SELECTION ET IDENTIFICATION DES SOUCHES TELLURIQUES

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES

DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION : CHIMIE

DEPARTEMENT DE CHIMIE MINERALE ET CHIMIE PHYSIQUE

MEMOIRE DE FIN D’ETUDE

En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER II

Parcours : Génie de l’Eau et Génie de l’Environnement (2GE)

Présenté le 23 Juillet 2015 par :

RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha

Devant la commission du Jury composée de :

Président : Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Maître de

Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo

Rapporteur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de Recherches au

Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement

Examinateur : Monsieur Pierre Hervé RAVELONANDRO, Professeur à la Faculté des

Sciences de l’Université d’Antananarivo

SELECTION ET IDENTIFICATION DES SOUCHES TELLURIQUES IMPLIQUEES DANS LA DEGRADATION DES

HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES (HAP)

Remerciements

REMERCIEMENTS

En premier lieu, J'adresse mes vifs remerciements et reconnaissances pour notre

Seigneur Tout Puissant à qui je dois la vie et la santé. Sans lui, je n’aurai pu réaliser ce travail.

Gloire à DIEU !!

Le présent travail a été réalisé dans le Laboratoire de Physico-chimique et de

Microbiologie de l’Environnement du Centre National de Recherches sur l’Environnement

(CNRE), je tiens à remercier différents responsables de m’avoir accueillie dans leur équipe.

J’exprime également ma profonde gratitude aux personnes citées suivantes :

Monsieur Armand René Panja RAMANOELINA, Président de l’Université

d’Antananarivo ;

Monsieur Marson RAHERIMANDIMBY, Doyen de la Faculté des Sciences ;

Monsieur Tinasoa RAMAMONJY, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de

l’Université d’Antananarivo, Chef du Département de Chimie Minérale et de Chimie

Physique à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo ;

Madame Fienena Félicitée REJO, Professeur, Directeur du Centre National de

Recherches sur l’Environnement (CNRE) de m’avoir accueillie au sein de cette

institution ;

Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Responsable de l’option

Chimie des Maréraiux et Maître de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université

d’Antananarivo qui a accepté de consacrer son temps précieux afin de présider ce

mémoire ;

Monsieur Pierre Hervé RAVELONANDRO, Responsable du Parcours Génie de l’Eau

et Génie de l’Environnement (2GE) et Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université

d’Antananarivo pour tous les efforts que vous avez déployé en vue d’orienter notre

formation dans les louables voies et de bien voulu examiner et juger cet humble travail ;

Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de recherches et Chef de

Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), rapporteur de ce mémoire, qui

a consacré son temps pour me diriger dans la progression de mon travail et nous a fait

bénéficier de ses expériences et précieux conseils malgré ses multiples activités.

Monsieur, les mots ne suffiront pas pour vous exprimer mes sincères remerciements, vos

commentaires, vos encouragements et ainsi que votre patience m’ont permis d’accomplir

ce travail dans les meilleures conditions ;

Remerciements

Monsieur Yves MONG, Maître de Recherches et Chef de Laboratoire d’Analyse

Environnemental et Qualité de la vie au Centre National de Recherches sur

l’Environnement (CNRE), pour les précieux conseils que vous avez procurez lors de la

réalisation de ce travail ;

Messieurs Lala RAJOELISOA et Wega Leonard ASIMBOLARIMALALA,

Enseignants Chercheurs au Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE)

pour leurs aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;

A toute l’équipe du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), en

particulier, Madame Onja ANDRIAMBELOSON, Monsieur Clet Marcellin

RABENAIVO et Mademoiselle Hanitrisoa Harimisa ANDRIAMAFANA pour leurs

aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;

A tous les membres de Jury, qui ont bien voulu juger mon travail, malgré leurs

nombreuses occupations ;

A tous les Enseignants de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo qui nous

ont fourni les connaissances indispensables à notre formation durant ces cinq années

d’études ;

A tous les membres de ma famille, mes ami (es) et collègues pour leurs soutiens autant

moraux que financiers et sans quoi, je n’aurais pu terminer ce mémoire.

Et enfin, je réitère une reconnaissance particulière pour une personne très spéciale à

mes yeux, c’est sa présence pendant les périodes difficiles dans l’élaboration de ce travail qui

m’a toujours encouragée à continuer. J’espère que tu apprécieras les fruits de tous les efforts

que j’ai mis dans ce livre.

Bref, je ne peux tous assez-vous remercier par ces simples phrases. C’est à travers

l’élaboration de ce mémoire que j’ai compris les intérêts de la solidarité.

Sincères reconnaissances à tous !

Table des matières

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE ................................................................................................................. i

ABREVIATIONS ............................................................................................................... iv

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... vi

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... vii

LISTE DES PHOTOS ........................................................................................................... viii

INTRODUCTION ................................................................................................................ 1

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 3

I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS ........................................................ 3

I.1.1. Activités microbiennes dans les sols ......................................................................... 4

I.1.2. Interactions entre microorganismes .......................................................................... 4

I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES –

GENERALITES ................................................................................................................... 4

I.2.1. Définition – classification ......................................................................................... 5

I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP .................................................................... 6

I.2.2.1. Solubilité ..................................................................................................... 6

I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau .............................................................. 6

I.2.2.3. Pression de vapeur ...................................................................................... 6

I.2.3. Origine des HAP ....................................................................................................... 8

I.2.4. Toxicité des HAP ...................................................................................................... 8

I.2.5. Distribution des HAP .............................................................................................. 10

I.2.6. HAP dans les sols .................................................................................................... 10

I.3. BIODEGRADATION DES HAP ............................................................................... 10

I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP

.............................................................................................................................................. 11

I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP ........... 12

Table des matières

I.6.FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP ............................ 14

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES

II.1. MATERIELS .............................................................................................................. 15

II.1.1.Site et échantillonnage de sol ................................................................................. 15

II.1.2. Milieu de culture .................................................................................................... 15

II.1.2.1. Milieu d’isolement et d’identification ...................................................... 15

II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar) ............................................... 15

II.1.2.1.2. Milieu King B .......................................................................... 16

II.1.2.1.3. Milieu AS1 .............................................................................. 16

II.1.2.2. Milieux d’identification de la souche de Bacillus ..................................... 16

II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate .......................................... 16

II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose – Glucose – H2S) ................... 16

II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate) ................................................. 16

II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer ..................................................................... 16

II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole ................................................................... 17

II.1.2.2.6. Milieu à l’eau peptonée au rouge de phénol ............................. 17

I.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification .................................. 17

II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3) ......................................... 17

II.1.2.4. Milieu d’identification macroscopique ....................................................... 17




II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments

diffusibles .............................................................................................. 17

II.1.2.5.1. ISP6 (International Streptomyces 6) .......................................... 17

II.1.2.5.2. ISP7 (International Streptomyces 7) .......................................... 18

II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques ........................ 18

Recherche de nitrate réductase ……………………………………… 18

II.1.2.6.1. Bouillon nutritif ........................................................................... 18

II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques ...................... 18

Détermination de la température optimale de croissance ……………18

II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA) .................................................................. 18

Table des matières

Détermination du pH optimum………………………………………18

II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose) ........................ 18

II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire ...................................... 18

II.1.2.8.1. Viande Foie (VF) ............................................................................ 18

II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité ............................................... 18

II.1.2.9.1. Mannitol–mobilité ................................................................................... 18

II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive ............................................. 18

II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif ............................ 19

II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG) ....................................... 19

II.2. METHODES ............................................................................................................... 20

II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP) ............................................................... 20

II.2.2. Isolement des souches microbiennes ..................................................................... 20

II.2.2.1. But .............................................................................................................. 20

II.2.2.2. Principe ........................................................................................................ 20

II.2.2.3. Mode opératoire ........................................................................................... 21

II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents .................... 21

II.2.2.3.2. Isolement des souches d’actinomycètes ......................................... 21

a. Prétraitement des échantillons de sol................................................... 21

b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu ... 21

II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable ............................................. 22

II.2.3. Conservation des souches ...................................................................................... 22

II.2.4. Test de résistance des souches isolées ................................................................... 22

II.2.4.1. But .............................................................................................................. 22

II.2.4.2. Principe ....................................................................................................... 22

II.2.4.3. Mode opératoire .......................................................................................... 23

II.2.4.3.1. Préparation d’une solution mère de HAP ......................................... 23

II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes ..................................................... 23

II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries ............................................................ 23

II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement .............................................................. 23

II.2.5. Identification des souches sélectionnées ............................................................... 24

II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable ................................................... 24

II.2.5.1.1. Etude des caractères culturaux.......................................................... 24

II.2.5.1.2. Etude des caractères morphologiques et structuraux ........................ 24

Table des matières

II.2.5.1.3. Etude des caractères physiologiques ................................................ 24

a. Mise en évidence des enzymes respiratoires ................................... 25

Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)…………..25

Test de peroxydase (Singleton, 1999;Gasser, 1989) ………………...25

b. Influence de la température (Singleton, 1999) ................................. 25

II.2.5.1.4. Etude des caractères biochimiques .................................................. 25

Galerie LEMINOR …………………………………………………..25

II.2.5.2.Etude phénotypique de la souche d’actinomycète ....................................... 26

II.2.5.2.1. Etude des caractères culturaux......................................................... 26

II.2.5.2.2.Etude des caractères morphologiques ............................................... 27

Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989) ……………………..27

II.2.5.2.3. Etude des caractères physiologiques ................................................ 27

II.2.5.2.4. Etude des caractères biochimiques ................................................... 27

II.2.6. Dosage des HAP résiduels ..................................................................................... 28

II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels ............................................................... 28

TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSIONS

III.1. TAUX DES HAP DANS L’ECHANTILLON DU SOL CONTAMINE .............. 29

III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES .............................................. 29

III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES .......................................... 30

III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES .................................. 31

II.4.1. Identification de la souche A1 ............................................................................... 31

III.4.2. Identification de la souche F2 .............................................................................. 33

III.5. RENDEMENT D’ELIMINATION DE CHAQUE HAP ...................................... 34

DISCUSSIONS……………………………………………………………………………… 37

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .......................................................... 42

ANNEXES

Glossaire

i

GLOSSAIRE

Acclimatation : Période pendant laquelle une population microbienne subit des

transformations phénotypiques et génétiques après avoir été mise en

présence de conditions nouvelles (par exemple, un apport d'éléments

nutritifs ou encore la mise en contact avec un composé xénobiotique, un

pesticide, un antibiotique, etc.…). Souvent cité sous le terme plus

général d'adaptation.

Adsorption : Phénomène de nature physique (forces de van der Wall) permettant

l'adhérence d'un composé sur des particules minérales (argiles).

Aérobie : Organisme utilisant l'oxygène pour son métabolisme.

Anaérobie : Organisme par qui l'oxygène n'est pas utilisé, ou pour qui il est létal.

Bioaccumulation : Incorporation et rétention d'un élément ou d'un composé toxique par un

organisme. Des bioaccumulations successives dans une chaîne

trophique (alimentaire) peuvent contribuer, dans les cellules du dernier

prédateur, dont l'homme, à des niveaux hautement toxiques.

Bioaugmentation : Souvent synonyme d'inoculation. Addition (dans un bioréacteur ou sur

un site pollué) de cultures bactériennes pour stimuler la biodégradation.

Bioconcentration : Augmentation cumulative de composés non biodégradables au cours de

leur transfert à travers les différents niveaux d'une chaîne trophique.

S'applique souvent aux métaux lourds, aux pesticides et aux composés

phosphorés.

Biodégradation : Décomposition partielle ou totale d'un produit par un agent biologique.

Le terme de biodégradation sous-entend l'élimination complète d'un

composé avec comme seuls rejets des produits simples tels que H2O,

CO2, CH4, H2, chlorure (pour un organochloré), ou encore de l'acétate,

des produits de fermentation. Elle est souvent mise en évidence par

l'emploi de molécules marquées par le 14C et la production de gaz

carbonique radioactif.

Glossaire

ii

Biotransformation: Transformation chimique d'un composé par un agent biologique. Cette

notion implique généralement un métabolisme incomplet du substrat et

non une véritable assimilation. Une oxydation, une hydrolyse, une

déhalogénation, un méthylation, etc…, sont des biotransformations

quand elles sont réalisées par un microorganisme.

Cométabolisme : Métabolisme bactérien par lequel le substrat peut être dégradé, mais qui

ne peut subvenir seul à la croissance cellulaire (car il ne constitue pour

le microorganisme ni une source de carbone, ni une ressource

énergétique).

Humus: Polymères complexes, souvent mal définis, mais de nature phénolique

et quinonique, provenant de la dégradation et de l'oxydation de la

lignine. Ils sont généralement récalcitrants à toute attaque biologique.

Minéralisation: Biodégradation dans laquelle l'étape ultime est la formation de CO2.

Cette notion implique généralement qu'une partie du composé a été

assimilée par l'organisme concerné (et pour lequel il a constitué un

"substrat").

Mycélium : appareil végétatif du champignon et d’Actinomycète constitué d'un

ensemble de filaments appelés hyphes

Ubiquitaire : se dit de substances, en particulier d'antigènes, présentes dans différents

milieux organiques.

Persistant : Un composé est qualifié de récalcitrant ou de persistant quand son

élimination par des voies biologiques est impossible (récalcitrant vrai),

ou très lente … ou encore qu'il n'a pas été possible de mesurer sa vitesse

de dégradation, tant elle est lente ! Ces termes s'appliquent le plus

souvent aux produits xénobiotiques, mais des composés naturels

peuvent aussi être récalcitrants (exemple, l'humine). La persistance d'un

composé est généralement estimée par le temps nécessaire pour que sa

concentration initiale diminue de 90%. Cette valeur est

approximativement égale à 3,5 fois la demi-vie.

Glossaire

iii

Xénobiotique: Traduit du grec : "étranger au monde vivant". Composé organique

résultant de l'activité humaine (non naturel, et absent des biotopes

naturels non pollués).

