Quel diagnostic évoquez-vous ? 1) Quelle est la bactérie responsable ?2) Comment le patient s’est infecté ? Vous décidez de l’hospitaliser, quelles

mesures prenez-vous?3) Quelle est la physiopathologie de la maladie et le pouvoir pathogène de la

bactérie? 4) Quel(s) examen(s) demandez-vous pour étayer votre diagnostic étiologique?5) Quelles vont être les étapes du diagnostic bactériologique ?6) Quels résultats attendez-vous pour confirmer votre diagnostic? 7) Quels antibiotiques vont être testés? 8) Quels examens de laboratoires demandez-vous pour le suivi?

Un homme âgé de 40 ans, Malien vivant en Foyer, en France depuis 6 mois, • consulte pour fièvre intermittente, toux et dyspnée, altération de l’état général, amaigrissement de 5 kg depuis 1 mois• Radio de thorax = présence d’une opacité dans l’apex gauche mal systématisée

TD-ED DCEM 1 Bactériologie R. Ruimy Propriété de la Faculté de Médecine Université Paris 7-Denis Diderot

Votre suspicion de tuberculose est forte devant :

- patient récemment arrivé en France et venant d’un pays à forte endémie - vivant dans des conditions socio-économiques difficiles- symptomatologie respiratoire la fièvre prolongéeintermittente depuis 1 mois - recherche des sueurs nocturnes assez typiques- amaigrissement- résultat de la Radio de thorax

1) Quel diagnostic évoquez-vous ?

Caractéristiques des malades tuberculeux bactériologiquement prouvés en France en 2002

(n=1528)

• 65% : hommes• 54% : nés à l’étranger• 57% : entre 25 et 59 ans• 10% : séropositifs pour le VIH• 71% : tuberculose pulmonaire isolée• 21% : tuberculose extra-pulmonaire isolée • 8% : tuberculose mixte• 40% : examen microscopique positif

Résultat enquête nationale groupe AZAY

2) Quel est la bactérie responsable de la tuberculose ?

Mycobacterium tuberculosis sensu stricto (Bacille de Koch : découvreur) (BK) pathogène spécifique de l’homme le plus fréquent, Mycobacterium africanum variant de M. tuberculosis que l’on peutisoler de patient africain

Mycobacterium bovis pathogène des bovidés ⇒ tuberculose bovine, L’homme peut s’infecter par absorption de lait cru ou au contact des animaux, bien contrôlé dans nos régions,

c’est à partir d’une souche de bovis repiquée pendant 13 ans = souche atténuée, appelée BCG (Bacille de Calmette et Guérin)

Regroupées sous le terme de mycobactéries du complexe tuberculosis, Famille des Mycobacteriaceae.

3) Comment le patient s’est infecté ? Vous décidez de l’hospitaliser quelles mesures prenez-vous ?

- Isolement respiratoire du patient

-Chambre seule, porte fermée, pression négative

- Port de masque obligatoire pour toute personne entrant dans la chambre

Transmission de la tuberculose est inter-humaine.

. . . .. ...... . . .. . .........

.. . . . . ......

.......

. ..

Sujet tuberculeux Sujet contact

goutelettes

Lésion detuberculosepulmonaire

4) Quelle est la physiopathologie de la maladie et le pouvoir pathogène de la bactérie?

Lyse cellulaire -> nécrose caséeuse

Multiplication dans macrophages

Virulence = Capacité de résister à la phagocytose et se multiplier dans les macrophagesIls peuvent gagner les ganglions lymphatiques qui drainent le territoire infectéQuelques semaines plus tard, réaction granulomateuse importante au foyer infectieux cellules épithéliodes giganto-cellulaire + nécrose caséeuse blanchâtre (caséum)

2 possibilités : soit guérit spontanément , soit s’étend avec nécrose tissulaire et formation d’une caverne = riche en bacilles +++Très contagieux Parfois, il peut avoir dissémination par les vaisseaux lymphatiques ou sanguins= dissémination vers d’autres organes : reins, méninges, os (mal de Pott), ganglions…

Tuberculose infection et tuberculose-maladie

Maladie = 10%

Infection(virage IDR)

Infectionlatente

5% (dans les 2 ans)

5% (réactivation)

95%

Décès en l’absence de

traitement

Sujet Contact d’un tuberculeux

Contamination aérienne

Pouvoir pathogène

5) Quel(s) examen(s) demandez-vous pour étayer votre diagnostic étiologique?

