CHROMATOGRAPHIE :

Synopsis de ses bases

Nathalie Vrielynck, 2007

CHROMATOGRAPHIE : généralités et principe

Historique : -première chromatographie en 1906 par Tswett (séparation des pigments végétaux et isolation de la chlorophylle)

-Prix Nobel de Chimie en 1952 pour Martin et Synge (CPG)

Méthode d’analyse qui sépare les constituants d’un mélange par entrainement au moyen d’une phase mobile (éluant) le long d’une phase stationnaire (gel).

Nature physique des phases : -gaz (molécule volatile) ⇒ Chromatographie Phase Gazeuse -liquide (molécule soluble) ⇒ Chromatographie Liquide

ADSORPTIONPARTAGE

Phase stationnaire = gel

Phase mobile = éluant

Les composants d’une chaîne de chromatographie

Eléments principaux

Eléments en option

Les supports de chromatographie

Gel de silice : bille de petite taille (3µM)porosité faible (petite molécule)pression élevée

Polymère naturel : hydrophile système macro-poreux (surface d’échange) copolymère (+ rigide) dextran, séphadex, sépharose

Polystyrène : + stable chimiquement et physiquement nouveau support : MiniBead, Resource

Les 2 familles de chromatographie

2-chromatographie d’adsorption :- chromatographie échangeuse d’ions- chromatographie d’affinité- chromatographie hydrophobe

1-chromatographie de partage - (ou chromatographie d’exclusion)

Principe de la chromatographie de partage

La technique repose sur la capacité différente des molécules àpénétrer dans les pores de la phase stationnaire.Elles sont éluées dans l’ordre décroissant de leur poids moléculaire.Une chromatographie d’exclusion se déroule en 3 étapes :

-Equilibration-Déposer l’échantillon sur la phase stationnaire-Eluer

= gel filtration, chromatographie d’exclusion,tamissage moléculaire, perméation de gel

Domaine de fractionnement:

Courbe de calibration:

Encombrement stérique (Rayon de Stockes)

⇒ poids moléculaire apparent⇒ Log PMVolume d’élutionexpérimental

Superdex peptide

Superdex 75

Superdex 200

Superdex 30 prep grade

Superdex 200 prep grade

Superdex 75 prep grade

Type de colonne: 103 104102

Echantillon:250µl

Echantillon:1000µl

Limite de la technique : -faible résolution (4-5 pics)-volume d’échantillon faible (1% du volume de gel)-influence du débit (diffusion)-échantillon dilué en sortie de colonne

Débit:0.25 ml/min

Débit:1 ml/min

Echantillon:25µl

Principe de la chromatographie d’adsorption

L SS

L S

L

L

L

L

S+

S

S

S

5 ETAPES : -Equilibration, -Accrochage de la molécule d'intérêt, -Elimination des molécules contaminantes, -Elution, -Régénération

Chaque soluté est soumis à une force de rétention par laphase stationnaire et à une force d’entrainement parl’éluant. On aboutit à une migration différentielle descomposants et en fonction des caractéristiques physicochimiques mises en jeu :-solubilité (polaire/apolaire) pour la chromatographie phasereverse-point isoélectrique pour la chromatographie échangeused’ions-interaction spécifique pour la chromatographie d’affinité

1-La chromatographie échangeuse d’ions

2 4 6 8Protéine= polyion

Cation exchanger :-SP- (sulfopropyl) = fort-CM- (carboxymethyl) = faible

Na+Elution

Anion exchanger :-Q+ = fort-DEAE+ =faible

Cl-Elution

Paramètres d’optimisation:

-force de l’élution et la nature du contre-ion

-volume de gradient et la pente (≠ finesse des pics)

-pH du tampon de fixation

NaCl NaBr

2-La chromatographie d’affinité

Spécificité de groupe :-protéine glycosylée = lectine sépharose-DNA binding protein= héparine sépharose-Enzyme à cofacteur NADP = 2’5’ ADP sépharose-Immunoglobuline = Protein A/G Sepharose-Etiquette polyhistidine= Chelation de métaux

Haute spécificité : immobilisation du ligand

Différentes possibilités pour éluer

1 seul profil d’élution Echantillon concentré Facteur de purification élevé Coût élevé

Capto Q = 2 Euros/mlButyl-sépharose = 2 Euros/mlNi-sépharose = 9 Euros/mlProteinA-sépharose = 61 Euros/ml Anti-cmyc agarose =345 Euros/ml

