Structure et morphologie de l’amylose synthétisée in vitro par l’amylosaccharase

Gabrielle Potocki-Veronese, Cécile Albenne, Pierre Monsan, Magali Remaud-SimeonINSA Toulouse –Ingénierie Enzymatique Moléculaire

U.M.R. CNRS 5504, U.M.R. INRA 792

Jean-Luc Putaux, Danielle Dupeyre

CERMAV Grenoble, Structure et Propriétés des Glycomatériaux

Alain Buleon

INRA Nantes, Unité de Physicochimie des Macromolécules

Amylose

Amidon amylose

amylopectine

Métabolisme de l’amidon : biosynthèse de l’amylose

GBSSI

Amidon phosphorylase

ADP-Glc + α-1,4-Glcn ADP + α-1,4-Glcn+1

Glc-1-P + α-1,4-Glcn Pi + α-1,4-Glcn+1

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

α(1-4)

Mw ~10 6 -107OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

α(1-4)

Mw ~10 6 -107

OH

H

H

OHO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OH

HO OHH

OH

H

H

CH 2

H

2CHOH

HH

H

H

HO

OH

O

Ø

cluster

D ~1 6P 5 ( nm)

α(1-6)

α(1-4)

Mw ~10 -10

OH

H

H

OHO OHH

OH

H

H

O

CH2OHCH2OH

HO OHH

OH

H

H

O

CH2OHCH2OH

HO OHH

OH

H

H

CH 2

H

2CHOH

HH

H

H

HO

OH

OH

2CHOHCHOH

HH

H

H

HOHO

OHOH

O

Ø

cluster

D ~1 6P 5 ( nm)D ~1 6P 5 ( nm)P 5 ( nm)

α(1-6)

α(1-4)

Mw ~107 -108

Structure de l’amylose

(Imberty et al., Starch/Staerke, 1991)

- Amylose et amylodextrines recristallisent sous forme d’agrégats ou de gelsen fonction du DP et de la concentration- Le type cristallin résultant (A ou B comme dans l’amidon natif) dépend de la température, du précipitant et du DP - Refroidissement de solutions aqueuses d’amylose ou amylodextrines : type B

(Imberty et al., J. Mol. Biol., 1988)

0 5 10 15 20 25 30

I

Angle de diffraction

Type B

Type A

Diffraction des rayons X

Modèles 3-D

Amylosaccharase : du saccharose à l’amylose

Saccharose

Amylosaccharase

fraction insoluble amylose

fraction soluble

L’amylosaccharase pour la synthèse d’amylose in vitro

Amylosaccharase

Saccharose : agro-ressource abondante et peu coûteuse

Expression recombinante chez E.coli800 mg/litre de culture

Synthèse d’amylose sans amorce

Enzyme pure (chromato. affinité TAG)

GBSSI, Amidon phophorylase

GBSSI : ADP-Glc Amidon phosphorylase : Glc-1-P

GBSSI recombinante inactive

GBSSI : amylopectine du grainAmidon phosphorylase : α-glucanes

L’amylosaccharase pour la synthèse in vitro d’amylose

Objectifs

- Synthèse d’ α-glucanes de structure et propriétés contrôlées

- Systèmes bio-mimétiques de la biosynthèse de l’amidon

contrôle de la synthèse d’amylose

- Éléments structuraux impliqués dans la spécificité pour le saccharose

et la transglucosylation

- Mécanisme catalytique de polymérisation

- Structure du polymère

Du saccharose à l’amylose

F G-Ftrehalulose

F

G-Fturanose

Isomerisation

G-enzymesaccharose

GF + enzymeF

G2

G3maltotriose

G

G2maltose

PolymerisationExtrémité non-réductriceMécanisme non-processif

Gn

Gn+1

Amyloseinsoluble

Maltooligosaccharides solubles

G

HydrolyseH2O

glucose

Caractérisation structurale de l’amylose

EnzymologieContrôle de la synthèse

MicroscopieMorphologie

Approche pluridisciplinaire

Diffraction des rayons XCristallinité

Analyse Enthalpique DifférentielleThermostabilité

Biochimie analytiqueTaille, rendements, cinétiques

Conditions réactionnelles

Concentrations initiales en saccharose100 mM (réaction A100)300 mM (réaction A300)600 mM (réaction A600)