Abréviations

iv

ABREVIATIONS

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ARN: Acide RiboNucléique

AS1 : Antibiotic Selection One

CE : Cadre Européenne

CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse

CYD : Casamino acids Yeast extracts D-glucose

DAS : Daw Agro Sciences

EDS : Eau Distillé

EPA : Environmental Protection Agency

EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act

HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique

IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer

ISP2 : International Streptomyces Two

KOW : coefficients de partage octanol/eau

LCPE : Loi Canadienne sur la Protection de l'Environnement

LDC : Lysine DéCarboxylase

LDA : Lysine DésAminase

MO : Matière Organique

MEL: Marine Environment Laboratory

NPP : Nombre les Plus Probables

OMS : Organisation Mondial de la Santé

PBS : Phosphate Buffer Saline

SA : Sporulation Agar

Abréviations

v

TSA : Triptic Soy Agar

TDA : Tryptophane DésAminase

UFC : Unité Formant Colonie

UV : Ultraviolet

VF : Viande Foie

Liste des tableaux

vi

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier,

1994). …………………………………………………………………………..4

Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP .............................................................. 7

Tableau 3. Toxicité des HAP ............................................................................................... 9

Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001) ....... 14

Tableau 5. Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie

LEMINOR…………………………………………………………………….26

Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo .................................... 29

Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélèvement

sur milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L.... .................... 31

Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélèvement sur

milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L………………......31

Tableau 9. Caractéristiques culturales de la souche d’actinomycète A1 ............................ 32

Tableau 10. Caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche

A1……………… ............................................................................................. 32

Tableau 11. Caractère culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2 ....... 33

Tableau 12. Caractère biochimiques de la souche F2 .......................................................... 33

Tableau 13. Rendement d’élimination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durée

d’élimination ………………………………………………………………....34

Liste des figures

vii

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA ................................................................ 5

Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en

technosol.. ......................................................................................................... 10

Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrène (Pseudomonas sp. 47

p1,s7k5) d'après la base de données Biocatalysis/biodegradation .................... 13

Figure 4. Localisation de Tsimiroro ................................................................................ 15

Figure 5. Schéma de la description d’un ensemble chromatographique ......................... 19

Figure 6. Rendement d’élimination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de

durée d’incubation pour l’espèce Streptomyces sp. .......................................... 35


durée d’incubation pour l’espèce Bacillus simplex .......................................... 36

Liste des photos

viii

LISTE DES PHOTOS

Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B ................. 30

Photo 2. Variétés des souches d’actinomycètes isolées sur milieu AS1 ........................ 30

Introduction

INTRODUCTION

Introduction

1

INTRODUCTION

Avec l’accélération du développement économique, l’homme est de plus en plus

responsable de la pollution de l’environnement par ses activités industrielles, économiques et

sociales (comme l'industrialisation ainsi que d'autres exploitations), générant ainsi une

multitude de composés plus ou moins toxiques pour les organismes vivants.

Un des problèmes majeurs à Madagascar étant l’absence de cadre légal spécifique et

précis régissant la prise en charge ou la gestion des sites et sols pollués. Très peu de systèmes

de dépollution concrète ont été appliqués durant ces décennies d’activités industrielles

existantes, ce qui a laissé un héritage lourd en matière de pollution de l’environnement.

Actuellement, de nombreuses industries génératrices de boues huileuses (contaminées

par des hydrocarbures) sont également implantées au pays et cette situation nous laisse

prévoir encore à la détérioration progressive de la qualité environnementale suite à des

accumulations prévisibles des polluants toxiques tels que les « Hydrocarbures Aromatiques

Polycycliques » (HAP).

Les HAP sont parmi les polluants les plus dangereux pour les êtres vivants et pour

l’homme en particulier dans la mesure où ils ont des propriétés cancérigènes et/ou mutagènes.

Ce sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplète de matières organiques,

surtout générés dans l’exploitation des produits pétroliers. Ils ont tendance à s’adsorber dans

les sols et les sédiments à cause de leur caractère hydrophobe et leur persistance dans les

écosystèmes. Or, de nombreuses études ont montré que les sols constituaient le principal point

de fuite environnementale des HAP (LCPE, 1994) du fait de leur caractère rémanent et

toxique. Il serait donc nécessaire de surveiller et de limiter cette pollution.

C'est dans cette optique que ce travail de mémoire a été mené pour réduire les impacts

générés par l’omniprésence des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans les sols et sur

la reprise de la bio-fonctionnalité du sol pollué, la technique de bioremédiation est désormais

la technologie de traitement fortement conseillée pour remédier les eaux ou les sols

contaminés par ces types de polluants (Ballerini et Vandecasteele, 1999). Elle a l’avantage de

ne pas utiliser des agents dépolluants agressifs, contrairement aux autres techniques, qui sont

susceptibles d’engendrer encore plus d’effets dégradants sur le milieu à dépolluer. Le principe

est basé sur l’utilisation des microorganismes vivants pour assurer la dégradation des chaines

polluantes piégées dans les eaux/ sols à décontaminer.

Introduction

2

L’utilisation de ces bactéries pour la bioremédiation est aujourd’hui reconnue comme

une action complémentaire des voies chimiques et physiques pour la dégradation ultime des

polluants dans l’environnement et considérée comme un traitement efficace, économique et

écologique, est largement mise en œuvre (Tarayre, 2012 ; Mi Jin et al., 2013).

De ce fait, l’objectif principal de cette étude est de rechercher et de mettre au point un

procédé de bioremédiation des HAP dans les sols, en tenant compte des microorganismes

telluriques pouvant être optimisé. Nos approches consistent, à sélectionner et à identifier les

souches telluriques résistantes à une gamme croissante de concentration de mélange HAP

étudiés dans des milieux de culture spécifique puis à suivre les cinétiques de dégradation des

polluants par ces microorganismes en évaluant le taux d’hydrocarbures restants à chaque

expérience.

Ainsi, pour ce faire, ce mémoire a été divisé en trois parties, à savoir : la première

partie qui résumera les données bibliographiques, la deuxième partie qui décrira les matériels

et méthodes utilisés et la troisième partie qui exposera les résultats et discussions. La première

partie est précédée par une introduction générale et la dernière partie est terminée par la

conclusion ainsi que les perspectives.

Synthèse bibliographique

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE


3

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS Le sol est un milieu vivant (Kilbertus, 1980). Il figure parmi les habitats les plus

diversifiés et renferme certains des assemblages les plus variés d’organismes vivants comme

les bactéries, les actinomycètes, les champignons, les algues, les parties souterraines des

plantes, ainsi qu’une faune très variée allant des protozoaires aux mammifères essentiellement

les nématodes, les annélides et les arthropodes (Paul et Clark, 1989).

Les bactéries : sont les organismes les plus nombreux du sol, leur densité est de

l’ordre de 109 par gramme de sol. Il existe plus de 200 genres bactériens différents. Parmi les

plus représentés dans le sol, on peut citer (Alexander, 1977) : les Arthrobacter, Gram

variables à croissance lente, qui peuvent représenter 5 à 60% des colonies, les Pseudomonas,

Gram négatif mobiles, représentant 3 à 20% des UFC (unités formant colonie), le genre

Bacillus, bâtonnets sporulant Gram positif ou Gram variables, souvent mobiles, qui est

également bien représenté dans les sols: de 7 à 67%, les Clostridium, bactéries anaérobies

utilisées pour la production d'alcool et de solvants.

Les actinomycètes : ce sont des microorganismes hétérotrophes qui forment une

structure végétative de type mycélien, ils peuvent atteindre jusqu’à 107 unités par gramme de

sol. Dans le sol, les genres les plus fréquents sont les Streptomyces qui représentent jusqu'à

90% des genres identifiés, et les Nocardia.

Les champignons : bien que moins nombreux que les bactéries dans les

dénombrements sur boîte de Pétri, les organismes hétérotrophes eucaryotes que sont les

champignons sont les principaux responsables de la décomposition des résidus organiques

dans les sols.

Les algues et les protozoaires : la densité des algues est de l’ordre de 105 par gramme

de sol et ce sont toutes des espèces de Cholorophyceae, de Cyanophyceae et des Diatomées,

dont certaines sont fixatrices d’azote. Quant aux protozoaires, ce sont les moins nombreux

avec une densité de 103 par gramme de sol (Morel, 1996).

Le tableau 1 ci-dessous montre l’abondance des microorganismes dans les sols.


4

Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier, 1994).

L’ensemble de ces organismes font partie intégrante du système sol et participe par

leur activité à la formation et à l’évolution des sols.

I.1.1. Activités microbiennes dans les sols

L'activité des microorganismes du sol ne se manifeste que si les conditions

énergétiques et nutritionnelles sont satisfaites. Les nutriments doivent répondre à 3 besoins :

- fournir de l'énergie pour la croissance cellulaire ;

- fournir des matériaux pour la synthèse des constituants cellulaires ;

- être utilisables comme accepteurs des électrons libérés au cours de la

production d'énergie.

I.1.2. Interactions entre microorganismes

De façon générale, les microorganismes du sol influencent diverses composantes liées

à la qualité du sol comme la matière organique et la structure. Le sol ne peut dès lors plus se

concevoir comme une matrice homogène mais plutôt comme un assemblage hétérogène

d’entités physiques formées par l’activité microbienne à la surface des matières organiques en

décomposition et qui sont en interaction avec les particules minérales du sol.

La croissance des microorganismes a été le plus souvent étudiée et modélisée dans des

conditions de culture pure (Slater et al., 1979) alors que dans les sols, ils se développent en

présence d'autres organismes (microorganismes, animaux, racines) et dans un système poreux

où ils sont le plus souvent fixés sur des constituants minéraux, organiques et organo-

minéraux.

I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES–GENERALITES Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) constituent une classe

importante de polluants issus de l’activité industrielle. Ce sont des molécules ubiquistes,

ORGANISMES NOMBRE (UFC/g de sol sec)

Bactéries 108

Actinomycètes 105 à 106

Champignons 105

Algues 104 à 105

Protozoaires 104


5

persistantes et toxiques qui figurent sur la liste des polluants prioritaires de l’Agence

Américaine de la Protection de l'Environnement (EPA) (Keith et Telliard, 1976). Ces

polluants récalcitrants sont aussi répertoriés comme des composés néfastes pour l'homme et

l'environnement par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et la Communauté

Européenne (CE).

I.2.1. Définition – classification

Les HAP sont des composés aromatiques hétérocycliques constitués d’atome de

carbone et d’hydrogène. Ils sont constitués de cycles aromatiques accolés en nombre croissant

allant de deux (2) cycles (naphtalène) jusqu’à six (6) cycles (benzo(g,h,i)pérylène). Les

structures des 16 HAP retenus comme polluants prioritaires par l’American Environmental

Protection Agency (EPA) sont présentés dans la figure 1.

Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA

Ces HAP sont classés en deux groupes selon le nombre de cycle benzéniques qui les

compose et l’état de condensation de ces noyaux de type phénol :

• les HAP légers (2 à 3 cycles) de masse molaire comprise entre 150 et 180 g/mol ;

• les HAP lourds (4 cycles ou plus) de masse molaire supérieure à 200 et 280 g/mol.


6

I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP

Les propriétés physico-chimiques des HAP varient selon la masse moléculaire, le

nombre et l’assemblage des cycles qui composent la molécule. La transformation et la

mobilité des HAP dans l’environnement sont principalement contrôlées par leur faible

solubilité, leur hydrophobicité et leur pression de vapeur saturante.

I.2.2.1. Solubilité

La solubilité correspond à la concentration du produit en phase aqueuse à l’équilibre et

elle augmente avec la température. La plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans

l’eau (Edwards, 1983), leur solubilité étant inversement proportionnelle au nombre de cycles

de la molécule (taille et angularité) (Haesseler, 1998) (tableau 2).

Leur solubilité en milieu aqueux est notable pour le naphtalène (30 mg/L) mais décroît

ensuite très rapidement avec le nombre de cycles aromatiques (160 μg/L pour le pyrène, 4

μg/L pour le benzo(a)pyrène).

I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau

Le coefficient de partage octanol/eau (log KOW) traduit la répartition d’une molécule

de soluté entre la phase lipophile (octanol) et la phase hydrophile (eau). Il évalue

l’hydrophobicité d’une molécule et son potentiel lipophile. Il permet de connaître la capacité

de la molécule organique (Fu et al., 1994) à s’accumuler dans les êtres vivants au niveau des

tissus adipeux et des membranes phospholipidiques. Par sa détermination, il est possible

d’estimer l’adsorption du composé au niveau des régions hydrophobes du sol (matière

organique, cires, lipides, matières particulaires) (Weissenfels et al., 1992 ; Marschner, 1999)

qui se fait via des liaisons hydrophobes plus ou moins stables, lui permettant de persister dans

l’environnement (Bouwer et Zehnder, 1993 ; Hartmann, 1996 ; Van Brummelen et al., 1996).

Les log KOW des HAP sont relativement élevés, variant de 3,37 à 6,5 (Makay et al.,

1992), selon le nombre de noyaux aromatiques du composé (tableau 2), et indiquent ainsi la

nécessité d’utiliser des solvants organiques ou des tensioactifs pour leur extraction.

I.2.2.3. Pression de vapeur

La pression ou tension de vapeur permet de connaître la capacité d’un produit à passer

d’une phase gazeuse à une phase aqueuse. A partir de 105 kPa, les composés sont considérés

comme volatils. Les tensions de vapeur des HAP de deux (2) à trois (3) cycles indiquent que


7

ces molécules sont volatiles, enrichissant ainsi relativement le milieu en HAP de fort poids

moléculaire (tableau 2).

Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP

Composés Formule

semi-développée a

Nombre de cycle

a

Formule brute a

Masse molaire

a (g/mol)

Solubilité dans l’eau

a 25 °C Sw (mg/L)

Coefficient de partage octanol/eau

a log KOW

Pression de vapeur saturante

a (Pa)

Temps de demi-vie b (j : jours, a : ans)

Naphtalène

2 C8H10 128,2 31 3,4 36,8 16 j – 48 j

Acénaphtylène

3 C12H8 152,2 16,1 4,0 4,14 Non étudié

Acénaphtène

3 C12H10 154,2 3,8 3,9 1,52 Non étudié

Fluorène 3 C13H10 166,2 1,9 4,2 0,715 32 j – 60 j

Phénanthrène

3 C14H10 178,2 1,1 4,6 0,113 16 j – 200 j

Anthracène 3 C14H10 178,2 0,05 4,5 0,0778 50 j – 1,3 a

Fluoranthène

4 C16H10 202,3 0,26 5,2 8,72.10-3 140 j – 1,2 a

Pyrène

4 C16H10 202,3 0,13 5,2 0,0119 210 j – 5,2 a

Benzo(a)anthracène

4 C18H12 228,3 0,01 5,9 6,06.10-4 102 j – 1,9 a

Chrysène

4 C18H12 228,3 0,002 5,6 8,4.10-7 1 a – 2,7 a

Benzo(b)fluoranthène

5 C20H12 252,3 0,002 5,8 6,7.10-5 Non étudié

Benzo(k)fluoranthène

5 C20H12 252,3 0,001 6,0 4,12.10-6 2,5 a – 2,9 a

Benzo(a)pyrène

5 C20H12 252,3 0,004 6,0 2,13.10-5 Non étudié

Dibenzo(a,h)anthracène

5 C22H14 278,4 0,0006 6,8 9,16.10-8 361 j – 2,6 a

Indénol(1,2,3,c,d)pyrène

6 C22H12 276,3 0,062 6,6 1,3.10-8 1,6 a – 2 a

Dibenzo(g,h,i)pérylène

6 C21H16 268,4 0,0003 6,5 2,25.10-5 0,25 a – 1,8 a

a : Makaya et al., 1992 ;b : IARC, 1997, 2000.


8

I.2.3. Origine des HAP

Les HAP ont pour origine différents processus : la combustion incomplète de la

matière organique, la diagenèse, la biogenèse. Les sources naturelles d’émission de HAP dans

l’environnement sont les feux de forêt, les éruptions volcaniques, mais aussi les réactions

biogènes générées par les plantes et les microorganismes (formation de l’humus et

minéralisation de la matière organique) (Henner et al., 1997 ; Juhasz et Naïdu, 2000 ; Wilcke,

2000), ainsi que les réactions géologiques associées à la formation du fuel fossile (Wilson et

Jones, 1993).

La plus importante source de HAP d’origine anthropique est l’activité industrielle par

la combustion incomplète des combustibles fossiles (Wilds et Jones, 1995 ; Vierle et al., 1999

; Samantha et al., 2002). Les mécanismes mis en jeu lors de leur formation font intervenir la

production de radicaux libres par pyrolyse à haute température (≥500°C) de la matière fossile

(pétrole, fuel, matières organiques…) dans des conditions déficientes en oxygène.

