Isolement des bactéries telluriques résistantes aux effets de salinité

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS

DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES

Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER Académique

Domaine : Sciences de la nature et de la vie

Filière : Biologie

Spécialité : Microbiologie appliquée

Présenté par : Melle SOBTI Sarah

Thème

Soutenu publiquement le : /06/2013

Devant le jury :

OULD EL-HADJ Med Didi (Professeur) Président UKM Ouargla HAMDI- AISSA Baelhadj (Professeur) Encadreurs UKM Ouargla Mlle BOUDERHEM Amel (MAA) Co-encadreurs UKM Ouargla Mlle OUSTANI Mabrouka (MAA) Examinatrice UKM Ouargla

Année universitaire : 2012/2013

Isolement des bactéries telluriques résistantes aux effets de salinité

Je dédie l’apanage de cet écrit : Aux plus chères à mon

cœur et lumière de mon âme, mes parents, que je profite pour

les remercier pour tout :

A mon unique sœur

A mon unique frère

Aux deux mes grandes familles :

A mes chères ami(e)s : RAOUF,AMI BOUZID, SOUMIA, AFAF

NIDHAL, AMEL, MERIEM, DANIA, HOUDA ET MOUNIRA

A tous les étudiants de la promotion 2013 de la

Microbiologie Appliquée.

Dédicace

Tout d'abord nous remercions le bon tout puissant de la bonne santé, la

volonté et la patience qu'il nous a donné tout le long de la période de nos études.

Nous exprimons nos profondes reconnaissances et gratitude à toutes les

personnes qui ont apporté leur aimable contribution à ce travail par leurs remarques,

leurs conseils, leurs encouragements et leurs compétences et en particulier :

Mr HAMDI-AISSA, mon encadreur, non seulement pour l’aide très

précieuse qu’il m’apporté, mais aussi pour son enthousiasme communicatif, sa patience

et sa totale disponibilité pour l’encadrement de ce travail.

M elle AMEL BOUDERHAM, Co- promoteur de ce travail, pour m’avoir

guidées et soutenues.

Mr Med Didi pour l'honneur qu'il nous a fait en président ce jury

Melle OUSTANI MABROUKA pour avoir accepté l'évaluation de ce mémoire et d'en

être l’examinatrice.

Nos remerciements vont également à Mr BR.RAOUF, Mme KASSI, Melle SALHI,

Mme AMINATA et Mr KARABI pour leurs aides, qu’ils nous ont apportées

Je remercie tous les travailleurs de laboratoire pédagogique de la faculté des

sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers sans

exception.

Enfin je remercie toutes les personnes qui ’m’ont aidé, de près ou de loin

SOMMAIRE

Table des matières

INTRODUCTION………………………………………………………………1

Partie UNE : étude bibliographique

Chapitre I :

I- La vie tellurique…………………………………………...............................3

I-1-La diversité microbienne de sol…………………………………………......3

I-2 les microorganismes du sol et les cycles biogéochimiques………………….5

2- les interactions plantes-communautés microbienne de rhizosphère………….8

2-1- la rhizosphère……………………………………………………………….8

2-2- La diversité de rhizobium............................................................................9

2-3- Etablissement des symbioses………………………………………………..9

2-4- La spécificité symbiotique………………………………………………….13

3- Effet de la salinité sur le comportement des isolats…………………………...14

Partie DEUX : Matériels et Méthodes

1-1 Choix du site expérimental………………………………………………….15

1-2 Matériel végétale……………………………………………………………16

1-3 Milieu d’étude ………………………………………………………………16

1.3.1 Milieu d’isolement…………………………………………………….16

1.3.2 Stérilisation…………………………………………………………….16

1-4 Méthodes

1.4.1 Technique de préparation et conservation des nodules…………………17

1.4.2 Isolement des souches de rizobia à partir des nodules………………….18

1.4.3 Tests de la tolérance de sel et d’effectivité……………………………...20

SOMMAIRE

1.4.4 Test de nodulation en pots……………………………………………….20

1.4.5 Stérilisation des graines…………………………………………………...21

1.4.6 Solution nutritive…………………………………………………….……21

1.4.7 Germination et inoculation………………………………………………….21

1.4.8 Paramètres à mesurer……………………………………………………....23

Partie Troisième: Résultats et discussion

Chapitre III: Résultats

I Caractéristiques morphologiques, culturaux et physiologiques des isolats

I .1 Résultats de l’isolement des bactéries à partir des nodules (1ére étape)…24

I.1.1 Croissance sur YMA………………………………………………………….24

I.1.2 Croissance sur les différents milieux de cultures utilisés………………….....25

II Test de tolérance de sel (2éme étape)…………………………………………….30

III Test de nodulation et effet des isolats sur la luzerne………………………….33

Chapitre IV : Discussion

Conclusion générale…………………………………………………………….38

ANNEXE…………………………………………………………………………..41

Référence bibliographique

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES FIGURES

N° de figure

Titre de figure N° page

01 Schéma du cycle de carbone

02 Schéma du cycle d’azote

03 Schéma du phosphate 04 Section d’une racine montrent de la structure de la rhizosphère

05 Etablissement symbioses rhizobiennes 06 Les nodules fixateurs d’azote chez les plantes

07 Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place d’une association symbiotique fixatrice de l’azote

08 Racine en coupe longitudinale montrent un nodule fonctionnaire

09 Schéma montrent nombreux bactéroides dans une cellule d’une nodosité 10 Coupe longitudinale schématique d’une nodosité de type indéterminé

11 Situation de site expérimental dans l’exploitation d’université Ouargla

12 Collecte des nodules 13 Rinçages des racines et nodules

14 Etape de stérilisation des nodules 15 Broyage des nodules jusqu’à l’obtention d’un aspect laiteux

16 Conservation des nodules 17 Exemple des souches rhizobiums sp a différent caractères morphologique

18 Exemple de rhizobium sp (bâtonnets Gram négative)

19 Aspect des colonies dans YEM+Rouge Congo 20 Aspect des colonies dans YEM+Bleu bromoythol

21 Cinétique de croissance des souches isolées pour différentes concentrations en NaCl. 22 Les deux formes que prends le nodule

N° de

tableau

Titre de TABLEAU N° page

01 Listes de quelques microorganismes utiles vivants dans le sol

02 Exemples d’association entre rhizobium et légumineuses 03 Tableau schématiques de quelques effets de l’environnement sur la physiologie des

nodules fixant l’azote

04 Testes d’efficacités des souches de rhizobiums sp sur la luzerne en condition salin 05 Critères et méthodes de calcul pour évaluer l’indice nodulaire

06 Résumé des caractères culturaux des 7 souches après l’observation à l’œil nu 07 Résumé des caractères morphologiques des 7 souches après microscope

08 Caractéristiques morphologiques nodulaire observés après l’inoculation des souches sélectionnées dans les pots

09 Solution de Hoagland et Arnon (1938)

INTRODUCTION GENERALE

1

Dans les régions arides et semi-arides, notamment autour de cuvette

d’Ouargla, la salinisation des sols constitue l’un des facteurs abiotiques majeurs

qui réduit le rendement agricole de plusieurs cultures (Daoud et Halitim, 1994).

L’importance des légumineuses dans l’agriculture est particulièrement liée à

leur capacité à fixer l’azote dans leurs nodosités. Cependant, des facteurs de

l’environnement tels que la salinité peuvent avoir un effet négatif sur le

rhizobium, sur la légumineuse hôte ou sur leur relation symbiotique.

La tolérance des végétaux aux sels notamment la famille légumineuse joue un

rôle important dans le maintien de la productivité en agriculture, cette tolérance

représente un phénomène complexe qui implique des particularités morphologique et

développementales avec des mécanismes physiologique et biochimiques variés.

Les communautés microbiennes telluriques, qui jouent un rôle primordial dans

les cycles biogéochimiques du carbone, de l’azote et d’autres éléments, exercent

également des effets bénéfiques ou délétères sur la croissance et la santé des plantes.

