SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM:

NOUVELLES APPLICATIONS

DANS LE DIAGNOSTIC DES MALADIES LYSOSOMALES

Pettazzoni M, Froissart R, Pagan C, Cheillan D, Latour P, Vianey-Saban C

Monique PIRAUD Laboratoire des Maladies Héréditaires

du Métabolisme et Dépistage Néonatal Centre de Biologie Est

Hospices Civils de Lyon FRANCE

Réunion de printemps 18 juin 2016

•Mucopolysaccharidoses •Oligosaccharidoses •Maladie de surcharge en acide sialique libre •Sphingolipidoses •Autres: CLN, Wolman, Niemann-Pick type C, maladie de Pompe…

Autosomiques récessives sauf Fabry, MPS II. Pathologies précoces (anténatales, anasarques) … ou tardives Signes cliniques

•Retard psychomoteur

•Traits grossiers, déformations osseuses

•Troubles neurologiques, convulsions

•±Hépatomégalie, opacités cornéennes, surdité

Méthodes de screening (urine, liquide amniotique) •Mucopolysaccharides (ou glycosaminoglycanes): isolement, puis dosage et électrophorèse •Oligosaccharides: chromatographie couche mince •Acide sialique libre et total •PAS DE METHODE GLOBALE POUR LES SPHINGOLIPIDOSES

MALADIES DE SURCHARGE LYSOSOMALE

Chromatographie liquide

Analyseur triple quadripôle

Introduction de l’échantillon: mélange

de molécules complexe

Ionisation des molécules à doser

Analyseur: séparation des analytes ionisés (ion

parent) selon m/z

Cellule de collision: fragmentation ion parent ---> ion fragment

Détecteur (transformation en signal électrique) + traitement informatique des données

Analyseur: séparation des ions fragments selon m/z

ION PARENT

ION FRAGMENT

Tran

siti

on

ou

M

RM

SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM

Technique Très sensible

Très spécifique

APPLICATIONS METABOLIQUES -Acides aminés -Acylcarnitines, carnitine -Homocystéine -Ac méthylmalonique -Succinylacétone -Créatine, guanidino-acétate -… -Gb3 (U) -Sulfatides (U) -Glc4 (U) -… -Enzymologie (Krabbe) -(Screening sur taches de sang séché) -…

Standards internes (si

possible deutérés), disponibles commercialement

Mode positif (cations) Mode négatif (anions)

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Aci

de

Sia

liqu

e li

bre

(µ

mo

l/L)

Semaines d'Aménorrhée

Témoins ISSD Faux + En cours

Dosage de l’acide Sialique Libre

Confirmation du diagnostic par mesure du contenu en acide sialique libre (et total) dans les cellules cultivées (fibroblastes, cellules amniotiques) par MS/MS.

NANA: N-acetyl neuraminic

acid

Normal

AF

100 µl

ISSD

AF

100 µl

Control Urine

Ac Sialique

libre

Recherche de maladie de surcharge en acide sialique libre. Prélèvement : urine, liquide amniotique Technique MS/MS depuis 2011

LIQUIDES AMNIOTIQUES

Quantification MS/MS

Protéine N-glycosylée

• Catabolisme lysosomal par des hydrolases spécifiques

• Déficit enzymatique: oligosaccharidose

D’après Bonesso et al.

Oligosaccharidoses

ASPARTYLGLUCOSAMINURIA

Chromatographie Couche Mince des urines

Humbel, 1975

Excrétion massive d’oligosaccharides dans les urines

Confirmation par mise en évidence du déficit enzymatique

Oligosaccharidoses, diagnostic

• 1 oligosaccharidose: 1 profil de bandes caractéristique

• Technique manuelle et qualitative

• Interférences: lait maternel, amikacine, Ca glubionate, Dotarem® (IRM gadolinium)

• Faux négatifs: adultes, formes modérées

• expérience

Identification des ions parents

Et des ions fragments

caractéristiques des oligosaccharidoses.

7 pathologies étudiées: Fucosidose Aspartyglucosaminurie

α-Mannosidose Gangliosidose à GM1

Maladie de Sandhoff (GM2) Sialidose

Mucolipidose II

Transposition des résultats sur un analyseur de type triple quadripôle (API 4500, ABSciex) : recherche et optimisation des MRM (couples ion parent/ion fragment) caractéristiques des oligosaccharidoses par infusion d’urines.

