UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR**********ECOLE INTER-ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES(E.I.S.M.V.)2007ANNEE:N19CARACTERISATION DE LA FLORE LACTIQUEDES LAITS FERMENTES ARTISANAUX AUSENEGAL : cas de la zone des NiayesTHESE27 Juin 2007Prsente et soutenue publiquement ledevant la Facult de Mdecine, de Pharmacieet dOdonto-Stomatologie de Dakar pour obtenir le Grade deDOCTEUR VETERINAIRE(DIPLOME DETAT)ParCyrille NGASSAM TCHAMBAN le 13 Dcembre 1982 Yaound(CAMEROUN)JURYPrsident : M. Moussa Fafa CISSEProfesseur la facult de Mdecine de DakarDirecteur de Thse : M. Malang SEYDIet RapporteurProfesseur lE.I.S.M.V. de DakarMembresMme. Rianatou BADA ALAMBEDJIProfesseur lE.I.S.M.V. de DakarM. Serge Niangoran BAKOUMatre de confrences agrg lE.I.S.M.V. de DakarCodirecteurs de thse: Dr Bellancille MUSABYEMARIYA, Assistante lEISMVDr Srigne K. SYLLA, attach de recherche lEISMV109 SOMMAIRE :PagesINTRODUCTION : 5PREMIERE PARTIE : Synthse bibliographique..8Chapitre 1 :LAIT CRU......91.1. Composition chimique du lait...91.2. Valeur nutritive du lait..111.3. Caractristiques organoleptiques et proprits physico-chimiques..121.3.1. Caractristiques organoleptiques..121.3.2 . Proprits physico-chimiques...121.3.2.1. Acidit du lait.131.3.2.2. Densit et masse volumique du lait141.3.2.3. Point de conglation...141.3.2.4. Point dbullition....141.4. Microbiologie du lait et des produits laitiers151.4.1. Flore daltration...151.4.2. Flore pathogne.161.4.3. Microflore lactique du lait.161.4.3.1. Genre Streptococcus...181.4.3.2. Genre lactococcus...191.4.3.3. Genre Lactobacillus191.4.3.4. Genre Leuconostoc.201.4.3.5. Genre Enteroco ccus201.4.3.6. Genre Aerococcus..201.4.4. Principales activits microbiennes dans le lait..211.4.4.1. Acidification...211.4.4.2. Production de gaz...221.4.4.3. Production dalcool221.4.4.4. Production de polysaccharides ou de polypeptides221.4.4.5. Protolyse...221.4.4.6. Lipolyse..23Chapitre 2 :LAITS FERMENTES....242.1. Phnomne de la fermentation..242.2. Diffrents types de laits ferments252.2.1. Yaourt ou yoghourt252.2.2. Autres laits ferments272.2.2.1. Kfir...272.2.2.2. koumis....281 2.2.2.3. Lait lacidophile..282.2.2.4. Leben ou Dahi292.2.2.5. Lait fil292.3. Intrt nutritionnel des laits ferments..302.4. Importance socio-culturelle du lait ferment.31Chapitre 3: METHODES DISOLEMENT ET DIDENTIFICATION DESBACTERIES LACTIQUES DANS LE LAIT..323.1. Mthodes didentifications phnotypiques..323.1.1. Critres de diffrentiation.323.1.2. Milieux commerciaux pour lidentification des bactrieslactiques333.1.3. Milieux, conditions de culture et aspect des bactries lactiquesfrquemment rencontres dans les laits ferments343.1.4. Micromthodes..373.1.4.1. Tests classiques...373.1.4.2. Tests rapides....383.1.5. Analyse srologique...473.1.6. Typage phagique et bactriocinique..473.1.7. Mthodes physico-chimiques.473.2. Mthodes gnotypiques ou molculaires..48DEUXIEME PARTIE : Etude exprimentale...49Chapitre 1: MATERIEL ET METHODE.....501.1 Enqute de terrain..501.1.1 Zone denqute..501.1.2 Matriel denqute.501.1.3 Mthode denqute501.2Analyse de laboratoire..511.2.1 Echantillons....511.2.2 Paramtres mesurs....511.2.2.1 Analyses physico-chimiques........511.2.2.1.1 Matriel......511.2.2.1.2 Mthode.....52pH...52Acidit DORNIC.521.2.2.2 Analyse microbiologique.......521.2.2.2.1 Matriel.........52Appareils..52Petit matriel....53Ractifs, milieux disolement et didentification.532 1.2.2.2.2 Mthode......54Prparation de lchantillon..54Recherche des coliformes fcaux..55Recherche des staphylocoques..57Recherche de la flore lactique...581.2.3 Traitement et an alyses des donnes... ...61Chapitre 2 :RESULTATS622.1 Rsultats denqute.622.1.1 Conduite du cheptel..622.1.2 Hygine des locaux...62Locaux administratifs...62Locaux techniques63Locaux sanitaires..632.1.3 Hygine du matriel.652.1.4 Hygine du personnel...672.1.5 Hygine du fonctionnement..692.2 Mesures physico-chimiques....712.2.1 Lait cru..71pH ou acidit actuelle...71Acidit de titration : D712.2.2 Lait caill..71Acidit actuelle..71Acidit Dornic ou titrable : D...712.3 Analyses microbiologiques......772.3.1 Lait cru..77Coliformes fcaux ou thermotolrant...77Staphylocoques.772.3.2 Lait caill.77Coliformes fcaux ou thermotolrants.77Staphylocoques.78Lactobacilles.78Streptocoques78Chapitre 3:DISCUSSION843.1 Hygine la ferme de MBOUSS843.1.1 Hygine des locaux..843.1.2 Hygine du matriel.843.1.3 Hygine du personnel...853.1.4 Hygine du fonctionnement.853.2 Caractristiques physico-chimiques863.2.1 pH863 Lait cru.....86Lait caill..864.2.2 Acidit de titration en D..87Lait cru.87Lait caill..874.3 Analyses microbiologiques.884.3.1 Coliformes fcaux ou thermotolrants.88Lait cru.............88Lait caill.884.3.2 Staphylocoques.89Lait cru..........89Lait caill..894.3.3 Flore lactique........90Genre lactobacillus........90Genre lactococcus.92Genre leuconostoc.92Chapitre 4: RECOMMANDATIONS..944.1 Hygines des locaux944.2 Hygine du matriel944.3 Hygine du personnel..954.4 Hygine du fonctionnement95CONCLUSION GENERALE964

INTRODUCTION5 Le lait est lun des aliments les plus consomms dans le monde. Eneffet, la production laitire dans le monde en 2000 se chiffrait 489,8millions de tonnes avec une rpartition dans tous les continents. Ainsi,on enregistrait : en Europe une production de 122,1 millions de tonnes,donc 24,9%, soit la plus grosse production mondiale ; 19,92% enAmrique du Nord et du Centre ; 9,51% en Amrique du Sud ; 17% enAsie ; 4,79% en Ocanie et enfin 5,3% en Afrique[9].Cette rpartitionntant pas homogne, certains continents tels que lAfrique et lOcaniesont obligs dimporter une grande quantit de lait en provenance descontinents de haute production, afin de satisfaire leur besoin en lait.Cette forte consommation du lait travers le monde se justifie par le faitque cest un aliment complet . En effet, il constitue le premier apportprotique de ltre humain et le premier aliment naturel complet ds lejeune ge. Il renferme tous les nutriments de base, savoir les glucides,les lipides, les protines et bien dautres.Cette richesse du lait en lments nutritifs fait de lui galement unexcellent milieu pour le dveloppement de nombreux microorganismes.De ce fait on trouvera dans le lait dune part les microorganismes decontamination, constitus par la flore daltration et les bactriespathognes, puis les microbes indignes (lactobacilles, streptocoques)responsables de la fermentation du lait.La fermentation du lait conduit la formation d'acides organiques,notamment d'acide lactique, do une acidification du lait. La productiond'acide lactique au cours de la fermentation conduit un abaissement dupH qui aura pour effet de cailler le lait. On distingue deux types de laitferment, en fonction du procd de fabrication : le lait fermentartisanal, obtenu soit partir de lait frais, soit partir de lait en poudrepar fermentation naturelle;le lait ferment industriel, qui rsulted'ensemencements par une flore et une temprature contrle.Au Sngal, la plupart des laiteries produisent le lait ferment naturelencore connu sous le nom de lait caill. La diversit de la florerencontre dans ce lait nous a incit effectuer notre travail, portant surla caractrisation de la flore lactique des laits ferments artisanaux auSngal.Pour cela nous avons choisi comme cadre dtude la zone des Niayes eten particulier la ferme de MBOUSS.6 Lobjectif de notre tude est de caractriser la flore lactique des laitsferments artisanaux au Sngal et den dduire leur intrt sur le plantechnologique et sanitaire.Notre travail comprend deux parties:- une premire partie relative la synthse bibliographique donne deslments concernant le lait cru, ses proprits et sa valeur nutritive.Cette partie, traite galement du lait ferment et de diffrentesmthodes disolement et didentification des bactries lactiques dansle lait.- la deuxime partie porte sur ltude exprimentale. Dans cette partienous dcrivons le matriel et la mthode utiliss pour la ralisationde nos travaux. Enfin, nous prsentons les rsultats obtenus, suivisde la discussion et de quelques propositions damlioration.7