Parmi les éléments qui peuvent contribuer à augmenter la production végétale et

le rendement chez les légumineuses, la mise à profit de la symbiose légumineuse-

Rhizobium à travers l’apport d’inoculum. (Claude et al., 2008)

De nombreuses recherches ont été effectuées sur le problème de l’effet de

stress salin sur les caractères phénotypiques et l’activité biologique des

microorganismes telluriques, en particulier la famille des Rhizobiaceae (Kassem et

al., 1984 ; N’deye Fatou Diaw, 1997 ; Berraho et al., 2003 ; Ibriz.M et al., 2004 ;

Fatma Lazrek, 2008 ; Tatiana, 2008 ; Mohamed-Rabie, 2011). C’est dans ce contexte

que s’inscrit notre travail de recherche qui a pour objectifs :

- la caractérisation phénotypiques des souches de rhizobiums isolées dans le sol

de la rhizosphère de Medicago sativa (Alfalfa) dans la région de Ouargla (au

niveau de l’exploitation du l’université)

- déterminer l’effet de la salinité sur la croissance des souches isolées à partir

de Medicago sativa

- déterminer l’infectivité (aptitude à noduler) et l’efficience des souches testées.

Notre travail se structure en trois parties :

INTRODUCTION GENERALE

2

Première partie :Synthèse bibliographique comporte trois chapitres :

Chapitre I : Description de la vie tellurique, afin de déterminer la diversité

microbienne de sol et leur rôle dans les cycles biogéochimiques.

Chapitre II : les interactions plantes-communautés microbiennes de la rhizosphère ;

afin d’avoir l’importance de la relation symbiotique entre plantes /Rhizobiums.

Chapitre III :Effet de la salinité sur le comportement des isolats, afin de déterminer :

-l’effet de stress salin sur la croissance des souches isolées (Rhizobium) ;

- l’infectivité (aptitude à noduler) et l’efficience des souches.

Deuxième partie : nous présenterons les matériaux est les méthodologies de

travail.

Troisième partie : sera consacrée à l’interprétation et la discussion des résultats

obtenus.

En fin une conclusion générale est établie pour ressortir l’apport de notre approche.

Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

3

1. La vie tellurique

Le réseau trophique du sol est fondamentalement la communauté des

organismes qui vivent dans le sol. Chaque champ agricole, forêt, prairie ou pâturage

possède son propre réseau trophique avec un ensemble unique d’organismes du sol.

Le sol est un milieu oligotrophe ,la plus part des microorganismes telluriques

(algues, protozoaires, champignons, bactéries) sont impliqués dans de nombreux

processus biogéochimiques (A.richaume et al., 2006). La communauté microbienne

tellurique, qui joue un rôle primordial dans les cycles biogéochimiques du carbone, de

l’azote et d’autres élément, exercent également des effets bénéfiques ou délétères sur

la croissance et la santé des plantes.

1.1. La diversité microbienne de sol

Il existe une grande diversité des communautés microbiennes dans le sol tant

du point du vue de la diversité taxonomique que du point de vue des fonctions. En

effet, il est estimé, par exemple, qu’un gramme de sol contient environ 1010 à 1011

bactéries (Horner-Devine et al. 2003), dont 6000 à 50000 espèces de bactéries et

plus de 200 mètres d’hyphes de champignons (Curtis et al. 2002).

Les agents de la microflore du sol se divisent en quatre groupes : les algues,

les champignons, les bactéries filamenteuses ou actinomycètes et les bactéries

(Tableau 1).

Certains auteurs incluent également dans la microflore du sol les protozoaires et

les virus. (Claude et al., 2008)

1.1.1. Les algues n’existent qu’en surface de sol, car elle besoin le soleil pour

leur photosynthèse, leur activité est limitée pendant la période où le sol est

humide. Malgré leur faible nombre (cent mille gramme par de sol), elles

ont un rôle important comme source de matière organique et comme

fixatrice d’azote en symbiose avec des algues blues.

1.1.2. Les champignons forment un règne est à eux tous seuls, leur importance

est telle dans la fertilisation de sol. Ainsi, on peut avoir d’une à deux

tonnes de champignons par hectare de sol agricole. Ils représentent les

deux tiers de la biomasse microbienne du sol. Leurs rôles sont variés ;


4

-leur rôle le plus déterminant vient du fait qu’ils sont les seuls organismes

sur la terre, à part quelques rares bactéries, à être capable de décomposer

la lignine des plantes (est la principale source d’humus dans le sol)

-Pour effectuer ce travail fondamental, les champignons ont besoin d’un

sol aéré, car tous les champignons, sauf ceux très particuliers du rumen de

bovins, ont besoins d’oxygéné pour vivre. C’est la raison pour laquelle la

végétation des marais, qui se décompose en absence d’air au fond de

l’eau, donne naissance à la tourbe et non à l’humus.

1.1.3. Les actinomycètes sont un peu intermédiaires entre les champignons et les

bactéries. De ces premiers, ils ont l’aspect filamenteux et la capacité de

sécréter d’antibiotiques ; des secondes, ils ont la possibilité d’effectuer de

très nombreuses réactions biochimiques. Leur nombre est d’un à cent

millions par gramme de terre, et leur poids total est d’environ une tonne

par hectare.

1.1.4. Les bactéries nous arrivons enfin au dernier groupe de microorganismes

du sol : les bactéries. C’est le groupe le plus nombreux et le plus varié,

puisque leur densité peut s’élever de dix millions à un milliard par gramme

de sol. Du fait de leur petite taille, leur poids reste inférieur à une tonne par

hectare de sol. Ce qui donne aux bactéries une place importante dans le

sol, c’est leur extraordinaire variabilité biochimique qui leur permet de

transformer toutes les substances du sol et de les faire entrer dans le monde

vivant. (Claude et al., 2008)


5

Tableau1 : Liste de quelques micro-organismes utiles vivants dans le sol (http://symbiotech.over-blog.com/pages/Les_microorganismes_utiles-5459433.html)

Microorganismes Leurs Rôle

Actinomycètes

groupe de bactéries appartenant à la flore du sol, qui

jouent un rôle important dans la décomposition des

matières organiques.

Azotobacter

bactérie aérobie stricte et libre dans le sol qui fixe l’azote

atmosphérique chez la plupart des végétaux et le

transforme en ammonium (20 à 40 kilos par hectare)

Pseudomonas spp

bactérie aérobie stricte et libre dans le sol. C’est une

bactérie rhizosphériquephytoprotectrice des racines

(PGPR). Elle crée un bio film adhésif et protecteur

(mucilage microbien). Elle a également la capacité de

solubiliser le fer.

Rhizobium

bactérie aérobie stricte qui fixe l’azote atmosphérique en

association avec des plantes hôtes (légumineuses) et le

transforme en ammonium (20 à 40 kilos par hectare).

Mycorhizes (glomus

Intraradices et mosseae)

est une association entre les racines des plantes et des

champignons. Elle existe chez 95% de toutes les plantes à

fleurs et à graines. Dans la nature, elle est essentielle à la

survie des deux partenaires. Chez la plante, elle augmente

sa capacité d'absorber les minéraux essentiels et sa

résistance aux maladies des racines. Et elle permet au

champignon de tirer les glucides directement de son

partenaire, sans la compétition des autres

microorganismes.

1.2. Les microorganismes du sol et les cycles biogéochimiques

Afin de bien illustrer ces capacités biochimiques dans le monde microbien,

nous allons décrire les cycles de quelques éléments entrants dans la matière vivant.

http://symbiotech.over-blog.com/pages/Les_microorganismes_utiles-5459433.html


6

1.2.1. Cycle de carbone

Cet élément fondamental (figure 1) qui constitue près de la moitié des corps

vivants.

Figure 1 : Schéma du cycle de carbone.

Source : http://www2.ustboniface.ca/cusb/abernier/Biologie/Ecologie/pg3.htm.2007

1.2.2. Cycle d’azote

Le cycle montre le rôle des microorganismes dans la circulation de la matière

de terre dans le monde vivant (figure2).


7

Figure 2 : Schéma du cycle de l’azote (http://microbiosol.fr.gd/Cycle-Azote.htm)

1.2.3. Cycle de phosphore

Le troisième cycle que nous décrirons est dominé par les champignons. Il

s’agit de celui du phosphore (figure 3).

