Technique d'étude de la cellule

7/24/2019 Technique d'tude de la cellule

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BIOLOGIE CELLULAIREPr TAHIRI JOUTI N.

UNIVERSITE HASSAN II CASABLANCAFacult de Mdecine et de Pharmacie

Anne Universitaire 2014-2015


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METHODES DETUDE DE LA CELLULE

LE NOYAU INTERPHASIQUELES CHROMOSOMES

LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES


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METHODES DETUDE DE LA

CELLULE


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- La connaissance des cellules dpend desinstrumentsdont nous disposons

- les progrs majeurs de la biologie cellulairesouvent arrivs aprs lintroduction denouvelles techniques

Pour comprendre la biologie cellulaire, il estdonc ncessaire de connatre ces mthodes


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METHODES DETUDE MICROSCOPIQUES

- MICROSCOPIE OPTIQUE (MO)

- MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)


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- Utilis en mdecine pour analyser des

prlvements tissulaires effectus chez le maladepour poser et/ou complter un diagnostic donn.

- Il existe plusieurs types de prlvements:

- cytologique: frottis, aspiration, liquides

- histologique: biopsie, pice opratoire

en fonction de la nature du prlvement

Microscopie Optique


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Techniques Cytologiques Pour LaMicroscopie Optique (1)

1. FrottisUtilis pour des cellules libres, en

suspension:

- Sang

- Moelle osseuse

- Cellules de la muqueuse

vaginale (frottis vaginal)


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1 23 4

Lame

Lamelle

Inclinaison de la lamelle (45) contrela goutte de sang

Mettre la lamelle incline en contactde la goutte du sang

Le sang stale par capillaritFaire glisser la lamelle

entranement du sang par capillaritfrottis


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Cytocentrifugeusepermet:

- La concentration cellulaire et-Ltalement en monocouche

2. Cytocentrifugation


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Techniques Cytologiques Pour LaMicroscopie Optique (2)

Technique :- Fixation par dessication

(schage par agitation lame)

- Coloration panoptique(MGG)* May Grnwald 3 min,* Eau tamponne (pH 7) 1

min,* Giemsa 10 min,* Lavage eau courante)

- Schage et observation auMO.


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La Microscopie

Microscopie:

- utilise un flux ondulatoire de particulesondulatoires: non chargs: photons

Microscopie photonique ou optique chargs : lectrons

Microscopie lectronique

- Ce flux traverse un systme de lentilles qui

permet dobserverune image agrandie.

Rsolution : Distance minimale entre deux pointsvoisins qui permet de les observer spars.


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Ou Microscopephotonique

- utilise la lumire visible(photons)

- rsolution= 0.2m

- grossissement = 1000

Le Microscope Optique (1)


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Le Microscope Optique (2)

Le Microscope Optiqueest constitu:

-dune lampe

photons- de trois lentilles en

verre:

- Le Condenseur-L Objectif

-L Oculaire


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1. Oculaires2. Glissire de rglage del'cartement inter-pupillaire

3. Tube binoculaire4. Potence5. Tourelle porte-Objectif6. Vernier de positionnement avecvis de dplacement bidirectionnel

du chariot7. Chariot de fixation et depositionnement de la lame porte-objet8. Platine porte-objet9. Vis macromtrique de mise aupoint10. Vis micromtrique de mise aupoint11. Vis de rglage de la hauteur duCondenseur

12. Pied


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diamtre : 15m

noyau: polylob (3 ou 4 lobes

Cytoplasmes : grains

azurophiles = Fines granulations

pourpres = granulations Ires =

grands lysosomes


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Techniques Histologiques pour laMicroscopie Optique (1)

Biopsie et coupe histologique

Technique utilise pour les tissus

(foie, peau, muscle) qui

ncessite la ralisation de coupes

minces avant l'observation aumicroscope.

La biopsie:

prlvement in vivo, d'un fragment

d'organe, dans le but de lesoumettre un examen

histologique, le prlvement

n'emportant pas la lsion dans sa

totalit.