PREMIERE PARTIE :SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE8 Chapitre 1 : Le lait cruSelon le congrs international pour la rpression des fraudesalimentaires, tenu Genve en 1908, le lait est le produit intgral de latraite totale et ininterrompue dune femelle laitire ; (vache, jument,chvre, brebis, etc.), bien portante, bien nourrie et non surmene. Il doittre recueilli proprement et ne doit pas contenir de colostrum [6, 40].Le lait sans qualificatif renvoie au lait de vache, qui fait lobjet de notretude. Sil sagit du lait provenant dune autre espce, on ajoute lequalificatif de lespce. Quant aux produits laitiers, ce sont des denresobtenues partir du lait ayant subi des traitements technologiques quimodifient ses caractristiques (yaourt, fromage, crme. etc...).1.1 Composition chimique du laitLe lait en gnral et le lait de vache en particulier, est constituessentiellement deau, de lipides, de protines et de glucides. Cesconstituants peuvent varier en fonction des facteurs gntiques,zootechniques, physiologiques et alimentaires. Le tableau n I donne lacomposition globale du lait de vache.9 Tableau I :Composition globale du lait de vache.CONSTITUANTSQUANTITE (g/l)Eau libre 842,625Eau875Eau lie 32,375GlucidesLactose 46Matires grasses proprement dite 36Matire grasseLcithine (phospholipide) 0,537Partie insaponifiable (strol,0,5carotne, tocophrols)Casine 25ProtinesProtines solubles (globulines,5,532albumines)Substances azotes non1,5protiquesSelsAcide citrique 2minrauxAcide phosphorique (P2O5) 3,38Acide chlorhydrique (HCl) 2,7ConstituantsVitamines, enzymes, gaz dissous,mineurspigments, cellules diversesTracesSource [47]Leau est donc le constituant majeur du lait. En effet, dans un litre de lait,on a 875g deau, soit 87,5% du volume total. Aprs leau, les nutrimentsnergtiques notamment les glucides et les lipides fournissentrespectivement 48% et 30 % de la valeur nergtique du lait. La matiregrasse du lait est constitue essentiellement de triglycrides (98% deslipides totaux), de phospholipides et dune fraction insaponifiable, formeen grande partie de cholestrol et de carotne. Les triglycrides sont desesters de glycrol. Ils sont forms par condensation de trois molculesdacides gras sur une molcule de glycrol. Le lactose est le glucide leplus important du lait. Il constitue environ 40% des solides totaux.Dautres glucides, comme le glucose et le galactose sont galementprsents. Ces derniers proviendraient de lhydrolyse du lactose. Dautresglucides peuvent se combiner aux protines. Ainsi, le lait contient 46 %de lactose, la poudre de lait crm en contient 52% alors que la poudrede lactosrum en contient prs de 70%. Quant aux protines, ce sontdes lments essentiels au bon fonctionnement des cellules vivantes.Elles constituent une part importante du lait et des produits laitiers. Dansle lait, leur concentration avoisine 32%.10 A ct de ces constituants majeurs, dautres substances comme lesminraux et les vitamines contribuent pour une part importante dans ladfinition des qualits du lait, notamment la valeur nutritionnelle.1.2 Valeur nutritive du laitLe lait prsente des qualits exceptionnelles pour la nutrition humaine.Comme luf, il contient lui seul, tous les lments ncessaires lavie humaine. Pour la couverture des besoins journaliers de lhomme, lelait sera dun apport prcieux. Un demi-litre de lait par jour permet decouvrir pour un adulte :plus de 20 % des besoins en matires protiquesPlus de 60% de calcium10% de thiamine (vitamine B1)Environ 4% de riboflavine (vitamine B2)15% des besoins journaliers en calories et 16g de matire grasse.Les protines du lait sont parmi les plus nobles. Elles viennent justeaprs celles de luf, avec une valeur biologique de 90. Les acides gras,particulirement les acides gras saturs dont la proportion peut allerjusqu 62% dans les produits laitiers, sont particulirement utilisscomme source dnergie. A ct de ces acides gras, dautrescomposantes lipidiques qui accompagnent la matire grasse au cours deson absorption comme les vitamines A et D jouent un rle essentiel danslorganisme. De ce fait, le lait constitue un apport apprciable de calcium.Lassimilation du calcium est dautant mieux assure que le lait apporteen mme temps du phosphore et de la vitamine D. La vitamine D,comme la vitamine A accompagnent la matire grasse au cours de sonabsorption. Quant au lactose du lait, il fournit de lnergie en mmetemps quil entretient la microflore lactique intestinale qui joue un rledantibiotique vis--vis des microbes pathognes. Il joue un rleimportant dans labsorption du calcium dont il constitue la sourcealimentaire principale.Le lait assure ainsi une triple scurit lhomme : apport protique,minral vitamin et nergtique. Sans parvenir remplacer le laitmaternel, le lait de vache peut parfaitement convenir aux nourrissonshumains. Pour ladolescent, le lait apporte un quilibre des rations durantla priode de croissance. Pour les femmes enceintes et les allaitantesdont les besoins protiques (surtout en acides amins essentiels) et enminraux sont parfaitement accrus, le lait sera galement un aliment de11 choix. En contrepartie de ces effets bnfiques, on met souvent lamatire grasse du lait en relation avec les problmes de sant,notamment cardiovasculaires. Mais il a t prouv que le lait et lesproduits laitiers contribuent aux apports des constituants lipidiquesathrogniques.1.3 Caractristiques organoleptiques et proprits physico-chimiques1.3.1 Caractristiques organoleptiquesLe lait est un liquide de couleur blanc mat, opaque cause des micellesde casinates. Le lait peut tre parfois bleut ou jauntre du fait de labta carotne ou de la lactoflavine contenue dans la matire grasse. Sonodeur est toujours faible et variable en fonction de lalimentation de lafemelle productrice. Il a une saveur doucetre, faiblement sucre, enraison de sa richesse en lactose[1]. La viscosit du lait est fonction delespce. Chez les monogastriques (jument, nesse, carnivores etfemme), le lait est visqueux alors que chez les polygastriques, le lait estmoins visqueux.1.3.2 Proprits physico-chimiquesCertaines caractristiques physico-chimiques du lait notamment le pH,lacidit titrable renseignent sur la qualit hyginique du lait. Dautrescomme le point cryoscopique et la densit permettent de dtecter lesfraudes. Le tableau nII donne les valeurs de rfrence pour certainescaractristiques physico-chimiques du lait.12 Tableau II : Caractristiques physico-chimiques du laitCaractristiques ValeursDensit 15C 1030 1034Chaleur spcifique 0,93Point de conglation - 0,55CpH6,6 6,8Acidit exprime en degrs16 18DornicIndice de rfraction 20C 1,35Point