Hu humification par les

Mycorhize champignons

RétrogradationMinéralisation

Argilo-humique microbienne

Figure 3 Schéma du cycle du phosphate (Claude et al, 2008)

Ces trois cycles biogéochimiques suffisent pour nous montrer le rôle clef joué par ces

microorganismes dans ces cycles. On comprend alors l’intérêt pour l’agriculture de

favoriser les cycles microbiens pour assurer une alimentation équilibrée à ses plantes.

Plante

PO4 ion phosphate

Humus

60%

Phosphate de la roche 40%

http://microbiosol.fr.gd/Cycle-Azote.htm


8

2. Les interactions plantes-communautés microbiennes de la

rhizosphère

Les interactions plante-communautés microbiennes de la rhizosphère pourront

être étudiées avec une vision plus globale intégrant tous les partenaires de

l’interaction avec leur diversité.

2.1. La rhizosphère

Le terme rhizosphère a été décrit pour la première fois en 1904 par un

chercheur allemand Lorenz Hiltner, est le volume de sol entourant les racines et

influencé par les matériaux libérés par ces mêmes racines (figure 4). La surface des

racines des plantes, ce qu’on appelle le rhizoplane (Prescott, 2007).

Elle est caractérisée par une forte activité microbienne due au renouvellement

des composés organiques assimilables issus des exsudats racinaires, des mucilages et

des cellules épidermiques mortes. L’interaction plante-microorganismes dans la

rhizosphère est un processus clé qui joue un rôle primordial dans le recyclage du

carbone dans la rhizosphère et notamment dans la croissance et la santé des plantes.

(G. Govaert et al., 2010).

Figure 4 : Section d’une racine montrant la structure de la rhizosphère

(http://www.nature.com/scitable/knowledge/library/the-rhizosphere-roots-soil-and-67500617)

http://www.nature.com/scitable/knowledge/library/the-rhizosphere-roots-soil-and-67500617


9

2.2. La diversité de rhizobium

Les Rhizobium sont des bactéries du sol, en forme de bâtonnets et non

sporulantes, appartenant à la famille des Rhizobiaceae (Jordan, 1962). Ces bactéries

présentent la capacité de former une symbiose avec des plantes de la famille des

légumineuses (pois, haricot, luzerne, etc.). En condition de carence en azote, les

Rhizobium induisent la formation de nodules au niveau des racines des légumineuses.

(Prescott, 2007). Ces nodules sont de véritables organes d’échange métabolique entre

les bactéries et les plantes. Cette symbiose va permettre aux bactéries de bénéficier

d’un micro habitat exceptionnellement favorable au niveau de l’hôte leur procurant un

apport en substrats carbonés issus de la photosynthèse. En se référant à la

classification de plusieurs auteurs, il y a différents genres de la famille des

Rhizobiaceae (Young 2001, Yong et al., 2003, Willems 2006).

Tableau 2 : Exemples d’associations entre rhizobia et légumineuses

(Sawada et al., 2003)

2.3. Établissement des symbioses rhizobiennes

Le genre Rhizobium est un membre remarquable de la communauté de la

rhizosphére. Cette bactérie peut aussi établir une association symbiotique avec

légumineuses et fixer l’azote au bénéfice de la plante. Rhizobium infecte des

légumineuses spécifiques et y forment des nodules (figure 7). La symbiose entre les


10

espèces Rhizobium et les plantes s’effectue avec un hôte spécifique tel que le cas de

Sinorhizobium meliloti et la luzerne. Ce processus de symbiose implique des

molécules secrétées par les plantes. Ces molécules s’appellent lectines et permettant la

reconnaissance de l’hôte et la fixation de l’espèce appropriée de Rhizobium sur des

sites spécifiques des radicules (Prescott, 1995). Ces lectines produites par les hôtes

permettent l’agglomération des Rhizobium (Prescott, 2007). De plus, les Rhizobium

libèrent des lipopolysaccharides qui pénètrent dans le poil absorbant et dirigent la

formation du filament infectieux. Lors du contact de la bactérie avec la racine, le poil

aura une forme de crosse et, par conséquent, la bactérie y pénètre et induit la

formation d’un filament infectieux par la plante qui s’allonge dans la radicule vers

la racine. Le Rhizobium se propage dans le filament infectieux et infecte les

cellules adjacentes de la racine qui subiront par la suite des divisions successives et

les nodules apparaissent. Les bactéries se multiplient dans les cellules infectées

et se développent en ramifications gonflées, nommées bactéroïdes, qui sont

responsables de réduire l’azote atmosphérique en ammoniaque. En plus, il y a la

production de leghémoglobine et de la noduline dans les bactéroïdes. La noduline

formée cause l’élargissement du cortex cellulaire tandis que la leghémoglobine est à

l’origine de la couleur rose chez les nodules et permet la régulation de

l’oxygène chez les bactéroïdes (Oldroyed et al., 2011 ; Prescott 2007).


11

Figure 5 : établissement des symbioses rhizobiennes

source :http://permaculturetokyo.blogspot.com/2009/02/rhizobium-symbiosis-with-woody-plants.html

Figure 6 : Les nodules fixateurs d’azote chez les plantes

A-C. La symbiose fixatrice d’azote Rhizobium-Légumineuse, exemple de

Medicagosativa et son symbionte S. meliloti. A. Tige et fleur de M. sativa. B. Nodules

entiers. C. Section longitudinale d’un nodule.

http://permaculturetokyo.blogspot.com/2009/02/rhizobium-symbiosis-with-woody-plants.html


12

La formation de nodules radiculaire par les rhizobiums :

Figure 7: Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place

d'une association symbiotique fixatrice de l'azote (Journet ; 2004).

Figure 8: Racine en coupe longitudinale montrant un nodule fonctionnel

Source : http://www.perrin33.com/microbiologie/azote/entree-n_3.php


13

Figure 9 : Schéma montrant nombreux bactéroïdes dans une cellule d'une nodosité

racinaire. Source :http://biosol.esitpa.org/liens/rhizo2003/nodulation.htm

Figure 10: Coupe longitudinale schématique d’une nodosité de type indéterminé (A)

et de type déterminé (B). I = zone méristématique, Il = zone d’infection, II-III = inter-zone, III = zone fixatrice d’azote. IV = zone de sénescence. Ce = cortex externe, E =

endoderme, Ci = cortex interne, FV = faisceau vasculaire, CF = cortex faisceau TC =Tissu conducteur, CC= Cortex conducteur (M.G. Jean-François ; 1997)

2.4. La spécificité symbiotique

L’une des caractéristiques majeures des associations rhizobium-légumineuse

est leur spécificité d’hôte. En effet, une espèce de rhizobium donnée n’est

capable, en général, d’établir une relation symbiotique efficace qu’avec un nombre

limité de partenaires végétaux (tableau 3). De même une espèce de légumineuse ne

peut être nodulée que par un certain nombre d’espèces de rhizobium.

(G.H.William, 2003).

Cette spécificité serait contrôlée par les lectines de l'hôte qui reconnaissent

certains glucides des capsules bactériennes. Les lipopolysaccahrides sont un des


14

composés minoritaires de la membrane bactérienne externe qui jouent aussi un rôle

important dans la spécificité rhizobiums légumineuses (Prescott, 1997)

3. Effet de la salinité sur le comportement des isolats

Les principaux facteurs limitant l'activité biologique dans les sols sont le

déficit hydrique, la salinité, les températures élevées, les pH extrêmes et les carences

en éléments nutritionnels. Les interactions fréquentes entre ces différentes contraintes

affectent la croissance et la capacité de survie des micro-organismes dans les sols

arides. (E.Cacciari et al., 1998 ).

La salinisation des sols est le processus d'accumulation de sels à la surface

du sol et dans la zone racinaire, qui occasionne des effets nocifs sur les végétaux et le

sol; il s’ensuit une diminution des rendements et, à terme, une stérilisation du sol. La

salinisation se produit généralement lorsque la quantité d’eau perdue par le sol par

évapotranspiration dépasse celle provenant de l’infiltration des précipitations. Pour

cette raison, nous avons étudié le facteur d salinité parmi ces facteurs abiotique.

(P.Sylvie van, 2009).

Afin de caractériser les différences de comportement physiologiques et

microbiologique des souches de rhizobiums isolées dans le sol de la rhizosphère de la

plante M.sativa,L.