L’émission de HAP se produit notamment lors de l’extraction et du raffinage du

pétrole (Hill et Goshal, 2002), de l’aluminerie, de la sidérurgie, de la cokéfaction (Menzie et

al., 1992 ; Arzayus et al., 2001; Hill et Goshal, 2002) et lors du stockage d’hydrocarbures de

goudron et de bitume (Colline, 2000).

I.2.4. Toxicité des HAP

Les HAP possèdent un fort pouvoir d’adsorption sur les particules élémentaires en

suspension dans l’air (mais aussi dans l’eau) ainsi qu’un fort potentiel de bioconcentration

dans les organismes. En revanche, en raison de leurs structures, les HAP sont très

hydrophobes (à l’exception du naphtalène). La toxicité des HAP varie fortement d’un

composé à l’autre. Ainsi plusieurs HAP ont des effets mutagènes et cancérogènes. Dans

l’organisme, les HAP deviennent toxiques après oxydation enzymatique, laquelle conduit à la

formation des métabolites électrophiles solubles. Les métabolites, à leur tour, forment des

adduits sur les acides nucléiques ARN, ADN et sur les protéines et provoquent une

perturbation sur le mécanisme de division cellulaire et à la formation de tumeurs (Szeliga et

al. 1998).

Le tableau 3 suivant présente les principales données de toxicité des HAP suivant la

classification utilisée par le CIRC pour l’évaluation des risques de cancérogénicité sur

l’homme:


9

• Groupe 1 : L’agent est cancérogène pour l’homme ;

• Groupe 2A : L’agent est probablement cancérogène pour l’homme ;

• Groupe 2B : L’agent est peut être cancérogène pour l’homme ;

• Groupe 3 : L’agent est inclassable quant à sa cancérogénicité pour l’homme ;

• Groupe 4 : L’agent n’est probablement cancérogène pour l’homme.

Tableau 3. Toxicité des HAP

IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer

EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act

Nom Toxicité Cancérogénicité Mutagénèse Rapporté dans

Benzo(a)pyrène Toxique pour

l’homme 1 Constatée (Cavalieri et

al.,1988 ; CIRC, Health Canada)

Benzo(a)anthracène Toxique pour

l’environnement 2B Constatée EPA-TSCA, CIRC, Health

Canada

Benzo(b)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Constatée

Amin et al.,1984; Emura et al.,

1980 ; Hermann, 1981 ; CIRC,

Health Canada Benzo(g,h,i)pérylène 3 Constatée CIRC

Benzo(k)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Constatée

EPA-TSCA, CIRC, Health

Canada

Benzo(j)fluoranthène Toxique pour l’homme 2B Health Canada

Fluoranthène Toxique pour l’environnement 3 Constatée


Canada

Indéno(1,2,3,c,d)pyrène Toxique pour l’homme 2B Constatée


Canada

Pyrène Toxique pour l’environnement 3 Constatée


Canada

Anthracène Toxique pour l’environnement 3 Constatée


Canada

Phénanthrène Toxique pour l’environnement 3 Constatée


Canada

Dibenzo(a,h)anthracène Toxique 2A Constatée EPA-TSCA, CIRC

Chrysène 2B Constatée (JOCE, 2004), CIRC


10

I.2.5. Distribution des HAP

Par leur nature hydrophobe, les HAP contenus dans les milieux aquatiques sont

principalement liés aux particules organiques et minérales en suspension dans l’eau (Herbes,

1977). Bien que la majorité des HAP soit émise dans l’atmosphère (Wild et Jones, 1995), le

sol et les sédiments constituent le principal point de fuite environnemental de ces polluants

(Wilcke, 2000). Wild et Jones (1995) estiment que 90% des HAP émis dans l’environnement

sont stockés dans les sols, sans comptabiliser ceux des sites industriels. En effet, la

contamination des sols à proximité des sites industriels est importante.

I.2.6. HAP dans les sols

Le sol est un système hétérogène et complexe à l’interface entre la géosphère,

l’atmosphère et la biosphère. Les HAP dans les sols peuvent interagir avec les constituants

minéraux, organiques, les organismes vivants, la phase gazeuse et la phase liquide. De par ses

caractéristiques physico-chimiques et biologiques, le sol est structuré en horizon.

Lors de l’installation de sites industriels et du remaniement des terres, les procédés

pédologiques intègrent les matières anthropiques et créent de nouvelles associations organo-

minérales (Monserie et al., 2009). Ces technosols ne font plus apparaître de structure en

horizons des sols (figure 2).

Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en

technosol

I.3. BIODEGRADATION DES HAP Actuellement, les techniques de traitement des sols pollués sont classées en quatre

grandes catégories : les procédés physico-chimiques, les procédés thermiques, les procédés

biologiques (ou bioremédiation), le confinement (Ballerini et al., 1998). Mais lors de cette


11

étude, nous avons choisi les procédés biologiques pour la dégradation des HAP en prenant en

compte les raisons suivantes :

• intérêt environnemental : réduire les impacts environnementaux ;

• intérêt économique : coûts de traitement réduits ;

• intérêts techniques : traitement d’une gamme diversifiée de polluants (organiques,

minéraux), possibilité de préparer des microorganismes spécialisés, capacité des

microorganismes à vivre dans des conditions extrêmes (pH, oxygénation,

concentrations élevées de polluant, etc.), nombreux microorganismes identifiés et

caractérisés ;

• tests en laboratoire concluants.

En réalité, la dégradation naturelle des matières organiques polluantes est généralement

un processus lent et dépend certainement de la nature, de la toxicité, du taux de

nutriments disponibles dans le milieu ainsi que de la concentration des polluants piégés dans

le sol. Tout cela constitue un facteur ralentissant, voire même inhibant, pour l’activité

dégradante qui devrait y avoir lieu et être assurée par des microorganismes vivants dans le

sol. La bioremédiation, qui est une méthode basée sur l’activité de la capacité naturelle

que possèdent de nombreux organismes, sont généralement soit des bactéries, des micros

algues ou des champignons dégradant les polluants en composés inertes, comme l’eau et

le gaz carbonique. Ces organismes peuvent être déjà présents dans la zone polluée

(indigènes) ou ajoutés au milieu (exogène), ou encore prélevés sur le site contaminé,

cultivées au laboratoire puis réintroduits dans le sol. Elle se déroule généralement en

condition d’aérobie ; toutefois, l’application des systèmes de bioremédiation en condition

d’anaérobie permet de dégrader un certain nombre de molécules récalcitrantes (Chedly, 2006).

I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP Divers microorganismes sont capables de dégrader les hydrocarbures comme les

bactéries et les champignons mais la culture de bactéries étant plus rapide, ajouté au fait que

les bactéries assimilent mieux certaines molécules donc, l’usage de ces derniers est préféré.

Dans cette optique, cette synthèse traitera donc des bactéries dégradant les hydrocarbures.

Dans plusieurs expériences, les souches favorables à la bioremédiation sont celles isolées du

sol contaminé en question ou isolées à partir des points des rejets industriels à traiter (Dong et

al., 2008 ; Cordova-Rosa et al., 2009). Ces microorganismes appartiennent à des genres


12

variés, les Pseudomonas ayant été particulièrement étudiées, isolées sur naphtalène (Grund

and Gunsalus, 1983; Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Yang et al., 1994).

Mahmoud et Rama Rao ,1993 ont quant à eux étudié l'abondance microbienne et la

dégradation d’HAP (anthracène, phénanthrène, chrysène, pyrène, fluoranthène) dans des sols

pollués. Ils ont observé une attaque préférentielle de l'anthracène et du phénanthrène (le plus

rapidement dégradé). Les bactéries dominantes appartenaient aux genres Pseudomonas,

Agrobacterium et Bacillus subtilis.

Kastner et al., 1994 ont étudié l'existence de bactéries dégradant des HAP sur

différents sols pollués en utilisant la méthode développée par Kiyohara et al., 1982. Ils ont

mis en évidence des populations bactériennes capables de croître sur l'anthracène, le

phénanthrène, le fluoranthène ou le pyrène de 103 à l05 UFC/g de sol sec dans les sols pollués

par des HAP, mais n'ont pas trouvé d'isolat capable de croître sur le pérylène, le triphénylène,

le benzo(a)pyrène ou le chrysène. Les actinomycètes nocardioformes (Rhodococcus,

Nocardia, Mycobacterium) représentaient la majeure partie de la microflore du sol capable de

minéraliser complètement des HAP.

Les espèces bactériennes capables de dégrader les HAP sont montrées en Annexe 4.

I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP Il y a plusieurs types de voies pour biodégrader les HAP :

• Par voie abiotique : qui se fait par la volatilisation en phase gazeuse des polluants à

l’interface eau-air dans les sols, avec dégazage vers l’atmosphère et la transformation

où la dégradation des HAP par voie chimique se fait soit par oxydation chimique, soit

par photo-oxydation sous l’action des rayonnements ultraviolets (UV), de l’ozone, du

peroxyde d’hydrogène, du dioxygène ou de radicaux –OH (Heitzer et Sayler , 1993 ;

Letho et al., 2003) ;

• Par voie biotique : ce mécanisme convertit une substance métabolisable en un

composé plus simple qui peut être moins ou plutôt toxique que le composé d’origine

(biotransformation) et aboutît à un produit final qui est le dioxyde de carbone

(minéralisation). Lors de cette dégradation, le composé peut servir ou non d’unique

source de carbone aux microorganismes (Grady, 1985 ; Lappin et al., 1985) ;

• Par voie bactérienne : le métabolisme bactérien est le processus majeur de

dégradation des HAP dans les sols (Cerniglia, 1997). Cette dégradation peut être plus


13

ou moins partielle et met en jeu de nombreuses genres bactériens Gram positif et

Gram négatif : Pseudomonas, Acinobacter, Bacillus, Sphingomonas, Burkholderia, et

mycobactérium (Johnsen et al., 2005). L’étude de la biodégradation des HAP par des

souches bactériennes isolées à partir de sols contaminés a permis d’établir des voies

métaboliques de dégradation, d’analyser l’organisation et la régulation des gènes qui

code les enzymes impliquées dans la dégradation (Saito et al., 2000) ;

Les voies de dégradation, comme le naphtalène et le phénanthrène, ont été largement

étudiées depuis de nombreuses années (Treccani et al,. 1954; Davis et Evans, 1964; Evans et

al,. 1965). A partir du phénanthrène et de la dihydroxylation du cycle aromatique par une

enzyme dioxygènase, il existe à l'intérieur de la bactérie une succession de réactions

cataboliques chacune synthétisée par une enzyme spécifique, lesquelles produisent de

nombreux métabolites dont le 1-hydroxy-2-naphtoate et le phtalate (Kiyohara et Nagao, 1978;

Seo et al,. 2006). La dégradation des composés aromatiques fournit des intermédiaires du

cycle de Krebs (pyruvate, succinate, etc.) et produit de l'énergie pour la bactérie (figure 3). Au

fur et à mesure des réactions, le nombre de carbone du polluant diminue, le déchet ultime est

le dioxyde de carbone lequel est rejeté à l'extérieur de la bactérie.

Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrène (Pseudomonas sp. 47

p1,s7k5) d'après la base de données Biocatalysis/biodegradation


14

I.6. FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP Plusieurs facteurs vont influencer la dégradation des polluants par les

microorganismes. Les conditions environnementales doivent être optimales pour obtenir une

croissance et une activité microbienne garantissant l’efficacité du procédé de bioremédiation.

Les nutriments doivent être présents en quantité suffisante : les valeurs optimales du rapport C

: N : P doivent être égales à 100 :5 :1 et la présence d’oligo-éléments est requise pour assurer

leur croissance.

L’efficacité du traitement par bioremédiation peut être ainsi limitée par la perméabilité

des sols, la teneur en silt et argile ne devant pas dépasser un certain seuil. Les sols à traiter ne

peuvent contenir de substances toxiques susceptibles d’empêcher le développement bactérien.

Le tableau 4 qui suit montre les conditions environnementales la biodégradation des

polluants par les microorganismes.

Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001)

Matériels et méthodes

MATERIELS ET METHODES


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II.1. MATERIELS

II.1.1.Site et échantillonnage de sol

L’échantillon de sol utilisé pour cette étude a été collecté dans un site industriel d’un

grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro situé au Nord-Ouest de Madagascar et

approximativement à 100 km Ouest de la côte de Madagascar, dans le bassin sédimentaire de

Morondava, au sud de Bemolanga et de Morafenobe (figure 4).

Source : Madagascar Oil, Etude d’Impact Environnemental de Tsimiroro, BD 500 FTM

Figure 4. Localisation de Tsimiroro

L’échantillon est prélevé à une profondeur située entre 10cm et 20cm. Cette zone

correspond à la zone d’hyperactivité biologique au niveau du sol. Environ 1 kg de sol sont

prélevés avec une spatule stérile et conditionnés dans des sachets de prélèvement. Les

échantillons sont conservés à la température ambiante jusqu’au laboratoire.

II.1.2. Milieu de culture

II.1.2.1. Milieu d’isolement et d’identification

II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar)

Le milieu solide est habituellement employé pour la culture et dénombrement de la

flore totale cultivable.


16

II.1.2.1.2. Milieu King B

Le milieu King B est un milieu contenant comme source de carbone la polypeptone.

Ce milieu est habituellement utilisé pour isoler et conserver les souches de Pseudomonas

fluorescents à partir de l’échantillon de sol.

II.1.2.1.3. Milieu AS1

Le milieu AS1 est un milieu solide utilisé pour l’isolement et la conservation des

souches d’actinomycètes.

Ce milieu est additionné de 3 antibiotiques pour l’isolement des actinomycètes :

• la triméthoprime (inhibiteur des champignons) ;

• le cycloheximide (inhibiteur des bactéries) ;

• l’acide nalidixique (inhibiteur des bactéries Gram négatif).

II.1.2.2. Milieux d’identification de la souche de Bacillus

Ce sont des milieux qui permettent de mettre en évidence les caractères biochimiques

des bactéries. Pour cela, le portoir de LEMINOR constitué par les milieux suivants a été

utilisé.

II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate

Il s’agit d’un milieu semi - mou permettant de mettre en évidence l’utilisation du

mannitol, la réduction du nitrate par les bactéries et leur mobilité à partir de la ligne

d’ensemencement.

II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose – Glucose – H2S)

C’est un milieu solide utilisé pour la mise en évidence de la fermentation du glucose

et du lactose, de la production de sulfure d’hydrogène (H2S), de la production de gaz et de la

recherche de ß– galactosidase.

II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate)

C’est un milieu solide également, contenant comme source de carbone le citrate. Ce

milieu permet de rechercher l’utilisation du citrate par les bactéries.

II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer

C’est un milieu solide qui permet de mettre en évidence simultanément la lysine

décarboxylase (LDC), la lysine désaminase (LDA), l’utilisation du glucose et la formation

d’ H2S.


17

II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole

Le milieu urée indole est un milieu liquide permettant de rechercher l’uréase, le

tryptophane désaminase (TDA) et la production d’indole par les bactéries.

D’autres milieux sont aussi utilisés pour identifier les microorganismes des

saucissons, outre ceux cités dans le portoir de LEMINOR.