dbullition 100,16CSource:[46]1.3.2.1 Acidit du laitDs sa sortie du pis de la vache, le lait a une certaine acidit. Cetteacidit est due principalement la prsence des protines, surtout lescasines et les lactalbumines, de substances minrales telles que lesphosphates et le gaz carbonique, ainsi que des acides organiques, leplus souvent lacide citrique. On lappelle acidit apparente ou aciditnaturelle du lait. Lacidit sapprcie par le pH et renseigne sur ltat defracheur du lait et sa qualit hyginique. A la traite, le pH du lait estcompris entre 6,6 et 6,8 et reste longtemps ce niveau. Toutes valeurssitues en dehors de ces limites indiquent un cas anormal (ex :mammites).Lacidit du lait peut sexprimer galement en acidit titrable ou aciditDornic. Celle-cimesure tous les ions H+ disponibles dans le milieu, quilssoient dissocis, c'est--dire ioniss ou non. Il mesure la fois le pHinitial du lait normal et lacidit dveloppe aprs la traite par lafermentation lactique qui diminue le pH jusqu 4 ou 5. Lacidit detitration indique donc le taux dacide lactique form partir du lactose.Elle sexprime de deux faons : soit en pourcentage (%) dquivalentdacide lactique, soit en degr DORNIC qui est le nombre de dixime demillilitre de soude utilise pour titrer dix (10) millilitres de lait en prsencede phnophtaline[2].Il faut noter que deux laits peuvent avoir des pH identiques, c'est--direles mmes tats de fracheur, mais avoir les acidits titrables diffrentes.De mme, deux laits peuvent avoir des acidits titrables identiques avecdes pH diffrents[47].13 1.3.2.2 Densit et masse volumique du laitLa densit est le rapport de la masse dun volume de lait donn sur lamasse du mme volume deau 20C. Elle varie donc en fonction de latemprature. La densit moyenne du lait de mlange est comprise entre1030 et 1033 20C. Pour un lait individuel, cette valeur est compriseentre 1020 1038.1.3.2.3 Point de conglationLe point de conglation est le point au niveau duquel apparaissent lespremiers cristaux. Pour le lait, le point cryoscopique dpend de sescomposantes solubles tels que le NaCl et le lactose. Sa mesure permetdapprcier la quantit deau frauduleusement ajoute au lait (NF, V04 205 de janv. 1969 ; AFNOR, 1980 et FIL, 1983). Le point cryoscopiquese mesure soit avec des thermomtres de haute prcision (1/100edeedegr) ou avec des appareils plus prcis du type osmomtre (au 1/1000de degr). Pour le lait de vache, le point cryoscopique est identique celui du srum sanguin. Il est de lordre de 0,555C. Le mouillage lvele point cryoscopique en direction de zro degr. Lcrmage nemodifiant pas le point de conglation. Par contre, lacidification du lait ouladdition de sels minraux abaisse le point de conglation.1.3.2.4 Point dbullitionLbullition propre du lait a lieu de 100,15C 100,17C voire 100,55C.Cependant une temprature voisine de 80 90C, lorsquon porte lelait sur le feu, il y a monte du lait c'est--dire formation dune membraneprotinocalcaire ou peau du lait (frangipane) qui gne lbullition du lait[7]. Pour bouillir le lait, il faut liminer cette peau de lait.Les caractres physico-chimiques du lait que nous venons de voir,notamment le pH et essentiellement lacidit, vont influencer dans unecertaine mesure la microbiologie du lait et produits laitiers.14 1.4 Microbiologie du lait et des produits laitiersLe lait peut contenir de nombreuses espces microbiennes. Pourcertaines, il constitue un bon milieu de culture, pour d'autres, il n'estqu'un vhicule. En fonction de son origine, la microflore du lait sedistingue en microflore indigne ou originelle et en microflore decontamination. La flore indigne ou originelle est lensemble desmicroorganismes retrouvs dans le lait la sortie du pis. Les germesindignes sont principalement des microorganismes msophiles. Ce sontles bactries du genreMicrococcus, Lactobacillus, StreptococcusetLactococcus. Ces derniers constituent galement la flore technologiquedu lait. A ct de cette flore technologique, nous avons les florespathogne et daltration qui altrent la qualit hyginique ettechnologique du lait.1.4.1 Flore daltrationLa flore de contamination du lait est constitue essentiellement decoliformes, des bactries psychrotrophes, de la flore ditethermorsistante, de levures et de moisissures.Les coliformes sont presque prsents dans le lait cru. Du point de vuetechnologique, certaines assurent la fermentation du lactose, produisant,outre des acides, des gaz (hydrogne et gaz carbonique) qui font gonflerles fromages. De plus, elles laborent diverses substances confrantaux produits des gots et des odeurs trs dsagrables. Certainesespces peuvent tre responsables d'infections gastro-intestinales.Quant la flore psychrotrophe, elleest constitue des micro-organismesqui ont la facult de se dvelopper une temprature gale ou infrieure 7 C. Cest le cas des bactries du genrePseudomonasquon retrouvesouvent dans des laits refroidis. Ces derniers peuvent produire deslipases et des protases thermorsistantes ayant pour consquencel'apparition de gots trs dsagrables (amer, rance ou putride) dans lesproduits laitiers. Pour ce qui est de la flore thermorsistante, il sagit debactries capables de rsister aux traitements thermiques usuels utilissdans le but d'assainir ou de conserver le lait. Cest le cas des bactriesdu genreBacillus, dont lactivit enzymatique peut tre responsable del'acidification, de la coagulation ou de la protolyse des laits de longueconservation. Quant aux bactries du genreClostridium, elles sontresponsables du gonflement de certains fromages, mais aussi des gotsrances et piquants, trs dsagrables. L'une d'elles,Clostridiumperfringens, peut tre dangereuse par ses toxines. Quant aux levures et15 moisissures, leur prsence la surface des yaourts, fromages, crme etbeurre, est un indice d'une pollution qui dprcie l'aspect et le got desproduits. En plus, les levures et moisissures supportent des pH de 3 8,avec un optimum de 4,5 6,5, ce qui explique leur prsence dans le laitcru comme dans le lait caill[36].1.4.2 Flore pathogneLe lait et les produits laitiers peuvent contenir des germes pathognespour l'homme. L'animal, l'environnement, l'homme et le matriel malnettoy sont lorigine de ces contaminations. Parmi lesmicroorganismes pathognes que lon trouve dans le lait, on peut citerles staphylocoques, les entrobactries, les germes zoonotiques commeles brucelles et le bacille tuberculeux sans oublier certains virus commecelui de lhpatite A[26].Les staphylocoques sont retrouvs frquemment dans le lait. L'origine dela contamination est la mamelle malade mais aussi l'homme. Lesstaphylocoques provoquent, par la production dune toxine thermostable,des intoxinations de gravit variable pouvant tre redoutables chezl'enfant. Les produits laitiers responsables sont le plus souvent le lait cru,le lait concentr, le lait en poudre et les crmes glaces. Unefermentation inhibe dans une certaine mesure la croissance desstaphylocoques. Ainsi, au cours de l'affinage des fromages, ilsdisparaissent progressivement, mais le risque subsiste s'il y a euaccumulation pralable de toxines. Les entrobactries susceptibles dese retrouver dans le lait sont les salmonelles,Escherchia coli, etYersinia.Ces entrobactries sont responsables des toxi-infectionsalimentaires et ont pour origine la consommation du lait et des produitslaitiers qui nont pas subi de traitement d'assainissement