Somite

Prolifération

• Test d’incorporation du BrdU

• Marquage de la Phosphohistone H3

La prolifération n’est pas affectée

• Comptage accumulation due à un défaut de migration

Apoptose

• Marquage Caspase 3 activée

• E10.5

• Lèvre ventrale DM

Apoptose

• E12.5

• Cellules redirigées ventralement

Expression des marqueurs myogéniques primordiaux

Pax3 Met Lbx

Expression de Pax3

• Hybridation in situ• E10.5

• Caudal: correct• Perturbations en

allant vers le pôle antérieur

• Pas de délamination dans le limb bud

Expression de Pax3

• Niveau: bourgeon membre postérieur

• Niveau: bourgeon membre antérieur

Pas de délamination + aggravation du phénotype

Perte expression dans les lèvres dorsales et ventrales

Pax3 est régulé par Six1-4 dans la lèvre ventrale du dermomyotome

• Bourgeon membre postérieur

• Perte expression Dorsale et Ventrale

• Expression réduite à lèvre caudale

Expression de Met

• Caudal OK

• Défauts en allant vers le pôle antérieur

• Perte de l’expression épaxiale

• Expression ectodermique

Régulation de Met par Six1 et 4, indépendamment de Pax3

• Faible expression Postdans le limb bud alors que Pax3 toujours présent

Expression réduite dans le dermomyotome

Pas d’expression dans le Antlimb bud

Expression de Lbx1

• Perte d’expression :

- chorde hypoglossale

- bourgeon de membre antérieur

Lbx1

• Expression faible:

- quelques somites au niveau du bourgeon de membre postérieur

Bandshift

• Test de retard sur gel

Mise en évidence des interactions

ADN-protéines

Bandshift

• Interaction entre Six1 et le promoteur de lbx1

• Interaction entre Six1, Eya1 et le promoteur de lbx1

Régulation directe?

Expression de Pax7

• Peu de différences

• Baisse d’expression à hauteur du bourgeon de membre antérieur

Localisation de la protéine Pax3

• E10.5 , dermomyotome

• Immunofluorescence

• Région caudale

• Co-expression Six1 et Pax3

• Phénotype normal

Localisation de la protéine Pax3

• Bourgeon membre postérieur, somites caudales

• Co-expression dans la région qui ne migre pas

Localisation de la protéine Pax3

• Membre postérieur, somites rostrales

• Les protéines ne co-localisent plus

• Perte d’expression de Pax3 antérieurement

Localisation de la protéine Pax3

• Membre antérieur

• Mauvaise localisation de Pax3, désorganisation , pas d’entrée dans le limb bud

Perte d’identité des cellules sans Pax3 et migration anormale

• Laminine: cellules à destinée musculaire

• En présence de Pax3, expression de laminine normale

Myotome organisé

En absence de Pax3, myotome désorganisé

Gènes MRFs

• Myf5, MyoD1, Myogénine, Mrf4: gènes de détermination myogénique

= facteurs de transcription de la famille Mrf

• Exprimés dans le myotome, avant la différenciation des cellules

Gènes MRFs

• Diminution expression Myf5

• Diminution expression myogénine

Gènes MRFs

• Diminution expression MyoD

• Disparition Mrf4

Les protéines Six régulent les gènes mrfs

Six et FGFs

• Baisse d’expression de Fgf6 et du récepteur à Fgf4

Six et FGFs

• Scleraxis sous le contrôle de Fgf

• Formation des vertèbres et des cotes

• Baisse d’expression

signalling de Fgf est altéré.

Conclusion/Discussion• Protéines Six contrôlent:

– Pax3 dans la lèvre ventrale– la délamination et la migration des précurseurs myogéniques hypaxiaux

En absence de Pax3, perte d’identité cellulaire, mauvaise migration et la mort pas apoptose

• Semblent contrôler- directement Met, indépendamment de Pax3 - directement Lbx1

• Absence de Six entraîne une baisse d’expression: - des Mrfs- des Fgfs

• Fonctions partagées entre Six1 et Six4• Somites rostrales plus affectées que caudales différents

pathways myogéniques

Conclusion/Discussion