II.1.2.2.6. Milieu à l’eau peptonée au rouge de phénol

C’est un milieu liquide contenant comme milieu de base l’eau peptonée additionnée

d’un indicateur coloré qui est le rouge de phénol. Il permet d’étudier l’utilisation par les

bactéries de certains composés glucidiques ajoutés stérilement dans le milieu.

II.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification

II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3)

C’est un milieu solide contenant de la solution d’avoine. Il est utilisé pour la

préparation des inoculums et pour la pré-identification des souches d’actinomycètes.

II.1.2.4. Milieu d’identification macroscopique


C’est un milieu de culture solide contenant comme source de carbone le glucose. Ce

milieu est habituellement utilisé pour l’identification macroscopique des souches

d’actinomycètes.


C’est un milieu solide contenant de l’amidon soluble. Il est employé pour identifier

macroscopiquement les souches d’actinomycètes.


C’est un milieu solide contenant du glycérol. Il est aussi utilisé lors de l’identification

macroscopique des souches d’actinomycètes.

II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des

pigments diffusibles


C’est un milieu solide à base de peptone utilisé pour déterminer la présence de

pigments dans les souches d’Actinomycètes.


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C’est un milieu solide contenant comme source de carbone le glycérol. Il est aussi

utilisé pour déterminer la présence de pigments dans les souches d’actinomycètes.

II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques

Recherche de nitrate réductase

II.1.2.6.1. Bouillon nutritif

C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour revivifier

les souches de microorganismes et pour rechercher la présence d’enzyme nitrate réductase.

II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques

Détermination de la température optimale de croissance

II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA)

C’est un milieu solide contenant de l’extrait de levure et de l’extrait de viande, il est

utilisé pour déterminer la température de croissance optimale des souches d’actinomycètes.

Détermination du pH optimum

II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose)

C’est un milieu solide mis au point par Crawford en 1993 pour déterminer le pH

optimum de croissance des souches d’actinomycètes.

II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire

II.1.2.8.1. Viande Foie (VF)

C’est un milieu de culture riche contenant un gradient de pression partielle en

dioxygène, il est utilisé pour l’étude du type respiratoire d'une bactérie.

II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité

II.1.2.9.1. Mannitol–mobilité

C’est un milieu semi-solide permettant de mettre en évidence la réduction du nitrate

par les bactéries et leur mobilité à partir de la ligne d’ensemencement.

II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive

La gélose nutritive est habituellement employée pour la culture et le dénombrement

des microorganismes ; il permet de détecter la pureté des souches ainsi que d’assurer leur

conservation.


19

II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif

C’est un milieu nutritif liquide dépourvu d’agar. Ce milieu est utilisé pour le test

l’acclimatation des souches isolées. La composition de chaque milieu est présentée en annexe

1.

II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG)

La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation de composés

susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition).

La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption. Elle

permet :

• la microanalyse (de µg au mg) ;

• la séparation de mélanges complexes ;

• l’analyse qualitative et quantitative aisée ;

• des analyses dans de nombreux domaines d’application

La figure 5 montre le schéma de la description d’un ensemble chromatographique,

l’appareil CPG comprend schématiquement trois (3) modules spécifiques : un injecteur (1),

une colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four) (2) et un détecteur (3) relié à un

intégrateur ou un ordinateur (4) sur lequel apparaît le chromatogramme.

Figure 5. Schéma de la description d’un ensemble chromatographique

1

2

3

4


20

II.2. METHODES

II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP)

Le taux des HAP dans le sol contaminé de Tsimiroro a été évalué par la méthode

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) élaboré par Marine Environment Laboratory

(MEL) International Atomic Energy Agency en 2007 ; les étapes de l’analyse des HAP dans

le sol contaminé a été comme suit : l’échantillon du sol de Tsimiroro a été mélangé avec du

sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) et avec de l’étalon interne ensuite conçu à l’extraction

par Soxhlet continu liquide - solide en utilisant l’hexane et le dichlorométhane comme solvant

puis la solution ainsi obtenu a été purifié par colonne avec du gel de silice et de l’alumine et

enfin la solution concentrée de HAP a été injecté dans le CPG pour pouvoir quantifier les

HAP présents dans le sol.

Le protocole détaillé lors du dosage des HAP par CPG est présenté en annexe 3.

La concentration des HAP présents dans le sol de Tsimiroro a été calculée par la

formule suivante :

𝐶𝐶𝑚𝑚,𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ =𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸

, × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 × 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸

, × 𝑀𝑀𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ×

100𝑀𝑀𝑆𝑆

𝐶𝐶m,Ech R: Concentration massique de l’échantillon 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸 : Masse de l’étalon ; 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸

, : Surface de l’étalon interne de l’échantillon 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ : Surface de l’échantillon ; 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 : Surface de l’échantillon aromatique 𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸 : Surface de l’échantillon interne ; 𝑚𝑚𝐸𝐸𝐸𝐸

, : Masse de l’étalon interne dans l’échantillon 𝑀𝑀𝐸𝐸𝐸𝐸ℎ : Masse brute de l’échantillon 𝑀𝑀𝑆𝑆 : Masse sèche.

II.2.2. Isolement des souches microbiennes

II.2.2.1. But

Le but de cette étape est d’isoler et d’avoir le maximum de souches microbiennes

contenues dans l’échantillon de sol.

II.2.2.2. Principe

Cette méthode consiste à isoler les souches microbiennes à partir de l’échantillon de

sol contaminé en utilisant des milieux spécifiques additionnés d’antibiotiques.


21

II.2.2.3. Mode opératoire

II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents

Les Pseudomonas fluorescents sont isolés et dénombrés selon la technique décrite par

King et al., (1954). Cette technique est basée sur l’observation sous lumière ultraviolette à

254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure partie des

sidéphores produites par ces bactéries.

Pour cela, 1 g de chaque échantillon de sol est donc pesé puis, des dilutions en cascade

(avec 9 ml de PBS) sont réalisées. L’ensemencement est effectué en surface. Les boîtes

ensemencées sont incubées à 30°C pour une durée d’incubation de 24 à 48 heures. Toutes les

colonies fluorescentes sont dénombrées et prélevées à l’aide de « cure-dents » préalablement

stérilisées puis repiquées dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant du milieu King B.

II.2.2.3.2. Isolement des souches d’actinomycètes

Les actinomycètes sont des microorganismes faciles à cultiver. Par ailleurs, leur

croissance lente et leur faible nombre dans les échantillons de sol sont souvent masqués par

les bactéries et les champignons à croissance rapide lors de l’isolement. Par conséquent,

l’utilisation d’un milieu spécifique (AS1) additionné d’antibiotiques combiné à des

traitements des échantillons de sol facilite l’isolement de ces groupes de microorganismes. Un

prétraitement des échantillons de sol est entrepris avant l’isolement.

a. Prétraitement des échantillons de sol

Une semaine avant leur utilisation, les échantillons de sol sont distribués dans des

boîtes de Pétri stériles et laissés dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui

absorbe l’humidité. Cette étape préliminaire permet de sélectionner les actinomycètes dans

l’échantillon de sol.

b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu

Un (1) gramme de sol est dilué dans 9 ml d’EDS puis agité au vortex deux fois

pendant 5 min ; cette suspension constitue la dilution 10-1.

Une série de dilutions décimales (jusqu’à 10-3) est effectuée pour chaque échantillon.

Le milieu est ensemencé en surface à raison de 0,1 ml par dilution par boîte de Pétri. Les

boîtes de Pétri sont incubées à 30°C et observées quotidiennement pendant une durée de 4

semaines.


22

Les colonies d’actinomycètes sont repérées par leur aspect macroscopique

caractéristique (colonies dures incrustées dans la gélose). La pureté des souches

d’actinomycètes est vérifiée par repiquages successifs sur de nouveaux milieux AS1 sans

antibiotiques.

II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable

La flore totale est constituée, en grande partie, par des bactéries qui peuvent se

développer sur le milieu TSA (Triptic Soy Agar).

A l’aide d’une pipette stérile, 0,1 ml de chaque dilution décimale 10-1 à 10-4 sont

ensemencés sur milieu TSA. La culture est incubée à l’obscurité à 28°C. La lecture est faite

après 24 heures, 48 heures et 72 heures d’incubation et toutes les colonies formées sont

repiquées dans des boîtes de Pétri contenant du milieu TSA pour la purification.

II.2.3. Conservation des souches

Une colonie de chaque isolat est cultivée sur milieu King B liquide pour les

Pseudomonas, sur milieu TSA pour la flore totale cultivable et sur un milieu AS1 liquide pour

les Actinomycètes. Ces cultures en milieu liquide sont ensuite incubées à 30°C dans un bain

marie avec agitation pendant 24 heures pour les Pseudomonas et la flore totale cultivable et

pendant 4 à 7 jours pour les actinomycètes.

Un millilitre (1 ml) de chaque culture est prélevé par la suite à l’aide d’une

micropipette stérile et introduit dans un cryotube stérile contenant 1 ml de glycérol à 20%

(V/V) stérilisée à l’autoclave à la température 121°C pendant 20 min et à une pression de 1,5

bar (Isik et al., 1999). Les cryotubes contenant la culture ont été conservés dans le congélateur

à -80°C.

II.2.4. Test de résistance des souches isolées

II.2.4.1. But

Le but de cette partie étant de sélectionner des souches jugées comme étant résistantes

et efficientes après leur soumission volontaire dans une condition extrême de stress (milieux

de croissance dopés par des polluants).

II.2.4.2. Principe

Une quantité connue de population microbienne a été inoculée dans un milieu de

culture synthétique préalablement pollué par une quantité connue de mélange de HAP. Le

comportement des microorganismes à se développer dans de tel milieu est mis en évidence


23

ainsi que leur intérêt à utiliser les carbones des polluants comme source d’énergie et de

carbone pour leur métabolisme.

II.2.4.3. Mode opératoire

II.2.4.3.1. Préparation d’une solution mère de HAP

Des mélanges de 100 mg de chaque HAP (Naphtalène, Acénaphtène, Fluorène,

Phénanthrène, Anthracène, Fluoranthène, Pyrène, Benzo(a) anthracène) sont dissous dans 25

ml de solvant acétone. La concentration en Σ8HAP correspondante est ensuite calculée, c’est-

à-dire : 800 mg dans 25 ml soit 32000 mg/L (ou 32000 ppm).

La concentration correspondante à chacun des HAP est donnée en annexe 2.

II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes

Différentes concentrations de solution de HAP (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ;

1500 mg/L) sont préparées à partir de la solution mère. Pour chaque concentration, un volume

de solution de HAP est versé dans des tubes préalablement stériles puis laissés pendant 12

heures sous hotte. Ceci permet l’évaporation complète du solvant utilisé. Dix millilitres (10

ml) de bouillon nutritif sont ensuite ajoutés et le mélange est vortexé pendant quelques

secondes. Une suspension microbienne de 100 µl (qui correspond à 109 UFC/ml) est

additionnée et le mélange est incubé à 30°C sur un agitateur orbital à une vitesse de 150

rpm/s.

II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries

La croissance microbienne a été suivie pendant 10 à 65 jours selon la méthode de

Nombre les Plus Probables (NPP) (Rattanasomboon et al., 1999). A des intervalles de temps

qui dépendent de la croissance des souches, 1 ml de chaque culture ou de chaque dilution

décimale est ensemencé en profondeur sur milieu TSA avec trois répétitions. La culture est

incubée dans une étuve à 28°C pendant 24 à 48 heures et toutes les colonies formées sont

dénombrées.

II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement

Le dénombrement consiste à compter les colonies présentes sur les boites en Unité

Formant Colonie (UFC). Le comptage se fait macroscopiquement. En tenant compte des

caractéristiques des colonies sur son milieu approprié, seules les boites ayant 30 à 300 UFC

sont retenues.


24

Le nombre d’Unité Formant Colonie est déterminé selon la formule :

𝑵𝑵 =𝑪𝑪𝟏𝟏 + 𝑪𝑪𝟐𝟐

𝑽𝑽(𝒏𝒏𝟏𝟏 + 𝟎𝟎,𝟏𝟏𝒏𝒏𝟐𝟐)𝒅𝒅

𝐶𝐶1 + 𝐶𝐶2 : Somme de toutes les colonies apparues sur les deux boites retenues ;

𝑉𝑉 : Volume de l’inoculum appliqué à chaque boite ;

𝑑𝑑 : Taux de dilution correspondant à la première dilution retenue ;

𝑛𝑛1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution ;

𝑛𝑛2 : Nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution.

II.2.5. Identification des souches sélectionnées

II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable

L’identification des souches actives est effectuée avec une culture pure. Elle comporte

un certain nombre d’étapes suivant un ordre déterminé. C’est ainsi que l’identification des

bactéries comprend généralement :

• l’étude des caractères culturaux ;

• l’étude des caractères morphologiques et structuraux ;

• l’étude des caractères physiologiques ;

• l’étude des caractères biochimiques.

II.2.5.1.1. Etude des caractères culturaux

L’étude des caractères culturaux permet d’observer macroscopiquement l’aspect des

colonies (forme, taille, couleur, …) cultivées sur milieu solide TSA et l’aspect de la culture

cultivée sur milieu liquide (bouillon nutritif).

II.2.5.1.2. Etude des caractères morphologiques et structuraux

Cette étude permet en général de différencier la morphologie, la mobilité, le mode de

groupement et éventuellement la mode de reproduction végétative de la souche bactérienne.

La mise en évidence de ces caractères est réalisée grâce à une étude microscopique des

bactéries qui comprend un examen à l’état frais (Marchal, 1985) et un examen après fixation

et coloration de frottis (Marchal, 1985 ; Singleton, 1999).

II.2.5.1.3. Etude des caractères physiologiques

Cette étude permet de déterminer le comportement des bactéries vis-à-vis de certains

facteurs du milieu (température, enzymes respiratoires,…).


25

a. Mise en évidence des enzymes respiratoires

Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)

Certaines bactéries peuvent dégrader le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène

moléculaire par production d’un enzyme appelé catalase selon la réaction :

2H2O2 2H2O + O2

Peroxyde d’hydrogène Eau oxygène

moléculaire

Pour le mettre en évidence, la souche est mise en contact avec une solution fraîche de

peroxyde d’hydrogène à 10 volumes. Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse

ou de bulles traduit la décomposition de peroxyde d’hydrogène sous l’action de la catalase.

Test de peroxydase (Singleton, 1999; Gasser, 1989)

Ce test consiste à déterminer la présence ou non d’un type de cytochrome dans la

chaîne respiratoire d’une bactérie. Pour cela, 1 ml de mélange à partie égale d’une solution de

benzidine à 1% dans l’acide acétique N et de l’eau oxygénée à 1% est ajouté dans une culture

bactérienne sur bouillon nutritif de 24 heures. Une coloration bleu-noir survenant

immédiatement traduit la présence de peroxydase dans le système enzymatique du germe.

b. Influence de la température (Singleton, 1999)

Les microorganismes selon les espèces peuvent se développer dans un large intervalle

de température. L’étude consiste à incuber la souche à étudier à différentes températures, les

autres paramètres étant maintenus constants. Les températures d’incubation sont : 4°C – 8 °C

– 15 °C – 30 °C 37 °C et 45 °C. La croissance bactérienne appréciée par la turbidité du milieu

est observée tous les jours.

