués dont les gangliosides. Il est donc probable que le métabolisme des

gangliosides soit affecté par l’environnement diabétique.

L’objectif de ce travail était de déterminer : i) les effets de deux voies biochimiques du

diabète, les AGE et la voie des hexosamines, sur la prolifération des péricytes rétiniens et des

cellules mésangiales rénales, ii) les effets des AGE et des hexosamines sur le métabolisme des

gangliosides et iii) le rôle des gangliosides dans les processus de perturbation de prolifération

exercée par les AGE et la voie des hexosamines.

Cette étude a été menée dans une optique comparative à la fois des deux voies biochimiques, AGE

9

et voie des hexosamines, et des deux complications microvasculaires, rétinopathie et néphropathie

diabétiques.

Le manuscrit s'articule comme suit:

• une "étude bibliographique" ayant pour objet de présenter les données nécessaires à la

compréhension du travail, de son contexte et de ses enjeux. La première partie est consacrée à la

rétinopathie et à la néphropathie diabétiques alors que la deuxième traite des gangliosides,

• une seconde partie décrivant les matériel et méthodes utilisés au cours du travail expérimental,

• les "résultats et discussion" qui exposent et discutent les résultats obtenus selon une première

partie traitant des AGE et une seconde de la glucosamine,

• et pour finir, les conclusions et perspectives.

10

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

11

LE DIABETE

I. LE DIABETE SUCRE

Le diabète est une maladie chronique qui prend les proportions d'une véritable épidémie (Figure

1). Elle touche aujourd'hui 150 millions de personnes, sur tous les continents et de tous les âges, soit

environ 3% de la population mondiale. Elle est responsable de 9% de la mortalité totale, tuant

chaque année 4 millions de malades. A l'horizon 2025, en l'absence de prévention primaire, le

nombre de diabétiques aura plus que doublé selon les prévisions de l'OMS, plaçant le diabète parmi

les principales causes d'incapacités et de décès.

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Figure 1: évolution des cas de diabète dans le monde. Source OMS

La maladie entraîne en effet des complications graves, voire mortelles, essentiellement d'origine

vasculaire, conséquences d'un taux de glucose sanguin en permanence anormalement élevé.

12

L'hyperglycémie chronique est la principale caractéristique du diabète, l'origine de toutes les

complications et la base du diagnostic. Un patient est considéré diabétique s'il présente deux

glycémies à jeun supérieures à 1,26 g/l (~ 7mmol/l). Cette glycémie oscille normalement entre 0,8 à

jeun et 1,4 g/l après un repas grâce à un système régulateur dont l'insuline est l'un des principaux

acteurs. Seule hormone hypoglycémiante de l'organisme, elle est produite par les cellules β des îlots

de Langerhans du pancréas. Elle stimule l'absorption du glucose sanguin par les tissus dits insulino-

dépendants (foie, muscle squelettique et tissu adipeux) et son stockage sous forme de glycogène. De

plus, elle inhibe les voies de production hépatique de glucose (néoglucogénèse et glycogénolyse).

Elle intervient enfin dans la régulation du métabolisme lipidique en inhibant la lipolyse des

triglycérides adipocytaires et en facilitant leur synthèse, ainsi que celle de protéines dans le foie et

le tissu adipeux. Dans le cas du diabète, un défaut de sécrétion de l'insuline et/ou une diminution de

sensibilité des tissus à son action ne permet plus une régulation adaptée du taux de glucose sanguin

qui augmente conduisant à l'hyperglycémie. Il existe deux types de diabète : le diabète de type 1 et

le diabète de type 2, partageant de nombreuses complications mais qui diffèrent par leurs causes ou

leur épidémiologie et correspondent à des mécanismes pathogéniques différents.

1. LES DIFFERENTS TYPES DE DIABETE

1.1.Le diabète de type 1

Le diabète de type 1, auparavant appelé diabète insulino-dépendant (DID), représente environ

10% des cas de diabète mondiaux. Il apparaît le plus souvent chez l'enfant et le jeune adulte, c'est

pourquoi il est aussi appelé "diabète juvénile". Les symptômes classiques les plus manifestes sont

une sécrétion excessive d'urine (polyurie), une sensation de soif (polydipsie) ainsi qu'une perte de

poids, d'où son autre dénomination de "diabète maigre".

C'est une maladie auto-immune conduisant à la destruction sélective et progressive des cellules

β pancréatiques, productrices d'insuline. Cette destruction résulte de la production d'auto-

anticorps dirigés contre des antigènes des cellules β (gangliosides, insuline, GAD : glutamic acid

decarboxylase). Elle semble apparaître chez des sujets génétiquement prédisposés, c'est à dire

possédant des gènes de susceptibilité liés au système HLA mais le processus auto-immun serait

déclenché par un facteur environnemental encore mal connu. Il pourrait correspondre à une

infection virale (par coxsackie B4 ou la rubéole in utéro) ou bien à un fragment de lactalbumine

bovine contenu dans le lait et mal digéré par le tube digestif immature du nourrisson. Ce processus

de destruction entraîne une carence en insuline absolue et définitive responsable de l'apparition

d'une hyperglycémie chronique permanente.

13

Le pancréas étant incapable de produire l'insuline, la survie de ces malades dépend entièrement

d'injection quotidienne de cette hormone, d'où son nom de diabète insulino-dépendant. Ce

traitement est associé à un régime alimentaire en glucose finement contrôlé.

1.2.Le diabète de type 2

Le diabète de type 2, anciennement diabète non insulino-dépendant (DNID) est de loin la forme

de la maladie la plus fréquente puisqu'elle représente 90% des cas mondiaux. C'est un véritable

problème de santé publique, touchant notamment 1,5 millions de français auxquels il faut ajouter

environ 300 000 malades qui s'ignorent. L'installation de la maladie est en effet insidieuse et les

symptômes sont souvent moins marqués que dans le diabète de type 1 pouvant même être

inexistants au début. Le diagnostic ne sera alors posé que plusieurs années après l'apparition de la

maladie (en moyenne 8 ans), alors que l'effondrement de la production d'insuline par les cellules β

et les complications existent déjà. Le diabète de type 2 est aussi appelé "diabète mature" car il

survient le plus souvent chez l'adulte, autour de la cinquantaine, sa prévalence augmentant avec

l'âge. Cependant, il apparaît, depuis quelques années, de manière inquiétante, chez l'adolescent et

l'enfant. Les sujets atteints sont généralement en surcharge pondérale, c'est pourquoi il est

également fait référence à cette maladie en tant que "diabète gras".

L'hyperglycémie des diabétiques de type 2 est la conséquence de deux grands mécanismes

physiopathologiques. Le premier correspond à une diminution de la sensibilité tissulaire à

l'action de l'insuline (insulino-résistance) touchant les tissus périphériques que sont le muscle, le

tissu adipeux et le foie. Cette résistance découle d'une altération de la signalisation de l'insuline qui

toucherait notamment le nombre de récepteurs à l'insuline et/ou leur affinité pour l'hormone et le

nombre de transporteurs membranaires dépendants de l'insuline qui permettent l'entrée du glucose

dans les cellules. Le deuxième phénomène consiste en une anomalie de l'insulino-sécrétion. La

production d'insuline est tout d’abord augmentée pour palier son inefficacité et l'hyperinsulinémie

permet dans un premier temps de maintenir une glycémie normale. Plus la maladie progresse et plus

la sensibilité à l'insuline baisse. L'hypersécrétion d'insuline ne suffit alors plus à compenser

l'insulino-résistance ce qui se manifeste à la fois par une hyperinsulinémie et une hyperglycémie.

Peu à peu, les cellules β deviennent moins sensibles au stimulus glucose. De plus, leur nombre et

leur masse diminuent à cause de la toxicité du glucose. La sécrétion d'insuline finit alors par

diminuer et les diabétiques de type 2 deviennent à terme, comme les diabétiques de type 1,

insulinopéniques. Avec cette baisse de l'insulino-sécrétion, l'hyperglycémie se fait plus sévère. Ces

désordres du métabolisme glucidique sont associés à des troubles importants du métabolisme

lipidique résultant en une dyslipidémie avec augmentation des triglycérides, acides gras libres, LDL

et baisse du HDL cholestérol. Les causes initiales de ce diabète sont mal connues et certainement

14

multiples, facteurs génétiques et environnementaux agissant de concert. Les facteurs génétiques

sont cruciaux puisque le diabète de type 2 est une maladie polygénique largement familiale. Les

facteurs environnementaux, comme le manque d'exercice physique et l'excès de poids, jouent

également un rôle majeur. 80% des diabétiques de type 2 présentent en effet un excès pondéral.

L'obésité, principalement la graisse androïde, favorise l'insulino-résistance et ainsi l'apparition du

diabète qui est d'ailleurs la complication la plus répandue de l'obésité. Chez un grand nombre

d'individus, le diabète de type 2 est lié au syndrome métabolique ou "syndrome X" associant excès

de poids voire obésité, résistance à l'insuline, dyslipidémie et hypertension artérielle, qui constitue

une situation à risque pour le développement de ce type de diabète. Dans la plupart des pays,

l'augmentation du nombre de personnes diabétiques résulte de changements sociaux tels

l'urbanisation, la sédentarisation et la baisse d'activité physique, le changement de régime

alimentaire…. Cette augmentation est particulièrement marquée dans les pays en voie de

développement.

Le traitement de ces malades passe tout d'abord par une réduction de la charge pondérale grâce à un

régime alimentaire approprié et un exercice physique accru. Il peut être associé à la prise d'anti-

diabétiques oraux (biguanides insulino-sensibilisateurs ou sulfamides hypoglycémiants stimulant

l'insulino-sécrétion). Si la survie des diabétiques de type 2 ne dépend pas de l'injection d'insuline, au

moins au départ, un tiers d'entre eux y ont quand même recours pour faire baisser leur glycémie.

Des stratégies indépendantes de la glycémie comme le contrôle de la pression artérielle, du profil

lipidique ou le blocage de l'angiotensine 2 peuvent également être mises en place.

2. LES COMPLICATIONS LIEES AU DIABETE

2.1.Les complications aiguës

Les comas hypoglycémiques ou hyperosmolaires ainsi que les acidoses cétosiques constituent les

principales complications aiguës du diabète. Elles sont causées par un mauvais contrôle glycémique

ou liées à la prise d'un traitement inadapté. Ces évènements conduisent fréquemment à

l'hospitalisation et mettent parfois en jeu le pronostic vital. Cependant, elles se raréfient grâce à la

meilleure prise en charge, l'éducation et l'auto-surveillance des diabétiques.

2.2.Les complications chroniques

Les diabétiques développent, en fonction de la gravité et de la durée de la maladie, des

complications chroniques d'origine vasculaire ayant principalement pour cause une normalisation

insuffisante et inconstante de la glycémie. La mise en place de ces complications est favorisée par le

15

caractère quasi asymptomatique de l'hyperglycémie modérée qui empêche une prise en charge

précoce. L'hyperglycémie crée insidieusement des altérations structurales et fonctionnelles des

gros et des petits vaisseaux conduisant respectivement à la macroangiopathie et la

microangiopathie.

2.2.1 La macroangiopathie diabétique

Ce terme désigne l’ensemble des lésions artérielles consécutives au diabète, qu’il soit de type 1 ou

de type 2, allant d'une altération discrète de l'intima à l'obstruction complète de certains vaisseaux

qui entraînent une ischémie du territoire périphérique correspondant. Elles consistent en fait en une

athérosclérose accélérée et aggravent par conséquent le risque d’accidents cardio-vasculaires. Ces

macrocomplications sont majoritairement représentées par les maladies coronaires mais aussi par

des accidents vasculaires cérébraux et des artérites des membres inférieurs. Les lésions

athéromateuses des diabétiques se caractérisent par leur incidence élevée et leur précocité, leur

caractère souvent asymptomatique et leur localisation multiple ainsi que par leur gravité. Ces

cardiopathies sont en effet la première cause de mortalité chez les diabétiques (50% des décès de

patients diabétiques dans les pays industrialisés, source OMS). Le risque de mortalité cardio-

vasculaire est accru d’un facteur 3 à 5 chez les malades du diabète comparé au reste de la

population et 15% des infarctus, angioplasties et pontages en France sont dus au diabète de type 2.

La pathogénèse des macrocomplications met en jeu trois facteurs principaux : des anomalies

lipidiques (en particulier des modifications quantitatives et qualitatives des lipoprotéines), des

anomalies de l’hémostase (hyperactivité plaquettaire et état procoagulant) et des modifications

pariétales (épaississement et perte de compliance de la paroi vasculaire).

2.2.2 La microangiopathie diabétique

Les complications microvasculaires consistent en des altérations structurales, telles qu’un

épaississement de la membrane basale, et fonctionnelles comme une augmentation de la

perméabilité des petits vaisseaux (artérioles, veinules et capillaires) de diamètre inférieur à 30 µm.

Il est admis que l’hyperglycémie est le facteur initial essentiel menant à ces complications

microvasculaires. Deux études épidémiologiques, l'une américaine (DCCT) (1993), l'autre

européenne (UKPDS) (1998a) ont en effet révélé qu’un contrôle strict de la glycémie permet de

retarder l’apparition et la progression des microangiopathies. Si ces lésions atteignent l'ensemble de

l'organisme, elles ne se manifestent cliniquement qu’au niveau de certains tissus et organes

particulièrement affectés. Il s’agit de la rétine (rétinopathie), du rein (néphropathie) et du système

nerveux (neuropathie).

16

• La rétinopathie diabétique touche environ 40 % des diabétiques. Son apparition est

dépendante et progressive en fonction de l'ancienneté du diabète. Elle conduit à une baisse

progressive de l’acuité visuelle pouvant aller jusqu'à la perte de la vue. Elle est d'ailleurs la

deuxième cause de cécité acquise dans les pays industrialisés après la dégénérescence maculaire

liée à l’âge et est par exemple responsable en France de 500 à 1000 cécités par an.

• La néphropathie diabétique est une complication un peu moins fréquente (30 % des patients

après 15 ans de diabète) mais très lourde de conséquences. L'atteinte rénale est en effet un important

facteur de surmortalité des diabétiques, notamment cardio-vasculaire. Les lésions et

dysfonctionnements rénaux évoluent plus ou moins rapidement vers une hypertension artérielle, une

réduction de la fonction de filtration glomérulaire amenant dans les stades terminaux à l'insuffisance

rénale. La néphropathie diabétique s'affirme d'ailleurs progressivement comme la cause la plus

fréquente d'insuffisance rénale terminale et est la principale cause de mise en dialyse et de

transplantation en Europe du Nord et aux USA. Son apparition semble atteindre un plateau après 15

à 20 ans d'évolution du diabète.

Ces deux premières complications microvasculaires, très souvent associées chez les malades,

intéressent notre étude et seront plus précisément décrites par la suite.

• La neuropathie diabétique est probablement la complication la plus courante du diabète.

Jusqu’à 50 % des diabétiques en souffrent à des degrés divers. C’est une maladie complexe

associant des perturbations à la fois des fibres nerveuses et des microvaisseaux qui leur sont

associés touchant aussi bien les nerfs périphériques que le système nerveux autonome. Elle conduit

à une perte de sensibilité (douleur, perception thermique) et à des lésions des membres inférieurs

(perte de réflexes moteurs, paralysie…) ainsi qu'à des troubles de la régulation du rythme cardiaque

ou de la motricité digestive et vésicale. Le pied diabétique est une conséquence ultime de

l’évolution pathologique au niveau des nerfs et des vaisseaux conduisant à une ulcération et bien

souvent à l’amputation.

II. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RETINOPATHIE ET DE LA

NEPHROPATHIE DIABETIQUES

Les microvaisseaux: artérioles, veinules et en particulier les capillaires qui les unissent, sont le siège

des échanges entre le sang et les tissus. Ils assurent l'apport de substrats métaboliques et d'oxygène

17

aux cellules ainsi que l'épuration des déchets cellulaires des tissus qu'ils irriguent. Leur intégrité est

donc nécessaire au bon fonctionnement des organes et des tissus. La paroi de ces microvaisseaux

est composée d'une couche mince de cellules endothéliales reposant sur une membrane basale,

éventuellement entourée d'autres types cellulaires, parfois spécifiques du tissu comme c'est la cas

pour la rétine ou le rein.

1. LES MICROVAISSEAUX AU SEIN DE LEUR STRUCTURE

1.1.La rétine

1.1.1 L’œil et la rétine

Le globe oculaire peut être divisé en trois couches concentriques (Figure 2) : la tunique fibreuse

(sclérotique et cornée) qui lui donne sa forme et protège ses parties internes, la tunique vasculaire

(choroïde, corps ciliaire et iris) qui l'irrigue en partie et la tunique nerveuse, la plus interne, que

constitue la rétine. Celle-ci recouvre les trois quarts postérieurs de l'œil et a pour fonction de

recevoir les signaux visuels focalisés par la cornée et ajustés par le cristallin, puis de les traiter

avant de les transmettre au cerveau via le nerf optique.

Cornée

CristallinHumeur aqueuse

Corps vitré

Tunique fibreuse

Tunique vasculaire

Tunique nerveuse

Cornée

CristallinHumeur aqueuse

Corps vitré

Tunique fibreuse Tunique fibreuse

Tunique vasculaire Tunique vasculaire

Tunique nerveuse Tunique nerveuse

Figure 2: structure de l'œil en coupe

(d'après http://www.bioinformatics.org/œil-couleur/dossier/anatomie.html)

18

La rétine est formée d'un épithélium pigmentaire et d'une partie neurale (Figure 3). Cette dernière

présente trois couches distinctes de neurones séparées par deux zones où se retrouvent les contacts

synaptiques (couches plexiformes) : les photorécepteurs (étage de réception), les cellules bipolaires

et les cellules ganglionnaires (étages de transmission). Entre ces éléments se trouvent des éléments

de soutien et de nutrition comme les cellules névrogliques, les limitantes et les cellules de Müller.

Lit vasculaire choroïdien

Epithélium pigmentaire

Photorécepteurs

Limitante externe

Limitante interne

Cellules ganglionnaires

Plexiforme interne

Nucléaire interne(cellules bipolaires)

Plexiforme externe

Nucléaire externe

Étage de transmission

Étage de réception

Lit microvasculaire rétinien:

veinuleartèriole

capillaires

Lit vasculaire choroïdien

Epithélium pigmentaire

Photorécepteurs

Limitante externe

Limitante interne

Cellules ganglionnaires

Plexiforme interne

Nucléaire interne(cellules bipolaires)

Plexiforme externe

Nucléaire externe

Étage de transmission

Étage de réception

Lit microvasculaire rétinien:

veinuleartèriole

capillaires

Lit vasculaire choroïdien

Epithélium pigmentaire

Photorécepteurs

Limitante externe

Limitante interne

Cellules ganglionnaires

Plexiforme interne

Nucléaire interne(cellules bipolaires)

Plexiforme externe

Nucléaire externe

Étage de transmission

Étage de réception

Lit microvasculaire rétinien:

veinuleartèriole

capillaires

Figure 3:représentation schématique de la structure de la rétine

La rétine est un tissu particulièrement irrigué et le seul endroit du corps où il est possible

d'examiner directement les vaisseaux sanguins qui traversent sa surface antérieure (examen du fond

de l'œil). L'artère rétinienne centrale se ramifie et s'étale en éventail pour irriguer la surface

antérieure de la rétine. Ce lit vasculaire est inégalement réparti dans 2 régions, majoritairement à la

surface de la rétine mais également enfoui dans la couche de cellules bipolaires.

1.1.2 Les microvaisseaux

Les capillaires rétiniens sont constitués de deux types cellulaires (Figure 4). Les cellules

endothéliales forment une monocouche du côté luminal reposant sur la membrane basale. Les

péricytes, enfouis dans cette membrane basale, enveloppent les microvaisseaux. La membrane se

19

compose principalement de collagène type IV, de protéoglycanes et de glycoprotéines comme la

laminine et la fibronectine. Cellules endothéliales et péricytes se répartissent selon un ratio 1 pour 1.

Ceci constitue une particularité de la paroi vasculaire rétinienne, les péricytes étant dans la plupart

des autres tissus en très large minorité. Une deuxième singularité repose sur l'existence de jonctions

serrées qui relient les cellules adjacentes de l'endothélium, prévenant ainsi les fuites de certaines

substances. Cellules endothéliales, péricytes et cellules neuronales (cellules de Müller), forment,

avec la membrane basale, la barrière hémato-rétinenne et sont donc responsables de la

perméabilité capillaire. Cette barrière étanche contrôle en effet les échanges entre le sang et les

espaces extra-vasculaires par voie transcellulaire active. Elle protège ainsi les éléments nerveux de

la rétine de certains facteurs circulants et permet de maintenir un environnement biochimique

particulier dans le compartiment extravasculaire.

cellule endothéliale

péricyte

Figure 4: structure d'un capillaire rétinien. Schéma et photo en microscopie

1.1.3 Les cellules

(a) Les cellules endothéliales

Outre la formation de la barrière hémato-rétinenne, les cellules endothéliales exercent de

nombreuses fonctions, participant à la régulation de phénomènes physiologiques. Elles jouent en

effet un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire en sécrétant des agents vaso-

dilatateurs comme la prostaglandine PGI2 et le monoxyde d'azote ou des agents vaso-constricteurs

tels que les endothélines. Les cellules endothéliales interviennent également dans la régulation de la

fibrinolyse en produisant l'activateur du plasminogène tissulaire (tPA) et l'inhibiteur de l'activateur

de plasminogène (PAI-I). D'autre part, elles peuvent produire plusieurs facteurs de croissance

membrane basale

lumière du capillaire

cellule endothéliale

péricyte

membrane basale

lumière du capillairelumière du capillaire

20

comme le "fibroblast growth factor" (FGF) qui stimule d'ailleurs la prolifération de péricytes en

culture. Enfin, les cellules endothéliales sécrètent des composants de la membrane basale tels que la

fibronectine, le collagène IV ou la laminine (Kohner E.M. et al., 1994).

(b) Les péricytes

La fonction des péricytes est moins claire. Bien qu'ils soient enchâssés dans la membrane basale, ils

interagissent étroitement avec les cellules environnantes. Ils émettent des prolongements

cytoplasmiques permettant des contacts directs avec les cellules endothéliales par des jonctions

gap, des molécules d'adhésion ou des glycoconjugués de surface, ou encore par la sécrétion de

facteurs solubles (Ruggiero D. et al., 1997). Ils joueraient ainsi un rôle important dans la régulation

du métabolisme et de la croissance des cellules endothéliales. Des expériences de co-culture

permettant les contacts cellule-cellule ont montré que les péricytes inhibaient la croissance des

cellules endothéliales, en activant le TGFβ (Orlidge A. et al., 1987). Il a également été suggéré que

les péricytes pourraient stimuler la production de prostacycline des cellules endothéliales ou les

protéger contre le stress oxydant (Yamagishi S. et al., 1993). D'autre part, les péricytes serviraient à

maintenir l'intégrité structurale des microvaisseaux en supportant les cellules endothéliales. Il a

été observé qu’une diminution de la couverture de péricytes s’accompagnait d’une augmentation de

segments de capillaires acellulaires, correspondant à une perte des cellules endothéliales (Hammes

H.P. et al., 2002). Les péricytes répondent au PDGF et une carence dans ce facteur de croissance

pourrait perturber le recrutement des péricytes vers leur destination finale. Lindahl et al. ont montré

qu’une perte de péricytes chez des souris déficientes en PDGF conduisait à une dilatation des

capillaires et à des hémorragies (Lindahl P. et al., 1997). Les péricytes possèdent de plus une

activité contractile proche de celle des cellules musculaires dont ils pourraient dériver.

Contractions et dilatations permettent de moduler le diamètre des vaisseaux et le tonus

vasculaire et donc de réguler le débit sanguin. Comme les cellules endothéliales, ils synthétisent

des constituants de la membrane basale, participent à la régulation du tonus vasculaire en produisant

par exemple des prostacyclines vasodilatatrices et interviennent également dans le contrôle de

l'hémostase en sécrétant la trombospondine, molécule d'adhésion des plaquettes à l'endothélium, et

le PAI-I.

1.2.Les reins

1.2.1 Le système urinaire et les reins

Avec les deux uretères, la vessie et l'urètre, les reins constituent le système urinaire qui prend en

charge l'élimination des déchets de l'organisme (Figure 5). Les reins règlent la composition et le

volume sanguin en évacuant sous forme d'urine une quantité sélective de déchets issus du sang

21

(substances toxiques et substances essentielles excédentaires, notamment les déchets azotés issus du

catabolisme des protéines, les ions tels Na+, H+, le dioxyde de carbone ou l'eau). Ils assurent ainsi

l'homéostasie hydro-électrique. Ils régulent également la pression sanguine. Ils assurent de cette

façon le maintien de l'homéostasie de l'organisme en adaptant la quantité et la composition de

l'urine produite en fonction des circonstances comme l'alimentation par exemple. Le rein comporte

une région externe appelée cortex, une région interne appelée medulla ainsi qu'une cavité centrale,

le bassinet, où s'écoule l'urine avant d'être évacuée vers la vessie par l'uretère. Les reins, de par leur

fonction de filtration du sang, renferment un grand nombre de vaisseaux sanguins issus des

ramifications très développées de l'artère et de la veine rénales.

medulla

cortex

bassinet

medulla

cortex

bassinet

Figure 5: structure du système urinaire et du rein (d'après

http://www.doctissimo.fr/html/sante/atlas/atlas_sysurogenital_78a.htm)

Cortex et medulla sont traversés par environ 1 million d'unités élémentaires de filtration du sang,

appelées néphrons (Figure 6). C'est au niveau de ces unités structurales et fonctionnelles que se

déroulent les processus menant à la formation de l'urine. Le néphron est constitué de deux parties:

un corpuscule rénal qui filtre le liquide et un tubule rénal dans lequel s'écoule le liquide filtré. Le

corpuscule est lui-même composé d'une masse de capillaires artériels, appelée glomérule,

entourée d'une structure épithéliale à double paroi, en forme de coupe, appelée capsule glomérulaire

ou de Bowman. Le sang pénètre dans le glomérule par une artériole afférente qui se divise pour

former le réseau enchevêtré de capillaires qui constitue le glomérule. Les capillaires glomérulaires

22

fusionnent ensuite pour former une artériole efférente par laquelle le sang filtré ressort du

glomérule. A mesure que le sang s'écoule dans les capillaires, l'eau et certains solutés du sang

(électrolytes, substances dissoutes de faible taille et de poids peu élevé) passent dans l'espace

capsulaire à travers la paroi des capillaires (filtration glomérulaire). Le liquide obtenu est l'urine

primitive qui sera transportée depuis cet espace jusqu'au tubule rénal. Durant son passage dans le

tubule, une grande partie du filtrat (98% de l'eau et du sel, ions, acides aminés, glucose…) retourne

au sang via des ramifications de l'artériole efférente qui entourent le tubule (réabsorption

tubulaire). Le sang épuré passe ensuite dans des veinules puis une série de veines et enfin dans la

veine rénale par laquelle il quitte le rein. Le filtrat, quant à lui, rejoint le bassinet par des tubules

collecteurs où il forme l'urine.

Figure 6: structure d'un néphron

Artériole afférente

Artériole efférente

Néphron

Urine

Capsule de

Bowman

GloméruleCorpuscule

ramifications de l’artériole

efférente

Urine

Sang épuré

Tubule

(veine rénale)

(artère rénale)

veine rénaleartère rénale

Artériole afférente

Artériole efférente

Néphron

Urine

Capsule de

Bowman

GloméruleCorpuscule

ramifications de l’artériole

efférente

Urine

Sang épuré

Tubule

(veine rénale)

(artère rénale)

veine rénaleartère rénale

23

1.2.2 Les glomérules, site de filtration

Le glomérule, bouquet de capillaires, est le siège de l'activité de filtration du rein (figure 7A). Il

se compose de 20 à 40 boucles de capillaires soutenus par un tissu mésangial intercapillaire, ou

mesangium, qui comprend des éléments à la fois cellulaires (cellules mésangiales) et acellulaires

(matrice extracellulaire mésangiale). L'endothélium des capillaires, le feuillet viscéral de la capsule

glomérulaire et la membrane basale qui les sépare, forment la membrane glomérulaire (Figure

7B) qui agit comme un filtre, laissant passer certaines substances en provenance du sang et en

arrêtant d'autres en fonction de leur taille et de leur charge. L'endothélium des capillaires se

compose d'une couche simple de cellules endothéliales avec des fenestrations (lamina fenestrae)

qui empêche le passage des cellules du sang. Le feuillet viscéral de la capsule est formé de cellules

épithéliales spécialisées appelées podocytes. Elles se prolongent par de nombreuses ramifications

en forme de pied qui recouvrent la membrane basale de manière discontinue. Les espaces laissés

représentent les fentes ou pores de filtration. Cet épithélium empêche le passage des protéines de

taille moyenne. La membrane basale glomérulaire est une couche dense de matériel

extracellulaire (lamina densa) située entre l'endothélium et l'épithélium. Elle est en continuité avec

la matrice mésangiale. Elles contiennent toutes deux collagène type IV, protéoglycanes, laminine et

fibronectine. Les groupes sulfates portés par un grand nombre de ces protéines confèrent une charge

anionique à la membrane basale qui contribue à la perméabilité sélective et dépendante de la charge

des microvaisseaux glomérulaires. Elle empêche également le passage des plus grosses protéines.

La barrière de filtration glomérulaire peut être considérée comme une membrane perforée par des

pores et recouverte de charges négatives. La filtration se fait donc au niveau des capillaires selon un

chemin extracellulaire, à travers l'endothélium (probablement via les fenestrations), la membrane

basale et l'épithélium (probablement via les pores de filtration) jusqu'à l'espace capsulaire. La

composition du filtrat dépend, en plus de facteurs hémodynamiques, principalement de la

perméabilité de la membrane glomérulaire, et à la fois la taille et la charge des molécules

influencent leur passage à travers cette membrane. Les petites molécules (eau, urée, glucose…)

passent librement au travers et plus le poids moléculaire augmente, plus le passage des particules à

travers les pores est entravé. La filtration glomérulaire est ainsi une ultrafiltration, produisant un

filtrat quasiment exempt de macromolécules.

24

Figure 7: structure d'un corpuscule rénal et de la membrane de filtration glomérulaire

1.2.3 Les cellules

(a) Les cellules endothéliales

Les cellules endothéliales forment une monocouche bordant la lumière capillaire. Elles assurent

différentes fonctions comme le transport de molécules plasmatiques ou le contrôle du tonus

vasculaire en synthétisant des médiateurs vasoactifs, comme le NO ou les endothélines, qui peuvent

notamment agir sur les cellules de type musculaire voisines. En formant un endothélium fenestré,

elles participent également à la barrière de filtration glomérulaire (Trevisan R. et al., 1997).

(b) Les podocytes, cellules epithéliales spécialisées

Il existe deux types de cellules épithéliales dans le glomérule: les cellules de l'épithélium pariétal

(feuillet externe) de la capsule de Bowman et celles de l'épithélium viscéral (feuillet interne)

appelées podocytes. Les podocytes, contrairement aux cellules mésangiales ou endothéliales, ne

sont pas enfouis dans la membrane basale glomérulaire mais la recouvrent. Ce sont des cellules

polarisées qui développent des ramifications en forme de pied attachées à la membrane basale du

glomérule alors que le corps cellulaire flotte dans la capsule de Bowman. Ces ramifications

recouvrent la membrane basale glomérulaire de manière discontinue, laissant entre elles des pores

de filtration. Les podocytes sont impliqués dans différentes fonctions du glomérule. Tout d'abord,

ils constituent avec les cellules endothéliales la paroi des capillaires et participent à la formation de

la membrane basale glomérulaire et potentiellement à sa dégradation. De plus, les "pieds" des

podocytes et plus précisément les fentes laissées entre eux (environ 10% de la surface de la

membrane basale glomérulaire), sont un composant majeur de la barrière de filtration

glomérulaire. Ils joueraient un rôle crucial dans la sélectivité dépendante de la taille des

molécules. Comme le mesangium, les podocytes pourraient également, grâce à leur cytosquelette

podocyte

mesangium

endothelium fenestré

endothelium fenestré

membrane basale

BARRIERE

DE

FILTRATION

urine primitive

feuillet interne

sangcapillaire

podocytes

glomérule

Capsule de Bowman

A B

podocyte

mesangium

endothelium fenestré

endothelium fenestré

membrane basale

BARRIERE

DE

FILTRATION

urine primitive

feuillet interne

sangcapillaire

podocytes

glomérule

Capsule de Bowman

A B

25

particulièrement développé, fournir un support matériel au glomérule, en stabilisant l'architecture

du capillaire ainsi qu'en opposant une résistance aux forces exercées sur la paroi capillaire par le

gradient de pression existant au travers de la barrière de filtration. Il a enfin été suggéré que ces

capacités contractiles pourraient permettre aux podocytes qui semblent répondre à différents agents

vasoactifs, de réguler la filtration glomérulaire (Mundel P. et al., 1995).

(c) Les cellules mésangiales

Les cellules mésangiales sont le troisième type cellulaire du glomérule. Elles représentent environ

un tiers des cellules glomérulaires et sont situées entre les capillaires, occupant une position

centrale dans le glomérule rénal (Figure 8).

membrane basale

Cellules mésangiales +

mésangium

podocyte

cellules endothéliales

capillaire membrane basale

Cellules mésangiales +

mésangium

podocyte

cellules endothéliales

capillaire

Figure 8: coupe d'un glomérule rénal

• Les cellules mésangiales synthétisent et dégradent la matrice mésangiale, une des deux

matrices extracellulaires du glomérule, l'autre étant la membrane basale. Elle se compose d'un

matériel dense proche de la membrane basale, principalement des glycoprotéines et protéoglycanes

tels le collagène, la laminine ou la fibronectine. Cellules et matrice mésangiales constituent le

mesangium qui remplit l'espace intercapillaire du glomérule. La matrice mésangiale a longtemps été

considérée comme une structure inerte et rigide. Elle fournit en effet un support solide aux

capillaires glomérulaires. Cependant, sa structure dynamique et flexible semble également

26

largement influencer la physiologie des cellules mésangiales à la fois en conditions normales et

dans des états pathologiques, au cours desquels la matrice mésangiale est souvent modifiée. De

plus, la matrice mésangiale permet des connexions entre les cellules mésangiales et la membrane

basale, avec laquelle elle est en continuité.

• Les cellules mésangiales maintiennent par ailleurs des contacts directs avec les cellules

endothéliales par des prolongements cytoplasmiques, au niveau de zones dites juxtaglomérulaires,

où la membrane basale et les podocytes recouvrent l'endothélium de manière discontinue. Ces

contacts étroits entre la surface de filtration endothéliale et le mesangium ont d'ailleurs conduit à

suggérer que les cellules mésangiales elles-mêmes puissent être impliquées dans les processus de

filtration glomérulaire et capter des macromolécules, comme par exemple des complexes immuns.

• Les cellules mésangiales sont particulièrement riches en éléments contractiles et parfois

considérées comme des cellules musculaires lisses modifiées ou des péricytes vasculaires

contractiles. Elles sont capables de se contracter ou de se relâcher en réponse à différents agents

vasoactifs. Elles pourraient de ce fait réguler le diamètre des capillaires et la filtration

glomérulaire en exerçant une action mécanique par contraction-relaxation sur les matrices

extracellulaires et l'endothélium. Par ailleurs, une expansion du mesangium, qui survient dans

certaines situations pathologiques comme le diabète, peut également affecter la surface de filtration

du glomérule en diminuant le diamètre des capillaires.

• Enfin, des études de culture cellulaire ont montré que les cellules mésangiales synthétisent

diverses enzymes et facteurs (rénine, protéinase, Plasminogen-Activator et PAI), hormones et

cytokines (erythropoïétine, Il, PDGF, IGF1, auxquels elles peuvent répondre de manière autocrine)

et lipides bioactifs (PAF, PG) (Mene P. et al., 1989)

Le terme de "myofibroblaste" est parfois utilisé pour décrire la nature indéterminée des cellules

mésangiales, partageant à la fois des caractères structuraux et fonctionnels des cellules musculaires

lisses et des fibroblastes. Cependant, leur importance dans la fonction glomérulaire est de plus en

plus claire, surtout lorsque le glomérule est endommagé.

2. DEUX PATHOLOGIES EVOLUTIVES Rétinopathie et néphropathie diabétiques correspondent à un ensemble d’altérations anatomiques et

fonctionnelles s’aggravant progressivement. Les manifestations cliniques apparaissent au fil des

différentes phases qui définissent la maladie, évoluant à terme vers la cécité et l’insuffisance rénale

terminale, respectivement. Cette évolution vers un handicap majeur et définitif peut être freinée par

une intervention médicale précoce.

27

2.1.Rétinopathie diabétique

2.1.1 Les différentes phases de la maladie

La rétinopathie diabétique regroupe les manifestations rétiniennes spécifiques du diabète et

représente un ensemble anatomo-clinique et fonctionnel qui évolue progressivement vers des

troubles de la vision jusqu’au stade ultime de cécité. Cette évolution est classée selon différentes

phases.

(a) Phase non-proliférative

Une des premières manifestations cliniques de la rétinopathie diabétique consiste en une dilatation

des microvaisseaux. Elle est la conséquence d’altérations structurales comme l’épaississement de

la membrane basale, la perte des péricytes et les altérations des cellules endothéliales ainsi que

d’une augmentation du débit sanguin, qui diminuent la résistance des capillaires (Forrester J.V. et

al., 1997). Les microanévrismes consécutifs conduisent à l’apparition de multiples hémorragies.

Les exsudats font également partie des lésions précoces de la rétinopathie diabétique et

correspondent à des fuites de constituants plasmatiques à travers la paroi des microvaisseaux

anormaux. Ils sont la conséquence d’une augmentation de la perméabilité vasculaire et favorisent

l’apparition d’œdèmes. Cette étape qui ne se manifeste généralement pas par une perte de vision,

est très courante et demeure en l’état chez la plupart des patients pendant de nombreuses années

(Dowler J.G.F. et al., 1997).

(b) Phase pré-proliférative

L’occlusion des capillaires est une caractéristique de cette phase pré-proliférative qui conduit à des

zones d’ischémie. Elle est associée à des modifications des microvaisseaux intrarétiniens comme

des dilatations, la formation de boucles, qui pourraient représenter des tentatives de

revascularisation de la rétine ischémiée, prélude à la formation de nouveaux vaisseaux. L’occlusion

des capillaires est favorisée par un profil sanguin pro-thrombotique (augmentation de l’activité

plaquettaire et fibrinolytique, adhésion de leucocytes ou monocytes circulants à l’endothélium…)

(Forrester J.V. et al., 1997). Cette phase intermédiaire constitue un risque majeur d’évolution vers la

phase proliférative de la rétinopathie diabétique et indique la nécessité d’une intervention rapide

pour freiner l’évolution de la maladie.

(c) Phase proliférative

Lorsque les zones de non-perfusion résultant de l’occlusion des capillaires sont trop importantes, la

prolifération des cellules endothéliales est stimulée dans les zones adjacentes pour former des

nouveaux microvaisseaux et tenter de revasculariser la rétine ischémiée. La production locale de

facteurs de croissance comme le VEGF serait responsable de ce phénomène d’angiogénèse

28

(Forrester J.V. et al., 1997). Ces nouveaux microvaisseaux sont dilatés, fragiles et perméables,

favorisant ainsi l’apparition d’hémorragies. D’abord formés dans la rétine, ils gagnent

progressivement la surface et s’attachent à la face postérieure du vitré, dans lequel ils peuvent

même pénétrer et provoquer des hémorragies. Le vitré se rétracte en exerçant une traction

importante sur la rétine qui se décolle. Cette étape est la plus significative en terme d’atteinte

visuelle et si les microvaisseaux néoformés ne sont pas traités, ils risquent d’occasionner la perte de

la vue (Kohner E.M., 1994).

2.1.2 Les facteurs de risque

L’hyperglycémie apparaît comme une cause majeure de la rétinopathie diabétique. Cette idée est

soutenue par des données du DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) qui indiquent

qu’un contrôle strict de la glycémie peut retarder l’apparition et/ou améliorer la sévérité de cette

pathologie (1993). L’hypertension constitue également un facteur aggravant. La durée du diabète

est aussi un facteur prédictif important de la rétinopathie diabétique.

2.1.3 Le traitement

Le traitement préventif de la maladie passe par un contrôle optimisé à la fois de la glycémie et de

la pression sanguine. Des études menées sur les patients diabétiques de type I et de type II ont

révélé qu’un traitement intensif de l’hyperglycémie réduisait de 54 et 25 %, respectivement

l’incidence de la rétinopathie (Fong D.S. et al., 2003). Le traitement de l’hypertension représente

également un moyen d’enrayer la progression de la rétinopathie diabétique. Une étude clinique a

notamment montré que la baisse de la pression sanguine chez les diabétiques de type II permettait

de réduire la progression de la rétinopathie (1998b). Le principal traitement de la rétinopathie

diabétique déclarée est resté inchangé depuis quasiment 50 ans. Il consiste à éliminer les parties de

rétine malades par photocoagulation au laser ou par cryothérapie. Les microvaisseaux

nouvellement formés, particulièrement dangereux pour la vision, répondent cependant bien à la

photocoagulation. Des méthodes de microchirurgie se sont de plus développées, permettant aux

patients de récupérer une partie des capacités visuelles qu’ils avaient perdues.

2.2.Néphropathie diabétique (ND)

2.2.1 Les différents stades de la maladie

La néphropathie diabétique est généralement considérée comme une dégradation de la fonction

rénale depuis une albuminurie normale jusqu’à une insuffisance rénale terminale passant par des

états intermédiaires marqués notamment par une microalbuminurie. L’évolution se fait

29

progressivement d’une phase à l’autre, à une vitesse très variable selon l’individu. La progression

de la maladie peut également être stoppée à un stade donné où le malade restera toute sa vie, voire

même régresser.

(a) ND silencieuse et hyperfiltration glomérulaire

Cette première étape (d'une durée de 8 à 12 ans en moyenne) correspond à une augmentation du

taux de filtration glomérulaire qui s’accompagne d’une augmentation du volume des reins et

d’une hypertrophie glomérulaire. Elle est la conséquence d’une augmentation de la pression

sanguine intraglomérulaire et d’une augmentation de la surface de filtration. Cette dernière est en

effet augmentée dans les stades précoces de la ND suite à un épaississement de la membrane basale

(Trevisan R. et al., 1997). Cette hyperfiltration est partiellement réversible par un contrôle strict de

la glycémie et de la tension, mettant en particulier en jeu l'angiotensine 2.

(b) ND débutante et microalbuminurie

La microalbuminurie est le premier signe clinique de la ND. Le taux normal d’excrétion

d’albumine est < 20 mg/jour et la microalbuminurie correspond à un taux allant de 30 à 300

mg/jour. Ces taux ne sont pas détectables par les méthodes classiques et nécessitent des techniques

plus sensibles alors que les lésions rénales sont déjà importantes. Une excrétion d’albumine

persistante et plus élevée (> 300 mg/jour), détectable par l’utilisation de bandelettes, correspond à la

macroalbuminurie.

La microalbuminurie est un facteur clé de la néphropathie diabétique. Les patients passent

premièrement par cette étape avant de développer une néphropathie plus avancée et la

microalbuminurie peut ainsi représenter un précieux marqueur de l’atteinte rénale débutante.

Les malades souffrant de microalbuminurie sont à risque pour développer une protéinurie même si

tous n’évolueront pas vers cette aggravation de la maladie. Plus la microalbuminurie s’est

développée tôt après la naissance du diabète et plus les risques de progression vers une protéinurie

sont forts (Krowleski A.S. et al., 1997) La microalbuminurie est également liée à une dysfonction

endothéliale généralisée et représente un marqueur de risque cardiovasculaire. La microalbuminurie

est due à une augmentation de la perméabilité des capillaires consécutive à une augmentation

de la pression sanguine dans le glomérule ainsi qu’à une perte de sélectivité de filtration de la

barrière glomérulaire. La filtration glomérulaire reste accrue à ce stade.

(c) ND confirmée et protéinurie

Au fur et à mesure que la barrière de filtration glomérulaire se dégrade en perdant sa sélectivité

(perte des charges négatives et augmentation de la taille des pores), la microalbuminurie progresse

en macroalbuminurie. La sélectivité initiale pour l’albumine disparaît et l’excrétion de protéines

30

devient non sélective, concernant notamment les IgG, c’est la protéinurie. Elle est accompagnée

d’une hypertension artérielle qui accélère l’augmentation de l’albuminurie et le déclin du taux de

filtration glomérulaire. La fonction rénale se dégrade et les patients atteints par la protéinurie

présentent de très forts risques de perte de la fonction rénale.

(d) Insuffisance rénale terminale

Elle correspond au stade ultime de la maladie où la fonction rénale s’effondre avec moins de 10 %

de néphrons fonctionnels, nécessitant le recours à des traitements épurateurs extrarénaux. Cette

perte de la fonction rénale est notamment due à l’expansion du mesangium qui conduit à la

sclérose diffuse des glomérules qui s'étend à la fibrose des structures tubulo-intersticielles. Le

risque de dégradation de la fonction rénale est alors quantitativement lié au niveau de protéinurie.

Parallèlement à la ND, d’autres complications se mettent en place. Les atteintes cardio-vasculaires

sont importantes et les diabétiques de type 2 décèdent souvent d’accident cardio-vasculaire avant

d’avoir atteint le stade d’insuffisance rénale terminale. L’artériopathie ou la neuropathie sont

également fréquentes chez les patients atteints par la ND. Enfin, la rétinopathie diabétique est

largement associée à la ND, à tel point qu’elle est par exemple systématique au stade de la ND

confirmée chez les diabétiques de type 1.

2.2.2 Les facteurs de risque

Tous les diabétiques ne développent pas de ND. Comme pour la rétinopathie, la glycémie joue un

rôle majeur et semble être le facteur principal influençant le passage d’une albuminurie normale à

une microalbuminurie. Plusieurs études cliniques ont montré qu’une amélioration du contrôle

glycémique diminuait le risque de développer une microalbuminurie ou d’évoluer vers la

néphropathie avérée. D’autres facteurs de risque semblent également entrer en ligne de compte

comme l’hypertension artérielle, le tabagisme ou un taux élevé de LDL. L’hyperlipidémie

pourrait favoriser la progression de la maladie (Krowleski A.S. et al., 1997). De plus, il est

démontré qu’un facteur de susceptibilité génétique, notamment une prédisposition à l’hypertension,

détermine en partie le risque de développer une ND.

2.2.3 Le traitement

Le traitement de la ND repose largement sur un contrôle strict de la glycémie. Il peut réduire ou

même normaliser la microalbuminurie et l’hyperfiltration glomérulaire. La baisse de la tension

artérielle est aussi un objectif du traitement par des antihypertenseurs, comme des inhibiteurs de

l’enzyme de conversion. Ceux-ci diminueraient la pression sanguine et l’hypertension glomérulaire

31

ainsi que la protéinurie et ralentiraient la diminution du taux de filtration glomérulaire. La réduction

de l’apport alimentaire en protéines réduirait également les altérations de la ND (Walker J.D. et al.,

1994). De plus, la réduction de l’hyperlipidémie semble améliorer le pronostic de la ND. Enfin,

l’utilisation de produits anti-AGE (produits avancés de glycation, formés en conditions

hyperglycémiques et impliqués dans le développement des complications microangiopathiques, cf

partie 5), comme l’aminoguanidine, pourrait constituer un traitement efficace.

Lorsque la fonction rénale est perdue, le recours à l’hémodialyse ou la dialyse péritonéale est

nécessaire. A un stade ultime de la maladie, la transplantation devient la solution de choix. Elle

peut concerner le rein ou combiner le rein et le pancréas. Plus récente et prometteuse, la greffe

d’îlots de Langerhans pourrait devenir une alternative.

3. ALTERATIONS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES Durant le rétinopathie et la néphropathie diabétiques, la structure et la fonction des microvaisseaux

sont progressivement et fortement altérées. Ces anomalies se manifestent à différents niveaux :

3.1.Membrane basale et matrice extracellulaire

L’épaississement des membranes basales est une des premières altérations observées lors de la

microangiopathie diabétique. Il atteint le système vasculaire de nombreux tissus (peau, muscle,

cerveau, cœur…) et en particulier la rétine et les glomérules et tubules rénaux. Cet épaississement

résulte d’une augmentation de la synthèse et du dépôt de composants de la matrice comme le

collagène IV et la fibronectine. Au contraire, la synthèse de protéoglycanes sulfatés, chargés

négativement, est diminuée, modifiant ainsi en plus la composition chimique des membranes

basales. En parallèle, les processus de dégradation de la matrice sont altérés, notamment par une

diminution de l’expression et de l’activité de collagenase et de metalloprotéinases. De plus, un

phénomène de glycation des protéines de la matrice se produit dans les conditions

hyperglycémiques du diabète. Cette modification leur confère notamment une résistance aux

protéases, limitant ainsi leur dégradation. La conjonction d’une augmentation de la production des

protéines matricielles et d’une diminution de leur dégradation altère le turnover des composants de

la membrane basale et concoure à leur accumulation (Tsilibary E.C., 2003).

Au niveau du glomérule rénal, l’augmentation de production de protéines matricielles affecte

également la matrice mésangiale. La biosynthèse du collagène IV et de la fibronectine est

augmentée alors que celle des protéoglycanes sulfatés est au contraire diminuée. L'augmentation

de la synthèse de matrice mésangiale est largement responsable de l'expansion du mesangium,

observée après quelques années de diabète. Ce phénomène est étroitement lié à la détérioration de la

32

fonction glomérulaire. Une corrélation entre l'expansion mésangiale et les manifestations cliniques

de la néphropathie diabétique comme l'albuminurie, l'hypertension ou la diminution du taux de

filtration glomérulaire a été mise en évidence. Associée à un épaississement de la membrane basale,

l’expansion du mesangium est responsable du grossissement du glomérule rénal, considéré comme

un caractère majeur de la néphropathie diabétique. Il semble que cette surproduction de protéines

matricielles soit en partie causée par une augmentation de l’expression du TGFβ, facteur pro-

sclérosant. Celle-ci a été montrée à la fois dans des cellules mésangiales soumises à de fortes

concentrations de glucose et dans des modèles d’animaux diabétiques. L’utilisation d’anticorps

anti-TGFβ in vitro et in vivo a par ailleurs permis de démontrer que l’induction de ce facteur de

croissance était nécessaire à l’hypertrophie rénale et à l’accumulation de matrice extracellulaire

(Sharma K. et al., 1996; Ziyadeh F.N. et al., 1994). D’autres facteurs de croissance comme le

PDGF, les produits avancés de glycation ou bien l’angiotensine II ont également été impliqués dans

la stimulation de la synthèse de protéines matricielles, certainement via une induction du TGFβ

(Wolf G. et al., 1999).

Les altérations structurales des membranes basales ont des conséquences fonctionnelles importantes

participant aux dysfonctionnements vasculaires :

• Les matrices extracellulaires jouent un rôle très important dans le comportement cellulaire et

ainsi, les modifications de la membrane basale vont moduler ce comportement. Le métabolisme des

cellules vasculaires est modifié et leur migration, leur adhésion ou leur croissance sont affectées. Il

a notamment été montré que la glycation de la matrice rétinienne diminuait l’adhésion et la

prolifération des péricytes alors qu’elle augmentait la prolifération des cellules endothéliales

pouvant ainsi favoriser l’angiogénèse caractéristique des stades tardifs de la rétinopathie diabétique

(Beltramo E. et al., 2002; Kalfa T.A. et al., 1995). L’épaississement de la membrane basale peut

également perturber les contacts importants qui existent entre les cellules, par exemple entre

cellules endothéliales et péricytes. Par ailleurs, Makino at al. ont suggéré que la survie et la mort

des cellules mésangiales pouvaient être régulées par la matrice extracellulaire via les intégrines

(Makino H. et al., 2000).

• Les membranes basales déterminent en partie la perméabilité vasculaire. L’épaississement et

les modifications de composition de la membrane basale glomérulaire par exemple se traduisent par

une diminution des charges négatives et ainsi une perte de sélectivité de la filtration. De plus, il a

été montré que la glycation des protéines de la membrane basale la rend plus poreuse aux

macromolécules (Boyd-White J. et al., 1996). Combinées à une hypertension, ces modifications de

la membrane basale conduisent notamment à une fuite de protéines plasmatiques vers l’espace

extra-vasculaire : passage d’albumine dans l’urine (microalbuminurie) ou d’exsudats dans la

rétine.

33

• Au niveau rénal, dans les phases précoces du diabète, l'augmentation de production de la

membrane basale cause un élargissement du glomérule et une augmentation de la surface de

filtration. Au fur et à mesure que la néphropathie diabétique évolue, le mesangium empiète peu à

peu sur la membrane basale glomérulaire, diminuant ainsi la surface de filtration. Plus le volume de

glomérule occupé par le mesangium augmente, plus la surface de filtration capillaire diminue.

Associée à une ischémie secondaire à l’occlusion des artérioles afférentes, l’expansion mésangiale

aboutit à l’occlusion de la lumière capillaire et diminue progressivement le taux de filtration

glomérulaire. Cette expansion du mesangium conduit à terme à la sclérose globale du glomérule

et à la perte de la fonction rénale. L’épaississement de la membrane basale au niveau du tubule

participe à la fibrose tubulo-intersticielle qui contribue également à la perte de la fonction rénale.

3.2.Altérations cellulaires

L’environnement diabétique affecte fortement le métabolisme des cellules microvasculaires, et ce

en fonction du type cellulaire considéré. Leur croissance est généralement perturbée et leur survie

peut être mise en jeu. Le fonctionnement des microvaisseaux est alors sévèrement dégradé par les

bouleversements de leur structure cellulaire.

3.2.1 Cellules microvasculaires rétiniennes

(a) Les péricytes

La perte des péricytes est, avec l’épaississement de la membrane basale, une des premières

manifestations histologiques de la rétinopathie diabétique. La disparition précoce des péricytes

abaisse le ratio péricytes/cellules endothéliales de 1 pour 1 à 1 pour 10 après plusieurs années de

diabète mal contrôlé. Ce phénomène est important car il a été montré qu’en conditions normales,

plus ce ratio est fort et plus le turnover cellulaire est lent (Kohner E.M. et al., 1994).

Plusieurs travaux suggèrent que les péricytes disparaissent par un phénomène d’apoptose. La

présence de péricytes apoptotiques a en effet été mise en évidence dans des rétines de patients

diabétiques (Mizutani M. et al., 1996). Romeo et al. ont montré que le diabète in situ et de fortes

concentrations de glucose in vitro induisaient l’apoptose des péricytes en activant NF-κB (Romeo

G. et al., 2002). L'apoptose des péricytes rétiniens a également été décrite en réponse aux AGE

(Denis U. et al., 2002). De plus, une surexpression des protéines Bax, pro-apoptotique (Podesta F.

et al., 2000), et caspase-3, protéase impliquée dans l’apoptose (Li W. et al., 1999), a été mesurée

dans des péricytes de diabétiques. D’autre part, des auto-anticorps dirigés contre les péricytes ont

été trouvés chez des patients diabétiques, mettant ainsi en cause des phénomènes immunologiques

dans la disparition de ces cellules (Attawia M.A. et al., 1999; Nayak R.C. et al., 2003).

Les péricytes jouant un rôle majeur dans la structure et dans la fonction des microvaisseaux, leur

34

disparition va largement participer aux altérations caractéristiques de la rétinopathie diabétique. La

perte des péricytes va tout d’abord fragiliser l’architecture de la paroi capillaire et favoriser la

dilatation des capillaires. De plus, en l’absence de l’activité contractile exercée par les péricytes,

le tonus vasculaire diminue et le débit sanguin augmente consécutivement. Les forces de

cisaillement générées par l’augmentation du débit sanguin fragilisent d’autant plus l’endothélium

qui devient plus perméable à différents constituants plasmatiques et permet la formation de dépôts

extravasculaires, ainsi que l’apparition de microanévrismes et d’hémorragies, caractéristiques de

la rétinopathie diabétique. La perte des péricytes précède la dégénération des microvaisseaux et la

protection qu’ils exercent sur les microvaisseaux rétiniens a plusieurs fois été suggérée. Hammes et

al. ont par exemple rapporté qu’une diminution du nombre de péricytes chez des souris PDGF+/-

conduisait à une augmentation des capillaires acellulaires par perte des cellules endothéliales après

induction du diabète (Hammes H.P. et al., 2002). D’autre part, ils ont rapporté que cette déficience

en péricytes induit une augmentation du nombre de microvaisseaux nouvellement formés en

réponse à une hypoxie suggérant l’implication des péricytes dans la phase proliférative de la

rétinopathie diabétique. La perte des péricytes favorise également la prolifération des cellules

endothéliales et le processus de néovascularisation, formation de microvaisseaux exempts de

péricytes plus fragiles et sujets aux hémorragies. Cette différence d’effet des péricytes sur

l’endothélium pourrait être liée au taux du facteur angiogénique VEGF, plutôt faible dans les stades

précoces et élevé dans la phase proliférative. Enge et al. ont reproduit des altérations

caractéristiques du diabète au niveau de microvaisseaux rétiniens de souris déficientes en péricytes

par ablation du PDGF présentant ainsi la perte des péricytes comme un événement pathogène causal

dans la rétinopathie diabétique (Enge M. et al., 2002) .

