Selection d'une souche de Rhodotorula pour la production deproteines sur pomme de terre

AbstractFifty strains of Rhodotorula belonging to 11 different species

ha:ve been studied on a substrate of acid hydrolyzed potato. Theirgrowth and their protein production have been compared tothose of a conventional yeast, Torula utilis NRRL Y-900. Theyeast Rhodotorula rubra Y-3832, isolated from the St. Lawrenceriver, has produced 27% more dry matter than Torula utilis whoseyield was 50%.

The acid hydrolysed potato has bee:l a good substratesuitable for the growth of traditional species as well as of moreefficient species such as Rhodotorula rubra Y-3832. The hydrolysiswith sulfuric acid (1%) at 121C in an autoclave has been completefor three different dilutions 1:30, 1:20 and 1:10. The time ofhydrolysis has been a function of the nature and size of thecontainer and also of the volume of the hydrolyzing mixture.

Cinquante lignees de Rhodotorula appartenant it 11 especesdifferentes ont ete selectionnees sur un milieu de l'hydrolyseacide de puree de pomme de terre. Leur croissance et leurproduction de proteines totales ont ete comparees it celles d'unelevure conventionnelle Torula utilis NRRL Y-900. La levureRhodotorula rubra Y-3832, isolee du fleuve Saint-Laurent adonne un rendement en matii~re seche 27% plus eIeve que To:Ulautilis, dont le rendement est 50%.

L'hydrolysat acide de pomme de terre s'est avere un bansubstrat convenable pour la croissance des especes traditionnellesaussi bien que des especes plus efficaces comme Rhodotorularubra Y-3832. L'hydrolyse it I'acide sulfurique (1%) it 121 Cdans un autoclave a ete complete au niveau de 3 dilutionsdifferentes 1:30, 1:20 et 1:10. La duree de l'hydrolyse a etefonction de la nature et des dimensions du contenant ainsi que desvolumes du melange it hydrolyser.

Materiels et Methodes1. Hydrolyse acide des pommes de terre.1.1 Pomme de terre

Les pommes de terre utilisees pour la prepara­tion du substrat etaient de la categorie de table A.Elles provenaient d'un seul lot et contenaient environ20% de matiere seche dont 75% etait de l'amidon.

Pour les fins d'hydrolyse, les pommes de terresont d'abord lavees et coupees en petits morceaux, puisensuite desintegrees dans des solutions d'acide suI·furique a l'aide d'un Waring Blender.1.2 Conditions d'hydrolyse

la concentration de l'acide sulfurique a variede 0.25% a 1.5%le taux de dilution en terme de g d'extraitssecs par ml de solution acide, a varie de 1 :10a 1:30l'usage d'un cuiseur a pression Presto a etecompare a celui d'un autoclavedes contenants en vel're et en propyethylenepour differents volumes de melange a hydroly­ser ont ete utilises.

1.3 IMesure des sucres reducteursLes sucres reducteurs ont ete determines par la

methode modifee de Somogyi (Cox et Pearson, 1962).2. Etude de selection2.1 Levures

I.es levures utilisees dans cette etude representent;'50 lignees appartenant a 11 especes differentes deRhodotorula provenant en majorite de la collectiondu departement des Vivres, Universite Laval. Quel­ques-unes nous ant ete fournies par le docteur Spencerde Saskatoon (Canada) et l'espece conventionnelle­ment utilisee, Torula utilis NRRL Y-900, a ete obte·nue du Dr. ",Vickermann, NRRL, Peoria, Illinois.

Ces cultures ont ete re.;ues a l'etat lyophilise etelles ont ete reactivees par la suite dans du bouillonY-M de composition suivante: Extrait de levure 3g,Extrait de malt 3g, Peptone 5g, Glucose 109 et unlitre d'eau.

Apres une periode d'incubation de 5 a 14 jours,les cultures ont ete repiquees dans un milieu a culturey.JM additionne d'agar et apres croissance elles ontete conservees a 0 C.

