Spectrométrie de masse – IntroductionIntérêts de la Spectrométrie de masse :

• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )

• Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions.

• Progrès technologique rapide

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Spectrométrie de masse –

Introduction - Principes

- Un spectromètre comprend :

- Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )

- Source d’ionisation

- Analyseur ( un ou plusieurs )

- Détecteur pour compter les ions

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- Détecteur pour compter les ions

- Système de traitement de donnée

Introduction ,GC, LC

Ionisation ,EI, CI

ESI, APCIFAB, …

AnalyseurSQ D,TQD,

EB, TOFDétecteur Logiciel

Spectrométrie de masse –

Introduction - Principes

Principes de la MS :

• 1er étape : Produire des ions

• La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation

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Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système dispersif

Ils sont ensuite détectés.

Introduction ,GC, LC

Ionisation ,EI, CI

ESI, APCIFAB, …

AnalyseurSQ D,TQD,

EB, TOFDétecteur Logiciel

Spectrométrie de masse –

Analyse de Biomolécules- Electrospray (ESI)

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Ion moléculaire ou pseudoIon moléculaire ou pseudo --moléculairemoléculaire

Ion Ion pseudopseudo--moléculairemoléculaire : :

�� En mode En mode positifpositif : : ajoutajout d’und’un proton sur M : (M+H)proton sur M : (M+H) + + (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1)

�� En mode En mode négatifnégatif : : perteperte d’und’un proton : (Mproton : (M--H)H) -- (masse : M(masse : M--1, charge 1, charge --1)1)

ElectrosprayElectrospray

1. Massifs isotopiques

• Isotopes : atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais un nombre différent de neutrons

• Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’ un élément dans la nature

• Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique appara issant sur le tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre deprotons : nucléons :

nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)

nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2)

Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5

Masse moyenne pondérée du chlore = ( 0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma

6

(1) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 atomes de l’élément(2) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 isotopes majoritaires

Principaux isotopes en chimie organique

Elément isotope % Masse isotopique

isotope % Masse isotopique

isotope % Masse isotopique

Masse moyenne

C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011

H 1H 100 1.0078 2H 0.015 2.0140 1.0079

N 14N 100 14.0031 15N 0.37 15.0001 14.0067

O 16O 100 15.9949 17O 0.04 16.9991 18O 0.20 17.9992 15.9994

S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066

F

Cl

19F

35Cl

100

100

18.9984

34.968837Cl 31.98 36.9659 35.453

Br 79Br 100 78.9183 81Br 97.28 80.9163 79.904

Calcul de masses exactes

282

nbre masse masse A isotopique moyenne

Hydrogène-1 1 1.0078 1.0079Hydrogène-2 2 2.0140

Carbone-12 12 12.0000 12.011Carbone-13 13 13.0034

Soit la molécule d’eicosane C 20H42 :

Masse exacte M :(12C20

1H42)(20 * 12.000)

Masse exacte M+1Masse exacte M+1

Masse moyenne : (20 * 12.011)

+ (42 * 1.0079) = 282,55

(20 * 12.000)+ (42 * 1.0078) = 282,33

avec un 13C : (19 * 12.000)

+ (1 * 13.0034)+ (42 * 1.0078) = 283,33

Masse exacte M+1avec un 2H :

(20 * 12.000)+ (41 * 1.0078)+ (1 * 2.0140) = 283,33

La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : ∆∆∆∆ entre

MM et M = ±±±± 1 Da / 1500 Da

Calcul de l’abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour

des petites molécules

Typed’élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2ème isotope*

1! Isotope ou F -Q plusieurs isotopes I -

dont un est majoritaire P -(A > 99,9%) H 0,015

Q+1 Isotope M+1 C 1,08 non négligeable N 0,37

* Abondancede l’isotope majoritaire = 100

analyse de spectres de masse 9

O 0,2Q+2 Isotope M+2 S 4,43 non

négligeable Cl 31,98Br 97,28

M+1 ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )M

M+2 ≈≈≈≈ (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ……M

Satellite M+1 :

Satellite M+2 :

100

100

Massifs isotopiques complexes

Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenan t 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

En Conclusion :

Chaque formule brute est associée à un massif isoto pique qui lui est propre

Pour des molécules de masse < 500 Da :

� L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :

M+1/M ≈≈≈≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100

� L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne su r la présence d’éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

analyse de spectres de masse 11

Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

Formules brutes* contenant 12C, 1H, 14N et 16Oentre 180.000 et 180.200 :

! Le nombre de formules brutes dont la masse est c omprise entre deux

valeurs données augmente avec la masse de l’entité

Formules brutes* Formules brutes* contenant contenant 1212C, C, 11H, H, 1414N et N et 1616O O entre 28.000 et 28.200 :entre 28.000 et 28.200 :

CO : 28.000N2 : 28.006N2 : 28.006

CH2N : 28.019*C2H4 : 28.031

La capacité d’un spectromètre à distinguer une mass e x d’une masse y dépend de la

résolution …

Résolution = m / ∆m

� Si la résolution est suffisante, on peut alors asso cier une masse donnée à une seule formule

brute

� ∆∆∆∆m = différence de masse correspondant à deux pics a djacents tout juste séparésm = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics)

� Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01)

analyse de spectres de masse 13

� Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallé e qui les

sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la hau teur du

pic le moins intense (généralement 10% pour la haut e

résolution et 50% pour la basse résolution)

� Autre définition (pour un pic isolé) = résolution F WHM : ∆∆∆∆m =

largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse : résolution

FWHM / résolution à 10% = 2,2

Remarque : Un autre paramètre important de l’analyseur est

l’exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la

justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et

du pouvoir de résolution de l’analyseur.