Tableau 3: tableau schématique de quelques effets de l’enivrement sur la physiologie

des nodules fixant l’azote. (H.Zahran et al., 1998)

Facteurs Effets

Températures Sur la fixation de l’azote et /ou son assimilation

Diffusion des gaz

Stress hydrique Effet direct sur les nodules incluant une

réduction de la porosité affectant l’assimilation

de l’oxygène.

Salinité Réduction de l’activité de la nitrogénase.

L’inhibition de la synthèse leghémoglobine.

L’azote combine Inhibition par les nitrites formes par la réduction

des nitrates dans les bacteroides.

Chapitre II: Matériel et Méthodes

15

1. Choix du site expérimental

Pour des raisons pratiques nous avons réalisé notre expérimentation au

niveau de l’exploitation agricole du département d’agronomie de l’université

d’Ouargla (ex. ITAS) (31° 57’ de latitude Nord et 5° 24’ de longitude Est) (figure 11).

Le site a été choisi en fonction de l'objectif de notre sujet, visant la présence

des plantes légumineuse, telle que Medicago sative et un sol salé. L'exploitation se

présente sous la forme d'un glacis d'une grande homogénéité topographique. Le sol

composé est à dominance texturale sableuse et sableu-limoneuse, avec une structure

particulaire, pH légèrement basique et une fore salinité (conductivité électrique

élevée) (DOUADI et SAHRAOUI, 1991 ; LAHMAR, 1992).

Figure 11 : situation du site expérimentale dans l’exploitation d’université d’Ouargla (EX : I.T.A.S) (Google earth., 2013)


16

1.1. Matériel végétal

Les souches utilisées dans ce travail sont isolées à partir des nodosités

prélevées sur des légumineuses, en particulier le Medicago sativa L. (la luzerne). Il

s’agit d’une plante vivace fourragère originaire d'Asie ; elle appartient à la famille des

papilionacées ou légumineuses, l'appelle encore alfalfa. Elle est tétraploïde (2n = 4x =

32). La luzerne est appréciée comme culture fourragère pour sa valeur nutritive et sa

grande aire d'adaptation, mais elle joue également un rôle important dans les

rotations, car elle améliore la structure du sol, l'enrichit en azote et facilite la lutte

contre les organismes nuisibles. (K.A.Lesins et al., 1979)

1.2. Milieux d’étude

1.3.1. Milieu d’isolement

- Milieu YEM (Yeast Extract Mannitol)

Le milieu nutritif agar YEM est un milieu de culture solide, mis au point par

Vincent (1970). Ce milieu est utilisé pour isoler et conserver les souches de bactéries

fixatrices d’azote dans les nodules.

-Milieu YMB (Yeast Mannitol Broth):

Bouillon de culture qui possèdent la même fonction, mais ces milieux ne

contiennent pas d'agar-agar, ils sont donc totalement liquides.

La composition de chaque milieu est donnée en (annexe 1).

1.3.2. Stérilisation

Tous les milieux, dont le pH a été neutralisé par NaOH N et du HCl M

suivant le cas. Les milieux sont stérilisés à 121°C pendant 20 minutes dans un

autoclave. La verrerie est stérilisée à 180°C dans une étuve universelle pendant 30

minutes. Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont

effectuées dans des conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme du bec

Bunsen et sous hotte à flux laminaire.


17

1.4. Méthodes

1.4.1. Technique de préparation et de conservation des nodules

La récolte des nodules s’effectue selon les techniques préconisées par

Vincent (1970) et Somasegaran et Hoben (1985). Il s’agit de creuser environ 15cm

autour de la plante et 20cm dans le sol pour extraire la plante et son appareil

racinaire. Manuellement, on se débarrasse de la terre au niveau des racines sans

toutefois endommager les nodules. Les racines avec leurs nodules sont lavées

délicatement des restes de terre à l’eau de robinet. Les nodules peuvent être conservés

pendant plus d’un an au réfrigérateur à +4°C. Les nodosités d’une même plante

doivent être mises dans un même tube.

Figure12 : Collecte des nodules (Photo D.P. Beck, 1993)

Figure 13 : Rinçage des racines et nodules (Photo D.P. Beck, 1993)


18

1.4.2. Isolement des souches de rizobia à partir des nodules

1.4.2.1. Stérilisation des nodules

La technique classique d’isolement des souches de Rhizobium décrite par

Cleyet-Marel (1989) a été adoptée. Les nodules roses (la pigmentation rose révèle

la présence de la léghémoglobine), récupérés à partir des racines de la luzerne sont

stérilisés superficiellement par immersion dans l’éthanol à 95° durant 30 secondes,

puis dans une solution de chlorure mercurique HgCl2 à 0,1 % ou l’eau javel pendant

deux minutes pour éliminer le plus de bactéries possibles de la rhizosphère. Ensuite

sont rincés 10 fois à l’eau distillée stérile.

Figure 14: étapes de stérilisation les nodules

Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont

effectuées dans des conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme du bec

Bunsen et sous hotte à flux laminaire.

1.4.2.2. Technique d’isolement

On citer deux techniques pour isolé les rhizobia à partir les nodules :

a) Broyage des nodosités et ensemencement du broyat

Cinq à six nodosités sont broyées dans 1 ml d’eau physiologique stérile, il

faut bien écraser les nodules afin d’obtenir une suspension laiteuse.

Une dilution de 10 -1 du broyat obtenu est réalisée, en mettant dans un

tube 0,1 ml de broyat et 0,9 ml d’eau physiologique stérile. On dépose 0,5 ml de

la dilution précédente sur des boites de Pétri contenant le milieu Y.E.M. puis on étale

la goutte déposée.


19

Figure 15 : Broyage des nodules jusqu'à l’obtention d'un aspect laiteux

b) Piquer au centre des nodules

La deuxième technique consiste à casser les nodules en deux et à piquer le

centre du nodule à l'aide d'un filament de platine puis à ensemencer des boîtes de

pétri. La deuxième technique a l'avantage par rapport à la première de permettre une

purification beaucoup plus rapide et c'est la méthode qu'on a utilisée.

La suspension obtenue, est étalée par épuisement sur boîte de Pétri contenant le

milieu YEM gélosé au Rouge Congo à la concentration finale de 0.025g/l. Notons

que le rouge Congo est utilisé afin d’éviter toute contamination par les bactéries

(Actinomycètes, Agrobacter, …). Les colonies apparaissent après 3 à 7 jours

d’incubation à 28°C dans des conditions aérobies. La pureté des souches est

vérifiée par repiquage successif sur milieu YEM gélosé au rouge

Congo.

L’identification des souches de Rhizobium a été faite par un examen

macroscopique (caractères culturaux sur milieu YEM gélosé au rouge

Congo) et par une observation microscopique (coloration de Gram et

examen à l’état frais des cellules vivantes), et d’autres tests biochimiques.

1.4.2.3. Conservation des souches

La technique de conservation utilisée est celle décrite par Vincent (1970).

Le milieu YMA est tamponné avec 3 g /l de CaCo3 et réparti dans des tubes. Après

autoclavage à 120° C pendant 20 minutes, les tubes sont inclinés.

Après refroidissement, des stries de la souche à conserver sont effectuées sur

la surface de la gélose inclinée. La technique permet une conservation de 6 à

12 mois à 4° C (Vincent, 1970).


20

Figure 16: Conservation des nodules (Photo D.P. Beck, 1993)

NB : Sur chaque flacon sont mentionnées le nom de la plante, date et lieu de collecte,

et la date de conservation.

1.4.3. Tests de la tolérance de sel et d’effectivité

Le tests de tolérance au sel ont été réalisés sur 7 souches de rhizobium

sélectionnées, les cinétiques de croissance sont établies par la mesure de l'évolution

de la densité optique (spectrophotomètre à 600 nm) des cultures dans le milieu

YEM liquide (Vincent, 1970), pour des concentrations salines allant de 0,8,12

et16g/1 de NaCl. Après 7 jours d'incubation à 28 °C sous agitation à 250 tr/min

(incubateur agitateur). La croissance bactérienne est comparée au témoin sans NaCl.

L'étude a été pour suivie par mesure périodique.