Température 30°C

Incubation 16-28 h consommation totale du saccharose

Rendements finaux

24 g/l

3 g/l

050

100150200250300350400

S P S P S P

rési

dus

gluc

osyl

es in

corp

orés

(mM

)

amylose insolubleisomères du saccharoseDP>25 DP4-DP25DP2-DP3glucose

A100 A600A300

3 g/l

24 g/l

54 g/l

Analyse de la fraction insoluble

4 20 30 40 50 60 70 80 90 100 112-0,005

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100 GABY 040510 #29 [modified by dionex] D24h concentré ECD_1µC

min

HPAEC

DP4

DP90

Mécanisme de polymérisation non-processif : forte polydispersité

Chromatographie d’exclusion de taille

A100 A300 A600DP 58 45 35

Polydispersité 3.0 2.6 2.3

Faibles concentrations en saccharose longues chaînes diluéesHautes concentrations en saccharose courtes chaînes concentrées

Morphologie : MET

Réseaux

Unités élémentaires 10-15 nm

Agrégats

A100 A300 A600

X 200 000 X 5 000 X 5 000

Morphologie : MEB

Particules ovoïdes

Agrégats de particules 1-2 µm

A300 A600

Particules isolées 4-5 µm

X 3 000

Morphologie : microscopie optique

Croix de MalteOrganisation sphérulitique

A300 A600

Biréfringence intense et homogène1 orientation par particule

X 500

Diffraction des rayons X

% crystallinité

5 10 15 20 25 302 thetas

DiffractedIntensity

5 10 15 20 25 305 10 15 20 25 305 10 15 20 25 302 thetas

DiffractedIntensity

Taille latérale(nm)

94

83

45 8.9

16.0

11.8

A600

A300

A100

DP

35

45

58

Type B

Analyse Enthalpique Différentielle

Tm↑ DP↑

Traitement thermique 5 min 90°C

0 80 120 160 200

T (¡C)

A100

A300

A600

Endothermic Flux

40

Traitement thermique

Crystallinité augmente de 30 %

5 min 90°C

5 10 15 20 25 302 Thetas

A600-TT

A600-NTT

A100-TT

A100-NTT

DiffractedIntensity

Pourquoi des structures si différentes ?

Cinétiques de précipitation et de polymérisation

- turbidimétrie des milieux de synthèse

- capacité de liaison à l’iode

- cinétique d’apparition des produits

Turbidité

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 10 20 30

Reaction time (h)

Turb

idity

(OD

600

nm

)

A100A300A600

2 mécanismes de précipitation :-A100 : précipitation progressive des plus longues chaînes diluées-A300, A600 : précipitation soudaine des petites chaînes concentrées

CTL A100 A300 A600

[chaînes DP>3]19 g/l

8 g/l

36 g/l

Polymérisation et précipitation

Temps de réaction

[saccharose] 100 mM

[saccharose] 600 mMMaltooligosaccharides

x2

1 h0.4 h

Interactions inter-chaînesprécipitation

17 hDP 58

DP 39DP 35

10 hDP 60

réseaux

agrégats

λmax

DP 642 h

λmax

précipitation

λmax

DP 642 h

Conclusion

Synthèse in vitro d’amylose

Concentration en saccharoseTaille, morphologie, cristallinité

Polydispersité élevée / DP 35-58 ≠ amylose naturelleIngénierie de l’amylosaccharase

- enzyme thermostable- ‘super-polymerase’

2 morphologies réseaux (longues chaînes diluées)agrégats ovoïdes (courtes chaînes concentrées)

Forte cristallinité de type B amylose résistante

Design d’amylose : thermostabilité, solubilité, résistance à l’hydrolyse enzymatique contrôlées

Merci !

INSA ToulouseIngénierie Enzymatique Moléculaire

Pierre Monsan Magali Remaud-Siméon

Cécile Albenne

INRA Nantes

Alain BuleonBruno Pontoire

Joëlle Davy

CERMAV Grenoble

Jean-Luc PutauxDanielle Dupeyre