P. Q. Tong, It E. Simard et R. R. RielDepartement des vivres, Faculte de sciences de l'agriculture

et de l'alimentation, Universite Laval, Quebec

terre. Ce substrat est d'ailleurs couramment utilisepour la culture de 1'o1'ula utilis NRRL Y·900, et cons­titue une source de plus en plus importante d'hydra·tes de carbone a recuperer des dechets industriels(Nikerson et Brown, 1965).

Plus precisement cette etude porte sur la recher·che des conditions favorables a l'hydrolyse acide del'amidon de pomme de terre et sur la selection d'uneespece de Rhodotorula apte a l'utilisation de cet hy.drolysat.

Resume

IntroductionLes levures qui sont couramment considerees com­

me levures-aliments commerciales se limitent a quel­ques especes de Saccharomyces et de Torula (Birolaud,1968). Les Rhodotorula ont ete plut6t etudiees pourla production des lipides (White, 1954). Les travauxde Chiao et Peterson (1954) ont montre qu'une ligneede Rhodotorula g1'acilis est plus riche en acides ami·nes limitants que les especes traditionnelles de Saccha­romyces et de Torula. Les Rhodotorula peuvent doncpresenter un interet avantageux en alimentation. Desrecherches effectuees recemment par une equipe desPhilippines (Hipolito, Domingo et Sarte, 1965; Mi­randa, 1967) ont montre la possibilite d'utiliser unesouche de Rhodotontla pilimanae comme source deproteines au meme titre que les Saccha1'omyces et lesTorulc(. En Russie, Zeltin (1969) a pu obtenir unebiomasse riche en proteines par la culture de Rhodo­torula gracilis sur de la liqueur sulfitique. Et plusrecemment au Canada, Simard, Busque et Riel (1973)ont utilise une souche de Rhodotorula pour traiterles eaux usees de croustilles.

A la suite de ces travaux, nous avons cherche aetablir l'habilete des Rhodotorula a produire des pro­teines alimentaires a partir de l'amidon de pomme deContribution No 168. Faculte des Sciences de l'Agrlculture et deI·AlImentatlon.

239 J. Inst. Can. Scl. Technol. Aliment. Vol. 6, No 4. 1973

12010080604020

DUREE D HYDROLYSE (min.)

Influence de la concentration d'acide sulfurique sur ledegre d'hydrolyse des pommes de terre dans un cuiseurPresto a 44g/cm2 de pres3ion. Concentrations de I'acide:1, 0.25%; 2, 0.5%; 3, 1.0%.Influence of sulfuric acid concentration on the extent ofhydrolysis of potato starch in Presto cooker at 44g/cm2.Acid concentrations: 1, 0.25%; 2, 0.5%; 3, 1.0%.

o

ILl 60CIl

~o0:o>-J: 40 2__e_e-=---z eg

~ ~ l:=: _Fig.!.

Fig. 1.

22 :Milieu de culture. L'hydrolysat de pomme de terre utilise comme

substrat de selection pour les levures avait la com-position suivante: 1.7% de matiere seche, 0.4% desucres, 0.18% d'azote et 0.71 % de cendres.

Il a ete prepare en quantite de 12 litres a l'aided'un autoclave a 121 C et d'une solution d'acide sulfu­rique a 0.5%. Le taux de dilution a ete1:20. Aucunesource d'azote n'a ete ajoutee au milieu afin que lepotentiel de chaque espece a utiliser l'azote des pom­roes de terre soit clairement mis en evidence.