Mode positif: [M+H]+ ou [M+Na]+ Mode négatif: [M-H]-

Louise MENEGAUT

Développement d’une chromatographie liquide sur colonne greffage NH2 (Uptisphere 5 µm, 120 Å, 50 mm x 2.1 mm, Interchrom©, Interchim)

Excellente spécificité Excellente sensibilité Quantification non validée faute d’IS pour chaque oligosaccharide Résultats rapportés à la créatinine, exprimés en MoM des urines témoins du jour

Alexandre MARTINS

Fucosidose (n = 6)

280 MoM

Fuc 1 OS

Fuc 2 OS

IS

2.2 e6

IS

Fuc 1 OS

4.9 e4 IS

ManA 3 OS

ManA 2 OS

ManA 1 OS

7.0 e3

IS

ManA 1 OS

ManA 2 OS

ManA 3 OS

4.5 e5

Control

Patient

a-Mannosidose (n = 10) 48 MoM

Mode pos.

GM1 Gangliosidose (n = 20) 1013 MoM,

Galactosialidose (n = 5) 108 MoM

GM1 1-OS

GM1 2-OS

IS

1.10 e5

IS

GM1 1-OS

1.15 e4

GM2 1-OS

IS

1.15 e4

GM2 2-OS

GM2 1-OS

GM2 3-OS

IS

1.3 e5

Maladie de Sandhoff

(n = 11) 120 MoM

Témoin

Patient

MRM spécifiques des oligosaccharidoses IS : Glc7

GlcNAsn

IS

AGU-OS 1

1.04 e7

GlcNAsn

AGU 1 and 2

IS

1.20 e7

IS

GlcNAsn 4.1 e5

AGU 1 and 2

Aspartylglucosaminurie (n = 7)

44 MoM 72 MoM

Mode pos. Mode neg.

Sialyl-OS

IS

2.0 e5

IS

Sialyl-OS

3.9 e5

Sialyl-OS

5.4 e4 IS

Sialyl-OS

1.28 e5

Mucolipidose type II (n = 9)

116 MoM

Témoin

Galactosialidose (n = 5)

1689 MoM

Mode neg.

MRM Sialyl-oligosaccharide

de masse 1200

MRM Aspartylglucosaminurie

IS

GlcNAsn

IS

5.8 e5

Témoin

Sialidose (n = 11)

1287 MoM

GalNAc-O-Ser

IS

1.10 e6

418

IS 1.8 e5

GalNAc-O-Ser

9.5 e4

IS

GalNAc-O-Thr

5.8 e4 IS

IS

307

345

5.00 e5

IS

Hex-HexNac

3.8 e4 IS

Hex-HexNac

1.8 e5 IS

307

IS

418 1.04 e6

Témoin

Mode neg. Mode neg.

Témoin

Mode pos. Mode pos.

b-Mannosidose Maladie de Schindler (n = 1) (n = 4)

MRM obtenus par infusion d’urine

16 MoM 28 MoM

20 MoM

113 MoM 169 MoM

Oligosaccharides Résultats en MoM : moyenne (range)

• Très grande sensibilité et spécificité • Remplace la CCM depuis 2016 • Interférence fragmentation dans la source • Interférence des mucopolysaccharidoses sur le MRM de la

sialidose (10 – 20 MoM) • Aucune des interférences observées en CCM • Une seule méthode oligosaccharides + acide sialique libre

Oligosaccharides anormaux dans le LA

Oligosaccharides et liquide amniotique

• Sialidose • Galactosialidose • GM1-gangliosidose

Normal

AF

25 µl Lactose

Sialidosis type 2

AF

25 µl 50 µl

MRM Oligo 1200 mode neg

LA Témoin

LA GalSial

Sphingolipidoses

From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014

Fabry

LDM

Gaucher

GM1 gangliosidosis

NPA/B

Krabbe

GM2 gangliosidosis

b-D-Galactosidase

Sandhoff: Hexo totale Tay-Sachs: Hexo A

Glucocérébrosidase

Sphingomyélinase acide

Galactocérébrosidase

Arylsulfatase A

a- Galactosidase A

Sphingolipidoses

S : serum. U : urine. From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014