(b) Les cellules endothéliales

Les péricytes exerçant un rôle régulateur sur les cellules endothéliales, leur disparition affecte

sérieusement le métabolisme et la croissance de ces dernières. La perte de contact avec les péricytes

semble prédisposer à une prolifération endothéliale. Généralement, les cellules endothéliales

soumises à un environnement diabétique présentent en effet une multiplication accélérée conduisant

à la formation de nouveaux microvaisseaux. L’hypoxie consécutive aux altérations de la

rétinopathie diabétique est le principal facteur causant l’angiogénèse. Nomura et al. ont rapporté

qu’une augmentation de l’expression du VEGF, facteur angiogénique, par les péricytes et les

cellules endothéliales elle-mêmes pourrait être responsable de l’augmentation de prolifération des

cellules endothéliales en réponse à l’hypoxie (Nomura M. et al., 1995). De nombreux autres

facteurs de croissance ont été impliqués dans les phénomènes d’angiogénèse, notamment FGF,

TGFβ ou IGF-1 (Forrester J.V. et al., 1997). Cependant, certains microvaisseaux voient leur

nombre de cellules endothéliales diminuer, ce qui conduit à la formation de capillaires acellulaires

35

ou "fantômes". De plus, la morphologie et la fonction des cellules endothéliales sont modifiées au

cours de la rétinopathie diabétique. Les jonctions cellulaires, normalement serrées, deviennent

d’adhérence intermédiaire suite à une baisse des taux d’une protéine majeure dans ces structures,

l’occludine.

Ces altérations cellulaires affectent l'intégrité des microvaisseaux et ont des conséquences

fonctionnelles graves. La prolifération excessive des cellules endothéliales peut localement oblitérer

les capillaires et favoriser l’apparition d’ischémies. Les capillaires acellulaires sont eux-aussi

associés à des zones d’hypoxie. Combinée à la disparition des péricytes, la dégradation des contacts

intercellulaires au niveau de l'endothélium contribue à la rupture de la barrière hémato-

rétinienne et à de petites hémorragies ou des fuites de macromolécules dans l’espace

extravasculaire. Les microvaisseaux nouvellement formés sont plus fragiles et donc sujets à ces

évènements.

3.2.2 Cellules glomérulaires

(a) Les cellules mésangiales

Des études sur des modèles d'animaux diabétiques ainsi que des expériences de culture cellulaire en

conditions hyperglycémiques, ont révélé une réponse biphasique des cellules mésangiales à

l'environnement diabétique (Wolf G., 2000) (Figure 9). Dans un premier temps, les cellules suivent

une prolifération limitée, en sortant d'un état de quasi-quiescence pour entrer dans le cycle

cellulaire et effectuer 1 à 2 mitoses. Elles sont ensuite rapidement arrêtées en phase G1 du cycle

cellulaire puis s’hypertrophient. Les cellules mésangiales augmentent leur synthèse protéique en

entrant en phase G1 mais ne se divisent pas. Cet arrêt du cycle cellulaire apparaît comme un des

mécanismes responsables de l'hypertrophie des cellules mésangiales. De plus, il semble qu’une

réduction de l’activité des protéases intracellulaires lors de l’état diabétique contribue également à

l’accumulation de protéines et donc à l’hypertrophie cellulaire.

36

cellule mésangiale normale

Prolifération initiale

Hypertrophie + synthèse accrue de

protéines matricielles

Néphropathie diabétique

DIABETE

cellule mésangiale normale

Prolifération initiale

Hypertrophie + synthèse accrue de

protéines matricielles

Néphropathie diabétique

DIABETE

Figure 9: comportement biphasique des cellules mésangiales rénales au cours de la néphropathie diabétique

(d'après Wolf G., 2000)

L'induction des protéines p21cip1 et p27kip1, inhibitrices des complexes cycline/kinase cycline-

dependante (CDKI), complexes nécessaires à l'accomplissement du cycle cellulaire, semble

primordiale dans ce blocage. Une augmentation de l’expression de p21Cip1 ou p27Kip1 a d’ailleurs été

montrée aussi bien in vitro dans des cellules mésangiales soumises à de fortes concentrations de

glucose (Kuan C.J. et al., 1998) qu’in vivo dans les glomérules de souris db/db (Wolf G. et al.,

1998) ou de rats STZ (Kuan C.J. et al., 1998). Les CDKI p21Cip1 et p27Kip1 semblent également être

des régulateurs de l'hypertrophie mésangiale. Wolf et al. ont par exemple montré que des cellules

mésangiales déficientes en p27Kip1 ne s’hypertrophient pas en réponse au glucose contrairement aux

cellules natives (Wolf G., 2000). De plus, Shankland et al. ont rapporté que des souris diabétiques

dont le gène codant pour p21Cip1 a été invalidé ne développent pas d’hypertrophie glomérulaire à la

différence des souris sauvages (al Douahji M. et al., 1999).

Là encore, différents facteurs de croissance sont en cause. L’augmentation de l’expression de

nombreux facteurs de croissance a été montrée à la fois in vitro et in vivo en conditions diabétiques.

Il paraît clair que ces facteurs de croissance, en particulier le TGFβ mais aussi le PDGF, l’HGF,

l’IGF-I, l’angiotensine II ou l’endothéline-1 sont des médiateurs de l’hypertrophie rénale et de

l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (Wolf G. et al., 1999). Le TGFβ est connu

pour médier l’hypertrophie des cellules mésangiales induite par de fortes concentrations de glucose.

De plus, il semble que ce facteur de croissance induit par l’hyperglycémie, les AGE ou

l’angiotensine II, stimule l’expression des CDKI p21Cip1 et p27Kip1 pour conduire à l’arrêt de

prolifération et à l’hypertrophie cellulaire (Wolf G., 2000). Il a également été montré qu’une forte

concentration de glucose inhibe la prolifération de cellules mésangiales via une augmentation de

37

l’expression du TGFβ (Kolm-Litty V. et al., 1998; Wolf G. et al., 1992). Le PDGF pourrait quant à

lui stimuler la prolifération précoce des cellules mésangiales (Wolf G. et al., 1999). Ces mêmes

facteurs peuvent également stimuler la synthèse de matrice extracellulaire et la phase d'hypertrophie

des cellules mésangiales est associée à une augmentation de la synthèse et du dépôt de protéines de

la matrice extracellulaire, conduisant à l'expansion du mesangium. Cette expansion mésangiale a

des conséquences fonctionnelles très importantes, comme il a déjà été décrit, liée à l’albuminurie,

l’hypertension et la diminution du taux de filtration glomérulaire. Les phénomènes d'apoptose

pourraient contribuer aux anomalies tardives de la néphropathie diabétique. Bien que l'apoptose des

cellules glomérulaires ne soit pas connue comme un caractère de la maladie, une augmentation de

l'apoptose des cellules mésangiales a été montrée. Elle pourrait constituer un mécanisme de

réparation visant à normaliser le nombre de cellules mésangiales (Griffin S.V. et al., 2003). Dans

les stades finaux de la néphropathie diabétique, le glomérule est complètement sclérosé et les

cellules mésangiales disparaissent.

(b) Les podocytes

L’expansion mésangiale et l’épaississement de la membrane basale glomérulaire ont très souvent

été associés à la dysfonction rénale. Plus récemment, les altérations des podocytes ont été

considérées comme contribuant à la pathogénèse de la néphropathie diabétique. Des études ont

montré une diminution du nombre ou de la densité de podocytes chez des diabétiques de type I

(Bjorn S.F. et al., 1995; Steffes M.W. et al., 2001) ou de type II (Dalla V.M. et al., 2003;

Pagtalunan M.E. et al., 1997). Des changements structuraux tels une hypertrophie, un

élargissement ou une perte des pieds des podocytes ont également été décrits (Obineche E.N. et

al., 2001; Pagtalunan M.E. et al., 1997). Il est probable que le CDKI p27Kip1 (Bjorn S.F. et al., 1995;

Hoshi S. et al., 2002) et le TGFβ (Bjorn S.F. et al., 1995; Nicholas S.B., 2003) soient impliqués

dans l’atteinte des podocytes.

Les podocytes font partie intégrante de la barrière de filtration glomérulaire et leur altération est en

partie responsable de la microalbuminurie puis de la protéinurie. La perte des podocytes met à nu

certaines zones de la membrane et favorise la sclérose du glomérule.

(c) Cellules épithéliales tubulaires

Les cellules épithéliales tubulaires subissent également une hypertrophie importante. Associée à

un épaississement de la membrane basale tubulaire, elle est largement responsable de

l'hypertrophie rénale observée durant la néphropathie diabétique (Wolf G. et al., 1999). Les

phénomènes d’hypertrophie qui surviennent dans le glomérule ou le tubule affectent très fortement

la fonction rénale en précédant toujours la sclérose du glomérule et la fibrose tubulointersticielle.

Un phénomène de transdifférenciation des cellules épithéliales tubulaires en myofibroblastes

38

s’opère également au cours de la néphropathie diabétique et semble important dans la fibrose

tubulointersticielle. Les cellules épithéliales perdent leur morphologie et forment des fibres de

stress. Les adhésions cellulaires sont perturbées et la migration et l’invasion des cellules sont

augmentées. Le TGFβ, les produits avancés de glycation et l’angiotensine II ont été décrits pour

induire cette différenciation (Lan H.Y., 2003).

(d) Cellules endothéliales

Les cellules endothéliales glomérulaires sont quiescentes mais conservent la capacité de proliférer

en fonction de l'équilibre entre facteurs pro-angiogéniques comme le VEGF facteurs et anti-

angiogéniques. Comme dans la rétine, la réponse aux lésions pourrait conduire à la formation de

nouveaux microvaisseaux ou à la perte de la microvasculature contribuant à la sclérose du

glomérule et à la perte de la fonction rénale (Griffin S.V. et al., 2003). Des modifications de forme

ou une diminution de la relaxation ont également été rapportées, pouvant être en cause dans la

microalbuminurie (Trevisan R. et al., 1997).

3.3.Modifications des paramètres sanguins

Les paramètres sanguins sont largement modifiés au cours du diabète. Les modifications

hémodynamiques consistent en une augmentation du flux et de la pression sanguine notamment

à cause de la perte des péricytes rétiniens et des podocytes qui assurent en partie le tonus des

microvaisseaux. Des modifications rhéologiques interviennent également: augmentation de la

viscosité sanguine, diminution de la déformabilité des globules rouges et blancs et augmentation

des capacités d’adhésion des leucocytes à l’endothélium. Cette adhésion des leucocytes, activant un

processus inflammatoire, est favorisée par une augmentation des taux de molécules d’adhésion

comme ICAM-1 à la surface de l’endothélium. Enfin, il existe des troubles importants de

l’hémostase avec une diminution de l’activité fibrinolytique et une hyperaggrégabilité

plaquettaire. L’ensemble de ces paramètres contribue à endommager l’endothélium.

L’augmentation du débit sanguin favorise l’hyperfiltration et le profil thrombotique du sang

contribue à l’occlusion des capillaires.

Ces modifications hémodynamiques sont à la base d’une des hypothèses proposées pour expliquer

la mise en place des complications microvasculaires.

3.4.Modifications des parois capillaires

Dans les yeux ou les reins de modèles d’animaux diabétiques, une augmentation de la

perméabilité vasculaire à l’albumine a été décrite après induction du diabète (Pugliese G. et al.,

1989). Cliniquement, les défauts de perméabilité vasculaire se manifestent par la fuite de

fluoresceine des capillaires rétiniens lors d’angiographie et par le passage d’albumine des

39

capillaires glomérulaires retrouvée dans l’urine. Les altérations des membranes basales, des cellules

de la paroi vasculaire ainsi que des paramètres sanguins agissent de concert pour perturber la

barrière hémato-rétinienne et la barrière de filtration glomérulaire.

• L’épaississement et les modifications de composition des membranes basales, notamment la

diminution des charges négatives ou la glycation, conduisent à la perte de sélectivité des

membranes qui deviennent poreuses à des substances dont elles bloquent habituellement le passage.

• La disparition des éléments de soutien que sont les péricytes rétiniens et les podocytes au cours

du diabète fragilise la paroi capillaire. La perte de contact entre les péricytes et les cellules

endothéliales, dont les jonctions serrées se désorganisent, perturbe l’étanchéité de l’endothélium.

• L’augmentation du débit et la pression sanguine qui survient au niveau du rein et de la rétine en

conditions diabétiques accentue les forces de cisaillement qui s’exercent sur l’endothélium, ce qui

favorise la vasodilatation, l’augmentation de la pression transglomérulaire et l’hyperfiltration au

travers de la paroi vasculaire.

• La perméabilité vasculaire est également due à la production de facteur spécifique comme le

VEGF ou VPF (vascular permeability factor), produits par les cellules endothéliales ou les

macrophages et qui se fixe sur des récepteurs endothéliaux (Forrester J.V. et al., 1997).

Tous ces éléments conduisent à une augmentation de la perméabilité vasculaire qui favorise la

progression des microcomplications. Au niveau rénal, elle engendre une microalbuminurie puis un

protéinurie et une perte de la fonction rénale. Au niveau rétinien, elle favorise les fuites de

macromolécules vers l’espace extravasculaire et l’apparition d’œdème, ainsi que le dépôt de

molécules circulantes, notamment des lipoprotéines, dans la paroi vasculaire et la membrane basale

où viennent alors s’accumuler les macrophages.

Il apparaît que la majorité des altérations structurales et fonctionnelles causées par l'environnement

diabétique touche de manière similaire les microvaisseaux rétiniens et glomérulaires et sont donc

communes à la rétinopathie et à la néphropathie diabétiques, deux microcomplications qui évoluent

en parallèle chez les patients diabétiques. Cependant, il existe des spécificités tissulaires dans les

réponses au stress hyperglycémique : le risque occulaire est un risque de rupture vasculaire et

d'hémorragie alors que le risque rénal consiste en l'évolution vers la sclérose glomérulaire.

III. LES MECANISMES

L'hyperglycémie est aujourd'hui connue comme la principale cause des complications

microvasculaires du diabète. Cependant, les mécanismes de la toxicité du glucose ne sont pas

40

encore clairement déterminés. Le glucose et ses métabolites étant utilisés par de nombreuses voies

dans la cellule, les effets néfastes de l'hyperglycémie reposent sans nul doute sur de multiples

mécanismes. Plusieurs hypothèses ont été formulées pour expliquer les altérations microvasculaires

du diabète. Elles interviennent probablement de concours dans la genèse de la maladie. La première

hypothèse est hémodynamique et concerne la physiologie de la microcirculation et du flux sanguin.

Cinq hypothèses biochimiques ont par ailleurs été proposées concernant des modifications aiguës,

répétées mais réversibles (la voie des polyols, l'activation de la PKC et la voie de l'hexosamine) ou

des changements cumulatifs et irréversibles (la glycosylation non enzymatique et l'apparition d'un

stress oxydant).

1. L'HYPOTHESE HEMODYNAMIQUE Les facteurs hémodynamiques sont largement modifiés au cours du diabète et l'hyperglycémie

conduirait à la perte de la régulation du tonus vasculaire caractérisée par une vasodilatation

chronique des microvaisseaux ainsi que par une augmentation consécutive de la pression et du débit

sanguin microvasculaires (Zatz R. et al., 1986a). L'hypothèse hémodynamique présente cette

augmentation de la pression sanguine comme une cause primaire des complications

microangiopathiques. Le stress hémodynamique (action mécanique, forces de cisaillement)

endommagerait l'endothélium et provoquerait une réponse adaptative de la paroi vasculaire

consistant en un épaississement de la membrane basale. Celui-ci, associé à l'hypertension, augmente

la perméabilité de la paroi vasculaire et induit une hyperfiltration. Le stress hémodynamique peut

également conduire à une prolifération accrue des cellules, notamment mésangiales et endothéliales

qui, associée à l'épaississement de membrane basale peut favoriser l'obstruction des

microvaisseaux. L'ensemble de ces modifications altère fortement la fonction microvasculaire et les

perturbations hémodynamiques ont été mises en cause dans le développement de la rétinopathie

(Kohner E.M. et al., 1995) comme de la néphropathie (Trevisan R. et al., 1997; Zatz R. et al.,

1986b) diabétiques.

2. LA VOIE DES POLYOLS L'hyperglycémie peut augmenter la métabolisation du glucose excédentaire par une voie alternative

à la glycolyse, saturée, la voie des polyols. Celle-ci fait intervenir successivement deux enzymes :

l'aldose réductase et la sorbitol déshydrogénase. La première, activée seulement en présence de

fortes concentrations de glucose du fait de sa faible affinité pour ce substrat, réduit le glucose en

sorbitol en utilisant le NADPH comme donneur d'hydrogène. La seconde enzyme oxyde le sorbitol

41

en fructose en utilisant le NAD+ comme cofacteur. L'activation de cette voie conduit à une

accumulation intracellulaire de sorbitol et de fructose ainsi qu'à une modification des rapports

NADPH/NADP+ et NADH+/NAD+ qui perturbent le fonctionnement cellulaire de plusieurs

manières (Sheetz M.J. et al., 2002).

Le sorbitol formé se dégrade lentement et diffuse difficilement à travers les membranes. Il

s'accumule donc et peut altérer les cellules de certains tissus via un stress osmotique. De plus, les

concentrations importantes en glucose et sorbitol pourraient entrer en compétition pour la captation

d'autres osmolytes comme par exemple le myo-inositol. La déplétion intracellulaire en myo-inositol

entraînerait une diminution de la synthèse des phosphoinositides, de la production de DAG et

consécutivement de l'activation de la PKC ou de l'activité de la pompe Na+/K+ ATPase. Par ailleurs,

l'altération du potentiel redox semble jouer un rôle important dans les effets néfastes de l'activation

de la voie des polyols. La formation du sorbitol s'accompagne en effet d'une baisse des ressources

en NADPH, au détriment d'autres réactions nécessitant également ce cofacteur. La glutathion

réductase par exemple, nécessite des niveaux élevés de NADPH pour régénérer du glutathion

réduit. La baisse de son activité suite à une déplétion en NADPH entrave le cycle redox du

glutathion et contribue ainsi à générer un stress oxydant. La déplétion en NADPH peut également

interférer avec la formation de NO par la NO synthase, qui utilise également ce cofacteur.

L'utilisation d'inhibiteurs de l'aldose réductase ont permis expérimentalement de prévenir les

altérations de la rétinopathie (Kador P.F. et al., 1990) et de la néphropathie (Mauer S.M. et al.,

1989) diabétiques.

3. L'ACTIVATION DE LA PKC L'activation de la PKC est un second mécanisme proposé pour expliquer le développement des

complications microvasculaires du diabète. Une augmentation des taux de glucose conduit en effet

à une augmentation de la glycolyse qui stimule la synthèse de novo de diacylglycérol (DAG) à

partir du glyceraldéhyde-3-P qu'elle produit. Cette élévation des taux de DAG entraîne alors une

activation de la PKC. Par ailleurs, l'activation de la PKC peut aussi être consécutive au stress

oxydant ou à l'interaction des AGE avec RAGE (cf partie suivante). Les protéines kinases C sont

des molécules très importantes de la signalisation intracellulaire qui peuvent réguler diverses

fonctions vasculaires comme la perméabilité, la contractibilité des vaisseaux ou le flux sanguin. La

PKC peut être impliquée dans l'induction de facteurs de croissance ou affecter des voies de

signalisation comme les MAP kinases ou NF-κB. Une activation de certaines isoformes de PKC a

été décrite dans la rétine ou les glomérules de rats diabétiques et plusieurs travaux ont rapporté que

l'utilisation d'inhibiteurs de PKC permet de prévenir des dysfonctionnements de la rétinopathie et de

42

la néphropathie diabétiques comme l'hyperperméabilité ou l'expansion mésangiale (Sheetz M.J. et

al., 2002).

4. LA GLYCOSYLATION NON ENZYMATIQUE La formation des produits avancés de glycation ou AGE (Advanced Glycation End products) figure

parmi les modifications irréversibles causées par l'hyperglycémie. La présence des AGE est

étroitement reliée à l'hyperglycémie et leur accumulation a été montrée au cours du diabète. De

nombreuses études ont permis de mettre en cause les AGE dans le développement des

complications microangiopathiques du diabète.

4.1.Formation des AGE

Les sucres réducteurs, comme le glucose, peuvent réagir, de façon covalente et non

enzymatique, avec les groupements amines des protéines, lipides ou acides nucléiques par une

série de réactions regroupées sous le terme de glycosylation non enzymatique ou glycation. Ce

processus est également appelé réaction de Maillard, du nom de celui qui, début 1900, a découvert

que les acides aminés chauffés en présence de sucres réducteurs réagissaient pour former une

couleur caractéristique jaune-brun. Durant les premières étapes de la réaction, le groupement

aldéhyde d'un sucre réducteur, sous sa forme linéaire, réagit avec le groupement amine de certains

acides aminés, phospholipides ou molécules d'ADN pour former une base de Schiff (Figure 10).

Cette base de Schiff, ou produit de glycation précoce, se réarrange ensuite pour se stabiliser en

produit d'Amadori. Ces premières étapes de la glycation sont rapides et réversibles. La formation de

ces produits intermédiaires peu stables dépend de la concentration en substrats, notamment en sucre

réducteur, et est donc augmentée au cours du diabète. Notons que le glucose a un taux de glycation

relativement lent, au contraire d'autres sucres réducteurs intracellulaires comme le glucose 6-P ou le

fructose. La formation des AGE dépend aussi du temps de contact entre les substrats.

L'hémoglobine glyquée est d'ailleurs un produit d'Amadori utilisé chez le diabétique comme

indicateur de la glycémie des 6 à 12 semaines précédentes. Les produits de glycation intermédiaires

que sont les produits d'Amadori conduisent ensuite aux produits avancés de glycation par une série

de réarrangements. Ils peuvent subir une fragmentation oxydative pour former des produits dits de

glycoxydation comme la carboxyméthyllysine (CML) ou la pentosidine, AGE parmi les mieux

caractérisés. Une fragmentation non oxydative peut également avoir lieu et conduire à la formation

de produits intermédiaires de réaction, les α-dicarbonyles (ou α-oxoaldéhydes) comme le 3-

désoxyglucosone ou les glyoxal et méthylglyoxal. Ces produits, hautement réactifs, vont enfin

réagir, de manière irréversible, avec des protéines à durée de vie longue, pour donner naissance à

43

des composés chimiquement stables, les AGE. Les AGE peuvent également se former à partir de la

réaction d'un dicarbonyle avec un produit d'Amadori ou de la condensation de deux produits

d'Amadori, qui réagissent ensuite avec des groupements amine. Certains AGE ainsi obtenus sont

capables de former des ponts intermoléculaires ou "cross-link" dans certaines protéines. D'autres

voies que la réaction de Maillard peuvent donner lieu à la formation de dicarbonyles. La

fragmentation des trioses P, dérivés de la glycolyse, l'oxydation de l'acétone au cours du

métabolisme des corps cétoniques ou la peroxydation lipidique, peuvent par exemple conduire à la

formation de méthylglyoxal. D'autre part, des composés dicarbonyles peuvent également se former

suite à une auto-oxydation de sucres réducteurs comme le glucose. Les AGE dérivés du

méthylglyoxal, carboxyéthyllysine ou MOLD sont d'ailleurs des produits majeurs observés lors du

diabète. (Singh R. et al., 2001).

Figure 10: différentes voies de formation des AGE, d'après Singh et al. (Singh R. et al., 2001)

Ces modifications irréversibles de protéines par les sucres se produisent normalement durant le

processus de vieillissement mais la formation des AGE est largement accélérée au cours du diabète.

Elle se produit généralement dans l'organisme, particulièrement en conditions hyperglycémiques,

44

mais les AGE peuvent également provenir de sources exogènes comme le tabac ou l'alimentation.

Les aliments, en particulier par le chauffage qui induit un brunissement non enzymatique ou

réaction de Maillard, pourraient constituer une source significative d'AGE (Goldberg T. et al.,

2004).

4.2.Caractérisation et mesure

La glycosylation non enzymatique est un processus multiple et complexe, aboutissant à la formation

d'une grande diversité de structure d'AGE, tant par la diversité des dicarbonyles issus du

métabolisme cellulaire, que par celle des acides aminés avec lesquels ils réagissent. De plus, les

protéines glyquées peuvent subir des pontages intra ou intermoléculaires. Ainsi les AGE désignent

un ensemble très hétérogène et complexe de molécules par conséquent assez difficiles à

identifier. Une série de preuves expérimentales permet aujourd'hui de penser que les AGE

s'accumulent au cours du diabète. Cependant, il n'existe pas de méthode ni d'unité de mesure

établies et universelles. Le manque de standard interne rend la mesure d'autant plus difficile et

n’exclu pas un certain biais. Les techniques les plus couramment utilisées pour détecter les AGE

sont l'HPLC, l'ELISA et l'immunohistochimie. La nature chimique des AGE tels qu’ils se forment

naturellement in vivo n’est que partiellement connue. Il existe cependant un nombre croissant

d’AGE structurellement définis qui se sont révélés augmentés dans des tissus diabétiques. C’est le

cas notamment de la CML et de la pentosidine. Des études ont montré que leurs concentrations sont

environ doublées au cours du diabète et corrélées à la sévérité des complications microvasculaires.

Des concentrations augmentées de pyrraline ont également été détectées dans le plasma et la peau

de patients diabétiques (Portero-Otin M. et al., 1995). Le dicarbonyle 3-DG a été mesuré en

concentrations importantes dans le plasma de patients diabétiques particulièrement ceux présentant

un déficit rénal (Singh R. et al., 2001). Enfin, les sels d’imidazolium GOLD et des molécules

"cross-link" ont été identifiés dans la cornée et les érythrocytes de patients diabétiques. L'étude de

modèles d'animaux diabétiques a montré que les concentrations en AGE augmentent dès quelques

semaines après le déclenchement du diabète. Cette augmentation semble être systémique, touchant

à la fois le plasma, les reins, la peau, les tissus vasculaires…(Singh R. et al., 2001).

4.3.Mécanismes d’action et conséquences pathologiques

Les processus de glycation perturbent la conformation des molécules ciblées, principalement les

protéines, mais aussi les lipides ou les acides nucléiques. Ils induisent la formation de ponts intra

et intermoléculaires qui participent certainement largement aux dommages causés par les AGE. La

structure, la fonction ou la reconnaissance des molécules glyquées sont ainsi largement altérées. La

formation des AGE a été mise en cause dans le développement de la macroangiopathie et des

45

complications microangiopathiques du diabète. Par ailleurs, les AGE semblent impliqués dans des

pathologies aussi disparates que l'arthrite rhumatoïde, la maladie d'Alzheimer ou l'atteinte rénale

terminale. Trois mécanismes généraux sont mis en avant pour expliquer les changements

pathologiques causés par la formation des AGE. Premièrement, la formation rapide d'AGE sur

des protéines circulantes ou intracellulaires, dégrade leur fonction. Deuxièmement, la glycation

des protéines de la matrice extracellulaire altère ses propriétés. Enfin, l'interaction entre les

AGE extracellulaires et des récepteurs membranaires spécifiques peut modifier l'expression de

certains gènes.

4.3.1 Glycation des protéines à durée de vie courte : protéines circulantes, intracellulaires

et acides nucléiques

Les protéines circulantes sont fortement touchées par les phénomènes de glycation car elles se

trouvent en contact direct avec le glucose sanguin.

• La glycation s'opère notamment sur l'apoprotéine B et les LDL. La présence de groupements

amine sur certains phospholipides comme phosphatidylserine ou phosphatidyléthanolamine, fournit

des sites appropriés où le glucose peut réagir pour former des AGE. Les taux d'AGE-ApoB sont

environ 4 fois plus importants chez les patients diabétiques. Les AGE augmentent la susceptibilité

des LDL à l'oxydation, c'est pourquoi la glycation est souvent suivie d'une oxydation des LDL

(Bucala R. et al., 1993). La clairance de ces LDL modifiées se trouve ralentie par rapport aux LDL

natives. En diminuant leur élimination et facilitant leur accumulation dans la paroi vasculaire, la

glycation des LDL pourraient donc activement contribuer aux dyslipidémies, courantes chez les

diabétiques et caractérisées par une augmentation du taux de LDL. Les HDL et les VLDL sont

également glyquées au cours du diabète ce qui altère leur fonction de transport du cholestérol et

d'élimination des triglycérides. Ces dyslipidémies prédisposent les diabétiques à l'athérosclérose.

• L'hémoglobine est largement sujette à la glycation. Cette modification augmente sa viscosité à

l'intérieur des globules rouges et exerce des effets négatifs sur le relarguage de l'oxygène.

• Les immunoglobulines, principalement les IgG et les IgM peuvent être glyquées (Danze P.M.

et al., 1987). Leur activité est ainsi modifiée, ce qui participerait à la diminution de la résistance à

l'infection observée chez les diabétiques.

• Les globules rouges peuvent également subir une glycation. Elle a été corrélée à une

diminution de leur fluidité membranaire et de leur déformabilité (Miller J.A. et al., 1980) et à une

adhérence accrue à l’endothélium par l’intermédiaire de récepteurs aux AGE ce qui contribue au

dysfonctionnement de l’endothélium (Wautier J.L. et al., 1994).

Des AGE se forment aussi directement à l'intérieur des cellules. Ce phénomène semble d'ailleurs

être plus rapide qu'en milieu extracellulaire car les sucres intracellulaires augmentés au cours du

46

diabète (glucose 6-P, fructose, métabolisés en dicarbonyles comme le méthylglyoxal) sont

largement plus réactifs que le glucose. bFGF est la principale protéine modifiée par les AGE, dans

les cellules endothéliales notamment. Cette modification réduit d'ailleurs son activité mitogénique

de 70 % (King G.L. et al., 1996). Dans la cellule, la glycation peut également toucher les

nucléotides des acides nucléiques. L'exposition de l'ADN à de fortes concentrations de glucose

cause une glycation des groupes amines des nucléotides. Des cellules endothéliales humaines

exposées à de fortes concentrations de glucose ont révélé une augmentation des cassures dans les

simples brins d'ADN et une diminution du taux de réparation de l'ADN (Lorenzi M. et al., 1986).

4.3.2 Glycation des protéines de la matrice

La durée d'exposition des protéines au glucose étant un des facteurs principaux gouvernant la

formation des AGE, ces derniers se forment et s'accumulent en premier lieu sur des macromolécules

à durée de vie longue. Les protéines de la matrice extracellulaire, par leur faible taux de

renouvellement, sont donc particulièrement touchées par la glycation, d'autant qu'elles se trouvent

en contact direct avec le glucose sanguin.

• Les AGE induisent des changements sur de nombreux composants de la matrice comme le

collagène, la fibronectine, la laminine ou la vitronectine. De plus, ces protéines matricielles

glyquées peuvent former des ponts intermoléculaires avec les molécules matricielles adjacentes. La

glycation de la membrane basale diminue sa solubilité et sa digestion par des enzymes. Des

études in vitro ont montré que le collagène glyqué et lié par des ponts intermoléculaires à d'autres

composants glyqués de la matrice, est plus résistant à la dégradation enzymatique. L'accumulation

d'AGE dans la matrice extracellulaire peut ainsi conduire à l'épaississement de membrane basale

caractéristique du diabète.

• De plus, la formation des AGE perturbe l'auto-assemblage géométrique et ordonné des

protéines de la membrane basale. Par exemple, la glycation de la laminine, de la vitronectine et

du collagène peut sérieusement altérer les charges des molécules, perturber leurs interactions et leur

capacité à s'assembler en agrégats tridimensionnels. Ces perturbations s'accompagnent d'une

augmentation de la taille des pores intermoléculaires, qui peuvent, associées à l'altération des

protéoglycanes anioniques, dégrader la barrière de filtration charge-sélective de la matrice et

provoquer des fuites de protéines circulantes au travers de la paroi vasculaire.

• Les ponts intermoléculaires formés par les AGE peuvent également lier les protéines de la

matrice avec les protéines plasmatiques comme les LDL. L'accumulation de ce matériel sur la paroi

des microvaisseaux pourrait progressivement causer le rétrécissement de la lumière vasculaire et à

terme l'occlusion des microvaisseaux.

• La formation d'AGE au niveau de la matrice extracellulaire interfère également dans les

47

interactions matrice-cellules. Par exemple, il a été montré que l'adhésion et l'étalement des

cellules endothéliales sont altérés par la glycation du collagène IV et de la laminine. De plus, la

glycation des composants de la membrane basale peut également affecter la fonction des cellules

vasculaires en jouant sur la transduction du signal via des récepteurs comme les intégrines (King

G.L. et al., 1996).

La formation d'AGE au niveau de la matrice extracellulaire, notamment la membrane basale,

perturbe donc ses propriétés physico-chimiques et sa fonction ce qui se répercute sur la fonction des

microvaisseaux eux-mêmes, dont l’élasticité ou les propriétés de filtration sont par exemple

altérées.

4.3.3 Interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques

Différentes molécules se liant aux AGE ont été décrites. Il s’agit des récepteurs scavenger, des

récepteurs aux AGE : AGE-R1, AGE-R2 et AGE-R3 et du récepteur RAGE. Certains sont plutôt

avancés comme servant à promouvoir les effets des AGE sur les cellules et les tissus, d’autres

servant à les limiter.

(a) Macrophage "scavenger" récepteurs

Les MRS (macrophage scavenger receptor) de la classe A (type I et II) (Radoff S. et al., 1988) ainsi

que de la classe B (CD36) (Ohgami N. et al., 2001) ont été décrits pour se lier aux AGE. Ils

constitueraient un système de captation et de dégradation des AGE par les macrophages (Araki

N. et al., 1995). Ces récepteurs pourraient être impliqués dans la macroangiopathie diabétique en

internalisant les LDL modifiées par la glycation et en formant des cellules spumeuses s’accumulant

sur la paroi des microvaisseaux (Sakata N. et al., 2001).

(b) Complexe AGE-récepteur

Trois protéines ont été identifiées : une première de 60 kDa (p60) aussi appelée AGE-R1, une

seconde de 90 kDa (p90) ou AGE-R2 et la galectine-3 ou AGE-R3 qui forment le complexe

récepteur aux AGE. Stitt et al. ont montré, dans des cellules endothéliales microvasculaires

rétiniennes, que les différents éléments AGE-R1, -R2 et -R3 de ce complexe sont enrichis au sein

des cavéoles de la membrane plasmique, qui serait le lieu de leur assemblage et de leur interaction

avec les AGE (Figure 11). AGE-R2 ne semble pas lier directement les AGE mais pourrait être

impliqué dans la transduction du signal par un mécanisme de phosphorylation (Stitt A.W. et al.,

2000b). L’expression de ce complexe est positivement régulée par une exposition aux AGE (Stitt

A.W. et al., 1999).

48

Figure 11: le complexe récepteur aux AGE d'après Stitt et al. (Stitt A.W. et al., 2000b)

Le complexe AGE-R est plus souvent décrit commune une voie de détoxification des AGE,

médiant leur captation, leur endocytose et leur dégradation. Ce système semble être prédominant à

la surface des macrophages mais existe également sur d’autres cellules endothéliales, mésangiales

ou neuronales (Vlassara H., 2001). Des études récentes ont montré leur rôle protecteur dans les

complications diabétiques. Tout d’abord, il a été rapporté que les AGE liés à ce complexe sont

internalisés et dirigés vers des endosomes et des structures de type lysosomes (Stitt A.W. et al.,

2000b). Iacobini et al. ont par ailleurs montré que des souris déficientes en galectine 3 (AGE-R3)

développent une glomérulopathie diabétique accélérée (Iacobini C. et al., 2003). Ils ont ensuite

précisé que cette déficience en AGE-R3 est associée à une susceptibilité accrue aux troubles rénaux

induits par une infusion d’AGE (expansion mésangiale, protéinurie et sclérose glomérulaire) ainsi

qu’à une augmentation des taux et de la signalisation des AGE (Iacobini C. et al., 2004). D’autre

part, il a été décrit que des cellules mésangiales murines surexprimant AGE-R1 présentent une

liaison, une captation et une dégradation accrue des AGE. De plus, la voie de signalisation de

RAGE conduisant à une atteinte inflammatoire est inhibée dans ces cellules (Lu C. et al., 2004).

D’ailleurs, alors que l’expression de récepteurs des AGE comme RAGE est augmentée en

conditions diabétiques, l’expression de AGE-R1 est diminuée chez des souris diabétiques avec

atteinte rénale grave (He C.J. et al., 2000) ou des patients souffrant de néphropathie diabétique (He

C.J. et al., 2001), ce qui soutient leur rôle de protection contre les effets des AGE. Cependant, ce

complexe récepteur a aussi été impliqué dans une transduction de signal. Chibber et al. ont par

exemple montré que les effets toxiques exercés par les AGE sur des péricytes rétiniens ou des

49

cellules endothéliales en culture peuvent être reversés par l’utilisation d’anticorps anti-p60 et -p90

(Chibber R. et al., 1997) alors que Doi et al. ont montré que ces mêmes composants du complexe

AGE-R peuvent être impliqués dans l’expression de PDGF (Doi T. et al., 1992).

(c) RAGE

Le récepteur RAGE est le mieux caractérisé des récepteurs aux AGE, membre de la superfamille

des immunoglobulines. Il est de plus en plus considéré comme un médiateur de la signalisation

intracellulaire des AGE et il semble qu’une grande partie des effets délétères des AGE soient

médiés par une interaction avec RAGE. Il est présent sur différents types cellulaires comme les

macrophages, lymphocytes, cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, cellules mésangiales

ou neuronales, péricytes. Son expression est augmentée au cours du diabète (Wautier J.L. et al.,

2001). La présence de RAGE a été décrite dans les cavéoles (Lisanti M.P. et al., 1994).

• La fixation des AGE au RAGE a été décrite pour induire une cascade de signalisation

impliquant le stress oxydant par la production de radicaux libres, l’activation de protéines comme

p21ras et des MAP-kinases (ERK1/ERK2) (Lander H.M. et al., 1997), et de NF-κB qui induit

finalement l’expression de différents gènes (Figure 12). Il a été montré que la NADPH oxydase est

impliquée dans la production de produits dérivés de l’oxygène et la génération d’un stress oxydant

induites par RAGE (Wautier M.P. et al., 2001). Cependant, le mécanisme de couplage de RAGE à

l’induction d’un stress oxydant n’est pas connu. L’implication de p38 MAP-kinase dans cette

cascade de signalisation a également été décrite (Yeh C.H. et al., 2001). Parmi les protéines dont

l’expression est induite par RAGE, des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α ou

l’interleukine-1 (Il-1), ou des molécules d’adhésion comme VCAM, ont jusqu’à présent été

identifiées (Singh R. et al., 2001).

50

RAGE

AGE

Stress oxydant

P21ras/MAP kinase

activation NF-κB

Expression de gènes

- Cytokines pro-inflamatoires(TNF-α, IL-1, IGF-1)

- Vasoconstricteurs (endothéline-1)- Pro-coagulants (thrombomoduline

PAI-1, facteur tissulaire…)

(NADPH oxydase)

- Molécules d’adhésion(VCAM)

RAGE

AGE

RAGE

AGE

Stress oxydant

P21ras/MAP kinase

activation NF-κB

Expression de gènes

- Cytokines pro-inflamatoires(TNF-α, IL-1, IGF-1)

- Vasoconstricteurs (endothéline-1)- Pro-coagulants (thrombomoduline

PAI-1, facteur tissulaire…)

(NADPH oxydase)

- Molécules d’adhésion(VCAM)

Figure 12: signalisation consécutive à la liaison des AGE au récepteur RAGE

Au niveau des macrophages par exemple, l’interaction des AGE avec RAGE conduit suivant cette

cascade de signalisation à la libération de TNF-α et d’Il-1 qui vont agir sur l’endothélium en

causant des dysfonctionnements vasculaires notamment une augmentation de la perméabilité, et sur

les cellules mésangiales, augmentant la synthèse de matrice (Mullarkey C.J. et al., 1994). De plus,

la fixation d’AGE circulants (globules rouges ou LDL glyquées) sur l’endothélium par

l’intermédiaire de RAGE augmente également la perméabilité vasculaire et favorise la dysfonction

endothéliale (Wautier J.L. et al., 1996). L’induction d’un processus inflammatoire consécutif à

l’interaction des AGE avec RAGE, combiné à une accumulation de lipoprotéines, accélère

l’athérosclérose (Singh R. et al., 2001).

L’interaction entre les AGE et le récepteur RAGE a été impliquée dans les altérations de la

microangiopathie diabétique, comme suggéré dans les paragraphes suivants.

• Trois éléments capables d'induire la transcription du gène de RAGE ont été identifiés : les AGE

eux-mêmes, le TNF-α et la 17β-estradiol. Le feed-back positif exercé par les AGE sur l'expression

51

de RAGE peut exacerber les effets délétères des AGE. Récemment, deux nouveaux variants de la

forme membranaire connue ont été découverts : une forme membranaire tronquée du côté N-

terminal et une forme soluble tronquée du côté C-terminal et libérée dans le milieu. Cette dernière

forme (esRAGE pour endogenous secretory RAGE) pourrait exercer un rôle protecteur sur les

cellules en capturant les AGE circulants dans le milieu extracellulaire (Sakurai S. et al., 2003).

• RAGE peut fixer différents ligands, ce qui lui confère un rôle potentiel dans différentes

pathologies : l'amphotérine, protéine impliquée dans la migration cellulaire et l’invasion des cellules

tumorales, le peptide β amyloïde qui s'accumule notamment lors de la maladie d’Alzheimer, et

certains membres de la famille des calgranulines qui présentent des propriétés pro-inflammatoires

(Wendt T. et al., 2003).

4.4.AGE et rétinopathie diabétique

Un grand nombre de travaux menés à la fois in vitro et in vivo ainsi que des études cliniques

indiquent clairement que les AGE jouent un rôle pathogène important dans la rétinopathie

diabétique.

Hammes et al. ont montré que les AGE s’accumulent dans la rétine au cours du diabète

(Hammes H.P. et al., 1999) et une augmentation des concentrations de fructosyl-lysine, de

carboxyméthyl-lysine ainsi que d’AGE dérivés du glyoxal et du méthylglyoxal a été mesurée dans

la rétine de rats STZ (Karachalias N. et al., 2003). Une accumulation d’AGE, fonction de la durée

du diabète, a également été décrite dans les péricytes et les cellules endothéliales de microvaisseaux

rétiniens ainsi que dans la membrane basale, chez des rats STZ (Stitt A.W. et al., 1997). De plus, la

même étude a permis de montrer que les AGE étaient colocalisés avec les récepteurs AGE-R1 et

AGE-R2. L’existence du récepteur RAGE a par ailleurs été décrite dans les cellules

microvasculaires rétiniennes, cellules endothéliales et péricytes (Yamagishi S. et al., 2002a;

Yonekura H. et al., 2003) et une colocalisation entre les AGE et ce récepteur RAGE a été décrite au

niveau de la rétine (Soulis T. et al., 1997). Chez des diabétiques de type 2, un fort taux d’AGE dans

le sérum a été corrélé à la sévérité de la rétinopathie diabétique (Aso Y. et al., 2000).

Le rôle des AGE dans la pathogenèse de la rétinopathie diabétique est renforcé par les résultats

d’études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs d’AGE. L’utilisation d’aminoguanidine, un inhibiteur

de la formation des AGE, a permis de limiter l’accumulation d’AGE au niveau des capillaires et de

prévenir la prolifération des cellules endothéliales et la perte des péricytes ainsi que d’atténuer

l’apparition de capillaires acellulaires ou de microanévrismes chez des rats diabétiques (Hammes

H.P. et al., 1991). Le traitement de rats diabétiques avec l’aminoguanidine a également permis de

protéger les capillaires rétiniens de l’épaississement de membrane basale caractéristique de la

microangiopathie diabétique (Gardiner T.A. et al., 2003). Cependant il est possible que cette

52

protection révèle l’implication d’autres voies car l’aminoguanidine n’est pas un inhibiteur

totalement spécifique des AGE mais présente aussi des propriétés anti-oxydantes (Stitt A.W.,

2003).

Les AGE agissent à différents niveaux pour contribuer aux altérations cellulaires et tissulaires de la

rétinopathie diabétique :

• Ils perturbent la prolifération des cellules microvasculaires rétiniennes. Plusieurs études ont

montré que les AGE sont toxiques pour les péricytes. In vitro, le traitement de péricytes rétiniens

avec des AGE diminue significativement leur prolifération (Chibber R. et al., 1997; Ruggiero-

Lopez D. et al., 1997; Yamagishi S. et al., 1995). Cette action anti-proliférative des AGE pourrait

passer par un effet récepteur car le blocage de l’interaction entre les AGE et leurs récepteurs par

l’utilisation d’anticorps ou d’oligonucléotides anti-sens permet de protéger les péricytes (Chibber R.

et al., 1997; Yamagishi S. et al., 1995). Des travaux antérieurs de notre équipe ont de plus montré

que les AGE induisent l’apoptose de péricytes rétiniens via une cascade de signalisation impliquant

notamment l’induction d’un stress oxydant, une augmentation des taux de DAG et de céramides et

l’activation de caspases (Denis U. et al., 2002). D’autres travaux ont également révélé l’apoptose

des péricytes traités avec d’autres types d’AGE (Chen B.H. et al., 2003; Yamagishi S. et al., 2002a)

ou avec du méthylglyoxal (Kim J. et al., 2004). Les AGE pourraient ainsi être en cause dans la perte

des péricytes qui survient lors de la rétinopathie diabétique. En ce qui concerne les cellules

endothéliales, plusieurs études ont montré que leur prolifération était augmentée en réponse aux

AGE (Chibber R. et al., 1997; Ruggiero-Lopez D. et al., 1997).

• La glycation affecte les protéines de la matrice extracellulaire. Ces modifications ont des

conséquences à deux niveaux. D’une part, les AGE induisent la formation de ponts inter-

moléculaires entre les protéines de la matrice comme le collagène type IV, la laminine ou la

fibronectine, qui deviennent plus résistantes à la dégradation. Les AGE participeraient de cette

manière à l’épaississement de la membrane basale (Wautier J.L. et al., 2001). La glycation

perturbe de plus l’auto-assemblage des protéines de la membrane basale qui perd alors de sa

sélectivité de filtration. D’autre part, la glycation des protéines matricielles modifie le

comportement cellulaire. Il a notamment été montré que l’adhésion et la viabilité des péricytes

sont réduites (Beltramo E. et al., 2002; Beltramo E. et al., 2003; Stitt A.W. et al., 2004) alors que la

prolifération des cellules endothéliales est augmentée sur une matrice glyquée (Kalfa T.A. et al.,

1995).

• Les AGE sont également capables d’induire l’expression de VEGF, facteur angiogénique et

de perméabilité très important dans la rétinopathie diabétique. Une augmentation de l’expression

de l’ARNm du VEGF dans les cellules épithéliales rétiniennes a été décrite chez des souris (Treins

53

C. et al., 2001) et des rats (Stitt A.W. et al., 2000a) infusés avec des AGE. Une augmentation de la

fuite d’albumine à travers les microvaisseaux rétiniens, attribuée à une augmentation de

l’expression de VEGF, a également été mesurée dans des rats infusés avec des AGE (Stitt A.W. et

al., 2000a).

• Il semble enfin que les AGE puissent participer à une réponse pro-inflammatoire. Il a été

récemment montré que l’endothélium microvasculaire rétinien exposé aux AGE in vitro et in vivo,

augmente l’expression de la molécule d’adhésion ICAM-1 et l’adhésion de leucocytes (Stitt A.W.,

2003).

4.5.AGE et néphropathie diabétique

De même que pour la rétinopathie diabétique, un grand nombre de travaux permettent de penser que

les AGE sont en cause dans le développement de la néphropathie diabétique. Une augmentation des

concentrations de fructosyl-lysine, de carboxyméthyl- et carboxyéthyl-lysine ainsi que d’AGE

dérivés du glyoxal et du méthylglyoxal a été mesurée dans les glomérules rénaux de rats STZ

(Karachalias N. et al., 2003). La détection des AGE à l’aide d’anticorps spécifiques a révélé leur

présence dans les zones d’expansion mésangiale et dans la membrane basale glomérulaire dans les

reins de rats diabétiques (Shikata K. et al., 1995). Une augmentation des taux d'AGE et notamment

de carboxyméthyl-lysine, a également été mesurée dans les reins ou les lésions glomérulaires au

niveau de la matrice mésangiale ou de la paroi capillaire, de patients diabétiques (Horie K. et al.,

1997; Niwa T. et al., 1997).

Il a également été rapporté que l’infusion de rats avec des AGE induit une augmentation du volume

glomérulaire, un épaississement de la membrane basale et une expansion mésangiale indiquant une

sclérose glomérulaire, ainsi qu’une perte d’albumine et de protéines dans l’urine. Le co-traitement

de ces animaux avec de l’aminoguanidine, inhibiteur de la formation des AGE, a permis de réduire

ces altérations structurales et fonctionnelles (Vlassara H. et al., 1994). L’utilisation d’un inhibiteur

ALT-946 de la formation de ponts intermoléculaires, plus spécifique, a également permis de réduire

l'albuminurie chez des animaux diabétiques (Forbes J.M. et al., 2001).

Yamamoto et al. ont de plus montré que des souris doublement transgéniques, diabétiques et

surexprimant le récepteur RAGE humain, présentent un tableau d’altération rénale aggravé

(élargissement du rein, hypertrophie glomérulaire, albuminurie, expansion mésangiale, et sclérose

glomérulaire ) comparé aux souris diabétiques sans le transgène RAGE (Yamamoto Y. et al., 2001).

De plus, la blocage de RAGE dans des souris db/db s’est révélé prévenir les altération structurales

et fonctionnelles du rein (Wendt T. et al., 2003). Une co-localisation entre les AGE et ce récepteur

RAGE a d’ailleurs été décrite au niveau du glomérule rénal (Soulis T. et al., 1997) et une

surexpression de RAGE a été montrée dans des reins de patients diabétiques (Wendt T. et al.,

54

2003).

Enfin, chez des diabétiques de type 2, un fort taux d’AGE dans le sérum a été corrélé à la sévérité

de la néphropathie diabétique (Aso Y. et al., 2000).

Différents effets des AGE ont été décrits qui concourent aux altérations cellulaires et tissulaires de

la néphropathie diabétique :

• La glycation des protéines de la matrice extracellulaire, en les rendant moins sensibles à la

dégradation protéolytique notamment par la formation de ponts intermoléculaires, participe à

l’épaississement des membranes basales et à l’expansion du mesangium. Il a d’ailleurs été

montré que la cassure de ces ponts par un agent spécifique, le ALT-711, diminue l’accumulation de

matrice au niveau du rein (Forbes J.M. et al., 2001). De plus, la glycation perturbe l’assemblage des

différents composants protéiques, augmente la taille des pores inter-moléculaires et diminue la

charge négative des protéoglycanes contribuant ainsi à l’augmentation de la perméabilité et à la

perte de sélectivité de la barrière de filtration glomérulaire (Wautier J.L. et al., 2001).

L’utilisation d’inhibiteurs de ponts intermoléculaires permet également de limiter le développement

de l’albuminurie (Forbes J.M. et al., 2003).

• Les AGE contribuent également au développement de la néphropathie diabétique en induisant

l’expression de différentes cytokines pro-inflammatoires et facteurs de croissance. En particulier, le

TGFβ semble être un médiateur important des effets des AGE. Il a par exemple été rapporté que

l’utilisation d’aminoguanidine chez des rats STZ permet de limiter la surexpression du TGFβ et du

PDGF ainsi que de réduire le dépôt de collagène IV dans les membranes (Kelly D.J. et al., 2001).

De plus, Yang et al. ont montré une augmentation des taux d’ARNm du TGFβ, du collagène IV et

de la laminine, ainsi qu’une hypertrophie glomérulaire dans des souris ayant reçu des injections

d’AGE pendant 4 semaines. Ils ont également observé que ces altérations caractéristiques de la

néphropathie diabétique sont réduites par la co-administration d’aminoguanidine (Yang C.W. et al.,

1994). La même équipe a d’ailleurs montré que ces effets pourraient être médiés par le PDGF (Doi

T. et al., 1992). D’autre part, il a été montré que les AGE peuvent induire la production de VEGF et

de molécule d’adhésion des monocytes (MCP-1) par des cellules mésangiales humaines favorisant

ainsi le processus inflammatoire (Yamagishi S. et al., 2002b).

• Un effet direct des AGE sur la prolifération des cellules mésangiales rénales a également été

montré. La culture de cellules mésangiales murines en présence de protéines de sérum glyquées

s’est révélée inhiber la prolifération cellulaire (Ziyadeh F.N. et al., 1993). De plus, Yamagishi et al.

ont montré qu’un traitement avec les AGE est capable d’induire l’apoptose de cellules mésangiales

humaines (Yamagishi S. et al., 2002b).

• D’autre part, Oldfield et al. ont décrit que l’exposition de cellules épithéliales tubulaires aux

55

AGE induit leur différenciation en myofibroblastes suggérant ainsi le rôle des AGE dans la fibrose

tubulo-intersticielle qui survient lors de la néphropathie diabétique. Ils ont de plus montré que cet

effet peut être neutralisé par des anticorps dirigé contre le récepteur RAGE ou le TGFβ suggérant

ainsi une signalisation des AGE via une interaction avec RAGE et l’induction de ce facteur de

croissance, particulièrement important dans la néphropathie diabétique (Oldfield M.D. et al., 2001).

Il faut noter que les reins sont le site principal d’élimination des AGE de la circulation. Lorsque la

fonction rénale est altérée au cours du diabète, la clairance des AGE s’en trouve amoindrie ce qui

favorise l’aggravation des lésions notamment rénales.

5. LA VOIE DES HEXOSAMINES

5.1.Définition

En 1991, l’équipe de Marshall découvre dans les adipocytes une nouvelle voie métabolique médiant

la désensibilisation induite par le glucose du système de transport du glucose insulino-dépendant

(Marshall S. et al., 1991). Cette voie, qui nécessite la présence de glucose, d’insuline et de

glutamine et qui met en jeu une glutamine amidotransférase est la voie des hexosamines :

Une fois entré dans les cellules via le système de transport, le glucose est rapidement phosphorylé

en glucose-6-P et converti en fructose-6-P. Alors que la majorité de ce fructose-6-P est catabolisé

par la glycolyse, une partie est convertie en glucosamine-6-P par la glutamine:fructose-6-P

amidotransférase (GFAT), la première enzyme limitante de la voie de biosynthèse des

hexosamines. La glucosamine-6-P est ensuite rapidement transformée puis activée en UDP-N-

acétylglucosamine (UDP-GlcNAc), précurseur d’autres sucres aminés, produits de la voie des

hexosamines, comme le CMP-NAc acide neuraminique. Ces produits sont ensuite utilisés pour la

biosynthèse de glycoconjugués : glycoprotéines et glycolipides comme les gangliosides, ou

protéoglycanes (Marshall S., 2002) (Figure 13).

56

protéoglycanesGlycolipides

(gangliosides)glycoprotéinesprotéoglycanes

Glycolipides

(gangliosides)glycoprotéines

Figure 13: voie de biosynthèse des hexosamines, d'après Schleicher et al. (Schleicher E. D. et al., 2000)

En conditions normales, la grande majorité du glucose capté par les cellules est métabolisé par la

glycolyse et seulement 2 à 5 % entrent dans la voie de biosynthèse des hexosamines. La quantité de

glucose qui est effectivement orienté vers cette voie est régulée par l’activité de la GFAT. Celle-ci

dépend tout d’abord de la concentration en substrat fructose-6-P et est donc activée en conditions

hyperglycémiques. Du et al. ont d’ailleurs proposé une voie selon laquelle l’hyperglycémie

orienterait le fructose-6-P vers la voie des hexosamines (Figure 14). Ils ont en effet montré, dans

des cellules endothéliales aortiques, que l’hyperglycémie diminue l’activité GAPDH

(glyceraldéhyde-3-phosphate dehydrogénase) via une augmentation de la production de l'anion

superoxyde au niveau de la mitochondrie et augmente parallèlement l’activité de la voie des

hexosamines (Du X.L. et al., 2000).