Ce substrat de selection a ete sterilise au pH 1.4et conserve a 0 C avec les conditions d'aseptie usuelles.Le pH a ete ensuite ajuste a 4.5 avant l'inoculationavec une solution sterile de NaOH a 10%.2.3 Fermentations

Les levures choisies pour chaque experience ontHe reactivees en les cultivant pendant 72 h a 28 Cdans 50 ml de substrat de selection. Les cellules dechaque lignee ont ete recueillies ensuite par centri­fugation a 1000 x g. Elles ont subi trois lavages suc­cessifs avec des portions d'eau distillee sterile de 50ml a chaque fois avant d'etre diluees a une concen­tration de 50% de transmittance mesuree au spectro­photometre a une longueur d'onde de 420 nm. Un mlde cette suspension, contenant environ 0.2 mg de ma-tiere seche, a ete utilise comme inoculum pour chaque ensuite a la determination de l'azote. L'azote est de-100 ml de substrat de selection place dans des ballons termine suivant la methode officielle Micro Kjeldahlerlenmeyer de 500 ml. Le melange a ete incuM en (A.O.A.C. 1965).conditions aerobiques a 28 C durant 72 h avec uneagitation de 400 rev/min sur un agitateur New-Bruns- Resultatswick. 1. Ifydrolyse acide des pommes de terre.2.4 Mesure de croissance La figure 1 presente l'influence de l'acidite sur

La croissance a ete mesuree d'apres la quantite l'hydrolyse des pommes de terre dans un cuiseur ade biomasse obtenue sous forme de matiere seche. Un pression de marque Presto, operant a 44 g/cm2 dea2 m! d'une suspension de cellules lavees sont pipettes pression. La proportion du melange est gardee con-dans des Mchers de 10 ml de poids connu. Les Mchers stante pour cette serie d'experiences, soit une partiesont ensuite places dans un four a vide a 80 C et a une en poids de pomme de terre pour vingt parties enpression de 29 g/cm2 pendant 16 h. lIs sont ensuite volume de solution acide. Les concentrations de sucresreftoidis au ctessicateur et peses pour en obtenir la rMucteurs sont calculees en mg par ml d'hydrolysatmatiere seche. obtenu et en pourcentage de la matiere seche. Les2.5 Determination de l'azote total teneurs en sucres produits par l'hydrolyse sont ra-

La biomasse recueillie par centrifugation d'une menees sur la base d'amidon en supposant que l'ami-quantite de substrat de 50 ml obtenu apres 72 h de don represente 75% du poids sec de la pomme depropagation a ete lavee trois fois avec des portions de terre (Treadway, 1965). Cette derniere valeur est une50 ml d'eau distillee afin de l'en debarrasser de toute mesure de l'efficacite du traitement.trace d'impuretes et d'azote residuel pouvant adherer Les influences de la concentration d'acide et dea la paroi externe des cellules. Le depOt a He dilue la duree d'hydrolyse ont ete nettes sur le rendementau volume initial et un ml de cette suspension a servi en sucres. La solution acide de 0.25% a donne un

Tableau 1. Influence du niveau de dilution et de la dun~e d'incubation sur le degre d'hydrolyse d'amidon de pomme de terre.

g Pommes de terre: Duree Rendement en sucre Rendement en sucre dans les pommes de terre (%)ml 1% H2SO. d'hydrolyse (min) mg/ml Hydrolysat base nature base seche base amidon

20 3.30 11.25 54.80 731:30 40 4.65 15.CO 75.60 100

60 4.65 15.50 75.60 10020 5.85 11.70 57.00 76

1:20 40 7.80 15.60 76.00 10060 7.80 15.60 76.00 10020 9.60 9.60 46.80 62

1:10 40 15.60 15.60 76.00 10060 15.60 1;:;.60 76.00 100

Table 1. Effect of dilution level and incubation time on the extent of hydrolys:s 0: potato starch.

Can. Inst. Food SeL Teehno!. J. Vo!. 6, No. 4, 1973 240

Fi~. 2.

Fi~. 2.

80

w(I)

~0 60er0....:I:

Z00 40~<l

~0

20

DUREE D' INCUBATION (min.)