Fabry

LDM

Gaucher

GM1 gangliosidosis

NPA/B

Krabbe

GM2 gangliosidosis

Sulfatides (U)

Chitotriosidase, (CCL18) (S)

Globotriaosylceramide (Gb3) (U)

Sphingolipides / LysoSphingolipides

Glucosylceramide

2

LysoGlucosylceramide / Glucosylsphingosine

• Sphingolipides : élévation très modérée dans le plasma • Lysosphingolipides (LysoSL) = forme déacylée des sphingolipides, marqueurs émergents pour le diagnostic et le suivi des sphingolipidoses

Ceramide

- Fatty acid acyl chain

Fabry

LDM

Gaucher

GM1 gangliosidosis

GM2 gangliosidosis

NPA/B

Krabbe

LysoGM1 ganglioside

(LysoGM1)

LysoGM2 ganglioside

(LysoGM2) Plasma sur EDTA

LC-MS/MS en une seule analyse

LysoGb3

Aerts JM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008

Lysogalactosyl-céramide (LysoGalCer) Chuang WL et al. Clin Chim Acta 2013 Lysosphingomyéline(LysoSM)

Chuang WL, et al . Mol Genet Metab 2014

Lysoglucosyl- céramide (LysoGlcCer)

Rolfs A, et al. PLoS One 2013

Lysosulfatide (LysoSulf)

Mirzaian,et al. Blood cell Mol Dis 2015

From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014

LysoSphingolipides dans le plasma

M Pettazzoni

Méthode

Extraction 200 µL of EDTA plasma

Adapted from Boutin et al. Clin. Chim. Acta 2012

Protein precipitation + mix Internal Standard (IS) + phosphoric acid

Centrifugation 8 min 14 000g Supernatant Purification by SPE cartridge OASIS® Elution

Methanol / formic acid Methanol / ammoniac

Evaporation + 1 mL migration phase

Injection 50 µL

Phase A : formic acid 0.2% (v/v) Phase B : formic acid 0.2% (v/v) in acetonitrile Analysis time: 13 minutes

Liquid Chromatography C8 Column (Uptisphère. Interchim©) + precolumn

Analyte STANDARDS** Internal Standard ** MODE TRANSITION

Lyso Gb3 Lyso Gb3 Glycinated lyso-Gb3 Positive 786.5 > 282.3

Lyso HexCer Lyso GlcCer Lyso GlcCer d5 Positive 462.3 > 282.3

Lyso SM Lyso SM d18:1 Lyso SM d17 :1 Positive 465.3 > 184

Lyso GM1 Lyso GM1 S1P d17 :1 Negative 1278.6 > 290.1

Lyso GM2 / S1P d17 :1 Negative 1116.6 > 290.1*

Lyso Sulf Lyso Sulf S1P d17 :1 Negative 540.3 > 96.9

MS/MS API 4500 Q-Trap (AbSciex©) – Multiple Reaction Monitoring Mode (MRM)

* No standard; calculated from mass/structure ** Commercialy available

Elution gradient

Time (min)

Aceto

nitrile

(%

)

Chromatogrammes

Positive mode

Validation quantitative (sauf LysoGM1 et Lyso GM2)

Negative mode

LysoGM1 1278.6>290.1

S1P d17 (IS) 364.2>78.9

LysoSulf 540.3>96.9

LysoSM d17 (IS) 451.3>184

LysoGb3 Gly (IS) 843.5>339.3

LysoGb3 786.5>282.3

LysoSM 465.3>184

LysoGalCer 462.3>282.3

LysoGlcCer 462.3>282.3

LysoGlcCer d5

(IS) 467.3>2853

Lysoglucosylcéramide et lysogalactosylcéramide non séparés sur la chromatographie: mesurés ensemble en tant que lysohexosylcéramide

LysoGM1 Method Validation pool - pool + Intraseries Biais (n = 10) / 7.8 % Interseries Biais (n = 12) / 47.3 %