II.2.5.1.4. Etude des caractères biochimiques

Cette étude permet de distinguer différents genre ou espèces bactériens en se basant

sur la différence de métabolisme.

Galerie LEMINOR

La galerie LEMINOR permet de :

• déterminer l’équipement enzymatique du genre ;

• étudier la fermentation des sucres par les bactéries ;

• caractériser les réactions cataboliques.

Catalase


26

Elle est réalisée à partir d’une colonie bactérienne prélevée à partir d’une culture pure.

Cette colonie est homogénéisée dans un tube de 10 ml d’eau distillée stérile.

Les modalités d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie LEMINOR

sont résumées dans le tableau 5 qui suit.

Tableau 5. Modalité d’ensemencement, de lecture et d’interprétation de la galerie

LEMINOR

Milieu Ensemencement Lecture après incubation 24 heures à 30°C Réaction + Réaction -

Mannitol Mobilité Nitrate

Piqûre centrale

Virage au jaune Diffusion de la culture

Précipité rouge après ajout de réactif de Griess : nitrate +

Pas de virage Pas de diffusion de culture

Pas de précipité après ajout de réactif de Griess: nitrate -

Hajna Kligler

Pente en stries

ascendantes et piqûre centrale

Culot jaune : glucose + Pente jaune : lactose +

Présence de bulles : gaz + Présence de précipité noir :

bactérie H2S +

Culot rouge : glucose – Pente rouge : lactose –

Absence de bulles : gaz – Absence de précipité noir :

bactérie H2S - Lysine

Fer

Pente en stries ascendantes et piqûre

centrale

Culot jaune : LDC – Pente jaune : LDA +

Culot violet : LDC + Pente violette : LDA -

Citrate de Simmons

Pente en stries ascendantes Virage au bleu Pas de virage

Urée

indole

Quelques gouttes de suspension

bactérienne dans 1 ml du milieu

Virage au rouge : uréase + Formation d’un anneau rouge à la surface après ajout de réactif

de Kovacs : indole +

Pas de virage : uréase – Pas d’anneau après ajout de

réactif de Kovacs : indole –

+ : positif LDC : lysine décarboxylase H2S:sulfure d’hydrogène –: négatif LDA : lysine désaminase

II.2.5.2. Etude phénotypique de la souche d’actinomycète

L’identification de la souche d’actinomycète par étude phénotypique nécessite l’étude

des différents caractères de la souche tels que les caractères culturaux, les caractères

morphologiques, les caractères physiologiques et les caractères biochimiques.

II.2.5.2.1. Etude des caractères culturaux

Cette étude permet d’observer macroscopiquement l’aspect des colonies sur milieu

solide. Les caractères culturaux sont déterminés sur des milieux de culture spécifiques : ISP2,

ISP4, ISP5 (Shriling et Gottlieb, 1966), le milieu AS1, le milieu Amidon-Caséine agar, le

milieu Nutrient agar, et le milieu sporulation agar. L’inoculum préparé précédemment est

ensemencé en stries sur ces différents milieux. L’importance de la croissance, le


27

développement du mycélium de substrat et du mycélium aérien ainsi que la recherche de la

présence des pigments diffusibles dans la gélose autres que les pigments mélanoides, sur

chaque milieu sont notés après 07, 14 et 21 jours d’incubation à 30°C.

II.2.5.2.2.Etude des caractères morphologiques

Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989)

Cette étude consiste en l’observation microscopique de la morphologie des spores, du

mycélium de substrat et du mycélium aérien d’une culture de souches d’actinomycètes sur

lamelle. Une lamelle stérile est insérée délicatement dans un milieu gélosé (ISP2), de manière

à former un angle d’environ 45°. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en

contact avec le milieu. Après 14 jours d’incubation à 30°C, la lamelle est retirée

soigneusement de la gélose, déposée sur une lame et examinée au microscope à immersion à

l’objectif x 100.

II.2.5.2.3. Etude des caractères physiologiques

L’étude des caractères physiologiques permet de déceler le comportement des

bactéries vis-à-vis de certains facteurs de milieu (température, pH, tolérance en sel,…). Pour

la détermination de la température optimale, la croissance est estimée après 21 jours

d’incubation à 5°C, 15°C, 20°C, 30°C, 37°C, 45°C et 55°C. Le pH optimum de croissance a

été étudié sur milieu CYD tamponné à différents pH (Crawford et al., 1993). La tolérance

maximale au Na Cl est réalisée sur milieu AS1 (Tresner et al., 1968). Le type respiratoire se

fait sur milieu viande-foie (VF) selon la méthode décrite par Guiraud en 1998. La

détermination de la mobilité des actinomycètes a été réalisée sur milieu mannitol-mobilité

(Guiraud, 1998). La mise en évidence des pigments mélanoides produits par les souches

représentatives est réalisée sur les milieux ISP6 et ISP7 en gélose inclinée (Shirling et

Gottlieb, 1966 ; Mochevaetal.,2002).

II.2.5.2.4. Etude des caractères biochimiques

Cette étude permet de distinguer différents genres ou espèces d’actinomycètes en se

basant sur la différence de métabolisme. Elle est basée sur la recherche de l’enzyme la

catalase, la recherche de l’uréase et de la production d’indole, l’hydrolyse de la caséine

(Williams et Cross, 1971 ; Gordon et Smith, 1953) et l’hydrolyse de l’amidon (Gordon et

Smith, 1953) et la fermentation des différentes sucres selon la méthode décrite par Pridham et

Gottlieb en 1948.


28

II.2.6. Dosage des HAP résiduels

II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels

Dans cette étape, seules les souches résistantes à la solution des HAP à la

concentration de 1500 mg/L sont à considérer. Pour cela, le même protocole que dans la

deuxième étape est appliqué. Un milieu liquide propre sans HAP et sans microorganismes est

réservé pour servir de témoin négatif.

A chaque prélèvement, la suspension bactérienne (ainsi que le blanc) est filtrée en

utilisant du papier filtre en fibre de verre. Le filtrat ainsi obtenu est ensuite utilisé pour

l’extraction des HAP résiduels.

Cette extraction se déroule en 2 étapes :

• Extraction des HAP résiduel : le filtrat additionné de trois volumes égaux de solvant

d’extraction (acétate d’éthyle) sont versés dans une ampoule à décanter de 100 ml et

agités vigoureusement pendant au moins 5 min puis laisser décanter pendant 15 min.

La phase organique est récupérée dans un ballon à fond rond de 100 ml.

• Pré-concentration : L’extrait est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif jusqu’à

obtenir un volume de 2 ml environ. Puis l’extrait est évaporé de nouveau avec un flux

d’azote pour obtenir exactement un volume final de 0,5 ml. L’extrait final est transféré

à l’aide d’une micro-seringue en verre dans un tube de 1,5 ml de contenance puis

passé à la GC et quantifié, il est ensuite conservé au congélateur.

Résultats

RESULTATS

Résultats

29

III.1. TAUX DES HAP DANS L’ECHANTILLON DU SOL CONTAMINE L’analyse chromatographique en phase gazeuse (CPG) de l’échantillon de sol de

Tsimiroro a permis de mettre en évidence la présence de quatorze (14) HAP composé de

naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène, fluorène, phénanthrène, anthracène, fluoranthène,

pyrène, benzo[a]anthracène, chrysène benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène, benzo[a]

pyrène, dibenzo[a,h]anthracène.

Le tableau 6 suivant montre les différents HAP et leurs concentrations présentes dans

l’échantillon de sol de Tsimiroro après le dosage chromatographique :

Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo

N° Noms des composés Formule brute

Nombre de cycle

Concentration (mg/kg)

1 Naphtalène C10H8 2 2,985 2 Acénaphtylène C12H8 3 1,436 3 Acénaphtène C10H10 3 0,002 4 Fluorène C13H10 3 0,765 5 Phénanthrène C14H10 3 0,374 6 Anthracène C14H10 3 0,418 7 Fluoranthène C16H10 4 0,105 8 Pyrène C16H10 4 0,247 9 Benzo[a]anthracène C18H12 4 0,156

10 Chrysène C18H12 4 3,805 11 Benzo[b]fluoranthène C20H12 5 0,649 12 Benzo[k]fluoranthène C20H12 5 1,755 13 Benzo[a] pyrène C20H12 5 0,983 14 Dibenzo[a,h]anthracène C22H14 5 0,251

III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES Vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir de sol pollué par les

hydrocarbures dans un site industriel d’un grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro dont

quatre (4) Pseudomonas fluorescents (numérotées de P1 à P4), dix (10) actinomycètes

(numérotées d’A1 à A10) et douze (12) flores totales cultivables (numérotées de F1 à F12).

Les isolats de Pseudomonas fluorescents sont reconnaissables par le reflet d’un

pigment fluorescent sous la lumière ultraviolette de longueur d’onde 254 nm (photo 1).

Résultats

30

Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B

Les souches d’actinomycètes isolées sont morphologiquement identiques c’est-à-dire les

colonies sont opaques, de forme arrondie, de petite taille, à bords irréguliers et incrustées dans

le milieu de culture. Les souches se différencient par la couleur du mycélium aérien et celle

du mycélium végétatif, leurs tailles et la production de pigments (photo 2).

Souche d’actinomycète Souche pure d’actinomycète Souches d’actinomycètes produisant des pigments sur milieu AS1 de différents couleurs

Photo 2. Variétés des souches d’actinomycètes isolées sur milieu AS1

III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES Les résultats des tests de résistance ont montré que parmi les 26 souches, seulement

deux souches (codées A1 et F2) sont résistantes au milieu hautement contaminé. C’est-à-dire

que ces souches ont de la capacité de se développer en milieu contaminé par les HAP

(Σ8HAP) à une teneur de 1500 mg/L. Les dénombrements des colonies s’effectuent

régulièrement; le temps de prélèvement dépend de la croissance de chaque souche étudiée.

Les résultats ont montré que la population microbienne augmente au cours de

l’expérience. Pour la souche F2, il y a augmentation rapide de la population microbienne du

début de l’expérience jusqu’à 12ème jours d’incubation. La croissance se stabilise au 20ème jour

jusqu’à 45ème jour. Par contre, la souche A1 croit progressivement au cours de test. Les

Résultats

31

tableaux ci-dessous présentent les résultats de dénombrement de la souche A1 et de la souche

F2 pour chaque temps de prélèvement en milieu contaminé par les HAP 1500 mg/L.

Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélèvement sur

milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L

Durée d’incubation (en jours)

Dénombrement 1j 7j 15j 27j 34j 48j 55j 62j

A1 (UFC/ml) 4,2.108 8,9.108 2,6.109 3,5.109 5,3.109 8.108 4,5.108 4,7.107

Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélèvement sur

milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L

Durée d’incubation (en jours)

Dénombrement 1 j 4 j 7 j 12 j 20 j 25 j 32 j 39 j 45 j

F2 (UFC/ml) 1,4.108 9,1.109 5,3.1010 6,1.1010 7,6.109 7,6.109 109 6,8.108 2,5.108

III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES Ces deux souches ont fait l‘objet d’une identification culturales, morphologiques,

physiologiques et biochimiques.

II.4.1. Identification de la souche A1

L’ensemble des caractères culturaux, morphologiques ainsi que les caractères

physiologiques et biochimiques étudiées de la souche A1 a permis de classer les souches dans

le genre Streptomyces. En se référant à la 9ème édition du Manuel de Bergey, l’isolat A1 se

rapproche à l’espèce Streptomyces sp.

Les caractères culturaux, morphologiques, physiologiques et biochimiques de cette

souche sont donnés dans les tableaux ci- après.

Résultats

32

Tableau 9. Caractéristiques culturales de la souche d’actinomycète A1

ISOLAT A1 :

Milieux Croissance Sporulation Mycelium de substrat

Mycelium aérien

Pigment diffusible

ISP2 ++ + brunâtre blanc - ISP4 ++ + brunâtre blanc - ISP5 ++ + brunâtre blanc -

Nutrient agar - - - - - AS1 +++ + Brun blanc - SCA +++ + Blanc blanc -

Sporulation agar ++ + Brun blanc -

Tableau 10. Caractères morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche A1

Caractéristiques Isolat

Caractéristiques Isolat

A1 A1 Production de pigment

mélanoïde : Température de croissance:

ISP6 - 4°C - ISP7 + 15°C ++

Activité enzymatique : 20°C +++ Hydrolyse de l’amidon + 30°C +++ Hydrolyse de caséine + 37°C ++

Catalase + 44°C - Uréase - Croissance à pH:

Coagulation du lait écrémé + 3,3 - Peptonisation du lait écrémé - 5,3 ++

Production d’indole - 7,3 +++

Type respiratoire Aérobie

strict 9,3 +++

Mobilité - 12,3 - Tolérance en NaCl: Source de carbone:

0% + Mannitol - 1% +++ Glucose + 3% ++ Galactose + 5% - Tréhalose - 7% - Maltose + 9% - Arabinose -

10% - Dulcitol + Saccharose + Rhamnose -

- : négatif, inhibition de la croissance / + : positif, croissance faible / ++ : croissance

modérée +++ : croissance abondante

Résultats

33

III.4.2. Identification de la souche F2

L’étude des caractéristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques a

permis de rapprocher la souche F2 à l’espèce Bacillus simplex. Les caractères culturaux,

morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces trois souches sont donnés dans les

tableaux ci- après.

Tableau 11. Caractère culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2

Souches Test F2

Caractères culturaux

Croissance : rapide Couleur : crème

Surface et texture : brillante Contour : irrégulier

Hauteur: légèrement surélevé Diamètre: 3- 6 m après 2 jours d’incubation

Caractères morphologiques

Gram + Bacille

0,7 -0,9 µm de diamètre Mobile

Caractère physiologiques Influence de la Température

4 °C - 8 °C +

20 °C ++ 30 °C +++ 37 °C ++ 45 °C -

pH 7 Enzymes respiratoires Catalase +

- : négatif + : croissance faible ++ : croissance moyenne+++ : croissance abondante

Tableau 12. Caractère biochimiques de la souche F2

Souches Milieu F2

Utilisation des sucres :

L-arabinose + Fructose +

Milieu urée indole

Uréase - Xylose + Indole - Raffinose +

SIMMONS Citrate perméase + Ribose +

Mannitol mobilité nitrate

Mannitol + Sucrose + Mobilité Mobile Trehalose + Nitrate

réductase + Sorbitol +

Lysine -fer LDA - D-xylose - LDC - Rahmnose -

Hajna-Kligler

Glucose + D-manose - Lactose + D-arabinose -

H2S - Cellulose - Gaz +

- : réaction négative / + : réaction positive

Résultats

34

III.5. RENDEMENT D’ELIMINATION DE CHAQUE HAP Les genres Streptomyces sp. et Bacillus qui ont été identifiées, sont utilisés pour le

dosage des HAP résiduels dans le milieu de culture mélangé avec les HAP à la concentration

de 1500 mg/L. Chaque souche est étudiée séparément. Les suivis des concentrations

s’effectuent régulièrement, le temps de prélèvement dépend de l’état d’évolution de

concentration en HAP dans le milieu lors de l’incubation. Si la dégradation est rapide, les

prélèvements ont été effectués à des intervalles de temps courts et à l’inverse, si la

dégradation est modeste, les prélèvements sont effectués toutes les semaines ou tous les dix

jours. Le tableau ci-dessous présente les rendements d’élimination de chaque HAP pour

chaque temps de prélèvement. Pour mieux visualiser les résultats, ces données sont présentées

en forme de graphe (figure 6 et figure 7).