Influence de la concentration d'acide sulfurique 1,0.25%; 2, 0.5%; 3, 1.0%; 4, 1.5% sur le degre d'hydrolysedes pommes de terre dans un autoclave a 121 C.Influence of sulfuric acid concentration 1, 0.25%; 2,0.5%; 3, 1.0%; 4, 1.5% on the extent of hydrolysis ofpotato starch in an autoclave at 121 C.

taux d'hydrolyse nul apres 100 min comparativementa 37% avec la solution acide de 0.5% et enfin 57%avec la solution acide de 1%. Au-dela de 100 min,apres une conversion de 57% de l'amidon en sucre,l'hydrolyse a atteint un plateau dans les conditions denotre experience.

Par contre, en utilisant un autoclave a 121 C laconversion de l'amidon en sucre a Me totale, apres100 min avec une solution acide de 0.5%, et apres40 min avec des solutions de 1% ou de 1.5% (Figure2). L'autoclave s'est donc revele plus efficace que lecuiseur Presto pour la preparation du substrat. Lasolution d'acide sulfurique de 1% a ete optimale pourune conversion complete.

Trois niveaux de dilution 1 :30, 1 :20, 1 :10 ontete calcules comme ayant respectivement 0.4%, 0.8%

Tab;eau 2. Classement des meiIleures Rhodotomla d'apres leurproduction de biomasse et de proteines.

Numero de Culture Matiere seche Proteine Proteinestotales

la souche (~/l) (% base sucre) (%) (gm

Y-3832 Rhodotorula rubra 2.84 71 ~9.58 0.8414Y-705 R. glutinis 2.80 70 26.80 0.7876Y-3787 R. glutinis 2.76 69 29.28 0.7836Y-3756 R. ~lutinis 2.68 67 29.66 0.7690Y-3799 R. glutinis 2.66 66 27.18 0.7552Y-3772 R. glutinis 2.64 66 27.58 0.7516Y-3740 R. laclosa 2.40 60 31.72 0.7278Y-900 Torula utilis 2.03 50 33.66 0.6795

Table 2. Biomass and protein yields of the most promisingRhod:>torula species.

24]

Tableau 3. Analyse de variances du rendement proteique deslevures.

De~re de Somme des Variances -----Constituants Fliberte carres

Total 38 73905.59Intergroupes 7 71092.59 10156.08 111.92Intragroupes 31 2813.00 90.74

F : 111.92F (7 31) 95%: 2.327F (7 31) 99%: 3.258Moyennes des groupes par ordre croissant:95%

Y-900 Y-3740 Y-3772 Y-3799 Y-3756 Y-3787 Y-705 Y3832679.5 727.8 751.6 755.2 769.0 783.8 787.6 841.4

99%679.5 727.8 751.6 755.2 769.0 783.8 787.6 841.4

Deux moyennes soulignees par le meme tuit ne sont passignificativement differentes; deux moyennes non soulignees parle meme trait le sont.

Table 3. Analysis of variance of protein yield of yeasts.

et 1.5% d'amidon. L'hydrolyse complete de ce~ quan­tites d'amidon devrait donner des concentratIOns de0.4%, 0.8% et 1.5% en sucre fermentescibles. Le ta­bleau 1 montre qu'une hydrolyse complete a He ob­tenue pour chacun des trois niveaux de dilution apres40 min dans l'autoclave et avec la concentration d'a­cide prealablement choisie (1%).2. Selection des souches de levures

Le tableau 2 montre les resultats globaux en ma­tiere seche en pourcentage de proteines et en quantitede protein~s totales produites par unite de substratpar les 7 l11eilleures souches de Rhoclotorula et parTorula utilis NRRL Y-900.

D'apres leur efficacite a croitre, exprimee selonla l11atiere seche produite, la souche de Rhodotorularubra Y-3832 a donne la biol11asse la plus elevee soit2.84 g/l cOl11parativel11ent a 2.03 g/l pour Torula utilisNRRL Y-900 qui s'est reveIe le plus faible du groupe.