57

Figure 14: mécanisme proposé pour l’induction de la voie des hexosamines par l’hyperglycémie,

d'après Du et al. (Du X.-L. et al., 2000)

La GFAT est également inhibée selon un rétro-contrôle négatif par son produit UDP-GlcNAc et

activée par phosphorylation dépendante de l’AMPc. Le flux à travers la voie des hexosamines

dépend aussi de la quantité de l’enzyme dans la cellule et de l’expression du gène de la GFAT. Sa

transcription pourrait être régulée par le facteur Sp1, l’EGF, le glucose et la glucosamine elle-

même. Il existerait deux isoformes de la GFAT, 1 et 2 (Schleicher E.D. et al., 2000). L’expression

de la GFAT a été mesurée dans les tissus humains à l’aide d’un anti-sérum spécifique de la protéine

et d’une sonde dirigée contre son ARNm. Des taux d’expression élevé de la protéine et de son

ARNm ont été mesurés dans les adipocytes et le muscle squelettique, sièges de l’insulino-

résistance, ainsi que dans les cellules musculaires lisses de microvaisseaux. Dans le tissu rénal, la

GFAT s’est révélée majoritairement tubulaire en conditions normales alors qu’elle était également

présente dans les cellules glomérulaires épithéliales et mésangiales issues de reins de patients

atteints de néphropathie diabétique. Ceci suggère que l’expression de la GFAT peut être induite par

le diabète dans des tissus cibles des microcomplications (Nerlich A.G. et al., 1998). Notons que la

GFAT a également été détectée dans la rétine (Mazlen R.G. et al., 1970).

5.2.Mécanismes d’action

A partir de l’UDP-GlcNAc généré par la voie des hexosamines, deux voies aux fonctions

différentes se distinguent. La manière dont les cellules régulent ces deux voies et coordonnent

58

l’utilisation du précurseur commun qu’est l’UDP-GlcNAc reste à déterminer.

5.2.1 Apport de précurseurs glycosidiques

L’UDP-GlcNAc issue de la voie des hexosamines peut être convertie en d’autres UDP-N-

acétylhexosamines qui sont les précurseurs glycosidiques aminés de la biosynthèse des

glycoconjugués. Il s’agit notamment de l’UDP-N-acétylgalactosamine, de l’acide CMP-N-

acétylneuraminique (acide sialique) ou de la N-mannosamine. Ces résidus peuvent être transportés

jusqu’au réticulum endoplasmique où ils sont utilisés pour glycosyler des protéines, notamment.

Cette glycosylation est généralement multiple sous forme de chaîne glycosidique. Les

glycoconjugués complexes ainsi formés sont le plus souvent destinés à être insérés au niveau de la

membrane plasmique à la surface des cellules ou bien à être secrétés. Ce mécanisme n’est donc pas

directement considéré comme une voie de signalisation cellulaire.

5.2.2 O-glycosylation simple de protéines

Le résidu UDP-GlcNAc formé par la voie des hexosamines peut être utilisé pour modifier de façon

covalente des protéines selon une liaison O-glycosidique (O-glycosylation) avec des résidus

thréonine et serine. Ce processus, contrairement au précédent, concerne, non pas des protéines de

surface ou secrétées, mais des protéines cytosoliques ou nucléaires. Il consiste en l’addition d’un

résidu monosaccharidique unique et non d’une chaîne oligosaccharidique. C’est un processus

dynamique et réversible qui varie en réponse à des stimuli physiologiques. Marshall et al.

présentent cette voie de signalisation des hexosamines comme un mécanisme gluco-sensible par

lequel le glucose pourrait agir directement sur le fonctionnement cellulaire (Marshall S., 2002).

Le processus dynamique et inductible de O-glycosylation est assuré par les activités régulées

d’enzymes cytosoliques et nucléaires : la O-GlcNAc transférase (OGT) et la O-GlcNAcase. La

première gère l’attachement du résidu O-GlcNAc sur les protéines et est régulée par O-

glycosylation elle-même et par phosphorylation. Son activité est inhibée par l’UDP, résidu de la

réaction de transfert et activée par l’UDP-GlcNAC dont le taux dépend lui-même notamment des

concentrations de glucose. La O-GlcNAcase qui catalyse l’enlèvement du résidu O-GlcNAc est

quant à elle une β-N-acétylglucosaminidase (Wells L. et al., 2001). Il a été montré que la délétion

de l’activité OGT est létale pour des cellules embryonnaires de souris, soulignant ainsi l’importance

de la O-glycosylation (Shafi R. et al., 2000). Cette modification se retrouve d’ailleurs dans toutes

les cellules eucaryotes (Comer F.I. et al., 2000).

La liste des protéines cytosoliques et nucléaires modifiées par O-glycosylation est toujours

croissante (Figure 15). Ces protéines sont généralement très importantes pour le fonctionnement

cellulaire contrôlant l’expression génique, la croissance ou la division cellulaire, les activités

59

enzymatiques ou l’intégrité structurale du cytosquelette. Les nucléoporines, qui gouvernent le

transport de macromolécules vers l’intérieur et l’extérieur du noyau, sont par exemple parmi les

premières protéines O-glycosylées structurellement caractérisées. Le rôle de cette modification

n’est pas encore clairement établi. Au niveau du noyau, l’ARN polymérase II est aussi connue pour

être modifiée par O-glycosylation. Cette modification pourrait induire des changements structuraux

altérant la conformation de l’enzyme et ainsi son interaction avec d’autres composants de la

machinerie de transcription. La O-glycosylation cible également un certain nombre de protéines du

cytosquelette et semble varier au cours du cycle cellulaire (Comer F.I. et al., 2000). Il a par ailleurs

été montré que la O-glycosylation joue un rôle dans le turnover et la transactivation de facteurs de

transcription comme par exemple Sp1. Ce facteur de transcription ubiquiste a été décrit pour être

fortement modifié par O-glycosylation (Jackson S.P. et al., 1988). Yang et al. ont rapporté que la O-

glycosylation de Sp1 inhibe son activité transcriptionnelle (Yang X. et al., 2001). Au contraire, Du

et al. ont montré que l’hyperglycémie induit une augmentation de la O-glycosylation de Sp1,

résultant en une augmentation de son activité promotrice (Du X.L. et al., 2000). De plus, il a été

montré que la O-glycosylation de cette protéine la protège contre la dégradation par le protéasome

(Han I. et al., 1997). La O-glycosylation des facteurs de transcription implique ainsi potentiellement

la voie des hexosamines dans la régulation de l’expression d’un grand nombre de gènes.

(Sp1, c-fos, AP1…)

(Src, c-myc, p53…)

(Tau, βamyloïde, cytokeratine, vinculine,

clathrine…)

(UDP-GlcNActransférase)

(Sp1, c-fos, AP1…)

(Src, c-myc, p53…)

(Tau, βamyloïde, cytokeratine, vinculine,

clathrine…)

(UDP-GlcNActransférase)

Figure 15: différentes protéines O-glycosylées connues dans la cellule d'après Comer et al. (Comer F.I. et al., 2000)

60

La O-glycosylation apparaît comme aussi répandue et dynamique que la phosphorylation et il

semble y avoir une certaine réciprocité entre les deux mécanismes. Griffith et al. ont par exemple

montré que l’inhibition de kinases augmente le taux de protéines O-glycosylées alors que leur

activation le diminue (Griffith L.S. et al., 1999). Sur plusieurs protéines, O-GlcNAc et O-phosphate

occupent les mêmes sites ou bien des sites adjacents et toutes les protéines O-glycosylées décrites

existent également à l’état phosphorylé. Si des exemples d’exclusion mutuelle de ces deux

modifications existent, elles pourraient tout de même se trouver en combinaison sur certaines

protéines et la régulation post-traductionnelle des protéines pourrait bien mettre en jeu une action

concertée de ces deux mécanismes (Comer F.I. et al., 2000).

Après la découverte de la modification par O-glycosylation d’un très grand nombre de protéines il y

a une vingtaine d’année, il est aujourd’hui important et prometteur d’élucider le rôle biologique de

la voie de signalisation des hexosamines dans les différentes cellules et tissus et de découvrir les

liens entre cette voie et certaines pathologies. Quelques éléments de réponse ont déjà été obtenus,

particulièrement en ce qui concerne le diabète.

5.3.Conséquences pathologiques

5.3.1 Insulino-résistance

L’insulino-résistance est le premier contexte pathologique dans lequel la voie des hexosamines a été

mise en cause (Marshall S. et al., 1991). Depuis, un nombre important de résultats a confirmé l’idée

que cette voie joue un rôle dans les mécanismes de l’insulino-résistance. Par exemple, la

surexpression de la GFAT dans le muscle et le tissu adipeux de souris a révélé que ces animaux

développent un hyperinsulinémie et une insulino-résistance (Hebert L.F., Jr. et al., 1996). Les

mêmes résultats ont été obtenus chez des souris surexprimant la GFAT au niveau des cellules β

pancréatiques (Tang J. et al., 2000). Il a également été décrit que le pancréas de rats rendus

diabétiques par l’injection de streptozotocine présente une augmentation des protéines O-

glycosylées associée à une perte des cellules β (Akimoto Y. et al., 2000). Enfin, la surexpression de

la GFAT dans des cellules β pancréatiques a été associée à une détérioration de la fonction de ces

cellules avec un défaut de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (Kaneto H. et al., 2001).

Vosseller et al. ont par ailleurs montré que l’augmentation de la O-glycosylation, par l’utilisation

d’un inhibiteur de O-GlcNAcase dans des adipocytes, cause une insulino-résistance, associée à une

augmentation de la modification par O-glycosylation des protéines impliquées dans la signalisation

de l’insuline comme IRS1 (Vosseller K. et al., 2002). Chen et al. ont également proposé un

mécanisme pour expliquer l’insulino-résistance induite par la voie des hexosamines mettant en jeu

61

la O-glycosylation d’une protéine impliquée dans la translocation dépendante de l’insuline de

GLUT4 (Chen G. et al., 2003).

5.3.2 Néphropathie diabétique

La voie des hexosamines a déjà été mise en cause à plusieurs reprises dans les altérations

caractéristiques de la néphropathie diabétique, et en particulier dans la surproduction de matrice

extracellulaire. Un certain nombre d’observations faites sur des cellules mésangiales permet de

proposer un mécanisme selon lequel la glucosamine induit une augmentation de la production de

protéines matricielles (Figure 16).

• Kolm-Litty et al. ont montré, dans des cellules mésangiales glomérulaires porcines, que la

glucosamine est capable de mimer, de manière plus efficace, les effets d’une forte concentration de

glucose : inhibition de prolifération cellulaire, induction du TGFβ, cytokine pro-sclérotique

importante dans la néphropathie diabétique, et augmentation consécutive de la production de

matrice. De plus, ces effets du glucose se sont révélés inhibés par l’utilisation d’azaserine, un

inhibiteur de GFAT ou d’oligonucléotides anti-sens dirigés contre cette enzyme. Enfin, ils ont

précisé que la glucosamine induit une augmentation du taux d’ARNm du TGFβ ainsi que de la

production de la protéine suggérant une régulation au niveau transcriptionnel (Kolm-Litty V. et al.,

1998). Weigert et al. ont confirmé l’implication de la voie des hexosamines et de la GFAT dans

l’induction du TGFβ en montrant qu’une surexpression de la GFAT dans des cellules mésangiales

induit une augmentation de l’expression du TGFβ et de la fibronectine (Weigert C. et al., 2003). De

plus, Singh et al. ont rapporté que les effets de la glucosamine et du TGFβ sur la surproduction de

protéines matricielles ne sont pas additifs et que l’utilisation d’anticorps dirigés contre le TGFβ

bloque la synthèse de fibronectine induite par la glucosamine (Singh L.P. et al., 2004).

Par ailleurs, plusieurs travaux de Singh et al. ont suggéré que cette augmentation de synthèse de

protéines matricielles par la voie des hexosamines implique les protéines kinases A et C. Ils ont tout

d’abord montré que la glucosamine et le TGFβ augmente la production de laminine et de

fibronectine ainsi que les activités PKC et PKA et que l’utilisation d’inhibiteurs de ces kinases

bloque l’augmentation de production de laminine induite par la glucosamine ou le TGFβ (Singh

L.P. et al., 2000; Singh L.P. et al., 2004). De plus, ils ont décrit que le glucose et la glucosamine

(Singh L.P. et al., 2001), ainsi que le TGFβ (Singh L.P. et al., 2004) augmentent la phosphorylation

et l’activité nucléaire du facteur de transcription CREB (cAMP Responsive Element Binding), qui

pourrait réguler le promoteur du gène de la fibronectine. L’ensemble de ces résultats a conduit

l’équipe à proposer que les effets du TGFβ sur l’augmentation de production de protéines

62

matricielles induits par la voie de l’hexosamine, sont médiés par les protéines kinases A et C,

potentiellement via une activation par phosphorylation de CREB.

PKC/PKA CREB

O-GlcNAc-transcription

factors (Sp1)

(fibronectine…)

PKC/PKA CREB

O-GlcNAc-transcription

factors (Sp1)

(fibronectine…)

Figure 16: mécanisme d’action de la glucosamine proposé pour la surproduction de matrice extracellulaire,

d'après Kolm-Litty et al. (Kolm-Litty V. et al., 1998)

• D’autre part, la voie des hexosamines a été impliquée dans l’augmentation de l’expression de

PAI-1, autre facteur mis en cause dans la pathogenèse de la néphropathie diabétique. Du et al. ont

en effet rapporté que l’utilisation d’asazerine inhibe l’augmentation de l’expression du PAI-1

induite par l’hyperglycémie dans des cellules endothéliales (Du X.L. et al., 2000). Au niveau

mécanistique, ils ont montré que l’hyperglycémie augmente l’activité et la O-glycosylation du

facteur de transcription Sp1 en diminuant sa phosphorylation et mis en cause ce facteur dans

l’augmentation de l’expression du PAI-1. Par ailleurs, la même équipe a ensuite impliqué la PKCβ1

dans ce mécanisme en montrant que son activité est nécessaire à l’activation de Sp1 induite par la

glucosamine (Goldberg H.J. et al., 2002).

63

6. LE STRESS OXYDANT Le stress oxydant est la conséquence d'un déséquilibre entre la production de radicaux libres et leur

destruction par des systèmes de défenses anti-oxydantes. Les radicaux libres peuvent engendrer des

dommages importants sur la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant de nombreuses

cibles : protéines, lipides et acides nucléiques.

La production de radicaux libres est augmentée au cours du diabète. L'hyperglycémie peut induire

un stress oxydant consécutivement à différents mécanismes, précédemment décrits: fragmentation

oxydative des produits d'Amadori et interaction des AGE avec RAGE, auto-oxydation du glucose et

altération du potentiel redox par la voie des polyols. De plus, les capacités anti-oxydantes sont

réduites chez les diabétiques (Ceriello A. et al., 1997).

L'équipe de Brownlee a présenté le stress oxydant comme le facteur inducteur de toutes les

hypothèses biochimiques jusqu'à présent proposées pour expliquer le développement des

complications microvasculaires du diabète (Figure 17). Ils ont effet montré dans des cellules

endothéliales aortiques bovines, que la production d'anion superoxyde par la mitochondrie en

réponse à l'hyperglycémie activait la voie des hexosamines, via une inhibition de la glyceraldéhyde-

3-P deshydrogénase (Du X.L. et al., 2000). De plus, ils ont décrit que la normalisation de la

production de dérivés actifs de l'oxygène par différents agents permettait de prévenir l'activation de

la protéine kinase C, la formation des AGE, l'accumulation de sorbitol et l'activation de NF-κB

induites par l'hyperglycémie (Nishikawa T. et al., 2000). Cet anion superoxyde proviendrait d'une

augmentation du gradient de protons généré par la chaîne respiratoire mitochondriale suite à une

production accrue de cofacteur NADH résultant de l'oxydation du pyruvate par la glycolyse activée.

64

TCA

NADH

e-

Mitochondrie

O2-.

GA3PDHase

AGEMéthylglyoxal

Fructose Sorbitol AR

Pyruvate

Pyruvate

GA3P

Glucose

G3P : glycérol-3-phosphateGA3P : glycéraldéhyde-3-phosphateAR : Aldose RéductaseTCA : cycle des acides tricarboxyliques

PKCG3P DAG

Fructose-6PGFAT

Glucosamine-6P Voie des hexosamines

+

+

+NF-κB

-

TCA

NADH

e-

Mitochondrie

O2-.

GA3PDHase

AGEMéthylglyoxal

Fructose Sorbitol AR

Pyruvate

Pyruvate

GA3P

Glucose

G3P : glycérol-3-phosphateGA3P : glycéraldéhyde-3-phosphateAR : Aldose RéductaseTCA : cycle des acides tricarboxyliques

PKCG3P DAG

Fructose-6PGFAT

Glucosamine-6P Voie des hexosamines

++

++

++NF-κB

--

Figure 17 : le stress oxydant, lien unificateur entre les différents mécanismes biochimiques issus de l'hyperglycémie

65

LES GANGLIOSIDES

I. STRUCTURE ET LOCALISATION

1. STRUCTURE

1.1.Les glycosphingolipides

Les gangliosides appartiennent à une famille hétérogène de lipides appelée glycosphingolipides

(GSL), présents chez tous les eucaryotes, vertébrés et animaux inférieurs, ainsi que minoritairement

dans les plantes, mais rarement dans les bactéries. Les GSL sont des composés amphiphatiques de

la membrane plasmique faisant partie du glycocalix qui la recouvre. Ils sont constitués d'une

structure céramide hydrophobe ancrée dans la bicouche lipidique et d'une chaîne de sucres,

hydrophile, exposée au milieu extracellulaire (Figure 18). Le céramide se compose lui-même

d'un alcool aminé, la base sphingoïde, relié au niveau de son groupement amine à un acide gras

généralement à longue chaîne par une liaison amide. La chaîne de sucres est quant à elle liée par

une liaison glycosidique, au niveau de la fonction alcool primaire du céramide (Figure 18).

Les GSL présentent une énorme hétérogénéité de structure, tant dans la partie céramide que dans la

chaîne glycosidique.

66

Figure 18 : structure d'un glycosphingolipide et position dans la membrane plasmique

• Plus de 60 bases sphingoïdes et 300 chaînes oligosaccharidiques différentes ont été caractérisées

jusqu'à présent, offrant par combinaison des centaines de structures théoriquement possibles. La

base sphingoïde peut varier en longueur, saturation, hydroxylation mais la principale présente chez

les mammifères est la sphingosine (18:1), ou quelquefois ses dérivés comme la sphinganine. L'acide

gras peut également varier en longueur, saturation ou hydroxylation. Chez les mammifères, il est

généralement long (≥C16) et saturé. Les conséquences fonctionnelles de l'hétérogénéité du

céramide sont encore mal connues. Il semble toutefois que la partie lipidique puisse influencer la

localisation et les fonctions des GSL dans la membrane plasmique, probablement par interaction

directe avec le cholestérol, les phospholipides ou les domaines transmembranaires de protéines.

• La chaîne oligosaccharidique peut contenir de un à une dizaine de résidus et comprend des

hexoses (essentiellement du glucose, galactose, fucose), des N-acétylhexosamines (galactosamine,

glucosamine) et de l'acide sialique. Un groupement sulfate peut également y être additionné.

Partie lipidique = ceramide

O

OOH

OH

OOH

OHO

HO

OHO

OH

OHOH

NH

CH3OOH

O

OHN

OH

O

H3C

HO

H3C

Base sphingoïde

Acide gras

Partie oligosaccharidique

membrane plasmique

cytosol

milieu extracellulaire

glycosphingolipide

Partie lipidique = ceramide

O

OOH

OH

OOH

OHO

HO

OHO

OH

OHOH

NH

CH3OOH

O

OHN

OH

O

H3C

HO

H3CO

OOH

OH

OOH

OHO

HO

OHO

OH

OHOH

NH

CH3OOH

O

OHN

OH

O

H3C

HO

H3C

Base sphingoïde

Acide gras

Partie oligosaccharidique

membrane plasmique

cytosol

milieu extracellulaire

glycosphingolipide

membrane plasmique

cytosol

milieu extracellulaire

glycosphingolipide

67

Cependant, malgré un grand nombre de combinaisons possibles, seul un nombre assez restreint de

GSL différents sont effectivement retrouvés dans les organismes. Ils sont regroupés en séries,

définies par la composition et l'enchaînement de la chaîne oligosaccharidique qui fonde la

classification des GSL. On distingue:

- les GSL neutres dont la chaîne oligosaccharidique ne contient que des sucres neutres:

glucosylcéramide, galactosylcéramide, lactosylcéramide, céramide trihexoside et les séries

globo et lacto dont les structures de base sont respectivement GalNAcβ1,3-Galα1,4-Galβ1,4-

Glcβ1,1-Cer et Galβ1,3-GlcNAcβ1,3-Galβ1,4-Glcβ1,1-Cer.

- les sulfato-GSL comprenant notamment le lactosyl-céramide-sulfate qui semblerait d'ailleurs

représenter un facteur de risque potentiel pour le diabète de type I.

- les gangliosides qui contiennent un ou plusieurs acides sialiques chargés négativement dans

leur chaîne glycanniques et dont la structure de base est Galβ1,3-GalNAcβ1,4-Galβ1,4-

Glcβ1,1-Cer.

1.2.Les gangliosides

Les gangliosides sont des GSL dont le céramide est substitué par une chaîne glycannique contenant

de l'acide sialique ou acide neuraminique (Figure 19). Ce résidu est généralement sous la forme

d'acide N-acétylneuraminique (NeuAc) ou N-glycolylneuraminique (NeuGc) mais il existe environ

30 dérivés obtenus par exemple par O-acétylation de ces derniers. L'ensemble des acides

neuraminiques est regroupé sous le nom d'acide sialique.

Ces sialoglycosphingolipides sont dénommés par des abréviations correspondant au nombre de

résidus acides sialiques présents dans la molécule (GM pour monosialoganglioside, GD pour

disialoganglioside, GT pour trisialoganglioside…) et leur ordre de migration en chromatographie

(GM3, GM2, GM1…). Cette classification, appelée nomenclature de Svennerholm, est la plus

couramment utilisée et celle qui sera employée dans ce manuscrit, pour plus de simplicité.

Cependant, une nouvelle nomenclature se fondant sur la connaissance détaillée des séquences

glycanniques a été recommandée par la commission de nomenclature biochimique (IUPAC-IUB,

1977). L'abréviation Cer pour céramide est précédée du préfixe lac ou, si la chaîne est plus

complexe, ose indicé du nombre de résidus glucidiques présents et précédé des lettres Gg pour la

série ganglio. La position de l'acide sialique substitué latéralement est indiquée par un chiffre

romain et l'anomérie de liaison par α ou β. C'est ainsi que le GM3 devient II α-NeuAc-Lac-Cer et le

GM1 II α-NeuAc-GgOse4-Cer.

68

glucosegalactose

galactose N-acétylgalactosamine

acide

N-acétylneuraminique

glucosegalactose

galactose N-acétylgalactosamine

acide

N-acétylneuraminique

Figure 19 : structure d'un ganglioside

2. LOCALISATION

2.1.Localisation tissulaire

Les gangliosides sont largement exprimés dans les tissus des mammifères, selon un profil

spécifique de l'espèce, de l'organe ou du tissu considéré, de la cellule, ainsi que du stade de

développement de l'organe ou de différenciation de la cellule. Ils sont particulièrement abondants

dans les tissus nerveux et le cerveau où ils ont d'ailleurs été découverts dans les années 40 par

Klenk. On les retrouve cependant quasiment dans tous les tissus de l'organisme, principalement

sous forme de GM3 et de GD3, et notamment dans les cellules vasculaires, bien qu'en faible

quantité. Le profil varie selon la localisation des cellules mais le GM3 semble toutefois le

ganglioside prédominant dans les cellules vasculaires jusqu'à maintenant étudiées. Une dizaine de

gangliosides différents de source inconnue ont également été détectés dans le sérum, liés à des

lipoprotéines hépatiques (Senn H.J. et al., 1989).

2.2.Localisation cellulaire

Les gangliosides, et plus généralement les GSL, sont majoritairement présents dans le feuillet

externe de la membrane plasmique bien qu'ils ne constituent qu'une fraction minoritaire (5 %) des

lipides membranaires. De plus en plus d'études tendent à prouver l'existence de microdomaines

membranaires enrichis en GSL et gangliosides. Des observations microscopiques, l'utilisation de

molécules marquées ou encore d'anticorps spécifiques ont permis de montrer que les gangliosides se

regroupent dans des fragments particuliers de membrane plasmique, appelés radeaux lipidiques

(rafts). Ces microdomaines possèdent la particularité d'être insolubles dans le Triton X100 à basse

69

température (4°C), propriété exploitée pour leur extraction. Ils présentent une composition lipidique

et protéique bien particulières: riches en cholestérol, sphingomyéline, en protéine à pied d'ancrage

glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) et en protéines impliquées dans la signalisation telles la famille

src tyrosine kinase. Les microdomaines pourraient jouer le rôle de plate-forme d’attachement pour

ces protéines. Au sein des radeaux lipidiques, les GSL et les gangliosides s'accumulent dans des

invaginations appelées cavéoles caractérisées par la présence d'une protéine spécifique, la

cavéoline, et contenant en particulier des protéines G, Ras (Figure 20). L'assemblage des

gangliosides et plus généralement des GSL dans ces microdomaines semble être à la base de leurs

fonctions. Les rafts sont particulièrement riches en molécules fonctionnelles impliquées dans la

transduction du signal et les gangliosides qui y sont associés peuvent interagir avec ces protéines

(récepteurs ou protéines kinases) pour moduler leur fonction. De plus, il a été montré que les GSL

peuvent affecter la formation et la fonction des microdomaines dans des cellules de carcinome de

poumon (Inokuchi J.I. et al., 2000) et que l'addition de GM1 à des cellules CHO-K1 modifie la

distribution des protéines à pied d'ancrage GPI dans la membrane plasmique (Crespo P.M. et al.,

2002). Les GSL contribuent aussi aux propriétés physico-chimiques des microdomaines et les

cavéoles sont d'ailleurs des lieux d'endocytose.

Cela étant, il semble qu'un certain nombre de GSL soient également présents dans le cytosol. Par

exemple, la fraction soluble du cerveau contiendrait environ 5 % des gangliosides totaux de

l'organe, de composition semblable à celle des gangliosides membranaires. Certains gangliosides

ont été retrouvés associés à la vimentine, un composant des filaments intracellulaires

intermédiaires, ce qui correspondrait peut-être à une voie de recyclage (Kotani M. et al., 1994).

D'autre part, les gangliosides sont également présents dans les membranes internes comme

l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, les endosomes et lysosomes, où ils sont

synthétisés, transportés ou dégradés. Enfin, il a été récemment montré que des gangliosides se

trouveraient dans des membranes associées aux mitochondries, ou MAM, un sous-compartiment du

réticulum endoplasmique étroitement associé à la mitochondrie (Ardail D. et al., 2003).

70

Figure 20 : structure d'un microdomaine membranaire

(disponible sur http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/glycolipid/GLA01E.html)

II. LE METABOLISME DES GANGLIOSIDES

1. BIOSYNTHESE D'une manière générale, la biosynthèse des gangliosides correspond à une glycosylation

séquentielle du céramide. Les additions successives de résidus monosaccharidiques sont

catalysées par différentes enzymes de la famille des glycosyltransférases. Chaque réaction

implique le transfert d'un résidu monosaccharidique depuis un donneur nucléotide-sucre à un

accepteur. Les différentes étapes de la biosynthèse des gangliosides s'accompagnent d'un transport

intracellulaire de molécules de plus en plus grosses du réticulum endoplasmique à l'appareil de

71

Golgi puis à la membrane plasmique.

1.1.Les premières étapes: formation du précurseur commun, le lactosylcéramide

Le céramide formé dans le réticulum endoplasmique est d'abord transporté jusqu'à la face

cytosolique de l'appareil de Golgi par des voies assez mal connues mettant en jeu des vésicules

membranaires ou alternativement une protéine de transfert du céramide, récemment identifiée. La

glucosylcéramide synthase lui transfert alors un résidu glucose depuis l'UDP-glucose. Toutes les

autres enzymes de glycosylation de la biosynthèse des gangliosides se trouvant du côté luminal, le

glucosylcéramide ainsi formé est transloqué, probablement à l'aide d'une protéine de type flippase.

A ce niveau, une galactosyltransférase ajoute un résidu galactose sur le glucosylcéramide pour

former le lactosylcéramide, précurseur commun de tous les gangliosides, mis à part le GM4

synthétisé directement à partir du glucosylcéramide (Degroote S. et al., 2004).

1.2.La chaîne d'assemblage

Les résidus monosacharidiques suivants sont alors transférés à la chaîne glycannique grandissante

par étapes précisément ordonnées au niveau de la face luminale du Golgi. Le lactosylcéramide et

ses dérivés sialylés, GM3, GD3 et GT3, obtenus par l'action de sialyltransférases, servent de

précurseurs pour la biosynthèse des gangliosides complexes des séries 0, a, b, c (Figure 21). Ces

différentes séries sont caractérisées par la l'absence (série-0), ou la présence d'un (série-a), deux

(série-b) ou trois (série-c) acides sialiques liés sur le premier résidu galactose.

Les sialyltransférases I, II et III catalysant les premières étapes de la biosynthèse des gangliosides

(formation du GM3, GD3 et GT3) présentent une spécificité importante pour leur substrat. Les

quantités relatives des glycolipides précurseurs Laccer, GM3, GD3 et GT3 semblent déterminer en

partie les taux de gangliosides des séries 0, a, b et c qui en dérivent respectivement et uniquement.

En revanche, les glycosylations successives de ces précurseurs sont catalysées par des

glycosyltransférases à faible spécificité, la N-acétylgalactosamine transférase (GalNAcT) et la

galactosyltransférase II (GalT-II) ainsi que les deux sialyltransférases ST-IV et ST-V. Elles

transfèrent un résidu saccharidique sur des accepteurs qui diffèrent uniquement par le nombre

d'acides sialiques liés au galactose, c'est à dire par leur série. Des données récentes suggèrent que

les précurseurs sont formés dans le Golgi proximal et distal alors que la synthèse des gangliosides

plus complexes se limiterait au Golgi distal (Kolter T. et al., 2002). Roseman a le premier proposé

que la biosynthèse des chaînes oligosaccharidiques pourrait être catalysée par des systèmes de

multiglycosyltransférases (Roseman S., 1970). L’existence de ces complexes fonctionnels a été

confirmée par la co-immunoprécipitation de GalNAcT et GalT-II, formant un complexe qui accepte

GM3 comme substrat pour libérer directement GM1 (Giraudo C.G. et al., 2001). Ceci pourrait

72

notamment expliquer pourquoi le cerveau, par exemple, contient de grandes quantités de GM1 et

GD1a mais peu de GM2.

Une fois synthétisés, les gangliosides gagnent leur destination principale, la membrane plasmique,

vraisemblablement via un transport vésiculaire.

Les glycosyltransférases présentes et actives dans l'appareil de Golgi varient en fonction du type

cellulaire, du stade de développement, ou d'un état pathologique (Degroote S. et al., 2004). Cet

équipement enzymatique conditionne la composition en gangliosides de la cellule. Les GM3, GD3

et GT3 synthases revêtent une importance particulière car elles gouvernent respectivement l’entrée

dans la voie de biosynthèse des séries-a, -b, et -c.

Figure 21 : schéma de biosynthèse des gangliosides,

d'après Van Echten G. (Van Echten G. et al, 1993)

2. CATABOLISME Avant d'être dégradés, les gangliosides présents dans la membrane plasmique sont tout d'abord

internalisés par endocytose et acheminés par des vésicules "coatées" jusqu'aux endosomes (Figure

22). De là, une partie peut être réinsérée dans la membrane plasmique ou rejoindre l'appareil de

Golgi mais la majeure partie est acheminée vers les lysosomes, lieu de leur dégradation.

SialyltransferaseIV

SialyltransferaseV

Cer

Cer CerGM3

(Lactosylceramide

CDH)

Glucosylceramide(CMH)

Cer

GM2

Cer

GM1

Cer

GD1a

Cer

GD3

Cer

GD2

CerGD1b

Cer

GT1b

Cer

GT3

Cer

GT2

CerGT1c

Cer

GQ1c

Sialyltransferase I Sialyltransferase II Sialyltransferase IIIGalNAc-transferase

Galactosyl-transferase II

CerGA2

CerGA1

Cer

GM1b

Cer Cer Cer Cer

GT1a GQ1b GP1cGD1

Série-a Série-b Série-cSérie asialo (série-0)

Galactosyltransferase I

CerCeramide

Glucosylceramide synthase Galactosylceramide

Cer

Cer

GM4

Sulfatide

glucose

galactose

acide sialique

N-acetylgalactosamine

sulfate

Cer

Ceramidetrihexoside

Cer

GlobosideLactoside

Cer

SialyltransferaseIV

SialyltransferaseV

CerCer

CerCerCer CerCerCerCerGM3

(Lactosylceramide

CDH)(Lactosylceramide

CDHLactosylceramide

CDH)

Glucosylceramide(CMH)

Glucosylceramide(CMH)

CerCer

GM2

Cer

GM1

CerCer

GD1a

CerCerCerCer

GD3

CerCer

GD2

CerCerGD1b

CerCer

GT1b

CerCerCerCer

GT3

CerCer

GT2

CerCerGT1c

CerCer

GQ1c

Sialyltransferase I Sialyltransferase II Sialyltransferase IIIGalNAc-transferase

Galactosyl-transferase II

CerCerGA2

CerCerGA1

CerCer

GM1b

Cer Cer CerCer CerCer

GT1a GQ1b GP1cGD1

Série-a Série-b Série-cSérie asialo (série-0)

Galactosyltransferase I

CerCerCeramide

Glucosylceramide synthase Galactosylceramide

CerCer

Cer

GM4CerCer

GM4

Sulfatide

glucose

galactose

acide sialique

N-acetylgalactosamine

sulfate

glucoseglucose

galactosegalactose

acide sialiqueacide sialique

N-acetylgalactosamineN-acetylgalactosamine

sulfate

CerCer

Ceramidetrihexoside

CerCerCer

GlobosideLactoside

CerCer

73

Les gangliosides y sont dégradés par l'action conjuguée de différentes enzymes. Des

exoglycosidases spécifiques enlèvent séquentiellement les résidus monosaccharidiques. L’action de

ces hydrolases est facilitée, pour les gangliosides à chaîne de sucres courte, par la présence de petits

cofacteurs protéiques appelés SAP (Sphingolipid Activator Proteins), comme par exemple le

"GM2-activator", qui dégagent les gangliosides de la membrane des lysosomes pour faciliter leur

accessibilité aux enzymes (van Echten G. et al., 1993). La chaîne de sucres entière peut également

être détachée par une céramide glycanase. Enfin, l’acide gras du céramide peut être enlevé par

l’action d’une céramide-N-désacylase.

Par ailleurs, des sialidases catalysent le détachement de l’acide sialique des gangliosides et des

glycoprotéines. Trois sialidases ont été identifiées chez les mammifères, différant par leurs

propriétés enzymatiques et leur localisation subcellulaire : lysosomale (Neu1), cytosolique (Neu 2)

ou membranaire (Neu3). Cette dernière, localisée dans la membrane plasmique où les taux d’autres

glycosydases sont très faibles, est spécifique des gangliosides. Elle pourrait jouer un rôle important

dans la signalisation membranaire en modulant le taux des gangliosides de la membrane plasmique

(Sasaki A. et al., 2003).

Les gangliosides présents dans la membrane plasmique sont régulièrement dégradés par la cellule.

Les études concernant leur taux de renouvellement donnent des demi-vies allant de quelques jours à

plusieurs semaines, suivant le système ou la méthode utilisés.

Lysosome

Endosome

Appareil de Golgi

Coated pit

Coated vesicleUncoated vesicleMembrane plasmique

Lysosome

Endosome

Appareil de Golgi

Coated pit

Coated vesicleUncoated vesicleMembrane plasmique

Lysosome

Endosome

Appareil de Golgi

Coated pit

Coated vesicleUncoated vesicleMembrane plasmique

Figure 22 : catabolisme des gangliosides

74

3. REGULATION DU METABOLISME L'équilibre entre biosynthèse et catabolisme des gangliosides est précisément contrôlé dans la

cellule et les déséquilibres ont des conséquences fortes, dont certaines sont bien identifiées.

Lorsqu'un défaut dans les processus de dégradation survient, suite à une déficience génétique

affectant une glycosidase ou une protéine activatrice, le ganglioside substrat de cette enzyme

s'accumule et est stocké dans les lysosomes. Ce déséquilibre ou gangliosidose, occasionne des

pathologies héréditaires neurodégénératives sérieuses. Les maladies de Tay-Sachs et Sandhoff sont

par exemple deux formes d'une déficience de l'enzyme β-hexosaminidase conduisant à une

accumulation de GM2.

A l'inverse, une activité diminuée des enzymes de biosynthèse est probablement à l'origine des

chaînes glycanniques incomplètes observées dans certaines cellules transformées. En effet, il a été

montré que des cellules transformées par des virus oncogènes ou par irradiation sont carencées en

gangliosides complexes à cause d'un diminution d'activité de glycosyltransférase spécifique

(Fishman P.H. et al., 1976).

La régulation des enzymes de biosynthèse des gangliosides est aussi particulièrement importante au

cours du développement. Des changements majeurs dans les quantités et le profil en gangliosides du

cerveau ont été observés au cours du développement, correspondant à des changements dans les

activités des glycosyltransférases. L’incapacité à synthétiser les gangliosides durant cette période

critique résulterait en des troubles neurologiques sévères (Fishman P.H. et al., 1976).

L’expression différentielle des gangliosides dans les tissus et les changements observés durant le

développement ou les pathologies comme l’oncogenèse apparaît donc comme un point clé de la

biologie des gangliosides. Il est donc particulièrement important de comprendre les mécanismes de

la régulation des enzymes du métabolisme des gangliosides, qui restent pourtant encore assez mal

connus.

3.1.Equipement enzymatique et disponibilité des substrats

Les premiers éléments qui gouvernent le métabolisme des gangliosides tiennent aux caractéristiques

même des enzymes : taux, spécificité, paramètres cinétiques comme le Km et organisation des

enzymes dans le Golgi. Un certain nombre de glycosyltransférases partageant les mêmes substrats,

une compétition s’opère. La disponibilité en substrats joue donc un rôle important dans la

détermination du profil en gangliosides. Il a par exemple été montré que la transformation de lignée

cellulaire de mélanome exprimant GM3 et GD3 avec l’ADNc de la GM2/GD2 synthase convertit

les cellules en transformants exprimant essentiellement du GM2. Les taux élevés de GM2/GD2

synthase ont dirigé dans ce modèle l’utilisation du GM3 vers la biosynthèse des gangliosides de la

série-a (Lloyd K.O. et al., 1998). L'expression et l'activité relatives des différentes

75

glycosyltransférases gouvernent le profil en gangliosides des différents types cellulaires.

3.2.Régulation au niveau transcriptionnel

La régulation du métabolisme des gangliosides se joue probablement principalement à ce niveau.

Des expériences ont révélé une forte corrélation entre la quantité des GSL, l’activité des

glycosyltransférases et leur expression (Ruan S. et al., 1999; Watanabe R. et al., 1998). Le clonage

assez récent de la plupart des glycosyltransférases a permis de fournir des informations sur la

régulation de l’activité des enzymes au niveau transcriptionnel. Furukawa at al. ont par exemple

montré que le gène codant pour la GM2/GD2 synthase humaine présente 3 sites d’initiation de la

transcription avec des séquences consensus pour la liaison des facteurs de transcription EGR-1,

HNE-5 et Sp1 (Furukawa K. et al., 1996). De même, le fragment 5’ de la GM3 synthase humaine a

été caractérisé. Huit facteurs de transcription pouvant se lier à la région proximale ou être recrutés

comme coactivateurs ont été identifiés, parmi lesquels CREB, PPAR ou Stat 6 (Zeng G. et al.,

2003). Enfin, le promoteur de la GD3 synthase de rat a également été analysé, révélant des sites

consensus pour la liaison de facteurs de transcription comme Sp1, AP-1, NFkB, C/EBP et TFIID

(Zeng G. et al., 1998). Cette régulation par des promoteurs pourrait être responsable de la spécificité

cellulaire de l'expression des gangliosides mais peu de preuves directes ont été apportées pour le

moment. Très récemment, il a été décrit dans des cellules HL60, que l'expression de la GM3

synthase est positivement régulée par le facteur de transcription CREB activé par la voie de

signalisation PKC/ERKs (Chung T.W. et al., 2004). Une étude de Tagami et al. a par ailleurs

montré que l'activité GM3 synthase et le taux d'ARNm de la protéine étaient augmentés dans des

adipocytes rendus insulino-résistant par le TNFα. Les auteurs suggèrent que la transcription du

gène de la GM3 synthase pourrait être activée par la signalisation du TNFα via le récepteur au

TNF1 (Tagami S. et al., 2002).

3.3.Mécanismes de régulation épigénétiques

En dehors de la régulation au niveau génétique, quelques observations suggèrent l'existence de

différents mécanismes régulateurs des enzymes du métabolisme des gangliosides.

3.3.1 Au niveau post-transcriptionnel

• Un certain nombre de travaux indiquent que l'activité des glycosyltransférases pourrait être

régulée par des mécanismes de phosphorylation / déphosphorylation. Par exemple, Scheideler et

Dawson ont montré qu'une inhibition de la synthèse d'AMPc par un agent pharmacologique

diminue l'activité GM2 synthase alors qu'une accumulation intracellulaire d'AMPc produit l'effet

inverse. De plus, ils ont révélé que l'ajout d'AMPc à des microsomes de cerveau de rat induit une

76

phosphorylation de la GM2 synthase et double consécutivement son activité, révélant ainsi un rôle

direct de l'AMPc et de la phosphorylation dans les changements d'activité de l'enzyme (Scheideler

M.A. et al., 1986). D'autre part, Gu et al. ont montré, in vitro, que la protéine kinase C inhibe

l'activité de préparations purifiées de sialyltransférases I et IV de rat, en phosphorylant

respectivement les résidus thréonine et serine. Ils ont également montré que cette diminution

d'activité peut être reversée en traitant les sialytransférases phosphorylées par une phosphatase,

renforçant ainsi, par sa réversibilité, l'importance de ce mécanisme de phosphorylation /

déphosphorylation comme régulateur de l'activité de l'enzyme (Gu X. et al., 1995). Enfin, la même

équipe rapporte que les changements dans la composition en gangliosides des cellules NG108-15,

observés lors de leur différenciation, peuvent être induits par les systèmes de phosphorylation liés

aux protéines kinases C et A. Ainsi, la phosphorylation de la GalNAcT augmenterait son activité

tandis que celle de la ST-IV la diminuerait (Bieberich E. et al., 1998). Bien que tous ces travaux

suggèrent l'existence de la phosphorylation comme facteur de régulation de l'activité des

glycosyltransférases, cette phosphorylation et sa signification en terme d'activité de l'enzyme n'ont

pas encore été directement montrés in situ.

• Par ailleurs, un autre type de modification covalente des glycosyltransférases, la N-

glycosylation, a été mise en cause dans la régulation de leur activité. Dans un premier temps,

l'analyse de l'ADNc cloné de glycosyltransférases comme la GD3 ou la GM2 synthase a permis de

prédire la présence de plusieurs sites potentiels pour la N-glycosylation. La signification de ces sites

a été clarifiée par différents travaux. Martina et al. ont montré, en utilisant une glycosidase sur des

cellules COS7 transfectées avec la GD3 synthase de poulet, que la forme déglycosylée de l’enzyme

était moins stable que la forme native. De plus, ils ont montré qu’un traitement avec un inhibiteur

de N-glycosylation bloque l’activité de l’enzyme et provoque sa rétention au niveau du reticulum

endoplasmique (Martina J.A. et al., 1998). L’importance de la N-glycosylation dans le trafic et la

localisation subcellulaire des glycosyltransférases a été confirmée par les travaux de Bieberich et al.

qui ont montré que la glycosylation augmente le "turnover" et perturbe le transport de la GD3

synthase depuis le reticulum endoplasmique jusqu’à l’appareil de Golgi (Bieberich E. et al., 2000).

En revanche, les travaux d’Haraguchi et al. ont révélé que la déglycosylation de la GM2 synthase

diminue son activité sans affecter sa localisation subcellulaire (Haraguchi M. et al., 1995). Il est

difficile de statuer sur la signification biologique de la N-glycosylation des glycosyltransférases du

fait de la variabilité des observations faites en fonction du type cellulaire.

3.3.2 Rétrocontrôle négatif

Un rétrocontrôle négatif de la biosynthèse des gangliosides par les gangliosides eux-même a été

observé in vitro. Ainsi, la GM2 synthase est inhibée par le GM3 et plus efficacement par les

77

gangliosides avec 2 ou 3 acides sialiques dans leur structure (Nores G.A. et al., 1984). Cette

observation a ensuite été confirmée par Yusuf et al. qui a montré que la GM2 synthase est

préférentiellement inhibée par le GD1a puis, moins fortement, par le GM1 et le GM2, mais

également par le GT1b. De même, l’activité GD3 synthase est inhibée le plus efficacement par le

GQ1b puis par le GT1b mais aussi par le GD1a (Yusuf H.K. et al., 1987). Ces résultats mettent en

évidence l’existence d’un rétrocontrôle négatif de la biosynthèse des gangliosides de la série-a et de

la série-b, préférentiellement par les produits finaux respectifs de la série mais qui ne semble pas

être totalement spécifique. Bien qu’une telle régulation n’ait jamais été mise en évidence in vivo,

elle paraît fort probable du fait de la co-localisation de nombreuses étapes de la biosynthèse des

gangliosides dans un même compartiment cellulaire.

3.3.3 Le pH

Le pH de l’environnement des enzymes pourrait également jouer un rôle dans la régulation de leur

activité. Un "shift" réversible de la série-a vers la série-b a été observé dans des cellules neuronales

murines lorsque le pH est abaissé de 7.4 à 6.2 (Iber H. et al., 1990). Cette observation pourrait

s’expliquer par la différence de pH optimum des premières enzymes catalysant la biosynthèse des

gangliosides de la série-a (GalNAcT) et de la série-b (ST-II).

Il semble donc que la composition en gangliosides des différents tissus soit le résultat d’une

expression sélective et d’une régulation active des enzymes spécifiques responsables de leur

métabolisme.

III. FONCTIONS

Le rôle fonctionnel des gangliosides se clarifie progressivement par le recours à différentes

approches in vitro : addition de gangliosides exogènes, blocage de la biosynthèse des gangliosides

par des inhibiteurs spécifiques ou des moyens biomoléculaires, utilisation de mutants déficients en

certains gangliosides ou au contraire introduction de nouveaux gangliosides dans les cellules par

transfection de l’ADNc de leur enzyme de biosynthèse. Plus récemment, le clonage de nombreuses

glycosyltransférases et le développement de techniques consistant à invalider des gènes précis dans

des organismes entiers (animaux KO) a permis d’obtenir des informations sur le rôle des

gangliosides in vivo. L'ensemble des observations faites jusqu'à présent a révélé que les

78

gangliosides exercent une double fonction : la reconnaissance cellulaire et la modulation du

signal transmembranaire. Ces deux fonctions leur confèrent un rôle majeur dans la prolifération,

la différenciation et la migration cellulaire et ainsi dans le développement et l’organisation des

tissus ou dans les phénomènes d’oncogénèse.

1. DOUBLE FONCTION DES GANGLIOSIDES

1.1.Reconnaissance cellulaire

Par leur localisation à la surface de la membrane plasmique et leur distribution ubiquiste et

spécifique, les gangliosides sont bien placés pour intervenir dans les phénomènes de reconnaissance

cellulaire. Ils possèdent des propriétés antigéniques et sont impliqués à la fois dans la

reconnaissance cellule-cellule et cellule-matrice par l’intermédiaire de différents types

d’interaction : avec des glycoprotéines, des récepteurs aux intégrines ou avec d’autres GSL. D’autre

part, les gangliosides ont été depuis longtemps décrits comme récepteurs pour différents virus,

bactéries ou toxines (Figure 23).

79

Figure 23 : récapitulatif des différentes fonctions occupées par les gangliosides

1.1.1 Propriétés antigéniques

Les gangliosides et plus généralement les GSL présentent une grande variété de structures,

notamment de la chaîne oligosaccharidique exposée au milieu extracellulaire. Ils sont répartis de

façon spécifique en fonction du tissu, de son stade de développement, et du type cellulaire. Ainsi ils

peuvent permettre de définir des spécificités antigéniques de la cellule et jouer le rôle d’antigène ou

d’immunogène. Ils correspondent par exemple à des antigènes du groupe sanguin ou à des antigènes

associés au stade de développement. Ils représentent également des marqueurs antigéniques de

certaines pathologies (Degroote S. et al., 2004). Par exemple, l’expression des gangliosides est très

perturbée dans de nombreuses tumeurs et les gangliosides concernés sont alors utilisés comme

antigènes cibles pour un immuno-diagnostic voire même une immuno-thérapie (Lloyd K.O. et al.,

1998). Certains gangliosides sont également des antigènes pouvant déclencher une réaction auto-

immune dans le cadre du diabète de type 1. Enfin, plusieurs gangliosides du tissu nerveux humain

celluleGG

bactéries virus

GG

GG Bactérie E.Coli

Glyco

ides

Membrane de la cellule A

Membrane de la cellule B

SBP SBP

SBP SBP

pide

Membrane de la cellule A

Membrane de la cellule B

protéines membranaires

GG

intégrines

Glycosphingol

Membrane cellulaire

Matrice extracellulaire

Récepteurintégrineα5β1

cellule voisine

cellulecelluleGGGG

bactéries virus

GGGG

GGGG Bactérie E.Coli

Glyco

ides

Membrane de la cellule A

Membrane de la cellule B

SBP SBP

SBP SBP

pide

Membrane de la cellule A

Membrane de la cellule B

protéines membranaires

protéines membranaires

GG

intégrinesintégrines

Glycosphingol

Membrane cellulaire

Matrice extracellulaire

Récepteurintégrineα5β1

cellule voisinecellule voisine

80

ont été décrits comme des antigènes dans des neuropathies auto-immunes (Yoshino H. et al., 1993).

1.1.2 Reconnaissance par des protéines de liaison aux hydrates de carbone

Quelques travaux suggèrent l'existence de molécules membranaires se liant aux hydrates de carbone

(SBP, sugar binding protein). Différents types de SBP, plus ou moins bien identifiées, ont été

décrites pour se lier aux gangliosides. Schnaar et al. ont par exemple montré qu'une molécule

présente dans la membrane de cerveau de rat, essentielle dans le développement du système

nerveux central, se lie spécifiquement au GT1b (Tiemeyer M. et al., 1989). La même équipe a

également mis en évidence la liaison d'une lectine (MAG, myelin associated glycoprotein) médiant

certaines interactions entre la myéline et les cellules neuronales, avec les gangliosides (Schnaar

R.L. et al., 1998). De la même manière, Hattori et al. ont révélé la présence à la surface de

"granulosa cell" immatures, d'une protéine servant de site de liaison au GM3, en soulignant le rôle

potentiel de cette interaction dans la différenciation des cellules (Hattori M. et al., 1995). Une sialo-

adhésine présente sur les macrophages et impliquée dans les interactions cellulaires au niveau des

tissus hématopoïétiques a également été décrite pour reconnaître spécifiquement une séquence

oligosaccharidique contenant de l'acide sialique dans les gangliosides ou bien les glycoprotéines

(Crocker P.R. et al., 1991). L'interaction entre le GM1 et la galectine 1 a par ailleurs été décrite dans

une lignée cellulaire de neuroblastome, en suggérant l'importance de cette interaction dans la

différentiation et l'inhibition de contact de ces cellules (Kopitz J. et al., 1998).

1.1.3 Modulation des récepteurs intégrines

Les gangliosides ont souvent été impliqués dans les interactions entre cellules et matrice

extracellulaire soit par liaison directe avec des protéines matricielles soit par interaction avec les

récepteurs intégrines. Il a été suggéré que les gangliosides puissent jouer un rôle de récepteurs pour

la fibronectine, glycoprotéine médiant une grande variété de phénomènes d'adhésion cellulaire, et

ce d'autant plus efficacement que le nombre d'acides sialiques contenu dans le ganglioside est élevé

(Yamada K.M. et al., 1983). Le GD3 a aussi été décrit pour interagir avec le collagène ou la

laminine (Nakano J. et al., 1999). Les travaux de Wang et al. ont montré que le GT1b interagit

directement avec l'intégrine α5β1, prévenant ainsi son interaction avec la fibronectine et inhibant

l'attachement et la migration de keratinocytes sur une matrice fibronectine. De plus, ils ont suggéré

que l'interaction entre le GT1b et α5β1 inhibe la voie de signalisation intégrine-kinase liée aux

intégrines – PKB – Akt (Wang X.Q. et al., 2001b). Au contraire, Zheng et al. ont décrit que la forte

adhésion à la fibronectine d'une lignée cellulaire de carcinome mammaire murin est due à un

support fonctionnel du GM3 sur le récepteur intégrine α5β1 (Zheng M. et al., 1993).

81

1.1.4 Interaction entre gangliosides et GSL

Alternativement à une interaction entre les gangliosides et des protéines, Hakomori et al. ont

proposé la possibilité d'une interaction entre un GSL et un autre GSL, complémentaire, exprimé à la

surface d'une cellule voisine, par l'intermédiaire de leur chaîne hydrate de carbone. L'utilisation de

liposomes contenant du GM3 a permis de montrer une interaction avec une phase solide "coatée"

avec le globoside Gb4 ou le lactosylcéramide, notamment, qui présenteraient des structures

complémentaires au GM3 (Kojima N. et al., 1991). De plus, une interaction a été découverte entre

le GM3 fortement exprimé à la surface de cellules de mélanomes murin et le lactosylcéramide

exprimé à la surface des cellules endothéliales, soulignant ainsi le rôle potentiel de cette interaction

dans les métastases de mélanomes (Hakomori S. et al., 1995). Ces interactions gangliosides-GSL,

rapides mais moins solides que les liaisons gangliosides-protéines, semblent intervenir dans des

phénomènes de reconnaissance cellulaire mais aussi d'adhésion ou de migration indépendants des

systèmes fibronectine/intégrines ou lectines.

1.1.5 Interaction avec des virus, bactéries ou toxines

Les gangliosides étant capables d'interagir avec des sucres ou des protéines, ils ont souvent été

décrits comme les cibles de divers pathogènes qui les utilisent en tant que site d'attachement. Les

gangliosides ont par exemple été décrits comme récepteurs pour le virus de la grippe (Suzuki Y.,

1994). Le GM1 serait de plus capable de lier une glycoprotéine de l'enveloppe du HIV (McAlarney

T. et al., 1994) alors que plusieurs souches de rotavirus bovins seraient capables de se lier aux GM2

et GD1a (Delorme C. et al., 2001). Les microorganismes pourraient posséder des lectines

spécifiques capables de reconnaître et de lier certains résidus des gangliosides membranaires de la

cellule hôte. Il semble d'ailleurs que la reconnaissance soit dirigée vers une portion interne plutôt

que terminale de la chaîne oligosaccharidique voire même vers la portion céramide. Les

gangliosides sont également utilisés comme des récepteurs par différentes toxines, dont la plus

connue est la toxine cholérique, enterotoxine produite par Vibrio cholerae, interagissant

spécifiquement avec le GM1. Cette propriété est d’ailleurs souvent exploitée pour l’identification

du GM1. Le mécanisme de cette interaction est bien connu et représenté en Figure 24. La liaison de

la sous-unité B de la toxine cholérique au GM1 induit un changement de conformation, une

dissociation de la molécule et l'entrée de la sous-unité A dans la membrane cellulaire. Il s'ensuit

l'activation de l'adénylate cyclase et la production d'AMPc qui pourrait médier les effets biologiques

de la toxine cholérique (Fishman P.H. et al., 1976). D'autres toxines bactériennes peuvent

également se lier aux gangliosides: la toxine tétanique (GD1b) (VAN HEYNINGEN W.E. et al.,

1961), la toxine botulinique (GT1b et GQ1b) (Simpson L.L. et al., 1971) ou la δ toxine produite par

Clostridium perfringens (GM2).