L'efficience est la capacité de réduire efficacement l'azote atmosphérique en

ammonium. Différentes techniques d'estimation de l'efficience sont disponibles.

La méthode qui nous avons été l’utilisé, elle est consisté à déterminer le

poids sec de la partie végétative des plantes inoculées par la souche à tester

comparativement au témoin non inoculé. L'effectivité des souches les plus tolérantes

au sel a été évaluée sur plante entière (5 plantes pour chaque souche et 2

répétitions par plante) .(vincent,1970)

1.4.4. Test de nodulation en pots

Tous les isolats doivent être testés et confirmés avant de les inoculer. Le test

de nodulation est la capacité et l’aptitude des isolats à former des nodules avec la

plante-hôte dans des conditions bactériologiquement contrôlées.


21

(Vincent., 1970, Beck et al., 1993). Ce test consiste en l’inoculation des graines de

la plante hôte Médicago sative L. avec les différents isolats obtenus.

1.4.5. Stérilisation des graines

Des graines de luzerne, ont été désinfectées en surface (alcool éthylique

95%, 2 min, hypochlorite de sodium NaCl à 5%, 10 min; cinq rinçages ont été

effectués avec de l’eau distillée stérile (Vincent, 1970).

1.4.6. Solution nutritive

La solution nutritive stérile (sans azote) est composée comme suit (mg/L

d’eau distillée) : 174 mg de K2HPO4, 136 mg KH2PO4, 5 mg de citrate de fer, 493 mg

MgSO4 .7H2O, 147 mg CaCl2.2H2O, et 1 ml de la solution de Hoagland (Annex 1).

1.4.7. Germination et inoculation

Des essais de culture ont été réalisés dans des pots de (15 cm de

diamètre) remplis d’un sole stérile. Les graines de luzerne désinfectées en surface

ont été semées et pré-germées durant 48 h, puis on a procédé à un éclaircissage de

façon à garder 5 plants/pot. Les différents traitements sont décrits au Tableau 4.

Tous les essais ont été conduits en 2 répétitions.

Les racines des plantes sont inoculées avec une dose de (10 8 bactéries/ml)

provenant d’une culture en phase exponentielle de croissance sur milieu YMB/plante.

Pour un volume de 5 ml/plante pour garder une certaine humidité et diminuer l’effet

des dilutions que peut causer l’arrosage, soit un volume de 50 ml/pot.

Un total de 28 pots a été utilisé. Après environ un mois, une coupe au stade

de 10% de floraison a été effectuée pour déterminer l’indice nodulaire et le

poids sec des racines.

Les pots ont été transférés dans une chambre de croissance (photopériode de

16 h, température de 25°C le jour et 15°C la nuit) pour une durée de 30 jours.

Les plantes ont été arrosées deux fois à 3 fois par semaine avec la solution nutritive


22

Tableau 4 : Tests d’efficacité des souches de rhizobium sp sur la luzerne en condition

salin

Traitement

Microorganismes

Volume de

bioinoculants (ml)

Volume de solution

nutritive (ml) ajouté

pour compléter à 50

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz1

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz2

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz3

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz4

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz5

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz6

5

45

T0+YMB

T8+YMB

T12+YMB

T16+YMB

Rhz7

5

45


23

1.4.8. Paramètres à mesurer

Après 4 semaines de croissance, on a déterminé le nombre de nodules,

l’indice nodulaire et le poids sec du feuillage. L’indice nodulaire exprime la qualité

de symbiose entre la plante et les microorganismes, c’est une valeur qualitative

qui tient compte de la gosseur, du nombre et de la couleur des nodules. Elle se calcule

comme le montre le Tableau 5.

Tableau 5 : Critères et méthode de calcul pour évaluer l'indice nodulaire.

(Ben Rebah et al. 2001)

Grosseur des nodules

Valeur A

Gros 3

Moyen 2

Petit 1

Couleurs des nodules Valeur B

Rose 2

Blanc 1

Nombres des nodules Valeur C

Pas de nodule 0

Peu de nodules 2

Beaucoup 3

Autres caractéristiques

Sur racine principale P

Sur racine secondaire S

Sur les racines P et S

Forme Allongé A

Forme ronde R

En groupe (Grappe) G

Isolé I

Indice nodulaire A×B×C ≤18 maximum


24

Dans ce chapitre, nous rapporterons les résultats des mesures et d’analyses notre

isolats les 3 étapes qui on a été effectués :

Etape 1ére : Dans le milieu de culture YMA (Yeast mannitol Agar)

Étudier les isolats selon :

- Leurs caractéristiques phénotypiques, (leurs caractères culturaux,

morphologiques, biochimiques…etc.) ;

- Leurs vitesses de croissance (lente ou rapide) dans les milieux de culture

spécifique (YMA+ rouge Congo, YMA + Blue bromythol).

Etape 2ème : Le test de tolérance de NaCl :

Le test de tolérance de NaCl a été réalisé dans le milieu de culture YMA

gélosé et liquide YMB (YMA sans agar), selon les différentes concentrations de NaCl

(0, 8, 12,16 g/l). Nous avons mesuré la densité optique pour :

- Evaluer leurs croissance selon le stress salin appliqué dans notre approche ;

- Sélectionnée la meilleure souche tolérante au sel.

Etape 3éme : Le test de nodulation

Le test permet d’évaluer la capacité d’infectivité des isolats (aptitude de

nodulation) par l’estimation de l’indice nodulaire, et leurs efficience (la capacité de

fixation l’azote) par l’estimation de pois sec de la partie aérienne après la culture des

plantules (la luzerne).

Nous avons interprétés nos résultats obtenus pour chaque étape par des tableaux, et

des observations principales.

I Caractéristiques morphologiques, culturaux et physiologiques des isolats

Sur le nombre total des nodules récoltés à partir des racines de luzerne, nous

avons tenu compte de sept (7) isolats, qu’ils sont détectables à partir de (24h) après

des observations macroscopique et microscopique.

I .1 Résultats de l’isolement des bactéries à partir des nodules (1ére étape)

Des colonies bactériennes rappelant les rhizobiums sont obtenues. Après

le piqueur au niveau de centre des nodules à l’aide d’une anse platine stérile,

L’ensemencement est réalisé selon la technique des quatre cadrans de manière à avoir

des colonies isolées et donc faciles à caractériser. Les mêmes nodules sont

ensemencés sur :


25

a) YMA (Yeast mannitol Agar): (observation macroscopique, microscopique) ;

b) YMA+ rouge Congo, YMA+ Blue bromythol (72 heures d'incubation à 28° C).

La vitesse de croissance, les aspects des cultures sur milieux qui on a cité

précédemment, On a choisis les isolats du genre Rhizobium en se basant sur :

1-Le temps d’incubation (72 heures) ;

2-Forme des colonies (colonies muqueuses, bombées, circulaires et brillantes

aspect mielleux) ;

3-La température pour une croissance optimale de la croissance est de 28°C ;

4-Le pH Pour une croissance optimale est de 7,00 ;

5-La mobilité et la coloration de Gram (Gram négative). (Vincent., 1970).

I.1.1 Croissance sur YMA

Les aspects des cultures sur milieu YMA après l’observation macro-

microscopique sont récapitulés dans le (tableau 6).


26

Tableau 6 : Résumé des caractères culturaux des sept (7) souches après observation à l’œil

nu

Souches

Caractéres

1 2 3 4 5 6 7

Diamètre de

colonie

< 2mm >2mm <2mm < 2mm <2mm < 2mm >2mm

Forme

arrondie

circulaire

arrondie,

circulaire,

colonie

volumineuse

arrondie,

Colonie

volumineuse

arrondie,

circulaire

Circul*

plats

Circul,

arrond*,

Colonie

Vol*

Circul,

arrond

Surface

lisse Lisse

humide

lisse lisse lisse lisse lisse

Hauteur

bombée légèrement

bombée

bombée bombée plats bombée bombée

Consistance

visqu*

visqu visqu

visqu visqu* visqu

Visuq*

Caractères

optiques

Trans*

Semi trans

Trans

opaque

Trans

opaque

Semi

trans

Trans*

Trans*

Trans

Couleur

blanche

laiteuse

blanche

beige et

brillante

blanche

brillante

blanche blanche blanche

Croissance à

28°C

rapide rapide lente rapide rapide lente rapide

Viqu*= très visqueuse, trans*= très translucide, circul*=circulaire, arrond*=arrondie,

vol*=volumineuse.


