I/ DECOUVERTE DES CELLULES DU SYSTEME IMMUNITAIRE

• Les médecins coloraient les cell selon les drogues, ce qui a donné leur nom aux cellules. ➔ Coloration basique → basophile ➔ Coloration pH neutre → neutrophile ➔ Coloration à l’éosine → éosinophile

• On reconnait les cell par : A. La différenciation selon des critères morphologiques ou autres ✓ Morphologie: microscopie optique avec coloration et microscopie électronique

B. La différenciation par l’expression différentielle de molécules de surface ✓ La microscopie à fluorescence ✓ La cytofluorométrie de flux

C. Sélection d’un type cellulaire ✓ Sélection négative ✓ Sélection positive ✓ Tri cellulaire

• La différenciation des types cellulaires selon des critères morphologiques Les éosinophiles

- Nombreux granules cytoplasmiques rouges-orangés.

- Noyau souvent bilobé. - Chromatine dense et groupée en masse

compacte.

Les neutrophiles - Nombreux petits granules cytoplasmiques roses et violets - 2 - 5 lobes nucléaires reliés par les filaments minces de chromatine. - Chromatine dense et groupée en masse compacte.

Les monocytes

- Cytoplasme abondant d’aspect inégal, de couleur bleu grise, vacuoles

- Noyaux variables en forme (ronde, ovale…) - Chromatine nucléaire relâchée de couleur rose

ou mauve pâle

➔ Monocytes : aucun rôle inflammatoire mais précurseurs des macrophages + cell dend (→ pas de granules).

➔ Macrophage & Cell dendritiques ne sont JAMAIS DANS LE SANG ! mais dans les TISSUS

TD IMMUNOLOGIE : Les cellules du système immunitaire

Les LT exprime des marqueurs CD4, CD8. CD11c marqueur dendritique CD11b marqueur macrophage

Famille GRANULOCYTES Caractéristique → Granule = vésicules remplis de molécule (histidine) pour tuer patho, bact.. = efficacité directe

REPONSE : A5 (éosinophile) / B1 (neutrophile) / C4 (monocyte) / D7 (cell dend ) / E2-3 (macrophage) / F6 (lymphocyte).

Leur rôle essentiel : s'attaquer aux parasites de l'organisme,

sans les phagocyter; ils se fixent dessus, déversent le

contenu de leurs granules qui contiennent des enzymes destinées à les détruire.

Mastocyte → activation → relargue des granules !

➔ Facteur histidine : 106 ➔ Facteur TNF X40

Par rapport au repos.

LT → euchromatine = région qui vont être transcrites ! ➔ Plasmocytes vont dans la moelle osseuse ! ➔ Ils possèdent un noyau + une grande partie de Réticulum Endoplasmique. ➔ En 48 h (après l’activation) elle va beaucoup grossir car elle va se diviser.

La rencontre des cell gang + des LT se font dans les ganglions lymphatiques.

• La différenciation par l’expression différentielle de molécules de surface : Utilisation d’anticorps monoclonaux

✓ La microscopie à fluorescence - localisation de molécules dans une cellule ou dans un tissu

Le fluorochrome absorbe l’énergie provenant du Laser Le fluorochrome libère l’énergie absorbée par émission de photons de longueur d’onde sup = fluorescence

L'inconvénient majeur de la microscopie à fluorescence

conventionnelle est sa perte de résolution dûe à la superposition d'informations issues des plans adjacents

✓ La microscopie confocale à fluorescence - images recomposées par ordinateur. En bleu : les macrophages & en rouge = les LT Ils coopèrent ensemble dans les zones de contact (boule X pointillé). microscopie confocale : Sections de cellules ou de tissus à très haute résolution. Un microscope confocal est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ appelées « sections optiques ». Ce sont des coupes optiques virtuelles ultrafines dans l'objet observé et seule l'image de fluorescence émise dans le plan est enregistrée. En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet. L'objet n'est donc pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur.

➔ Microscopie confocale fait comme un scanner. Il prend des photos à différents niveaux.

✓ La microscopie biphotonique

Problèmes avec le confocal - Le « photobleaching » du marquage fluorescent (chromophore) - La phototoxicité. Améliorations apportées par la microscopie biphotonique - Augmentation de la résolution par rapport au confocal. - Excitation uniquement du plan focal (30 images par seconde). L’absence d’échauffement permet de travailler sur des tissus vivants. Permet :

♦ de pénétrer plus profondément dans les tissus

♦ de visualiser les mouvements cellulaires. Dans gang, les cell suivent des réseaux de fibre pour bouger.