82

Figure 24 : mécanisme de l'interaction du GM1 avec la toxine cholérique

(disponible sur http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/glycolipid/GLB02E.html)

1.2.Modulation du signal transmembranaire

Les gangliosides sont connus pour moduler la transduction du signal, en interagissant avec des

protéines membranaires impliquées dans des cascades de signalisation. Deux systèmes majeurs de

signalisation transmembranaire en action dans la majorité des cellules eucaryotes ont été décrits

pour être modulés par les gangliosides, ou leurs produits de dégradation : les protéines kinases

associées à des récepteurs aux facteurs de croissance et la PKC.

1.2.1 Régulation des récepteurs à tyrosine kinase

Ce système de signalisation est de loin le plus étudié en terme de régulation par les gangliosides.

Depuis la première association découverte entre une inhibition de la prolifération cellulaire en

présence de gangliosides et une action au niveau du récepteur à l’EGF, presque sinon tous les

récepteurs de facteurs de croissance ont été décrits pour être modulés par les gangliosides. La

Figure 25 récapitule de manière non exhaustive les effets des gangliosides sur les principaux

récepteurs de facteur de croissance étudiés dans différents types cellulaires.

83

EGFR IR

Figure 25 : modulation de l'activité de différents récepteurs aux facteurs de croissance par les gangliosides

• L'inhibition de l’activité du récepteur à l’EGF (EGFR) par les gangliosides a souvent été décrite.

Bremer et al. ont par exemple montré que le GM3 et le GM1 sont capables d’inhiber la

phosphorylation de l’EGFR stimulée par l’EGF et ainsi de diminuer la croissance de lignées

cellulaires KB et A431 (Bremer E.G. et al., 1986). De même, Mirkin et al. ont révélé que le

traitement avec les gangliosides GM3, GT1b et GD1a des cellules de neuroblastomes inhibe la

phosphorylation de l’EGFR (Mirkin B.L. et al., 2002). Contrairement à cet effet inhibiteur du GM3,

un produit issu de sa dégradation, le dé-N-acetylGM3, semble stimuler l'activité tyrosine kinase

associée à l'EGFR et ainsi la croissance de cellules 3T3 (Hanai N. et al., 1988). Des approches

opposées consistant à utiliser des mutants déficients en gangliosides (Weis F.M. et al., 1990), à

transfecter une sialidase diminuant les taux de GM3 (Meuillet E.J. et al., 1999) ou à traiter les

cellules avec un inhibiteur de glucosylcéramide synthase (Meuillet E.J. et al., 2000) ont révélé une

augmentation de l’autophosphorylation de l'EGFR et une croissance cellulaire plus forte,

confirmant ainsi l'action inhibitrice des gangliosides sur l'EGFR. En revanche, Liu et al. ont montré

que le GD1a augmente à la fois l’autophosphorylation de l’EGFR induite par l’EGF et son activité

GM3, GM1, GD1a, GT1b GM3,

GM2, GM1

PDGFR

FGFR

GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD3, GT1b

GM3, GM2, GM1

GM3GD1a

NGFR

GM1

-

-

-- +++

EGFR IR

GM3, GM1, GD1a, GT1b GM3,

GM2, GM1

PDGFR

FGFR

GM1, GM2, GD1a, GD1b, GD3, GT1b

GM3, GM2, GM1

GM3GD1a

NGFR

GM1

-

-

-- +++

84

tyrosine kinase dans des fibroblastes (Liu Y. et al., 2004).

• Concernant le récepteur au PDGF (PDGFR), Yates et al. ont montré que les gangliosides GM1,

GD1a, GD1b, GD3 et GT1b mais pas GM3 inhibent sa phosphorylation à la fois dans des cellules

3T3 (Van Brocklyn J. et al., 1993) et dans des cellules dérivées de gliome humain (Yates A.J. et al.,

1995). Hynds et al. ont confirmé cette inhibition de la phosphorylation du PDGFR par GM1, GM2,

GD1a et GT1b dans des cellules de neuroblastome humain (Hynds D.L. et al., 1995). Plusieurs

études ont également montré que les gangliosides, et en particulier GM2 et GM1, inhibent la

phosphorylation du PDGFR et la cascade de signalisation consécutive, notamment la stimulation de

la PLC et l’élévation du Ca2+ cytosolique, inhibant ainsi l’effet prolifératif du PDGF (Sachinidis A.

et al., 1996; Saqr H.E. et al., 1995; Yates A.J. et al., 1995).

• Par ailleurs, Bremer et al. ont décrit l'inhibition de la fonction du récepteur au FGF et la

diminution de croissance de fibroblastes de hamster par le GM3 (Bremer E.G. et al., 1982). Au

contraire, Slevin et al. ont montré que la croissance de cellules endothéliales aortiques bovines

induite par le bFGF est inhibée par le GM2 et le GM1 alors qu’elle est augmentée par le GM3. Le

GM2 et le GM1 se sont avérés modifier la liaison du bFGF à son récepteur et inhiber la voie de

signalisation mitogène conduisant à l’activation des PLCγ, MAPK et PKC (Slevin M. et al., 1999).

Etonnamment, le GM1 a été décrit pour se lier au FGF2 et renforcer son activité mitogène ce qui

suggérerait que le GM1 puisse agir comme un corécepteur du FGF2 (Rusnati M. et al., 2002).

• Le GM1 s'est également révélé activer le récepteur au NGF en synergie avec le facteur de

croissance, stimulant ainsi la différenciation de cellules PC12 en présence de NGF (Mutoh T. et al.,

1995).

• Enfin, il a été rapporté que l’incubation de cellules avec du GM3 exogène diminue

l’autophosphorylation du récepteur à l’insuline stimulé par son ligand (Nojiri H. et al., 1991). De

même, Tagami et al. ont montré que l’incubation d’adipocytes avec du GM3 supprime la

phosphorylation du récepteur à l’insuline et de son substrat IRS1 (Tagami S. et al., 2002). De plus,

Sasaki et al. ont révélé qu’une accumulation de GM2 et GM1 suite à la surexpression d’une

sialidase dans des souris transgéniques diminue significativement la phosphorylation du récepteur

en réponse à l’insuline ainsi que de son substrat IRS1 (Sasaki A. et al., 2003). Ces travaux sont

d’ailleurs d’une importance cruciale dans le cadre du diabète et seront discutés par la suite.

Les mécanismes par lesquels les gangliosides modulent l’activité de ces récepteurs de facteurs de

croissance à tyrosine kinase sont encore assez mal connus. Il a été montré que l’efficacité à inhiber

la phosphorylation de l’EGFR et la croissance de neuroblastomes, par exemple, différe en fonction

du ganglioside considéré, indiquant une relative spécificité de structure dans l’action des

gangliosides et suggérant que des modifications différentielles du profil en gangliosides pourraient

85

jouer un rôle dans la modulation de la croissance cellulaire (Mirkin B.L. et al., 2002). Bien que

quelques travaux suggèrent une perturbation de la liaison du facteur de croissance à son récepteur

(Liu Y. et al., 2004; Slevin M. et al., 1999), le mécanisme d’action des gangliosides ne semble

impliquer, dans la plupart des cas, ni une diminution du nombre de récepteurs, ni une inhibition de

la liaison du ligand. Le plus souvent, la diminution d’activité du récepteur est décrite comme la

conséquence d’une diminution de l’autophosphorylation du récepteur et de son activité tyrosine

kinase conduisant à une inhibition de la cascade de signalisation qui en découle normalement. Il a

été suggéré que cette inhibition de phosphorylation puisse être la conséquence d’une perturbation de

la dimérisation du récepteur requise pour l'activité tyrosine kinase, comme par exemple pour

l’EGRF ou le PDGFR (Hynds D.L. et al., 1995; Van Brocklyn J. et al., 1993; Yates A.J. et al.,

1995). Il a par ailleurs été avancé que le GM3 pourrait interagir directement avec l’EGFR en se

liant à un site présent sur le domaine extracellulaire du récepteur, distinct du site de liaison de

l’EGF (Miljan E.A. et al., 2002). Wang et al. vont également dans ce sens, en précisant que la

glycosylation du récepteur est nécessaire pour l’interaction avec le GM3 (Wang X.Q. et al., 2001a).

Certains auteurs ont également proposé que les gangliosides puissent agir sur la distribution des

récepteurs aux facteurs de croissance au niveau des microdomaines (Mitsuda T. et al., 2002; Wang

X.Q. et al., 2002).

1.2.2 Modulation de la protéine kinase C

La PKC est une enzyme ubiquiste, dépendante du Ca2+ et des phospholipides, jouant un rôle clé

dans la transduction du signal transmembranaire et impliquée dans de nombreux processus tels que

la prolifération ou la différenciation cellulaires. Kreutter et al. ont montré lors d'essais in vitro que

l'activité PKC est fortement inhibée par un mélange de gangliosides cérébraux, d'autant plus

efficacement que le nombre d'acides sialiques présents dans la molécule est élevé. Ils suggèrent que

l'inhibition exercée par les gangliosides n'est pas due à une interaction avec le substrat, une

compétition avec les phospholipides ou une chélation du Ca2+ mais plutôt à une action directe sur

l'enzyme (Kreutter D. et al., 1987). Cette inhibition de l'activité PKC par le GM3, GD3 et le GT1b a

été confirmée par l'équipe de Katoh qui a attribué cet effet à une perturbation de l'association de la

PKC ou de son substrat avec les phospholipides membranaires (Katoh N., 1995). Kanda et al. ont

également montré que le GM3 exogène supprime l'activité PKC dans des cellules endothéliales

microvasculaires du cerveau (Kanda T. et al., 1993).

D'autres protéines kinases ont été décrites pour être modulées par les gangliosides. C'est le cas par

exemple de la protéine kinase A positivement régulée par le GM3 dans les cellules endothéliales

(Kanda T. et al., 1993). Une protéine kinase spécifiquement inhibée par les gangliosides a de plus

été purifiée du cerveau de cochon d'Inde alors qu'un système de phosphorylation de protéines

86

stimulé par les gangliosides a été détecté à la surface de cellules de neuroblastome (Chan K.F.,

1988).

Les gangliosides présentent donc clairement une double activité, l'une médiant les interactions de la

cellule avec son environnement et l'autre modulant la fonction de protéines membranaires et

régulant la transduction du signal transmembranaire. Ces deux fonctions sont liées et confèrent aux

gangliosides une importance majeure dans divers processus biologiques, évoqués ci-dessous. Il est

important de noter que les intermédiaires de biosynthèse ou bien les métabolites des gangliosides,

c'est à dire le céramide, la sphingosine, la sphingosine 1-P, les lyso-gangliosides…, peuvent eux

aussi inhiber ou activer de nombreux processus intracellulaires et sont connus comme des

médiateurs importants dans l'apoptose, la prolifération….

2. IMPORTANCE BIOLOGIQUE / PHYSIOLOGIQUE DES GANGLIOSIDES

2.1.Développement, différenciation cellulaire et tissulaire, embryogenèse

L'importance capitale des gangliosides dans le développement embryonnaire et la différenciation

des tissus a été mise en lumière avec la mort précoce à 7.5 jours d'embryons de souris KO pour la

glucosylcéramide synthase, totalement déficients en gangliosides (Yamashita T. et al., 1999).

Les gangliosides sont connus pour intervenir dans les phénomènes de reconnaissance cellule-cellule

essentiels pour l'embryogenèse et la morphogenèse. Leur rôle dans la différenciation a été montré in

vitro, particulièrement pour le système nerveux. Tout d’abord, l’interaction entre les gangliosides et

des protéines impliquées dans le développement du tissu nerveux ou la différenciation des cellules

neuronales a été plusieurs fois décrites (Schnaar R.L. et al., 1998; Tiemeyer M. et al., 1989). De

plus, il a été montré que la transfection de cellules Neuro2a de souris avec l'ADNc de la GD3

synthase induit une croissance des neurites et la différenciation cholinergique de ces cellules

(Kojima N. et al., 1994). Il a également été rapporté que l'expression des gangliosides de cellules de

la rétine neuronale varie fortement au cours de leur différenciation (Panzetta P. et al., 2000). Par

ailleurs, l'augmentation des taux de GM3, par ajout exogène ou blocage de la synthèse des

gangliosides plus complexes, a provoqué la différenciation de cellules HL-60 en

monocytes/macropahges ou granulocytes (Nojiri H. et al., 1986; Zeng G. et al., 1995).

Le rôle des gangliosides dans le développement du système nerveux est renforcé par le fait que le

profil en gangliosides varie de manière importante au cours du développement et que les

gangliosidoses, comme par exemple la maladie de Tay-Sachs qui correspond à une accumulation de

GM2, causent des dysfonctionnements neurologiques sévères chez les patients atteints.

87

Cependant, les observations tirées de l'étude de souris KO pour différents gènes de

glycosyltransférases sont mitigées. Par exemple, la souris KO pour la GM2/GD2 synthase

déficiente en gangliosides complexes, développée par l'équipe de Furukawa est viable et ne présente

pas de changements morphologiques apparents (Takamiya K. et al., 1996). Ce résultat surprenant

pourrait s'expliquer, selon les auteurs, par une compensation des fonctions des gangliosides

complexes par les gangliosides plus simples (GM3 et GD3) toujours exprimés dans l'animal.

Cependant, la conductivité nerveuse de cette souris et la régénération après une atteinte nerveuse

sont affectées, ce qui souligne l'importance des gangliosides complexes dans le maintien et la

réparation du tissu nerveux. De plus, cette souris présente un défaut de spermatogénèse et une

stérilité mâle, révélant un nouveau rôle des gangliosides.

2.2.Oncogénèse

L’expression des gangliosides est généralement aberrante dans les cellules transformées et les

tumeurs, tant quantitativement que qualitativement avec l’apparition de nouveaux gangliosides dans

le profil. Ainsi, des mélanocytes de la peau, exprimant initialement du GM3 en majorité,

synthétisent de grandes quantités de GD3 après transformation (Carubia J.M. et al., 1984).

L'analyse de carcinomes de cou et de tête humains a révélé la présence de GM2, GD2, GM1, GD1a

ou GT1b alors que les tissus normaux expriment un profil plus simple avec une majorité de GM3 et

GD3 (Bolot G. et al., 1998). La même équipe a également découvert un ganglioside spécifique

associé à cette tumeur, GalNAc-GM1 (Bolot G. et al., 1999).

Ces modifications sont suffisamment nettes et caractéristiques pour faire des gangliosides des

antigènes de tumeurs, utilisés pour le diagnostic ou le traitement. Des thérapies prometteuses

utilisant des anticorps anti-gangliosides ou bien des vaccins, comme par exemple un vaccin à base

de GM2, ganglioside exprimé dans de nombreux mélanomes, sont d'ailleurs en cours de

développement.

Les mécanismes par lesquels les gangliosides sont impliqués dans la cancérogenèse restent obscurs.

• Il semble que les tumeurs synthétisent et libèrent des gangliosides dans leur

microenvironnement qui pourraient favoriser leur développement en supprimant les réponses

immunitaires de l'organisme (Li R. et al., 1996). Il a récemment été montré que le GM3 et le GD3,

purifiés à partir de mélanome humain, inhibent la différenciation et induisent l'apoptose de cellules

dendritiques (Peguet-Navarro J. et al., 2003).

• Les gangliosides pourraient aussi avoir une importance dans la radiosensibilité des cellules

tumorales ainsi que dans leur capacité métastatique. Zebda et al. ont montré que des cellules de

mélanomes humains à fort pouvoir métastatique présentent des défauts de biosynthèse des

gangliosides, n'exprimant que du GM3 en faibles quantités (Zebda N. et al., 1995). La sensibilité

88

aux radiations de cellules de mélanome humain M4Be a d’autre part été inversement corrélée à la

quantité totale de gangliosides ainsi qu'à la présence de GD3. De plus, l'incubation de cellules

radiosensibles avec du GM1 augmente la proportion de cellules résistantes et diminue leur potentiel

métastatique (Thomas C.P. et al., 1997).

• Les gangliosides ont été décrits pour moduler les interactions, l’adhésion ou la motilité

cellulaires et pourraient ainsi participer aux propriétés invasives des cellules cancéreuses. Merzak et

al. ont montré que les gangliosides, et particulièrement le GD3, favorisent l'adhésion de trois lignées

cellulaires dérivées de gliome humain à la fibronectine, le collagène I, la vitronectine et la laminine

(Merzak A. et al., 1995). Nakano et al. ont également suggéré que les gangliosides pourraient

augmenter le potentiel métastatique de cellules de mélanome en renforçant l'attachement des

cellules aux protéines de la matrice extracellulaire, par interaction directe ou par l'intermédiaire des

récepteurs intégrines (Nakano J. et al., 1999). L'interaction entre le GM3 et le

gangliotriaosylcéramide ou LacCer joue un rôle dans l'adhésion de cellules de mélanomes murins

B16 aux cellules endothéliales et a été avancé comme le facteur initiateur des métastases de ces

mélanomes (Hakomori S. et al., 1995).

Au contraire, Nojiri et al. ont proposé un rôle thérapeutique du GM3 dans le cancer. Ils ont montré

que le GM3 induit une différenciation terminale, culminant par la mort par apoptose de cellules de

carcinome humain et qu’un traitement de tumeurs de souris nude avec du GM3 diminue leur

croissance (Nojiri H. et al., 2002). De même, Aoki et al. ont très récemment montré une diminution

de la motilité et des capacités invasives de cellules de carcinome rénal en diminuant les taux de

GM2, prédominant dans ces cellules et en faisant apparaître du GM3 par inhibition de la GM2

synthase par la technique des SiRNA (Aoki H. et al., 2004).

2.3.Prolifération cellulaire

L’implication des gangliosides dans la régulation de la prolifération cellulaire est maintenant bien

établie.

• De multiples études, basées sur l’utilisation de gangliosides exogènes, ont permis de déterminer

leurs effets in vitro. Quelques travaux indiquent un effet prolifératif des gangliosides : stimulation

de la croissance de cellules musculaires lisses par GM1 et GM2 (Gouni-Berthold I. et al., 2001) ou

augmentation de la prolifération de fibroblastes par GD1a (Liu Y. et al., 2004), mais le plus

souvent, les gangliosides sont décrits pour inhiber la croissance cellulaire. Citons par exemple

l’action anti-proliférative exercée par le GM3 sur des cellules endothéliales microvasculaires,

rapportée par Alessandri et al. (Alessandri G. et al., 1992). Il a également été montré que la

prolifération de cellules de neuroblastome humain est inhibée par les GM3, GM1, GD1a et GT1b

(Mirkin B.L. et al., 2002) ou que le GM3 et le GM1 diminuent la croissance de lignées cellulaires

89

KB ou A431 (Bremer E.G. et al., 1986). Une inhibition de prolifération des cellules vasculaires de

muscle lisse a aussi été observée en réponse aux GM3, GM2 et GM1 (Sachinidis A. et al., 1996).

Tsuboi et al. ont décrit les gangliosides comme des inhibiteurs endogènes de la croissance dans des

cellules mésangiales glomérulaires (Tsuboi N. et al., 2001). Ils ont en effet montré que les cellules

sécrètent des gangliosides dans le milieu de culture, en majorité du GM3, qui inhibent la

prolifération lorsqu’ils sont utilisés pour traiter les cellules. Ils spéculent que ces gangliosides

pourraient être sécrétés par des cellules mésangiales activées sous certains conditions pathologiques

comme un mécanisme de défense pour contrecarrer une prolifération excessive stimulée par des

facteurs de croissance.

Ces observations ont été confirmées plus récemment par des techniques de transfection. Mitsuda et

al. ont notamment montré que la surexpression du GM1 par transfection des ADNc des enzymes

GM2 et GM1 synthases dans des cellules 3T3 diminue leur croissance (Mitsuda T. et al., 2002).

Ces effets sont la plupart du temps attribués à une interaction des gangliosides avec les récepteurs

de facteurs de croissance, comme cela a été décrit précédemment.

Cependant d’autres mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet des gangliosides sur la

prolifération cellulaire :

• Nakatsuji et al. ont décrit une action des gangliosides sur le cycle cellulaire. Ils ont rapporté que

le GM3 diminue la prolifération de cellules neurales en bloquant leur cycle cellulaire et induisant

l’apoptose, en partie via un inhibiteur de kinase cycline-dépendante p27Kip1 (Nakatsuji Y. et al.,

2001). Une étude très récente a confirmé l’existence d’un effet des gangliosides sur le cycle

cellulaire. Les auteurs ont en effet révélé que la surexpression de la GD3 synthase inhibe la

prolifération de cellules vasculaires de muscle lisse, en diminuant l’expression de protéines

associées au cycle cellulaire, cycline E et CDK2, et en induisant un inhibiteur du cycle cellulaire,

p21 (Moon S. K. et al., 2004).

• Par ailleurs, il semble que les gangliosides soient aussi impliqués dans l’induction de l’apoptose.

Le GM3 a par exemple été décrit pour induire l’apoptose de cellules neurales (Nakatsuji Y. et al.,

2001). L’apoptose de monocytes a également été provoquée par un traitement avec du GM3 et du

GD3 purifiés à partir de mélanomes humains (Peguet-Navarro J. et al., 2003). Il a de plus été

rapporté que le GD3 induit l’apoptose d’oligodendrocytes (Simon B.M. et al., 2002) ou de cellules

musculaires lisses aortiques (Bhunia A.K. et al., 2002). Plusieurs travaux ont permis d’expliciter le

rôle du GD3 dans la propagation du signal apoptotique généré par le récepteur CD95 (Fas) (Figure

26). La fixation d’un ligand à ce récepteur au niveau des complexes de mort conduit à l’activation

de deux voies apoptotiques : une cascade protéolytique médiée par les caspases et une voie

lipidique induisant l’activation de la sphingomyélinase acide et la libération de céramide (Malisan

90

F. et al., 1999). L’équipe de Testi a montré que l’accumulation de céramide conduit à la synthèse de

GD3 et que ce GD3 perturbe le potentiel transmembranaire de la mitochondrie. Ils ont de plus

montré que la surexpression de la GD3 synthase provoque à elle-seule directement l’apoptose alors

que l’inhibition de la synthèse de GD3 par des oligonucléotides anti-sens prévient l’apoptose

induite par CD95 (De Maria R. et al., 1997). Ils ont enfin rapporté que la transition de perméabilité

de la mitochondrie induite par le GD3 s’accompagne d’une libération de cytochrome c, de facteurs

induisant l’apoptose (AIF) et de l’activation de la caspase 9 (Rippo M.R. et al., 2000). Ces effets

n’étaient pas induits par d’autres gangliosides que le GD3. Ces résultats ont été confirmés par

Kristal et al. (Kristal B.S. et al., 1999) et Garcia-Ruiz et al. (Garcia-Ruiz C. et al., 2000) dans des

mitochondries isolées et des hépatocytes. Il semble donc que la mitochondrie soit la cible du GD3

dans l’induction du processus apoptotique. Le trafic intracellulaire de ce ganglioside à la

mitochondrie a d’ailleurs été décrit dans des hépatocytes (Garcia-Ruiz C. et al., 2002).

Figure 26 : processus apoptotique impliquant le GD3

(SM, sphingomyélinase; ST8, sialyltransférase 8: GD3 synthase)

d'après Tomassini B. et al (Tomassini B. et al., 2002)

Colell et al. ont cependant proposé un mécanisme alternatif par lequel le GD3 réprimerait

l’activation de NF-κB, facteur associé à une voie de survie (Colell A. et al., 2001). D’autre part,

Garofalo et al. ont montré que l’induction du système CD95/Fas provoque l’association du GM3

91

avec la caspase 8 au niveau des complexes de mort, suggérant un rôle structural des gangliosides

dans cette voie apoptotique (Garofalo T. et al., 2003).

Notons pour finir que les gangliosides ont déjà été impliqués dans les phénomènes d’angiogénèse.

Ziche et al. les ont décrits comme des promoteurs de l’angiogénèse dans la cornée de lapin. Ils ont

en effet montré que les GM1, GT1b ou GD3, contrairement au GM3, stimulent la

néovascularisation induite par des facteurs angiogéniques comme la prostaglandine E1 (PGE1) ou

le bFGF, ainsi que le nombre et la croissance des vaisseaux nouvellement formés, (Ziche M. et al.,

1989; Ziche M. et al., 1992). Ils ont également montré que ces gangliosides agissent en synergie

avec la PGE1 et le bFGF pour améliorer la survie, la croissance et la migration des cellules

endothéliales (De Cristan G. et al., 1990). Une étude menée sur des cellules de gliome humain a de

plus révélé que le GD3 stimule la production de VEGF, suggérant ainsi son rôle angiogénique

potentiel (Koochekpour S. et al., 1996). Enfin, Slevin et al. ont rapporté que le GM3 augmente la

prolifération de cellules endothéliales induite par le bFGF au contraire de GM2 et GM1, proposant

les gangliosides comme modulateurs de l’angiogénèse (Slevin M. et al., 1999).

Par leur double fonction de sites de reconnaissance cellulaire et de modulateurs du signal

transmembranaire, les gangliosides sont impliqués dans une grande variété de fonctions biologiques

dans l’organisme. Les plus connues ont été décrites précédemment mais les gangliosides ont déjà

été associés à d’autres processus comme par exemple la spermatogenèse, les lésions auditives, les

neuropathies ou l’arthrose. Il est fort à parier que d’autres rôles et mécanismes d’action sont encore

à découvrir. Les gangliosides ont été mis en cause dans différentes pathologies, essentiellement le

cancer et certaines maladies neurodégénératives, mais peu de recherches ont été faites sur leur rôle

potentiel dans le diabète.

IV. GANGLIOSIDES ET DIABETE

Des altérations des glycoconjugués et de leur métabolisme ont été décrites au cours du diabète.

• In vivo, différents travaux ont montré des modifications d’activité des enzymes du métabolisme

des glycoprotéines, ainsi une augmentation de plusieurs glycosidases dans le sérum de patients

diabétiques (Serrano M.A. et al., 1983). Des modifications sélectives de la chaîne de sucres de

92

glycoprotéines, avec une diminution des galactose, fucose et acide sialique, ont été décrites dans des

cellules microvasculaires rétiniennes en réponse aux AGE et associées à des modifications

d’activité des glycosyltransférases et glycosidases correspondantes, confirmées dans des rétines de

rat diabétique (Rellier N. et al., 1997; Rellier N. et al., 1999).

• Une forte augmentation de l’activité sialidase ainsi qu’une diminution de l’activité

sialyltransférase et de la concentration d’acide sialique lié ont également été mesurées dans le

cortex rénal de rats STZ (Cohen-Forterre L. et al., 1990). Le taux d’acide sialique plasmatique est

d’ailleurs bien connu pour être augmenté dans le diabète. Une augmentation a été mesurée chez les

diabétiques de type 1 et corrélée à la présence et la sévérité de la rétinopathie (Crook M.A. et al.,

2001). De plus, une accumulation d’acide sialique a également été mesurée dans le sérum et la paroi

des capillaires glomérulaires de patients atteints de néphropathie diabétique (Tomino Y. et al.,

1987; Tomino Y. et al., 1988).

Cependant, peu d’études se sont intéressées jusqu’à présent aux glycolipides ou plus

particulièrement aux gangliosides dans le cadre du diabète. S’ils sont clairement impliqués dans les

phénomènes d’auto-immunité caractéristiques du diabète de type 1, leur rôle dans les complications

diabétiques n’a été que rarement envisagé. Des études récentes les associant aux mécanismes de

l’insulino-résistance ravivent pourtant l’intérêt d’étudier les gangliosides dans cette pathologie.

1. GANGLIOSIDES ET AUTO-IMMUNITE

Le diabète de type 1 est la conséquence d’une destruction auto-immnune des cellules β

pancréatiques productrices d’insuline. Ce phénomène est caractérisé par la présence dans la

circulation, d’auto-anticorps et de lymphocytes T auto-réactifs dirigés contre de multiples

autoantigènes présents au niveau des îlots pancréatiques. Certains autoantigènes sont de nature

protéiques et d’autres ont été identifiés comme étant des gangliosides. Des anticorps circulants

dirigés contre le GT3 (Gillard B.K. et al., 1989) et le GD3 (Tiberti C. et al., 1995) ont par exemple

été détectés chez des diabétiques de type 1 récemment diagnostiqués. Le ganglioside GM2-1 (Cer-

glucose-galactosamine-galactose-acide sialique), exprimé spécifiquement dans les îlots

pancréatiques, a également été identifié comme la cible d’autoanticorps du groupe ICA (Islet Cell

Antibodies), eux-aussi spécifiques des îlots pancréatiques (Dotta F. et al., 1996).

93

2. GANGLIOSIDES ET MICROANGIOPATHIE DIABETIQUE Quelques travaux décrivent des modifications du profil en gangliosides en réponse à un

environnement diabétique, in vivo ou in vitro.

Une perte spécifique des gangliosides de la série-c a été décrite dans le pancréas et le cristallin de

rats STZ (Saito M. et al., 1999; Saito M. et al., 2000). Sanchez et al. ont quant à eux observé une

modification des gangliosides du foie chez des rats STZ. Ces modifications concernent le profil en

gangliosides avec une augmentation du GM3, GM1, GD1b et GT1b ainsi que leurs enzymes de

biosynthèse puisque l’activité GM2/GD2 synthase est augmentée alors que les activités des

galactosyltransférase-II et sialyltransférase-IV sont diminuées. Ils ont de plus montré que ces effets

du diabète sur le métabolisme des gangliosides sont normalisés par un traitement des animaux à

l’insuline (Sanchez S.S. et al., 2000).

Un petit nombre d’études suggère l’implication potentielle des gangliosides dans les complications

microangiopathiques:

Zador et al. ont révélé une accumulation de glucosylcéramide et de GM3 dans les reins

hypertrophiés de rats STZ. De plus, ils ont montré qu’un traitement des animaux diabétiques avec

un inhibiteur de glucosylcéramide synthase, D-PDMP, ramene le poids de leurs reins à un niveau

normal, suggérant ainsi le rôle des GSL et du GM3 dans l’hypertrophie rénale caractéristique de la

néphropathie diabétique (Zador I.Z. et al., 1993).

Au contraire, une équipe coréenne a montré une diminution des taux d’acides sialiques et des

gangliosides totaux, en particulier du GM3 dans les glomérules de rats diabétiques STZ. Ils

suggèrent que cette appauvrissement en GM3 pourrait conduire à une diminution de la charge

anionique de la barrière glomérulaire et ainsi contribuer à la perte de sélectivité de la filtration et à

la protéinurie consécutive, observée au cours de la néphropathie (Kwak D.H. et al., 2003). La même

équipe a très récemment montré que de fortes concentrations de glucose stimulent la prolifération

de cellules mésangiales, effet reproduit par un traitement avec le PDMP. De plus, les fortes

concentrations de glucose diminuaient fortement les taux de GM3 et l’activité GM3 synthase. Les

auteurs présument que la diminution des taux de GM3 pourrait contribuer à la stimulation de

prolifération cellulaire induite par l’hyperglycémie et participer ainsi à l’hypertrophie rénale qui

survient lors du diabète (Rho Y.I. et al., 2004).

Enfin, une étude réalisée dans notre laboratoire a mis en évidence des modifications spécifiques du

profil en gangliosides de cellules microvasculaires rétiniennes soumises à un traitement avec les

AGE. Natalizio et al. ont montré une augmentation des taux de tous les gangliosides dans les

cellules endothéliales et une augmentation des taux de tous les gangliosides exceptée une

diminution des taux de GD3 dans les péricytes, en réponse aux AGE. Ces résultats sont les premiers

94

à révéler des modifications des gangliosides par l’environnement diabétique dans des cellules

rétiniennes particulièrement touchées au cours du diabète, et à souligner ainsi le rôle potentiel des

gangliosides dans la rétinopathie diabétique (Natalizio A. et al., 2001).

3. GANGLIOSIDES ET INSULINO-RESISTANCE Des études récentes menées notamment sur des souris génétiquement modifiées renforcent

vivement l'importance des gangliosides dans le diabète en suggérant leur rôle dans l’insulino-

résistance.

• Tagami et al. ont les premiers apporté des preuves soutenant l’implication du GM3 dans

l’acquisition de l’insulino-résistance (Tagami S. et al., 2002). Ils ont tout d’abord montré que

l’induction de l’insulino-résistance dans des adipocytes murins 3T3 par traitement avec de faibles

concentrations de TNFα s’accompagne d’une augmentation du taux de GM3 cellulaire. Celle-ci est

liée à une régulation positive de l’activité GM3 synthase ainsi que du taux d’ARNm de l’enzyme,

suggérant une activation de la biosynthèse du GM3 par le TNFα au niveau transcriptionnel. Cette

augmentation des taux d’ARNm de la GM3 synthase a d’ailleurs été également observée dans le

tissu adipeux de modèles d’animaux diabétiques, rat Zucker ou souris ob/ob. Les auteurs ont ensuite

montré que l’incubation des cellules en présence de GM3 mime les effets du TNFα sur la

signalisation de l’insuline, c’est à dire inhibe la phosphorylation du récepteur à l’insuline et de son

substrat IRS-1 ainsi que la captation du glucose en réponse à l’insuline. De plus, ils ont rapporté que

l’inhibition de la synthèse du GM3 par le D-PDMP, un inhibiteur de glucosylcéramide synthase,

normalise les défauts de phosphorylation du récepteur à l’insuline et de IRS-1 induits par le TNFα.

Ils suggèrent ainsi que l’augmentation de la biosynthèse du GM3 induite par le TNFα pourrait

participer à la mise en place de l’insulino-résistance caractéristique du diabète de type 2. Les

auteurs proposent un mécanisme d’action du GM3 mettant en jeu les microdomaines, illustré par la

figure 27. La voie de signalisation métabolique de l’insuline, contrairement à la voie du signal de

croissance (Shc-Ras-MAPK), nécessite l’internalisation du récepteur au niveau des microdomaines

et l’interaction avec son substrat. Dans les adipocytes rendus insulino-résistants par le TNFα, ce

processus est perturbé alors que le signal de croissance n’est pas affecté. Le récepteur à l’insuline

semble être déplacé à l’extérieur des microdomaines. Le GM3 pourrait participer à ces changements

structuraux et fonctionnels des microdomaines qui sous-tendent le phénomène d’insulino-

résistance.

95

GM3GM3

Figure 27 : mécanisme d'action proposé pour expliquer l'implication du GM3 dans l'insulino-résistance

(d'après http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/glycopathology/GD-B03E.html)

• L’implication du GM3 dans l’insulino-résistance a été confirmée un an plus tard par Yamashita

et al. à l’aide d’une souris KO pour le gène de la GM3 synthase (Yamashita T. et al., 2003). Ils ont

en effet rapporté que cet animal, incapable de synthétiser le GM3, présente une sensibilité accrue à

l’insuline, liée à une augmentation de la phosphorylation du récepteur dans le muscle squelettique.

Ces souris mutantes étaient également protégées contre une insulino-résistance induite par un

régime hyperlipidémique.

• Enfin, la surexpression d’une sialidase (Neu3) a été décrite pour atténuer la signalisation de

l’insuline, en inhibant la phosphorylation du récepteur à l’insuline et de son substrat, dans un

modèle de souris transgénique (Sasaki A. et al., 2003). Les auteurs ont mesuré une augmentation du

taux des gangliosides GM1 et GM2, résistants à la Neu3, qui deviennent majoritaires dans

différents tissus. Ils ont également montré que ces deux gangliosides inhibent la phosphorylation du

récepteur à l’insuline in vitro et ont donc suggéré que la surexpression de la sialidase Neu3 inhibe la

signalisation de l’insuline au moins en partie via une accumulation de GM1 et GM2.

96

MATERIEL ET METHODES

97

I. CULTURES CELLULAIRES

Les expériences ont été menées sur des cultures primaires et non des lignées de péricytes rétiniens

et de cellules mésangiales rénales afin d'être le plus proche possible de la physiologie des cellules

natives. Pour éviter toute dégénérescence, les cellules ont de plus été utilisées pendant un nombre

de passages restreint (P2 pour les BRP, P5-P15 pour les RMC). Cependant, une limitation de ces

modèles tient au fait que la croissance et le renouvellement des péricytes et des cellules mésangiales

dans les microvaisseaux in vivo est très faible. Ces choix ne permettent pas de cultiver des cellules

en grande quantité et nécessitent, surtout pour les péricytes, des mises en culture très fréquentes.

D’autre part, ceci amène une certaine hétérogénéité entre les expériences, en particulier dans le cas

des péricytes rétiniens, pour lesquels les cellules étaient issues à chaque préparation de bœufs

différents.

1. PERICYTES RETINIENS DE BŒUF Les péricytes rétiniens sont obtenus à partir des microvaisseaux issus de rétine de bœuf.

1.1.Isolement des microvaisseaux et mise en culture

Des yeux de bœuf, fraîchement énucléés, sont obtenus auprès des abattoirs Cibevial (Corbas,

France) et transportés jusqu’au laboratoire sur de la glace. Les yeux sont d’abord nettoyés de tout

tissu attenant et placés dans du tampon PBS froid (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France). Toutes

les manipulations ultérieures s’effectuent à 4 °C et de manière stérile, sous une hotte à flux

laminaire.

Les yeux sont rapidement plongés dans une solution d’éthanol à 70 % puis rincés dans du tampon

HBSS sans Mg2+ ni Ca2+ (Sigma). Ils sont ensuite découpés 5 mm postérieurement à la cornée afin

d’éliminer le cristallin et l’humeur vitrée à l’aide d’une pince fine et de faire apparaître la rétine.

Celle-ci est alors délicatement décollée du globe oculaire, sectionnée au niveau du nerf optique puis

placée dans une boite de Pétri contenant une solution d’HBSS. Cette solution, préparée à partir de

HBSS sans Mg2+ ni Ca2+, contient 10 mM d’HEPES, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de

streptomycine (Sigma). Après 10 min d'oxygénation par un mélange O2/CO2 (95/5, v/v), de la BSA

est ajoutée à une concentration finale de 0,5 % et le pH est ajusté à 7,5 avec quelques gouttes de

NaOH concentré (en suivant le virage de l'indicateur rouge phénol présent dans l'HBSS).

Les rétines sont ensuite débarrassées d’éventuelles cellules pigmentaires contaminantes et placées

98

par lot de deux dans 10 ml de solution HBSS propre. Elles sont découpées aux ciseaux en petits

fragments avant d’être homogénéisées (Dounce 15 ml, piston A) et centrifugées (5 min, 300g). Le

culot, enrichi en microvaiseaux est repris par 5 ml d’une solution enzymatique de collagénase-

dispase. Cette solution, préparée dans du tampon HBSS sans Mg2+ ni Ca2+, contient 1 mg/ml de

collagénase-dispase (Boehringer-Mannheim), 10 mM d’HEPES, 100 U/ml de pénicilline et 100

µg/ml de streptomycine. Son pH est ajusté à 7,4 après 10 minutes d’oxygénation et avant addition

de TLCK (147 ng/ml) et de DNAse (200 U/ml) (Sigma). La digestion enzymatique s’effectue à 37

°C pendant 20 minutes sous agitation douce. Les homogénats de rétines sont régulièrement

resuspendus par retournement des tubes afin de disperser les agrégats.

La suspension est ensuite passée sur un filtre de porosité 40 µm. Les fragments de microvaisseaux

retenus sur le filtre sont récupérés dans 10 ml de solution HBSS puis centrifugés (5 min, 300 g). Le

culot est repris dans 3 ml de milieu de culture pour péricytes, c'est à dire du DMEM (Sigma)

contenant 10 % de SVF (Gibco, Invitrogen Corporation, N.Y., USA), 2 mM de glutamine, 100

U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Les fragments de microvaisseaux sont enfin

ensemencés dans une boite de Pétri de 6 cm de diamètre "coatée" avec de la fibronectine

(incubation préalable des boites avec 1,5 ml d'une solution de fibronectine à 57 µg/ml dans du

DMEM pendant 1 à 2 heures à 37°C). Après ensemencement, les boites sont placées dans un

incubateur à 37 °C sous atmosphère humide contrôlée contenant 5 % de CO2. Après environ 4

heures d’incubation, le milieu contenant les débris de microvaisseaux n’ayant pas adhéré à la

matrice est éliminé et remplacé par 3 ml de milieu de culture frais. La croissance des péricytes hors

des microvaisseaux apparaît au bout de 48 heures (Figure 28A). Le milieu de culture est remplacé

tous les deux jours et les cellules atteignent la confluence en une dizaine de jours.

A BA B

Figure 28 : croissance des péricytes depuis un microvaisseau rétinien (A)

Péricytes rétiniens (B)

99

Les pericytes se présentent sous la forme de cellules polygonales irrégulières, avec émission de

pseudopodes et croissant de manière non jointive (Figure 28B). Ces cellules ont été caractérisées au

laboratoire par étude de leur morphologie en microscopie à contraste de phase, et par

immunodétection à l'aide d'un anticorps anti-α1-actine et d'un anticorps 3G5 spécifique des

péricytes (Nayak R.C. et al., 1988). Cette technique permet d’obtenir des cultures d’une pureté

proche de 100 %, de manière reproductible (Lecomte M. et al., 1996).

1.2.Passages et traitements

• Une fois la culture arrivée à confluence, les cellules sont rincées 2 fois avec 3 ml de PBS puis

trypsinées pendant environ 5 minutes à 37 °C par 1 ml d’une solution de trypsine à 0,5 % contenant

0,2 % d’EDTA (Sigma). Quand les cellules commencent à se décoller, la trypsine est inactivée par

2 ml de PBS contenant 10 % de SVF. Les cellules sont alors récupérées puis centrifugées pendant 3

min à 300g. Elles sont ensuite réensemencées dans un rapport 1:3 (1 boite 6 cm passée dans une

boite 10 cm) dans des boites "coatées" avec de la fibronectine.

• Les cellules sont cultivées jusqu'au deuxième passage (P2), passage pendant lequel elles sont

utilisées et traitées pour les différentes expériences.

2. CELLULES MESANGIALES RENALES DE RAT Les cellules mésangiales rénales sont obtenues à partir de glomérules rénaux de jeunes rats mâles

Wistar (Charles River, L'Arbresle, France).

2.1.Isolement des glomérules et mise en culture

Les glomérules rénaux sont isolés par une technique de tamisage différentiel.

Le rat est euthanasié au CO2 puis les manipulations ultérieures s’effectuent de manière stérile, sous

une hotte à flux laminaire. L'abdomen du rat est tout d'abord nettoyé à l'aide d'une compresse

imbibée d'éthanol 70 % puis ouvert pour prélever les reins. Ceux-ci sont rapidement plongés dans

une solution d’éthanol à 70 % puis rincés dans du tampon HBSS sans Mg2+ ni Ca2+. Les reins sont

alors nettoyés en enlevant le tissu conjonctif et la capsule fibro-adipeuse qui les entoure. Ils sont

ensuite de nouveau rincés dans du HBSS et le cortex est prélevé à l'aide d'un scalpel.

Le cortex est découpé en fragments avant d'être broyé à l'aide d'un piston sur un tamis de type mesh

60 (230 µm). Le tamis est ensuite rincé avec environ 50 ml de solution d'HBSS (identique à celle

utilisée pour l'isolement de microvaisseaux rétiniens). Le filtrat obtenu est récupéré et passé sur un

deuxième tamis, de type mesh 200 (73,7 µm). Il est de nouveau broyé avec un piston et le tamis est

rincé avec 50 ml de solution d'HBSS. Le filtrat est récupéré et passé sur un tamis de type Falcon 70

100

µm. Le rétentat est récupéré en rinçant le filtre avec environ 15 ml de solution d'HBSS.

Le rétentat ainsi obtenu, enrichi en glomérules, est centrifugé 10 min à 300g. Le culot est repris

dans du milieu de culture contenant du DMEM, 20 % de SVF, 2 mM de glutamine, 100 U/ml de

pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine et ensemencé dans des boîtes de Pétri préalablement

"coatées" avec de la fibronectine (les glomérules obtenus à partir de 2 reins sont ensemencés dans 4

boîtes de 6 cm ). Après ensemencement, les boîtes sont placées dans un incubateur à 37°C sous

atmosphère humide contrôlée contenant 5 % de CO2. Après environ 3-4 jours de période

d'adhésion, le milieu contenant les glomérules n’ayant pas adhéré à la matrice est éliminé et

remplacé par du milieu de culture frais. Les cellules mésangiales poussent hors du glomérule après

environ 3 semaines (Figure 29A), après les cellules endothéliales qui sont progressivement

éliminées. Le milieu de culture des cellules mésangiales, c'est à dire du DMEM contenant 15 % de

SVF, 2 mM de glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine est alors remplacé

tous les deux jours.

A BA B

Figure 29 : croissance des cellules mésangiales à partir d'un glomérule rénal (A)

Cellules mésangiales (B)

Les cellules mésangiales sont identifiés sur la base de critères morphologiques (cellules irrégulières

prenant une forme allongée à confluence, Figure 29B) et par immunodétection, absence de

marquage pour le facteur VIII et la cytokératine et marquage du cytosquelette très important pour

l'actine.

101

2.2.Passages et traitements

• Une fois la culture arrivée à confluence, les cellules sont rincées 2 fois avec 3 ml de PBS puis

trypsinées par incubation avec 1 ml d'une solution de trypsine à 0,5 % contenant 0,2 % d’EDTA

pendant environ 5 minutes à 37 °C. Quand les cellules commencent à se décoller, l'action de la

trypsine est inactivée par ajout de 2 ml de PBS contenant 10 % de SVF. Les cellules sont alors

récupérées puis centrifugées pendant 3 min à 300g. Elles sont ensuite filtrées sur un tamis Falcon de

40 µm afin d'éliminer les glomérules et débris, puis réensemencées dans un rapport 1:5 dans des

boites préalablement "coatées" avec de la fibronectine. Les cellules sont cultivées pendant 5

passages avant d'être utilisées pour les expériences, afin de se débarrasser des glomérules et des

cellules endothéliales contaminantes et jusqu'àu 15ème passage pour éviter toute dégénérescence.

Les cellules mésangiale sont donc utilisées et traitées pour les expériences entre P5 et P15.

• Les cellules mésangiales peuvent être congelées après collecte par trypsination, dans un milieu

de culture contenant 20 % de SVF et 5 % de DMSO, dans l'azote liquide. La décongélation doit être

rapide et les cellules rincées avant d'être réensemencées.

II. TRAITEMENT DES CELLULES

1. LES AGE Les effets des AGE in vivo sont difficiles à reproduire in vitro car les AGE représentent un

ensemble complexe et hétérogène de molécules tant par la variété des produits d’Amadori et des

dicarbonyles que par celle des protéines impliquées dans les différentes réactions menant à leur

formation.

Dans cette étude, nous avons choisi de former des AGE à partir de l’incubation du méthylglyoxal et

d’albumine de sérum de bœuf car un certain nombre de travaux permettent de penser que les AGE

dérivés du méthylglyoxal, carboxyéthyllysine ou MOLD, sont des produits majeurs observés lors

du diabète. Tout d’abord, il a été montré que le méthylglyoxal est augmenté dans le sang de patients

diabétiques (McLellan A.C. et al., 1994). Ce dicarbonyle peut être formé de différentes manières :

décomposition des intermédiaires trioses phosphate, dégradation oxydative des sucres ou des

lipides, dégradation des bases de Schiff ou produits d’Amadori (Degenhardt T.P. et al., 1998; Singh

R. et al., 2001). Degenhardt et al. ont décrit MOLD et GOLD, AGE respectivement issus du

méthylglyoxal et du glyoxal, comme les modifications chimiques majeures observées dans les

102

protéines tissulaires de patients diabétiques, à des concentrations 10 à 50 fois supérieures à la

pentosidine par exemple (Degenhardt T.P. et al., 1998). De plus, une augmentation des

concentrations des AGE dérivés du méthylglyoxal, notamment la carboxyéthyl-lysine, a été

mesurée dans la rétine et les glomérules rénaux de rats STZ (Karachalias N. et al., 2003).

1.1.Préparation des AGE

Les AGE méthylglyoxal sont obtenus en incubant 7,2 mg/ml de BSA avec 100 mM de

méthylglyoxal (concentrations finales) pendant 50 h à 37 °C. Cette concentration de méthylglyoxal

a déjà été décrite pour induire des modifications sur les résidus arginine et lysine de la BSA et

conduire à la formation de différents AGE (Westwood M.E. et al., 1994). La solution de "BSA

contrôle" est obtenue en incubant de l’albumine dans les mêmes conditions mais sans

méthylglyoxal. Afin d’éliminer les sels et le méthylglyoxal libre n’ayant pas réagi, les solutions

d'AGE et de BSA contrôle sont ensuite filtrées sur colonnes de Sephadex G-25 M (colonnes PD10,

Amersham Pharmacia Biotech) et éluées par du DMEM selon les indications du fabricant. Les

solutions sont enfin stérilisées (filtre Acrodisc 0,2 µm) et aliquotées pour être conservées à –20 °C

jusqu’à utilisation.

1.2.Traitement

Dans le but d'étudier les effets à long terme d'une exposition des cellules à l'environnement

diabétique, les péricytes et les cellules mésangiales sont traités de manière chronique durant un

passage entier soit respectivement 7 et 4 jours, avec une concentration finale de 3 µM d’AGE ou de

BSA-contrôle.

2. LA GLUCOSAMINE La glucosamine exogène est rapidement captée par les cellules via les transporteurs au glucose et

phosphorylée par l'hexokinase en glucosamine-6-P, entrant ainsi sélectivement dans la voie de

l'hexosamine juste an aval de l'enzyme limitante GFAT (Schleicher E.D. et al., 2000). Pour ces

raisons, la glucosamine est utilisée expérimentalement pour mimer une suractivation de la voie de

l'hexosamine.

• Afin d'étudier les effets à long terme d'une exposition des cellules à l'environnement diabétique,

les péricytes et les cellules mésangiales sont cultivées pendant un passage entier, soit

respectivement 7 et 4 jours, en présence de 2 ou 5 mM de glucosamine (Sigma), concentrations

finales.

• Les cellules mésangiales ont également été traitées pendant un temps plus court (48 heures)

103

et avec des concentrations plus faibles (0,5 mM) afin d'étudier des mécanismes d'action spécifiques

de la glucosamine.

3. GANGLIOSIDES EXOGENES Les gangliosides, ainsi que leurs précurseurs non sialylés, Glucosylcéramide et Lactosylcéramide

(Matreya, Biovalley, Marne la Vallée, France), utilisés comme contrôles, sont utilisés sous forme de

complexe avec la BSA afin de faciliter leur incorporation dans la cellule. Pour cela, une solution de

DMEM contenant 10 mM d'Hepes, pH 7,4 et 0,34 mg/ml de BSA délipidée est préparée puis

stérilisée par filtration. Après évaporation du solvant chloroforme/méthanol 2:1, les gangliosides

sont repris dans cette solution selon un rapport 1:1 avec la BSA.

Pour déterminer les effets des gangliosides exogènes sur la prolifération des BRP et des RMC, les

cellules sont cultivées en plaque 96 puits en présence de concentrations croissantes (10-100 µM) de

ces complexes glycolipides- BSA pendant un passage.

Dans le cas de l'étude des effets des gangliosides GM2 et GM1 sur l'hypertrophie et le cycle

cellulaire des cellules mésangiales, les cellules sont cultivées dans des boites de Pétri de 10 cm en

présence de 60 µM de ces complexes glycolipides-BSA, pendant 48 heures.

L'ajout exogène de gangliosides est une technique largement utilisée pour déterminer leur rôle

notamment dans la régulation de la prolifération cellulaire. Cependant, il semble que seule une

petite partie de ces gangliosides exogènes s'incorpore effectivement dans la membrane plasmique

(Bremer E.G. et al., 1984). De plus, les espèces de gangliosides exogènes apportées peuvent

potentiellement être métabolisées au sein de la cellule en d'autres gangliosides plus ou moins

complexes si bien qu'il est délicat d'attribuer les effets à une espèce de ganglioside en particulier.

4. ANTICORPS ANTI-GANGLIOSIDES Des anticorps ont été utilisés pour bloquer l'effet potentiel des gangliosides de la série-a. Les

cellules sont cultivées en plaque de 96 puits, en présence de 0,5 µg par puits d’anticorps

monoclonal anti-GM3 (Cosmobio), ou de 5 µg par puits d'anticorps polyclonal anti-GM2

(Calbiochem), anti-GM1 (Matreya) ou d’IgG de lapin utilisée comme contrôle.

5. PPMP Le DL-threo-1-Phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-propanol ou PPMP (Sigma) est un

104

inhibiteur de glucosylcéramide synthase utilisé pour bloquer la biosynthèse des gangliosides. Les

cellules, cultivées en plaque 96 puits sont exposées pendant un passage à des doses croissantes de

PPMP en solution dans du DMSO (0,1-1 µM). Cet inhibiteur n'est pas utilisé à des doses

supérieures à 1 µM car il cause des altérations morphologiques et risque d'avoir des effets toxiques.

Le DMSO seul est utilisé comme contrôle.

III. TRANSFECTION DES CELLULES AVEC LES SiRNA

Dans les cellules mésangiales, la technique dite de "RNA interference" ou RNAi a été utilisée pour

inhiber l’activité de la GM3 synthase. Cette technique consiste à introduire dans la cellule de petits

fragments d'ARN ou SiRNA pour "small interfering RNA" qui vont se lier au fragment d'ARN

cellulaire complémentaire pour entraîner sa dégradation (Figure 30).

Membrane plasmique

Agent de transfection

(Oligofectamine)

Membrane plasmique

Agent de transfection

(Oligofectamine)

Figure 30 : mécanisme de l'interférence ARN

(d'après http://www.ambion.com/techlib/append/RNAi_mechanism.html)

105

• Préparation des SiRNA : les SiRNA ont été designés contre la séquence ADNc du gène de la

GM3 synthase de rat. La séquence antisens utilisée était la suivante :

GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt (Ambion, Huntingdon, UK). Les SiRNA sont tout d'abord

repris dans de l'eau ultrapure sans RNAse pour obtenir une solution stock à 20 µM. Les conditions

de transfection sont les suivantes, données à titre d'exemple pour un puits de plaque 6 puits et une

concentration finale de transfection de 400 nM :

500 µl800 µl11 µl4 µl165 µl20 µl

Milieu de culture 3X

DMEMOpti-MEMAgent de transfection

Oligofectamine (Invitrogen

Corporation)

Opti-MEMSolution stock d’oligonucléotide

(20 µM)

185 µl : 5-10 min à température ambiante

Dilution des SiRNA

15 µl : 5-10 min à température ambiante

Dilution de l’Oligofectamine

200 µl : 15-20 min à température ambiante

Homogénéisation douce SiRNA + agent de transfection

1 ml : 4h à 37 °Ctransfection

culture

500 µl800 µl11 µl4 µl165 µl20 µl

Milieu de culture 3X

DMEMOpti-MEMAgent de transfection

Oligofectamine (Invitrogen

Corporation)

Opti-MEMSolution stock d’oligonucléotide

(20 µM)

185 µl : 5-10 min à température ambiante

Dilution des SiRNA

15 µl : 5-10 min à température ambiante

Dilution de l’Oligofectamine

200 µl : 15-20 min à température ambiante

Homogénéisation douce SiRNA + agent de transfection

1 ml : 4h à 37 °Ctransfection

culture

• Transfection des cellules : les cellules sont transfectées dans des plaques 6 puits à environ 30 %

de confluence afin d'optimiser le rendement de transfection sans pour autant atteindre la confluence

au terme de la période de traitement. Elles sont tout d'abord rincées avec du DMEM puis les 200 µl

de la solution de SiRNA combiné à l'agent de transfection sont ajoutés dans le puits avec 800 µl de

DMEM, soit un volume final de transfection de 1 ml. Les cellules sont placées dans l'incubateur

pendant 4 heures à 37 °C. A l'issue de l'incubation, 500 µl de milieu 3X sont rajoutés dans le puits.

Ce milieu de culture ne contient pas d'agents anti-bactériens (pénicilline/streptomycine) qui pourrait

perturber la transfection. L'activité GM3 synthase est mesurée 72 h après la transfection.

Alternativement, les cellules sont traitées avec 3 µM de BSA ou AGE, 24 h après la transfection et

106

la prolifération est évaluée au bout de 3 jours.

IV. ANIMAUX DIABETIQUES

Les souris diabétiques db/db et leur contrôle db/m (Charles River) sont sacrifiées par décapitation

après euthanasie à l'isoflurane (Minerve). Les reins sont ensuite prélevés, nettoyés et le cortex est

prélevé. Les fragments de cortex sont ensuite disséqués et homogénéisés mécaniquement à l'aide

d'un Potter de 7 ml (verre/téflon) dans un tampon composé d'Hepes 25 mM, d'EDTA 1 mM, de

Triton 0,1 % et de 10 µl/ml de cocktail d'inhibiteurs de protéases.