Résolution = m / ∆m

Remarque : Un autre paramètre important de l’analyseur est l’exactitude en masse càd

la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de

la stabilité et du pouvoir de résolution de l’analyseur.

analyse de spectres de masse 14

Basse Résolution et Haute Résolution

Formule Brute : Masse exacte M12C 1H4 16,0313 13C

1H417,0346

12C2571H383

14N6516O77

32S6* 5 803,6377

13C12C2561H383

14N6516O77

32S6* 5 804,6401

14N2 28,0061512C 1H 28,0312

∆∆∆∆m R = m/∆∆∆∆m

1,0033 16

1,0033 6 000

0,025 1 100

SpectromètreHR ou BR ?

BR

HR

BR

Entitésidentiques dont l’une contient un 13C

analyse de spectres de masse 15

12C21H4 28,0312

12C9 14N4

16O 180,007312C11

1H2 14N 16O2 180,0085

12C2571H383

14N6516O77

32S6* 5 803,6377

12C2591H385

14N6216O78

32S6 5 803,6390

0,0013 140 000

0,0013 4 500 000

* Insuline

Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque 500 000 HR = haute résolution : R de l’ordre de 10 4 -105 - BR = Basse résolution : R de l’ordre de 10 3

BR

HR

Impossibleà séparer

Entités ≠ mais de masses très proches

En Conclusion :

� La résolution détermine la capacité d’un spectromèt re de masse à différencier deux masses : R = m / ∆∆∆∆m

Pour des molécules de masse < 1000 Da :

� Les spectromètres à haute résolution permettent d’a ssocier une masse donnée à une

formule bruteformule brute

Pour des molécules de masse > 1000 Da

� Ce n’est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut parfois distinguer les satellites isotopiques ( ∆∆∆∆m = 1)

NB : N’oubliez pas que l’analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l’attribution d’une formule

brute

Spectrométrie de masse –

Quantification

La La sensibilité = recherche de la limite de détectio n(LOD) et Quantification (LOQ).

En analyse Qualitative , la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire àl’obtention d’un spectre de masse de qualité.

En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule parrapport au bruit de fond.

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LOD = 3 S/N

LOQ = 10 S/N

Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :

- Paramètre de source du spectromètre de masse

- La technique d’ionisation

- les solvants et tampon en ESI

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Spectrométrie de masse –

Analyse de Biomolécules

MRM, des limitations …

1. La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD )4. Précision des mesures : 10%5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareils ( 20 pg pour la

carnitine sur TQD Waters de 2000), inférieur sur une Maxis Q-TOF de 2009.6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre

1. lié à l’encrassement2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ).

On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration externe

Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement ( Testostérone D3, Carnitine D3.

Spectrométrie de masse –

Quantification

La spectrométrie de masse apporte :La spectrométrie de masse apporte :

- Spécificité

- La sensibilité

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La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :

- La préparation de l’échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences.

- Le spectromètre de masse en lui même

La La sensibilité est obtenu par :est obtenu par :

- La technologie employée

- Les modes du spectromètre de masse

Spectrométrie de masse –

Quantification La La spécificité est obtenu par :est obtenu par :

- La purification de l’échantillon

- Extraction ( liquide liquide )

- SPE / MIP

- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.

- Le spectromètre de masse.

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- Le spectromètre de masse.

- Augmenter la résolution

- R= 2000 TQD

- R= 20 000 Q-TOF

- - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .

Quantitatif

1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne.2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.

Cpd # Formula RT Mass [M+H]+

DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227

DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540

DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697

Quantitatif

DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697

ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010

ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324

Qualitatif

1. Définir les paramètres optimaux de sources.

2. Réaliser la Courbe de calibration1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl2. Faire varier la quantité d’atrazine de 20ng ( limite haute de la réglementation)3. 20 ng4. 10 ng5. 5 ng6. 1 ng7. 0.5 ng7. 0.5 ng8. 100 pg9. 10 pg

3. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5après extraction en HR-MS

Spectre “Produit” de l’Atrazine à Ce =5, 19,33,47 eV

Spectre “Produit” de l’Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 eV

Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne

MRMCompound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage PolarityATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17

7 PositiveATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41

7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13

7 PositiveATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29

7 Positive

HPLC : colonne type C18 2.1 x 100 mm, 2.6µm

Debit 300µl/min Temps B% Débit

Solvant A H2O 5mM Acétatate d'ammonium 0 3 300 µl/minSolvant B Méthanol 0.5 3 300 µl/min

5 90 300 µl/min7 90 300 µl/min

7.05 3 300 µl/min9 3 300 µl/min

QQQ.Vcap 3500 VGAS Temp 350 °CDrying gaz 12 L/minNebuliseur 45 psiFragmenteur 120 VESI Positif