par la chaleur,ou recontamins aprs le traitement thermique.A ct de cette flore pathogne et daltration, nous avons dans le lait laflore dintrt technologique ou utile reprsente essentiellement par lesbactries lactiques, les levures et les moisissures.1.4.3.Microflore lactique du laitLa flore lactique est utilise en industrie laitire, sous forme de fermentou levain pour la fabrication de produits laitiers ferments. Lintrt16 technologique des bactries lactiques rside dans la production del'acide lactique par la fermentation du lactose. La production d'acidelactique, en faisant baisser le pH, provoque une dstabilisationprogressive de la dispersion micellaire, ce qui rend le lait de moins enmoins stable aux traitements thermiques et peut entraner sacoagulation, mme temprature ambiante. Lors de la fermentation, enplus de lacide lactique, certaines bactries lactiques produisent du gazcarbonique ainsi que divers composs qui contribuent l'arme desproduits laitiers. Par leur production d'enzymes protolytiques, lesbactries lactiques contribuent l'affinage des fromages.Les bactries lactiques forment un groupe trs htrogne. Elles ont encommun les caractres suivants :gram +microarophiles ou anarobies facultatifsfermentation des sucresnon rduction des nitratespeu ou pas protolytiques dans le lait[35].Parmi les bactries lactiques ayant comme habitat le lait, nous avons legenreStreptococcus,Lactococcus,Lactobacillus,Enterococcus,LeuconostocetAerococcuscomme le montre le tableau II.17 Tableau III :Classification des bactries lactiquesFAMILLE GENRE PRINCIPALES ESPECESLactobacillacaeLb.acidophilus,Lb.delbrueckii(homofermentaires)LactobacillusLb.plantarum,Lb.casei,Lb.sakei(htrofermentaires facultatifs)Lb.brevis,Lb.fermentum(Htrofermentaires stricts)StreptococcaceaeSt.pyogenes(groupe A)St.agalactiae(groupe B)StreptococcusSt. dysgalactiae, St. equi(groupeC)St.bovis, St. equinus, St. suis(groupe D)Lc. lactisLactococcusLc. garviae,Lc. plantarum,Lc. raffinolactisEnterococcaceaeEnterococcusE. faecalis, E. faecium, E. durans,E. hirae,E.gallinarum,E.casseliflavus,E.malodoratus, E. mundtiiLeuconostacaeLn.mesenteroides,LeuconostocLn pseudomesenteroides,Ln lactisAerococcaceaeAerococcusAc.viridansSource : [13]1.4.3.1 GenreStreptococcusCe sont des bactries en forme de coques ayant pour principalescaractristiques dtre Gram-positif, catalase-ngatif et asporogne. Lesstreptocoques lactiques appartiennent au groupe srologique N, sontfaiblement hmolytiques, mais jamais pathognes, et sont prsents dansle lait cru et les produits laitiers ferments. Ils se caractrisent parlabsence dantigne connu, leur temprature de croissance minimale estde 19-21C et optimale est de 42-43C. Ils sont rsistants au chauffage 60C pendant 30 min et sont incapables de crotre en prsence de 4%de NaCl et pH 9,6.18 Streptococcus thermophilusest la seule espce dintrt industriel etnutritionnel du genre streptococcus. En effet, ses cellules de formeovodes, se groupent en longues chanes, sont homofermentaires etproduisent lacide lactique. Il lui est reconnu le rle dagent initiateur delacidification en laiterie industrielle.1.4.3.2 GenreLactococcusLes lactocoques sont des coques gram positifs, de 0,5 1 m dediamtre. Ils prsentent un groupement typique en chanettes,immobiles, dpourvus de spores et rarement capsuls. Aro-anarobiefacultatifs, ils se dveloppent aussi bien en absence doxygne quenprsence doxygne. Ils sont msophiles, avec un optimum decroissance de 37C. Les lactocoques ne tolrent pas les milieux acideset sals. Ils sont incapables de crotre pH 9,6 et en prsence de 6,5%de NaCl. Lactivit mtabolique de lactococcus varie, mais toutes lesespces se caractrisent par labsence de catalase et lutilisation de lavoie fermentaire pour la dgradation de certains glucides, sansproduction de gaz. Ils sont donc homofermentaires et produisentexclusivement de lacide lactique[43].En technologie laitire, les lactocoques jouent un rle de bioconservateur . En effet, des germes commeLactococcus lactisetLactococcus cremorisproduisent respectivement la nisine et la diplococcine , qui sont des bactriocines. Ces derniers inhibent lacroissance des autres germes pouvant avoir un effet nfaste sur lascurit des produits. Il leur est galement reconnu le rle dagentinitiateur de lacidification en laiterie.Ce rle est reconnu lactococcuslactispour le caillage naturel [19].1.4.3.3 GenreLactobacillusLes lactobacilles sont des bactries en forme de btonnets ou decoccobacilles. Elles sont soit isoles, soit en chanes. Elles sont souventmobiles grce des flagelles pritriches. EIles se dveloppent destempratures comprises entre 35 et 45C et leur optimum de pH est 5,5.Leur croissance sarrte lorsque le pH avoisine 3,5[13].Leslactobacilles fermentent le lactose et dautres sucres pour produirelacide lactique. Ils occupent une place de choix en bactriologieapplique. EIles appartiennent en effet aux ferments lactiques et cetitre, elles interviennent en industrie laitire (fabrication de yaourts, kfirs,19 fromages etc.)[47].Chez lhomme (ainsi que chez d'autres animaux) leslactobacilles sont des htes trs rpandus et gnralement utiles. On lestrouve notamment dans le tractus gastro-intestinal o ils participent lquilibre de la flore intestinale[13].1.4.3.4 GenreLeuconostocLes bactries du genreLeuconostocsont htrofermentaires. Ellesproduisent partir des hexoses, du CO, de lthanol, et de lacide2lactique. Le genreLeuconostocse distingue des lactobacilleshtrofermentaires producteurs de gaz par deux principaux caractres :incapacit produire de lammoniac partir de larginine, et la formationdacide lactique partir du glucose. Les leuconostoc coagulent rarementle lait et sont souvent lorigine de rpugnance des denres pour leconsommateur[29].1.4.3.5 GenreEnterococcusLes entrocoques sont des htes normaux du tractus intestinal desanimaux sang chaud. Mais ils sont aussi prsents sur les plantes etchez les insectes. Plusieurs espces peuvent avoir un caractrepathogne. Ils se distinguent des autres bactries lactiques en forme decoque par la prsence dantigne du groupe D et par leur aptitude crotre 10 et 45C, en prsence de 6,5% de NaCl ou de 40% de bile ou pH 9,6. Cependant, les espces nouvellement identifies ne possdentpas ces caractristiques. Le genre enterococcus a aussi un mtabolismehomofermentaire et produit de lacide lactique.1.4.3.6 GenreAerococcusAc viridansetAc urinaesont les seules espces reconnues du genreAerococcus. Il est trs diffrent des autres genres du groupe lactique. Eneffet, il se prsente sous forme de sphres immobiles de 1 2m qui onttendance former des amas, mais aussi des paires et des ttrades(culture frache en milieu riche). Il est homofermentaire, peu acidifiant,Gram-positif et catalase-ngative ou faiblement positive, microarophile.Les arocoques ont aussi beaucoup de similarits biochimiques etphysiologiques avec les entrocoques, lactocoques et streptocoques, et20 sont souvent confondus avec ces derniers. Ils interviennent aussi dans lafermentation lactique par production dacide lactique comme les autres[13].La flore acidifiante du lait n'est pas uniquement constitue de bactrieslactiques. On a aussi des bifidobactries qui interviennent dansl'acidification. En effet les bifidobactries sont des htes normaux dutractus digestif des vertbrs et des insectes. Le rle fondamental quejouent les bifidobactries dans les