V. ANALYSE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE

Plusieurs techniques ont été utilisées pour étudier la prolifération des péricytes et des cellules

mésangiales en réponse à différents traitements.

1. COMPTAGE DES CELLULES Les cellules sont tout d’abord collectées par trypsination. Le culot est rincé 2 fois dans du PBS puis

repris dans un volume donné de ce tampon (environ 1 ml pour 105 cellules). Une aliquote de 10 µl

est prélevée et ajoutée à 10 µl de bleu trypan. 10 µl de ce mélange sont alors utilisés pour compter

les cellules dans une chambre hématimétrique.

2. DOSAGE DES PROTEINES

• Après collecte par trypsination, le culot de cellules est rincé 2 fois avec du PBS et repris dans

un volume donné de ce tampon (environ 1 ml pour 105 cellules). Uns aliquote de 10 µl est alors

prélevés et ajoutés à 50 µl de tampon de lyse contenant 0,1 N de NaOH et 0,05 % de triton X100.

Les cellules sont lysées à 4 °C pendant une nuit. Une gamme étalon de 0 à 12 µg de BSA est

107

réalisée dans 50 µl de tampon de lyse. Les protéines ont ensuite été dosées par la technique

colorimétrique de Bradford (Compton S.J. et al., 1985). Le volume de lysat est ajusté à 800 µl avec

de l’eau ultrapure et 200 µl de réactif Bio-Rad sont ajoutés. 200 µl de la solution sont transférés

dans une plaque de 96 puits et l’absorption est lue à 620 nm. La quantification est faite par rapport à

la gamme étalon à l’aide du logiciel Biolise.

• Pour les expériences menées en plaque de 96 puits, la technique de dosage des protéines BCA

(Pierce) a été utilisée pour doser les protéines directement dans les puits, sans collecte préalable des

cellules. Les cellules sont tout d’abord rincées 3 fois par du PBS froid puis lysées pendant 30

minutes sous agitation à 37 °C dans 50 µl de tampon de lyse RIPA contenant 1 % de NP40, 0,5 %

de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 10 µl/ml de cocktail d’inhibiteurs de protéases et du

PBS 10 mM. Les cellules lysées sont ensuite incubées avec 200 µl par puits de réactif de Pierce

reconstitué selon les recommandations du fournisseur, pendant 30 min sous agitation à 37 °C.

L’absorption est mesurée à 562 nm et la quantification est faite par rapport à la gamme étalon (de 0

à 15 µg de BSA par puits) à l’aide du logiciel Biolise. Pour les expériences menées dans les plaques

de 6 puits, 600 µl de tampon de lyse sont ajoutés dans les puits et 50 µl de lysats sont utilisés pour

le dosage des protéines selon le même protocole. Etant donné que la quantité totale de protéines

était corrélée au nombre de cellules, le dosage de protéines a été utilisé, dans certaines expériences

notamment celles menées en puits, pour estimer la prolifération cellulaire à la place du comptage

des cellules pour des raisons de praticité.

3. MESURE DES QUANTITES D'ADN La technique du CyQuant a été utilisée pour mesurer les quantités d'ADN. Les cellules sont

ensemencées dans des plaques de 96 puits à fond blanc de type Optilux. A la fin de la période de

traitement, les cellules sont rincées 3 fois avec du PBS froid. La plaque de 96 puits est alors placée

à –70 °C pour faire éclater les cellules et faciliter l'entrée du composé de marquage fluorescent. Une

fois la plaque revenue à température ambiante, 200 µl de réactif, reconstitué selon les

recommandations du fabricant, sont ajoutés à chaque puits. Les cellules sont ensuite incubées

pendant 1 heure à température ambiante. La plaque est enfin agitée 2 min avant de mesurer la

fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 480 nm et une longueur d'onde d'émission à 520

nm.

108

4. ANALYSE DU CYCLE CELLULAIRE Après collecte des cellules par trypsination et rinçages avec du PBS, le culot de cellules est

resuspendu avec soin dans du PBS (environ 75 µl pour 106 cellules) et les cellules sont fixées en

ajoutant goutte à goutte de l’éthanol 100 % à -20 °C de manière à ce qu’il soit à 70 % au final. Le

mélange doit être "vortexé" tout au long de la fixation à l’éthanol. Les cellules sont incubées dans

cette solution d’éthanol pendant une nuit à 4 °C. Elles sont ensuite rincées en remplissant les tubes

de PBS et centrifugées 5-10 min, 300g à 4 °C. Le culot est ensuite repris dans 100 µl de RNAse à 1

mg/ml et incubé pendant 10-30 min afin que seul l’ADN soit analysé par la suite, puis 400 µl de

PBS sont ajoutés. Environ 30 min avant l’analyse, l’ADN des cellules est marqué par ajout de 10 µl

d’iodure de propidium à 2 mg/ml qui s’intercale au niveau de l’ADN. Le cycle cellulaire est enfin

analysé par cytométrie en flux à l’aide d’un FACSCAN et du logiciel CellQuest (Becton Dickinson,

Franklin Lakes, N.J., USA).

5. MESURE DE L’EXPRESSION DES PROTEINES INHIBITRICES DU CYCLE

CELLULAIRE A la fin de la période de traitement, les cellules sont rincées avec du PBS puis incubées pendant 20

min à 4 °C avec du tampon de lyse RIPA. Les cellules sont alors collectées par grattage et le

matériel insoluble est éliminé par centrifugation à 10,000g pendant 5 min à 4 °C. Les protéines du

surnageant sont ensuite dosées et utilisées pur réaliser l'essai. Une quantité égale de protéines de

chaque échantillon est chauffé à 100 °C pendant 5 min en présence d'un tampon Laemli afin de

dénaturer les protéines. Les échantillons ainsi préparés sont ensuite déposés sur un gel SDS-

polyacrylamide 12 % avec un standard de poids moléculaire et les protéines sont séparées par

électrophorèse à 100 V. Elles sont ensuite transférées sur une membrane PVDF à 80 V pendant 30

min.

La membrane PVDF est bloquée dans du PBS-Tween (PBST) contenant 5 % de lait pendant 30 min

puis incubée avec l'anticorps primaire pendant 1 heure à température ambiante. Les anticorps

primaires monoclonaux sont préparés dans une solution de PBST 5 % BSA à 1 µg/ml pour

p21Waf1/Cip1 et à 1:2000 pour p27Kip1 (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France). La membrane est

rincée 3 fois 10 min dans du PBST-BSA 5 % puis incubée pendant 45 min avec l'anticorps

secondaire anti-souris couplée à la peroxydase (Calbiochem) à une dilution de 1:2000. Après

rinçages, le signal est visualisé par chimioluminescence. La membrane est ensuite révélée avec un

anticorps anti-β actine afin de contrôler l'équivalence du dépôt et du transfert des protéines de

chaque échantillon. Pour cela, après plusieurs rinçages, la membrane PVDF est de nouveau bloquée

109

dans le PBST-BSA 5 % pendant plusieurs heures puis incubée avec un anticorps primaire anti-β

actine 1:5000 dans la solution de blocage pendant 1 heure. Après rinçages, l'anticorps secondaire est

ajouté pendant 45 min et le signal est révélé de même par chimioluminescence. Le signal est

quantifié par densitométrie à l'aide d'une caméra Image Master VDS-CL et du logiciel Image Quant

(Amersham Pharmacia Biotech). Les résultats obtenus pour l'expression de p21Waf1/Cip1 et p27Kip1

sont corrigés par le signal de la β actine pour chaque échantillon.

VI. ANALYSE DES GANGLIOSIDES

1. MARQUAGE METABOLIQUE Le marquage métabolique des gangliosides cellulaires est réalisé avec du galactose marqué au 14C.

Cet ose a été choisi car il est rapidement incorporé et métabolisé par la cellule et est présent, ainsi

que ses métabolites comme le glucose, dans tous les gangliosides, permettant ainsi un marquage

efficace et global. La veille de la collecte des cellules, 0,2 µCi/ml, ou 1 µCi/ml pour les expériences

nécessitant un marquage à plus forte activité spécifique, de 14C-[U]-galactose (329,5 mCi/mmol)

(PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) est ajouté au milieu de culture. Les cellules sont ainsi

incubées pendant 16 heures.

2. EXTRACTION, PURIFICATION, SEPARATION ET DETECTION DES GANGLIOSIDES

2.1.Extraction et séparation des gangliosides

Au terme de la période de traitement et de marquage métabolique, les cellules sont récupérées par

trypsination, rincées avec du PBS et centrifugées pendant 5 min à 300g. Le culot est ensuite repris

dans 2 ml de chloroforme/méthanol (1:1, v/v) et 1 µg de GT1b est ajouté à chaque échantillon. Ce

ganglioside, absent du profil des péricytes et des cellules mésangiales, est utilisé comme standard

interne. Les tubes sont vigoureusement "vortexés" et l'extraction des lipides se poursuit pendant une

nuit à 4°C. Les tubes sont alors centrifugés (1000 g, 5min) et le solvant contenant les lipides totaux

est récupéré. Le culot est ré-extrait deux fois par 1 ml du même mélange de solvant. Les phases

organiques sont rassemblées et évaporées à sec sous un flux d'azote. Le résidu est repris dans 3 ml

110

de chloroforme/méthanol (1:1, v/v), auxquels est ajouté 1 ml de PBS 1 mM. Les tubes sont

"vortexés" et les phases sont séparées par centrifugation (1000 g, 5min). La phase supérieure

contenant les gangliosides est récupérée et la phase inférieure est ré-extraite deux fois par 2 ml de

méthanol/PBS 1 mM (1:1, v/v). Les trois phases supérieures sont rassemblées et évaporées sous

flux d'azote. Les gangliosides sont repris dans 2 ml de méthanol/PBS 10 mM (1:1, v/v) pour être

déposés sur une colonne de silice C18 (Waters Corporation, Milford, MA), lavée par du méthanol et

équilibrée dans du méthanol/PBS 10 mM (1:1, v/v). Tous les composants polaires, tels que les sels

et les sucres sont éliminés par 10 ml d'eau. Les gangliosides sont ensuite élués par 6ml de méthanol

et 4ml de chloroforme/méthanol (2:1, v/v). Le solvant est évaporé et les gangliosides purifiés sont

repris dans un petit volume de chloroforme/méthanol (2:1, v/v) (30 µl) pour être déposés sur une

plaque HPTLC (gel de silice 60, épaisseur 0,2 mm, support plaque en verre). Le dépôt est réalisé

par un déposeur automatique de plaque (Automatic TLC Sampler III) à l'aide du logiciel Wincats

(Camag). Des standards commerciaux de gangliosides sont également déposés sur la plaque. Les

gangliosides sont enfin séparés par migration sur la plaque HPTLC dans un mélange de

chloroforme/méthanol/CaCl2 0,2% (55:45:10, v/v/v).

Alternativement, une autre technique d'extraction est utilisée pour extraire les gangliosides du

cortex rénal, plus longue mais permettant une meilleure purification à partir de tissus (Dreyfus H. et

al., 1997). Les lipides totaux des homogénats de cortex sont tout d'abord extraits 3 fois avec 6 ml de

chloroforme/méthanol 1:1 puis repris dans du chloroforme après évaporation du solvant. Les

différentes classes lipidiques sont ensuite séparées par chromatographie sur une colonne de silice 60

(Merck) équilibrée dans du chloroforme. 12 ml de chloroforme permettent d'éluer les lipides neutres

puis 1,5 ml de chloroforme : méthanol : acétone: acide acétique : eau (52:8:8:18:4, par volume)

suivi de 8 ml de chloroforme : méthanol (4:1, v/v) permettent d'éluer les phospholipides et

sphingolipides. Enfin, les gangliosides sont élués avec 2,5 ml de chloroforme : méthanol (2:3, v/v),

2,5 ml de chloroforme : méthanol : eau (65:25:4, v/v/v), 2,5 ml de chloroforme : méthanol : eau

(60:35:8, v/v/v) puis 2,5 ml de chloroforme : méthanol : eau (48:35:10, v/v/v). Le solvant est

évaporé et les gangliosides sont repris afin d'être déposés sur plaque HPTLC et séparés par

migration.

2.2.Révélation et identification des gangliosides

Les gangliosides ainsi séparés sont alors révélés par deux techniques : autoradiographie et

révélation colorimétrique. Les plaques sont tout d'abord placées au contact d'un écran de type

Phosphoscreen pendant 2 jours. L'écran impressionné est ensuite lu à l'aide d'un Storm 820

(Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). D'autre part, la plaque

HPTLC est vaporisée avec un mélange de résorcinol/HCl/Cu2+ (10 ml de résorcinol à 1,5 % (w/v

111

dans de l'eau), 0,15 ml de sulfate de cuivre 1 %, 15 ml d'acide chlorhydrique concentré et 25 ml

d'eau) (Schnaar R.L. et al., 1994). Celle-ci est ensuite couverte par une plaque en verre et chauffée à

125 °C pendant 20 minutes. Les gangliosides apparaissent alors en bleu-violet sur la plaque

HPTLC. Le résorcinol, en présence de Cu2+, possède en effet la particularité de colorer

spécifiquement les acides sialiques en bleu-violet (SVENNERHOLM L., 1957). Les gangliosides

sont identifiés par comigration avec un standard et les quantifications sont faites par densitométrie

avec une caméra VDS et le logiciel Image Quant. Les valeurs sont rapportées à la quantité de

protéines de chaque échantillon et corrigées par quantification du standard interne.

La révélation colorimétrique par le résorcinol (Figure 31B) reflète la quantité absolue de chaque

ganglioside présent dans l'échantillon, qui peut alors être déterminée par utilisation d'un standard.

Par contre, le marquage métabolique des gangliosides par le 14C galactose et la révélation par

autoradiographie (Figure 31A) ne permet pas la détermination de la masse de chaque composé mais

plutôt la quantité du composé synthétisée pendant la période de marquage alors qu'elle est plus

sensible que le résorcinol et permet donc de visualiser des espèces de gangliosides même

minoritaires. Cette différence d'interprétation peut expliquer les variations parfois observées entre

les résultats obtenus par révélation colorimétrique et par marquage radioactif.

A B

origine

standards

standard interne (GT1b)

standards

A B

origine

standards

standard interne (GT1b)

standardsstandards

standard interne (GT1b)

standards

Figure 31 : Exemple de plaque HPTLC révélée par autoradiographie (A) puis par révélation colorimétrique au

résorcinol (B)

Les gangliosides GM2 et GM1 étant absents dans les RMC à l’état basal et apparaissant en

réponse à un traitement à la glucosamine, nous avons voulu confirmer leur identité. Nous avons tout

d’abord essayé d’identifier ces gangliosides par spectrométrie de masse suite à une séparation par

112

HPLC en utilisant une colonne LiChrosorb-NH2 par élution avec des gradients de mélanges

acétonitrile/tampon phosphate. Cependant, des problèmes de quantité de matériel et de pureté

d’échantillon n’ont pas permis d’obtenir des résultats concluants. L'identité du GM2 et du GM1 a

alors été confirmée par immunocytochimie en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre GM2

(don généreux du Dr J. Portoukalian) et la sous-unité β de la toxine cholérique, spécifique du GM1.

• Les gangliosides des cellules mésangiales traitées ou non avec 5 mM de glucosamine sont

déposés en double de façon identique sur une plaque HPTLC à support en aluminium (Merck).

Après la séparation des gangliosides par migration, la plaque est découpée en deux aux ciseaux

pour donner deux parties identiques. Une partie est révélée par pulvérisation au résorcinol alors que

l'autre est utilisée pour l'immnuodétection. Celle-ci est tout d'abord rapidement immergée dans une

solution de polyisobutylmétacrylate à 0,4 % dans l'hexane afin de fixer la silice. La plaque est

ensuite bloquée dans du PBS-BSA 1 % pendant 2 heures puis incubée à température ambiante avec

l'anticorps primaire anti-GM2. Après rinçage, la plaque est incubée avec un anticorps secondaire

biotinylé pendant 1 heure puis un complexe streptavidine-peroxydase est ajouté après rinçage. Au

bout de 45 min, le signal peroxydase est visualisé avec une solution préparée en dissolvant 2 mg de

4-chloronaphtol dans 3 ml de méthanol, 7 ml de tampon et 5 µl de H2O2 à 30 %. Comme le montre

la Figure 32, cette expérience nous a permit de confirmer l'identité du GM2, en comparant les

parties de plaque révélées au résorcinol et par immunodétection.

Immunodétection (anticorps anti-GM2) révélation au résorcinol

GM2 standard

GM2 échantillon

Glucosamine (mM)0 50 5

GM2 standard

Immunodétection (anticorps anti-GM2) révélation au résorcinol

GM2 standard

GM2 échantillon

Glucosamine (mM)0 50 5

GM2 standard

Figure 32 : immunuodétection du GM2

113

• Les gangliosides des cellules mésangiales traitées ou non avec 5 mM de glucosamine,

marqués métaboliquement, sont séparés par migration sur une plaque HPTLC. La plaque est tout

d'abord révélé par autoradiographie. Elle est ensuite rapidement plongée dans un bain de PBS-acidé

actéique 0,5 % afin de fixer la silice puis rincée dans le PBS. Elle est ensuite bloquée dans du PBS-

BSA 2 % pendant 30 min puis incubée pendant une nuit à 4 °C et à l'obscurité avec la sous-unité B

de la toxine cholérique fluorescente (2,5 µg/ml dans la solution de blocage) (Molecular Probes). Le

signal est révélé par lecture sous UV à l'aide d'une caméra VDS. Cette manipulation nous a permis

de confirmer l'identité du GM1, comme le montre la Figure 33.

Plaque révélée à la choleratoxine Plaque autoradiographiée

Glucosamine (mM)0 50 5

GM1 standard

GM1 échantillon

Plaque révélée à la choleratoxine Plaque autoradiographiée

Glucosamine (mM)0 50 5

GM1 standard

GM1 échantillon

Figure 33 : détection du GM1 par la toxine cholérique

3. DOSAGE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES Au terme de la période de traitement, les cellules sont rincées avec du PBS puis incubées pendant

20 min à 4 °C avec du tampon de lyse (50 µl pour une boîte de 10 cm) composé de cacodylate de

sodium 20 mM pH 6,6, de 0,2 % de Triton X-100, 1 mM EDTA et 10 µl/ml de cocktail

d'inhibiteurs de protéases. A l'issue de la lyse, les cellules sont collectées par grattage. 4 boîtes de

péricytes (~2-3 × 106 cellules) ou 3 boîtes de cellules mésangiales (~3-6 × 106 cellules) sont

combinées. Les lysats cellulaires sont centrifugés à 10,000g pendant 5 min à 4 °C et les protéines du

surnageant sont dosées et utilisées pour mesurer les activités enzymatiques.

Alternativement, les homogénats de cortex sont centrifugés à 1000g pendant 5 min à 4 °C et les

protéines sont dosées sur le surnageant.

Des quantités égales de protéines de chaque échantillon sont utilisées pour l'essai (environ 500 µg

pour les homogénats cellulaires et 200-400 µg pour les homogénats de cortex).

114

Les activités des sialyltranséfrases GM3 synthase et GD3 synthase sont déterminées grâce à

l'incorporation d'acide N-acétyl neuraminique marqué au 14C (CMP-[14C]-NeuAc) sur un substrat

accepteur. Celui-ci est le CDH (lactosylcéramide) pour le dosage de la GM3 synthase et le GM3

pour le dosage la GD3 synthase. Les activités enzymatiques sont estimées en fonction de la quantité

de produit radioactif formé (Figure 34).

CMP-[14C]-NeuAc CMP

(GM3) (GD3)

Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc

CMP-[14C]-NeuAc CMP

(CDH) (GM3)

Gal Gluc Ceramide Gal Gluc Ceramide[14C]NeuAcGM3 synthase

GD3 synthase

CMP-[14C]-NeuAc CMP

(GM3) (GD3)

Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc Gal Gluc CeramideNeuAc[14C]NeuAc

CMP-[14C]-NeuAc CMP

(CDH) (GM3)

Gal Gluc Ceramide Gal Gluc Ceramide[14C]NeuAcGM3 synthase

GD3 synthase

Figure 34 : principe du dosage des activités enzymatiques GM3 et GD3 synthases

Les échantillons sont mélangés à un volume égal de tampon de réaction contenant en concentrations

finales : 0,1 mM de lactosylcéramide ou de GM3 (Matreya, Biovalley, Marne la Vallée, France)

pour les activités GM3 et GD3 synthase, respectivement, 4 µCi/ml de [sialic-4,5,6,7,8,9-14C]CMP-

acide sialique (325.2 mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences), 100 µM de CMP-acide sialique

(Sigma), 10 mM MgCl2, 0,2 % Triton X-100, et 100 mM de cacodylate de sodium pH 6,6. Les

mélanges réactionnels sont ensuite incubés à 37 °C pendant 150 min sous agitation. La réaction est

stoppée en déposant les échantillons sur une colonne de silice 60 (Merck) préalablement lavée au

méthanol puis équilibrée à l'eau, afin de séparer l'excès de substrats des produits de réaction. Le

substrat n'ayant pas réagi est éliminé avec 4 ml d'eau puis les gangliosides sont élués avec 2 ml de

chloroforme/méthanol (1:1, v/v). Le solvant est évaporé et les gangliosides sont repris dans 30 µl de

chloroforme/méthanol 2:1 puis déposés sur plaque de chromatographie sur couche mince, avec des

standards, pour être séparés par migration dans un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 0,2 %

(55:45:10, v/v/v). La révélation des produits se fait par autoradiographie après impression d'un

écran Phosphoscreen pendant 10 jours. Les gangliosides sont également révélés par pulvérisation de

résorcinol afin d'identifier les bandes par rapport aux standards. Les quantifications sont faites par

115

densitométrie avec le logiciel Image Quant. Les activités enzymatiques sont exprimées en pmoles

de produit formées par heure et par mg de protéines.

VII. ANALYSE STATISTIQUE DES RESULTATS

Les valeurs présentées correspondent aux moyennes ± SEM de n expériences indépendantes.

Dans les études menées sur culture cellulaire, le test non paramétrique pour valeurs appariées de

Wilcoxon a été choisi pour comparer les différences entre groupes. Pour les expériences réalisées

sur les souris, le test t de Student a été utilisé. Les résultats sont jugés statistiquement significatifs

pour p<0,05.

116

RESULTATS-DISCUSSION

117

CONTEXTE ET OBJECTIFS

L'hyperglycémie est à l'origine des complications, notamment microvasculaires, du diabète.

Le glucose exerce ses effets toxiques via un certain nombre de voies biochimiques décrites, dont la

formation des produits avancé de glycation (AGE) et la voie des hexosamines. L'utilisation

d'inhibiteurs de la formation des AGE permet en effet de limiter le développement de la rétinopathie

(Hammes H.P. et al., 1991)et de la néphropathie (Forbes J.M. et al., 2001) chez des animaux

diabétiques. De même l'utilisation d'un inhibiteur de la voie des hexosamines permet de prévenir

par exemple

La prolifération cellulaire est largement affectée au cours du diabète, particulièrement celle des

péricytes au niveau rétinien et celle des cellules mésangiales au niveau rénal.

Par ailleurs, les gangliosides sont connus pour jouer un rôle dans la régulation de la

prolifération cellulaire.

L’objectif de ce travail de thèse a été de déterminer les effets d’un environnement

diabétique sur la prolifération cellulaire et le rôle potentiel des gangliosides dans ces

processus.

La multiplicité des voies par lesquelles l'hyperglycémie peut générer des effets toxiques

amenuise l'efficacité des interventions ciblées contre une seule de ces voies. Dans cette étude,

l’environnement diabétique a été mimé à la fois par un traitement avec les AGE et avec la

glucosamine afin de mettre en parallèle les conséquences de la formation des produits avancés de

glycation et de l’activation de la voie des hexosamines et d'identifier ainsi des mécanismes

intracellulaires communs par lesquels ces deux voies biochimiques induites par l'hyperglycémie

exerceraient leurs effets.

De plus, chez les patients diabétiques, rétinopathie et néphropathie sont souvent associées et

plusieurs caractéristiques pathologiques sont communes à ces deux complications, qu'il serait

profitable de pouvoir traiter en même temps. C’est pourquoi nos travaux ont été menés à la fois sur

des péricytes rétiniens et sur des cellules mésangiales rénales, dans une optique comparative

rétinopathie-néphropathie et de recherche de mécanismes communs aux deux microcomplications.

118

LES AGE DIMINUENT LA PROLIFERATION DES

PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES:

IMPLICATION DES GANGLIOSIDES

Les AGE ont été largement impliqués lors d'études in vitro et in vivo, dans le développement des

complications microvasculaires du diabète que sont la rétinopathie et la néphropathie. Leur

accumulation a été montrée notamment dans le rein et la rétine de patients diabétiques. Différentes

équipes ont montré que les AGE affectent la croissance et la viabilité à la fois des péricytes

(Chibber R. et al., 1997; Denis U. et al., 2002; Yamagishi S. et al., 2002a) et des cellules

mésangiales (Yamagishi S. et al., 2002b; Ziyadeh F.N. et al., 1993). Cependant, les mécanismes

d'action de la toxicité des AGE n'ont pas été totalement identifiés.

D'autre part, de précédents travaux réalisés dans le laboratoire ont révélé que les AGE peuvent agir

sur le métabolisme des glycoconjugués et notamment des gangliosides de cellules microvasculaires

rétiniennes (Natalizio A. et al., 2001).

L'objectif de cette première étude a été de déterminer l'effet des AGE sur la prolifération cellulaire

et le profil en gangliosides, ceci dans une approche comparative péricytes-cellules mésangiales.

Ensuite, nous avons étudié l’hypothèse d’un lien potentiel entre modifications de la croissance

cellulaire et métabolisme des gangliosides.

I. EFFETS DES AGE SUR LA PROLIFERATION

CELLULAIRE

Péricytes rétiniens et cellules mésangiales rénales ont été cultivés durant un passage (7 et 4 jours,

respectivement) en présence de 3µM de BSA contrôle ou d’AGE. Au terme de cette période de

traitement, la prolifération cellulaire a été évaluée par comptage des cellules et par dosage des

protéines totales.

La Figure 35A montre que, dans les péricytes, les AGE diminuent le nombre de cellules de

33 % par rapport au nombre de cellules témoin. Cet effet délétère des AGE se manifeste également

119

sur la quantité totale de protéines puisqu’elle est 42 % inférieure dans les cultures traitées

comparées aux cultures témoin.

Les AGE affectent également la croissance des cellules mésangiales de manière importante

puisque le nombre de cellules est diminué d’environ 45 % par rapport au nombre de cellules

témoin. La quantité totale de protéines est quant à elle, inférieure de 34 % dans les cultures traitées

comparées aux cultures témoin (Figure 35B).

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

**

A BRP

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

**

B RMC

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

**

A BRP

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines

**

A BRP

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

**

B RMC

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

BSA AGEs

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

0

20

40

60

80

100

120

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines

**

B RMC

Figure 35 : Les AGE inhibent la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. BRP (A) et RMC (B) ont été

traités durant un passage par 3µM de BSA contrôle ou d’AGE, collectés par tripsynation puis comptés à l’aide d’un

hématimètre. La quantité totale de protéines a également été mesurée. Les résultats sont exprimés en % du contrôle

BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6-9 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05.

Les AGE exercent donc un effet anti-prolifératif sur les deux types de cellules étudiés, comme

indiqué à la fois par la baisse du nombre de cellules et par la diminution de la quantité totale

de protéines.

120

II. EFFETS DES AGE SUR LE METABOLISME DES

GANGLIOSIDES

1. LE PROFIL BASAL EN GANGLIOSIDES Les deux modèles cellulaires ont été traités pendant un passage avec 3 µM de BSA contrôle ou

d’AGE puis les gangliosides ont été extraits, purifiés, séparés par HPTLC et révélés à la fois au

résorcinol et par autoradiographie grâce à un marquage métabolique préalable au 14C-galactose.

L'analyse a permis de déterminer d'une part la composition en gangliosides des BRP et RMC à l'état

basal et d'autre part l'effet des AGE sur ce profil en gangliosides.

Comme l'illustre la Figure 36A, le profil basal en gangliosides est spécifique du type cellulaire. Les

gangliosides se présentent sous la forme de doublets, correspondant probablement à des différences

dans les chaînes hydrophobes formant le céramide pour une même chaîne glycosidique. Les

gangliosides sont ici identifiés par comigration avec un standard. Dans les péricytes, les

gangliosides majoritaires sont le GM3 (63 % de tous les gangliosides détectés) et le GM1 (9 %)

parmi les gangliosides de la série-a (Figure 36B), et le GD3 (28 %) parmi les gangliosides de la

série-b. Le profil en gangliosides des cellules mésangiales diffère par une faible proportion de GD3

(5 % de tous les gangliosides détectés) et parmi la série-a, par la présence de GD1a (20 %), le GM3

restant largement majoritaire (75 %). Ces résultats sont en accord avec la composition des cellules

microvasculaires déjà caractérisées, où le GM3 est prédominant.

121

Figure 36 : Profil en gangliosides des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales rénales. Les gangliosides des

BRP et des RMC ont été extraits puis purifiés. Ils ont ensuite été séparés sur plaque HPTLC et révélés au résorcinol.

Les différentes espèces ont été identifiées par co-migration avec des standards.

1.1.Effet des AGE sur la composition en gangliosides des péricytes

Comme représenté sur la Figure 37A, les AGE induisent des modifications spécifiques du profil en

gangliosides présents dans les péricytes. Les quantités de GM3 et GM1 augmentent d’environ 40 %

par rapport au contrôle BSA, alors que celle de GD3 diminue de 24 %, en réponse aux AGE. Des

résultats similaires ont été obtenus par autoradiographie (Figure 37B).

GM3

GD3

GT1b(standard interne)

RMCBRP

GM1

GT1b(standard interne) standardsstandards

GD1a

GM2

A B

Laccer GM3 GT3

GM2 GD2 GT2

GM1 GD1b GT1c

GD1a GT1b GQ1c

GT1a GQ1b GP1c

GD3

série-a série-b série-c

GM3

GT1b(standard interne)

RMCBRP

GM1

GD3

GT1b(standard interne) standardsstandards

GD1a

GM2

GM3

GT1b(standard interne)

GT1b(standard interne)

RMCBRP

GM1

GD3

GT1b(standard interne) standardsstandards

GD1aGD1a

GM2

A B

Laccer GM3 GT3

GM2 GD2 GT2

GM1 GD1b GT1c

GD1a GT1b GQ1c

GT1a GQ1b GP1c

GD3

série-a série-b série-c

Laccer GM3 GT3

GM2 GD2 GT2

GM1 GD1b GT1c

GD1a GT1b GQ1c

GT1a GQ1b GP1c

GD3

série-a série-b série-c

122

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

% d

u co

ntrô

le

GM3 GM1GD3

BSA AGE0

20

40

60

80

100

120

140

160

BSA AGE

% d

u co

ntrô

le

GM3 GM1GD3

* *

*

A B

**

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

% d

u co

ntrô

le

GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3

BSA AGE0

20

40

60

80

100

120

140

160

BSA AGE

% d

u co

ntrô

le

GM3 GM1GD3GM3 GM1GD3

* *

*

A B

**

Figure 37 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. Les cellules ont été exposées à 3 µM

de BSA contrôle ou d’AGE durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides, métaboliquement marqués par le 14C

galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été révélés à la fois par pulvérisation de

résorcinol (A) et par autoradiographie (B) puis quantifiés par densitométrie. (A) En conditions contrôle, les quantités

de GM3, GM1 et GD3 étaient respectivement de 2.39 ± 0.19, 0.34 ± 0.03, et 1.05 ± 0.11 µg/mg de protéines. Les

résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6 expériences indépendantes

réalisées en duplicats. *p<0,05.

Les gangliosides ont été métaboliquement marqués par ajout de 14C galactose à forte activité

spécifique dans le milieu de culture afin de pouvoir quantifier les taux de GM2, ganglioside de la

série-a quasiment indétectable par révélation au résorcinol ou faible marquage radioactif. Les

résultats présentés en Figure 38, indiquent que le GM2 est également augmenté de 55 % dans les

péricytes traités avec les AGE.

123

BSA AGE

%du

con

trôle

GM2

0

25

50

75

100

125

150

175

BSA AGE

%du

con

trôle

GM2GM2

0

25

50

75

100

125

150

175

0

25

50

75

100

125

150

175

Figure 38 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 dans les péricytes. Les cellules ont été traitées avec 3 µM de

BSA contrôle ou d’AGE durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides ont été métaboliquement marqués par 1 µCi/ml

de 14C galactose et révélés par autoradiographie. Les résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la

moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. (tendance à la significativité p<0,1)

Les AGE induisent donc une augmentation de tous les gangliosides de la série a présents dans

les péricytes (GM3, GM2 et GM1) et une diminution du ganglioside de la série b, GD3.

1.2.Effet des AGE sur la composition en gangliosides des cellules mésangiales

De la même manière, le traitement par les AGE modifie le profil en gangliosides des

cellules mésangiales. Les résultats présentés dans la Figure 39A indiquent que le taux de GM3

augmente de 33 % alors que celui de GD3 diminue de 30 % en réponse aux AGE. Le taux de GD1a,

quant à lui, n'est quasiment pas affecté. Des résultats semblables ont été obtenus par analyse du

marquage radioactif des gangliosides (Figure 39B).

124

A B

0

20

40

60

80

100

120

140

160

BSA AGE

%du

con

trôle

GM3 GD1aGD3 *

*

0

20

40

60

80

100

120

140

BSA AGE

%du

con

trôle

GM3 GD1aGD3

*

A B

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0

20

40

60

80

100

120

140

160

BSA AGE

%du

con

trôle

GM3 GD1aGD3GM3 GD1aGD3 *

*

0

20

40

60

80

100

120

140

0

20

40

60

80

100

120

140

BSA AGE

%du

con

trôle

GM3 GD1aGD3GM3 GD1aGD3

*

Figure 39 : Les AGE modifient le profil en gangliosides des cellules mésangiales. Les cellules ont été exposées à 3

µM de BSA contrôle ou d’AGE durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides, métaboliquement marqués par le 14C

galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont ensuite été révélés à la fois par pulvérisation

de résorcinol (A) et par autoradiographie (B), puis quantifiés par densitométrie. (A) En conditions contrôle, les

quantités de GM3, GD1 et GD3 étaient respectivement de 4.03 ± 0.28, 1.08 ± 0.11 et 0.27 ± 0.07 µg/mg de protéines.

Les résultats sont exprimés en % du contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 9 expériences indépendantes

réalisées en duplicats. *p<0,05.

Les gangliosides de la série-a, GM2 et GM1, étant difficilement détectables par révélation au

résorcinol ou faible marquage radioactif, un marquage métabolique plus élevé des gangliosides a

été réalisé par ajout de 14C galactose à forte activité spécifique. Les résultats obtenus par

autoradiographie, présentés en Figure 40, montrent que GM2 et GM1 sont augmentés de 25-35 %

en réponse aux AGE.

125

BSA AGE

%du

con

trôle

0

25

50

75

100

125

150

175GM2GM1

BSA AGE

%du

con

trôle

0

25

50

75

100

125

150

175GM2GM1GM2GM1

Figure 40 : Les AGE augmentent la synthèse du GM2 et du GM1 dans les cellules mésangiales. Les cellules ont été

traitées avec 3 µM de BSA contrôle ou d’AGE durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides ont été métaboliquement

marqués par 1 µCi/ml de 14C galactose et révélés par autoradiographie. Les résultats sont exprimés en % du contrôle

BSA et représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. (tendance à la significativité p<0,1)

Les AGE induisent donc une augmentation des gangliosides GM3, GM2 et GM1 appartenant à la

série a et une diminution du ganglioside GD3 appartenant à la série b.

D'après ces résultats, les AGE semblent provoquer des effets similaires sur le

métabolisme des gangliosides dans les péricytes et les cellules mésangiales. On observe en effet

une augmentation des gangliosides de la série-a et une diminution des gangliosides de la série-

b dans les deux types cellulaires traités avec les AGE.

2. EFFET DES AGE SUR L’ACTIVITE DES ENZYMES DE BIOSYNTHESE DES

GANGLIOSIDES Dans le but de préciser les mécanismes responsables de ces variations dans les taux de gangliosides,

les activités des enzymes de biosynthèse, GM3 et GD3 synthase, ont été mesurées en réponse aux

AGE.

Les résultats présentés en Figure 41 indiquent que le traitement par les AGE augmente

l’activité GM3 synthase, de 80 % dans les péricytes et de 50 % dans les cellules mésangiales.

Parallèlement, les AGE induisent une diminution de l’activité GD3 synthase d’environ 60 % dans

les deux types cellulaires.

126

A%

du c

ontrô

le

*

*

0

50

100

150

200

250

BRP RMC

BSAAGE

GM3 synthase B

0

20

40

60

80

100

120

**

%du

con

trôle

BSAAGE

BRP RMC

GD3 synthaseA%

du c

ontrô

le

*

*

0

50

100

150

200

250

BRP RMC

BSAAGE

GM3 synthase B

0

20

40

60

80

100

120

**

%du

con

trôle

BSAAGE

BRP RMC

GD3 synthase%

du c

ontrô

le

*

*

0

50

100

150

200

250

BRP RMC

BSAAGE

GM3 synthase%

du c

ontrô

le

*

*

0

50

100

150

200

250

BRP RMC

BSAAGE

GM3 synthase B

0

20

40

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100

120

**

%du

con

trôle

BSAAGE

BRP RMC

GD3 synthaseB

0

20

40

60

80

100

120

**

%du

con

trôle

BSAAGE

BRP RMC

GD3 synthase

Figure 41 : Les AGE augmentent l'activité GM3 synthase et diminuent l'activité GD3 synthase. BRP et RMC ont été

cultivés en présence de 3 µM de BSA contrôle ou d’AGE pendant un passage. Les activités enzymatiques GM3 (A) et

GD3 (B) synthase ont été mesurées sur les homogénats cellulaires comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes.

En conditions contrôle, l’activité GM3 synthase était de 2.7 et 5.1 pmoles/h/mg de protéines et l’activité GD3 synthase

de 0.8 et 0.7 pmoles/h/mg de protéines, respectivement dans les BRP et RMC. Les résultats sont exprimés en % du

contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 4-5 expériences indépendantes. *p<0,05 comparé au contrôle BSA.

Ces observations suggèrent que les AGE exercent des actions communes dans les

péricytes et dans les cellules mésangiales. Ainsi, le traitement par les AGE modifie le profil en

gangliosides des deux types cellulaires, notamment en modulant les activités de leurs enzymes

de biosynthèse.

Ces résultats indiquent que les AGE induisent une diminution de la prolifération cellulaire,

concomitante à une augmentation des gangliosides de la série a, et ce dans les deux types cellulaires

BRP et RMC. Les gangliosides étant connus pour moduler la prolifération cellulaire,

l’augmentation des gangliosides de la série-a pourrait ainsi constituer un mécanisme commun par

lequel les AGE diminuent la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. Différentes

approches ont alors été mises en œuvre pour tester cette hypothèse.

127

III. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA

DIMINUTION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE

PAR LES AGE

1. EFFET D’UN TRAITEMENT PAR DES GANGLIOSIDES EXOGENES SUR LA

PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES De nombreuses données de la littérature montrent que les gangliosides, et en particulier ceux de la

série-a, inhibent la croissance cellulaire. L’utilisation de gangliosides exogènes est courante dans

ces études et il a été rapporté qu’au moins une partie de ces gangliosides exogènes apportés aux

cellules dans le milieu de culture s’incorpore dans la membrane plasmique (Bremer E.G. et al.,

1984). L’effet sur la prolifération cellulaire des différents gangliosides de la série-a, augmentés en

réponse aux AGE, a donc été étudié.

Dans ce but, les cellules ont été traitées par des doses croissantes de GM3, GM2, GM1 ainsi que de

leurs précurseurs non sialylés, Glucosylcéramide et Lactosylcéramide, utilisés comme contrôles,

sous forme de complexe avec la BSA. La prolifération cellulaire a ensuite été évaluée par dosage de

la quantité totale de protéines et par mesure de la quantité d’ADN.

La figure 42 montre que les gangliosides testés inhibent la prolifération des BRP, de manière

dose-dépendante, alors que Glucosylcéramide et Lactosylcéramide sont sans effet. L’inhibition de

prolifération est observée à partir d’une concentration de 50 µM et semble plus efficace avec les

gangliosides GM2 et GM1, atteignant 25 % à une concentration de 100 µM. Les résultats obtenus

en utilisant le test du CyQuant (Figure 42B) sont conformes bien que plus modérés.

128

BA

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM 50µM 100µM

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM 50µM 100µM

** **

** *

**

BA

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

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100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM 50µM 100µM

% d

u co

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le

0

20

40

60

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100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM 50µM 100µM

BA

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

0

20

40

60

80

100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer

10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM

** **

** *

**

Figure 42 : L’ajout exogène de gangliosides de la série a diminue la prolifération des BRP. Différentes doses de

complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et

l'ADN (B) ont ensuite été mesurés. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 5

expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle.

Dans les cellules mésangiales, les gangliosides testés exercent également un effet anti-

prolifératif contrairement aux Glucosylcéramide et Lactosylcéramide qui restent sans effet (Figure

43). L’effet est observé à partir d’une concentration de 50 µM et l’inhibition de prolifération atteint

25-30 % à 100 µM. Les résultats obtenus par le test du CyQuant confirment cet effet d’inhibition de

la prolifération exercé par les gangliosides exogènes.

129

BA

% d

u co

ntrô

le

10µM 50µM 100µM

% d

u co

ntrô

le

10µM 50µM 100µM

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer0

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40

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80

100

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0

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40

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100

120

***

**

*****

*

*

BA

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le

10µM 50µM 100µM

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer0

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60

80

100

120

% d

u co

ntrô

le

10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM

contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCercontrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer contrôle GM3 GM2 GM1 GlucCer LacCer0

20

40

60

80

100

120

0

20

40

60

80

100

120

***

**

*****

*

*

Figure 43 : L’ajout exogène de gangliosides de la série a diminue la prolifération des RMC. Différentes doses de

complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et la

quantité d'ADN (B) ont ensuite été mesurés. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ±

SEM de 4-6 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle.

Ces résultats révèlent l'effet anti-prolifératif des gangliosides de la série-a dans les péricytes et

les cellules mésangiales et suggèrent donc qu'ils pourraient être impliqués dans la diminution

de prolifération cellulaire observée en réponse aux AGE.

2. EFFET D’UN TRAITEMENT AVEC LES AGE EN PRESENCE D’ANTICORPS DIRIGES

CONTRE LES GANGLIOSIDES DE LA SERIE-A Pour préciser si les gangliosides de la série a sont effectivement médiateurs de l’effet anti-

prolifératif des AGE, les cellules ont été traitées avec les AGE en présence d’anticorps anti-GM3,

anti-GM2 ou anti-GM1, dans le but de bloquer les effets potentiels de ces gangliosides. Pour les

contrôles BSA, la prolifération évaluée par le dosage des protéines totales, était semblable avec ou

sans anticorps. Les IgG de lapin, utilisées comme contrôle, n’ont pas montré d’effets particuliers sur

la prolifération. En revanche, la présence d’anticorps anti-gangliosides semble protéger

partiellement les deux types cellulaires de la diminution de prolifération causée par les AGE (Figure

44). En effet, dans les BRP, l'inhibition de prolifération causée par les AGE est de 36 % alors

qu'elle n'est plus que d’environ 25 % en présence d'anticorps anti-GM3, anti-GM2 ou anti-GM1. De

130

même dans les cellules mésangiales, l'inhibition de prolifération passe de 35 % avec les AGE seuls

à environ 15 % en présence des anti-GM2 et anti-GM1, l’anticorps anti-GM3 ne présentant pas

d’effet significatif.

A

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

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% d

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le0

20

40

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80

100

120

BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

BRP RMC

* *

*

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60

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120

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contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

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BSA

AGE

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120

BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

B

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120

BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

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BSA

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contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

A

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BSA

AGE

BSA

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contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

B

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20

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BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

B

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20

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100

120

BSA

AGE

BSA

AGE

contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2contrôle IgG anti GM3 anti GM1anti GM2

BRP RMC

* *

*

Figure 44 : L’utilisation d’anticorps anti-GM2 et anti-GM1 protège partiellement de l’effet anti-prolifératif des

AGE. BRP (A) et RMC (B) ont été traitées avec 3 µM de BSA contrôle ou d’AGE pendant un passage en présence ou en

absence de 0.5 µg par puits d’anticorps monoclonal anti-GM3 ou 5 µg par puits d'anticorps polyclonal anti-GM2, anti-

GM1 ou d’IgG. Après rinçage et lyse des cellules, les protéines totales ont été mesurées. Les résultats sont exprimés en

% du contrôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 5-6 expériences indépendantes réalisées en triplicats.

*p<0,05 comparé aux cellules traitées avec AGE seul.

Combinés avec l’effet des gangliosides exogènes, ces résultats suggèrent que, dans les péricytes

et les cellules mésangiales, les gangliosides de la série-a, en particulier GM2 et GM1, sont des

médiateurs de l’inhibition de prolifération causée par les AGE.

3. EFFET D’UN COTRAITEMENT AGE ET PPMP Une approche complémentaire a été envisagée pour soutenir l’implication des gangliosides de la

série-a dans les effets des AGE. Le PPMP, un inhibiteur de glucosylcéramide synthase, a été utilisé

pour bloquer l’augmentation des gangliosides causée par les AGE.

Ainsi, BRP et RMC ont été traités par les AGE en présence de concentrations croissantes de PPMP

puis la prolifération a été évaluée par dosage des protéines totales.

Dans les BRP, l'ajout de PPMP au traitement AGE permet de réduire l'inhibition de

prolifération causée par les AGE. En effet, la quantité de protéines est 26 % plus importante dans

131

les BRP traités avec les AGE en présence de 1 µM de PPMP que dans les BRP traités avec les AGE

seuls (Figure 45).

PPMP (µM)

prot

éine

s(µ

g/pu

its)

0

1

2

3

4

5

6

7

* * *

BSAAGE

*

0 1 0 0,1 0,25 0,5 1

PPMP (µM)

prot

éine

s(µ

g/pu

its)

0

1

2

3

4

5

6

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otéi

nes

(µg/

puits

)

0

1

2

3

4

5

6

7

0

1

2

3

4

5

6

7

* * *

BSAAGEBSAAGE

*

0 1 0 0,1 0,25 0,5 10 1 0 0,1 0,25 0,5 10 1 0 0,1 0,25 0,5 1

Figure 45 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par les AGE dans les péricytes. Les

cellules ont été exposées à 3 µM d’AGE en présence de doses croissantes de PPMP pendant un passage. Après rinçage

et lyse des cellules, les protéines totales ont été mesurées. Les résultats sont exprimés en µg de protéines par puits et

représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé aux cellules

traitées avec AGE seul.

Par contre, aucun effet protecteur du PPMP n'a été observé dans les RMC. Une explication

potentielle à ces résultats pourrait être l'accumulation de produits en amont de la voie de

biosynthèse des gangliosides consécutivement au blocage de la glucosylcéramide synthase. Par

exemple, les céramides, n'étant plus utilisés pour la synthèse des gangliosides, peuvent s'accumuler

ou être utilisés par d'autres voies pour produire notamment de la sphingosine, connue pour son

caractère anti-prolifératif (Geoffroy K. et al., 2004). La mise en place de ces voies alternatives dans

les RMC pourrait contre-carrer l'effet protecteur d'une inhibition de la synthèse des gangliosides par

le PPMP. D’autre part, il est également possible que la captation du PPMP soit différente dans les

BRP et les RMC. Ces résultats suggèrent par ailleurs que l’effet d’un tel agent pharmacologique

peut varier en fonction du type cellulaire considéré.

132

4. EFFET DE LA TRANSFECTION AVEC UN SIRNA DE GM3 SYNTHASE Dans les cellules mésangiales, une dernière approche a été envisagée, consistant à inhiber la

biosynthèse des gangliosides à l’aide de la technique des SiRNA. L’activité GM3 synthase a donc

été inhibée par la transfection des cellules avec un SiRNA spécifique.

Dans un premier temps, l’activité GM3 synthase a été mesurée dans les cellules suite à une

transfection avec des doses croissantes de SiRNA (Figure 46A). Cette expérience de dose-réponse a

permis de montrer que le SiRNA utilisé inhibe effectivement l’activité de l’enzyme et ce, de façon

dépendante de la dose et à hauteur d’environ 50 % pour une dose de 400 nM. Cette dose a été

choisie afin d’éviter les effets aspécifiques ou toxiques qui pourraient survenir à une dose plus forte.

Ensuite, la prolifération des RMC transfectées a été mesurée en réponse au traitement avec la BSA

contrôle ou les AGE. Les résultats présentés en Figure 46B indiquent que l’inhibition de l’activité

GM3 synthase à l’aide des SiRNA protège partiellement les RMC des effets anti-prolifératifs des

AGE. L’inhibition partielle de l’activité GM3 synthase obtenue par la transfection (50 %) peut

contribuer à expliquer l’effet protecteur assez faible de cette transfection contre les effets des AGE.

De plus, il faut signaler que les effets des AGE sont plus faibles comparés aux expériences

précédentes car les cellules ont été traitées à un état de confluence plus fort pour améliorer

l’efficacité de la transfection.

% d

u co

ntrô

le

BA

200 400 800Ctr 100

+ GM3 synthase SiRNA (nM)

fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52

Ctr + GM3 synthase SiRNA

BSAAGE

0

20

40

60

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% d

u co

ntrô

le

BA

200 400 800Ctr 100

+ GM3 synthase SiRNA (nM)

fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52

200 400 800Ctr 100

+ GM3 synthase SiRNA (nM)+ GM3 synthase SiRNA (nM)

fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52

Ctr + GM3 synthase SiRNA

BSAAGEBSAAGE

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100*

Figure 46 : La transfection avec un SiRNA spécifique de la GM3 synthase protège partiellement les RMC de

l’inhibition de prolifération causée par les AGE. (A) Les cellules ont été transfectées avec des doses croissantes de

SiRNA et l’activité GM3 synthase a été mesurée sur les lysats cellulaires après 72h. Ctr, cellules transfectées en

présence d’oligofectamine mais sans SiRNA. (B) 24h après transfection avec 400 nM de SiRNA, les cellules ont été

traitées avec 3 µM de BSA ou d’AGE. Au terme du traitement, les cellules ont été rincées, lysées et la quantité totale de

protéines mesurée. Les résultats sont exprimés en % du contôle BSA et représentent la moyenne ± SEM de 6

expériences indépendantes. *p<0,05 comparé aux cellules contrôle (Ctr) traitées avec AGE.

133

Ces observations confirment clairement l’implication de la GM3 synthase et des gangliosides

de la série-a dans l’inhibition de prolifération des cellules mésangiales causée par les AGE.

IV. DISCUSSION

Cette première partie du travail expérimental porte sur les AGE, produits s’accumulant dans un

environnement diabétique. Ces produits de glycation avancés se retrouvent notamment dans le rein

et la rétine de patients diabétiques et sont connus pour jouer un rôle important dans le

développement de la rétinopathie et la néphropathie diabétiques. Les AGE utilisés ont été préparés

par modification de l'albumine par le méthylglyoxal. Ces AGE-méthylglyoxal ont été observés dans

les protéines tissulaires chez le diabétique et sont donc représentatifs d'AGE s'accumulant in vivo au

cours du diabète (Degenhardt T.P. et al., 1998; Shamsi F.A. et al., 1998). Par ailleurs, le traitement

avec les AGE a été réalisé à une concentration déjà décrite pour induire des modifications du

métabolisme et de la prolifération cellulaire (Chibber R. et al., 1997; Yamagishi S. et al., 2002b;

Yamagishi S. et al., 2002a), notamment par notre équipe (Denis U. et al., 2002; Natalizio A. et al.,

2001).

Dans un premier temps, nous avons évalué l'effet des AGE sur la prolifération des BRP et

des RMC. Les résultats ont montré que le traitement avec les AGE inhibe la prolifération des deux

types cellulaires d'intérêt. Ces observations sont en accord avec celles de précédentes études

utilisant d'autres types d'AGE à la fois dans les péricytes (Chibber R. et al., 1997; Yamagishi S. et

al., 2002a) et les cellules mésangiales (Yamagishi S. et al., 2002b; Ziyadeh F.N. et al., 1993). Nous

n’avons pas exploré ici les mécanismes responsables de la diminution de prolifération mesurée.

Cependant, Denis et al. ont montré que les AGE sont capables d’induire l’apoptose des péricytes

rétiniens, même si ce processus n’est pas responsable à lui-seul de l’inhibition de prolifération

exercée par les AGE sur les péricytes (Denis U. et al., 2002).

Dans un deuxième temps, l'effet des AGE sur le profil en gangliosides a été étudié. Les

résultats indiquent que le traitement avec les AGE provoque une augmentation des gangliosides de

la série-a (GM3, GM2, GM1) parallèlement à une diminution des gangliosides de la série-b (GD3),

et ce dans les deux types cellulaires. Ces modifications peuvent s'expliquer par l'augmentation de

l'activité GM3 synthase et la diminution de l'activité GD3 synthase observées en réponse aux AGE.

134

L’augmentation de l’activité GM3 synthase se fait très certainement via une augmentation du Vmax

de la réaction plutôt que du Km (résultats non présentés). Ces résultats révèlent que les AGE sont

capables d’induire des effets opposés sur ces deux sialyltransférases et suggèrent qu’ils peuvent

réguler spécifiquement l'activité des enzymes de biosynthèse des gangliosides. Cependant ces

mécanismes de régulation n'ont pas encore été étudiés. Certaines données de la littérature nous

permettent tout de même de formuler une hypothèse. Il a en effet été montré que la liaison des AGE

au RAGE génère un stress oxydant capable d’activer des facteurs de transcription parmi lesquels

Sp1 (Du X.L. et al., 2000). Par ailleurs des analyses du promoteur du gène de la GM3 synthase

humaine ont révélé que sa transcription était positivement régulée par le facteur Sp1 (Zeng G. et al.,

2003). L'expression de RAGE ayant été décrite dans les BRP (Yamagishi S. et al., 2002a; Yonekura

H. et al., 2003) et dans les RMC (Vlassara H., 2001), il est envisageable que les AGE modulent

l'activité des enzymes GM3 et GD3 synthase en régulant leur expression génétique via la voie de

signalisation de RAGE.

Les investigations menées par la suite ont visé à vérifier si les gangliosides de la série-a,

dont les taux se trouvent augmentés en réponse aux AGE, peuvent être des médiateurs des effets

anti-prolifératifs de ces AGE.

Tout d'abord, nous avons étudié l’effet des gangliosides exogènes sur la prolifération des

deux types cellulaires. Le traitement des cellules par les gangliosides GM3, GM2 et GM1 induit une

diminution de la croissance des BRP et des RMC. Ces observations révèlent un effet anti-

prolifératif des gangliosides testés dans nos deux modèles cellulaires. L'inhibition de la prolifération

atteint un maximum de 25-30 % pour une dose de 100 µM. Cet effet relativement faible des

gangliosides exogènes peut s'expliquer par des données sur leur comportement au sein de la cellule.

Ainsi, même si l'addition exogène de gangliosides est utilisée dans de nombreuses études pour

déterminer leur rôle dans la régulation de la prolifération cellulaire, leur comportement dans la

cellule est assez mal connu. Cependant, un certain nombre de travaux anciens ont étudié leur

intégration dans la membrane cellulaire. Bremer et al. ont par exemple montré en utilisant des

gangliosides marqués au tritium, qu'environ 10-20 % des gangliosides ajoutés au milieu de culture

s'associent à la cellule et que, au bout de 48 h, 70 % de ces gangliosides associés sont effectivement

insérés dans la bicouche lipidique. Ces proportions n'étaient pas différentes quelque soit le

ganglioside testé (Bremer E.G. et al., 1984).

Une approche complémentaire a ensuite consisté à utiliser des anticorps dirigés contre les

gangliosides de la série a, GM3, GM2 et GM1, et destinés à bloquer leur action. Le traitement des

cellules avec les AGE en présence de ces anticorps s'est révélé protéger partiellement les BRP et les

RMC de la chute de prolifération causée par les AGE. Ces résultats supportent l'implication des

135

gangliosides dans les effets anti-prolifératifs des AGE. Le caractère partiel de la protection exercée

par les anticorps peut provenir du fait que ces anticorps n'accèdent pas complètement au

compartiment de gangliosides actifs. D'autre part, cela peut également signifier que d'autres voies

sont en cause. Par exemple, de précédents travaux menés au laboratoire ont permis de proposer une

cascade impliquant le stress oxydant, l'accumulation de céramides et les caspases pour expliquer

l'apoptose des péricytes en réponse aux AGE (Denis U. et al., 2002).