LysoGM1 et LysoGM2 IS : S1P d17 N : non détecté

Standard

Témoin

GM1 gangliosidosis

LysoGM1 1278.6>290.1

IS

LysoGM2 1116.6>290.1

Témoin

GM2 gangliosidosis

IS

n = 6/8

Sandhoff 10/12 Tay-Sachs 3/5

Conclusion Bonne spécificité Sensibilité insuffisante

Lysohexosylcéramide: Gaucher et Krabbe

** p<0,001 * p<0,005

GAUCHER KRABBE Controls

NOMBRE n = 8 n = 7 n = 228

LysoHexCer

(nmol/L)

Mediane 224.0 14.4 < 1.9 (95e perc.)

Range 45.7-236.5 9.3-21.6 0.1-3.5

Conclusion Gaucher : forte élévation Krabbe infantile : élévation Krabbe adulte : ? Probablement normal Déficit en saposine C : 1 cas traité (68,9 nmol/L ) Diagnotic et suivi des maladies de Gaucher Diagnostic de la maladie de Krabbe infantile

LA Gaucher LA Témoins

n = 5 n = 37

Lysohexosylcéramide (nmol/L)

Médiane 524 < 0.5

Range 70 - 1520

LHexCer 462.3>282.3

LA Témoin

LA Gaucher

LGlcCer (IS) 467.3>287.3

Lysohexosylcéramide dans le liquide amniotique: maladie de Gaucher

Conclusion Screening de la maladie de Gaucher dans le LA (anasarques) Résultat plus rapide que la mesure d’activité glucocérébrosidase sur CAC

Maladie de Fabry Liée à l’X FORME CLASSIQUE Hommes hémizygotes : - déficit en alpha Gal A - Gb3 urinaire très élevé - clinique sévère Femmes hétérozygotes : - début différé - alpha Gal A normale (1/3 des cas) ou diminuée - Gb3 urinaire normal (1 cas sur 10) ou légèrement élevé

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 5 10 15 20 25

alpha Gal A (µkat/kg)

Gb

3 (

nm

ol/m

mo

l c

rea

tin

ine

)

Controls (males n = 4)

Controls (females (n= 25)

Fabry classic form

Fabry variants

FORME VARIANT Mutations « variant » du gène GLA: ex p.N215S Hommes hémizygotes : - forme tardive (late-onset) - Gb3 urinaire normal, - activité résiduelle parfois Femmes hétérozygotes :

SCREENING Hommes : - activité alpha Gal A Femmes : - activité alpha Gal A - Gb3 urinaire

LysoGlobotriaosylcéramide : Fabry

** p<0,001 * p<0,005

F Classique

Homme

Variant

Homme

F Classique

Femme

Variant

femme Témoins

NOMBRE n = 7 n = 6 n = 26 N = 3 n = 228

LysoGb3

(nmol/L)

Median 70.7 4.8 5.6 1.7 < 0.5 (95e perc.)

Range 47.8-100.8 1.8-9.4 1.1-31.2 0.6-2.8 0-1.1 Conclusion Meilleur marqueur que le Gb3 urinaire SCREENING Hommes : activité alpha Gal A Femmes : activité alpha Gal A + LysoGb3 plasma SUIVI PATIENTS Gb3 urine + LysoGb3 plasma

Lysoglobotriaosylcéramide urinaire

et isoformes

Il existe des isoformes du LysoGb3 dans l’urine/le plasma. Ce sont des composés dérivant du LysoGb3 sur la partie sphingosine, avec des différences de masse de -2, -12, -28, +14, +16, +18, +34 et +50 Da.

Structure non élucidée.

Control

NPB

IS

LysoSM

NPC

** LLOQ

Niemann-Pick type A/B Déficit en sphingomyélinase (méthode radioisotopique, B 1200)

Niemann-Pick type C Accumulation de cholestérol non estérifié intracellulaire, mis en évidence par le test à la filipine sur fibroblastes cultivés (B 1000 + B 1250 culture de cellules)

Maladies de Niemann-Pick

Lyso-SM « 509 » = LSM + 44 Giese AK. et al. (2015) Orphanet Journal of rare diseases 10-78. A novel, highly sensitive and specific biomarker for Niemann-Pick type C1 disease,

(Chitotriosidase serum)

Lysosphingomyéline

** p<0,001 * p<0,005

NPA/B NPC Controls

NOMBRE n = 13 n = 8 n = 228

LysoSM

(nmol/L)

Median 19.9 0.90 < 1.1 (95e perc.)