- 3 Crachats à la recherche de Bacilles Acido-Alcoolo Résistants

Pourquoi 3 ?Emission discontinue des bacilles 1 prélèvement 3 jours consécutifs

(si le 1er est positif, le 3ème n’est pas utile)

Conditions des prélèvements:Bien expliquer au patient qu’il faut recueillir des expectorations et pas de la salive- le matin à jeun, après rinçage de la bouche - qualité :

après effort de toux +++si ne crache pas faire appel à un kinésithérapeute

- quantité : au moins 5 ml

Attention un examen mal prélevé = un diagnostic faussement négatif

Si ces examens sont négatifs et que la suspicion est forte ou surtout si le patient ne crache pas (ex: femme)

- Demander 3 Tubages gastriques à la recherche de Bacille Acido-Alcoolo Résistant (« BK Tubages ») :récupérer les sécrétions bronchiques dégluties pendant la nuit (le BK résiste au pH gastrique)

Conditions de prélèvements :

- le matin, à jeun, le plus tôt possible dès le réveil- bien suivre la procédure pour assurer un recueil du liquide gastrique - un tubage 3 jours de suite

Si les deux premiers sont positifs (le 3ème n’est pas utile)

Dans le cas d’une forte suspicion clinique de tuberculoseet

seulement si les 3 examens précédents sont négatifs

- Un prélèvement respiratoire sous fibroscopie :- permet un prélèvement dirigé - le plus souvent lavage broncho alvéolaire et/ou aspiration bronchique pour recherche de BAAR- biopsies pour diagnostic anatomopathologique

- provoque dans les heures qui suivent la fibroscopie une irritation et l’émission d’expectorations à recueillir

Pour les tuberculoses Extra- pulmonaires

Recherche peut être effectuée selon localisation dans :

- Liquides de ponction (LCR, liquide pleural, articulaire)

- Biopsies : ganglion, osseuses, cutanés, - Moelle osseuse, Sang (immunodéprimé)

- Urines (3 BK urines)

6) les étapes du diagnostic bactériologiques ?

Les prélèvements respiratoires sont contaminés par une flore commensale :

- éliminer la flore commensale pour permettre la pousse des mycobactéries qui est lente

- mycobactéries + résistants aux agents chimiques que les bactéries de la flore (cf. commentaire schéma ci-dessous)

- Principe : Fluidifier (mécaniques + N-acétyl cystéine), Décontaminer (soude), Centrifuger - Délai de traitement 60 min

Paroi Riche en acides mycoliques :Résiste aux agents chimiques,Non colorée par le GRAM

Examen Microscopique des frottis

Examen au microscope à fluorescence :- coloration à l’auramine qui reste fixée sur les bacilles après traitement à l’acide-alcool - bacilles brillants sur fond noir à l’objectif X25- la lame peut être examinée en totalité, délai de lecture rapide

Examen plus sensible et un peu moins spécifique que le Ziehl-Neelsen

Examen au microscope après Ziehl-Neelsen :- La fuschine colore en rouge les « mycobactéries » et persiste après traitement à l ’acide-alcool + contre coloration au bleu de méthylène- rouge sur fond bleu au microscope à l’objectif X100 à immersion- délai de lecture + long : au moins 10 à 15 min par lame

BAAR = pas seulement mycobactéries et pas seulement du M. du complexe tuberculosis

mais aussi Nocardia, Rhodococcus, Actinomycetes

Présence de Bacilles Acido-Alcoolo Résistants dans une expectoration

Coloration de Ziehl-Neelsen Microscope optique X100

Présence de Bacilles Acido-Alcoolo Résistants dans une expectoration

Coloration à l’auramine Microscope à fluorescence objectif X25

Stratégie d’examen microscopique des frottis

Examen en fluorescence des prélèvements respiratoires

- : absence d’éléments suspects

+ : présence d ’éléments suspects

Examen microscope après Ziehl

Nombre de BAAR pour 100 champs

Nombre de BAAR par Champ

OMSRésultat

< 1 / 100 champs négatif

1 - 9 / 100 champs1 + suspect à confirmer

10 - 99 / 100 champs 2 +1 - 9 / champs 3 +

10 - 99 / champ 4 +> 100 / champ 5 +

En général

Mise en culture des prélèvements

- Milieux solides : Milieu de Löwenstein-Jensen et Milieu de ColetsosMycobactéries poussent lentement en 3 semaines à 1 mois dépend de la richesse en BAAR de l’examen directPeut aller jusqu’à 2 à 3 mois pour M. africanum

Surveillance de la culture est non automatisée

- Milieux liquides : • MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) par exemple• pousse en 10 à 12 Jours en moyenne

Surveillance de la culture est continue et automatisée

7) Quels résultats attendez-vous pour confirmer votre diagnostic ?