Par ailleurs, le PPMP, un inhibiteur de la glucosylcéramide synthase, a été utilisé pour

bloquer l'augmentation de la biosynthèse des gangliosides de la série-a qui s’opère en réponse aux

AGE. L’addition de PPMP a permis de protéger partiellement les BRP de la chute de prolifération

induite par les AGE. Là encore, ces observations soutiennent l’hypothèse du rôle de médiateurs des

effets des AGE des gangliosides. La protection partielle exercée par le PPMP suggère, comme déjà

évoqué, l'existence d'autres voies d'action des AGE sur la prolifération cellulaire.

Enfin, nous avons eu recours à la technique des SiRNA pour inhiber spécifiquement

l’activité GM3 synthase et donc l’augmentation de la biosynthèse des gangliosides observée en

réponse aux AGE. La transfection des cellules mésangiales avec un SiRNA spécifique de la GM3

synthase a partiellement protégé les cellules de la diminution de prolifération causée par les AGE.

Ce résultat confirme de manière plus directe l’implication des gangliosdies dans l’inhibition de

prolifération causée par les AGE.

L'ensemble des résultats obtenus par ces différentes approches, conforte l'hypothèse que les

gangliosides de la série-a peuvent effectivement participer à l'effet anti-prolifératif des AGE sur les

BRP et les RMC. Notons que les gangliosides ont déjà été décrits comme inhibiteurs endogènes de

la croissance de cellules mésangiales (Tsuboi N. et al., 2001). Ce rôle est en plus conforté par de

nombreux travaux montrant que les gangliosides, particulièrement de la série-a, diminuent la

prolifération de différents types cellulaires, en interagissant avec la signalisation de facteurs de

croissance. Par exemple, Bremer et al. ont montré que l'ajout exogène de GM3 et GM1 diminue la

prolifération de lignées cellulaires humaines de carcinome d’épiderme en inhibant la

phosphorylation du récepteur à l'EGF (Bremer E.G. et al., 1986). De plus, une croissance accélérée

et une autophosphorylation accrue du récepteur à l'EGF ont été montrées dans des lignées

cellulaires transfectées avec un gène codant une sialidase, diminuant le taux de GM3 (Meuillet E.J.

et al., 1999). Les mêmes observations ont été faites dans des lignées cellulaires issues d'ovaires de

hamster et présentant un défaut dans la biosynthèse des gangliosides (Weis F.M. et al., 1990). De la

même manière, différents travaux ont indiqué que GM1 et GM2 diminuent la croissance cellulaire

en inhibant la phosphorylation ou la dimérisation du récepteur au PDGF (Hynds D.L. et al., 1995;

Van Brocklyn J. et al., 1993). Enfin, des lignées cellulaires Swiss 3T3 surexprimant le GM1 ont

136

révélé une prolifération ralentie et une diminution de la phosphorylation du récepteur au PDGF

(Mitsuda T. et al., 2002).

En conclusion, les résultats de cette première partie suggèrent que les gangliosides de

la série-a sont des médiateurs de l’effet anti-prolifératif des AGE à la fois dans les péricytes et

dans les cellules mésangiales. De plus, l'augmentation des gangliosides de la série-a apparaît

comme un nouveau mécanisme d'action potentiel des AGE, commun aux deux types

cellulaires.

137

L’ACTIVATION DE LA VOIE DES HEXOSAMINES

DIMINUE LA PROLIFERATION DES PERICYTES

ET DES CELLULES MESANGIALES :

IMPLICATION DES GANGLIOSIDES

Un nombre grandissant de travaux suggère l'implication de la voie des hexosamines dans la

néphropathie diabétique. Précisément, cette voie semble jouer un rôle important dans les altérations

des cellules mésangiales, comme la surproduction de matrice extracellulaire. Cependant, son rôle

dans les perturbations de la prolifération de ces cellules a été peu étudié. Il existe également très peu

d'études, sinon aucune, s'intéressant à l'implication de la voie des hexosamines dans la rétinopathie

diabétique, bien qu'un grand nombre de caractéristiques pathologiques soient communes à la

néphropathie et à la rétinopathie.

Par ailleurs, l'addition d'un résidu monosaccharidique, la N-acétylglucosamine (GlcNAc), produit

de la voie de l'hexosamine, est connue pour modifier de façon covalente des protéines cytosoliques

ou nucléaires et réguler ainsi leur activité. Les cibles potentielles de cette O-glycosylation étant

nombreuses, la voie des hexosamines pourrait interférer avec de multiples voies biochimiques. De

plus, l’UDP-GlcNAc peut être utilisée comme précurseur du CMP-acide sialique ou de l’UDP-N-

acétylgalactosamine (UDP-GalNAc) qui sont des substrats pour la biosynthèse des gangliosides.

Ainsi, ces voies métaboliques soulèvent la possibilité d'une connexion entre la voie des

hexosamines et les gangliosides.

L'objet de cette deuxième partie expérimentale a été de déterminer l'effet d'une activation de la voie

des hexosamines, mimée par un traitement avec la glucosamine, sur la prolifération et le profil en

gangliosides des péricytes et des cellules mésangiales ainsi que d'éclaircir le lien potentiel entre ces

deux éléments.

138

I. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LA

PROLIFERATION CELLULAIRE

Péricytes et cellules mésangiales ont été cultivés durant un passage (7 et 4 jours, respectivement) en

milieu contrôle ou en présence de 2 ou 5 mM de glucosamine. A l’issue de cette période de

traitement, la prolifération cellulaire a été évaluée par comptage des cellules ainsi que par dosage

des protéines totales.

Les résultats présentés en Figure 47A montrent que la glucosamine inhibe la prolifération

des péricytes de manière dose-dépendante. A une concentration de 5 mM, le nombre de cellules

traitées est diminué de 41 % par rapport au nombre de cellules témoin. De même, la quantité de

protéines est 47 % inférieure dans les cultures traitées à la glucosamine comparée aux cultures

témoin.

La glucosamine affecte encore plus fortement la prolifération des cellules mésangiales, de manière

dose-dépendante. Un traitement avec la glucosamine diminue le nombre de cellules de 62 % et 77

% par rapport au contrôle pour des concentrations respectivement de 2 mM et 5 mM. La quantité

totale de protéines diminue également de façon dose-dépendante puisqu’elle est inférieure de 43%

et 60 % avec 2 et 5 mM, respectivement, par rapport aux cultures contrôle (Figure 47B). Il faut par

ailleurs noter que la quantité de protéines est affectée dans des proportions moindres que le nombre

de cellules. Ces résultats suggèrent une hypertrophie des cellules mésangiales en réponse à la

glucosamine, point sur lequel nous reviendrons dans la suite de l'étude.

139

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

* *

A BRP

%du

con

trôle

nombre de cellulesquantité de protéines

*

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20

40

60

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120

140

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*

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nombre de cellulesquantité de protéinesnombre de cellulesnombre de cellulesquantité de protéinesquantité de protéines

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120

0 2 5glucosamine (mM)

0 2 50 2 5glucosamine (mM)

*

*

Figure 47 : La glucosamine diminue la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales. BRP (A) et RMC (B)

ont été traités durant un passage par 0, 2 ou 5 mM de glucosamine, collectés par tripsynation puis comptés à l’aide

d’un hématimètre. La quantité totale de protéines a également été mesurée. Les résultats sont exprimés en % du

contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 3-5 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05 comparé

au contrôle en absence de glucosamine.

Le traitement avec la glucosamine exerce donc un effet anti-prolifératif à la fois sur les

péricytes et sur les cellules mésangiales, comme indiqué par la baisse du nombre de cellules et

par la diminution de la quantité totale de protéines.

II. EFFETS DE LA GLUCOSAMINE SUR LE METABOLISME

DES GANGLIOSIDES

BRP et RMC ont été cultivés en milieu contrôle ou traités par 2 mM ou 5 mM de glucosamine

pendant un passage. Les gangliosides ont alors été extraits puis analysés par séparation sur plaque

HPTLC, révélation au résorcinol et autoradiographie.

140

1. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES DES PERICYTES Comme le montre la Figure 48, des modifications importantes du profil en gangliosides surviennent

dans les BRP, en réponse au traitement avec la glucosamine. L’analyse des taux de gangliosides

(Figure 48A) révèle une diminution des quantités de GM3 d'environ 40 % par rapport au contrôle

aux deux concentrations de glucosamine, une augmentation des quantités de GM1 de 60 % à 2 mM

et de 70 % à 5 mM, ainsi qu'une augmentation de 70 % des quantités de GD3 ne survenant qu'à une

concentration de 5 mM de glucosamine. Les résultats obtenus par autoradiographie sont conformes,

avec cependant une dose-dépendance plus marquée (Figure 48B).

% d

u co

ntrô

le

GM3 GM1GD3

B

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u co

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le

GM3 GM1GD3

* *

*

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100

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0 2 5glucosamine (mM)

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100

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250

300*

0 2 5glucosamine (mM)

0 2 5glucosamine (mM)

**

Figure 48 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des péricytes rétiniens. Les cellules ont été cultivées en

milieu contrôle ou en présence de 2 mM ou 5 mM de glucosamine durant 7 jours puis collectées. Les gangliosides,

métaboliquement marqués par le 14C galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été

révélés à la fois par pulvérisation de résorcinol (A) et par autoradiographie (B) puis quantifiés par densitométrie. (A)

En conditions contrôle, les quantités de GM3, GM1 et GD3 étaient respectivement de 2.75 ± 0.30, 0.58 ± 0.20, et 1.27 ±

0.28 µg/mg de protéines. Les résultats sont exprimés en % du contrôle en absence de glucosamine et représentent la

moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicats. *p<0,05 comparé au contrôle en absence de

glucosamine.

2. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES DES CELLULES

MESANGIALES Le profil en gangliosides des RMC est également très affecté par le traitement avec la glucosamine

(Figure 49). La quantité de GM3 augmente en réponse à 2 mM de glucosamine mais semble rester

stable à 5 mM. La quantité de GD1a est augmentée en réponse au traitement d'environ 30 % par

141

rapport au contrôle à 2 mM et 50 % à 5 mM. Le GD3, quant à lui, devient indétectable dès 2 mM de

glucosamine. L'autoradiographie confirme la disparition du GD3 et indique en revanche une

diminution du GM3 radioactif par rapport au contrôle (Figure 49C). Ceci suggère qu’une quantité

moindre de GM3 a été synthétisée dans les cellules traitées pendant le "pulse" de marquage

métabolique, ce qui est d’ailleurs conforme à la diminution d’activité GM3 synthase mesurée en

réponse à la glucosamine (paragraphe suivant). Cette diminution de flux ne se manifeste cependant

pas immédiatement sur les quantités de GM3, probablement à cause de la masse importante que

représente ce ganglioside.

Les taux de gangliosides GM1 et surtout GM2 subissent des variations beaucoup plus

spectaculaires (Figure 49B). Ces espèces, quasiment indétectables dans les cellules témoin,

atteignent 2.37 et 0.70 µg/mg de protéines, représentant ainsi respectivement 24 % et 7 % de tous

les gangliosides détectés dans les cellules traitées avec 5 mM de glucosamine. Cette forte

augmentation de GM2 et GM1 est également nettement visible par analyse des gangliosides

marqués (Figure 49D). Etant donné que ces deux gangliosides sont absents dans les cellules

contrôle, nous avons voulu vérifier leur identité. Après séparation sur plaque HPTLC, les

gangliosides ont été révélés par immunocytochimie en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre

GM2 (don généreux du Dr J. Portoukalian) et la sous-unité β de la toxine cholérique, spécifique du

GM1.

142

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

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200

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*

*

*

*

*

Figure 49 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des cellules mésangiales. Les cellules ont été cultivées

en milieu contrôle ou en présence de 2 mM ou 5 mM de glucosamine durant 4 jours puis collectées. Les gangliosides,

métaboliquement marqués par le 14C galactose, ont alors été extraits, purifiés et analysés par HPTLC. Ils ont été

révélés à la fois par pulvérisation de résorcinol (A, B) et par autoradiographie (C, D) puis quantifiés par densitométrie.

En conditions contrôle, les quantités de GM3, GD3 et GM1 étaient respectivement de 3.96 ± 0.32, 0.27 ± 0.05, et 1.23 ±

0.16 µg/mg de protéines. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes réalisées en

duplicats. *p<0,05 comparé au contrôle en absence de glucosamine.

Nous pouvons déduire de ces résultats que la glucosamine affecte le métabolisme et modifie le

profil en gangliosides des péricytes et des cellules mésangiales. Les gangliosides de la série-a,

GM1 dans les BRP et GM1 et GM2 dans les RMC, sont augmentés en réponse à la

glucosamine. Cependant, le ganglioside de la série-b GD3 subit des modifications spécifiques

du type cellulaire, augmentation dans les BRP et diminution dans les RMC.

143

III. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’ACTIVITE GM3

SYNTHASE

Les gangliosides de la série-a étant augmentés dans les deux types cellulaires en réponse à 5 mM de

glucosamine, l'activité GM3 synthase a été mesurée afin d'éclaircir les mécanismes sous-tendant ces

variations.

Les résultats présentés en Figure 50A montrent que le traitement avec la glucosamine induit

une augmentation de l'activité GM3 synthase d'environ 160 % dans les BRP. L'augmentation de

l'activité de cette enzyme limitante pour la biosynthèse de l’ensemble des gangliosides, est

compatible avec l'augmentation des taux de GM1 et de GD3 observée en réponse à la glucosamine.

En revanche, une diminution du taux de GM3 a été mesurée malgré cette augmentation de l'activité

GM3 synthase. GM3 étant le précurseur des gangliosides plus complexes, ceci suggère qu'il a été

métabolisé en GM1 et GD3, tous les deux fortement augmentés en réponse au traitement.

L'augmentation de la biosynthèse de GM3 consécutive à une augmentation de l'activité GM3

synthase ne suffirait pas à compenser sa consommation pour la biosynthèse accrue de GM1 et GD3.

Contrairement à ce qui est attendu, l'activité GM3 synthase est diminuée d'environ 50 %

dans les RMC traitées à la glucosamine (Figure 50B). On observe cette diminution d'activité malgré

une augmentation massive des taux de GM2 et de GM1, produits indirects de cette enzyme. Une

explication possible serait que ces produits, fortement augmentés, exercent un rétrocontrôle négatif

sur la GM3 synthase puisqu'un rétrocontrôle négatif de l’activité des enzymes de biosynthèse des

gangliosides a été décrite in vitro (Yusuf H.K. et al., 1987). Une analyse cinétique aurait été

nécessaire pour vérifier cette hypothèse. L’activité GD3 synthase n’a pas été mesurée en réponse à

la glucosamine. Les modifications des gangliosides des RMC étant similaires suite au traitement

avec la glucosamine et avec les AGE (augmentation des gangliosides de la série-a et diminution du

GD3), il est probable que l’activité GD3 synthase soit diminuée en réponse à la glucosamine

comme elle l’est en réponse aux AGE.

144

A BRP B RMC*

0

50

100

150

200

250

300

350%

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0 5glucosamine (mM)

%du

con

trôle

0 5glucosamine (mM)

0 5glucosamine (mM)

*

Figure 50 : La glucosamine modifie l'activité GM3 synthase des péricytes et des cellules mésangiales. Les BRP (A) et

les RMC (B) ont été traitées avec 5 mM de glucosamine pendant un passage. L’activité GM3 synthase a été mesurée sur

les homogénats cellulaires comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. En conditions contrôle, l’activité GM3

synthase était de 2.7 et 5.1 pmoles/h/mg de protéines respectivement dans les BRP et RMC. Les résultats sont exprimés

en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 5-8 expériences indépendantes. *p<0,05 comparé au contrôle.

Les résultats présentés ci-dessus indiquent que le traitement avec la glucosamine inhibe la

prolifération des BRP et des RMC. Il occasionne parallèlement des modifications spécifiques

du profil en gangliosides dans les deux types cellulaires, dont certaines sont communes

(augmentation des gangliosides de la série-a) et d’autres opposées (GD3). Partant de ces

résultats, des expériences ont ensuite été menées afin de déterminer si ces modifications des

gangliosides pouvaient participer à l'inhibition de prolifération induite par la glucosamine.

145

IV. IMPLICATION DES GANGLIOSIDES DANS LA

DIMINUTION DE PROLIFERATION CELLULAIRE CAUSEE PAR

LA GLUCOSAMINE

1. EFFET D’UN TRAITEMENT PAR LES GANGLIOSIDES EXOGENES SUR LA

PROLIFERATION DES PERICYTES ET DES CELLULES MESANGIALES Les gangliosides ont été décrits comme des modulateurs, et le plus souvent des inhibiteurs, de la

croissance cellulaire. L’effet sur la prolifération cellulaire des différents gangliosides augmentés en

réponse à la glucosamine a donc été étudié.

Pour cela, des concentrations croissantes de gangliosides ainsi que de leurs précurseurs non sialylés,

Glucosylcéramide et Lactosylcéramide, utilisés comme contrôles, ont été ajoutées au milieu de

culture, sous la forme de complexe avec la BSA. La prolifération a ensuite été évaluée par dosage

de la quantité totale de protéines et par mesure de la quantité d’ADN.

La Figure 51 montre que les gangliosides testés inhibent la prolifération des BRP, de

manière dose-dépendante, alors que Glucosylcéramide et Lactosylcéramide sont sans effet.

L’inhibition de prolifération, dose-dépendante atteint environ 25 % à une concentration de 100 µM.

Les résultats obtenus par la technique du CyQuant sont conformes (Figure 51B) bien qu’atténués.

146

BA%

du

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rôle

0

20

40

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120

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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer

* ** * * *

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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer

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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer

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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer

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contrôle GM1 GD3 GlucCer LacCer

* ** * * *

Figure 51 : Le traitement par le GM1 et le GD3 diminue la prolifération des BRP. Différentes concentrations de

complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et

l'ADN (B) ont ensuite été mesurés. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 4

expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle. Les histogrammes des GM1, GlucCer

et LacCer sont empruntés à la Figure 42.

Dans les cellules mésangiales, les gangliosides testés exercent également un effet anti-

prolifératif contrairement aux Glucosylcéramide et Lactosylcéramide qui restent sans effet (Figure

52). L’inhibition de prolifération apparaît maximale dès 50 µM et atteint environ 30 %. Cet effet est

confirmé par les résultats obtenus avec la mesure de la quantité d'ADN (Figure 52B).

147

A%

du

cont

rôle

10µM 50µM 100µM

contrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCer0

20

40

60

80

100

120B

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120 10µM 50µM 100µM

contrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCer

* * ***

* **** **

A%

du

cont

rôle

10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM

contrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCercontrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCer0

20

40

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80

100

120B

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le

0

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40

60

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120B

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0

20

40

60

80

100

120 10µM 50µM 100µM10µM10µM 50µM50µM 100µM100µM

contrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCercontrôle GM2 GM1 GD1a GlucCer LacCer

* * ***

* **** **

Figure 52 : Le traitement par les GM2, GM1 et GD1a diminue la prolifération des RMC. Différentes doses de

complexes glycolipides-BSA ont été ajoutées au milieu de culture pendant un passage. Les protéines totales (A) et la

quantité d'ADN (B) ont ensuite été mesurées. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ±

SEM de 4-6 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé au contrôle. Les histogrames des

GM2, GM1, GlucCer et LacCer sont empruntés à la Figure 43.

Ces résultats révèlent un effet anti-prolifératif des gangliosides augmentés suite au traitement

avec la glucosamine dans les péricytes et les cellules mésangiales. Ils suggèrent ainsi qu'ils

pourraient être impliqués dans la diminution de prolifération cellulaire observée en réponse à

la glucosamine.

2. EFFET D’UN COTRAITEMENT GLUCOSAMINE ET PPMP Le PPMP, un inhibiteur de glucosylcéramide synthase, a été utilisé pour bloquer l’augmentation des

gangliosides causée par le traitement et vérifier ainsi leur implication dans les effets de la

glucosamine.

BRP et RMC ont été traités avec la glucosamine en présence de doses croissantes de PPMP puis la

prolifération a été évaluée par dosage des protéines totales.

Dans les BRP, l'ajout de PPMP permet de réduire l'inhibition de prolifération causée par la

glucosamine. En effet, la quantité de protéines est 36 % plus importante dans les BRP traités avec la

glucosamine en présence de 1 µM de PPMP que dans les BRP traités avec la glucosamine seule

148

(Figure 53). Le caractère partiel de la protection par le PPMP suggère, comme pour les AGE, que la

glucosamine agit également par d’autres voies pour diminuer la prolifération des péricytes.

prot

éine

s(µ

g/pu

its)

PPMP (µM)

0GlcN 5 mM

* **

*

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 0 0,1 0,25 0,5 1

prot

éine

s(µ

g/pu

its)

PPMP (µM)

0GlcN 5 mM0GlcN 5 mM

* **

*

0

1

2

3

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5

6

7

8

0 1 0 0,1 0,25 0,5 10

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 0 0,1 0,25 0,5 1

Figure 53 : L’utilisation de PPMP réduit l’inhibition de prolifération causée par la glucosamine sur les péricytes.

Les cellules ont été exposées à 5 mM de glucosamine en présence de doses croissantes de PPMP pendant un passage.

Après rinçage et lyse des cellules, les protéines totales ont été mesurées. Les résultats sont exprimés en µg de protéines

par puits et représentent la moyenne ± SEM de 6 expériences indépendantes réalisées en triplicats. *p<0,05 comparé

aux cellules traitées avec la glucosamine seule.

Par contre, aucun effet protecteur du PPMP contre les effets anti-prolifératifs de la glucosamine n'a

été observé dans les RMC, comme il a déjà été observé avec les AGE. Nous avons discuté dans la

partie précédente que la mise en place de voies biochimiques suite à l’exposition au PPMP de ces

cellules pourrait contrecarrer l'effet protecteur d’un blocage de la synthèse des gangliosides. De

plus, il est possible que la captation du PPMP soit différente en fonction du type cellulaire.

L'ensemble des résultats de cette partie révèle que la glucosamine inhibe à la fois la

prolifération des BRP et des RMC mais occasionne des modifications des gangliosides

différentes en fonction du type cellulaire. Ils conduisent à l’hypothèse que l'inhibition de la

prolifération observée dans les BRP et les RMC en réponse à la glucosamine pourrait

impliquer les gangliosides. Notamment, nous avons noté dans les cellules mésangiales, une

augmentation massive des quantités de GM1 et GM2. Par la suite, nous avons choisi

149

d'explorer plus en détails les mécanismes spécifiques par lesquels la glucosamine inhibe la

prolifération des RMC et la place de ces deux gangliosides dans ces mécanismes.

V. ETUDE DES MECANISMES CONDUISANT A

L’INHIBITION DE PROLIFERATION DES CELLULES

MESANGIALES PAR LA GLUCOSAMINE

Pour préciser ces mécanismes, nous avons réalisé des études plus détaillées en utilisant deux

concentrations de glucosamine, une faible (0,5 mM) et une forte (5 mM).

1. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR L’HYPERTROPHIE DES RMC L’hypertrophie des cellules mésangiales est un processus qui contribue à l’expansion mésangiale

caractéristique de la néphropathie diabétique. Nous avons étudié ici ce phénomène en réponse à un

traitement avec la glucosamine.

Dans un premier temps, les cinétiques de croissance des RMC ont été déterminées en réponse à un

traitement avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine. Le nombre de cellules ainsi que la quantité de

protéines ont été mesurés, permettant ainsi le calcul du rapport protéines totales / nombre de

cellules. Ce rapport est un moyen bien établi de mesurer l'hypertrophie cellulaire.

Les résultats présentés en Figure 54 indiquent que la glucosamine diminue fortement la croissance

des RMC. L’effet, visible dès 48 h, correspond à une diminution du nombre de cellules de 56 %

pour une concentration de 0,5 mM et de 85 % pour une concentration de 5 mM au terme du

traitement (Figure 54A). Cet effet est également révélé par une baisse de la quantité totale de

protéines, mais dans une moindre mesure (Figure 54B). Par conséquent, l’augmentation du rapport

protéines totales/nombre de cellules semble indiquer que la glucosamine induit l'hypertrophie des

cellules mésangiales (Figure 54C).

150

A B

0

5

10

15

20

25

30

35

40

jours0 1 2 3 4

nom

bre

de c

ellu

les

(10*

5)contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

0

200

400

600

800

1000

1200

prot

éine

s to

tale

s(µ

g)

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C

4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4jours

prot

éine

s to

tale

s/n

ombr

ede

cel

lule

s

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

A B

0

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25

30

35

40

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jours0 1 2 3 4

nom

bre

de c

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les

(10*

5)contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

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1200

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jours0 1 2 3

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contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

0

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100

0 1 2 3 4jours

prot

éine

s to

tale

s/n

ombr

ede

cel

lule

s

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

contrôleGlcN 0,5 mMGlcN 5 mM

44

Figure 54 : La glucosamine inhibe la croissance des cellules mésangiales. Les cellules ont été exposées à 0,5 ou 5

mM de glucosamine pendant 4 jours. Chaque jour, des cellules ont été collectées, comptées et les protéines totales ont

été mesurées. Des courbes de croissance représentatives correspondant au nombre de cellules (A) et à la quantité totale

de protéines (B) sont présentées. Le rapport quantité de protéines / nombre de cellules exprimé en µg par 105 cellules a

également été calculé (C). 2 expériences indépendantes ont été réalisées, une seule est ici représentée.

Les effets de la glucosamine étant nets dès 48 h, les expériences ultérieures ont été menées à ce

temps de traitement afin d'éviter l'inhibition de contact survenant à confluence et pouvant gêner

l'étude des mécanismes de régulation de prolifération. Tout d'abord, la mesure du rapport protéines /

cellules a été répétée à 48 h. Il s'est avéré 1.5 et 1.8 fois plus élevé dans les cellules traitées avec 0,5

et 5 mM de glucosamine, respectivement, que dans les cellules contrôle (Figure 55A). De plus, des

photos obtenues en microscopie photonique à contraste de phase montrent clairement une

augmentation de la taille des cellules traitées avec la glucosamine, caractéristique de l'hypertrophie

(Figure 55B).

151

*

*

0

50

100

150

200

250

contrôle

% d

u co

ntrô

le

0,5 mM 5 mM

GlcN

A B

cont

rôle

0,5

mM

5m

M

Glc

N

*

*

0

50

100

150

200

250

contrôle

% d

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le

0,5 mM 5 mM

GlcN

0,5 mM 5 mM

GlcN

A B

cont

rôle

0,5

mM

5m

M

Glc

N

Figure 55 : Le traitement avec la glucosamine induit l’hypertrophie des cellules mésangiales. Les cellules ont été

traitées avec 0.5 ou 5 mM de glucosamine pendant 48 h. Au terme de cette période, elles ont été rincées, collectées puis

comptées à l’aide d’un hématimètre et la quantité totale de protéines a été mesurée. Le rapport protéines totales /

nombre de cellules a ensuite été calculé (A). Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ±

SEM de 10 expériences indépendantes. (B) Images en microscopie de phase de cellules en condition contrôle ou

traitées avec la glucosamine. *p<0,05 comparé au contrôle.

Ces résultats indiquent que la glucosamine bloque la croissance des RMC dès 48h de

traitement et induit une hypertrophie cellulaire.

2. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE CYCLE CELLULAIRE Le blocage de la croissance cellulaire exercé par la glucosamine contribue certainement à

l'hypertrophie observée. Cette hypertrophie étant la conséquence d'une augmentation de la quantité

de protéines associée à une division cellulaire ralentie ou absente, les effets de la glucosamine sur la

progression des RMC dans le cycle cellulaire ont ensuite été étudiés.

2.1.Analyse du cycle par FACS

L'analyse du cycle cellulaire des RMC traitées ou non avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine a été

réalisée par cytométrie de flux. Les résultats résumés dans la Figure 56A montrent qu'un traitement

152

avec 0,5 mM de glucosamine augmente la proportion de cellules en phase G0/G1 du cycle cellulaire,

passant de 58 % pour les cultures contrôles à 71 % pour les cultures traitées. Ces observations

suggèrent qu'une faible concentration de glucosamine bloque la progression des RMC à travers le

cycle cellulaire en inhibant la transition de phase G1/S, arrêtant ainsi les cellules en phase G0/G1. De

façon assez surprenante, un traitement avec une forte concentration de glucosamine (5 mM) cause

un blocage du cycle cellulaire au niveau de la phase G2/M, augmentant de 10 % la proportion de

cellules dans cette phase.

Afin de préciser cette différence, une expérience de dose-réponse a été menée. Les résultats

présentés en Figure 56B indiquent qu'une dose de glucosamine inférieure ou égale à 1 mM arrête

les cellules en phase G0/G1 alors que des concentrations plus fortes (2-5 mM) bloquent le cycle des

RMC en phase G2/M.

0

50

60

70

80

90

100

0 0,5 1 2 5

% d

e ce

llule

s da

ns le

s di

ffére

ntes

pha

ses

GlcN (mM)

G2/MSG0/G1

A B

Phase du cycle

Control 58 ± 2 22 ± 1 19 ±1

GlcN 0,5 mM 71 ± 1 13 ± 1 16 ±1

GlcN 5 mM 54 ± 1 15 ± 1 ±2

Figure 56 : La glucosamine bloque le cycle cellulaire des RMC de façon dose-dépendante. (A) Les cellules ont été

traitées avec 0,5 ou 5 mM de glucosamine pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été collectées pour être analysées en

cytométrie de flux. Les résultats sont exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle et représentent la moyenne

de 5 expériences indépendantes. (B) Les cellules traitées avec des doses croissantes de glucosamine pendant 48 h ont

été analysées en cytométrie de flux. Les résultats sont exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle.

2.2.Effet de la glucosamine sur l’expression des inhibiteurs de kinase cycline-dépendante

Dans le but de préciser les mécanismes de l'arrêt du cycle cellulaire observé, l'expression

d'inhibiteurs de complexes cycline-kinase cycline-dépendante a été étudiée. p21Waf1/Cip1 et p27Kip1

ont été ciblés car ils sont connus pour inhiber les transitions de phase G1/S et G2/M. De plus, ces

protéines ont été impliquées dans le blocage en G0/G1 et l'hypertrophie des cellules mésangiales

29

G0/G1 S G2/M

0

50

60

70

80

90

100

0 0,5 1 2 5

% d

e ce

llule

s da

ns le

s di

ffére

ntes

pha

ses

GlcN (mM)

G2/MSG0/G1

G2/MSG0/G1

A B

Phase du cycle

Control 58 ± 2 22 ± 1 19 ±1

GlcN 0,5 mM ± 1 13 ± 1 16 ±171

GlcN 5 mM 54 ± 1 15 ± 1 ±229

G0/G1 S G2/M

153

cultivées en présence de fortes concentrations de glucose ou dans des modèles d’animaux

diabétiques.

L'expression de p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a donc été évaluée dans les RMC cultivées en milieu contrôle

ou en présence de 0,5 ou 5 mM de glucosamine. Les résultats présentés en Figure 57 montrent que

les deux doses de glucosamine augmentent l'expression de p21Waf1/Cip1 alors qu'elles diminuent

l'expression de p27Kip1.

A B

β-actin

p21

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

β-actin

p27

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

contrôle 0,5 5

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u co

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le

GlcN (mM)

0

20

40

60

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100

120

140%

du

cont

rôle

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

A B

β-actin

p21

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

β-actin

p21

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

β-actin

p27

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

β-actin

p27

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

contrôle 0,5 5

% d

u co

ntrô

le

GlcN (mM)

0

20

40

60

80

100

120

140%

du

cont

rôle

contrôle 0,5 5GlcN (mM)

Figure 57 : La glucosamine augmente l’expression de p21Waf1/Cip1. Les cellules ont été traitées avec.0,5 mM ou 5 mM

de glucosamine pendant 48 h. Les cellules ont alors été lavées, collectées et lysées. Des quantités égales de protéines

ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane PVDF. Ces membranes

ont été révélées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-p21 (A) ou anti-p27 (B) puis par un anticorps anti-β actine

comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Des immnunoblots représentatifs ainsi que les quantifications

obtenues par analyses densitométriques des bandes de 4 expériences indépendantes sont présentés. Les résultats sont

en exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM. (tendance à la significativité p<0,07)

La glucosamine arrête donc la progression des RMC dans le cycle cellulaire en augmentant

spécifiquement l’expression de la protéine p21Waf1/Cip1. D’autre part, les cellules sont arrêtées

dans des phases du cycle différentes en fonction de la concentration de glucosamine,

suggérant que des voies d'action distinctes sont mises en jeu.

154

3. EFFET DE LA GLUCOSAMINE SUR LE PROFIL EN GANGLIOSIDES Dans un deuxième temps, l'effet sur le profil en gangliosides d'un traitement de 48h avec la

glucosamine a été déterminé. Des modifications importantes des quantités de gangliosides ont été

observées, semblables à celles obtenues précédemment avec un traitement de 5 mM de glucosamine

pendant un passage (Figure 58). En particulier, le GM2 et le GM1 quasiment indétectables en

conditions contrôle, subissent une très forte augmentation pour atteindre environ 1,5 et 0,4 µg/mg

de protéines, ce qui correspond respectivement à 20 % et 5 % de tous les gangliosides détectés, et

ce aux deux doses de glucosamine testées.

GlcN (mM)stds50 0,5

GT1b(std interne) origine

GM1

GM2

GM3

GD3

GD1a

GD3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,5 5

GlcN (mM)

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

éine

s

GM2GM1

A B

ND

GlcN (mM)stds50 0,5

GT1b(std interne) origine

GM1

GM2

GM3

GD3

GD1a

GD3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,5 5

GlcN (mM)

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

éine

s

GM2GM1

A B

ND

Figure 58 : La glucosamine modifie le profil en gangliosides des RMC. Les cellules ont été traitées avec 0,5 ou 5 mM

de glucosamine pendant 48 h puis collectées. Les gangliosides ont été extraits, purifiés et analysés par migration sur

plaque HPTLC et révélation au résorcinol. Une plaque HPTLC représentative (A) ainsi que les quantifications de 3-5

expériences indépendantes chacune réalisée en duplicates (B) sont présentés. Les résultats sont exprimés en µg de

gangliosides par mg de protéines et représentent la moyenne ± SEM. ND, non détecté. Les résultats obtenus ici à 48 h

de traitement avec 5 mM de glucosamine sont similaires à ceux obtenus à 4 jours de traitement.

La glucosamine induit donc une augmentation massive des gangliosides GM2 et GM1 dans les

cellules mésangiales.

La suite de l'étude s'est focalisée sur ces deux gangliosides, subissant les modifications les plus

155

remarquables et a eu pour objet de vérifier si ces gangliosides pouvaient être impliqués dans les

effets exercés par la glucosamine sur l'hypertrophie et le blocage du cycle cellulaire des RMC.

4. EFFET DE GM2 ET GM1 SUR L’HYPERTROPHIE ET LE CYCLE CELLULAIRE DES

RMC

4.1.Effet des gangliosides sur l’hypertrophie

Les cellules ont été cultivées pendant 48h en présence de 60 µM de GM2 ou GM1. Le nombre de

cellules et la quantité de protéines ont alors été mesurés et le rapport protéines / cellules a été

calculé pour évaluer l'hypertrophie.

Les résultats de la Figure 59 indiquent que l'addition de gangliosides exogènes augmente le rapport

protéines / cellules d'environ 30 % suggérant que les RMC s'hypertrophient en réponse à une

exposition au GM2 et au GM1.

**

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

contrôle GM2 GM1

**

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

contrôle GM2 GM1

Figure 59 : GM2 et GM1 induisent l’hypertrophie des cellules mésangiales. Les RMC ont été cultivées en présence de

60 µM de GM2 ou GM1 complexés à la BSA pendant 48 h. Les cellules ont alors été lavées, collectées puis comptées à

l’aide d’un hématimètre et la quantité totale de protéines a été mesurée. Le rapport protéines totales / nombre de

cellules a ensuite été calculé. Les conditions contrôle correspondent au milieu complet avec 10 mM de BSA / Hepes pH

7.4. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la moyenne ± SEM de 4-6 expériences indépendantes.

*p<0.05 comparé au contrôle.

156

4.2.Effet des gangliosides sur le cycle cellulaire

Les gangliosides semblant, comme la glucosamine, induire l'hypertrophie des RMC, nous avons

ensuite cherché à déterminer si les mécanismes mis en jeu sont similaires.

Tout d'abord, le cycle cellulaire de RMC cultivées en présence de GM2 et GM1 a été

analysé par cytométrie de flux. Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous (Fig. 60) montrent

que les gangliosides induisent une accumulation de cellules en G0/G1, suggérant un blocage au

niveau de la transition de phase G1/S, comme il a été observé en réponse à 0,5 mM de glucosamine.

G0/G1 S G2/M

Control 58±2 22±1 19±1

GM2 79±2 9 ±1 12±1

GM1 1 8 ±1 12±1

Figure 60 : GM2 et GM1 bloquent le cycle cellulaire des RMC en phase G0/G1 Les RMC ont été cultivées en présence

60 µM de GM2 ou GM1 pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été collectées pour être analysées en cytométrie de flux.

Les conditions contrôle correspondent au milieu complet avec 10 mM de BSA / Hepes pH 7,4. Les résultats sont

exprimés en % de cellules dans chaque phase du cycle et représentent la moyenne de 5 expériences indépendantes.

L'expression des inhibiteurs du cycle cellulaire p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a alors été étudiée dans

les cellules en réponse à une exposition aux gangliosides. Comme illustré en Figure 61, GM2 et

GM1 causent une augmentation de l'expression de p21Waf1/Cip1 et au contraire une diminution de

l'expression de p27Kip1.

79±

Phase du cycle G0/G1 S G2/M

Control 58±2 22±1 19±1

GM2 2 9 ±1 12±179±

GM1 1 8 ±1 12±179±

Phase du cycle

157

A B

β-actin

p21

contrôle GM2 GM1

0

50

100

150

200

250

contrôle GM2 GM1

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

% d

u co

ntrô

lecontrôle GM2 GM1

β-actin

p27

contrôle GM2 GM1

A B

β-actin

p21

contrôle GM2 GM1

0

50

100

150

200

250

contrôle GM2 GM1contrôle GM2 GM1

% d

u co

ntrô

le

0

20

40

60

80

100

120

140

% d

u co

ntrô

lecontrôle GM2 GM1contrôle GM2 GM1

β-actin

p27

contrôle GM2 GM1

β-actin

p27

contrôle GM2 GM1

Figure 61 : GM2 et GM1 augmentent l’expression de p21Waf1/Cip1. Les RMC ont été cultivées en présence 60 µM de

GM2 ou GM1 pendant 48 h. Les cellules ont alors été rincées, collectées et lysées. Des quantités égales de protéines ont

été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide puis transférées sur membrane PVDF. Ces membranes ont

été révélées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-p21 (A) ou anti-p27 (B) puis par un anticorps anti-β actine comme

décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Des immnunoblots représentatifs ainsi que les quantifications obtenues par

analyses densitométriques des bandes de 4 expériences indépendantes sont présentés. Les résultats sont exprimés en %

du contrôle et représentent la moyenne ± SEM. (tendance à la significativité p<0,07)

Ces observations indiquent que la glucosamine à faible dose et les gangliosides GM2 et GM1

induisent l'hypertrophie et inhibent la prolifération des RMC par des mécanismes similaires,

en augmentant l'expression de p21Waf1/Cip1 et en bloquant les cellules en phase G0/G1 du cycle

cellulaire. Elles suggèrent que les gangliosides GM2 et GM1, fortement augmentés en réponse

à la glucosamine, pourraient médier les effets de la glucosamine sur les cellules mésangiales.

158

VI. DISCUSSION

Cette deuxième partie a consisté à explorer la voie des hexosamines, une des hypothèses

biochimiques proposée pour expliquer les complications microvasculaires du diabète, en particulier

la néphropathie. Elle consiste à convertir le fructose-6-P issu du glucose en glucosamine-6-P

(GlcN-6-P) via une enzyme spécifique et limitante, activée en conditions hyperglycémiques, la

glutamine: fructose-6-P-amidotransférase (GFAT). La GlcN-6-P est ensuite rapidement convertie et

activée en UDP-N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc), précurseur des sucres aminés nécessaires à

la biosynthèse des glycoprotéines et glycolipides et résidu utilisé pour la O-glycosylation des

protéines.

L’expression de la GFAT a été décrite dans les cellules épithéliales et mésangiales glomérulaires de

reins de patients diabétiques atteints de néphropathie (Nerlich A.G. et al., 1998). Cette voie est

souvent mise en cause dans le développement des caractéristiques pathologiques de la néphropathie

diabétique comme par exemple l’augmentation de la production de TGFβ et consécutivement de

protéines de la matrice extracellulaire (Schleicher E.D. et al., 2000). Une activité GFAT a de plus

été mesurée dans la rétine, et les quantités d'hexosamines sont augmentées dans les tissus rétiniens

d'homme et de rat diabétiques, soulignant ainsi la possibilité d'un rôle de la voie des hexosamines

dans la rétinopathie (Heath H. et al., 1967; Mazlen R.G. et al., 1970).

L’UDP-N-acétylglucosamine est un des principaux métabolites issus de la voie des hexosamines.

La glucosamine exogène est rapidement captée par les cellules via les transporteurs au glucose et

phosphorylée par l'hexokinase, entrant ainsi sélectivement dans la voie des hexosamines an aval de

l'enzyme limitante GFAT (Schleicher E.D. et al., 2000). Pour ces raisons, la glucosamine est

utilisée expérimentalement pour mimer une suractivation de la voie des hexosamines. Cependant, la

quantité de glucosamine exogène effectivement captée par les cellules varie certainement en

fonction du type cellulaire considéré. Ainsi, des différences de concentration intracellulaire en

glucosamine peuvent exister entre deux types cellulaires cultivés en présence de concentrations

extracellulaires de glucosamine identiques. Dans cette optique, même si certains résultats ont été

observés dans les deux modèles cellulaires étudiés, il faut rester prudent sur les analogies entre BRP

et RMC. Par ailleurs, la glucosamine est un agent pharmacologique puissant pouvant être toxique à

forte dose ou à long terme. Il est donc important de garder à l'esprit, lors de l'interprétation des

résultats obtenus, que ces effets toxiques potentiels peuvent masquer, dans les cellules, les effets

spécifiques de la glucosamine.

Dans un premier temps, nous avons étudié les effets d’un traitement avec la glucosamine sur

159

la prolifération cellulaire. Les résultats ont montré que la glucosamine diminue la prolifération des

péricytes et encore plus fortement celle des cellules mésangiales, de manière dose-dépendante.

Ensuite, nous avons déterminé les effets de la glucosamine sur le métabolisme des

gangliosides. Dans les BRP, les taux de GM1 et de GD3 sont augmentés, au détriment du GM3,

dont le taux diminue en réponse au traitement. Dans les RMC, une augmentation du taux des

gangliosides de la série-a, et particulièrement une très forte augmentation du GM2 et du GM1, a été

mesurée, au détriment du GD3, dont le taux est nettement diminué en réponse à la glucosamine.

Les mécanismes par lesquels la glucosamine peut affecter le métabolisme des gangliosides n’ont

pas été précisément explorés. Cependant, il est connu que la N-acétyl glucosamine peut modifier,

par une O-glycosylation simple, l’activité d’une grande variété de protéines et d’enzymes. Par

exemple, il a été montré que l’activité du facteur de transcription Sp1 peut être positivement

modulée par la liaison d’un résidu GlcNAc (Goldberg H.J. et al., 2002). Plusieurs enzymes du

métabolisme des gangliosides, notamment GM3, GD3 et GM2 synthases, présentent des sites de

liaisons potentiels à ce facteur de transcription dans leur promoteur. Il est donc possible que la

glucosamine puisse modifier les activités d’enzymes de biosynthèse des gangliosides en régulant

leur expression. Par ailleurs, il semble que les enzymes du métabolisme des gangliosides puissent

être régulées par phosphorylation (Bieberich E. et al., 1998; Gu X. et al., 1995). Or, sur certaines

protéines, O-glucosamine et O-phosphate peuvent occuper les mêmes sites (Wells L. et al., 2001). Il

est donc envisageable que ces enzymes soient directement régulées par O-glycosylation. Ces modes

de régulation pourraient expliquer l’augmentation de l’activité de la GM3 synthase observée dans

les BRP en réponse à la glucosamine. D’autre part, la glucosamine peut être convertie en différents

métabolites, notamment en acide sialique, composant caractéristique de tous les gangliosides. De

plus, la GlucNAc peut être isomérisée en N-acétylgalactosamine (GalNAc), pouvant elle-même être

incorporée dans la structure de certains gangliosides, tels le GM2 et le GM1. Il est donc probable

que la glucosamine affecte le métabolisme des gangliosides par action de masse, en fournissant des

quantités importantes de précurseurs glycosidiques utilisés comme substrats pour leur biosynthèse.

La glucosamine affecte le métabolisme des gangliosides dans les deux types cellulaires d’intérêt.

Cependant, alors que le traitement inhibe à la fois la prolifération des BRP et des RMC, les

modifications du profil en gangliosides observées en réponse à la glucosamine se sont révélées

différentes en fonction du type cellulaire considéré. Il est possible que l’augmentation des

gangliosides de la série-a (GM1 dans les BRP et GM2 et GM1 dans les RMC), facteur commun aux

deux types cellulaires, soit en partie responsable de l’inhibition de prolifération induite pat le

traitement avec la glucosamine. Il est aussi envisageable que les différents gangliosides agissent,

éventuellement selon des mécanismes distincts, en fonction du type cellulaire pour concourir à la

diminution de prolifération observée. Il a déjà été évoqué dans la partie précédente qu’un certain

160

nombre de gangliosides exercent un effet anti-prolifératif via une interaction avec la voie de

signalisation de facteurs de croissance. Par ailleurs, le GD3 principalement, a été décrit comme un

médiateur intracellulaire de l’apoptose, plus précisément pour son rôle dans la transition de

perméabilité mitochondriale, le relarguage de cytochrome c et l’activation de caspase.

L’augmentation importante de GD3 observée dans les BRP pourrait ainsi jouer un rôle primordial

dans la diminution de prolifération causée par la glucosamine, en participant à l’induction d’un

processus apoptotique. Les résultats préliminaires que nous avons obtenus en mesurant l’apoptose

dans les péricytes traités à la glucosamine (mesure de l’activité caspase 3 et détection d’une

fragmentation de l’ADN) ne vont cependant pas dans ce sens. Enfin, les gangliosides ont déjà été

impliqués, bien que plus rarement, dans la régulation du cycle cellulaire. Nakatsuji et al. ont par

exemple montré que le GM3 induit un arrêt du cycle cellulaire des astrocytes en partie via une

augmentation de l’expression de p27Kip1 (Nakatsuji Y. et al., 2001).

Dans la suite de l’étude, nous avons choisi de nous intéresser plus en détail aux mécanismes

par lesquels la glucosamine, par l’intermédiaire des gangliosides, peut inhiber la prolifération

cellulaire. Ce travail, plus mécanistique, a été mené uniquement dans les RMC.

Premièrement, les courbes de croissance des RMC en réponse à la glucosamine ont montré

un blocage assez rapide de la prolifération cellulaire. Réalisées à la fois sur le nombre de cellules et

la quantité de protéines, elles ont également mis en évidence une hypertrophie des cellules traitées.

Cette hypertrophie a également été révélée par l’augmentation de taille des cellules, aisément

remarquable par simple observation au microscope. L’hypertrophie des cellules mésangiales est une

caractéristique pathologique typique de la néphropathie diabétique. Ce phénomène a été décrit à la

fois in vivo dans les reins de rats rendus diabétiques par injection de streptozotocine ou de souris

db/db et in vitro dans des cellules mésangiales cultivées en présence de fortes concentrations de

glucose (Wolf G., 2000). Il est particulièrement important car, associé à une hypersécrétion de

protéines de la matrice extracellulaire, il participe au grossissement puis à la sclérose du glomérule,

altérations majeures de la néphropathie diabétique, étroitement corrélées aux manifestations

cliniques comme l’albuminurie, l’hypertension ou la diminution du taux de filtration glomérulaire.

D’autre part, il a été montré que cette hypertrophie est consécutive à un arrêt des cellules

mésangiales en phase G1 du cycle cellulaire. C’est pourquoi nous avons ensuite étudié le cycle

cellulaire des RMC traitées avec la glucosamine. Les résultats ont montré qu’un traitement avec une

concentration de 0,5 mM de glucosamine induit un blocage des cellules en phase G0/G1 du cycle

cellulaire, en accord avec les observations déjà faites in vivo et in vitro. Ces résultats sont les

premiers, à notre connaissance, à montrer que la glucosamine peut bloquer le cycle cellulaire et

induire l’hypertrophie des cellules mésangiales. Par contre, il s’est avéré qu’un traitement avec 5

161

mM de glucosamine cause un blocage en phase G2/M. Ces observations montrent clairement qu’une

faible et une forte concentration de glucosamine exercent des effets différents sur les RMC. Ces

différences pourraient s’expliquer à la lumière de récents travaux de Marshal et al. dans les

adipocytes (Marshall S. et al., 2004). Ces auteurs ont en effet montré que des concentrations de

glucosamine assez élevées (>2 mM) causaient une accumulation massive de GlcN-6-P, un produit

intermédiaire de la voie de l’hexosamine, accompagnée par une chute du taux d’ATP. Au contraire,

ces effets n’étaient pas observés à de plus faibles concentrations de glucosamine (0,25 mM) ou bien

à des fortes concentrations de glucose (20 mM). Ces observations ont été faites avec des adipocytes

et il est délicat de les extrapoler aux cellules mésangiales. Cependant, nous pouvons émettre

l’hypothèse qu’à 5 mM de glucosamine, d’autres mécanismes absents à des doses plus faibles, se

mettent en place, tels la déplétion en ATP, exerçant des effets délétères sur les cellules et

conduisant au blocage en phase G2/M. Il est alors probable que l’utilisation de faibles

concentrations de glucosamine soit plus adaptée pour révéler les effets spécifiques de la

glucosamine et découvrir les effets de l’hyperglycémie médiés par la voie de l’hexosamine.

Pour préciser les mécanismes responsables de l’arrêt du cycle cellulaire observé suite aux

traitements avec la glucosamine, l’expression de deux inhibiteurs de kinases cycline–dépendantes

p21Waf1/Cip1 et p27Kip1 a été évaluée. Les résultats ont montré que l’expression de p21Waf1/Cip1 est

environ triplée en réponse à la glucosamine, suggérant ainsi son rôle dans l’arrêt du cycle cellulaire

des RMC. Par contre, l’expression de p27Kip1 est plutôt diminuée par le traitement avec la

glucosamine. Une expression diminuée ou inchangée de cette protéine a déjà été décrite dans les

glomérules de modèles d’animaux diabétiques (Griffin S.V. et al., 2003; Kuan C.J. et al., 1998),

ainsi que dans des cellules mésangiales cultivées en présence de fortes concentrations de

glucose(Griffin S.V. et al., 2003). Ces résultats suggèrent que les effets de la glucosamine sur le

cycle cellulaire des RMC sont spécifiquement médiés par p21Waf1/Cip1. D’autre part, p21Waf1/Cip1 a

été décrit comme un régulateur clé de l’hypertrophie. Fan et al. ont montré que l’inhibition de cette

protéine à l’aide d’oligonucléotides antisens permet de diminuer l’hypertrophie de cellules

mésangiales induites par l’hyperglycémie et l’IGF-I (Fan Y.P. et al., 2004). De plus, in vivo, des

souris diabétiques dont le gène de p21Waf1/Cip1 a été invalidé n’ont pas développé d’hypertrophie

glomérulaire (al Douahji M. et al., 1999). Ces travaux suggèrent que l’augmentation de l’expression

de p21Waf1/Cip1 pourrait également participer aux mécanismes conduisant à l’hypertrophie des

cellules mésangiales observée ici en réponse à la glucosamine. Par ailleurs, étant donné que les

effets de la glucosamine sur les RMC sont similaires à ceux de fortes concentrations de glucose déjà

décrits dans la littérature, nous pouvons penser que les effets de l’hyperglycémie sur la croissance et

l’hypertrophie des cellules mésangiales sont, au moins en partie, médiés par la voie de

l’hexosamine et p21Waf1/Cip1.

162

Deuxièmement, nous avons déterminé l’effet sur le profil en gangliosides d’un traitement de

48h avec une concentration faible ou une concentration forte de glucosamine. Les modifications se

sont révélées similaires à celles déjà observées suite à un traitement pendant un passage, avec en

particulier une augmentation massive de GM2 et GM1. Nous avons ensuite cherché à savoir si ces

gangliosides peuvent être des médiateurs de la glucosamine, en étudiant l’effet de GM2 et GM1 sur

l’hypertrophie et le cycle cellulaire des RMC. Le traitement avec ces deux gangliosides occasionne

en effet une augmentation du rapport protéines/cellules, marqueur de l’hypertrophie. De plus,

l’analyse du cycle cellulaire des RMC exposées à GM2 ou GM1 a révélé un blocage en phase

G0/G1, associé à une augmentation de l’expression de p21Waf1/Cip1. Ainsi, le GM2 et le GM1

exogènes reproduisent l’effet d’une faible concentration de glucosamine sur l’hypertrophie et l’arrêt

du cycle cellulaire des RMC. Ces observations suggèrent que ces gangliosides sont effectivement

en cause dans les effets de la glucosamine sur les RMC et proposent la modulation des taux de

gangliosides comme un nouveau mécanisme d’action de la voie de l’hexosamine. Comme il a déjà

été signalé, très peu d’études, à part celle de Nakatsuji et al. montrant l’effet du GM3 sur l’arrêt du

cycle cellulaire des astrocytes (Nakatsuji Y. et al., 2001), ont impliqué les gangliosides dans le

cycle cellulaire. Nos résultats suggèrent non seulement le rôle de GM2 et GM1 dans le blocage du

cycle cellulaire, mais indiquent également que les gangliosides pourraient participer aux

mécanismes conduisant à l’hypertrophie cellulaire.

163

METABOLISME DES GANGLIOSIDES DU

CORTEX RENAL DE SOURIS db/db

Les résultats précédemment obtenus in vitro suggèrent que les gangliosides sont impliqués dans les

perturbations de prolifération cellulaire causées par les AGE ou une activation de la voie de

l’hexosamine. Ils soulignent ainsi le rôle potentiel des gangliosides dans les complications

microangiopathiques du diabète. Nous avons donc cherché à déterminer si le métabolisme des

gangliosides pouvait également être affecté par un environnement diabétique in vivo. Pour cela, les

activités GM3 et GD3 synthase ont été mesurées et le profil en gangliosides a été analysé sur des

homogénats de cortex de souris contrôle db/m et de souris diabétiques db/db de 11 semaines. Ces

souris obèses développent un profil diabétique type II et présentent une complication rénale

importante, proche de celle observée chez l’Homme.

I. MESURE DES ACTIVITES GM3 ET GD3 SYNTHASE

Le cortex rénal a été isolé, fragmenté puis homogénéisé. Les activités enzymatiques ont été

mesurées sur ces homogénats comme décrit dans la partie Matériel et méthodes.

Les résultats de la Figure 62 montrent que l’activité GM3 synthase est augmentée d’environ 80 %

alors que l’activité GD3 synthase est diminuée d’environ 50 % dans le cortex rénal des souris

diabétiques comparées aux souris contrôle.

164

A GM3 synthase B GD3 synthase

%du

con

trôle

contrôle db/db0

50

100

150

200

250

% d

u co

ntrô

le

*

0

20

40

60

80

100

120

contrôle db/db

*

A GM3 synthase B GD3 synthase

%du

con

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50

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60

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100

120

0

20

40

60

80

100

120

contrôle db/dbcontrôle db/db

*

Figure 62 : Les activités GM3 et GD3 synthase sont modifiées dans le cortex rénal de souris db/db. Les activités GM3

et GD3 synthases ont été mesurées sur des homogénats de cortex rénal de souris contrôle (db/m) et de souris db/db

comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Chez les souris contrôle, les activités GM3 et GD3 synthases étaient

de 0,6 et 21 pmoles/h/mg de protéines, respectivement. Les résultats sont exprimés en % du contrôle et représentent la

moyenne ± SEM de 4-6 animaux. *p<0,05 comparé au souris contrôle.