Range 7.9-69.6 0.3-2.1 0.1-2.0

Résultats : LysoSM509 exprimée en MoM

** p<0,001 * p<0,005

NPA/B NPC Controls

NOMBRE n = 13 n = 8 n = 228

LysoSM509 (MoM) Median 221.6 172.1 < 4.3 (95e perc.)

Range 126.8-363.7 101.5-348.6 0-9.1

Isoformes des lysosphingolipides

Lyso-HexCer Mirzaian M. et al. (2015) Blood Cells Molecules and Diseases (54) 307-314. Mass spectrometric quantification of glucosylsphingosine in plasma and urine of type 1 Gaucher patients using an isotope standard,

Il existe des isoformes des LSL dans l’urine/le plasma. Ces isoformes sont des composés dérivant du LSL correspondant, sur la partie

sphingosine, avec des differences de masse de -2, -12, -28, +14, +16, +18, +34 et +50 Da. Structure non élucidée.

Lyso-Gb3 Lavoie P. et al. (2013) Anal. Chem. (85) 1743-1752. Multiplex analysis of novel urinary Lyso-Gb3 related biomarkers for fabry disease by tandem mas spectrometry.

Lyso-SM « 509 » = LSM + 44 Giese AK. et al. (2015) Orphanet Journal of rare diseases 10-78. A novel, highly sensitive and specific biomarker for Niemann-Pick type C1 disease,

Isoformes de la LysoSM IS : LysoSM d17:1

Etude systématique des isoformes Nombreux pics. Interférence des lysophosphatidylcholines (même fragment 184), hydrolysées par KOH

méthanol.

X = hydrolysed by KOH methanol (not Lyso-SMs)

+18 +18+14 +18+28 +18+42 +18+56

IS (red)

-28 -12 -2

IS IS

+14 +16 +34 +50

IS IS IS IS Control

NPA/B

NPC

X X

X

X

X

X

= Isoform of

interest

IS IS IS IS IS Control

NPA/B

NPC

X X

X X X

X

X

X

X

X

X X

X X

X

L’ensemble constitue un profil différent pour NPA/B et NPC.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

LSM

LSM

50

9

(-2

) R

T 2

,92

(+1

4)

RT

4,3

5

(+1

6)

RT

4,0

5

(+3

4)

RT

2,9

2

(+5

0)

RT

1,5

4

(+1

8)

RT

3,0

7

(+1

8)

RT

3,6

3

(+1

8)

RT

4,0

3

(+1

8+2

8)

RT

0,8

3

(+1

8+2

8)

RT

5,5

7

(+

18

+4

2)

RT

1,4

2

(+1

8+4

2)

RT

5,2

5

(+1

8+5

6)

RT

1,3

6

(+1

8+5

6)

RT

1,8

(+1

8+5

6)

RT

5,3

9

(+1

8+5

6)

RT

8,1

Mo

M

Controls (n=305)

NPC children(n=21)

NPC adults (n=22)

NPA/B (n=13)

LSM isoforms patterns in NPC and NPAB patients

Expressed in MoM

0

50

100

150

200

250

300

350

400

LSM

LSM

50

9

-2

RT

2,9

2

(+1

4)

Rt

4,3

5

(+1

6)

RT

4,0

5

(+3

4)

RT

2,9

2

(+5

0)

RT

1,5

4

18

RT

3,0

7

18

RT

3,6

3

18

RT

4,0

3

Mo

M

Controls

NPC children

NPC adults

NPA/B

Un profil NPA/B Un profil NPC Expérience en cours… Il est parfois difficile de se prononcer!...

