1

BCPST. 1- 851 et 852. Lundi 10/10/2011.

SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

DEVOIR n° 1

Durée 3 heures 30. Le sujet comporte deux parties indépendantes à traiter sur deux copies distinctes. Ces deux parties sont obligatoires. Il sera accordé une grande importance à la qualité de la présentation, à la clarté et à la concision de la rédaction ainsi qu'à la présence et à la qualité de l'illustration. Certains documents peuvent être découpés et collés sur la copie à condition que le rédacteur ait eu une action sur eux (légende et/ou coloration....)

PARTIE 1.

Quelques aspects de la biologie de la cellule acine use pancréatique. Durée conseillée : 1h15 PARTIE 2.

Organisation et dynamique des membranes des cellule s. Durée conseillée : 2h Attention, cette partie comporte deux thèmes à traiter obligatoirement.

2

PARTIE 1.

Quelques aspects de la biologie de la cellule acine use pancréatique.

1. Etude de sa structure microscopique.

Document 1 : cellule pancréatique de Cobaye (Cavia porcellus) – J.D. Jamieson et G.E. Palade (1973) – structure fine des cellules. Porter – Bonneville. Ed. Ediscience 1.1. En vous appuyant sur le document 1 ainsi que sur son interprétation schématique clairement annotée et

orientée, vous présenterez les caractéristiques d’une cellule sécrétrice. 1.2. Quelles sont les caractéristiques principales des différentes membranes plasmiques (basale, apicale,

latérale) de ce type de cellule.

3

2. Etude de son fonctionnement

Document 2 (à gauche) : résultat d’une autoradiographie de cellule pancréatique prélevée au bout de 3 minutes de séjour dans un milieu contenant de la leucine marquée. Biologie cellulaire et moléculaire – de Robertis – Ed. Maloine. Document 3 (à droite) : Mesure quantitative du marquage des protéines en fonction du temps. Les numéros des courbes correspondent aux numéros des organites indiqués sur les documents photographiques. 2.1. Le document 2 montre les résultats d’une autoradiographie de cellules acineuses pancréatiques. Dans ce

cas, les chercheurs ont utilisé un acide aminé radioactif : la leucine. Sans entrer dans les détails pratiques, précisez les principales étapes de la méthode d’investigation par autoradiographie, appliquée à des cellules vivantes. 2.2. Le document 3 donne les résultats quantitatifs d’une telle étude sur des cellules pancréatiques acineuses.

Le numéro de chaque courbe correspond au numéro de l’organite désigné sur les documents photographiques.

Vous analyserez et interpréterez les courbes et en déduirez le sens de migration des molécules synthétisées. 2.3. En prenant comme exemple une molécule de votre choix, vous préciserez les grandes étapes de synthèse

de celle-ci au sein de la cellule acineuse pancréatique, et les rôles biologique et biochimique précis des organites intervenant dans celle-ci.

2.4. Dans le cas de la sécrétion provoquée, les différents composants lipidiques et protéiques de la membrane

de la vésicule sécrétrice sont incorporés à la membrane plasmique. Ainsi, dans une cellule acineuse

pancréatique sécrétant des enzymes digestives, environ 900 µm2 de membrane de vésicules sont insérés

dans la membrane plasmique apicale (dont la surface n’est que de 30 µm2), à chaque stimulus de sécrétion.

Quel problème cela soulève-t-il du point de vue structural et comment la cellule l’a-t-elle résolu ?

4

3. Etude de la régulation des sécrétions

Document 4 : effet de l’injection intraveineuse de sécrétine (indiquée par la flèche verticale) sur le débit et la concentration de l’ion bicarbonate dans le suc pancréatique. D’après Vagne (1969) – Précis de physiologie –Masson. 3.1. Le document 4 correspond à la sécrétion des bicarbonates (débit et concentration) par un ensemble de

cellules acineuses pancréatiques sous l’influence d’injection de sécrétine (hormone produite par les cellules de la muqueuse duodénale), à différentes concentrations.

Vous analyserez et interpréterez ces résultats expérimentaux.

Document 5 : effet d’une perfusion de pancréozymine sur le débit et la sécrétion d’amylase pancréatique. D’après Harper –Blair – Scratcherd (1962) Précis de physiologie – Masson. 3.2. Le document 5 est l’enregistrement du débit du suc pancréatique, ainsi que de sa concentration en

amylase, sous l’effet d’une perfusion de pancréozymine ou cholécystokinine (produite par les cellules de la muqueuse duodénale).