La quantite de l11atiere seche de 2.84 g/l a eteobtenue par la levure Rhodotorula rubra Y-3832 surun hydrolysat de 0.4% de sucres ferlllentescibles. L'ef­ficacite de conversion en terllles de lllatiere seche surla base des sucres presents a ete 71%. Elle a ete 50%pour la lignee Torula utilis NRRL Y-900.

La richesse en proteines de chaque souche calculeeen pourcentage de la biol11asse sur la base de lllatiereseche est dOllnee. La souche standard Toru7a utilisNRRL Y-900 contient le plus fort pourcentage avec33.6%. D'apres llotre crit<~re de selection, ni la pro­duction de la matiere seche ni la richesse en proteinesprises separelllent ne peuvent servir de critere aUchoix de la meilleure lignee, Celle-ci doit etre carac­terisee silllultanelllent par une biomasse et un tauxeleve de proteines. Ces deux valeurs conduisent ne­cessairel11ent au calcul de la quantite de proteinestotales produites par unite de substrat (Gray et Abou­el-Seoud, 1966). C'est le critere que nous utiIisonspour notre etude de selection.

Enfin la lignee Rhoclotorula rubm Y-3832 a pro­duit la plus grunde quantite (0.84g) de proteines to-

J. Inst. Can. SeL Teehnol. Ailment. Vol. 6, No 4, 1973

polymeres

celle de la souche standard dont le rendement sur labase des sucres est en accord avec les donnees citeesdans la litterature (Bujak, 1952; Janicki, Szebiotkeet Stuwick, 1966). Le faible pourcentage de sucres(0.4%) qui a ete choisi pour nos travaux de selectionn'a pas affecte la force de croissance intrinseque deslevures etudiees, it savoir que celle-ci semblerait pro­portionelle it la quantite de sucres fournie.

Les teneurs en proteines des levures etudiees ontete plus faibles que celles rapportees dans la litte­rature. Ainsi la lignee Tontla utilis NRRL Y-900 dentla teneur en proteines est generalement de l'ordre de50% a 56%, en contenait moins de 40% ('fableau 2).Les memes observationsont ete notees chez les sou­ches de Rhodotorulcl qui ne contenaient que 23 it 30%

77.093.0

Amidon

Tableau 4. Comparaison de l'hydrolyse acide de l'amidon(autoclave a 121 C) dans deux contenants differents.

~elle d'hydrolyse Duree d'incubation Rendement(min.) (g sucres/l00 g amidon)

~l dans des 20 89.4bouteilles en verre 40 98.9

60 98.95000 ml dans des contenar.tsen propyethyJene 120

180

:rable 4. Effect of type of container on acid hydrolysis of starch(autoclave 121 C).

tales par litre de substrat. C'est la levure Torula utilisNRRL Y-900 qui a produit la plus faible quantite,soit 0.68 g/l. Des huit levures selectionnees, le TOl'ulalltilis a ete la plus riche en proteines mais la plus pau­vre en biomasse. L'analyse des variances a demontred'autre part que le Rhodotorula TLlbra Y·3832 est si­gnificativement distinct des autres au niveau de 99%(Tableau 3).

Discussion et Conclusions

opereI' a 121 C, et ceci nous a contraints au choix d'unesolution de 1% d'acide sulfurique. La solution acidede 0.5% peut aussi donner des resultats satisfaisantssi la temperature peut etre plus elevee, autrement ilfaut poursuivre l'hydrolyse pendant des temps pluslongs (Figure 2).

Les sucres obtenus sont bien assimiIes par les le­vures, car le rendement de la souche Torula utilisNRRL Y-900, soit 50 g de matU~re seche par 100 g desucres, correspond bien aux travaux de Bujak (1952)sur un substrat provenant de l'hydrolyse acide des pom­mes de terre, et de Janicki, Szebiotke et Stawicki(1965) sur un motH prepare a partir de h'ydrolyse en­zymatique. D'apres tous ces resultats, le rendement nesemble pas dependre de la nature des sucres obtenusde l'hydrolyse acide ou de l'hydrolyse enzymatiquecomme le pretendent Norheim, Schierbaum et Richter(1968) .