Cholestane-3ß,5a,6ß-Triol

7-Céto-cholesterol

Dosage des oxystérols – Produits d’auto-oxydation du

cholestérol,

– Screening du NPC

–Porter (2010)

–Jiang (Porter + Ory, 2011)

–Cholestane-3ß,5a,6ß-triol plus discriminant que le 7-Cétocholesterol

Cholestane-3β-5α-6β-Triol (résultats C. Pagan)

CTRL, controls; CTX, Cerebro-Tendinous-Xanthomatosis; HETZ, Heterozygotes; NP-B, Niemann-Pick disease Type B; NP-C, Niemann-Pick disease Type C; WOL, Wolman disease

0

50

100

150

200

250

300

0 200 400 600 800

LSM

50

9 (

Mo

M)

Triol (nmol/L)

NPC (pediatric)

NPC (adult)

NPB

LALD

CTX

LSM 509 cut-off

Triol cut-off

LSM 509 versus triol (C. Pagan)

(Chitotriosidase)

Excellents tests d’orientation

Triol plus spécifique que 7-céto-cholestérol

Formes adultes: marqueurs moins élevés, mais LSM-509 semble

plus sensible que oxystérols

n = C-Triol

(nmol/l)

LysoSM

(nmol/l)

LysoSM-509

(MoM)

NPA/B 12 114 (68 - 181) 16 (6,5 – 41,7) 167 (98 - 280)

NPC enfants 20 191 (94 - 546) 0,6 (0,23 - 1,68) 120 (36 - 224)

NPC adultes 16 86 (12 - 244) 1,3 (0,28 – 3,51) 63 (7 – 148)

Wolman / CESD 1 / 1 574 / 73 0,1 / 0,2 9 / 8

XCT 3 60 - 205 0,27 – 0,49 1 - 4

Contrôles < 20 < 1,1 1 - 3

Biomarqueurs plasmatiques NPA/B et NPC

Conclusion

PLASMA Lysosphingolipides •Au laboratoire: une seule méthode pour mesurer simultanément tous les LSL dans le plasma.

•Nouveaux marqueurs pour Fabry , Gaucher , déficit Saposine C, Krabbe infantile, NPA/B, NPC. •Diagnostic et suivi. •Si résultat normal, la plupart de ces maladies sont exclues.

URINES Une seule méthode Oligosaccharides Excellente sensibilité / spécificité Formes adultes, atténuées Acide sialique libre

EN PRATIQUE

Tube EDTA (5 ml adultes, 1 ml enfants); si envoi: centrifuger, congeler le plasma à -20°C Réalisation : mensuelle monique.piraud@chu-lyon.fr magali.pettazzoni@chu-lyon.fr cecile.pagan@chu-lyon.fr

LIQUIDE AMNIOTIQUE (surnageant)

anasarques Meilleure sensibilité/spécificité - ISSD - oligosaccharidoses - + maladie de Gaucher

Diagnostic des sphingolipidoses

Fabry Hommes: - a-Galactosidase A (Guthrie, leucos): B 100 Femmes: - a-Galactosidase A (Guthrie, leucos): B 100 - Lyso-Gb3 Plasma (B 120)

Krabbe Enfants - b-Galactocérébrosidase (B 500), 10 ml EDTA

ou - Lyso-hexosylcéramide (B 120) Adultes - b-Galactocérébrosidase (B 500), 10 ml EDTA

Niemann-Pick type A/B Déficit en sphingomyélinase (méthode radioisotopique, B 1200)

ou Lysosphingomyéline +509+isof (B 500) Oxystérols (B 120)

Niemann-Pick type C Accumulation de cholestérol non estérifié intracellulaire, mis en évidence par le test à la filipine sur fibroblastes cultivés (B 1000 + B 1250 culture de cellules)

ou Lysosphingomyéline +509+isof (B 500) Oxystérols (B 120)

Gaucher - b-Glucocérébrosidase taches de sang (B 100) - b-Glucocérébrosidase lymphos (B 500), 10 ml EDTA

ou - Lyso-hexosylcéramide (B 120)

Chitotriosidase serum (B 100)

Remerciements

Service des Maladies Héréditaires du Métabolisme Centre de Biologie et de Pathologie Est

Magali PETTAZZONI

Roseline Froissart

Cécile Pagan David Cheillan

Christine Vianey-Saban Séverine Ruet

Philippe Latour Marie T Vanier

monique.piraud@chu-lyon.fr