Analysez et interprétez ces courbes. 3.3. Sous forme d’un schéma de synthèse et uniquement à partir des documents du sujet, vous montrerez

comment synthèse et sécrétion moléculaires sont régulées.

5

PARTIE 2.

Organisation et dynamique des membranes des cellule s.

���� A partir de l’exploitation des documents fournis, étudiez quelques aspects de l’organisation et des

propriétés des membranes biologiques.

Le sujet comporte deux thèmes, indépendants, à aborder tous les deux obligatoirement.

Des conseils pour traiter ce sujet :

• L’exposé sera encadré par une introduction et une conclusion et sera structuré par un plan faisant

apparaître explicitement les thèmes abordés et la progression suivie.

• L’exposé doit se limiter aux deux thèmes abordés par les documents qui feront l’objet de deux parties

indépendantes.

• Les documents doivent tous être exploités avec rigueur et méthode. Selon les cas, il faut justifier les

principales étapes des protocoles expérimentaux.

• Les documents peuvent être découpés et intégrés à la copie à condition d’être exploités. Des schémas

légendés à l’appui de certains raisonnements peuvent être proposés.

• Les connaissances sur le sujet ne doivent pas être longuement développées si elles ne découlent pas

directement de l'exploitation des documents.

6

Thème 1 Organisation et composition des membranes

Document 1 : Cryofracture de membranes.

On réalise une cryofracture et une observation au microscope électronique à balayage : (A) d’une membrane de liposome, vésicule dont la membrane ne contient que des lipides (x 80 000) (B) d’une membrane plasmique de bactérie (E. coli) (x 50 000) D’après Biochimie et biophysique des membranes, Shechter E., 1997, Masson, 2e édition. A B

Document 2 : Observation en microscopie électronique d'une mem brane plasmique

Une cellule de racine de pois est fixée et des coupes fines sont réalisées. Après coloration métallique, la membrane est observée en coupe par microscopie électronique à transmission. ROLAND JC et Coll., « Atlas de biologie cellulaire », Dunod Ed., 2001

Document 3 : Immunomarquage des glucides de la membrane

plasmique

Des anticorps reconnaissant des polymères glucidiques particuliers ont été couplés à des billes d'or. Ces anticorps ont ensuite été incubés en présence d'hématies humaines. Les hématies ont enfin été fixées et coupées, et leur membrane plasmique observée en microscopie électronique à transmission. ROLAND JC et Coll., « Atlas de biologie cellulaire », Dunod Ed., 2001

7

Document 4 : Distribution des phospholipides dans la membrane plasmique de l’hématie

Parmi les phospholipides de la membrane plasmique de l’hématie, on distingue : 17% de phosphatidylcholine (PC) ; 18% de phosphatidyléthanolamine (PE) ; 18% de sphingomyéline (SM) ; 7% de phosphatidylsérine (PS). On étudie la sensibilité des différents phospholipides en réaction à deux enzymes : - la sphingomyélinase (enzyme qui hydrolyse spécifiquement la sphingomyéline), - la phospholipase de venin de serpent (enzyme qui hydrolyse les glycérophospholipides). L'action de ces deux enzymes est testée sur : - des hématies entières, séparées du reste du sang, et placées dans une solution de concentration équivalente à celle des liquides physiologiques. - des "fantômes" d'hématies, obtenus en plaçant les hématies dans de l'eau distillée, puis en isolant la membrane ainsi obtenue, devenue poreuse à toutes les molécules, y compris les enzymes. Après action des deux enzymes, on isole et analyse les phospholipides membranaires pour tester si ils ont été (+) ou non (-) hydrolysés par l'enzyme. Les résultats de cette expérience sont résumés dans le tableau ci-dessous :

Hydrolyse par la sphingomyélinase Hydrolyse par la phospholipase de

venin de serpent

Phospholipides hématies entières "fantômes"

d'hématie hématies entières

"fantômes"

d'hématie

PC - - + +

PE - - - +

SM + + - -

PS - - - +

Document 5 : Distribution du phosphatidyléthanolamine dans la membrane

Du réticulum endoplasmique lisse (lieu de synthèse des phospholipides membranaires passant par la voie de sécrétion) est isolé à partir de cellules végétales. Le REL isolé est mis en présence d'éthanolamine marquée au 14C pendant 30 minutes, puis l'éthanolamine radioactive est remplacée par de l'éthanolamine non marquée. Après ce pulse d'éthanolamine marquée, le REL est mis en présence de molécules se liant par liaison covalente au phosphatidyléthanolamine : - le FDNB (fluoro-dinitrobenzène), auquel la membrane du REL est perméable, - ou le TNBS (acide trinitrobenzènesulfonique), auquel la membrane du REL est imperméable.