Cet outil est particulièrement utile pour les biologistes qui souhaitent étudier des mécanismes dynamiques dans les tissus ou les cellules vivantes sans infliger des dommages potentiellement létaux à l'échantillon.

Bleaching = javel → délavé = couleur dim ➔ Pas possible de le voir sur l’animal.

✓ La cytofluorométrie de flux Qu’est ce que la Cytométrie de Flux ? Mesures simultanées des différentes caractéristiques d’une cellule. Mesures effectuées pendant que les cellules défilent dans une chambre d’analyse, à une vitesse de 50 à 100.000 cellules par seconde. Que requiert la Cytométrie de Flux ? des anticorps couplés à des fluorochromes un cytomètre de flux

L’appareil : FACS: Fluorescence activated cell sorter Le passage dans le vaisseau très fin, les cell passent les unes après les autres. Les capteurs reco les fluorochromes que les cellules expriment. On obtient un tableau de fluo :

FL1 FL2 FL3

CELL 1 + +++ +

CELL 2 +++ + +

CELL 3 + + +++

Quelles informations un Cytomètre de Flux peut-il nous donner sur une cellule ? Sa taille relative (Forward Scatter - FSC) Sa granulosité relative (Side Scatter - SSC) Son intensité relative de fluorescence

(FL1, FL2, FL3 et FL4 voire FL5, FL6, ...) • FSC—lumière diffractée aux petits angles = DIAMETRE DE LA CELLULE

proportionnelle à la taille de la cellule Détectée dans l’axe de la lumière incidente

• SSC—lumière diffractée aux grands angles = MESURE GRANULOSITE DE LA CELL (bcp ou non). proportionnelle à la granulosité de la cellule Détectée à 90°par rapport à l’axe de la lumière incidente

Cellules du sang. →

METHODOLOGIE DU GRAPHIQUE PAR FLUORESCENCE :

Par cette méthode, on peut comprendre les populations des différentes cellules marqueurs. Ici, on remarque 3 taches. La tâche verte = marqueur aux LT CD8 La tâche bleu = marqueur aux LT CD4 La tâche rose n’est pas marquée par la fluo (cd4 ou CD8) mais exprime une fluo naturellement faible. Cela correspond aux LB.

Si on a 1 seuil Ac (ex avec FL1) : Analyse des données:

• Les paramètres de fluorescence: cellules marquées avec avec un Ac anti-CD8 marqué au FITC et un Ac anti-CD44 marqué au PE

Analyse en 3 dimensions Cellules de rate: marquage anti-CD4 (FL3) , anti-CD8 (FL2), anti-CD3 (FL1). Analyse de l’expression de CD4 et CD8 sur les lymphocytes . Analyse de l’expression de CD3 sur les lymphocytes .

La barre à 75% = niveau où

l’aire sous la courbe

correspond à celle du grand pic.

On calcul l’aire sous la courbe

du pic de CD8 moins l’aire sous

la courbe des autres.

3. Sélection d’un type cellulaire Sélection négative in vivo Souris injectées avec des anticorps anti-CD4 Sélection positive ou négative ex-vivo

• Billes magnétiques

• Le tri par cytofluorométrie de flux EXERCICE : Des souris BALB/c adultes ont été traitées au jour 1 par injection dans le coussinet plantaire d’une émulsion de 50 µg de protéine HA et de CFA (groupe 1), ou de protéine HA et de PBS (groupe contrôle). Au jour 5, les souris ont été sacrifiées. Les cellules des ganglions drainant le site de l’immunisation ont été comptées, purifiées et analysées par FACS après marquage avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD8 fluorescents. - Quel résultat attendez-vous quant au nombre de cellules dans les ganglions de souris traitées comparé au

nombre de cellules dans les souris contrôle ? - Sachant que le ganglion lymphatique d’une souris non immunisée contient 1,8 X 106 cellules dont 2 X 105

lymphocytes T CD8+ et 4 X 105 lymphocytes T CD4+, représentez les profils FACS attendus pour les cellules provenant de souris traitées ou de souris contrôle. (profil en 2 dimensions CD4/CD8).

- Comment procèderiez-vous pour éliminer les lymphocytes B dans votre préparation de cellules ? - Représentez le profil en 2 dimensions CD4/CD8 obtenu après déplétion des lymphocytes B