27

Figure 17 : Exemples des souches rhizobium sp à différentes caractères

morphologiques


28

Tableau 7 : Résumé des caractères morphologiques des sept (07) souches après

microscopie (G ; ×100) :

Souches

Caractères

1 2 3 4 5 6 7

mobilité + + ++ ++ + - ++

forme bâtonnet

courte

bâtonnet

courte

bâtonnet

courte

bâtonnet

court

bâtonnet

long

bâtonnet

longue

bâtonnet

courte

Mode de

regroupement

isolé grappe grappe Isolé

isolé isolé grappe

Diamètre de

cellule

longue

petite

longue

petite

longue

moyenne

_ _ courte

large

_

Gram négatif négatif négatif négatif négatif négatif négatif

+ : mobile ; ++ : très mobile ; - : no déterminé

Regroupés

Isolées (grappe)

Figure 18 : Exemples de rhizobium sp (bâtonnets Gram négatif) ; (G ;×100) au microscope électronique.


29

I.1.2 Croissance sur les différents milieux de cultures utilisés

- Sur milieu YMA + rouge Congo: les isolats absorbent peu ou pas le

rouge Congo restant ainsi rose à blanchâtre (Figure 19).

- Sur milieu YMA + bleu de bromothymol (BTB): L’ensemble des isolats

acidifie le milieu (virage de l’indicateur de pH en moins de 24h).

(Figure 20)

Figure 19 : Aspect des colonies dans YEM+ rouge Congo

Figure 20 : Aspect des colonies dans YEM+BTB


30

II Test de tolérance de sel (2éme

étape)

La croissance des rhizobiums est évalué par l'apparition de colonies dans

les boîtes de Petri ou liquide renfermant des concentrations croissantes de NaCl :

0, 8, 12, 16 g/L, avec deux répétitions pour chaque traitement.

La mise en culture des souches étudiées sur le milieu YMA gélosé enrichi en

concentrations

Croissantes de NaCl montre que:

- La majorité des souches peuvent croître sur le milieu contenant 8 g/l de NaCl par

rapport à la souche témoins (sans NaCl).

-Au-delà de cette concentration, ainsi les souches peuvent se développer jusqu’à la

concentration 12 g/L.

- Une diminution remarquable au-delà de 12g/L, on a distingué seulement une souche

développée dans le milieu contenant 16g /L.

La même expérimentation, réalisée en milieu liquide, isole les mêmes souches

tolérantes. Les courbes de la figure 21 représentent la croissance des souches choisies

sur YMA liquide, à différentes concentrations de NaCl en fonction du temps.


31

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

Série1

Série2

Série3

Série4

Souche 3

Temps (h)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

Série1

Série2

Série3

Série4

Souche 4

Temps (h)

U

nit

é D

O à

60

0 n

m

Un

ité

DO

à 6

00

nm


32

Série 1= 0 g/L, Série 2= 12g/L, Série 3= 16g/L, Série 4= 8 g/L

Figure 21 : Cinétique de croissance des souches isolées pour différentes

concentrations en NaCl. Cultures réalisées en milieu YMA liquide et croissance

évaluée par mesure de la densité optique (DO) de la culture à 600 nm.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 20 40 60 80 100 120 140

Série1

Série2

Série3

Série4

Souche 5

Temps (h)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

Série1

Série2

Série3

Série4

Souche 7

Temps (h)

U

nit

é D

O à

60

0 n

m

U

nit

é D

O à

60

0 n

m


33

III Test de nodulation et effet des isolats sur la luzerne

Afin de vérifier les propriétés symbiotiques de nos isolats, c’est à dire la capacité à

noduler et à fixer l’azote, nous avons testé nos souches obtenus après leurs

caractérisations phénotypiques.

La détermination et le suivi de la croissance des isolats sur milieu YMB

(Vincent., 1970) nous a permet seulement de prendre les souches à une phase

exponentielle de croissance figure 21 pour pouvoir déterminer leurs aptitudes à

noduler les graines germées de la légumineuse.

Tableau 5 montre les caractéristiques morphologiques nodulaires observées après

l’inoculation des souches sélectionnées dans les pots :

Tableau 5 : Caractéristiques morphologique nodulaire observés après l’inoculation

des souches sélectionnées dans les pots

Inoculation

[NaCl]=

[8, 12,16]g/l

Témoin

Sans

inoculation

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7

Tou

tes [NaC

l]

Tou

tes [Na

Cl]

Dans:

[8a,12b, 16c]

Seulement

dans:

[8a,12b]

Seulement

dans:

[8a,12b]

Tou

tes [NaC

l]

Seulement

dans:

[8a,12b]

Caractères

Forme sphérique 0 0 Cylindriquea

Sphériqueb

Cylindriquec

Sphérique Sphérique 0

Sphérique

Grosseur

A

petit 0 0 Moyenne Petit* Petit* 0 petit

Couleur

B

blanche 0 0 rose blanche-

rose

blanche-

rose

0

rose

Nombre

C

3 0 0 8 4 2

0

2

racine P 0 0 P+R P+R P 0 P

Indice

nodulaire

A*B*C

(cf matériels

et méthodes)

0 0 12 2- 4 2-4 0 4

Petit*= Très petit, P= racine principale, R= racine secondaire


34

Figure 22 : Les deux formes que prend le nodule (Richter., 1993)

Après une période d’un mois, on remarque qu’en présence des concentrations de 0,

8 g/L de NaCl après l’inoculation des plantules par S3, S4, S5, S7, la partie aérienne

est bien développée avec des feuilles bien formées vertes ainsi que la partie racinaire.

et pour la concentration 12g/L, on peut noter que les résultats sont satisfaisants avec

peu de développement par rapport à ceux citer juste au-dessus.

Dans la concentration de 16g/L de NaCl, et avec S4, S5, S7, on note la mort des

plantules. Alors que dans la présence de la souche 3, les plantules présentent un

faible développement, suivi par une formation d’un nombre peu des nodules.

Chapitre IV: Discussion

35

Tout en suivant une démarche classique Vincent (1970, 1982) ; Somasegaran

et Hoben, (1994), relative à l’identification des bactéries appartenant aux genres

Rhizobium ; nous avons procédé à un isolement et une caractérisation des bactéries

nodulant la légumineuse fourragère (Medecag sativa, L.)

A travers les résultats obtenus, notamment les caractères phénotypiques, on

constate que les isolats se comportent pratiquement comme des rhizobia

(morphologie des colonies sur YMA, vitesse de croissance, test de nodulation,….).

En effet, les aspects morphologique et cultural des isolats sur les différents

milieux de culture attribuent la majorité de nosisolats à des souches à croissance

rapide et une morphologie des colonies proche du genre Rhizobium tel que décrit

Vincent (1970, 1982), Jordan (1984), Somasegaran et Hoben (1994). Il en est de

même pour la croissance des isolats sur milieux spécifiques (absorption du rouge

Congo), et une réaction acide rapide sur le milieu YMB.

Les résultats de tolérance au sel révèlent que nos isolats présentent différent

comportements. Il est à noter que Zahran et al., (2003); Vriezen et al.,(2006, 2007)

ont constaté que les rhizobiums sont généralement plus tolérants aux stress

comparativement à leurs plantes hôtes.

La gamme de tolérance au sel des rhizobiums est variable selon la souche et

le type de sel (El Sheikh et al., 1989). Khatteli (1994) a constaté que la tolérance aux

concentrations en NaCl supérieures à 1,5% (15g /L, 0,25M) est rare chez certains

Rhizobium.

L’analyse de la croissance des souches S4, S5 et S7 en milieu liquide en

présence de différentes concentrations NaCl montre que seule la concentration à

16g/L de NaCl a un effet inhibiteur sur la croissance de ces souches ; phénomène déjà

observé lors des cultures de souches bactériennes tolérantes au sel (Kassem et

al.,1985), qui montre que l’influence de NaCl sur légumineuse peut se manifester dès

leur gémination. Ainsi la germination de Medecag sativa, L. est inhibée par 1,5% de

NaCl (0,26 M/L).