cosystmes digestifs justifie leurutilisation en technologie laitire. Enfin, nous avons les levures et lesmoisissures qui participent galement laffinage des fromages alorsque dautres entrent dans la fabrication de certains produits laitiersferments tels que le Kfir et le Koumis[20,43,44].1.4.4 Principales activits microbiennes dans le laitLes activits mtaboliques des microorganismes prsents dans le laitpeuvent avoir des effets positifs ou ngatifs sur lapparence, lodeur, laconsistance ou la texture et le got des produits laitiers. Parmi cesactivits on peut citer lacidification, la production de gaz et dalcool, lelimonage, la protolyse et la lipolyse.1.4.4.1 AcidificationLes bactries lactiques, lors de leur croissance, hydrolysent le lactose dulait grce la bta-galactosidase pour produire deux nouveaux sucres :le glucose et le galactose. Gnralement, le glucose provenant de cettehydrolyse sera ferment pour produire des composs acides, du gazcarbonique ou de lalcool. Cette production de composs acides vaentraner un abaissement de pH. Cet abaissement de pH peut induiredes odeurs et des gots particuliers, mais aussi une coagulation du lait,si on atteint le point isolectrique de 4,6. Lacidification est un bon indicepour valuer la qualit microbiologique et le respect de la chane de froiddu lait cru.21 1.4.4.2 Production de gazCertaines bactries lactiques ne produisent que de lacide lactique lorsde la fermentation du lactose. On dit quelles sont homofermentaires.Toutefois dautres bactries lactiques produisent du COet dautres2sous-produits en addition lacide lactique. On les qualifiedhtrofermentaires ou gazognes. Outre les bactries lactiqueshtrofermentaires, on a aussi des bactries non lactiques acidifiantesproduisant aussi du COcomme sous-produits de leur fermentation. La2plupart de ces bactries non lactiques htrofermentaires sont doriginefcale ou tellurique, c'est--dire du sol. Leur prsence traduit un dfautdhygine.1.4.4.3 Production dalcoolLa production dalcool est souvent lie la prsence des levures dansun produit laitier. La principale consquence est lapparition dune odeurlevure ou alcoolise.1.4.4.4 Production de polysaccharides ou de polypeptidesCertains microorganismes utilisent les sucres ou les protines du laitpour produire des molcules plus grosses appeles respectivementpolysaccharides et polypeptides. On dira de ces microbes quils sontfilants, limoneux, texturants ou paississants. La production de ceslongues molcules donne au lait une texture visqueuse ou graisseuseen raison de leur grosseur et de leur longueur. Comme la plupart de cesmicroorganismes sont msophiles, la prsence de ce problme dansles produits laitiers est souvent un indice du non respect des rglesdhygine.1.4.4.5 ProtolyseAu cours de leur activit mtabolique, certains microbes grce lactionde leur protase, utilisent les protines du lait. Ce phnomne produit lalibration de sous-produits trs varis, dont des peptides longuechanes ou courte chanes, des acides amins et des drivs dacidesamins. Lors de laffinage des fromages, la protolyse joue un rleprimordial dans lobtention dune texture caractristique et de flaveurs22 dsires pour divers types de fromages. Cest une utilisation contrlede la protolyse. Si cette activit protolytique nest pas contrle enraison de la prsence de contaminants bactriens dans le lait cru oupar perte de contrle de ferment, on peut alors voir apparatre desgots amers, des flaveurs non dsires et atypiques ou des texturesinadquates durant laffinage des fromages. De plus cette protolysepourra tre lorigine de lapparition de got indsirable, celui de vanilledans certains produits laitiers et de fraise dans du yogourt nature1.4.4.6 LipolyseLes bactries lactiques, grce leur lipase, peuvent dcomposer lesmatires grasses et les acides gras libres du lait, entranant lapparitiondodeur rance dans le produit laitier. Les produits laitiers haute teneuren matire grasse sont plus sensibles la dgradation par lesmicroorganismes lipolytiques. Dans lindustrie laitire, on exploite cetteactivit lipolytique de faon contrle dans la production de certainsfromages comme le brie et le saint-paulin. Lorsque la lipolyse nest pascontrle ou exagre, on observe lapparition de fortes odeurs et degot rance[47].23 Chapitre 2 : LES LAITS FERMENTESOn rassemble sous le terme de laits ferments, diffrents laits ouproduits laitiers obtenus par la fermentation du lait par des bactrieslactiques et ventuellement d'autres micro-organismes, notamment deslevures. Le lait ferment se diffrencie du fromage frais qui est un produitfrais ou affin, obtenu par gouttage aprs coagulation du lait, de lacrme, du lait crm ou partiellement crm (Codex alimentariusFOA/OMS).2.1 Phnomne de la fermentationLa fermentation est un processus au cours duquel le lactose esttransform en acide lactique, sous laction des microorganismesindignes du lait ou ajouts sous forme de ferment lactique ou levain.Dans le langage courant, on parle gnralement delait caill.Lafermentation conduit la prise en masse du lait par la coagulation de lacasine. Le coagulum obtenu est ferme, sans exsudation de lactosrum.Lpaississement du lait ferment correspond la modification de lastructure des protines du lait, suite lacidification du milieu qui rsultede la transformation du lactose en acide lactique par les ferments.Ladjonction de poudre amliore davantage la consistance et la fermetdes laits caills[1].En plus de labaissement du pH, la fermentationpermet dobtenir des produits de consistance plus ferme et darmesspcifiques. Elle na donc pas pour seul but lallongement de la dure deconservation du lait. Elle rend les aliments plus digestes et de saveurplus agrable.De ce fait, lesaliments ferments sont plus nutritifs et plusassimilables que les matires premires dont ils proviennent[3].Historiquement, on a obtenu les premiers produits laitiers ferments,accidentellement et de faon non contrles, par le caillage du lait avecles bactries lactiques contaminantes du lait. Ces produits taient fortpriss en raison de leur facilit de conservation puisque leur pH acideinhibe une grande proportion des micro-organismes de dgradation ainsique la plupart des pathognes. Ds le XXe sicle, il a t reconnu que laconsommation des laits ferments avait un effet favorable sur la sant etconstituait une bactriothrapie lactique. Il existe un grand nombre delaits ferments qui diffrent par leurs matires premires, leur floremicrobienne, leur technologie, leur texture, leur got et leur dure deconservation. Certains sont voisins, mais prsents sous des nomsvaris.24 2.2 Diffrents types de laits ferments2.2.1 Yaourt ou yoghourtSelon la norme A-11a de 1975 du Codex Alimentarius : le yoghourt estun produit laitier coagul obtenu par fermentation lactique grce laction deLactobacillus bulgaricuset deStreptococcus thermophiluspartir du lait ou des produits laitiers et avec ou sans adjonction de lait enpoudre, lait crm en poudre, lactosrum concentr ou en poudre,cultures lactiques...etc.Le yaourt ou yoghourt est le lait ferment le plus connu et le plusconsomm dans le monde. Les principales tapes conduisant lobtention du yaourt sont mentionnes dans la figure n1.25 Figure 1 : Diagramme des principales tapes dans la fabrication du yoghourtPrparation des levainsLAITStandardisationFERMENTS LACTIQUESEn matire grasseEntretienConcentration ouDes souchesAddition de