1- changement de tampon2- pH extreme ou agent chaotrope ⇒ dénaturation3-4 Elution spécifique par compétition ⇒ dessalage

3-La chromatographie hydrophobe

Salting-in Salting-out = précipitation

Conditions thermodynamiques plus favorables pour l’eau

Support hydrophobe

Faiblement substitué (10-50 µMol/ml gel)Interaction faible : élution par [sel]Proteine >20 kDa =HIC

Fortement substitué (500-1000 µMol/ml gel)Interaction forte : élution par hydrophobicité au moyende solvant organique = risque DENATURATIONPeptide-Petite protéine = RPC

Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 -forte saturation (4M)-coût relativement faible-non dénaturant

Paramètre d’optimisation:

-choix du support : + le bras est long, + hydrophobe est la colonne HIC = Butyl-Octyl-Phenyl

RPC = C4-C8-C18

-Pour la RPC : choix de l’ion d’appariement (TFA, PFPA, HFBA, Triéthylamine)

+ -R’’

R’Echantillon Ion

d’appariement

+ + -R

R

Complexe Hydrophobe

-Conditions initiales (pH, force ionique, T°)-Conditions chromatographiques (volume et pente du gradient)

Efficacité (pic fin et symétrique)

Résolution

Sélectivité (séparation entre 2 pics)

Succès d’une chromatographie de partage ou d’adsorption:

Bonne sélectivité Mauvaise sélectivité

ADSORPTION

-taille des particules

-homogénéité (monodisperse)

-tampon

-gradient (longueur, pente)

+HIC-RPC: choix du support

-volume négligeable car accrochage

-capacité de fixation (overload!)

PARTAGE

-volume (ne pas dépasser 1% du gel)

-domaine de fractionnement

-tampon indifférent

-concentration indifférente

Sélectivité :

Efficacité :

Limites des différentes chromatographies :

Capture : isoler, concentrer et stabiliser Intermediate Purification : éliminer grosses impuretés Polishing: haut degré de pureté

Capture

Intermediate Purification

Polishing

Comment mettre au point une stratégie de purification?

⇒Démarche CIPP en 3 étapes :

Aptitudes des différentes chromatographies pour la CIPP

Techniques Resolution Rendement Capacité Capture IntermP PolishIEX

HIC

RPC

Affinity - ()

Gelfiltration

Capture

Intermediate Purification

Polishing

Chromatographie`Echangeuse d’ions

ChromatographieHydrophobe

Combinaison « logique »

Règle générale: 1- associer des chromatographies avec des sélectivités complémentaires 2- minimiser les étapes intermédiaires (dialyse, concentration)

Capture :

IntermediairePurification :

Polishing : Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse

ChromatographieD’affinité

Chromatographie`Echangeuse d’ions

ChromatographieHydrophobe

Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse

Gel Filtration ou Chromatographie phase reverse

Autres considérations = l’échantillon biologique

Propriétés de la protéine point isoélectrique, poids moléculaire ligand spécifique

Origine *milieu de culture très dilué*localisation cellulaire cytosoluble/membranaire *subcellulaire enrichissement

Nature des contaminants polysaccharide, lipides, Acides Nucléiques protéine majoritaire

2-Taille des pores du support

30 µM15 µM

5 µM

Considérations « chromatographiques »

1-Rendement

3-Débit

90 µM

3 µM

Exemple 1: Purification d’une protéine recombinante étiquetée

purification «orientée», solubilité, immunodétection,

Tag Matrice Conditions d’élution

Poly-His Ni2+, Co2+ Imidazol, pH acideGlutathione S transférase Glutathione agarose Glutathion réduitMaltose Binding domain Amylose agarose MaltoseCalmodulin Binding domain Calmodulin Agarose EGTAStrep-tag Streptavidin-sépharose Biotin

BSA (8 µg)

M25 (8 µg)

PM

Exemple 2: Purification d’une phospholipase recombinante

SDS-PAGE 15%

protéine sécrétée dans le milieu de culture de cellules d’insecte(Baculovirus)

Purification en 3 étapes de chromatographie:

-capture=Héparine-sépharose

-intermediaire =Colonne Echangeuse de cations (SP)

-polishing= Phase reverse (C18) en HPLC

Exple 3: Purification d’une métalloprotéine protéine membranaire dans les cellules épithéliales de rein (lapin)

Purification en 1 seule étape de chromatographie:

-extraction des membranes par action d’un détergeant

-purification par affinité (anticorps monoclonal greffé)