Tableau 13. Rendement d’élimination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durée

d’élimination

Pourcentage d’élimination (%) des HAP en fonction de leur durée d’incubation (en jours)

Streptomyces sp. (A1)

HAP 0j 1j 7j 18j 28j 45j 51j 58j 62j 75j

Naphtalène 0 23,74 50,33 62,24 75,32 73,15 69,12 80,32 83,79 85,38

Acénaphtène 0 13,50 34,55 46,23 68,29 71,44 70,43 77,65 80,10 82,36

Fluorène 0 19,11 41,18 45,66 52,73 57,26 48,32 65,25 68,51 73,27

Phénanthrène 0 21,42 49,31 53,60 69,99 73,22 68,45 70,95 74,98 76,19

Anthracène 0 15,33 29,61 50,33 55,91 61,22 51,47 61,26 66,59 71,86

Fluoranthène 0 0 3,76 17,33 31,44 34,15 33,23 36,17 38,55 40,17

Pyrène 0 0 2,79 15,12 32,75 30,41 29,36 42,13 47,56 50,28

Benzo(a)anthracène 0 0 1,32 10,24 27,40 29,12 26,48 27,68 30,31 32,42

Bacillus simplex (F2)

HAP 0j 1j 7j 15j 25j 46j 53j 59j 63j 72j

Naphtalène (2) 0 0 6,45 68,59 74,41 78,74 82,15 86,35 91,63 95,32

Acénaphtène (3) 0 0 4,21 39,20 48,61 60,32 64,26 70,13 74,29 78,41

Fluorène (3) 0 0 5,22 47,76 61 ,02 65,44 72,09 78,56 80,63 83,45

Phénanthrène (3) 0 0 8,73 55,39 72,52 81,11 85,90 89,31 88,30 86,66

Anthracène (3) 0 0 7,22 72,31 76,22 79,16 82,19 84,72 86,1 89,31

Fluoranthène (4) 0 0 2,30 26,22 32,44 47,31 50,88 51,25 52,38 54,22

Pyrène (4) 0 0 3,71 31,66 40,21 50,23 52,16 54,19 56,33 58,37

Benzo(a)anthracène 0 0 1,97 12,65 19,95 24,63 31,44 36,79 40,36 45,21

Résultats

35

La figure 6 présente l’évolution de rendement d’élimination des 8 HAP par le

Streptomyces sp. en fonction de la durée d’incubation. Le rendement d’élimination augmente

linéairement au début de l’expérience jusqu’à 28ème jours d’incubation pour les 8 HAP puis la

dégradation semble moins vite, la courbe semble atteint le plateau au bout de 75 jours

d’incubation. Cette espèce dégrade plus efficacement et plus rapidement les HAP légers : le

naphtalène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène et l’anthracène (cycles aromatiques ≤

3) que les HAP lourds (le fluoranthène, le pyrène et le benzo(a)anthracène). Ces résultats

montrent que Streptomyces sp. est une espèce potentielle pour éliminer les HAP dans le

milieu de culture.


durée d’incubation pour l’espèce Streptomyces sp.

La figure 7 ci-dessous présente le pourcentage d’élimination des 8 HAP par Bacillus

simplex en fonction de la durée d’incubation. Des résultats similaires que précédemment ont

été observés. Cette espèce de Bacillus simplex élimine plus facilement les HAP composés de

cycles aromatiques ≤ 3 que les HAP lourds. Cependant, le Bacillus simplex dégrade le

naphtalène et l’anthracène plus rapidement que les autres HAP.

En égard aux résultats obtenus, l’espèce de Bacillus simplex semble pouvoir dégrader

ces HAP plus vite que l’espèce de Streptomyces sp.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 7 18 28 45 51 58 62 75

Pour

cent

age

d'él

imin

atio

n (%

)

Durée d'incubation (jours)

Naphtalène

Acénaphtène

Fluorène

Phénanthrène

Antrhacène

Fluorenthène

Pyrène

Benzo(a)anthracène

Résultats

36


durée d’incubation pour l’espèce Bacillus simplex

0

20

40

60

80

100

120

0 1 7 15 25 46 53 59 63 72

Pour

cent

age d

'élim

inat

ion

(%)

Durée d'incubation (jours)

Naphtalène

Acénaphtène

Fluorène

Phénanthrène

Antrhacène

Fluorenthène

Pyrène

Benzo(a)anthracène

Discussions

DISCUSSIONS

Discussions

37

DISCUSSIONS

L’objectif de cette étude était (i) de sélectionner les souches résistantes à une gamme

croissante de concentration de mélange HAP étudiés dans des milieux de culture spécifique et

(ii) de suivre la cinétique de dégradation des polluants en mettant en œuvre différents

microorganismes sélectionnés.

Dans la première partie de l’étude dont les activités visent principalement à

sélectionner des souches jugées comme étant résistantes et efficientes après leur soumission

volontaire à une condition extrême de stress (milieux de croissance dopés par des polluants).

Pour y parvenir, plusieurs étapes de travaux ont été poursuivies.

Diverses espèces de microorganismes (bactéries, champignons) ont été identifiées

comme étant capable de dégrader ces composés mais d’une façon limitée. Dans notre étude,

trois (3) groupes de microorganismes (le genre Pseudomonas, les actinomycètes et la flore

totale cultivable) ont été isolés à partir de sol pollué par les hydrocarbures. Ces trois types de

microorganismes ont déjà été rapportés comme étant capables de dégrader les HAP dans le

sol (Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Mahmoud et Rama, 1993 ; Yang et al., 1994).

L’isolement des microorganismes rhizosphériques nécessite des techniques permettant

d’obtenir un nombre considérable des isolats à partir de sol pollué par les hydrocarbures. A

cette fin, l’utilisation des méthodes d’isolement sélectives a été une étape cruciale.

L’isolement sélectif des microorganismes n’est pas exactement facile pour les souches

d’actinomycètes. Les substrats apportés par les produits utilisés pour le milieu favorisent non

seulement la croissance des actinomycètes mais aussi d’autres bactéries à croissance rapide et

des champignons. De ce fait, la présence de ces derniers empêche un isolement facile des

actinomycètes qui ont un temps de génération relativement long (Williams et al., 1982;

Crawford et al.,1993). L’utilisation de milieu contenant de la chitine, de l’amidon, de

l’arginine, de l’asparagine, de la caséine conduit à un isolement sélectif des actinomycètes

alors que la croissance des bactéries et des champignons est faible (Williams et Davies, 1965).

Ce qui explique le choix du milieu AS1 pour l’isolement, ce milieu contient de

l’amidon, de l’arginine et de l’asparagine. L’AS1 est surtout utilisé pour l’isolement des

souches d’Actinomycètes telluriques. Il a été utilisé par le Laboratoire de Daw Agro Sciences

(DAS) pour l’isolement des souches d’actinomycètes à partir du sol.

Les techniques d’isolement utilisées consistent en un prétraitement par la chaleur de

l’’échantillon et à l’addition dans le milieu d’isolement, d’antibiotiques inhibant la croissance

Discussions

38

de germes envahisseurs (Larpent et Sanglier, 1989; Ouhdouche et al., 2001; Hilali et al.,

2002 ; Jung Yeoplee, 2002). Cependant, l’utilisation d’antibiotiques lors de l’isolement est un

sujet controversé. Certains auteurs pensent que les antibiotiques inhibent beaucoup

d’actinomycètes (Porter et al., 1960) et d’autres au contraire suggèrent l’emploi d’un mélange

antifongique et antibactérien (Dulaney et al.,1955 ; Williams et Davies ,1965).

Dans cette étude, trois (3) antibiotiques ont été utilisés : l’acide nalidixique qui permet

l’élimination des bactéries à Gram négatif selon Suzuki et al. (1999). Les actinomycètes

peuvent résister à l’acide nalidixique jusqu’à une concentration de 10 μg/ml. La

triméthoprime quant à elle, inhibe les bactéries à croissance rapide (Labeda et Shearer, 1990).

Et la cycloheximide qui est un inhibiteur utilisé pour l’isolement des actinomycètes (Wang et

al., 1999).

L’ajout d’antibiotiques dans le milieu d’isolement n’a pas empêché la croissance de

quelques petites colonies de champignons mais ce sont surtout les bactéries à Gram positif qui

posent problème : elles ne peuvent pas être éliminées et envahissent la gélose, gênant ainsi la

croissance des actinomycètes.

Pour les Pseudomonas fluorescents, l’isolement a été effectué sur milieu de culture

King B (King et al., 1954). Cette technique est basée sur l’observation sous lumière

ultraviolette à 254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure

partie des sidéphores produites par ces bactéries. Connus pour être abondants dans les sols

rhizosphériques (Kragelund et Nybroe, 1996), les Pseudomonas fluorescents ont une densité

dépendant beaucoup de son statut symbiotique et de la nature de la plante (Founoune et

Duponnois, 2002). Ces derniers auteurs ont confirmé que ce groupe de bactéries est

particulièrement abondant autour des racines mycorhizées.

Les flores totales sont des microorganismes faciles à cultiver. Elles sont constituées,

en grande partie, par des bactéries à croissance rapide qui peuvent se développer sur le milieu

TSA. Par conséquent, l’utilisation d’un milieu à base de peptone sans antibiotiques permet

facilement l’isolement de ces groupes de microorganismes.

Ces différentes méthodes ont été utilisées afin de récupérer un maximum de

microbiennes viables et cultivables. Le protocole adopté s’est ainsi avéré efficace. En effet,

vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées et purifiées. Douze (12) souches des flores

totales cultivables, dix (10) souches d’actinomycètes et quatre (4) souches de Pseudomonas

fluorescents proviennent d’un échantillon de sol contaminé par les hydrocarbures. D’une

Discussions

39

manière générale, le nombre des souches isolés à partir de sol contaminé par les

hydrocarbures est largement élevé pour effectuer de test d’acclimatation et la suivi cinétique

de la dégradation des molécules des HAP. La présence d’un nombre moins élevé de souche de

Pseudomonas fluorescent dans le sol indique que la croissance de ce genre de bactérie est

inhibée à un certain seuil de HAP dans le sol. Il est possible également que le taux de

nutriments dans le sol est épuisé et influence cette inhibition en présence de toxicité élevée de

HAP.

En ce qui concerne l’effet des polluants sur la biomasse, nos résultats montrent

clairement la capacité de certaines souches isolées à résister et à se développer en milieu

contaminé par une gamme croissante de concentration de mélange HAP. Les populations

microbiennes indigènes d’un écosystème pollué ne présentent pas tous les outils métaboliques

permettant de réaliser une dégradation complète des polluants dans le cadre d’une atténuation

naturelle. L’acclimatation (ou bio-stimulation) est une méthode utilisée pour améliorer ce

processus de biodégradation en modifiant les conditions environnementales par adjonction de

surfactants, de nutriments, d’eau, de donneurs ou d’accepteurs d’électrons. Les conditions

favorables pour la croissance des microorganismes sont tout de même fournies au maximum

afin d’assurer leur viabilité.

Lors de cette acclimatation, la survie de la souche A1 (actinomycète) et la souche F2

(flore totale cultivable), en présence de concentration élevée de HAP (1500 mg/L), révèle déjà

leur résistance ainsi que leur efficacité dans le processus de biodégradation. Elles s’adaptent

facilement à ce type d'environnement tant du point physiologique et que génétique. Le fait

que le taux de population microbienne augmente au cours cette expérience démontre la

capacité de ces deux souches à utiliser les carbones des polluants comme source de carbone et

d’énergie.

Ces deux (2) souches ont fait l’objet d’une identification phénotypique. La souche F2

a été identifiée par plusieurs caractères tels que les caractères culturaux, les caractères

morphologiques, les caractères physiologiques et les caractères biochimiques. En

l’occurrence, l’ensemble de ces caractères a permis de rapprocher la souche F2 à l’espèce de

Bacillus simplex. C’est une espèce particulière que l’on retrouve dans les endroits chauds tels

qu’en Afrique. Leur croissance bactérienne peuvent avoir lieu jusqu’à 43°C (Sikorski et

Nevo, 2007).

Discussions

40

Pour la souche d’actinomycète A1, l’identification a été effectuée au niveau de

l’espèce selon la méthode préconisée par l’International Streptomyces Project, par des

analyses phénotypique. L’étude macroscopique et microscopique des isolats sur différents

milieux de culture, permet de suivre le développement et l’arrangement des mycéliums de

substrat et aérien ainsi que la formation des spores, elle permet aussi d’observer la forme et

l’aspect des colonies. L'ensemble des caractères culturaux, morphologiques ainsi que les

caractères physiologiques et biochimiques étudiés, a permis de classer cette souche dans

l’espèce Streptomyces p. D’autant plus, les résultats obtenus seront utiles pour optimiser les

conditions de culture afin d’augmenter la capacité de cette souche à résister et à se développer

dans de milieu hautement contaminé par les HAP.

Pour cette étude, les informations apportées par les études phénotypiques ne sont pas

suffisantes pour l’identification au niveau de l’espèce. D’autres techniques sont ainsi

suggérées pour l’identification de ces deux genre bactériens, à savoir les séquences

intergéniques répétitives d'ADN (rep-PCR) (Sadowsky et al., 1996), PCR- RFLP du gène

codant la protéine du choc thermique 65-kDa (Steingrube et al., 1997), ou le séquençage du

gène rpoB codant la sous unité β de l’ARN polymérase (Kim et al., 2004).

Dans la deuxième partie de l’étude, l’objectif était de suivre la cinétique de

dégradation des polluants par les souches sélectionnées de Streptomyces sp. et de Bacillus

simplex.

Les genres Actinomycètes et Bacillus sont connus pour leur capacité à dégrader les

molécules HAP dans le sol. Nos résultats montrent que ces deux espèces de bactéries ont des

forts potentiels dans l’élimination de HAP dans le milieu. Les deux souches dégradent plus

efficacement et plus rapidement les HAP légers (cycles aromatiques ≤ 3) par rapport aux HAP

composés de quatre (4) cycles aromatiques. Les deux souches sélectionnées ont pu utiliser les

carbones de naphtalène, d’acénaphtène, de fluorène, de phénanthrène et d’anthracène comme

source de carbone et d’énergie. Les résultats lors de cette étude sont conformes à ceux trouvés

dans la littérature qui ont indiqué que les souches d’actinomycètes et de Bacillus telluriques

dégradent facilement les HAP composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (Das and

Mukhjee, 2007 ; Jacques et al., 2008).

Quant au HAP composés de quatre (4) cycles aromatiques, la capacité de ces isolats à

minéraliser, décomposer ou transformer les HAP en substances moins nocives est réduite.

Discussions

41

Cela est surement dû à l’hydrophobicité élevée de HAP (fluoranthène, le pyrène et le

benzo(a)anthracène). Ainsi, ils ne sont pas bio-disponibles pour ces deux souches.