poudreMultiplicationTraitement1stadethermiqueerHOMOGENEISATIONMultiplication2stadeeRefroidissement tempraturede fermentationLEVAINS LEVAINSEnsemencementConditionnementFermentation encuvesBrassage du coagulumFermentation enCuves chaudesRefroidissementRefroidissementConditionnementStockageStockage rfrigrrfrigrYAOURT FERME YAOURT BRASSE26 Le yaourt peut tre consomm en l'tat (yaourt ferm) ou aprsbrassage lui donnant une consistance crmeuse ou liquide. Deuxbactries lactiques sont associes la fabrication du yaourt. Il sagit deStreprococcus salivarius, subsp.thermophilus(anciennement dnommStr.thermophilus), etLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus(anciennement dnommL. bulgaricus).Dans le yaourt, ces deuxbactries doivent tre ltat viable et en quantits abondantes. Aumoment de la vente au consommateur, le yaourt ne doit pas contenirmoins de 0,8g dacide lactique pour 100g de lait[26].Outre le gotacidul qu'elles donnent au gel, ces bactries lui assurent une saveurcaractristique due la production de composs aromatiques(actaldhyde principalement, ctone, actone, diactyle). Enfin, cesdeux bactries produisent des polysaccharides (glucanes).Ces deux bactries ont des rles trs complmentaires.Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus, ne produit que de l'acide lactique. Il sedveloppe bien la temprature de 45 50 C en acidifiant fortement lelait jusqu' 1,8 pour cent (pH voisin de 4,5), voire, avec certainessouches, jusqu' 2,7 pour cent d'acide lactique (pH 3,8 3,6). Quant Streptococcus salivarius, subsp. thermophilus, il se dveloppe destempratures comprises entre de 37 40 C. Nettement moins acidifiantquelactobacillus, il produit gnralement 0,5 0,6 pour cent d'acidelactique (pH voisin de 5,2).Le yaourt contient divers composs volatiles et aromatiques intervenantsdans sa saveur et son apptence. Parmi ceux-ci, outre l'acide lactiquequi confre au yaourt son got acidul, nous avons l'actaldhyde qui aun grand pouvoir aromatisant. Dautres composs (actone, actone,butane-2-one, etc.) contribuent l'quilibre et la finesse de la saveurdu yaourt. C'est principalement le lactose qui joue un rle dans laformation de composs aromatiques dont la production est dueprincipalement aux lactobacilles.2.2.2 Autres laits ferments2.2.2.1 KfirDe la catgorie des laits ferments alcooliss, le kfir a des originescaucasiennes. On le retrouve galement en Asie du sud-ouest et enEurope de l'est. Il a une texture visqueuse mais homogne avec unesurface plutt luisante. Son got est fortement acide avec de lgersarmes de levure et dalcool. Le kfir est obtenu partir du lait de vache,27 de brebis ou de chvre. Il est le fruit dune fermentation lactique parlactobacilles et streptocoques, associe celle qui provient dudveloppement dune levure transformant le lactose en alcool.Traditionnellement, lors de la fabrication du kfir, on ensemence le lait laide de grains de kfir. Ces grains proviennent dune macration longuedu lait dans une outre, en prsence dun fragment destomac de moutonou de veau. Aprs plusieurs utilisations, il se dveloppe sur la paroiinterne de loutre une crote spongieuse contenant des levures et desbactries. Cette crote est divise et sche en petits grains[16].Lafermentation du kfir seffectue en deux tapes.Lacidificationqui a lieuentre 22 et 25 C pendant une priode de 8 12 heures etlaffinageune temprature entre 10 et 16C, pendant 12 et 14 heures.[26].2.2.2.2 koumisComme le kfir, il fait partie de la catgorie des laits fermentsalcooliss ; Il est le plus souvent sous forme de boisson. On le fabriquaitau dpart, partir du lait de jument, mais aujourdhui, on trouve sur lemarch du koumis fait partir du lait crm de vache supplmentavec 2,5% de sucre. Comme ferment ; on utilise gnralement unmlange symbiotique de la bactrie thermophileLactobacillus delbrueckiissp. bulgaricuset de levures du genreSaccharomyces. Dans un premiertemps, on ajoute une quantit suffisante de ferment de manire atteindre une acidit de dpart pour le mlange de 45 50D.Lincubation du mlange 25-26C seffectue avec agitation, pendantune priode de 15 20 minutes. Le but de cette agitation est depermettre la prolifration de la biomasse de levures favorise parlarobiose. On poursuit avec de courtes agitations de une deuxminutes raison de trois quatre fois durant la premire heure. Aprs 2 4 heures, Selon les recettes et lactivit du ferment, on agite denouveau pendant 30 60 minutes jusqu lobtention du got typique dekoumis. On termine les oprations avec le refroidissement et leconditionnement.2.2.2.3 Lait lacidophileLe lait entier ou crm est soumis un traitement thermique. Selon lesfabricants, il est soit pasteuris 95 C pendant 30 secondes; soitchauff pendant 1 heure une temprature proche de l'bullition. Aprsrefroidissement 37 C, il est ensemenc avec 1 5 pour cent d'uneculture pure de Lactobacillus acidophilus. Le lait est ensuite maintenu 28 36-37 C jusqu' ce qu'il coagule, ce qui demande de 20 24 heures.Aprs cette tape, on procde un brin du gel jusqu lobtention dunmlange uniforme. Il est alors mis au froid (vers 5 C) jusqu' saconsommation, qui doit tre rapide afin d'viter une acidificationexcessive. Le produit se prsente comme une crme d'odeur lgre etde saveur acidule particulire[26].2.2.2.4 Leben ou DahiCest un produit trs proche du yaourt traditionnel en Europe du SUD-EST et au Proche-Orient, il prend le nom deTiaourtien Grce,Tarhoen Hongrie,Matzoon et Katyken Transcaucasie,Lebenen Egypte etau Liban,Masten Iran,Robaen Irak,Dahien Inde. Il est fabriqu partir des laits disponibles dans ces diffrents pays : vache,chvre, brebis ou bufflonne, entiers ou crms. Le lait partiellementconcentr par bullition est ensemenc en ferments contenus dans desfabrications de la veille. On conserve jusqu coagulation la tempraturede 45 50C ncessaire. Le produit obtenu peut tre dilu leau ;cest le cas duDoughet de lEyranen Turquie. On le consommesouvent aromatis avec des essences vgtales (essence de Kakuti, dementhe ou de rose). On peut galement le mlanger de la farine defroment quon laisse fermenter puis scher au soleil ; cest le Kushuk enIrak, le Kishk au Liban et le Tarhana en Turquie.[16]2.2.2.5 Lait filCest un lait acide, de consistance visqueuse, surtout consomm dansles pays scandinaves, dnommTaetteen Norvge, etLangmjolkenSude. Lacidification lactique est combine laction des bactriesfilantes. Lensemencement est fait partir de prparations antrieures ;le lait mis dans de grandes cuves fermente 100C. Lacidit saccrot etla viscosit obtenue dcrot aprs plusieurs semaines. La conservationdu Taette peut tre de plus de dix mois, sa teneur en acide slevantjusqu 2,5%.