Les molécules de phosphatidyléthanolamine membranaire du REL sont ensuite extraites, et on teste le % de ces molécules qui ont été liées au FDNB ainsi que le % de molécules liées au TNBS.

Temps de chasse (h)

8

Thème 2 Fluidité des membranes

Documents issus de Schechter, « Biochimie et biophysique des membranes », ed Dunod et de Lodish et al., « Biologie moléculaire de la cellule », ed De Boeck.

Document 6 : Mobilité des protéines membranaires

En 1970, Frye et Edidin ont pu créer des hybrides cellulaires ou hétérocaryons en fusionnant une cellule humaine avec une cellule de souris pour former une seule cellule avec une membrane plasmique continue et contenant des protéines membranaires humaines et de souris. Après la fusion, la distribution des protéines sur la surface cellulaire a été suivie durant plusieurs heures en utilisant un marquage spécifique des protéines humaines et des protéines de souris, grâce à des anticorps spécifiques couplés à des marqueurs fluorescents. Les auteurs distinguent des cellules mosaïques où il y a un mélange des antigènes de surface et des cellules non mosaïques où les antigènes de surface sont séparés.

Document 6a.

Pourcentage de cellules doublement marquées (hybrides) montrant une distribution en mosaïque (noir) ou non-mosaïque (blanc) de protéines humaines ou de souris sur leur surface en fonction du temps d’incubation (en minutes à 37°C). D’après Frye L.D. and Edidin M., Journal of Cell Science 7:319-335, 1970.

Document 6b.

Les mêmes auteurs ont répété l’expérience à des températures différentes. Ils ont reporté sur le graphe du document 6b le pourcentage de cellules mosaïques observé 40 minutes après la fusion cellulaire. Le même protocole a été mis en œuvre en présence d’un inhibiteur de la synthèse d’ATP: les résultats obtenus sont identiques.

9

Document 7 : Résultats de la technique de fluorescence photo-bl eaching-recovery appliquée à quelques

systèmes membranaires.

Un constituant de la membrane plasmique (une protéine par exemple) est marqué spécifiquement par une molécule fluorescente. Une petite région de la surface cellulaire (environ 3 µm2) est observée au microscope.(fig. a). Puis les molécules fluorescentes de cette région sont détruites par l’émission de lumière brève et intense d’un laser (fig. b). Le rétablissement de la fluorescence de cette région est ensuite suivi en fonction du temps (fig. c). Les résultats sont rassemblés sur un graphique.(fig. d).

Les courbes ci-après ont été établies pour des membranes artificielles constituées de phospholipides dont les acides gras sont : - l’acide stéarique (fig e), - un mélange acide stéarique et acide oléique (fig f), - un mélange acide stéarique- acide oléique et cholestérol (fig g).

10

Document 8 : Etude de la fluidité membranaire chez la bactéri e.

La viscosité est la propriété qu’a tout fluide d’opposer une résistance aux forces qui tendent à déplacer les unes par rapport aux autres les particules qui le constituent. La fluidité est l’inverse de la viscosité : plus un milieu est fluide, plus sa résistance au déplacement particulaire est faible et donc plus sa viscosité est faible. Une bicouche phospholipidique présente deux états possibles : un état liquide (fluide) et un état gélifié (plus visqueux). L’état fluide est indispensable au bon fonctionnement des membranes biologiques.

8a. Variations de la fluidité membranaire en fonction de la température de croissance chez E. Coli

Des bactéries (E.Coli) sont cultivées à 37°C ou à 27°C. La membrane plas mique est isolée et sa viscosité est déterminée par RPE (résonance paramagnétique électronique). U.A : unité arbitraire

8b. Composition des lipides membranaires en acide gra s en fonction de la température de croissance

d’E.Coli.

La composition des lipides membranaire a été analysée chez E. Coli aux deux températures de croissance de 27°C et 37°C.

Acide gras (%) C14 :0 C16 :0 C16 :1 % insaturés

Température de croissance

27°C

37°C

4

19

47

65

49

16

49

16

Les acides gras sont notés Cx :y où x = nombre d’atomes de carbone, y = nombre de doubles liaisons dans la chaîne hydrocarbonée.