Le desavantage de l'hydrolyse acide reside dansla corrosion possible des appareils utilises a l'echelleindustrielle. Les contenants en verre sont bien effi­caces et inattaquables par les solutions acides mals

1 - Hydrolyse acide des pommes de terre tres peu maniables. Nous avons essaye les contenantsL'autoclave operant a 121 C s'est avere superieur en propyethylene et l'efficacite de l'hydrolyse a dimi-

au cuiseur Presto pour hydrolyser des pommes de nue de 23% a la temperature de 121 C apres deuxterre. Il est probable que le cuiseur n'atteignait pas heures dans l'autoclave, mais elle etait a 93% apresla pression de 44 g/cm2 correspondante a 121 C alors 3 heures de traitement (Tableau 4). L'utilisation deque le taux et le degre d'hydrolyse sont influences temperatures plus elevees et de polymeres thermo-par la temperature (Hollo et Szejtli, 1961; Kryach- resistants favoriseraient l'hydrolyse complete tout enkov, 1954) comme d'ailleurs par les concentrations d'a- contournant les problemes de corrosion.cide (Leman et Didry, 1950). Nos resultats expriment 2 - Etude de selection.bien les influences de ces facteurs sur l'efficacite d'hy· La superiorite de la souche RhodotoTLlla rubradrolyse (Figures 1, 2). Y-3832 SUI' la souche de reference Torula utilis NRI{L

L'hydrolyse acide de l'amidon pourrait etre ce- Y-900 (Reiser, 1954) dans la production des proteinespendant incomplete a cause d'une resynthese ou d'une a ete manifestee de fagon convaincante. I ..es sept sou-reversion eventuelle des sucres telle que mentionnee ches de Rhodoto1'ula etudiees dans la selection finalepar Norheim, Schierbaum et Richter (1968), et par sont aussi superieures a cet egard au Torula utilisMark et Clerk (1963). Ces sentiers de reversion ont NRRL Y-900. Leur- superiorite est due a leur habileteete schematises par Kerr (1950) de la fat;on suivante: a produire une biomasse beaucoup plus abondante que

Hydrolyse 1{eversion----)~ D-glucose ~~ produits de reversion

J DeshydratationHydroxy-methyl furfuraldehyde

tAcides levulinique et formique

Kerr a d'ailleurs precise que cette recombinaisondependait des concentrations initiales d'amidon, donedes divers taux de dilution. Silin et Sapegina (1939)ont particulierement etudie l'effet des concentrationsd'amidon de 0 a 63%, et l'hydrolyse atteinte fut de98% et 100% pour les concentrations initiales d'amidonde 0 it 4% et seulement de 63.6% pour la concentrationla plus elevee. Donc, plus les concentrations d'amidonsont fortes plus l'efficacite d'hydrolyse diminue. Dansnotre tl'avail, nous avons utilise des niveaux de dilu­tion de 1 :30 it 1 :10, contenant de 0.4 a 1.5% d'amidon.L'hydrolyse u ete complete a l'autoclave a 121 C etavec des solutions de 0.5 a 1.5% d'H2S04, ce qui cor­l'espond bien aux resultuts des chercheurs precites.

L'autoclave dont nous disposons etait regIe poUl'

Can. Inst. Food SeL Teelinol. J. Vol. 6, No. 4, 1973 242

de proteines par rapport aux valeurs de 40 a 45%eapportees par Chiao et Peterson (1954).

La nature du milieu de culture semblerait etreit l'origine de ce faible rendement en proteine. La de­ficience en azote du substrat est probablement la causede cette faiblesse en proteines. D'apres Chiao et Pe­terson (1954), et Zeltin (1969) les sels d'azote peu­vent aider a la conversion des sucres en proteines chezTorula 1ltilis et Rhoclotorula gllltinis.

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