II. MESURE DES TAUX DE GM3

Les gangliosides du cortex de souris contrôle et db/db ont été extraits, purifiés puis analysés par

HPTLC et révélation au résorcinol. Le profil du cortex s’est avéré différent de celui des cellules

mésangiales. Le cortex contient en effet d’autres types cellulaires comme les cellules épithéliales ou

les podocytes, ce qui explique probablement cette différence. Le profil contient plus d’espèces de

gangliosides, moins nettement séparées et plus difficiles à identifier. C’est pourquoi seul le GM3,

majoritaire et bien identifiable, a été quantifié.

Les résultats présentés en Figure 63 mettent en évidence une augmentation, bien que non

significative, du taux de GM3 dans le cortex des souris db/db comparé aux souris contrôle. Cette

observation est conforme à l’augmentation d’activité GM3 synthase et à la diminution d’activité

GD3 synthase précédemment mesurées.

165

% d

u co

ntrô

le

contrôle db/db

0

50

100

150

200

% d

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contrôle db/dbcontrôle db/db

0

50

100

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200

0

50

100

150

200

Figure 63 : Le taux de GM3 est augmenté dans le cortex rénal de souris db/db. Les gangliosides ont été extraits

d’homogénats de cortex rénal de souris contrôle db/m et de souris db/db, puis purifiés et analysés par migration sur

plaque HPTLC et révélation au résorcinol. Les taux de GM3 représentés correspondent à la moyenne ± SEM de 4-6

animaux et sont exprimés en % du contrôle. Dans les souris contrôle, le taux de GM3 était de 66 ± 9 ng/mg de

protéines.

L’ensemble de ces résultats indique que le métabolisme des gangliosides est affecté dans le

cortex rénal des souris db/db.

III. DISCUSSION

Ces résultats obtenus ex vivo confortent l’implication des gangliosides dans la pathogénèse des

complications microangiopathiques du diabète et renforcent la signification biologique des résultats

obtenus in vitro sur les péricytes et les cellules mésangiales. Il est intéressant de noter que

l’augmentation de la GM3 synthase et du taux de GM3 ainsi que la diminution de l’activité GD3

synthase observées ici dans le cortex rénal de souris db/db ont également été observées dans les

cellules mésangiales rénales en réponse aux AGE. Les deux approches mettent particulièrement en

cause la GM3 synthase, les gangliosides de la série-a et le GM3 dans les perturbations liées au

diabète.

Peu d’études ont déjà mis en cause les gangliosides dans la microangiopathie diabétique. Zador et

al. ont rapporté une accumulation de GM3 dans les reins hypertrophiés de rats STZ. De plus, ils ont

montré que l’inhibition de la synthèse des gangliosides, par l’utilisation d’un inhibiteur de

166

glucosylcéramide synthase, permet de ramener le poids des reins de ces animaux diabétiques à un

niveau contrôle (Zador I.Z. et al., 1993). Une augmentation des taux d’ARNm de la GM3 synthase

a par ailleurs été mesurée dans le tissu adipeux de rats Zucker fa/fa (Tagami S. et al., 2002). Ces

données de la littérature obtenues sur différents modèles d’animaux diabétiques ainsi que ceux que

nous avons obtenus chez des souris db/db associent la GM3 synthase et les gangliosides de la série-

a à l’état diabétique.

167

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

168

L’objectif de ce travail était de déterminer : i) les effets de deux voies biochimiques du

diabète, les AGE et la voie des hexosamines, sur la prolifération des péricytes rétiniens et des

cellules mésangiales rénales, ii) les effets des AGE et des hexosamines sur le métabolisme des

gangliosides et iii) le rôle des gangliosides dans les processus de régulation de prolifération exercés

par les AGE et la voie des hexosamines. Nos résultats ont permis de montrer que les AGE et la

glucosamine, produit de la voie des hexosamines, inhibent la prolifération et affectent le

métabolisme des gangliosides à la fois dans les péricytes rétiniens et dans les cellules mésangiales

rénales. De plus, ils suggèrent que ces modifications du métabolisme des gangliosides pourraient

médier en partie les effets anti-prolifératifs des AGE et de la glucosamine. Si les gangliosides sont

souvent associés à des pathologies comme le cancer ou certaines maladies neurodégénératives, ce

travail est un des premiers à suggérer leur implication dans les complications microvasculaires du

diabète que sont la rétinopathie et la néphropathie diabétiques. Il ouvre un certain nombre de

perspectives, notamment thérapeutiques, et soulève des questions appelant des travaux

complémentaires à la fois en terme de mécanismes et de pertinence physiopathologique.

La glycation et la voie des hexosamines sont deux hypothèses biochimiques proposées pour

expliquer les altérations cellulaires et tissulaires causées par l’hyperglycémie. Différents modes

d’action ont été mis en évidence qui peuvent occasionner un effet délétère sur les cellules. Les AGE

sont connus pour agir notamment selon une cascade de signalisation impliquant un récepteur

membranaire, RAGE, le stress oxydant et l’activation de différents facteurs de croissance ou

cytokines. De plus, la formation des AGE altère la fonction des protéines et, au niveau des protéines

matricielles, perturbe le comportement cellulaire. La glucosamine, produit majeur de la voie des

hexosamines, peut quant à elle servir de précurseur pour la biosynthèse de glycoconjugués

importants pour les fonctions cellulaires. De plus, le résidu UDP-Nacétylglucosamine est utilisé

pour O-glycosyler un grand nombre de protéines, de structure, nucléaires ou facteurs de

transcription, et ainsi réguler leur fonction. Nous avons observé lors de cette étude que les AGE et

la glucosamine inhibent la prolifération des péricytes rétiniens et des cellules mésangiales

rénales. De plus, nos observations ont révélé que la glucosamine bloque le cycle cellulaire et

induit l’hypertrophie des cellules mésangiales. Ces perturbations de croissance cellulaire sont en

accord avec celles observées in vivo sur les péricytes rétiniens et les cellules mésangiales rénales.

En effet, la perte des péricytes rétiniens est une des altérations précoces de la rétinopathie

diabétique qui participe largement aux dysfonctions liées à la pathologie et à leur évolution vers des

troubles de la vue. L’arrêt de croissance, l’hypertrophie et finalement la disparition des cellules

mésangiales rénales sont des caractéristiques de la néphropathie diabétique, en partie responsables

de la sclérose glomérulaire et de la perte de la fonction rénale. La prévention des altérations de ces

169

deux types cellulaires serait un moyen d’enrayer la progression de la rétinopathie et de la

néphropathie diabétiques. Ces résultats soutiennent ainsi l’implication des AGE et de la

glucosamine dans les altérations cellulaires caractéristiques de ces deux complications

microvasculaires.

Notre étude met pour la première fois en cause la glucosamine dans le blocage du cycle cellulaire et

l’hypertrophie des cellules mésangiales. In vivo, l’hyperglycémie caractéristique du diabète, ainsi

qu’une régulation de l’enzyme limitante GFAT, donnent lieu à une modulation de la quantité de

glucosamine effectivement formée. Dans notre étude en revanche, l’utilisation directe de la

glucosamine exogène permet de contourner cette enzyme et d’apporter la glucosamine aux cellules

de manière artificielle. Il serait à ce stade important de vérifier la spécificité et la pertinence

physiologique de nos résultats en déterminant notamment s’ils sont reproductibles par un traitement

avec une concentration élevée de glucose et reversés par l’utilisation d’un inhibiteur de la GFAT

comme l’azaserine. Ceci permettrait de savoir si la modification du métabolisme des gangliosides

observée est effectivement dépendante de la GFAT et d’une activation de la voie des hexosamines.

Nous avons montré lors de ce travail, dans deux modèles cellulaires différents, que les AGE et la

glucosamine sont capables d’affecter le profil en gangliosides en agissant sur les activités de

leurs enzymes de biosynthèse. La modification du métabolisme des gangliosides pourrait

constituer un nouveau mécanisme d’action potentiel des AGE et de la glucosamine. Les

mécanismes selon lesquels ces produits régulent les activités des enzymes de biosynthèse des

gangliosides n’a pas été explorée. Il s’agirait par exemple de déterminer si la modification du

métabolisme des gangliosides fait partie de voies déjà décrites. La régulation des enzymes de

biosynthèse des gangliosides par la glucosamine met-elle en jeu une O-glycosylation de facteurs de

transcription ou des enzymes elle-mêmes, ou bien se fait-elle par apport de substrats et action de

masse ? La régulation par les AGE passe-t-elle par RAGE ? Dans les cellules mésangiales, les AGE

et la glucosamine induisent des modifications des gangliosides similaires : une augmentation des

gangliosides de la série-a et une diminution du GD3. Il serait intéressant de déterminer comment

ces deux voies biochimiques activées lors du diabète, peuvent converger vers le métabolisme des

gangliosides, notamment si les AGE et la glucosamine agissent parallèlement et indépendamment

ou si au contraire les deux voies se chevauchent et empruntent les mêmes mécanismes. Les AGE et

la glucosamine peuvent activer différents facteurs de transcription, respectivement par suite d’une

interaction avec RAGE et d’une O-glycosylation, notamment NF-κB ou Sp1 (Du X.L. et al., 2000;

Goldberg H.J. et al., 2002; Lander H.M. et al., 1997), facteurs qui réguleraient la transcription de

différents gènes d’enzymes de biosynthèse des gangliosides (Furukawa K. et al., 1996; Zeng G. et

al., 1998; Zeng G. et al., 2003). Il est donc possible que la régulation du métabolisme des

170

gangliosides se déroule finalement à un niveau transcriptionnel. La mise en évidence de

mécanismes d’action communs entre la voie de la glycation et celle des hexosamines permettrait

d’envisager des actions thérapeutiques communes pour contrer les deux voies à la fois.

Un bon nombre des effets cellulaires des AGE semble être médié par une interaction avec des

récepteurs membranaires spécifiques. Les récepteurs aux AGE (R1, R2, R3) sont plutôt décrits

comme des voies de captation et d’élimination des AGE (Iacobini C. et al., 2003; Lu C. et al., 2004)

alors que le RAGE est avancé comme la première étape d’une voie de signalisation menant à des

altérations cellulaires variées. La présence de RAGE a été détectée dans les péricytes (Yonekura H.

et al., 2003) et les cellules mésangiales (Vlassara H., 2001). Le blocage de l’interaction entre les

AGE et RAGE dans nos modèles cellulaires, par l’utilisation d’anticorps spécifiques ou l’inhibition

de l’expression du récepteur par des olgonucléotides anti-sens ou des SiRNA par exemple

permettrait de déterminer si l’inhibition de prolifération et la modification du métabolisme des

gangliosides causées par les AGE sont dépendantes de RAGE. Par ailleurs, le stress oxydant est une

caractéristique générale de l’état diabétique, qui pourrait être un point commun entre toutes les

voies biochimiques menant aux microcomplications. Les AGE ont été décrits comme générateurs

de stress oxydant, notamment dans les péricytes rétiniens (Denis U. et al., 2002). Il serait intéressant

de vérifier par l’utilisation d’anti-oxydant par exemple, si le stress oxydant joue un rôle dans l’effet

anti-prolifératif des AGE et la perturbation du métabolisme des gangliosides dans les péricytes et

les cellules mésangiales.

Le métabolisme et le profil en gangliosides sont donc modifiés dans les péricytes et les cellules

mésangiales, en réponse aux AGE comme à la glucosamine. L’ensemble des résultats obtenus dans

cette étude suggère que les gangliosides pourraient être des médiateurs de l’effet anti-

prolifératif des AGE et de la glucosamine sur les péricytes et les cellules mésangiales mais les

mécanismes par lesquels les gangliosides affectent la croissance cellulaire n’ont pas été totalement

élucidés. Certaines modifications sont communes aux deux types cellulaires ou aux deux

traitements alors que d’autres sont spécifiques (Figure 64). C’est le cas par exemple pour le GD3

dont le taux diminue sauf dans les péricytes traités avec la glucosamine où il est augmenté. La

signification de ces différences n’est pas claire et nous ne savons pas précisément quel(s)

ganglioside(s) est (sont) responsable(s) de l’effet observé. Les effets de la modification du profil en

gangliosides doivent-ils être attribués à un ganglioside en particulier, à une série ou bien à la

perturbation de l’équilibre entre les différentes séries ? Par quels mécanismes les gangliosides

agissent-ils sur la prolifération cellulaire ? Il est envisageable que tel ou tel ganglioside augmenté en

réponse au traitement agisse selon un mécanisme propre. Nous avons montré que le GM2 et le GM1

sont capables de bloquer le cycle cellulaire des cellules mésangiales et de causer une hypertrophie

via l’augmentation d’une protéine inhibitrice du cycle cellulaire, p21Waf1/Cip1. Par ailleurs, le GD3 a

171

été décrit dans la littérature pour induire l’apoptose alors qu’un grand nombre de gangliosides de la

série-a ont été impliqués dans une interaction avec les récepteurs aux facteurs de croissance. Les

différents gangliosides augmentés en réponse aux traitements pourraient agir de concours pour

inhiber la prolifération cellulaire. Il serait dans un premier temps intéressant de définir le

mécanisme selon lequel la prolifération des péricytes et des cellules mésangiales est inhibée en

réponse aux AGE ainsi qu’à la glucosamine : apoptose, nécrose, ralentissement ou blocage du cycle

cellulaire… afin d’éclaircir le mode d’action des gangliosides.

↑ GM3, GM2, GM1

↓ GD3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

↑ GM3, GM2, GM1

↓GD3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

↓ GM3

↑ GM1, GD3

↑ GM3 synthase

↑↑ GM2, GM1

↓ GD3

↓ GM3 synthase

Glu

cosa

min

eAG

E

Péricytes Cellules mésangiales

↓ prolifération

Souris db/db

↑GM3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

↑ GM3, GM2, GM1

↓ GD3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

↑ GM3, GM2, GM1

↓GD3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

↓ GM3

↑ GM1, GD3

↑ GM3 synthase

↑↑ GM2, GM1

↓ GD3

↓ GM3 synthase

Glu

cosa

min

eAG

E

Péricytes Cellules mésangiales

↓ prolifération↓ prolifération

Souris db/db

↑GM3

↑ GM3 synthase

↓ GD3 synthase

Figure 64 : Bilan des modifications du métabolisme des gangliosides dans les péricytes et les cellules mésangiales en

réponse aux AGE et à la glucosamine, et dans les souris db/db.

Cependant, dans les deux types cellulaires en réponse aux deux traitements, les modifications des

gangliosides semblent aller dans le sens d’une augmentation du flux vers les gangliosides de la

série-a : augmentation des gangliosides de la série-a et de l’activité GM3 synthase dans les péricytes

et les cellules mésangiales en réponse aux AGE, augmentation du GM1 et de l’activité GM3

synthase dans les péricytes et augmentation des gangliosides de la série-a dans les cellules

mésangiales traitées avec la glucosamine. De plus, une augmentation de l’activité GM3 synthase et

des taux de GM3 dans les cortex rénaux de souris db/db ont été mesurées (Figure 64). Les

gangliosides de la série-a et la GM3 synthase, enzyme limitante de leur biosynthèse, pourraient

constituer un dénominateur commun aux altérations de prolifération causées par les AGE et

la glucosamine dans les péricytes et les cellules mésangiales et par extension, commun à la

172

rétinopathie et à la néphropathie diabétiques. Là encore, il est nécessaire de vérifier la

pertinence physipathologique des observations faites en étudiant par exemple le métabolisme des

gangliosides au niveau des structures microvasculaires rétiniennes et rénales de patients diabétiques

notamment. La découverte de mécanismes communs aux deux microcomplications est

particulièrement attrayante car elle permettrait d’envisager des traitements efficaces sur les deux

microcomplications à la fois. L'inhibition de l'activité de la GM3 synthase et donc de l'augmentation

des gangliosides de la série-a pourrait permettre de limiter la chute de prolifération et/ou

l'hypertrophie des péricytes et des cellules mésangiales causées par l'environnement diabétique. La

GM3 synthase représenterait ainsi une cible thérapeutique commune contre les deux

microcomplications. L'intérêt des gangliosides, notamment de la série-a, et de la GM3 synthase

dans le cadre plus global du diabète est d’ailleurs vivement renforcé par de récents travaux

suggérant leur rôle dans les mécanismes de l'insulino-résistance (Sasaki A. et al., 2003; Tagami S.

et al., 2002; Yamashita T. et al., 2003).

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PUBLICATIONS

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a-series gangliosides mediate the effects of Advanced Glycation End-products on pericyte and mesangial cell proliferation A common mediator for retinal and renal microangiopathy ?

DIABETES, VOL. 54, JANUARY 2005

Running title: gangliosides as mediators of AGE effects

Elodie Masson, Lysiane Troncy, Daniel Ruggiero, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde, and

Samer El Bawab

Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM UMR 585, INSA-Lyon

Corresponding author: S. El Bawab, Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM

U585, INSA-Lyon, Louis Pasteur Bldg, 69621 Villeurbanne Cedex, France.

Phone: (+33) 4 72 43 81 12

Fax: (+33) 4 72 43 81 13

E-mail: samer.elbawab@merck.fr

Abstract Advanced glycation end-products (AGE) are involved in the development of microvascular

complications, including alterations of retinal pericyte and renal mesangial cell growth occurring

during diabetic retinopathy (DR) and nephropathy (DN), respectively. As gangliosides are

implicated in the regulation of cell proliferation, we hypothesized that AGE could exert cellular

effects in part by modulating ganglioside levels. Results of the present study indicate that AGE

caused an inhibition of both bovine retinal pericyte (BRP) and rat renal mesangial cell (RMC)

proliferation, associated with an increase of a-series gangliosides consecutive to GM3 synthase

activity increase and GD3 synthase activity inhibition. Similar modifications were also found in

renal cortex of diabetic db/db mice as compared to controls. Treatment of BRP and RMC with

exogenous a-series gangliosides decreased proliferation and blockade of a-series gangliosides with

specific antibodies partially protected the two cell types from the AGE-induced proliferation

decrease. Further, inhibition of GM3 synthase using specific SiRNA partially reversed the AGE

effects on mesangial cell proliferation. These results suggest that a-series gangliosides are mediators

of the adverse AGE effects on BRP and RMC proliferation. They also raise the hypothesis of

common mechanisms involved in the development of DR and DN.

Abbreviations: AGE, advanced glycation end-products; BRP, bovine retinal pericytes; BSA, bovine

serum albumin; DMEM, dulbecco’s modified eagle’s medium; DN, diabetic nephropathy; DR,

diabetic retinopathy; HPTLC, high-performance-thin-layer chromatography; PBS, phosphate-

buffered saline; RAGE, receptor for advanced glycation end-products; RMC, rat mesangial cells.

Microangiopathy is a chronic complication of diabetes mellitus characterized by structural and

functional alterations of microvessels. Retina and kidney are two main targets of the pathology

leading to diabetic retinopathy (DR) and nephropathy (DN), respectively. Diabetic retinopathy is

the second cause of blindness in developed countries (1). Capillaries undergo progressive structural

alterations such as basement membrane thickening, specific loss of pericytes and subsequent

modifications of endothelial cell proliferation and function. Combined with ischemia, these

alterations damage microvessel walls and favor excessive capillary permeability, edema,

microaneurisms and hemorrage, thereby threatening vision (2). Nephropathy is considered a major

cause of mortality in diabetic patients (3). One of the main features of the pathology is glomerular

enlargement. This is the consequence of basement membrane thickening and expansion of the

mesangium due to hypertrophy of growth-arrested mesangial cells and accumulation of

extracellular matrix proteins. Combined with haemodynamic defects, these events trigger

glomerular sclerosis, impaired glomerular filtration rate and microalbuminuria resulting in severe

renal insufficiency (4).

On the other hand, although the pathogenic basis of DR and DN are not fully understood at cellular

and molecular levels, regulation of cell proliferation, cell-cell and cell-matrix interactions seem to

play important role. A number of biochemical hypotheses explaining the mechanisms involved in

the development of diabetic microvascular complications have been proposed, among others, the

formation of Advanced Glycation End-products (AGE) (reviewed in (5)). Reducing sugars such as

glucose react non-enzymatically with amino-groups of proteins, lipids and nucleic acids through a

series of reactions finally producing AGE. Glycation is glucose concentration-dependent and is thus

enhanced in diabetes. It occurs preferentially with long-lived proteins exposed to blood glucose

such as extracellular matrix or circulatory proteins, altering their structure and function. In addition,

AGE can bind membrane receptors to induce cellular responses via generation of oxidative stress

(6,7), activation of nuclear factor-κB (5,7), and expression of various genes such as pro-

inflammatory cytokines or adhesion molecules (8,9). All these modifications have important

biological effects that can explain many of the changes observed in diabetic microvascular

complications, including increase in vascular permeability, increase in extracellular matrix

production and stiffness, and alteration in cell-matrix interactions and cell growth (10). Indeed,

many in vivo and in vitro studies have pointed out the implication of AGE in the development of

diabetic retinopathy and nephropathy (10,11).

Gangliosides are glycosphingolipids concentrated in plasma membrane microdomains and

characterized by the presence of sialic acid in their structure. Successive sialylations of

lactosylceramide lead to monosialoganglioside GM3, disialoganglioside GD3, and

trisialoganglioside GT3. These gangliosides are then converted by the sequential actions of

glycosyltransferases and sialyltransferases into more complex gangliosides to form the a-, b-, and c-

series, respectively (12). Gangliosides are known to play major roles in cell-cell and cell-matrix

recognition via interactions with adhesion receptors such as integrins, matrix proteins, or with other

glycosphingolipids. Moreover, gangliosides, and in particular the a-series gangliosides, have been

implicated in the regulation of cell proliferation, through modulation of different growth factor

activities (13). As AGE are implicated in many perturbations of cell growth and viability occurring

during DR and DN, we hypothesized that gangliosides could participate in mediating their effects.

In the present study, we investigated the effect of AGE on the proliferation of two cell types, retinal

pericytes and renal mesangial cells, involved in DR and DN, respectively. Results indicated that

AGE cause an inhibition of proliferation of both cell types at least in part by accumulating the a-

series gangliosides. The observations suggest that the a-series gangliosides might represent a

common mechanism involved in cellular alterations occurring during the development of DR and

DN.

RESEARCH DESIGN AND METHODS

Cell isolation and culture. Bovine retinal pericytes (BRP) were obtained from microvessels of

bovine retinas as previously described (14). Briefly, microvessels fragments were isolated from

freshly dissected bovine retinas after Dounce homogenization and collagenase-dispase digestion.

Microvessels fragments were then trapped onto a 40 µm nylon filter and plated in 6 cm fibronectin-

coated dishes. Primary cultures were grown in dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)

supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Invitrogen Corporation, N.Y., USA), 1%

glutamine and 1% penicillin/streptomycin (Sigma). Outgrowth of pericytes from the microvessels

occurred after about 48 h. BRP cultures were 100% pure as characterized on the basis of

morphological criteria and immunostaining as previously described (14). Cells were cultured up to

the second passage during which BRP were treated.

Rat renal mesangial cells (RMC) were obtained from glomeruli purified from young male Wistar

rat (Charles River, L’Arbresle, Fance). Briefly, cortex fragments were isolated from freshly

removed kidneys. Glomeruli were separated by differential sieving as previously described (15) and

plated in 6 cm fibronectin-coated dishes in DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum, 1%

glutamine and 1% penicillin/streptomycin. Outgrowth of RMC from the glomeruli occurred after

about 3 weeks and cells were cultured in the same medium supplemented with 15% fetal bovine

serum and used between 5th and 15th passages. RMC were characterized by morphological criteria

and by immunostaining as previously described (15)

Isolation of mice renal cortex. Renal cortex fragments were isolated from kidneys of eleven weeks

diabetic db/db and control db/m mice (Charles River). Briefly, animals were anaesthetized, sacrified

and kidneys were removed. Kidney cortex fragments were then dissected and mechanically

homogenized with a Dounce homogenizer in 25 mM Hepes, 1 mM EDTA, 10 µl/ml proteases

inhibitors.

AGE preparation and treatment. AGE were prepared as previously described (16) by incubation

of fatty acid free and low endotoxin bovine serum albumin (7.2 mg/ml final concentration) (Sigma)

with 100 mM methylglyoxal (Sigma) at 37°C for 50 hours. Bovine serum albumin (BSA) in the

absence of methylglyoxal was incubated in the same conditions and used as a control preparation

(control BSA). AGE or control BSA (3 µM final concentrations) were added to the culture media

24 h after seeding. Each cell type was treated during one passage (about 7 days for BRP and 4 days

for RMC). Cultured medium was replaced by fresh medium every 2 days.

Measurement of cell growth. At the end of the treatment, cells were harvested with trypsin and

cell pellets were washed twice with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) (Sigma). For each

sample, an aliquot of cells was counted using a haemocytometer to determine the cell number.

Another aliquot was used to measure proteins according to Bradford.

Ganglioside analysis. For metabolic labelling of gangliosides, 0.2 µCi/ml or 1 µCi/ml for labelling

experiments with high specific activity (GM2 and GM1 measurement experiments) of [14C(U)]D-

Galactose (329.5 mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) were added to the media

overnight. Cells were then collected by tripsynation and washed 3 times with PBS. Extraction of

gangliosides from cell pellets or cortex homogenates was performed as previously described by

Natalizio et al. (17). Briefly, total lipids were extracted with chloroform (C)/methanol (M) (1:1, v/v)

and submitted to partition with C/M/PBS 1 mM (10:10:7, v/v/v). The upper phases containing

gangliosides were next desalted on C18 silica gel column (Waters Corporation, Milford, MA) and

analyzed by HPTLC (Merck, Darmstadt, Germany). Plates were developed in C/M/0.2% CaCl2

(55:45:10, v/v/v) and gangliosides were visualized by autoradiography using phosphor screen and

Storm 820 (Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA) and by

resorcinol staining (resorcinol 0.3% (Sigma), 0.03% CuSO4, 30% HCl) with Image Master VDS-

CL (Amersham Pharmacia Biotech). Quantification was done with Image Quant (Molecular

Dynamics). As GT1b is absent in both BRP and RMC ganglioside profiles, it was added as internal

standard in the samples before lipid extraction.

Measurement of GM3 and GD3 synthase activities. At the end of treatment, cells were washed

with PBS, incubated for 20 min at 4°C in 50 µl lysis buffer (20 mM sodium cacodylate pH 6.6

(Sigma), 0.2% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10 µl/ml proteases inhibitors, Calbiochem, La Jolla,

CA, USA) and then collected by scrapping. Four dishes of BRP (~2-3 × 106 cells) and 3 dishes of

RMC (~3-6 × 106 cells) were pooled. Cell lysates were centrifuged at 10,000g for 5 min, and

proteins in the supernatants were used to measure enzyme activity. Cortex homogenates were

centrifuged at 1000g for 2 min, and the postnuclear supernatant was used to measure enzyme

activities. Equal amounts of proteins from each sample (about 500 µg for cells and 200-400 µg for

cortex) were used to perform the assay. Samples were mixed with an equal volume of reaction

buffer containing at final concentrations: 0.1 mM lactosylceramide or GM3 (Matreya, Biovalley,

Marne la Vallée, France) for GM3 and GD3 synthase activities, respectively, and 4 µCi/ml [sialic-

4,5,6,7,8,9-14C]CMP-sialic acid (325.2 mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences), 100 µM CMP-

sialic acid (Sigma), 10 mM MgCl2, 0.2% Triton X-100, 100 mM sodium cacodylate pH 6.6. After

shaking, the reaction mixtures were incubated at 37°C for 150 min. Reactions were stopped by

loading the samples on silica gel 60 columns (Merck) to separate excess substrates from products.

After washing the columns with water, gangliosides were eluted with C/M (1:1, v/v), finally

separated by TLC (Merck) and reaction products were revealed by autoradiography. Enzyme

activities were expressed as pmoles of product formed/hour/mg proteins.

Treatment with exogenous gangliosides. To evaluate the effect of exogenous gangliosides on

BRP and RMC proliferation, cells were cultured in 96 wells plates. Exogenous glycolipids GM3,

GM2, GM1, GD1a, glucosylceramide and lactosylceramide (Matreya) were added to the culture

complete medium at a final concentration of 50 µM in the form of complexes with BSA at a ratio of

1:1 in DMEM–10 mM Hepes, pH 7.4. At the end of the treatment, cells were washed twice with

PBS and lysed for 30 min at 37°C in 50 µl Ripa lysis buffer (PBS 10 mM, NP40 1% (Pierce, Perbio

Science, Brebières, France), sodium deoxycholate 0.5%, SDS 0.1%, 10 µl/ml proteases inhibitors).

Total proteins were finally measured using the BCA protein assay (Pierce) to assess cell

proliferation, as in our experiments cell number correlated with total protein concentrations (see

Fig. 1).

Treatment with anti-a-series ganglioside antibodies. In order to block the potential effects of a-

series gangliosides, cells were cultured in 96 wells plates and treated with 3 µM of AGE or control

BSA in the presence or absence of 50 µg/ml of polyclonal anti–GM2 (Calbiochem) or anti–GM1

(Matreya) antibodies. Rabbit IgG (Sigma) was used as a control. At the end of the treatment, cells

were washed twice with PBS, lysed in 50 µl Ripa lysis buffer and proteins were measured to assess

cell proliferation.

Transfection of RMC with GM3 synthase SiRNA. In order to block GM3 synthase activity,

RMC were grown in 6-wells plates to 30 % confluence and transfected with specific GM3 synthase

SiRNA designed against rat cDNA sequence (Ambion, Huntingdon, UK) using Oligofectamine

reagent (Invitrogen Corporation). The GM3 synthase antisense sequence used was

GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt. In preliminary experiments, dose-response study was

performed by transfecting cells with increasing concentrations of SiRNA (0-800 nM). After 72 h of

transfection, GM3 synthase activity was measured on homogenates of transfected cells.

Proliferation was next assayed in SiRNA transfected cells. To this end, 24 h after transfection with

400 nM SiRNA, cells were treated with 3 µM of either control BSA or AGE (3 days). Cells were

then washed twice with PBS, lysed in Ripa lysis buffer and proteins were measured to assess cell

proliferation.

Statistical analysis. Data are expressed as means ± SEM and presented as percentage of controls.

In cell studies, the Wilcoxon signed-rank test was used to define the significance of the difference

between groups. For GM3 and GD3 synthase activity in mice experiments, the Student t-test was

used. p< 0.05 was considered as statistically significant.

RESULTS AGE inhibit pericyte and mesangial cell proliferation. To compare the effects of AGE on

pericyte and mesangial cell proliferation, cells were treated with either BSA or AGE 3 µM for 4-7

days. Cell counting revealed that AGE reduced pericyte and mesangial cell numbers by 33% and

40%, respectively (Fig. 1). Total proteins were also measured, found diminished, and correlated to

cell number. The results show similar adverse effects of AGE on both pericyte and mesangial cell

proliferation, and led us to investigate common mechanisms involved in the AGE response in these

two cell types.

AGE increase the a-series gangliosides in pericytes and mesangial cells. Previous results from

our laboratory suggested that AGE modulate gangliosides profile of retinal microvascular cells (17).

To this end, ganglioside patterns were analyzed in BRP and RMC in response to BSA control or

AGE. As shown in Figure 2A, ganglioside profile is cell type specific. Under control conditions,

main gangliosides in pericytes were GM3 (63% of all gangliosides detected) and GM1 (9%) of the

a-series gangliosides (Fig. 2B), and GD3 (28%) of the b-series gangliosides. Mesangial cell profile

differed by the very low amount of GD3 (5%), and in the a-series, by the presence of GD1a (20%),

with GM3 remaining the major ganglioside (75%).

An increase of the a-series gangliosides and a decrease of the b-series gangliosides were observed

in both AGE-treated cell types. In pericytes, the a-series gangliosides GM3 and GM1 were

increased by about 40% whereas the b-series ganglioside GD3 was decreased by 24% (Fig. 3A). In

mesangial cells, GM3 was increased by 33% whereas GD3 was decreased by 30%; GD1a levels

were not affected (Fig. 3B). Similar results were obtained by autoradiography analysis after

galactose labelling (data not shown). As the a-series GM2 in BRP, GM2 and GM1 in RMC were

hardly detectable by resorcinol staining, cells were labeled with [14C]D-Galactose at high specific

activity and gangliosides were then analyzed in control and AGE treated cells. Results revealed that

GM2 was also increased by 55% in BRP (Fig 3C) and that GM2 and GM1 were increased by 25-

35% in RMC (Fig 3D). These results indicate that AGE induce similar gangliosides pattern

modifications in both pericytes and mesangial cells. They also suggest that the increase of the a-

series gangliosides might be a common mechanism underlying the decrease of cell proliferation.

AGE modulate GM3 and GD3 synthase activities in pericytes and mesangial cells. To

investigate the mechanism responsible for the observed a-series ganglioside increase, GM3 and

GD3 synthase activities were measured in control and treated cells. Results presented in Figure 4A

show that AGE treatment increased GM3 synthase activity by about 80% in pericytes and 50% in

mesangial cells, most likely through increase of Vmax of the reaction (data not shown). In parallel,

AGE treatment decreased GD3 synthase activity by about 60% in both cell types (Fig. 4B). These

results suggest that AGE exert similar mechanisms in RMC and BRP leading to a-series

gangliosides accumulation.

A-series gangliosides inhibit pericyte and mesangial cell proliferation. Previous literature data

have described gangliosides as growth suppressors notably in mesangial cells (18) and implicated

the a-series gangliosides in inhibition of cell proliferation (18-23). Thus, we investigated whether

exogenous addition of the a-series gangliosides affects pericyte and mesangial cell proliferation.

Cells were treated during one passage with 50 µM gangliosides and, as a control, with the non-

sialylated precursors glucosylceramide and lactosylceramide. Figure 5A shows that GM2, GM1 and

GD1a inhibited most efficiently pericyte and mesangial cell proliferation by 15-30%. GM3 slightly

inhibited pericyte proliferation but had no significant effect on mesangial cells. Glucosylceramide

and lactosylceramide used as controls had no effect. Because GM2 and GM1 are increased in BRP

and RMC in response to AGE, and as they alter proliferation of both cell types, we hypothesized

that these a-series gangliosides might be common mediators of the AGE effect. Thus, cells were

treated with AGE in the presence of anti-GM1 and anti-GM2 antibodies and proliferation measured.

In the control BSA-treated cells, proliferation was not different in the presence or absence of anti-

gangliosides antibodies (data not shown), and addition of IgG as a control to the AGE treatment did

not affect the AGE response. Treatment of cells with AGE in the presence of anti-GM2 and anti-

GM1 antibodies partially prevented the proliferation decrease of pericytes and mesangial cells (Fig.

5B). Together these observations suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and

GM1, are common mediators of the AGE-induced inhibition of proliferation of pericytes and

mesangial cells.

GM3 synthase SiRNA partially protects against the AGE effects. To further support the role of

a-series gangliosides in mediating the AGE effects, RMC were transfected with GM3 synthase

SiRNA. Preliminary experiments showed that the designed SiRNA indeed inhibited GM3 synthase

activity in RMC (Fig. 6A). Next, proliferation was measured in the transfected and treated cells. As

shown in Figure 6B, the effects of AGE on RMC proliferation were partially reversed in cells

transfected with GM3 synthase SiRNA. These results clearly show the implication of gangliosides

in mediating the AGE effects. It must be indicated that the partial effects could be explained by: (i)

the AGE effects were less potent than in previous experiments as cells were treated at higher

confluency in order to improve transfection efficiency and (ii) GM3 synthase activity was inhibited

only by about 50%. In fact, SiRNA concentrations higher than 400nM were not used to avoid non-

specific and toxic effects.

GM3 and GD3 synthase activities, and GM3 levels are modified in renal cortex of diabetic

mice. To assess the effect of a diabetic environment on ganglioside biosynthetic pathway ex vivo,

GM3 and GD3 synthase activities were measured on homogenates of renal cortex of the diabetic

db/db mice model. Results presented in Figure 7A-B show that GM3 synthase activity was

increased by 80% whereas GD3 synthase activity was decreased by 50% in diabetic mice renal

cortex as compared to controls (db/m). Gangliosides were also analyzed and revealed an increase,

although not statistically significant, of GM3 levels in the renal cortex of diabetic db/db mice

(Figure 7C). Altogether these results support the pathophysiological significance of the results

obtained in RMC and BRP treated with AGE.

DISCUSSION

Numerous studies have pointed out the crucial role of pericytes and mesangial cells in the

development of diabetic retinopathy (DR) and nephropathy (DN), respectively. Indeed, retinal

pericytes loss is one of the earliest hallmarks of DR, and growth-arrest, hypertrophy, and loss of

renal mesangial cells are typical features of DN. Thus, regulation of these two cell type proliferation

appears to be a pivotal pathophysiological process in microvascular complications. AGE, glycated

protein derivatives that notably accumulate in kidneys (24) and retina (25) of diabetic patients, have

been widely involved in the development of microvascular complications (5). In the present study,

we investigated the effect of AGE on BRP and RMC proliferation. Results showed that AGE

treatment indeed inhibited both cell types proliferation. These findings are consistent with previous

results obtained with other types of AGE in pericytes (26,27) and mesangial cells (28,29), thus

highlighting their pathophysiological relevance.

The effects of AGE have been extensively studied. However, mechanisms leading to alteration of

cell function and viability remain incompletely understood. On the other hand, although

gangliosides play a major role in cell growth and apoptosis, their potential involvement in diabetic

microvascular complications has been poorly studied. In the present work, we show that treatment

of BRP and RMC with AGE resulted in an increase of the a-series gangliosides concomitant with a

decrease of the b-series in both cell types. This increase could be explained by the observed

concomitant activation of GM3 synthase and inhibition of GD3 synthase activities, suggesting that

AGE regulate activity of these enzymes through yet undefined mechanisms.

On the other hand, evidence that the a-series gangliosides are likely to be responsible for the

observed proliferation decrease has been provided in the present study. Exogenous a-series

gangliosides application, particularly GM2 and GM1, inhibited BRP and RMC proliferation.

Moreover, treatment of cells with AGE in the presence of anti-GM1 or anti-GM2 partially protected

BRP and RMC against the proliferation decrease caused by AGE. Finally, inhibition of GM3

synthase using specific SiRNA partially reversed the AGE effects on RMC proliferation. Together,

these results suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and GM1, are involved in

mediating the anti-proliferative effect of AGE on BRP and RMC. The partial protection observed

using anti-GM2 and anti-GM1 antibodies or SiRNA approach might suggest that other pathways

are also involved in mediating the AGE effect. For example, a cascade involving oxidative stress

and ceramide accumulation has been proposed to induce BRP apoptosis in response to AGE (16).

The role of the a-series gangliosides is further supported by numerous studies showing that a-series

gangliosides decrease cell proliferation by modulating growth factor receptors signaling. For

example, a-series gangliosides (GM3, GM2, GM1, GD1a) have been described to inhibit epidermal

growth factor and platelet-derived growth factor receptor phosphorylation and signaling in different

cell types (19-22,30-32).

The potential role of gangliosides in diabetic microvascular complications is also supported by ex

vivo observations. Indeed, the present results show that GM3 and GD3 synthase activities are

increased and decreased, respectively, and that GM3 tends to accumulate in renal cortex of diabetic

db/db mice. Moreover, GM3 has been shown to accumulate in kidney of streptozotocin-induced

diabetic rats, and kidney hypertrophy was inhibited when ganglioside biosynthesis was blocked,

suggesting a crucial role of gangliosides in diabetes-induced renal hypertrophy (33).

On the other hand, recent studies have suggested the involvement of GM3 synthase and a-series

gangliosides in insulin resistance. Thus, GM3 synthase activity and its mRNA have been shown to

be increased in adipocytes treated with low concentrations of tumor necrosis factor α, and GM3

synthase mRNA levels were found to be increased in adipose tissues of Zucker fa/fa rats (34).

Furthermore, GM3 synthase knock-out mice showed increased sensitivity to insulin by enhanced

insulin receptor phosphorylation and mice were protected against high fat diet-induced insulin

resistance (35). Finally, mice overexpressing the human sialidase NEU3 showed reduced insulin-

stimulated phosphorylation of the insulin receptor and the insulin receptor substrate, suggesting that

GM2 and GM1, the possible sialidase products in transgenic tissues, attenuate insulin signaling

(36).

In conclusion, our data suggest that the a-series gangliosides, and in particular GM2 and GM1, are

mediators of the adverse AGE effects on pericyte and mesangial cell proliferation. Further,

gangliosides pathway appears to be a new and common AGE mechanism of action in both BRP and

RMC. These data also raise GM3 synthase and a-series gangliosides as potential targets for the

treatment of both DR and DN.

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Legends :

Fig. 1. AGE inhibit pericyte and renal mesangial cell proliferation. Cells were exposed to 3 µM BSA or AGE for 4 (RMC) and 7 (BRP) days. Cells were then trypsinized and counted using haemocytometer and total proteins were measured. Results are presented as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 (BRP) and 9 (RMC) independent experiments each performed in duplicates. * p < 0.05 vs control BSA. Fig. 2. Gangliosides pattern of pericytes and mesangial cells. (A) Gangliosides were extracted, separated by HPTLC, then detected by resorcinol staining and quantified. GT1b, absent in both cell types, was used as internal standard. (B) Scheme representing gangliosides biosynthesis pathway, modified from (12). Cer, ceramide; Glccer, glucosylceramide; Laccer, lactosylceramide. Fig. 3. AGE modulate gangliosides pattern in pericytes and mesangial cells. Pericytes (A) or mesangial cells (B) were exposed to 3 µM BSA or AGE for 7 and 4 days, respectively. Gangliosides were analyzed by HPTLC and revealed by resorcinol spraying as described under Research designs and Methods. In control conditions, GM3, GM1 and GD3 quantities in BRP were 2.39 ± 0.19, 0.34 ± 0.03 and 1.05 ± 0.11 µg/mg proteins, respectively. GM3, GD3 and GD1a quantities in RMC were 4.03 ± 0.28, 0.27 ± 0.07 and 1.08 ± 0.11 µg/mg proteins, respectively. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 (BRP) and 9 (RMC) independent experiments each performed in duplicates. * p<0.05 vs control BSA. (C) and (D) Gangliosides were metabolically labelled with 1 µCi/ml [14C]Galactose and analyzed by autoradiography. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 3 independent experiments.

Fig. 4. AGE increase GM3 synthase activity and decrease GD3 synthase activity in pericytes and mesangial cells. Cells were treated with 3 µM BSA or AGE. GM3 (A) and GD3 (B) synthase activities were measured on cell homogenates as described under Research design and Methods. Control activities were 2.7 and 0.8 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively, in BRP; 5.1 and 0.7 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively, in RMC. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 4-5 independent experiments. * p<0.05 vs control BSA. Fig. 5. A-series gangliosides inhibit cell proliferation. (A) Pericytes or mesangial cells were treated with gangliosides-BSA complexes for one passage. (B) Cells were treated with 3 µM BSA or AGE in the presence or absence of 5µg per well of IgG, anti-GM2 or anti-GM1 polyclonal antibodies. At the end of the treatment, total proteins were measured. Results are expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 5-6 independent experiments each performed in triplicates. * p<0.05 vs control (A) or AGE treated cells (B).

Fig. 6. Transfection with GM3 synthase SiRNA protects RMC.

(A) TLC separation of GM3 product obtained from GM3 synthase activity in homogenates of RMC. Mesangial cells were transfected with increasing concentrations of GM3 synthase SiRNA and GM3 synthase activity was measured after 72 h. Ctr, cells transfected with oligofectamine without SiRNA. (B) 24 h after transfection with 400 nM GM3 synthase SiRNA, cells were treated with 3 µM BSA control or AGE. At the end of treatment, total proteins were measured. Results are expressed as percentage of control BSA and represent means ± SEM of 6 independent experiments. * p<0.05 vs AGE treated control cells.

Fig. 7. GM3 and GD3 synthase activities, and GM3 levels are modulated in renal cortex of diabetic mice. GM3 (A) and GD3 (B) synthase activities were measured on homogenates of renal cortex from control (db/m) and db/db mice. Control activities were 0.6 and 21 pmoles/hour/mg proteins for GM3 and GD3 synthase, respectively. (C) GM3 levels of control (db/m) and db/db mice renal cortex are represented. In control mice, GM3 levels were 66 ± 9 ng/mg proteins. Results are expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 4-6 animals. * p<0.05 vs control mice.

Figure 1:

0

20

40

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% o

f con

trol

cell number

total proteins

A BRP

B RMC

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f con

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BSA AGE

BSA AGE

cell number

total proteins

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* *

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% o

f con

trol

cell number

total proteins

A BRP

B RMC

0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

BSA AGE

BSA AGE

cell number

total proteins

0

20

40

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100

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f con

trol

0

20

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120

0

20

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100

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% o

f con

trol

cell number

total proteins

cell numbercell number

total proteinstotal proteins

A BRP

B RMC

0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

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0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

BSA AGEBSA AGE

BSA AGEBSA AGE

cell number

total proteins

cell numbercell number

total proteinstotal proteins

**

* *

Figure 2:

GM3

GT1b

GD3

GM2

GM1

GD1a

BRP RMCstandards

A

Cer

GlcCer

LacCer

GT1a

GD2

GD1b

GT1b

GQ1b

GT3

a-series

GM3 synthase

c-series

b-series

o-series

GM3

GM1

GM2

GD3

GD1a

B

GD3 synthase

GM3

GT1b

GD3

GM2

GM1

GD1a

BRP RMCstandards

A

Cer

GlcCer

LacCer

GT1a

GD2

GD1b

GT1b

GQ1b

GT3

a-series

GM3 synthase

c-series

b-series

o-series

GM3

GM1

GM2

GD3

GD1a

B

GD3 synthase

Figure 3:

BSA AGE0

50

100

150

% o

f con

trol

GM3GM1GD3

A B

C D

BRP RMC

GM3GD1aGD3

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150

% o

f con

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BSA AGE

BSA AG E0

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GM2 GM2GM1

* *

*

*

*

BSA AG E0

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BSA AGE0

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GM3GM1GD3

BSA AGEBSA AGE0

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% o

f con

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GM3GM1GD3

GM3GM1GD3

A B

C D

BRP RMC

GM3GD1aGD3

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100

150

% o

f con

trol

BSA AGE

GM3GD1aGD3

GM3GM3GD1aGD1aGD3GD3

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% o

f con

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f con

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% o

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BSA AGEBSA AGE

BSA AG E0

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% o

f con

trol

GM2GM2 GM2GM1GM2GM1

* *

*

*

*

BSA AG E0

50

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f con

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% o

f con

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Figure 4:

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BRP RMC

% o

f con

trol

BSAAGE

*

*

A

B

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BRP RMC

% o

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BRP RMC

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BSAAGE

*

*

A

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BRP RMC

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BSAAGE

*

*

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BRP RMC

% o

f con

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BSAAGEBSAAGE

*

*

A

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BRP RMC

% o

f con

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BSAAGE

**

B

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100

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BRP RMC

% o

f con

trol

BSAAGE

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100

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BRP RMC

% o

f con

trol

BSAAGEBSAAGE

**

Figure 5:

A

B

BRP

contr

olGM3

GM2GM1

GD1a

Gluccer

Laccer

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f con

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* * * *

RMC

contr

olGM3

GM2GM1

GD1a

Gluccer

Laccer

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f con

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* * *

BRP

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BSAAGE

control anti GM2

anti GM1

IgG

*

RMC

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* *

BSAAGE

control anti GM2

anti GM1

IgG

A

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BRP

contr

olGM3

GM2GM1

GD1a

Gluccer

Laccer

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% o

f con

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contr

olGM3

GM2GM1

GD1a

Gluccer

Laccer

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RMC

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olGM3

GM2GM1

GD1a

Gluccer

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f con

trol

contr

olGM3

GM2GM1

GD1a

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* * *

BRP

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BSAAGE

control anti GM2

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BSAAGEBSAAGE

control anti GM2

anti GM1

IgGcontrol anti GM2

anti GM1

IgG

*

RMC

% o

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* *

BSAAGE

control anti GM2

anti GM1

IgG0

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* *

BSAAGEBSAAGE

control anti GM2

anti GM1

IgGcontrol anti GM2

anti GM1

IgG

Figure 6:

A

B

Ctr + GM3synthaseSiRNA

*

% o

f con

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BSAAGE

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100

+ GM3 synthase SiRNA (nM)

200 400 800Ctr 100

fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52

A

B

Ctr + GM3synthaseSiRNA

*

% o

f con

trol

BSAAGEBSAAGE

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100

0

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60

80

100

+ GM3 synthase SiRNA (nM)

200 400 800Ctr 100

fold change 1 0.82 0.66 0.54 0.52

Figure 7:

control db/db0

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% o

f con

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A

*%

of c

ontr

ol

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control db/db

B

*

C

% o

f con

trol

control db/db0

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100

150

200

control db/db0

50

100

150

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250

% o

f con

trol

A

*%

of c

ontr

ol

0

20

40

60

80

100

120

control db/db

B

*

control db/db0

50

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control db/dbcontrol db/db0

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Involvement of gangliosides in glucosamine-induced

proliferation decrease of retinal pericytes

GLYCOBIOLOGY ADVANCE ACCESS PUBLISHED DECEMBER 29, 2004

Elodie Masson, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde, and Samer El Bawab

Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM UMR 585, INSA-Lyon

Corresponding author: S. El Bawab, Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK Santé-INSERM

U585, INSA-Lyon, Louis Pasteur Bldg, 69621 Villeurbanne Cedex, France.

Phone: (+33) 4 72 43 81 12

Fax: (+33) 4 72 43 81 13

E-mail: samer.elbawab@merck.fr

Keywords: diabetic retinopathy/gangliosides/hexosamine pathway/pericytes

Abstract The hexosamine pathway (HP) is a biochemical hypothesis recently proposed explaining cellular

alterations occurring during diabetic microvascular complications. Diabetic retinopathy is a

common microvascular complication of diabetes, and it is known that cell proliferation is severely

affected during the development of the disease. Particularly, early stages are characterized by death

of the retinal microvascular cells, pericytes. Gangliosides have often been described to regulate cell

growth, however very few studies focused on the potential role of gangliosides in diabetic

microvascular alterations. The aim of the present study was to investigate the effect of the HP

activation on pericyte proliferation and to determine the potential implication of gangliosides in this

process. Results indicate first that HP activation, mimicked by glucosamine treatment, decreased

pericyte proliferation. Second, glucosamine treatment induced a modification of gangliosides

pattern, particularly, GM1 and GD3 were significantly increased. Next, results showed that

exogenous addition of a-series gangliosides (GM3, GM2,GM1, GD1a) and b-series ganglioside

(GD3) caused a decrease of pericyte proliferation, whereas non-sialylated precursors

glucosylceramide and lactosylceramide were without effect. Further, when ganglioside biosynthesis

was blocked using PPMP, a glucosylceramide synthase inhibitor, the effects of glucosamine on

pericyte proliferation were partially reversed. Our results suggest that, in retinal pericytes,

gangliosides and particularly GM1 and GD3 that are increased in response to glucosamine, are

involved in the anti-proliferative effect of glucosamine. These observations also underlie the

potential involvement of gangliosides in a pathological context, such as diabetic microvascular

complications.

Introduction

Gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their

oligosaccharidic portion. After the initial glycosylation step of ceramide catalyzed by

glucosylceramide synthase, successive sialylations and glycosylations lead to a wide diversity of

gangliosides. They are concentrated in plasma membranes with a cell-specific pattern. They are

found in most tissues of the body and are particularly abundant in brain and nervous tissues (van

Echten et al., 1993). Gangliosides are known to exert a bifunctional role (Hakomori, 1990). On one

hand, they play major roles in cell-cell and cell-matrix recognition via interactions with adhesion

receptors such as integrins, matrix proteins (collagen and fibronectin), or with other

glycosphingolipids, giving them important role in morphogenesis and oncogenesis. In addition, a

number of gangliosides may act as receptors of bacteria, viruses or toxins. On the other hand,

gangliosides are known to regulate transmembrane signaling by modulating functional membrane

proteins. Thus, they have been described to regulate cell proliferation through modulation of growth

factor receptor-associated kinases such as EGF and PDGF receptors (Bremer et al., 1986; Mirkin et

al., 2002; Sachinidis et al., 1996; Van Brocklyn et al., 1993). The importance of gangliosides in

regulating cell proliferation is also supported by studies implicating them in cell cycle arrest

processes via cyclin-dependent kinase inhibitors (Nakatsuji et al., 2001) or in apoptosis through

mitochondrial events (Kristal et al., 1999; Rippo et al., 2000).

It is well documented that regulation of cell proliferation is severely affected in retinopathy, a main

microvascular complication of diabetes. Death of retinal pericytes, microvascular contractile cells,

is indeed one of the earliest retinal changes, induced by hyperglycemia. Pericyte loss and

subsequent modification of endothelial cell proliferation and function, combined with basement

membrane thickening, trigger structural and functional alterations of capillaries. These chronic

alterations establish edema, microaneurisms and hemorrage that at ultimate stages can lead to

blindness (Forrester J.V. et al., 1997).

Although the pathogenic basis of diabetic microangiopathy is not fully understood at cellular and

molecular levels, it is clear that regulations of cell proliferation play an important role. The

hexosamine pathway (HP), a novel glucose-sensing pathway, has been implicated in

hyperglycemia-induced diabetic vascular alterations (Marshall et al., 1991). After entering cells,

glucose is rapidly phosphorylated and converted to fructose-6-phosphate (F-6-P) which is mainly

catabolized through the glycolytic pathway. Nevertheless, under hyperglycemic conditions, a

greater part of F-6-P can be converted to glucosamine-6-phosphate by glutamine:F-6-P

amidotransferase (GFAT), the first and rate-limiting enzyme of the hexosamine biosynthetic

pathway. Glucosamine-6-phosphate then undergoes rapid conversion to various hexosamine

products, including UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Thus, the HP can be activated

under the hyperglycemic conditions of a diabetic state by increased availability of substrate (F-6-P)

and/or GFAT activation. HP exerts its effects via two described mechanisms. First, hexosamine

product biosynthesis provides glycosidic precursors for the synthesis of glycoproteins, glycolipids

and proteoglycans. These intermediates can especially be used in the endoplasmic reticulum to form

complex glycoproteins, secreted or inserted into the membrane where they can modulate

transmembrane signaling or extracellular interactions. Additionally, UDP-GlcNAc can be used as

precursor for CMP-sialic acid, a substrate of ganglioside biosynthesis, raising the possibility of a

connection between HP and the ganglioside pathway. Second, cytosolic or nuclear proteins can be

covalently modified by the addition of a single monosaccharide GlcNAc, a product of the HP. This

O-linked glycosylation occurs on key intracellular proteins playing roles in controlling gene

expression, cell growth and division, enzyme activity, or structural integrity of the cytoskeleton

(Marshall, 2002). Because the potential targets of these O-glycosylation modifications are

numerous, the HP may be involved in many pathological mechanisms.

A growing number of studies suggest a role of HP in glucose-induced insulin resistance (Hebert, Jr.

et al., 1996; Kaneto et al., 2001; Vosseller et al., 2002) and in diabetic nephropathy, particularly in

renal mesangial cell alterations (Kolm-Litty et al., 1998; Schleicher et al., 2000; Singh et al., 2001).

However very few studies, if any, have examined the involvement of HP in the development of

diabetic retinopathy. Moreover, although gangliosides play major role in cell proliferation, their

potential involvement in diabetic microvascular complications and particularly in retinal pericyte

growth perturbations has been poorly studied.

The aim of the present study was to investigate the effect of the HP activation on pericyte

proliferation, ganglioside profile, and potential link between the two events. Results indicated that

glucosamine modifies pericyte ganglioside pattern concomitantly to a decrease of cell proliferation.

Further, addition of exogenous gangliosides exerted anti-proliferative effects on pericytes,

suggesting that gangliosides are involved in mediating the adverse glucosamine effects on pericyte

proliferation.

Results

Glucosamine treatment inhibits pericyte proliferation

To evaluate the effect of HP on pericyte growth, cells were treated with glucosamine which

bypasses the rate limiting enzyme GFAT and mimics an exacerbation of the HP. Cells were

exposed to 5mM glucosamine for 1 to 7 days and proliferation was estimated by cell counting and

total proteins measurement. As shown in Figure 1, time-course experiments revealed that

glucosamine potently decreased pericyte proliferation starting at 1-2 days of treatment. Cell

counting revealed that glucosamine reduced pericyte number by 32% and 40% after 2 and 7 days of

treatment, respectively. A decrease of total proteins was also observed in glucosamine treated cells

and correlated to cell number (Fig. 1C). To investigate the effects of glucosamine on cell

proliferation, apoptosis was measured in cells treated for 7 days with 5mM glucosamine.