La croissance est même plus importante lorsque le milieu est enrichi avec 8g/L

de NaCl, alors que des cinétiques de croissance identiques sont observées pour les

souches qui se développent en absence de sel ou en présence de 12 g/L de NaCl

(Fatou et al.,1998). Ces mêmes résultats sont constatés pour la cinétique de croissance

par S3, S4, S5 et S7.


36

Des résultats rapportées par Steiborn et Rhoughley (1975) et Ibriz et al.,(1988),

montrent que la tolérance aux fortes concentrations de NaCl semble être un

caractère adaptatif, comme il a été établi avec des souches de Sinorhizobium meliloti,

qui après un long séjour dans un milieu à forte concentration de NaCl, sont devenues

tolérantes à 3,5% de NaCl. Ce qui confirme la formation des nodules par la souche

S3.

D’après les résultats obtenus par (Zahran., 2001) et (Zahran et al., 1985), les

souches tolérantes et sensibles ont des évolutions respectives rapide et plus lente. En

symbiose, le rhizobium est plus résistant à la salinité que son partenaire végétal.

Ainsi, la salinité affecte l'initiation, le développement et le fonctionnement des

nodules, de même que la capacité photosynthétique des feuilles. Il s'avère que la

fixation symbiotique de l'azote est plus affectée par le sel que la croissance des

plantes (Rao et al., 2002). Selon Kaseem et al., (1985), il a été constaté que la

sensibilité de la nodulation à la salinité est très variable, elle peut être inhibée par des

petites quantités de NaCl, cette inhibition peut être due à la sensibilité de rhizobium

au sel, à la sensibilité de la plante-hôte et à celle de l’interaction rhizobium-plante-

hôte ; ce qui explique l’absence de nodulation pour les souches S1, S2 et S6.

Le test de nodulation en pots n’a pas été très précis puisque les témoins non

inoculés avec Rhizobium sont nodulés (Nadjib.M., 2011). Ceci traduit, que nos

résultats sont probablement dus à une contamination entre les pots, concernant

l’indice nodulaire, la récupération des nodules n’était pas facile; il y a eu une perte qui

a rendu les résultats moins précis en plus les témoins non inoculés ont été contaminés.

La nodulation atténuée par l’effet du sel continue à se produire dans des

fortes concentrations (16 g/l de NaCl) (Ibriz et al., 1988) ; ceci confirme la formation

d’un nombre un peu réduit des nodules par la souche 3.

Les résultats obtenus lors de nos travaux montrent la mort, après une

semaine, des plantules inoculées par les souches S1, S2 et S6 ; ce phénomène est dû

à l’insuffisance en quantité de ces souches inoculées, ou à cause de la température

élevée (mois de juin : période de déroulement du test).


37

Selon Mezni et al., (2002), qui stipule que les échecs des cultures de

légumineuses dans certaines régions sont souvent le résultat d'une insuffisance ou d'un

manque d'efficience des souches de rhizobium. Ce qui confirme bien notre approche.

En présence des souches S3, S4, S5 et S7, on observe la formation de

quelques nodules de couleur rose de taille moyennes à petites, ces nodules se situent

dans la partie supérieure des racines. La couleur rose des nodules est probablement

due à la présence d’un pigment, la Leghémoglobine ; l’apparition de ce pigment dans

le nodule coïncide avec le démarrage de fixation d’azote et sa dégradation correspond

à l’arrêt de la fixation. En plus le réisolement des souches bactériennes à partir de ces

nodules fait apparaître des colonies sur milieu YMA.

L'apparition de nodosités (infectivité) est suivie par la capacité de ces

nodules à fixer l'azote (effectivité) ; infectivité et effectivité sont estimées par l'état de

la plante (taille, couleur des feuilles) et parcomparaison avec des plantes témoins non

inoculées.

Jebara et col., (2000) ont montrés que l’association de Sinorhizobium avec

Medicago sativa donne une différence de réponse à la salinité (aussi bien au

niveau du nombre de nodules que du poids en matière sèche des parties

aériennes). Ceci appui en termes d’explication les différents résultats obtenus dans les

concentrations utilisées dans nos expériences

Nos résultats obtenus lors du test de nodulation montrent un faible

développement des parties aériennes et racinaires dans une concentration de 16g/L de

NaCl avec la présence de souche 3. Ceci est confirmé par les travaux de Berraho et

al., (2003), qui ont montré que, les faibles rendement souvent obtenus ne seraient pas

limités uniquement par le potentiel fixateur d’azote de la symbiose mais pourraient

aussi être dus aux stress osmotiques prévalantes dans les zones salée. Aussi l’étude

réalisée par Mainassara et al., (2009), conduisant à terme à des baisses de rendement

et de qualité des productions, dû à la présence d’un excès de sel dans le sol, confirme

ce phénomène.

Conclusion générale

38

La salinité est une contrainte majeure qui affecte la croissance et le

développement des plantes surtout dans les régions arides et semi-arides qui

souffrent des problèmes de la salinisation des sols. Les effets dépressifs de la

salinité sur les légumineuse, en particulier la luzerne, affectent également la

nodulation, la fixation symbiotique d’azote ainsi que le métabolisme azoté.

Notre travail est basé sur trois objectifs principaux, le premier ayant pour but

d’isoler les souches de Rhizobium à partir des nodules de racines de la légumineuse

Medigaco sative au niveau de l’exploitation agricole dans la région d’Ouargla ; dans

cette phase nous avons procédé à un isolement et une caractérisation

phénotypique selon les techniques usuelles propres aux rhizobia dans des

conditions bactériologiquement contrôlées. Le second objectif présente une étude de

l’effet de stress salin sur nos isolats selon différentes concentration de NaCl afin de

déterminer la tolérance de ces isolats à la contrainte saline.

Le troisième objectif, et toujours par rapport au même facteur abiotique major, est

consacré à l’étude de l’influence du stress salin sur le spectre d’hôte de nos isolats en

testant leur infectivité et leur effectivité sur la luzerne.

Les résultats ainsi obtenus, nous ont permis de constatés ce qui suit :

Les aspects morphologique et cultural des isolats sur les différents milieux

de culture attribuent que la majorité de nos isolats ont une morphologie des

colonies proche du genre Rhizobium. La croissance sur milieu YMA- rouge

Congo montre que les souches absorbent peu du rouge Congo.

En fonction de la vitesse de croissance sur le milieu YMA additionné

de bleu de Bromothymol, les isolats peuvent être séparés en deux

groupes : Rhizobium (Bactéries à croissance rapide) et Bradyrhizobium

(bactéries à croissance lente) (Vincent, 1970), or la majorité de nos souches

ont acidifié le milieu après seulement 24h d’incubation.

Selon le test de tolérance à la salinité, on a constaté une variation de la

croissance des cultivars sous contrainte saline et on a distingué trois types

des isolats :


39

Souche tolérante : la majorité des souches peuvent se développée en l’absence

de NaCl et dans une concentration 8g/L.

Souche intermédiaire : un développement suffisant de nos isolats dans la

concentration 12g/L de NaCl.

Souche sensible : Dans la concentration de 16g/L de NaCl ; on remarque une

inhibition pour la majorité des souches, mais il existe une souche qui présente

une tolérance dans cette concentration.

Les interactions symbiotiques sont caractérisées chez les légumineuses en

particulier la luzerne, par la formation des nodules racinaires colonisés

par des bactéries fixatrices d’azote. Cette fixation est due à la capacité de la

luzerne à établir des symbioses avec des bactéries du genre Rhizobium

qui conduit à la formation de nodules au sein desquels les bactéries sont

capables d'assimiler l'azote de l'air.

Un test de nodulation sous l’effet de stress salin a été réalisé dans des conditions

bactériologiquement contrôlées, ce test montre qu’ il y’a une différence réponse

dans :

La pénétration des inoculant dans les tissus racinaires da la luzerne pour

induire la formation des nodules, avec une certaine sensibilité des isolats

aux fortes concentrations de NaCl.

La concentration de NaCl dans le milieu affecte aussi le nombre et la taille des

nodules formés.

le degré d’infectivité varie non seulement en fonction de concentration de

NaCl, mais aussi en fonction de la souche inoculée.