- Milieu solide + en 3 sem à 1 mois aspect rugueux des colonies : sèches, eugoniquesvérifier qu’il s’agit de BAAR

- Milieu liquide + en 10 à 12 jours en moyenneprésence de BAAR : forme des cordes assez typique de j

suspicion de Mycobactérie du complexe tuberculosis confirmer par

1) Identification moléculaire : a) soit par hybridation directe b) soit hybridation après amplification +++

2) Identification phénotypique cf poly,

Résultat = Mycobactérie du complexe tuberculosis + permet de détecter la majorité des mutations qui confère la résistance

à la rifampicine (95%)et récemment à l’isoniazide (70%)

Culture positive

Aspect des colonies de M. du complexe tuberculosis sur tube de Löwenstein-Jensen

Culture de M. du complexe tuberculosis sur milieu solide : Löwenstein-Jensen

Place du Diagnostic direct de M. du complexe tuberculosis par PCR sur prélèvement

- Faible sensibilité pour prélèvements Microscopique négatif - présence de faux positifs- présence d’inhibiteurs de PCR

Intérêt très limité et peu rentable de la PCR sur prélèvement

quand ED + chez patient HIV +Pour différencier

M. du complexe avium intracellulare de M. du complexe tuberculosis

8) Quels vont être les antibiotiques testés ? Technique ? Étude de la sensibilité aux ATB antituberculeux ?

Antibiotiques différents des antibactériens classiques

Une caverne contient environ 108 bacilles et environ 102 à 103

germes sont d’emblée résistants à un antibiotique⇒ il existe des mutants R naturels au sein de la population

⇒ l’antibiotique ne tuera pas toute la population, il faut donc au moins 2, 3 voire 4 ATB pour tuer tous les bacilles et éviter l’apparition de résistance secondaire

⇒ Un atb sera considéré comme efficace lorsqu ’il laisse le plus faibles taux de mutants préexistants d’emblée.

Réalisation d’un antibiogramme

- milieu solide résultat obtenu qu’après 3s à 1 mois :tester la sensibilité aux 5 antituberculeux majeurs dont seulement 4 (*) sont classiquement utilisés en thérapeutique :

- milieu liquide plus rapide

- isoniazide (*)- rifampicine (*)- éthambutol (*)- pyrazinamide (*)- streptomycine

- le test des antituberculeux de 2ème intention est réalisé dans des laboratoires de référence

ATB par Méthode des proportions

But : détecter le taux de mutants résistants à chaque antibiotique Au sein de la souche étudiée.

En pratique,un tube sans ATB (témoin) et un tube avec ATB sont inoculés avec différentes suspensions de la souche.La lecture au bout de 21 jours consiste à dénombrer le nombre de colonies sur les géloses avec ATB (N) et sans ATB (NT) etcalculer le % de résistants P = N/NTx100. Ce % est comparé à un % ou proportion critique, diffèrent pour chaque ATB

Si le % de résistant de la souche à l’ATB testé ≥ au % critique de l’ATB = souche résistante Si le % de résistant de la souche à l’ATB testé < au % critique de l’ATB = souche sensible‘proportion critique : déterminé empiriquement en fonction d’expérience clinique.

INH

0.1µg/ml

INH

1µg/ml

RIF

40µg/ml

T sans

ATB

EMB

2µg/ml

INH

0.2µg/ml

STR

4µg/ml

T sans

ATB

T Pzasans

ATB

PZA

200µg/ml

Antibiogramme : Méthode des proportions

Exemple d’une souche SensibleInoculum à 10-2

INH

0.1µg/ml

INH

1µg/ml

RIF

40µg/ml

T sans

ATB

EMB

2µg/ml

INH

0.2µg/ml

T sans

ATB

T Pzasans

ATB

PZA

200µg/ml

Inoculum à 10-2

Antibiogramme : Méthode des proportions

Souche de la patiente Y..

STR

4µg/ml

INH

0.1µg/ml

INH

1µg/ml

RIF

40µg/ml

T sans

ATB

EMB

2µg/ml

INH

0.2µg/ml

STR

4µg/ml

T sans

ATB

T Pzasans

ATB

PZA

200µg/ml

Antibiogramme : Méthode des proportions

Souche de la patiente Y..Inoculum à 10-4

9) Quels examens de laboratoire demandez-vous pour le suivi?

Pour les patients bacillifères

- demander 3 BK crachats 3 semaines après la mise sous traitement antituberculeux

- si les 3 sont négatifs le patient est considéré comme non contagieux et peut retourner au domicile.