Measurement of caspase 3 activation and determination of DNA fragmentation using an

oligonucleosomes determination kit showed that glucosamine did not induce apoptosis of bovine

retinal pericytes (BRP), at least under our culture conditions (data not shown). These results suggest

that the growth inhibition observed in response to glucosamine might involve cell cycle events.

Glucosamine modulates ganglioside profile

Ganglioside pattern of bovine retinal pericytes was analyzed in control and cells treated with 5mM

glucosamine. Under control conditions, the main gangliosides were GM3 (60% of all gangliosides

detected), GD3 (28%) and GM1 (12%) (Fig. 2A). As shown in Figure 2, important modifications of

ganglioside profile were observed in response to glucosamine (Fig 2B-C). Thus, GM1 and GD3

masses were increased by 27 and 19%, and by 85 and 105%, after 2 and 7 days of treatment,

respectively. Conversely, GM3 mass was decreased by 21 and 32% after 2 and 7 days of treatment,

respectively. Similar results were obtained by autoradiography analysis after galactose labeling

(data not shown). These results suggest a possible connection between the hexosamine pathway and

the ganglioside biosynthesis pathway. As the glucosamine effects were maximal at 7 days,

subsequent experiments were performed at this time of treatment.

Glucosamine increases GM3 synthase activity

To investigate the mechanism responsible for the observed increase of GM1 and GD3 masses, GM3

synthase activity, a rate-limiting enzyme for the synthesis of gangliosides was measured in control

and treated cells. Results presented in Figure 3 show that glucosamine treatment increased GM3

synthase activity by about 160%. As GM3 is a precursor of complex gangliosides, its decrease

despite the augmentation of GM3 synthase activity suggests that GM3 was metabolized to GM1

and GD3 that are both increased in response to glucosamine.

Treatment with exogenous gangliosides inhibits pericyte proliferation

Since GM1 and GD3 were increased concomitantly to a decrease of cell proliferation in response to

glucosamine, we further explored the hypothesis that gangliosides are involved in mediating the

glucosamine effects. Thus, we investigated whether the addition of exogenous gangliosides affects

pericyte proliferation. Cells were treated during one passage (7 days) with 10, 50 or 100 µM

gangliosides and, as a control, with the non-sialylated precursors glucosylceramide and

lactosylceramide. Results presented in Figure 4 show that GM1 and GD3 inhibited pericyte

proliferation in a dose-dependent manner whereas glucosylceramide and lactosylceramide used as

controls showed no effects. Inhibition of cell proliferation reached 25% at ganglioside concentration

of 100 µM. The effect of a-series gangliosides that were not increased in response to glucosamine

was also tested. Results indicated that GM3, GM2, and GD1a also inhibited BRP proliferation (data

not shown), suggesting that the presence of sialic acid is required in the active structure leading to

inhibition of BRP proliferation. It should be indicated however, that treatment with exogenous

gangliosides resulted in rather modest effects as compared to the effects of glucosamine. These data

might be explained by the fact that only a small proportion of added gangliosides are inserted into

cell membranes. Additionally, exogenous gangliosides treatment may result in the generation of cell

membrane pool functionally different from the gangliosides pool formed endogenously in response

to glucosamine treatment.

PPMP protects against the inhibition of proliferation caused by glucosamine

Next, a complementary approach was used to further support the involvement of gangliosides in the

anti-proliferative effects of glucosamine on pericytes. PPMP, an inhibitor of glucosylceramide

synthase was used to block the increase of gangliosides caused by glucosamine. As shown in Figure

5, treatment of BRP with glucosamine in the presence of increasing concentrations of PPMP

partially protected cells against proliferation decrease, in a dose-dependent manner.

Altogether, these results support the hypothesis that GM1 and GD3 increase is involved, at least in

part, in the proliferation decrease of pericytes treated with glucosamine.

Discussion

A growing number of studies indicate that the hexosamine pathway may be causally involved in the

development of diabetic microvascular complications, particularly nephropathy. Many of the

pathological features of diabetic nephropathy are also common to diabetic retinopathy. Further, as it

is known that retina expresses active GFAT and that hexosamine content is increased in retinal

tissues in human and rats with diabetes (Heath et al., 1967; Mazlen et al., 1970), this raises the

hypothesis that the HP could possibly be implicated in diabetic retinopathy development and

pericyte loss. On the other hand, gangliosides are known to play a role in cell differentiation and

growth regulation. Altered ganglioside levels have been associated with oncogenic transformation

or inherited disease such as Farber’s disease (Farina et al., 2000; Manzi et al., 1990; Zeng et al.,

2000), although very little is known concerning the mechanism or the biological significance of

these changes. However, ganglioside changes and their involvement in diabetes where cell growth

is also altered have been poorly studied. In the present study, ganglioside modifications and their

consequences on proliferation of pericytes submitted to diabetic environment were investigated.

Glucosamine, that is avidly taken up by the glucose transporter and phosphorylated by hexokinase

when added to cells (Schleicher et al., 2000), was used to mimic the high glucose environment

effects that are mediated by the HP in our model. Pericytes were chosen as their growth is

particularly affected in diabetic microangiopathy. Results demonstrate that glucosamine treatment

induces modification of BRP ganglioside profile with an increase of GM1 and GD3 and a decrease

of GM3. Moreover, glucosamine increased GM3 synthase activity, which regulates GM3

biosynthesis, a precursor of complex gangliosides. Thus, by increasing GM3 synthase activity,

glucosamine could drive complex ganglioside biosynthesis. This hypothesis is supported by the

observed increase of GM1 and GD3. Glucosamine regulates GM3 synthase activity through yet

undefined mechanism. One possible explanation is through regulation of GM3 synthase gene

expression. In fact, human GM3 synthase promoter presents putative binding sites for SP1 (Zeng et

al., 2003), a transcription factor whose activity is known to be regulated by O-linked N-

acetylglucosamine modification (Goldberg et al., 2002). On the other hand, it should be also

considered that glucosamine can lead to increased ganglioside biosynthesis by providing excessive

substrates that increase the flux of ganglioside biosynthesis in glucosamine-treated pericytes.

Indeed, UDP-GlcNAc can be converted into CMP-sialic acid, a precursor of ganglioside

biosynthesis.

Next, results showed that glucosamine causes a decrease of pericyte proliferation. This proliferation

decrease is partially reproduced by the application of exogenous gangliosides including GM1 and

GD3, both increased in response to glucosamine. This observation suggests a role of gangliosides in

mediating glucosamine effects. Of note, previous studies have documented that only 20% of

exogenously added gangliosides are inserted into cell membranes (Bremer et al., 1984). This might

explain the less potent effects of exogenous gangliosides on decreasing pericyte proliferation as

compared to glucosamine. These results are in accordance with other studies showing that

gangliosides can decrease cell growth, by modulating growth factor receptor signaling. For

example, GM1 has been shown to inhibit epidermal growth factor and platelet-derived growth

factor receptor phosphorylation and signaling in different cell types (Bremer et al., 1986; Mirkin et

al., 2002; Sachinidis et al., 1996; Van Brocklyn et al., 1993). Moreover, GD3 has been described as

an intracellular mediator of apoptosis, particularly by inducing mitochondrial permeability

transition, cytochrome c release and caspase activation (Garcia-Ruiz et al., 2000; Kristal et al.,

1999; Rippo et al., 2000). A complementary approach using PPMP, an inhibitor of

glucosylceramide synthase, was used next. Addition of PPMP to glucosamine treatment partially

protected pericytes against the proliferation decrease, supporting a role of gangliosides in mediating

the glucosamine effects. These data also suggest that unknown additional pathways are also

involved in causing decrease of pericyte proliferation in response to glucosamine. As discussed

earlier, the hexosamine pathway can affect cell proliferation through several pathways and

mechanisms. Activation of the hexosamine pathway leads to O-GlcNAc modifications of proteins

such as transcription factors (Wells et al., 2001). For example it has been shown in bovine aortic

endothelial cells that the transcription factor SP1 is modified by O-GlcNAc in response to

hyperglycemia or elevated glucosamine (Du et al., 2000). Increased O-GlcNAc modification of SP1

increases SP1 transactivation and SP1-dependent expression of TGF-β1 and PAI-1 (Du et al.,

2000). Interestingly, SP1 has also been shown to regulate the expression of proteins involved in cell

cycle regulation such as p21waf1/cip1 (Gartel et al., 1999). As in our study, glucosamine did not inhibit

BRP proliferation through apoptosis, it would be of great interest to investigate the effect of

glucosamine on cell cycle proteins such as p21waf1/cip1 in these cells.

In conclusion, the present study indicates that glucosamine increases ganglioside biosynthesis in

pericytes and suggests that gangliosides are likely involved in the anti-proliferative effect of

glucosamine in this cell type. These observations also indicate that the ganglioside pattern can be

modified by a diabetic environment and extend the role of gangliosides into the field of diabetic

microvascular complications.

Materials and methods

Cell isolation and culture

Bovine retinal pericytes (BRP) were isolated from microvessels of bovine retinas as previously

described (Lecomte et al., 1996). Briefly, retinas were dissected under sterile conditions from

freshly enucleated bovine eyes obtained from a local slaughterhouse. Retinas (2 per culture dish)

were minced into small pieces and homogenized in a Dounce homogenizer in Hanks’ balanced salt

solution (HBSS) buffer (HBSS supplemented with 10 mM Hepes, pH 7.4, 1% antibiotics, 0.5%

bovine serum albumin (BSA), Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France). The homogenates were then

digested at 37°C for 20 min in a solution of collagenase/dispase (Roche Diagnostics, Mannheim,

Germany). After digestion, microvessels fragments were trapped onto a 40 µm nylon filter and

plated in 6 cm fibronectin-coated dishes. Outgrowth of pericytes from the microvessels occurred

after about 48 h. Primary cultures were grown in dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM,

Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Invitrogen Corporation, N.Y., USA),

1% glutamine and 1% penicillin/streptomycin (Sigma). Cells were passaged with trypsin-EDTA

(Sigma) (1:3) and cultured up to the second passage during which they were treated. Glucosamine

(Sigma) was added to the culture medium at 5 mM final concentration and culture medium was

replaced every two days. BRP were treated for 1 to 7 days.

Ganglioside analysis

At the end of the treatment period, pericytes (5-8 × 105 cells) were collected by trypsination and

washed twice with phosphate-buffered saline (PBS, Sigma). For metabolic labelling of

gangliosides, 0.2 µCi/ml of [14C(U)]D-Galactose (329.5 mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences,

Boston, MA) was added to the media overnight before harvesting as galactose incorporates into all

gangliosides. Cell pellets were dispersed into 2 ml chloroform (C)/methanol (M) (1:1, v/v), mixed

thoroughly and extracted overnight at 4°C. After centrifugation, the residues were extracted twice

with 2 ml of the same solvent. The pooled extracts of total lipids were evaporated to dryness and

submitted to partition with C/M/PBS 1 mM (10:10:7, v/v/v). The upper phases containing

gangliosides were next desalted on C18 silica gel column (Waters Corporation, Milford, MA) and

analyzed by HPTLC (Merck, Darmstadt, Germany). Plates were developed in C/M/0.2% CaCl2

(55:45:10, v/v/v) and gangliosides were visualized by autoradiography using phosphor screen and

Storm 820 (Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA) and by

resorcinol staining (gangliosides-specific stain: resorcinol 0.3% (Sigma), 0.03% CuSO4, 30% HCl)

with Image Master VDS-CL (Amersham Pharmacia Biotech). Gangliosides were identified by

comigration with standards (Matreya, Biovalley, Marne la Vallée, France). Quantification was done

by densitometry analysis with Image Quant (Molecular Dynamics). As GT1b is absent in BRP

ganglioside profile, it was added as an internal standard in the samples before lipid extraction.

Results were adjusted to the total proteins of the sample and the extraction efficiency.

Measurement of GM3 synthase activity

At the end of treatment, cells were washed with PBS, incubated for 20 min at 4°C in 50 µl lysis

buffer (20 mM sodium cacodylate pH 6.6 (Sigma), 0.2% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10 µl/ml

proteases inhibitors, Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) and then collected by

scrapping. Four dishes of BRP (~2-3 × 106 cells) were pooled. Cell lysates were centrifuged at

10,000g for 5 min, and proteins in the supernatants were used to measure GM3 synthase activity.

Equal amounts of proteins from each sample (about 500 µg) were used to perform the assay.

Samples were mixed with an equal volume of reaction buffer containing at final concentrations: 0.1

mM lactosylceramide (Matreya), 4 µCi/ml [sialic-4,5,6,7,8,9-14C]CMP-sialic acid (325.2

mCi/mmol) (PerkinElmer Life Sciences), 100 µM CMP-sialic acid (Sigma), 10 mM MgCl2, 0.2%

Triton X-100, 100 mM sodium cacodylate pH 6.6. After shaking, the reaction mixtures were

incubated at 37°C for 150 min. Reactions were stopped by loading the samples on silica gel 60

columns (Merck) to separate excess of substrates from products. After washing the columns with

water, gangliosides were eluted with C/M (1:1, v/v) and the solvent dried under nitrogen.

Gangliosides were finally separated by TLC (Merck) and reaction products were revealed by

autoradiography. GM3 synthase activity was expressed as pmoles of GM3 produced per hour/mg

proteins.

Measurement of cell growth

After each treatment period, cells were harvested with trypsin and cell pellets were washed twice

with PBS. For each sample, an aliquot of cells was counted using a haemocytometer to determine

the cell number, another aliquot was used to measure proteins according to Bradford.

Treatment with exogenous gangliosides

To evaluate the effect of exogenous gangliosides on BRP proliferation, cells were cultured in 96

wells plates. Exogenous glycolipids GM1, GD3, glucosylceramide and lactosylceramide (Matreya)

were added to the culture complete medium at final concentrations of 10, 50 or 100 µM in the form

of complexes with BSA at a ratio of 1:1 in DMEM–10 mM Hepes, pH 7.4 to facilitate their

incorporation within the cell. At the end of treatment, cells were washed twice with PBS and lysed

for 30 min at 37°C in 50 µl Ripa lysis buffer (PBS 10 mM, NP40 1% (Pierce, Perbio Science,

Brebières, France), sodium deoxycholate 0.5%, SDS 0.1%, 10 µl/ml proteases inhibitors). Total

proteins were finally measured using the BCA protein assay (Pierce) to assess cell proliferation, as

in our experiments cell numbers correlated with total protein concentrations (see Fig. 1).

PPMP treatment

In order to inhibit ganglioside biosynthesis, DL-threo-1-Phenyl-2-palmitoylamino-3-morpholino-1-

propanol (PPMP, Sigma), an inhibitor of glucosylceramide synthase that catalyses the first step of

ganglioside biosynthesis, was used. BRP were cultured in 96 wells plates and treated with 5 mM

glucosamine in the presence of increasing concentrations of PPMP for 7 days. PPMP was not used

at concentrations higher than 1µM as it caused cellular morphological alterations and toxic effects.

At the end of treatment, cells were washed twice with PBS, lysed in Ripa and proteins were

measured to assess cell proliferation as described above.

Statistical analysis

Data are expressed as means ± SEM and presented as percentage of controls. The Wilcoxon signed-

rank test was used to define the significance of the difference between groups. p< 0.05 was

considered as statistically significant.

Abbreviations BRP, bovine retinal pericytes; DMEM, dulbecco’s modified eagle’s medium; DR, diabetic

retinopathy; Glccer, glucosylceramide; GlcN, glucosamine; Laccer, lactosylceramide; HBSS,

Hanks’ balanced salt solution; HP, hexosamine pathway; HPTLC, high-performance thin-layer

chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; PPMP, DL-threo-1-Phenyl-2-palmitoylamino-3-

morpholino-1-propanol.

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Legends:

Fig. 1. Glucosamine inhibits pericyte proliferation.

Pericytes were exposed to 5 mM glucosamine for a maximum of 7 days. Cells were periodically

trypsinized, counted and total proteins measured. Representative growth curves corresponding to

cell number expressed in 105 cells (A) and total proteins expressed in µg (B) are shown. (C) Cell

number counting and total protein measurement at 2 and 7 days are represented. Results are

expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 3-7 independent experiments. * p

< 0.05 vs control. GlcN, glucosamine.

Fig. 2. Glucosamine modulates ganglioside pattern.

Pericytes were exposed to 5 mM glucosamine for 2 (B) or 7 (C) days, and then collected.

Gangliosides were analysed by HPTLC and resorcinol staining. Representative HPTLC of

gangliosides after 7 days treatment revealed by resorcinol (A) and densitometric quantification of 3-

7 independent experiments (B, C) are shown. Results are expressed as µg of gangliosides per mg of

proteins and represent means ± SEM. * p<0.05 vs control. Std, standard. The band on the origin

was unknown, therefore it was not quantified.

Fig. 3. Glucosamine increases GM3 synthase activity.

Pericytes were treated with 5 mM glucosamine for 7 days. GM3 synthase activity was measured on

cell homogenates as described in Materials and methods. (A) Autoradiography of a representative

TLC plate of GM3 synthase activity products is shown. (B) Control activity was 4.2 pmol/hour/mg

proteins. Results are expressed as percentage of control and represent means ± SEM of 8

independent experiments. * p<0.05 vs control.

Fig. 4. Exogenous gangliosides inhibit cell proliferation.

Pericytes were treated with increasing concentrations of GM1, GD3, glucosylceramide (Gluccer) or

lactosylceramide (Laccer)-BSA complexes for 7 days. At the end of treatment, cells were washed,

lysed and total proteins were measured. Results are expressed as percentage of control and represent

means ± SEM of 4 independent experiments each performed in triplicates. * p<0.05 vs control.

Fig. 5. PPMP protects against glucosamine effects.

Pericytes were treated with 5 mM glucosamine in the presence or absence of 0.1, 0.25, 0.5, or 1 µM

PPMP for 7 days. At the end of treatment, cells were washed, lysed, and total proteins measured.

Results are expressed as µg of proteins per well and represent means ± SEM of 6 independent

experiments each performed in triplicates. * p<0.05 vs glucosamine treated cells.

Fig. 1.

0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

cell numbertotal proteins

glucosamine (mM)

0 5

2 days 7 days

**

C

0

1

2

3

4

cell

num

ber (

105 )

control5 mM GlcN

0 2 4 6days

0

50

100

150

200

250

tota

l pro

tein

s (µg

)

0 2 4 6days

control5 mM GlcN

BA

0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

cell numbertotal proteins

glucosamine (mM)

0 5

2 days 7 days

**

0

20

40

60

80

100

120

% o

f con

trol

cell numbertotal proteins

glucosamine (mM)

0 5

2 days 7 days

**

C

0

1

2

3

4

cell

num

ber (

105 )

control5 mM GlcN

0 2 4 6days

0

1

2

3

4

cell

num

ber (

105 )

control5 mM GlcNcontrol5 mM GlcN

0 2 4 6days

0 2 4 6days

0

50

100

150

200

250

tota

l pro

tein

s (µg

)

0 2 4 6days

control5 mM GlcN

0

50

100

150

200

250

tota

l pro

tein

s (µg

)

0 2 4 6days

0 2 4 6days

control5 mM GlcNcontrol5 mM GlcN

BA

Fig. 2.

A

B

(internal std)

0 5glucosamine (mM)

std std

GM3

GM2GM1

GD3

GM3

originGT1b

C

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 GM3GM1GD3

*GM3 GM1GD3

*

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)

2 days 7 days

A

B

(internal std)

0 5glucosamine (mM)

std std

GM3

GM2GM1

GD3

GM3

originGT1b

C

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 GM3GM1GD3

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)0 5

glucosamine (mM)

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 GM3GM1GD3

GM3GM1GD3

*GM3 GM1GD3

*

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)

*GM3 GM1GD3

*

*

GM3 GM1GD3

GM3GM3 GM1GM1GD3GD3

*

*

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

µg g

angl

iosi

des

/ mg

prot

eins

0 5glucosamine (mM)0 5

glucosamine (mM)

2 days 7 days

Fig. 3.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5glucosamine (mM)

*

% o

f con

trol

BA

origin

GM3

0 5glucosamine

(mM)

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5glucosamine (mM)

*

% o

f con

trol

B

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5glucosamine (mM)

*

% o

f con

trol

BA

origin

GM3

0 5glucosamine

(mM)

A

origin

GM3

0 5glucosamine

(mM)

origin

GM3

0 5glucosamine

(mM)

Fig. 4.

0

20

40

60

80

100

120

control GM1 GD3 Gluccer Laccer

% o

f con

trol

**

**

10µM50µM100µM

0

20

40

60

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100

120

control GM1 GD3 Gluccer Laccer

% o

f con

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**

**

0

20

40

60

80

100

120

control GM1 GD3 Gluccer Laccer

% o

f con

trol

**

**

10µM50µM100µM

10µM50µM100µM

Fig. 5.

PPMP (µM)

Prot

eins

(µg)

0glucosamine 5mM

* * * *

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 0 0.1 0.25 0.5 1

PPMP (µM)

Prot

eins

(µg)

0glucosamine 5mM0glucosamine 5mMglucosamine 5mM

* * * *

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 0 0.1 0.25 0.5 10

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 0 0.1 0.25 0.5 1

Glucosamine induces cell-cycle arrest and hypertrophy of

mesangial cells: implication of gangliosides

BIOCHEMICAL JOURNAL IMMEDIATE PUBLICATION. Published on 17 Jan 2005.

Short title: glucosamine, gangliosides, and hypertrophy of mesangial cells Elodie Masson, Nicolas Wiernsperger, Michel Lagarde, and Samer El Bawab

Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK-Santé/INSERM UMR 585, INSA-Lyon

Corresponding author: S. El Bawab, Diabetic Microangiopathy Research Unit, MERCK-Santé/INSERM

U585, INSA-Lyon, Louis Pasteur Bldg, 69621 Villeurbanne Cedex, France.

Phone: (+33) 4 72 43 81 12

Fax: (+33) 4 72 43 81 13

E-mail: samer.elbawab@merck.fr

Keywords : hexosamine pathway, diabetic nephropathy, hypertrophy, mesangial cells, gangliosides

SYNOPSIS

Alterations of proliferation and hypertrophy of renal mesangial cells are typical features of diabetic

nephropathy. The hexosamine pathway has been proposed as one biochemical hypothesis

explaining microvascular alterations of diabetic nephropathy, however, its involvement in the

regulation of mesangial cell growth or hypertrophy has been poorly studied. On the other hand,

although gangliosides are known to regulate cell proliferation, their potential role in mesangial cell

growth perturbations has hardly been explored. In the present study, we investigated the effects of

the hexosamine pathway activation, mimicked by glucosamine treatment, on mesangial cell growth

and hypertrophy, and the potential implication of gangliosides in these processes. Results indicate

that glucosamine induced hypertrophy of mesangial cells as measured by an increase of proteins to

cell ratio, and caused cell-cycle arrest through increased cyclin-dependent kinase inhibitor

p21Waf1/Cip1 expression. Further, glucosamine treatment resulted in a massive increase of

gangliosides GM2 and GM1 levels. Treatment of cells with exogenous GM2 and GM1 reproduced

0.5 mM glucosamine effects on p21Waf1/Cip1 expression, cell-cycle arrest and hypertrophy,

suggesting that gangliosides GM2 and GM1 are likely involved in mediating glucosamine effects.

These results document a new role of the hexosamine pathway in the regulation of mesangial cell

growth and hypertrophy. They also suggest a potential new mechanism of action of the hexosamine

pathway through modulation of ganglioside levels.

INTRODUCTION Diabetic nephropathy (DN) is the most frequent cause of end stage renal disease. DN affects

approximately 30% of patients after 20 years of diabetes, and exposes them to higher mortality. The

pathology is characterized by complex structural changes including renal hypertrophy, basement

membrane thickening, and progressive accumulation of extracellular matrix components. Combined

with haemodynamic disturbances, these changes lead to glomerulosclerosis, microalbuminuria and

finally to a decline in renal function [1]. Hypertrophy of mesangial cells and increased secretion of

matrix proteins contribute to glomerular enlargement, which is considered as one of the earliest

alterations of DN. Mesangial cells growth during the diabetic state consists in an early, transient and

limited proliferation, followed by growth-arrest and hypertrophy. For example, it has been shown in

kidneys of streptozotocin-induced diabetic animals, that mesangial cells arrest at the G1 phase and

undergo sustained hypertrophy associated with an increase in the synthesis and deposition of

extracellular matrix proteins [2]. The cyclin-cyclin dependent kinase complex inhibitors,

p21Waf1/Cip1 and p27Kip1, have been implicated in this blockade, as shown in mesangial cells treated

with high glucose concentrations [3,4]. Increased expression of p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 has also

been shown in mesangial cells of streptozotocin-induced diabetic rats and in diabetic db/db mice

[3,5].

Numerous hypotheses have been proposed to explain glucose toxicity and diabetic microvascular

alterations. In 1991, Marshall et al. first reported on a new pathway mediating glucose effects, the

hexosamine pathway (HP) [6]. After entering cells, glucose is rapidly phosphorylated and converted

to fructose-6-phosphate (F-6-P), which is mainly catabolized through the glycolytic pathway. Under

hyperglycemic conditions however, a greater part of F-6-P can be converted into glucosamine-6-

phosphate by the action of glutamine: F-6-P amidotransferase (GFAT), the first and rate-limiting

enzyme of the hexosamine biosynthetic pathway. Glucosamine-6-phosphate is then metabolized

into various hexosamine products, including UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Thus, the

HP exerts its effects by providing glycosidic precursors for glycoproteins, glycolipids and

proteoglycans. Additionally, the HP could mediate its effects through a single O-linked

glycosylation. In fact, GlcNAc, a product of the HP, can covalently modify and affect activities of

proteins playing roles in the control of gene expression, cell growth and division, enzyme activity,

or structural integrity of the cytoskeleton [7,8].

The HP was first implicated in glucose-induced desensitization of the insulin response [6]. In vivo,

acute glucosamine infusion induces insulin-resistance in normoglycemic rats [9]. Moreover,

overexpression of GFAT in mouse skeletal muscle [10] or in β cells [11] has proven the role of the

HP in insulin-resistance in animals and highlighted the importance of this pathway. Recent data also

suggested a role of the HP in the development of diabetic microvascular complications such as

nephropathy. Thus, the HP has been shown to activate through a mechanism involving the

transcription factor Sp1 the promoter of the Plasminogen Activator Inhibitor-1 gene, a regulator of

extracellular matrix production [12,13]. Moreover, HP activation has been largely described to

induce TGFβ production and matrix protein synthesis in mesangial cells [14-17]. However, the

involvement of the HP in the regulation of mesangial cell growth or hypertrophy has been poorly

studied.

Gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their

oligosaccharidic part. They are concentrated in the plasma membrane with a cell-specific pattern,

and found in most tissues of the body, especially in brain and nervous tissues [18]. Gangliosides

play major roles in cell-cell and cell-matrix recognition via interactions with adhesion receptors

such as integrins, matrix proteins (collagen and fibronectin), or with other glycosphingolipids [19].

On the other hand, gangliosides are known to regulate transmembrane signalling by modulating

functional membrane proteins. Thus, they have been described to regulate proliferation of different

cell types through modulation of growth factor receptor-associated kinases such as EGF and PDGF

receptor [20-23]. In spite of these described effects of gangliosides in regulating cell proliferation,

their implication in mesangial cell growth perturbations occurring during DN, has not been studied

yet.

The aim of the present study was to investigate the effect of HP activation, mimicked by

glucosamine treatment, on mesangial cell growth and hypertrophy, and to determine the potential

role of gangliosides in mediating the glucosamine effects. Results show that 0.5 mM glucosamine

inhibited mesangial cell growth and induced hypertrophy by increasing p21Waf1/Cip1 expression and

arresting cells at the G0/G1 phase. Moreover, glucosamine treatment increased very significantly

GM2 and GM1 gangliosides, and treatment with exogenous GM2 and GM1 reproduced

glucosamine effects on mesangial cell hypertrophy, cell-cycle arrest at the G0/G1 phase and

p21Waf1/Cip1 expression. The results suggest that glucosamine induces cell-cycle arrest and

hypertrophy of mesangial cells, at least in part, through GM2 and GM1 ganglioside production.

EXPERIMENTAL

Materials Sources of materials were as follows: animals, Charles River, L’Arbresle, Fance; fetal bovine

serum, Gibco, Invitrogen Corporation, N.Y., USA; all other cell culture products, RNAse,

resorcinol, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France; D-[U-14C]galactose and D-[1-14C]glucosamine

hydrochloride, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK; HPTLC, Merck, Darmstadt,

Germany; C18 silica gel column, Waters Corporation, Milford, MA; gangliosides, Matreya,

Biovalley, Marne la Vallée, France; fluorescein-labelled cholera toxin B subunit, Molecular Probes,

Leiden, The Netherlands; NP40 1 %, Pierce, Perbio Science, Brebières, France; monoclonal

antibodies, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France.

Methods Mesangial cell isolation and culture Renal mesangial cells (RMC) were obtained from glomeruli of young male Wistar rat kidneys

isolated by differential sieving, as previously described [24]. RMC were characterized by

morphological criteria (stellate, spindle-shaped when confluent) and by negative staining for Factor

VIII and cytokeratin and their prominent cytoskeletal staining for actin. Cells were cultured in

DMEM supplemented with 15 % fetal bovine serum, 1 % glutamine and 1 %

penicillin/streptomycin and used between passages 7 to 15. Under these conditions, cells reached

confluency after about 4 days, therefore, treatments were done for a maximum of 4 days.

Total proteins to cell count ratio RMC were treated with 0.5 mM or 5 mM glucosamine for 1 to 4 days. At the end of the treatment

period, cells were trypsinized and washed twice with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS). For

each sample, an aliquot of cells was counted using a haemocytometer to determine the cell number.

Another aliquot was lysed and used to measure total proteins according to Bradford. The ratio of

total proteins to cell number expressed as micrograms per 105 cells was used as a hypertrophy

index.

Cell cycle analysis RMC were harvested with trypsin after different treatments, washed twice with PBS, fixed in 70 %

ethanol and stored at 4 °C until use. Before flow cytometry analysis, cells were washed in PBS,

centrifuged and cell pellets were resuspended in RNAse (1 mg/ml) for 20 min. Cells were then

stained for 15 min with propidium iodide in PBS (40 µg/ml final concentration) before analysis

with FACSCAN (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J., USA) using CellQuest software (Becton

Dickinson).

Ganglioside analysis After 48 h of treatment, RMC (1-4 × 106 cells) were collected by trypsination and washed twice

with PBS. For metabolic labelling of gangliosides, 0.2 µCi/ml of D-[U-14C]galactose (303

mCi/mmol) were added to the media overnight before harvesting cells, as galactose is incorporated

into all gangliosides. Cell pellets were dispersed into 2 ml chloroform (C)/methanol (M) (1:1, v/v),

mixed thoroughly and extracted overnight at 4 °C. After centrifugation, the residues were extracted

twice with 2 ml of the same solvent. The pooled extracts of total lipids were evaporated to dryness

and submitted to partition with C/M/PBS 1 mM (10:10:7, v/v/v). The upper phases containing

gangliosides were next desalted on C18 silica gel column and analyzed by HPTLC. Plates were

developed in C/M/0.2 % CaCl2 (55:45:10, v/v/v) and gangliosides were visualized by

autoradiography using phosphor screen and Storm 820 (Molecular Dynamics, Amersham

Pharmacia Biotech, Piscataway, USA) and by resorcinol staining (gangliosides-specific stain:

resorcinol 0.3 % (Sigma), 0.03 % CuSO4, 30 % HCl) with Image Master VDS-CL (Amersham

Pharmacia Biotech). Gangliosides were identified by comigration with standards. GM2 and GM1

identities were confirmed after HPTLC separation using anti-GM2 antibody (generous gift from Dr.

J. Portoukalian, Lyon, France) and fluorescein-labelled choleratoxin B subunit that interact

specifically with GM1. Quantification was performed by densitometry analysis using Image Quant

(Molecular Dynamics). As GT1b is absent in RMC ganglioside profile, it was added as an internal

standard in the samples before lipid extraction. Results were then adjusted for extraction efficiency

and total proteins of the sample.

Radiolabelling with 14C glucosamine To investigate the hypothesis that glucosamine treatment can affect ganglioside profile by providing

substrates for the ganglioside biosynthesis, cells were labeled with 14C-glucosamine. Control cells

were incubated with 0.2 µCi/ml D-[1-14C]glucosamine for 48 h. Glucosamine-treated cells were

incubated with 2 mM glucosamine at a much higher specific activity of 0.5 mCi/ml D-[1-14C]glucosamine. After the incubation, cells were washed and the radioactivity associated to

gangliosides was then analyzed to test the ability of glucosamine to incorporate into ganglioside

structures.

Treatment with exogenous gangliosides Exogenous gangliosides GM2 and GM1 were added to the culture complete medium at a final

concentration of 60 µM. This concentration was used as it induces inhibition of RMC proliferation

close to the effects observed with 0.5 mM GlcN treatment. Gangliosides were added in the form of

complexes with BSA at a ratio of 1:1 in DMEM–10 mM Hepes, pH 7.4 to facilitate their

incorporation within the cell.

Western blot analysis At the end of the treatment period, cells were washed and collected in Ripa lysis buffer (PBS 10

mM, NP40 1 %, sodium deoxycholate 0.5 %, SDS 0.1 %, 10 µl/ml proteases inhibitors). To remove

insoluble materials, lysates were centrifuged at 10 000 g for 5 min. Samples (20 µg of lysates) were

then boiled for 5 min, loaded onto a 12 % SDS-polyacrylamide gel, electrophoresed, and transferred

to a PVDF membrane. The membranes were blocked with 5 % milk in PBS containing 0.05 %

Tween (PBST), and blotted with monoclonal antibodies (p21, 1 µg/ml; p27, 1:2000) in the blocking

solution. After extensive washing, the membranes were blotted with secondary anti-mouse antibody

at a dilution of 1:2000. The signal was visualized by enhanced chemiluminescence.

Statistical analysis Data are expressed as means ± SEM. The Wilcoxon signed-rank test was used to define the

significance of the difference between groups. p<0.05 was considered as statistically significant.

RESULTS

Glucosamine decreases mesangial cell proliferation and induces hypertrophy The effect of glucosamine on RMC proliferation and hypertrophy was investigated in this study.

Glucosamine was used to mimic HP activation because of its demonstrated ability to selectively

enter the hexosamine biosynthetic pathway and to bypass the rate-limiting enzyme GFAT [25]. To

this end, mesangial cells were treated with either 0.5 or 5 mM glucosamine, collected and cell

number and total proteins were measured. As shown in Figure 1, time-course experiments revealed

that glucosamine potently decreases proliferation. Glucosamine effect was evident starting from 48

h and, at the end of the treatment period, cell number in RMC treated with 0.5 mM and 5 mM

glucosamine represented only 41 % and 12 % of control, respectively (Figure 1A). This adverse

effect on cell proliferation was also measurable by a decrease of total proteins content (Figure 1B).

In addition, as the ratio of total protein content to cell number is a well-established measurement of

cellular hypertrophy, this parameter was used to determine whether the alteration of cell growth was

accompanied by cell hypertrophy. As shown in Figure 1C, glucosamine indeed induced an increase

of the proteins to cell number ratio. At the end of the treatment period, protein to cell number ratio

increased by 1.6- and 2-fold for cells treated with 0.5 mM and 5 mM glucosamine, respectively.

The increase of cell size, characteristic of cellular hypertrophy, was also obvious by microscopy, as

illustrated in Figure 1D. These observations indicate that glucosamine triggers a decrease of

proliferation as well as hypertrophy of mesangial cells. As these effects were evident at 0.5 mM

GlcN, and to avoid potential cytotoxicity with the relatively high concentration of 5 mM, the

following experiments were carried out using 0.5 mM GlcN. Moreover, as the glucosamine effects

were evident at 48 h, and to avoid contact inhibition at confluence (4 days), the subsequent

experiments were performed at this time of treatment.

Glucosamine arrests cell-cycle progression Results from previous experiments showed that glucosamine treatment blocks very early cell

proliferation and may thus contribute to cellular hypertrophy. Therefore, the mechanisms

responsible for cell growth inhibition in response to glucosamine were investigated next. Cell cycle

analysis by flow cytometry was performed on control and cells treated with either 0.5 mM or 5 mM

glucosamine. Results summarized in Table 1 indicate that 0.5 mM glucosamine increased the

proportion of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle as compared to control cells. This suggests

that 0.5 mM glucosamine blocks the progression of RMC through the cell cycle by inhibiting the

G1/S transition phase, arresting cells at G0/G1 phase. Surprisingly, treatment of cells with higher

glucosamine concentration (5 mM) resulted in cell cycle blockade at the G2/M phase. To further

investigate this discrepancy, a dose-response study was performed. As shown in Fig. 2,

glucosamine concentrations lower than 1 mM arrested cells in G0/G1 phase, whereas higher

concentrations of glucosamine (2-5 mM) induced G2/M phase arrest. These observations suggest

that at high glucosamine concentrations (>1 mM), additional pathways are involved.

Glucosamine increases p21Waf1/Cip1 expression

P21Waf1/Cip1 and p27Kip1 are inhibitors of cyclin-cyclin dependent kinase complexes known to inhibit

the G1/S phase transition. Moreover, it has been shown that p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 proteins are

involved in growth arrest at the G1/S phase transition and hypertrophy of RMC in response to high

glucose concentrations [2]. Therefore, the expression of p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 proteins was

measured. As shown in Figure 3, p21Waf1/Cip1 expression in cells treated with glucosamine was about

3-fold higher than in control cells. These data are consistent with the cell cycle arrest shown by

flow cytometry analysis. In contrast however, p27Kip1 expression was decreased by glucosamine

treatment. These results suggest that unlike high ambient glucose effects on RMC, GlcN-induced

cell-cycle arrest is likely p21Waf1/Cip1-dependent.

Glucosamine increases GM2 and GM1 levels The hexosamine pathway has been implicated in the regulation of numerous enzyme and protein

activities and as a consequence may regulate several pathways. Moreover, because the HP provides

intermediates for the synthesis of glycoconjugates such as glycolipids, glucosamine treatment could

affect ganglioside pattern of mesangial cells. To investigate this possibility, ganglioside pattern was

analyzed by HPTLC in control and cells treated with either 0.5 mM or 5 mM glucosamine for 48 h.

Under control conditions, the main gangliosides observed in RMC were GM3 (70 % of all

gangliosides detected), GD1a (24 %) and GD3 (5 %). When cells were treated with glucosamine,

important modifications of the ganglioside profile were observed (Figure 4A). Thus, gangliosides

GM2 and GM1, hardly detectable in control cells, were strongly increased to reach about 1.5 and

0.4 µg/mg of proteins that corresponded to 20 % and 5 % of all gangliosides detected, respectively

(Figure 4B). Similar results were obtained by autoradiography analysis after galactose labelling

(data not shown). GM3 and GD1a levels were only slightly affected whereas GD3 was undetectable

in the glucosamine-treated cells. These results suggest a shift into a-series ganglioside biosynthesis

in response to glucosamine. To further investigate whether HP affects ganglioside biosynthesis,

control cells were labelled with exogenous radioactive glucosamine and gangliosides were extracted

and analyzed for radioactivity content. Results show that indeed glucosamine or its metabolites

incorporate into ganglioside biosynthesis pathway (Figure 4C). Next, cells were treated for 48 h

with 2 mM glucosamine at a specific activity of 0.5 mCi/ml. Ganglioside analysis revealed

radioactive GM3, GM2, GM1 and GD1a (Figure 4C). These results support the hypothesis of a

connection of the HP and ganglioside biosynthesis pathways.

GM2 and GM1 gangliosides induce mesangial cell hypertrophy Gangliosides are known to play a role in a variety of important cellular functions including

proliferation and differentiation. As GM2 and GM1 were massively increased concomitantly to

RMC hypertrophy in response to glucosamine, we further investigated the possibility that

gangliosides would be involved in mediating the glucosamine effects. Proteins to cell number ratio

was measured in control cells and in cells treated with exogenous gangliosides. Results presented in

Figure 5 show that exogenous addition of GM2 and GM1 decreases mesangial cell proliferation as

measured by cell number counting and increases proteins to cell number ratio by about 30 %,

suggesting that RMC undergo hypertrophy in response to GM2 and GM1 exposure. GM3, GD3,

GD1a and lactosylceramide, a non-sialylated precursor of gangliosides, were also tested. Whereas

GM3, GD3 and GD1a also induced mesangial cell hypertrophy similar to GM2 and GM1,

lactosylceramide had no effect (data not shown). These results suggest that sialic acid is part of the

active structure.

GM2 and GM1 gangliosides block cell-cycle progression by increasing p21Waf1/Cip1 expression As GM2 and GM1 induced RMC hypertrophy as observed for glucosamine, we next investigated

whether similar mechanisms were involved. First, cell-cycle of cells treated with exogenous GM2

and GM1 was analysed by flow cytometry. As shown in Table 1, gangliosides induced an

accumulation of cells in the G0/G1 phase, suggesting a blockade in cell-cycle progression at the

G1/S transition. Next, p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 expression was measured. Results indicate that

p21Waf1/Cip1 expression tended to increase in response to GM2 and GM1 exposure whereas p27Kip1

expression was diminished (Figure 3). Altogether, these results suggest that glucosamine and

exogenous gangliosides (GM2 and GM1) inhibit RMC proliferation likely through similar

mechanisms, by increasing p21Waf1/Cip1 expression and blocking cells at the G0/G1 phase. They also

suggest that gangliosides GM2 and GM1 are, at least partly, mediators of the glucosamine effects.

DISCUSSION

Several lines of evidence indicate that the flux through the hexosamine pathway may be causally

involved in the development of diabetic nephropathy. Activation of the HP has been implicated in

signaling pathways that lead to matrix proteins overproduction [25], a major cause of glomerular

enlargement in the early stages of DN. For example, GlcN in particular has been shown to increase

the production of the known matrix-stimulating growth factor, TGFβ [26-28]. However, the

potential role of the HP in growth perturbation and hypertrophy of mesangial cells has been poorly

studied. Therefore, these hypotheses have been investigated in the present study.

Treatment of RMC with GlcN potently inhibited cell growth and induced hypertrophy as assessed

by the proteins to cell number ratio, in a time-dependent manner. Hypertrophy is the consequence

of increased protein content combined to absence of cell division. Thus, the effect of GlcN

treatment on cell-cycle progression of RMC was investigated next. Flow cytometry analyses

indicated that low concentration of GlcN (0.5 mM) arrested RMC cycle progression at the G0/G1

phase. On the other hand, 5 mM GlcN caused an accumulation of cells at the G2/M phase,

suggesting that high concentrations block mesangial cell-cycle at the G2/M transit. These

observations clearly show that low and high concentrations of GlcN exert different actions on

RMC. These differences could be explained when taking into account recent observations from

Marshall et al. in adipocytes [29]. Indeed, these authors showed that a high concentration of GlcN

(2 mM) causes massive accumulation of the hexosamine intermediate product GlcN-6-P that was

accompanied with ATP depletion. In contrast, these effects were not observed in response to low

concentrations of GlcN (0.25 mM) or to high glucose concentrations (20 mM). In RMC treated with

GlcN, ATP depletion or alternatively high GlcN concentrations through other unknown

mechanisms, could result ultimately to DNA damage leading to the arrest of cells in G2/M. Thus,

treatment of RMC with low GlcN concentration (0.5 mM) is likely to be more physiologically

relevant.

To gain better insight into the mechanisms responsible for cell-cycle arrest caused by GlcN, the

expression of cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKI) p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 was studied. Our

studies focused on p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 as these proteins have been involved in G0/G1 arrest of

mesangial cells in different diabetic animal models as well as of cultured mesangial cells exposed to

high ambient glucose concentration [2]. Results indicated that p21Waf1/Cip1 expression was about 3-

fold increased by GlcN treatment as compared to control levels, suggesting that p21Waf1/Cip1 is

involved in the blockade of the cell-cycle progression observed in RMC exposed to GlcN. On the

contrary, p27Kip1 expression was found rather diminished in response to GlcN treatment. A

decreased or unchanged p27Kip1 expression has also been shown in glomeruli of diabetic animal

models [3,30] and in RMC treated with high glucose concentrations [3]. Thus, the effect of GlcN on

RMC cell-cycle arrest is most likely p21Waf1/Cip1-dependent. In addition, p21Waf1/Cip1 has been

described as a pivotal regulator of hypertrophy. Fan et al. showed that exogenous attenuation of

p21Waf1/Cip1 using antisense oligonucleotides, decreased hypertrophy of mesangial cells induced by

hyperglycemia and insulin growth factor-1 [31]. Moreover, in vivo, p21Waf1/Cip1 knockout diabetic

mice did not develop glomerular hypertrophy [32]. These observations suggest that the increased

p21Waf1/Cip1 expression may also be involved in the mechanisms leading to hypertrophy of RMC in

response to GlcN. Because glucosamine effects on RMC are similar to high ambient glucose

effects, one might speculate that the high glucose effects on RMC growth and hypertrophy are, at

least in part, mediated through a HP-induced p21Waf1/Cip1 pathway.

On the other hand, gangliosides are glycosphingolipids that have been involved in the regulation of

proliferation of various cell types. Further, it has been shown that when GlcN is added to cells, even

at low concentrations, marked elevation of UDP-GlcNAc levels is observed [7,29]. This glycosidic

precursor can be incorporated into ganglioside structures such as GM2 and GM1, after

isomerization to UDP-N-Acetyl-galactosamine. Therefore, we investigated whether ganglioside

pattern was affected in RMC submitted to GlcN treatment. Analyses revealed modification of

ganglioside pattern with a massive increase of gangliosides GM2 and GM1. These results suggest

that GlcN increases GM2 and GM1 levels by mass action by providing high amounts of precursors

such as UDP-GalNAc. Radiolabelling experiments with 14C glucosamine also supported a

connection of the HP and ganglioside biosynthesis pathways. However, other mechanisms

regulating ganglioside biosynthesis in response to GlcN should not be excluded. For example, GM2

synthase presents putative binding sites for Sp1, a transcription factor whose activity is up regulated

by GlcN [33].

Next, we assessed whether GM2 and GM1 were involved in the hypertrophy and cell-cycle arrest of

RMC in response to GlcN. Exogenous application of GM2 and GM1 resulted in an increase of the

proteins to cell number ratio. Further, cell-cycle analysis of RMC exposed to GM2 and GM1

showed an accumulation of cells at the G0/G1 phase that was associated to an increase of p21Waf1/Cip1

expression. Thus, exogenous GM2 or GM1 application reproduced the effects of 0.5 mM GlcN on

RMC hypertrophy and cell-cycle arrest. Few studies implicated gangliosides in cell-cycle arrest.

Nakatsuji et al. showed that ganglioside GM3 induces cell-cycle arrest and apoptosis of astrocytes

in part through CDKI p27Kip1 increased expression [34]. Our results further suggest that

gangliosides might also contribute to mechanisms leading to cell hypertrophy. However and as

gangliosides showed similar effects on p27Kip1 expression, results from the present study can not

rule out a role of p27Kip1 decrease in cell cycle arrest induced by glucosamine and gangliosides.

In conclusion, our results show that 0.5 mM GlcN induces cell-cycle arrest at the G0/G1 phase and

hypertrophy of RMC. Moreover, results suggest that gangliosides GM2 and GM1 are involved in

mediating GlcN effects in RMC. Observations from the present study raise new hypothesis into the

potential involvement of the HP in the development of diabetic nephropathy, and add on new

mechanism of action of the HP such as modulation of ganglioside levels in cells. Interestingly,

gangliosides have recently been implicated in insulin-resistance [35,36] and, as discussed earlier,

HP has been shown to induce insulin-resistance in vitro and in vivo. It would be of interest to

investigate whether gangliosides are involved in the HP-induced insulin-resistance.

ABBREVIATIONS

Abbreviations used: CDKI, cyclin-dependant kinase inhibitor; DMEM, dulbecco’s modified eagle’s

medium; DN, diabetic nephropathy; GFAT, glutamine: F-6-P amidotransferase; GlcN,

glucosamine; HBSS, Hanks’ balanced salt solution; HP, hexosamine pathway; HPTLC, high

performance thin layer chromatography; PBS, phosphate-buffered saline; RMC, renal mesangial

cell.

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FIGURE LEGENDS

Figure 1 Glucosamine decreases RMC growth and induces hypertrophy Mesangial cells were exposed to 0.5 mM or 5 mM glucosamine for 4 days. Every day, cells were collected, cell number was counted and total proteins were measured. Growth curves corresponding to cell number expressed in 105 cells (A) and total proteins expressed in µg (B) are shown. Total proteins to cell number ratio is presented in (C) expressed in µg proteins per 105 cells. Results represent means ± SEM of 4 independent experiments. (D) Microscopy phase images of cells under control conditions or cells treated with glucosamine. * p < 0.05 vs control.

Figure 2 Dose-dependent effects of glucosamine on cell-cycle arrest RMC were treated with increasing concentrations of GlcN for 48 hours. Cells were then collected and analysed by flow cytometry as described under Materials and Methods. Results are expressed as the percentage of cells in G0/G1, S, and G2/M.

Figure 3 Glucosamine, GM2 and GM1 gangliosides increase p21Waf1/Cip1 expression RMC were exposed to glucosamine (0.5 or 5 mM), GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Cells were then lysed and equal amounts of proteins immunobloted with monoclonal anti-p21Waf1/Cip1 (A) or anti-p27Kip1 (B)

antibodies. Membranes were immunobloted next with anti-β-actin to control for equal protein loading and

transfer. Representative immunoblots and quantification obtained by densitometric analysis of the bands are

shown. Results were corrected to β-actin signal and are expressed as fold change compared to control.

Results represent means ± SEM of 4 independent experiments.

Figure 4 Effect of glucosamine on ganglioside profile (A and B) RMC were treated with glucosamine (0.5 or 5 mM) for 48 hours and then collected. Gangliosides were extracted, purified and analysed by HPTLC and resorcinol staining. Representative HPTLC (A) and densitometric quantitation (B) are shown. Results are expressed as µg of gangliosides per mg of proteins and represent means ± SEM of 4 independent experiments each performed in duplicates. Under control

conditions, gangliosides quantities were 4.62 ± 0.37, 1.65 ± 0.11 and 0.30 ± 0.05 µg/mg proteins for GM3,

GD1a and GD3, respectively. ND, not detectable. * p < 0.05 vs control. (C) RMC were labelled for 48 h in the presence of 0.2 µCi/ml 14C glucosamine for control cells and 2 mM of glucosamine at a specific activity of 0.5 mCi/ml for treated cells. At the end of incubation, cells were washed extensively and gangliosides were extracted, purified, and separated by HPTLC as described under

Experimental procedures. Radioactivity associated to gangliosides was then analyzed by autoradiography of the HPTLC plates.

Figure 5 GM2 and GM1 gangliosides induce mesangial cells hypertrophy RMC were cultured in the presence of GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Control conditions were complete medium with BSA-10 mM Hepes pH 7.4. Cells were then harvested and counted using haemocytometer, and total proteins measured. Cell number expressed in 105 cells (A) and total proteins expressed in µg (B) are presented. Total proteins to cell number ratio, used to assess hypertrophy is expressed in µg proteins per 105 cells (C). Results represent means ± SEM of 4-6 independent experiments. * p < 0.05 vs control.

Table 1 Glucosamine, GM2 and GM1 gangliosides block cell-cycle of mesangial cells RMC were treated with glucosamine (0.5 or 5 mM) or cultured in the presence of GM2 or GM1 (60 µM) for 48 hours. Cells were then collected and analysed by flow cytometry as described under Experimental methods. Results are expressed as the percentage of cells in each phase of the cell-cycle G0/G1, S and G2/M. Results represent means ± SEM of 5 independent experiments.

Figure 1

C

A

B

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4days

tota

l pro

tein

s / c

ell n

umbe

r controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5days

cell

num

ber (

105 )

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

0

200

400

600

800

1000

1200

tota

l pro

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s (µg

)

0 1 2 3 4 5days

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

D

control

GlcN 0.5 mM

GlcN 5 mM

*** *

*

*

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r controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

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0 1 2 3 4 5days

cell

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ber (

105 )

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

0

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1000

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tota

l pro

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s (µg

)

0 1 2 3 4 5days

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

D

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GlcN 0.5 mM

GlcN 5 mMC

A

B

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40

60

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0 1 2 3 4days

tota

l pro

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s / c

ell n

umbe

r controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

0

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0 1 2 3 4 5days

cell

num

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105 )

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

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0 1 2 3 4 5days

0 1 2 3 4 5days

cell

num

ber (

105 )

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

0

200

400

600

800

1000

1200

tota

l pro

tein

s (µg

)

0 1 2 3 4 5days

0 1 2 3 4 5days

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

controlGlcN 0.5 mMGlcN 5 mM

D

controlcontrol

GlcN 0.5 mMGlcN 0.5 mM

GlcN 5 mMGlcN 5 mM

*** *

*

*

*

Figure 2

0

50

60

70

80

90

100

0 0.5 1 2 5GlcN (mM)

G2/MSG0/G1

% o

f cel

ls

0

50

60

70

80

90

100

0 0.5 1 2 5GlcN (mM)

G2/MSG0/G1

G2/MSG0/G1

% o

f cel

ls

Figure 3

p27

GM2 GM1control 0.5 5GlcN (mM)

β-actin

B

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

β-actin

p21

control 0.5 5 GM2 GM1GlcN (mM)

A

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

p27

GM2 GM1control 0.5 5GlcN (mM)

β-actin

B

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

fold

cha

nge

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

β-actin

p21

control 0.5 5 GM2 GM1GlcN (mM)

A

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

fold

cha

nge

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

control 0.5 5 GM1 GM2GlcN (mM)

Figure 4

A

B

0 50.50

1

2

3

4

5

6

GlcN (mM)

µg /

mg

prot

eins

GM3 GD1a GD3

µg /

mg

prot

eins

ND

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8 GM2

GM1

0 50.5GlcN (mM)

*

ND ND

GT1b (internal

std)

GlcN (mM)stds50 0.5

origin

GM1GM2

GM3

GD3

GD1aGD3

C

control cells

GlcN-treated cells

GM1GM2GM3

GD1aGD3

A

B

0 50.50

1

2

3

4

5

6

GlcN (mM)

µg /

mg

prot

eins

GM3 GD1a GD3

µg /

mg

prot

eins

ND

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8 GM2

GM1

0 50.5GlcN (mM)

*

ND ND

0 50.50

1

2

3

4

5

6

GlcN (mM)

µg /

mg

prot

eins

GM3 GD1a GD3

µg /

mg

prot

eins

ND

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8 GM2

GM1

0 50.5GlcN (mM)

*

ND ND

GT1b (internal

std)

GlcN (mM)stds50 0.5

origin

GM1GM2

GM3

GD3

GD1aGD3

C

control cells

GlcN-treated cells

GM1GM2GM3

GD1aGD3

control cells

GlcN-treated cells

GM1GM2GM3

GD1aGD3

Figure 5

A

control GM1 GM2

cell

num

ber (

105 )

B

tota

l pro

tein

s (µg

)

control GM1 GM2

C

prot

ein

to c

ell n

umbe

r rat

io

control GM1 GM2

* *

* *

02468

10121416

050

100150200250300350400450

0

51015202530

35

A

control GM1 GM2 control GM1 GM2

cell

num

ber (

105 )

B

tota

l pro

tein

s (µg

)

control GM1 GM2 control GM1 GM2

C

prot

ein

to c

ell n

umbe

r rat

io

control GM1 GM2 control GM1 GM2

* *

* *

02468

10121416

02468

10121416

050

100150200250300350400450

050

100150200250300350400450

0

51015202530

35

0

51015202530

35

Table 1

G0/G1 S G2/M

Control ±58 2 22±1 19±1

GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±1

GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±2

GM2 79±2 9±1 ±12 1

GM1 79±1 8±1 12±1

Cell-cycle phase G0/G1 S G2/M

Control ±58 2 22±1 19±1

GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±1

GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±2

GM2 79±2 9±1 ±12 1

GM1 79±1 8±1 12±1

G0/G1 S G2/M

Control ±58 2 22±1 19±1±58 258 2 22±122±1 19±119±1

GlcN 0.5 mM 71±1 13±1 16±171±171±1 13±113±1 16±116±1

GlcN 5 mM 54±1 15±1 29±254±154±1 15±115±1 29±229±2

GM2 79±2 9±1 ±12 179±279±2 9±19±1 ±12 112 1

GM1 79±1 8±1 12±179±179±1 8±18±1 12±112±1

Cell-cycle phase