Selon la littérature, les HAP lourds sont difficilement dégradés si des bactéries

individuelles sont mises en en œuvre. De nombreuses études ont montré que l’emploi de

consortium de bactérie est plus efficace pour la dégradation des matières polluantes (Ghazali

et al., 2004 ; Goux et al., 2003) et que la combinaison avec une phytoremédiation augmente

le pourcentage de dégradation (Jingchant Tang et al., 2010). Jacques et al., (2008) ont

déjà évalué la capacité de consortium de six (6) souches (Mycobacterium fortuitum,

Bacillus cereus, Mycrobactérium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae

bactérium et Fusarium oxysporum) et qui ont pu dégrader et minéraliser l’anthracène, le

phénanthrène et le pyrène dans le sol avec un taux de dégradation allant de 96% à 99% au

bout de 70 jours. Une liste de type de microorganismes sélectionnés pour des essais de

bioaugmentation des sols contaminés par les composés aromatiques est détaillée dans le

travail de Agnieszka Mrozik et al., 2010.

Conclusion générale et perspectives

CONCLUSION GENERALE ET

PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

42

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Le présent travail portant sur « Sélection et identification des souches telluriques

impliquées dans la dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques», nous a

permis de :

de maitriser les techniques usuelles en microbiologie et en physico-chimique,

d’apporter des informations sur l’abondance des souches microbiennes dans le

sol pollué par les hydrocarbures,

de mettre en place une banque de souches microbiennes utilisable dans les

recherches à venir,

d’apporter des informations sur la potentialité des microorganismes telluriques

à résister et à dégrader les HAP,

de mettre en évidence la diversité phénotypique des souches sélectionnées.

Nous avons mis en évidence l’activité dégradante des microorganismes telluriques

sélectionnés de milieu pollué par une quantité connue de mélange de HAP aussi bien les HAP

légers composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques que les HAP lourds composés de

quatre (4) cycles aromatiques. Cependant, cette étude est loin d’être finie. A l’avenir, nous

envisagerons d’entreprendre les travaux de recherche sur :

la caractérisation moléculaire des souches sélectionnées par PCR des gènes

16S ribosomal,

l’expérimentation de décontamination de sols pollués (expériences en

microcosmes) et suivi de cinétique de dégradation de polluants en utilisant les

souches sélectionnées (utilisé en consortium),

le développement et optimisation des méthodes d’extraction et de

quantification de HAP,

l’isolement d’autres groupes de microorganismes (bactéries, champignons)

identifiés comme étant capable de dégrader les molécules des HAP dans le

sol,

la sélection des consortiums microbiens efficaces et le suivi de la dynamique

des souches d’intérêts utilisées.

Références bibliographiques

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES


43

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Alexander M. (1977). John Wiley and sons, Inc. New York, “Introduction to soil

microbiology”, 2nd edition.

Agnieszka Mrozik et al., (2010). Bioaugmentation as a strategy for cleaning up soils

contaminated with aromatic compounds, Microbiol. Res., 2010, 165-363.

Ballerini et Vandecasteele. (1999). La restauration par voie microbiologique des sols contaminés

par les polluants organiques. Biotechnologie, coordinateur R. Scriban, 5éme édition, Edition Tech

et Doc, pp, 835-865.

Bonneau M., Souchier B. (1994). Masson, Paris, "Pédologie. 2 - Constituants et propriétés du

sol ", 2ème édition.

Bower E.J. and Zehnder A. J. B. (1999).Bioremediation of organic compound-putting

microbial metabolism to work. Trends in Biotechnology., 11: 360-367.

Cerniglia C. E. (1997). Fungal metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: past,

present and future applications in bioremediation. Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology., 19: 324-333.

Crawford D.L., Lynch J.M. and Ousley M.A. (1993). Isolation and characterization of

actinomycetes antagonists of a fungal root pathogen. Appl. Envirnm. Microbiol., 59 (11):

3899-3905.

Collin C. (2000). (Biodégradation des hydrocarbures). Pollution localisée des sols et des

sous-sols par les hydrocarbures et par les solvants chlorés. Rapport de l’académie des sciences

n°44, Technique et Documentation Lavoisier, Paris 417p.

Das K. and Mukherjee A. K. (2007). Crude petroleum-oil biodegradation efficiency of

Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil

contaminated soil from North-East India. Bioresour Technol., 98: 1339-45.

Davis J. I., Evans W. C. (1964). Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonas.

Biochemistry Journal, 91: 251-261.

Dulaney E.L., Larsen H.A. and Stapley E.O. (1955). A note on the isolation of

microorganisms from natural sources. Mycol., 47:420.


44

Edwards N. T., (1983). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the terrestrial

environment-a review. Journal Environmental Quality., 12 :427-441.

Erickson M., Dalhammar G. and Borg-Karlson A. K. (2000). Biological degradation of

selected hydrocarbons in an old PAH/creosote contaminated soil from a gas work site.

Applied Microbiology and Biotechnology., 53: 619-62.

Evan W. C., Fernley, H. N. Griffiths, E. (1965). Oxidative metabolism of phenanthrene and

anthracene by soil Pseudomonas. Biochemistry Journal., 95, 819-831.

Founoune H. et Duponnois R. (2002). Interactions between ectomycorrhizal symbiosis and

fluorescent Pseudomonas on Acaciaholosericea: isolation of mycorrhiza helper bacteria

(MHB) from a Soudano-Sahelian soil. FEMS Microbiology Ecology., 41: 37-46.

Fu G., Kan A. T. and Thomson M. (1994). Adsorption and desorption hysteresis of PAHs in

surface sediment. Environmental Toxicology and Chemistry., 13:1559-1567.

Grady C. P. L. (1985).Biodegradation: its measurement and microbiological basis.

Biotechnology Bioengineering., 27: 660-674.

Ghazali F.M., Rahmann R.N., Salleh A.D. and Bassri M. (2004). Biodegradation of

hydrocarbons in soil by microbial consortium. International Biodeterioration and

Biodegradation., 54:61-67.

Goux S., Shapir N., El Fantroussi S., Lelong S., Agathos S.N., Pussemier L. (2003). Long

term maintenance of rapid atrazine degradation in soils inoculated with atrazine degraders.

Water Air Soil Pollution Focus., 3: 131-42.

Haesseler F., Blanchet D. Druelle V., Werner P, and Vandecasteel J.P. (1998).Degradation of

PAH: polluant accessibility and efficiency of soil michloforae contamined soil’s. Proceedings

of the Sixth International FZK/TNO conference on contamined soil, Volume 2, Thomas

Telford publisha,, 1298p.

Hartmann R. (1996). Polycyclic aromatic oh hydrocarbons (PAHs) in forest soils: critical

evaluation of new analytical procedure. Journal of Environmental Analytical Chemistry., 62:

161-173.

Hatzinger P. B. and Alexander M.(1995).Effect of aging of chemicals in soil on their

biodegradability and extractability. Environmental Science and Technology.,29: 537-545.


45

Heitzer A. and Sayler G. S. (1993).Monitoring the efficacy of bioremediation. Trends in

Biotechnology Technology.,11: 334-351.

Henner P., Schiavon M. Morel J-L and Lichtfousse E., (1997).Polycyclic aromatic

hydrocarbon (PAH) occurrence and remediation methods analysis, 25: 56-59.

Herbes S. E. (1997). Partioning of polycyclic aromatic hydrocarbons between dissolved and

particulates phases in natural waters. Water Ressources., 11:493-600.

Hilali L., Khattabi A., Nssarlah N., Malki A. and Finance C. (2002). Isolement des

nouvelles souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques à partir du

milieu naturel marocain. Biol. Biotech., 1(2): 49-53.

Hill A. J. and Goshal S. (2002). Micellar solubilization of naphthalene and phenanthrene

from monaqueous-phase liquids. Environment Science and Technology.,36: 3901-3907.

Hurst C. J., Sims R. C. Sims J. L., Sorensen D. L., Mclean J. E. and Huming S. (1996).

Polycyclic aromatic biodegradation as a function of oxygen tension in contaminated soil.

Journal of Hazardous Materials.,51: 193-208.

Jacques R.J.S., Okeke B.C., Bento F.M., Teixeira A.S., Peralba M.C.R., Comargo F.A.O.

(2008). Microbial consortium bioaugmentation of a polycyclic aromatic hydrocarbons

contaminated soil. Bioresour Technol., 99: 2637-43.

Jingchant Tang et al., (2010). Rhizoremediation of petroleum contaminated soil.

Biogeosciences, 7, 3961-3969.

Johnsen A. R. and Karlson U. (2005).PAH Degradation Capacity of Soil Microbial

Communities- Does it depend on PAH exposure? Microbial Ecology., 50: 488-495.

Juhasz A. L. and Naidu R. (2000).Bioremediation of high molecular weight polycyclic

aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene.

International Biodeterioration and Biodegradation.,45: 57-88.

Jung Y.L., Byung K.H. (2002). Diversity of antifungal actinomycetes in various vegetative

soils of Korea. Can. J. Microbiol., 48: 407-417.

Kastner M., Breuer-Jammali M., Maro B., (1994). Enumeration and characterization of the

soil microflora from hydrocarbon contaminated soil sites able to mineralize polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAH). Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol.41: 267-273.


46

Kanaly R. A. and Harayama S. (2000). Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic

aromatic hydrocarbons by bacteria-Minireview. Journal of Bacteriology., 182: 2059-2067.

Keith, L.H., Teillard, W.A. (1979). Priority pollutants. 1. A perspective view. Environmental

Science and Technology., 13: 416-423.

Kilbertus G. (1980).Etude des microhabitats contenus dans les agrégats de sol. Leurs

relations avec la biomasse bactérienne et la taille des procaryotes présents. Rev. Eco. Biol.

Sol., Vol.l7 (4): 543-557.

Kim S. B., Seong C. N., Jeon S. J., Bae K. S. & Good fellow M. (2004). Taxonomic study of

neutrotolerant acidophilic actinomycetes isolated from soil and description of Streptomyces

yeochonensis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol., 54: 211-214.

Kiyohara H., Nagao, K. (1978). The catabolism of phenanthrene and naphthalene by

bacteria. J. Gen. Microbiol.., 105: 69-75.

Kiyohara H., Nagao K., Yana K. (1982). Rapid screen for bacteria degrading water-

insoluble, solid hydrocarbons on agar plates. Appl. Environ. Microbiol., Vol.43 (2): 454-457.

Kragelund L. and Nybroe O.(1996). Competition between Pseudomonas fluorescents Ag1

and Alcaligenes eutrophus JMP134 (pJP4) during colonization of barley roots. FEMS

Microbiol. Ecol., 20:41-51. Labeda D.P. and Shearer M.C. (1990). Isolation of actinomycetes for biotechnological applications.

Isolation of Biotechnological Organisms from Nature. New York: McGraw Hill Publishing Company:

1-19.

Lappin H. M., Greaves M. P. and Slater J. H. (1985).Degradation of the herbicide mecoprop

[2-(2-methyl-4-chlorophenoxy) propionic acid] by a synergistic microbial community.

Applied Environmental Microbiology., 49: 429-433.

Larpent J.P. et Sanglier J.J. (1989). Biotechnologie des antibiotiques. Ed. Masson. Paris :

481.

Letho M. K., Puhakka A. J. and Lemmetyinen H., (2003). Biodegradation of selected UV

irradiated and non-irradiated polycyclic aromatics hydrocarbons (PAHs). Biodegradation.,

14 : 249-263.

Loi Canadienne sur la Protection de l’Environnement (LCPE). (1994). Liste des

substances d’intérêt prioritaire-rapport d’évaluation-Hydrocarbures Aromatiques

Polycycliques, 69p.


47

Mackay D., Schiu W. Y. and Ma K. C. (1992). Illustrated handbook of physical-chemical

properties and environmental fate for organic chemicals. Volume 1. Lewis publishers.

Chelsea, 697p.

Mahmoud S.K., Rama Rao P. (1993). Microbial abundance and degradation of polycyclic

aromatic hydrocarbons in soil. Bull. Environ. Contam. Toxicol., Vo1.50: 486-491.

Marschner B. (1999).Sorption of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and

polychlorinated biphenyls (PCB) in soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science., 162: 1-

14.

Mi Jin H., Choi E.J, Jeon C.O. (2013). Isolation of a BTEX-degrading bacterium, Janibacter

sp. SB2, from a sea-tidal flat and optimization of biodegradation conditions. Bioresource

Technology., 145: 57-64.

Monserie M. F., Watteau F., Villemin G., Ouvrard S. Morel J. L. (2009). Technosol genesis:

identification of organo-mineral association in a young Technosol derived from coking plant

waste materials. J. Soils Sediments.

Ouhdouche Y., Barakate M. and Finance C. (2001). Actinomycetes of maroccan habitats:

isolation and screening for antifungal activities. Eur. J. Biol., 37: 69-74.

Paul E.A., Clark F.E. (1989). Academic Press Inc, San Diego, Ca. "Soil Microbiology and

Biochemistry”.

Porter J.N., Wilhem J.J. and Tresner H.D. (1960). Method for the preferential

isolation of actinomycetes from soil. Appl. Microbiol., 8:174.

Sadowsky M.J., Kinkel L.L., Bowers J.H. and Schottel J.L. (1996) Use of repetitive intergenic

DNA sequences to classify hogenic and disease-suppressive Streptomyces strains. Applied and

Environmental Microbiology., 62: 3489-3493.

Saito A., Iwabuchi T. and Harayama S. (2000).A novel phenanthrene dioxygenase from

Nocardioides sp. KP7 : expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology., 182: 2134-

2141.

Samanta S. K., Singh O. M. and Jai R. K. (2002).Polycyclic aromatic hydrocarbons:

environmental pollution and bioremediation-review. Trends in Biotechnology., 20: 243-248.

Seo, J.-S., Keum, Y.-S., Hu, Y., Lee, S.-E. Li, Q. X. (2006). Phenanthrene degradation in

Arthrobacter sp. P1 1: Initial 1, 2, 3, 4 and 9,10-dioxygenation, and meta- and ortho-cleavages


48

of naphthalene-1,2-dicarboxylic acid and hydroxyl naphthoic acids. Chemosphere., 65 : 2388-

2394.

Sikorski J., and Nuevo E. (2007). Patterns of thermal adaptation of Bacillus simplex to the

microclimatically contrasting sol pes of ‘Evolution Canyons’ I and II, Israel. Environmental

Microbiology., 9(23), 716-726.

Suzuki S.I., Okuda T. and Komatsubara S. (1999). Selective isolation and

distribution of Sporichthya strains in soil. Appl. Env. Microbiol., 65(5): 1930-1935.

Steingrube V. A., Wilson R. W., Brown B. A., Jost K. C., Jr, Blacklock Z., Gibson J. L. &

Wallace, R. J. (1997). Rapid identification of the clinically significant species and taxa of

aerobic actinomycetes, including Actinomadura Gordona, Nocardia, Rhodococcus,

Streptomyces and Tsukamurella isolates, by DNA amplification and restriction endonuclease

analysis. J Clin Microbiol., 35 : 817-822.

Tarayre. C. (2012). Bioremédiation de sols pollués aux hydrocarbures. Editions Universitaires

Européennes. 116p.

Treccani, V., Walker N. Wiltshire G. H. (1954). The metabolism of naphthalene by soil

bacteria. J. Gen. Microbiol., 11: 841-848.

Van Brummelen T. C., Verweij R. A., Wedzinga S. A. and Van Gestel C. A. M. 1(996).