[16].Comme partout ailleurs, les laits ferments sont prsents dans toutelAfrique o ils portent galement des noms varis. Cest le cas du Katch,du Mbannick et du kossam au Sngal ; du rouaba et pendidam et durayeb au Tchad, de larera en thiopie, du Kossam au Cameroun, dufn au Mali etc.Dans ces pays en dveloppement, les laits fermentsprsentent un grand intrt en raison de leur acidit qui en facilite la29 conservation. De plus, ils prsentent une bonne valeur nutritionnelle, desqualits organoleptiques gnralement trs bien acceptes ainsi qu'unerelative facilit de prparation et de distribution.2.3 Intrt nutritionnel des laits fermentsLes produits laitiers ajoutent leurs proprits propres aux qualitsnutritionnelles du lait utilis. Il y a un accroissement de la valeurbiologique du lait suite laction denzymes hydrolytiques facilitantlassimilation du lactose, des protines et des lipides. L'acidificationconstitue du point de vue hyginique un atout majeur. En effet, elleprvient la croissance de la plupart des germes pathognes et assure,par des moyens qui peuvent tre trs simples, la conservation du lait.Les laits caills favorisent un bon quilibre de la flore intestinale chezlenfant bas ge ou aprs un traitement aux antibiotiques[17].Pour lespays en voie de dveloppement, Les laits ferments constituent desaliments de haute valeur nutritionnelle plus facilement recommandableque le lait cru. En effet, ces produits ferments bnficient duneprotection acide bien utile lorsque lhygine fait dfaut et, en outre,semblent mme de rsoudre lgamment le difficile problme delintolrance au lactose[22].Dautres effets bnfiques sont associs la consommation des laitsferments. On peut citer la tolrance au lactose du lait cru chez certainespersonnes dficientes en -galactosidase. Chez ces personnes, lelactose n'est plus hydrolys; il n'est donc plus absorb dans l'intestingrle. Il va atteindre le colon, o il sera ferment par la flore intestinalepour produire des gaz. Les laits ferments sont susceptibles d'apporterune solution simple car lhydrolyse du lactose a eu lieu in vitro, au coursde la fermentation. Un certain nombre de travaux chez l'animal montrentgalement que l'ingestion de laits ferments est susceptible de modifierla flore intestinale de l'hte, en particulier de diminuer la quantit degermes indsirables. Plusieurs tudes depuis les annes 50 indiquentque l'ingestion de lait ferment par Lactobacillus acidophilus estsusceptible de rduire le nombre d'Escherichia coli dans les selles chezlhomme. Cette proprit est utilise avec succs dans le cas d'enfantssouffrant de diarrhes.30 Limportance du lait ferment ne se situe pas seulement sur le plannutritionnel. En Afrique, dans les communauts des leveurs, le lait joueun grand rle dans la vie conomique, sociale et culturelle.2.4 Importance socioculturelle du lait fermentEn Afrique, en absence de moyens de conservation efficaces, le lait crunest que rarement commercialis, mais les leveurs fabriquent desproduits issus de la fermentation du lait ventuellement suivie dubarattage. Les diverses techniques laitires sont trs prsentes dans laculture des peuples de pasteurs et les usages alimentaires oucosmtiques des produits laitiers correspondent des habitudes trsanciennes. Ces usages restent dailleurs encore aujourdhui trsprsents dans les villes[3].Le lait ferment revt et tmoigne desdiffrents traits de la culture des peuples du Sahel, essentiellementpasteurs de tradition. Le lait demeure un facteur essentiel dans ladtermination de lorganisation sociale et familiale, dans le modedalimentation, dans les changes, dans le dveloppement etlappropriation des techniques, dans la culture et ses reprsentationsrituelles et symboliques. Cette importance socioculturelle est dautantplus grande quelle est prsente surtout chez les peuhls. En effet, leconcept de lait (dans la vie familiale) est lun des principaux facteurs dereproduction du pulaku , ce sentiment primordial dappartenir lethnie peuhl, sentiment qui inspire tous les comportements permettantau peuhl, berger par excellence, de se raliser en tant que membredune communaut spcifique.[30].On trouve des produits laitiers fermiers dans lensemble de la bandesahlo-soudanienne de lAfrique subsaharienne. Ils sont fabriqus partir du lait de vache, du lait de petits ruminants ou dun mlange desdeux. Il est noter que le lait de chamelle, malgr son importance, nefait lobjet daucune transformation traditionnelle en raison de ses faiblescapacits au caillage lactique ou enzymatique[14].Les femmesdleveurs contrlent lessentiel de la filire laitire, mme si elles nesoccupent pas systmatiquement de la traite. Aprs la traite, le laittombe dans le domaine domestique spcifiquement fminin. Lespouses du chef de famille sont responsables de la rpartition du laitentre les personnes, surtout les enfants. En priorit la consommationfamiliale, le surplus tant commercialis.31 Chapitre 3 : METHODES DISOLEMENT, ET DIDENTIFICATION DESBACTERIES LACTIQUES DANS LE LAITLes bactries lactiques sont prsentes dans le lait cru, les produitslaitiers tels que les fromages, les yaourts et le lait ferment. Poursinscrire dans une dmarche qualit visant au dveloppement desbactries lactiques effet sant ou dintrt technologique, lisolement,le comptage et la caractrisation parfaite de ces bactries sontncessaires. De nos jours, il existe plusieurs milieux slectifs pour isolerles bactries lactiques. Des outils sont galement disponibles pour lescaractriser au niveau du genre, de lespce ou de la souche.3.1 Mthodes didentification phnotypique3.1.1 Critres de diffrentiationLanalyse phnotypique des microorganismes tudis est base surlobservation microscopique, sur ltude de leur comportement dansdiffrentes conditions de culture, sur la production de divers mtaboliteset enzymes spcifiques et sur diverses autres aptitudes particulires[13].Pour les bactries lactiques, les critres de biotypages les plus utilisspeuvent tre rsums comme suit :morphologie, mobilit, production de capsule ou de pigment(examen microscopique aprs coloration).Croissance en arobiose ou en anarobiose et diffrents pH,tempratures et concentration de NaCl, en prsence de bile, debleu de mthylne, dthanol ou dautres inhibiteurs.Production de COen milieu glucos, de H, HOou HS en milieu22222glucos de COet de H partir du lactate, de NH partir de223larginine, dactone partir du glucose ou du citrate, depolysaccharidesIsomre optique de lacide lactique produit par fermentation duglucoseProfil de fermentation de nombreux sucres par galeriedidentification.Hydrolyse de larginine, de lhippurate, de lesculine, de lamidon,de lure.32 Autres caractres particuliers ; par exemple hmolyse alpha oubta (pathogne), rduction du tetrazolium, du tellurite depotassium, dcarboxylation de la tyrosine, activit lipolytique.Observation posteriori de la synthse denzymes spcifiques(catalase ou pseudocatalase, phosphatase alcaline, alpha-galactosidase, bta-galactosidase, pyrrolidoxylarylamidase,glucose-6-phosphate dshydrognase, mobilit lectrophortiquede la D-lactodshydrognase et de la L- lactodshydrognase .Les bactries lactiques ont de grandes exigences nutritionnelles.Ltude de leurs proprits physiologiques et biochimiques ncessitedes milieux de culture complexes et riches mais aussi capablesdinduire ou de mettre en vidence les proprits spcifiques dessouches bactriennes tudies.3.1.2 Milieux commerciaux pour lidentification des bactrieslactiquesMilieux pour les lactobacillesOn peut avoir dans ce cas les milieux tels que: la glose acidesorbique ; la glose RCM ; la glose MRS ; la glose Rogosa. On aaussi les bouillons tels que: bouillon MRS ; le bouillon Rogosa et lebouillon test[13].Milieux pour lactocoquesOn peut utiliser : le milieu de Chalmers, le milieu de Mac Cleskey(pour les bactries lactiques gazognes) ; le milieu de Reddy ; lemilieu de Turner ; la glose M17, le bouillon M17.Milieux pour streptocoquesOn peut utiliser : la glose azide; la glose M17 Terzaghi ; le bouilloncur-cervelle, le bouillon M17 ;..Etc.Milieux pour entrocoquesCest le bouillon glucos lazide de sodium ; le milieu de Barnes; lemilieu