La fixation de l’azote par la symbiose Rhizobium-Légumineuses présente un intérêt

économique et agronomique considérable, en limitant l'utilisation des engrais azotés

(nitrates) qui sont coûteux et polluants, et en augmentant le stock d’azote du sol pour

produire un bon compte des protéines alimentaires de qualité sanitaire.

Grâce à cette dernière raison, on peut améliorer notre approche étudiée sous

l’effet de la salinité pour atteindre plus de tolérance à l’effet de sel ; et améliorer

ainsi la capacité d’infectivité et d’efficience des isolats inoculées.


40

Cependant, cette étude est loin d’être finie. Dans l’avenir, nous envisagerons

d’entreprendre des travaux de recherches visant à l’application et à la

vulgarisation des techniques mises au point.

Nos travaux futurs seront axés sur:

L’étude de la compétitivité des souches introduites vis-à-vis d’autres

microorganismes du sol ;

La caractérisation moléculaire de nos isolats en comparaison à une souche de

référence donnée ;

La caractérisation phénotypique des isolats selon d’autres facteurs abiotiques

et biotiques

ANNEXE

41

ANNEXE 1

Les milieux de culture

Milieu: Yeast Mannitol Broth (YMB) (Vincent, 1970)

Mannitol 10.0g

K 2 HPO 4 0.5g

MgSO 4 7H 2 O 0.2g

NaCl 0.1g

Extrait de levure 0.5g

Eau distillée 1000ml

PH 6.8

Autoclavage 120° Pendant 20minutes

Milieu: Yeast Mannitol Agar (YMA) (Vincent, 1970)

YMB 1000ml

Agar 15g

PH 6.8

Autoclavage 120°C pendant 20minutes

Milieu: YMA+rouge Congo

YMB 1000ml

Solution stock de rouge Congo 10ml

Agar 15g

PH 6.8

Autoclavage 120° Pendant 20minutes

Après ajustement du pH on ajoute 10ml de rouge Congo (0.25g rouge Congo

dans 100ml d’eau distillée), puis on ajoute l’agar.

ANNEXE

42

Milieu : YMA+bleu de bromothymol

YMB 1000ml

Solution stock de bleu de bromothymol 5ml

Agar 15g

PH 6.8

Autoclavage 120°C pendant 20minutes

Après ajustement de pH on ajoute 5ml de bleu de bromothymol (0.5g BTB

dans 100ml d’éthanol), puis on ajoute l’agar.

ANNEXE 2 Composition de la solution nutritive

La solution nutritive stérile (sans azote) est composée comme suit (mg/L d’eau

distillée) : 174 mg de K2 HPO4, 136 mg KH2 PO4, 5 mg de citrate de fer, 493 mg

MgSO4 .7H2 O, 147 mg CaCl2 2H2 O et 1 ml de la solution de Hoagland

Tableau 9 : Solution de Hoagland et Arnon (1938)

Produit Quantité

H3 BO3

MnCl2 4H2O

ZnSO4 7H2 O

CuSO 4 5H2 O

H2 MoO4 H2 O (85%MoO3 )

CoCl2 6 H2 O

H2O

2.86 mg

1.81mg

0.22 mg

0.008 mg

0.09 mg

0.004 mg

1000 ml

ANNEXE

43

ANNEXE 3 :

Résultats de la mesure de densité optique pour le test effet de la concentration de

NaCl

Souche 3

jours

[NaCl]

g/L

J1 J2 J3 J4 J5 J6

0 0.382 0.474 0.874 0.747 0.276 1.242

8 0.228 0.326 0.336 0.572 0.35 0.428

12 0.186 0.382 0.194 0.375 0.26 0.685

16 0.218 0.308 0.764 0.315 0.213 0.62

Souche 4

Jour

[NaCl] g/L

J1 J2 J3 J4 J5 J6

0 0.226 0.522 0.443 1.271 0.745 0.98

8 0.113 0.238 0.265 0.425 0.198 0.313

12 0.192 0.46 0.4 0.498 0.174 0.453

16 0.221 0.349 0.707 0.557 0.272 0.607

ANNEXE

44

Souche 5

Jour

[NaCl] g/L

J1 J2 J3 J4 J5 J6

0 0.462 0.57 0.629 0.892 0.609 1.131

8 0.14 0.23 0.289 0.379 0.28 0.384

12 0.273 0.448 0.241 0.498 0.264 0.526

16 0.43 0.333 0.774 0.388 0.403 0.927

Souche 7

Jour

[NaCl] g/L

J1 J2 J3 J4 J5 J6

0 0.48 0.457 0.578 0.813 0.202 1.15

8 0.077 0.372 0.579 0.579 0.352 0.388

12 0.8 0.249 0.348 0.217 0.241 1.241

16 0.297 0.406 0.71 0.342 0.46 1.052

ANNEXE

45

Souche 3 [NaCl : 8g/L] Souche 4 [NaCl : 8g/L]

Souche 5 [NaCl : 12g/L] Souche 3 [NaCl :16g/L]

La prés-germination les grains de la luzerne

(Incubation 48h dans la chambre de culture, température 28°)

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Isolement des bactéries telluriques résistantes aux effets de salinité

Résumé :

Les bactéries du sol couramment appelées rhizobium sont d’une importance considérable en agriculture à

cause de leur capacité à fixer l’azote atmosphérique en symbiose avec les plantes de la famille des

légumineuses. Le présent travail a porté sur l’évaluation de la tolérance au stress salin de 7 souches

isolées à partir des racine de Medicago sativa L., au niveau de l’exploitation agricole de l’université de Ouargla.

Les essais ont été réalisés en milieu de culture YEM et en pots de végétation dans des conditions semi‐

contrôlées. Les résultats montrent que la caractérisation phénotypique des isolats a été étudiée par les

méthodes classiques se comportent pratiquement comme des rhizobia, sous l’effet de des concentrations de

NaCl (0, 8, 12, 16 g/L), on a noté une différence réponse dans la croissance des isolats en YEB mesurer à

DOy=600nm. D’autre part, le test de nodulation révélé une capacité symbiotique diffère (infectivité et effectivité).

Mots clés : Rhizobiums, symbiose, salinité, nodulation, sol, Medicago sativa L.

:الملخص

من البقول.بكتيريا االرض عادة ماتسمئ ريزوبيوم لھا اھمية في الزراعة بسبب تثبيت النيتروجين الجوي عن طريق التعايش مع النباتات

.المساخة الزراعية بجامعة ورقلةالموجودة في Médicago Sativa. L من الريزوبيوم المعزولة من جذور 7في ھذا العمل تم عزل

NaCl (0, 8, 12, 16 g/L). واظھر تخليل مميزاتھا في مختلف تركيز درجلة المولوحة ,تم فحص المظھر الفزيولوجي لريزوبيوم

ومالحظة فعالية ھذه االخيرة في تجربة انتاج العقد الجذرية وتثبيت ,ظة الفرق في التباين الفيزيولوجي بين انواع الريزوبيوم المعزولةوتمكنا من مالح النيتروجين الجوي.

.Medicago sativa Lالعقد الجذرية االرص ,الملوحة ,التعايش ,ريزوبيوم :الكلمات المفتاحية

Abstract

The bacteria of the ground usually called rhizobium are of considerable importance agriculture of their capacity to fix the atmospheric nitrogen in symbiosis with the plants of the family of legumes. The present work concerned the evaluation of the tolerance in the salt stress of 7 stumps isolated from root of Medicago sative. L., at the level of the exploitation agriculture of Ouargla. The essays were realized in the middle of culture YEM and in jars of vegetation in semi-controlled conditions.

The results show that the phenotypic characterization of isolates was studied by the classic methods behave practically as rhizobia, under the influence of concentrations of NaCl g/L (0, 8, 12, 16), we noted a difference answer in the growth of isolates in YEB to measure to DOy=600nm. On the other hand, the test of nodulation revealed a symbiotic capacity differs (infectivity and effectiveness). Keywords: Rhizobiums, symbiotic, salinity, nodulation, , soil, Medicago sativa L.

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Isolement des bactéries telluriques résistantes aux effets de salinité