Enrichment of polycyclic aromatic of hydrocarbons in forest soils near a blast furnace plant.

Chemosphere., 32: 293-314.

Vierle O., Launhart T. Strehler A., Dumler Gradlr, Thomas H. and Schreiner M.

(1999).Investigation of organic pollutants from house heating systems using biogenic fuels

and correlation with other exhaust gas components. Analytic chemical Act., 393: 131-140.

Vidali M. (2001). Bioremediation. An overview. Pure and Applied Chemistry., 73: 1163-

1172.

Wang Y., Zhang Z. S., Ruan J. S. (1999). Investigation of actinomycete diversity in the tropical

rainforests of Singapore. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.,23: 178-187.

Weissenfels W. D., Klewer H. J. and Langhoff J. (1992).Adsorption of polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAH) by soil particles: influence on biodegradation and biotoxicity. Applied

Microbiology and Biotechnology., 36: 689-696.


49

Wilcke W. (2000).Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soils a review Journal of

Plant Nutrition and Soil Science., 163: 229-248.

Wilds S. R. and Jones K. (1995). Polynuclear aromatic hydrocarbons in the United Kingdom

environment: a prelimary source inventory and budget. Environmental Pollution., 88: 91-108.

Williams S.T. and Davies F.L. (1965). Use of antibiotics for selective isolation and

enumeration of actinomycetes in soil. J. Gen. Microbiol., 38: 251-261.

Williams S.T. and Wellington E.M.H. (1982). Principals and problems of selective isolation

of microbes. Bioactive microbial products: Search and discovery. Academic Press. London:

9-26.

Wilson S. C. and Jones K. C. (1993). Bioremediation of soil contaminated with polynuclear

aromatics hydrocarbons (PAH): a review Environmental Pollution., 81: 229-249.

Annexes

ANNEXES

Annexes

ANNEXE I : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

1- MILIEU D’ISOLEMENT

• Milieu d’isolement de Pseudomonas fluorescent

King B

Polypeptone.......................................................................... 20 g

Glycérol ............................................................................. 10 ml

Phosphate bipotassique anhydre ........................................ 1,5 g

Sulfate de magnésium ........................................................ 1,5 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

Agar ..................................................................................... 15 g

pH = 7,2±0,2

• Milieu d’isolement des souches d’actinomycètes

AS1 (Antibiotic Selection One)

Bacto Yeast Extract................................................................ 1 g

Arginine ............................................................................. 0,2 g

Alanine ............................................................................... 0,2 g

Asparagine monohydrate ................................................... 0,5 g

Difco soluble starch ............................................................... 5 g

NaCl .................................................................................... 2,5 g

Sulfate de sodium ................................................................. 10 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

Agar ..................................................................................... 15 g

pH=7,0

Les antibiotiques

Pour 1 L de milieu AS1, on ajoute :

- 10 ml de Cycloheximide (0,02g dilué dans 10ml de DMSO) ;

- 10ml de Triméthoprime (0,05g dilué dans 10ml d’ED) ;

- 10 ml d’Acide nalidixique (0,05 g dilué dans 10 ml d’ED) ;

• Milieu d’isolement pour la flore totale cultivable

TSA (Tryptic Soy Agar)

Peptone de caséine ............................................................... 15 g

Annexes

Peptone de soja ...................................................................... 5 g

NaCl ....................................................................................... 5 g

CaCl2, 2H2O ...................................................................... 0,04 g

Agar...................................................................................... 15 g

Eau distillée .................................................................... 1000 ml

pH=7,2

• Milieu pour le test de résistance des souches

BN (Bouillon nutritif)

Extrait de levure .................................................................... 5 g

Peptone ................................................................................ 15 g

NaCl ..................................................................................... 15 g

Agar...................................................................................... 13 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH=7,3

2- MILIEU DE DENOMBREMENT

Gélose nutritive

Extrait de viande .................................................................... 3 g

Peptone .................................................................................. 5 g

NaCl ...................................................................................... 15g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH=7,3

3- MILIEU D’IDENTIFICATION DES SOUCHES

Eau peptonnée au rouge de phénol

Peptone ................................................................................ 10 g

NaCl ....................................................................................... 5 g

Eau peptonnée

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

NaOH ................................................................................. 80 ml

Indicateur coloré

Rouge de phénol .................................................................... 2 g

Annexes

Eau distillé stérile ............................................................. 950 ml

Eau peptonnée au rouge de phénol

Eau peptonnée ................................................................ 1000 ml

Rouge de phénol ................................................................ 12 ml

pH=7,5±0,2

• Milieu urée indole

L-tryptophane ...................................................................... 0,3 g

Phosphate monopotassique ................................................. 0,1 g

Phosphate dipotassique ....................................................... 0,1 g

Na Cl ...................................................................................... 5 g

Urée ........................................................................................ 2 g

Alcool 90° ....................................................................... 0,25 ml

Rouge de phénol 1% ....................................................... 0,25 ml

Eau distillée stérile ........................................................... 950 ml

pH=7,4±0,2

• Milieu de Simmons

Sulfate de magnésium ......................................................... 0,2 g

Phosphate monoammoniaque ................................................ 1 g

Phosphate bipotassique .......................................................... 1 g

Na Cl ...................................................................................... 5 g

Citrate de sodium ................................................................... 1 g

Bleu de bromothymol ........................................................ 0,08g

Agar...................................................................................... 15 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH=7,1±0,2

• Milieu mannitol-mobilité-nitrate

Hydrolysat trypsique de caséine .......................................... 10 g

Nitrate de potassium .............................................................. 1 g

Mannitol .............................................................................. 7,5 g

Rouge de phénol 10% ....................................................... 0,04 g

Agar..................................................................................... 3,5 g

Annexes

Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml

pH=7,6±0,2

• Milieu lysine fer

Peptone bactériologique ......................................................... 5 g

Extrait de levure ..................................................................... 3 g

Glucose .................................................................................. 1 g

L-lysine ................................................................................ 10 g

Citrate de fer ammoniacal ................................................... 0,5 g

Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,04 g

Pourpre de bromocrésol .................................................... 0,02 g

Gélose ............................................................................... 14,5 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH= 6,7 ±0,2

• Milieu Hajna-Kligler

Peptone ................................................................................. 15 g



Peptone pepsique de viande ................................................... 5 g

Na Cl ...................................................................................... 5 g

Sulfate ferreux ..................................................................... 0,2 g

Thiosulfate de sodium ......................................................... 0,3 g

Lactose ................................................................................. 10 g

Glucose ................................................................................... 1g

Rouge de phénol .............................................................. 0,24ml

Agar...................................................................................... 11 g


pH= 7,5±0,2

• Milieu ISP2


Extrait de Malt ..................................................................... 10 g

D glucose ............................................................................... 4 g

Agar...................................................................................... 20 g


pH = 7,3

Annexes

• Milieu ISP4

Amidon soluble .................................................................... 10 g

K2HPO4 .................................................................................. 1 g

Mg SO4, 7H2O ....................................................................... 4 g

(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g

Na Cl ....................................................................................... 1g

CaCO3 .................................................................................... 2 g

Solution saline 1 ................................................................... 1 ml

Agar...................................................................................... 20 g


pH = 7,0

• Milieu ISP5

Glycérol................................................................................ 10 g

L-aspargine ............................................................................ 1 g

K2HPO4 .................................................................................. 1 g

(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g

Na Cl ....................................................................................... 1g


Agar...................................................................................... 20 g


pH = 7,0

• Milieu Starch Casein agar

Amidon soluble .................................................................... 10 g

Caséine ................................................................................... 1 g

K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g

Agar...................................................................................... 15 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH = 7,0

• Milieu Sporulation agar



Annexes

Trypose .................................................................................. 2 g

Glucose ................................................................................ 10 g

Agar...................................................................................... 15 g

Eau distillée ................................................................... 1000 ml

pH = 7,2

• Milieu ISP6

Peptone ................................................................................. 15 g

Protéose peptone ................................................................... 5 g

Cittrate de fer ammoniacal .................................................. 0,5 g

Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,08 g

Extrait de levure ...................................................................... 1g

K2HPO4 .................................................................................. 1 g

Agar...................................................................................... 20 g


pH = 7,0

• Milieu ISP7

Glycérol................................................................................ 15 g

L-aspargine ............................................................................ 1 g

K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g

Na Cl .................................................................................... 0,5g

Fe2SO4 ............................................................................... 0,01 g

Agar...................................................................................... 20 g


pH = 7,2

• Milieu ISP9

(NH4)2SO4 ......................................................................... 2,64 g

K2HPO4 ............................................................................. 2,38 g

K2HPO4 ............................................................................. 5,65 g

Mg SO4.................................................................................... 1g


Agar...................................................................................... 20 g


pH= 6,8

Annexes

• Milieu CYD

Casamino acids ................................................................... 0,5 g

Extrait de levure ................................................................. 0,3 g

D-glucose ............................................................................ 0,4 g

K2HPO4 .................................................................................. 2 g

Mg SO4................................................................................... 1 g


Agar...................................................................................... 20 g


pH= 7,2

• Milieu de viande foie

Extrait de viande .................................................................. 10 g

Peptone ................................................................................. 20 g

Extrait de levure .................................................................. 10 g

Glucose .................................................................................. 2 g


Agar...................................................................................... 20 g


pH= 7,6

• Milieu mannitol-mobilité

Peptone ................................................................................. 20 g

Nitrate de potassium .............................................................. 1 g

Mannitol ................................................................................. 2 g

Rouge de phénol .............................................................. 40 mg

Agar........................................................................................ 4 g


pH= 8,1

• PBF (Phosphate Buffer Saline)

Na Cl ...................................................................................... 8 g

K Cl ..................................................................................... 0,2 g

Na2HPO4, 12H20 ............................................................... 1,44 g

K2HPO4 .......................................................................... 0,24 mg


Annexes

ANNEXE II : CONCENTRATION CORRESPONDANTE A CHACUN DES HAP

HAP Masse HAP (mg) Volume solvant (ml) Concentration

(mg/L) Naphtalène 100 25 4000

Acénaphtène 100 25 4000

Fluorène 100 25 4000

Phénanthrène 100 25 4000

Anthracène 100 25 4000

Fluoranthène 100 25 4000

Pyrène 100 25 4000 Benzo(a) anthracène 100 25 4000

[Σ8HAP] (mg/L ou ppm) 32 000

Annexes

ANNEXE III : PROTOCOLE DETAILLEE DE L’ANALYSE DES HAP DU SOL DE

TSIMIRORO PAR CPG

Etape 1 : Préparation du sol

Mélanger l’échantillon du sol avec du Na2SO4 et avec de l’étalon interne.

Etape 2 : Extraction du solvant par Soxhlet

Extraire à l’aide d’un ballon de 200 ml le mélange d’hexane/dichlorométhane (50/50)

par la méthode Soxhlet, une prise d’essai environ 2 g et attendre 8heures.

Extraction par Soxhlet

Etape 3 : Evaporation

Transvase le solvant dans un ballon de 250 ml en vue d’évaporation (30°C jusqu’à

environ 10 ml).

Etape 4 : Chromatographie sur colonne

Glisser un petit coton jusqu'à l'extrémité d'une colonne de purification. Remplir la

colonne de purification avec de l’alumine et de silicagel puis avec 1 cm de sulfate de sodium

anhydre. déposer 2 ml de la solution ainsi obtenue en éluant avec 30 ml d’hexane afin

d’obtenir la fraction aliphatique. La 2ème fraction s’obtient avec 40 ml de

hexane/dichlorométhane (90/10) pour la fraction aromatiques.

Annexes

Purification par colonne

Etape 5 : Concentration finale par soufflage à l’Azote

Souffler le tube contenant la fraction aromatique par N2 jusqu’à 0,5 ml.

Etape 6 : Injection sur la chromatographie en phase gazeuse

Régler l’appareil CPG puis injecter la solution concentrée afin de voir le

chromatogramme correspondant aux HAP.

Injection par CPG

Annexes

ANNEXE IV : DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES CAPABLES DE DEGRADER

LES HAP

Titre : Sélection et identification des souches telluriques impliquées dans la

dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)

Nom et Prénoms : RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha Adresse : LOT IVY 245 Ilanivato Ampasika Tel : +261 33 18 540 39 E-mail : [email protected] Nombre de page : 49 ; Nombre des tableaux : 13 ; Nombres des figures : 7 ; Nombres des photos : 2

RESUME Une collection de vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir des sols pollués

par les hydrocarbures dans un site industriel d’un grand gisement d’huile lourde de Tsimiroro dont quatre (4) Pseudomonas fluorescents, dix (10) actinomycètes et douze (12) flores totales cultivables. Ces souches ont été testées pour leurs capacités à développer en milieu de culture synthétique préalablement pollué par une quantité connue de mélange de HAP (Σ8HAP) à différentes concentrations (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ; 1500 mg/L). La croissance microbienne a été suivie pendant soixante-cinq (65) jours selon la méthode de Nombre les Plus Probables (NPP). Parmi toutes les souches, seulement deux isolats A1 et F2 ont la capacité à résister et à développer en milieu contaminé par les HAP d’intérêt à une teneur de 1500 mg/L. Une augmentation de la population microbienne a été observée au cours de cette expérience. L’étude des caractéristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces deux souches ont permis de rapprocher l’isolat A1 à l’espèce Streptomyces sp. et l’isolat F2 à l’espèce Bacillus simplex. Le dosage des HAP résiduels dans le milieu de culture mélangé avec les HAP à la concentration de 1500 mg/L a montré que ces deux souches peuvent dégrader assez rapidement les HAP légers composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (naphtalène, l’acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène et l’antrhacène) que les trois HAP lourds de quatre (4) cycles aromatiques : le fluoranthène, le pyrène et le benzo(a)anthracène.

Mots-clés : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques, Microorganismes telluriques, Bioremédiation, Identification.

ABSTRACT

A collection of twenty-six (26) microbial strains were isolated from polluted soil by the hydrocarbons in an industrial site of a large heavy oil gisement of Tsimiroro including four (4) fluorescent Pseudomonas, ten (10) actinomycetes and twelve (12) total cultivable strains. These strains were tested for their ability to grow in synthetic culture media previously contaminated by a mixture of PAH (Σ8PAH) with different concentrations (250 mg/L; 500 mg/L; 1000 mg/L 1500 mg/L). The microbial growth was evaluated during sixty five (65) days according to the More Probable Number Method (MPN). Among all strains, only two isolates A1 and F2 were resistant and developed on media contaminated by the interest PAH at 1500 mg/L. An increase of microbial population was observed during this experiment. Cultural, morphological, physiological and biochemical characteristics of the two strains indicated that the isolate A1 was closely related to Streptomyces sp. and the isolate F2 to Bacillus simplex. The quantification of residual PAH in the culture media with PAH at 1500 mg/l showed that these two strains may degrade quite rapidly lighter PAHs compounds two (2) and three (3) aromatic cycles (naphtalene, acenaphtene, fluorene, phenanthrene and anthracene) than the three PAH compounds four (4) aromatic cycles : fluoranthene, pyrene and benzo(a)anthracene.

Key words : Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Telluric microorganisms, Bioremediation, Identification.

Encadreur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, Maître de Recherches et Chef de Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME)

mailto:[email protected]

Documents

SELECTION ET IDENTIFICATION DES SOUCHES TELLURIQUES