KF ; milieux de Rothe et Lisky ; milieu de Slanetz.33 Milieux pour pdiocoquesLe milieu MRS en bouillon ou glose, peut intervenir galement danslisolement des pdiocoquesMilieu pour leuconostocLe milieu de Gravie peut nous tre dune grande utilit pour isoler lesleuconostoc.Milieu pour bifidobactriesCe sont les milieux: TPY; Casitone 10g, glose LBS; glose VL.Milieux pour propionibactriesOn utilise le milieu Trypticase (BBL) 1 %3.1.3 Milieux, conditions de culture et aspect des bactrieslactiques frquemment rencontres dans les laits fermentsLes tableaux III et IV donnent les milieux disolement, les conditionsde culture et laspect des colonies pour quelques bactries lactiquesfrquemment rencontres dans les laits ferments.34 TABLEAU IV:Milieux disolement et de dnombrement des bactries lactiquesdans les produits laitiers.Dans les yaourtsGermes Milieux Incubation Aspect des colonies37 C pdt 3jMRS acidifienSt.thermophilusanarobioseCirculaires, blanches, opalescentesavec bordure bien dfiniesSMA (SkimMilk Agar)37 C pdt 3jMRS acidifienSMA (SkimanarobioseLb.delbrueckii.Rondes, grises, plates avecMilk Agar)ssp bulgaricusbordure non dfinie47 C,SMA acidifipdt 2j,AnarobieSource :[10]35 Dans le lait ferment et drivspopulations Milieux Incubation Aspect des coloniesCLBSMRS salicin37 C, 2jColonies Bleues avec pourtour blancMRS sorbitolanarobieHHDLA agarLBSTPPYpetites colonies blanches violettes,MRS maltoseLb.acidophiluslgrement leve et un peu flouMRS arabinose37 C, 2jBriggs agararobieModifiedBriggs agar3 BLA37C, 3jcolonies bleuesBile-MRSanarobieRCA pH 5,5T-MRS37C, 3jcolonies bleuesG-MRSarobieX-GluLb. caseiLC (lb.casei37 C, 2jColonies blanchesanarobieagar)HHD37 C, 2janarobieColonies en point dpingleLA agarSt.thermophilusTPPYColonies circulaires ou semi-37 C, 2jcirculaire,convexe,opaque, blanc-TPPYPBArobieviolet, svt avec un centre sombre.HHD37C, 2jrsanarobieColonies surleves et blanchesLA agarTPPYPB 37C, 2jrspetites colonies brillantes et blanchesarobieentoures par une large zone bleueLb. BulgaricusBile- MRS37C, 3jrspeuvent pousseranarobieRCA pH 5,5G-MRS37C, 3jrsarobieColonies blanchesX-GluBifidus blood agar 37 C, 2jrscolonies Surleves et brun chocolatBifidobactrium.anarobiesspHHD37C, 2jrsarobiecolonies surleves et blanchesLA agarSource :[10]36 3.1.4MicromthodesLes micromthodes sont un ensemble de techniques permettantdeffectuer des tests biochimiques, qui se distinguent des mthodesconventionnelles par leur miniaturisation. Leur mise au point, la fin desannes soixante, a tout dabord t base sur des travaux visant reproduire dans un faible volume les conditions physicochimiquesrgnant dans les tubes essai utiliss traditionnellement enbactriologie. Elles ont connu par la suite un dveloppement importantavec la commercialisation de systmes didentification associant, pourun groupe bactrien donn, une galerie miniaturise de test biochimiqueet des documents ou des programmes informatiques permettantdinterprter les rsultats obtenus[13].Les premires applications des micromthodes ont concern lesbactries dintrt mdical, en particulier la famille desEnterobacteriaceae.La premire galerie biochimique miniaturisedestine lidentification des bactries lactiques a t la galerie API 50CHL, commercialise en 1970 pour ltude des souches du genrelactobacillus, puis rapidement tendue dautres genres (leuconostocetlactococcus). La gamme des systmes didentification miniaturisespcifiquement destins aux bactries lactiques, sest peu tenduedepuis cette poque, en-dehors des galeries destines lidentificationde groupes dintrt mdical(streptococcus, enterococcus). Il est toutefois possible dans certains cas dutiliser pour ltude de ces bactries lesgaleries commercialises pour dautres groupes bactriens ou pour unusage gnral. Sur le plan technique, les tests utiliss dans les galeriesminiaturises peuvent tre diviss en deux catgories :les test dits classiques, ncessitant la croissance de la bactrieles tests dits rapides, reposant sur la dtection denzymesprformes.3.1.4.1 Tests classiquesIls drivent directement des tests utiliss en bactriologieconventionnelle. Ils ncessitent une dure dincubation assez longue (de12 heures quelques jours), mais requirent un inoculum faible. Ils sonten gnral peu sensibles aux conditions de prculture, toute fois, leurapplication aux bactries lactiques peut demander plusieurs repiquagespralables pour stabiliser le profil biochimique des souches identifier.La galerieAPI 50 CHest un exemple de kit miniaturis destin lidentification des bactries lactiques en cours de croissance.37 3.1.4.2 Tests rapidesCes tests reposent sur la mise en vidence denzymes ou de systmesenzymatiques prforms, laide de substrats synthtiqueschromognes ou fluognes. Leur dure dincubation est courte(quelques heures un jour), et dpend directement de la densit delinoculum, qui doit tre plus importante que pour les tests classiques. Ilssont trs sensibles aux conditions de prculture puisquil ny a pas decroissance bactrienne au cours de lincubation et que le matrielenzymatique dtect doit avoir t produit lors de la prculture. Unesouche cultive sur un milieu inhibiteur exprimera moins de caractresque si elle est cultive sur un milieu inducteur. Une micromthode usage gnral reposant sur des tests de ce type est la galerie API ZYM ;cette galerie peut tre applique des tudes de classification ou debiotypages sur les bactries lactiques.Les micromthodes peuvent tre utilises dans diffrents cas o il estncessaire deffectuer de faon simple la caractrisation phnotypiquede bactries lactiques ; par exemple, lidentification de souchesappartenant des espces diffrentes ou de biotypages de souchesappartenant une mme espce, ou encore le suivi dune souchedonne au cours dun processus de fabrication. Leur relative facilite demise uvre les rend bien adaptes des applications de routine.Toutefois, le pouvoir discriminatif des tests phnotypiques sur lesquelselles reposent nest pas trs lev et il convient de vrifier que lamicromthode choisie permet rellement de discerner les souchesauxquelles on sintresse.Les tableaux V, VI, VII, VIII, IX, X, XI et XII donnent quelques critresbiochimiques pris en compte lors de lidentification des bactrieslactiques isoles frquemment dans les produits laitiers ferments parces micromthodes38 Tableau V : Caractristiques physiologiques du genre lactobacillus du Groupe IESPECESCROISSANCE A/(DANS)TempratureTempratureoptimale demaximale decroissancecroissance15C 45C pHpH4%10%3,37NaClNaClLb.acidophilus- - ++ 45C 52C-Lb.delbrueckii- - + 45C 52Cssp.bulgaricusLb.delbrueckii- - +52Cssp.delbruekii45CLb.delbrueckii- - + 45C 52Cssp.lactisLb.gasseri- - ++ V(+) 35-38C-Lb.helveticus- - ++-Lb.kefiranofaciens- - -Source:[13]39 Tableau VI : Profil fermentaire du genre lactobacillus du groupe IProduction dacide par fermentation de :ESPECESAmygdalineArabinoseFructoseGalactoseLactoseMaltoseMannitolSaccharoseXyloseCellobioseLb.acidophilus+ + - + V + + + - + -Lb.delbrueckii- - - - + - + - - - -ssp.bulgaricusLb.delbrueckii- - - V + - - V - + -ssp.delbruekiiLb.delbrueckii+ - V + V + + - + -ssp.lactis-Lb.gasseri+ - + + + V v - + -+Lb.kefiranofaciens- - - - + + + - + -Source : [13]40 Tableau VII : Caractristiques physiologiques du genre lactobacillus du groupe IIESPECESCROISSANCE A (DANS)TempratureTempratureoptimale demaximale decroissancecroissance15C45CpH 3,3pH 74%10%NaClNaCl+ v 30-37C