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La Biopsie

Techniques Histologiques pour laMicroscopie Optique (2)


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Prlvement tissulaire

Diffrentes tapes techniques

Lame coloreinterprtable au microscope

Techniques Histologiques


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La Fixation (1)

- Dfinition : conservationdu prlvement dansun tat aussi proche que possible de lETAT

VIVANT

- Mcanismes:

- inhibition de lautolyse cellulaire

- inhibitionde la putrfaction- ponts intermolculaires entre lesmacromolcules


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La Fixation (2)

Deux types de fixateurs:

- Fixateurs chimiques sont les plus utiliss ; ce sontdes composs qui font prcipiter ou coaguler lesmacromolcules ;

Fixateurs simples: Formol, alcool thylique, acide actique,acide picrique,

Fixateurs composs: mlange de Bouin, mlange de Carnoy, etc.

- Fixateurs physiques les plus utiliss en mdecine sontlazoteliquide (-196C) et la neige carbonique (-60C).

Principe: Conglation


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Fixation formole

Circulation

Inclusion

Microtomie et coloration

Ralisation dune coupe histologiqueAprs fixation chimique (Formol)


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La Circulation (1)

-Ncessit de rigiditdu tissu

But : permettre la microtomie et laralisation decoupes minces

- Fixation durcit insuffisamment

Ncessitdimprgnationdu tissu

par une matire rigide


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-

milieux dinclusion: pas daffinitpour leauNon miscibles leau

- Milieu dinclusion le plus utilis : la paraffine

(liquide 56C)

Il faut donc remplacer leau (fixateur en phaseaqueuse) parun solvant de la paraffine

permettre limprgnation laparaffine

La Circulation (2)


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Paraffine : pas daffinit pour leau

Non miscible leau

Prlvement Imprgnation la paraffine

Ethanol Tolune

H2O


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La Circulation (3)

La paraffine nest pas miscible leau,

linclusiondoit donc tre prcde par :

- une Dshydratationdans des bains dalcools concentration croissante

suivie

- de bains de tolune.


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Cassette pour prlvement

- en plastique jetables pour tissus sont utilises pour contenir

et identifier les chantillons de tissus lors des procdures detraitement, d'inclusion et de sectionnement.

- Surface inclinepermettant l'identification d'chantillons dans

toutes les tapes d'inclusion


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La Circulation (4)

Dfinition: passage du prlvement dans une sriede liquides intermdiaires

But: permettre limprgnation du prlvement par la

paraffine liquide


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LInclusion (1)

- Dfinition: enrobage du prlvement

dans un bloc de paraffine

- But : permettre la manipulation et la

fixation du prlvement au niveaudu microtome


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Station dEnrobage

Moule dInclusion


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LInclusion (2)


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LInclusion (3)


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LInclusion (4)


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Microtomie et Coloration

- confection et talement de coupes

tissulaires fines

- Colorations histochimiques des coupes

lame colore


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Microtomie (1)

Les coupes

- doivent tre trs fines (3-4

m) afin que la lumire

(photons) du microscope puisse

les traverser.

- sont ralises par un

microtome quip dunelame

Mi t i (2)


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Microtomie (2)

Coupe aumicrotome

Mi t i (3)


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Microtomie (3)

Coupes au microtome

Mi t i t Et l t


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Coupes : (2-4m)

Etalement des coupes sur la lame

Coupes

Porte-objet Bloc de paraffine + pice Bloc deparaffine pice

Lame

coupes

Microtomie et Etalement

Lame


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Etalement des coupes (1)

Les coupes obtenues

sont tales et colles

sur des lames en verre

laide deau

glatineuse oualbumineuse sur une

platine chauffante

Et l t d (2)


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Etalement des coupes (2)

Etalement des coupes sur la

lame

Collage et schage des coupes


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La Coloration (1)

Permet daugmenter le contraste entre les structurescellulairesqui ont des indices de rfraction trs voisinset sont donc translucides au MO.

Un colorant est une substance colore qui transmet sacouleur ; on rencontre des :

- colorants acides : ex. : osine colore le cytoplasme

en rose- colorants basiques : ex.: hmatinecolore le noyauen bleu (autre: bleu de mthylne)


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Coloration (2)

Il faut procder la rhydratationdes coupesparun:

1/ dparaffinagedes coupes par un solvant de la

paraffine (tolune) ;

2/ passage dans ensuite des bains dalcools titredcroissant (100, 95, 70) qui permettent leremplacement progressif de la paraffine par leau.

Car

Les colorantssont en phase aqueuse


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Coloration (3)


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Coloration (4)

C l ti (5)


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Coloration (5)

On distingue:

- les colorations de base (HmatineEosine, Trichromede Masson)

- des colorations spciales* Imprgnation argentique / fibres de rticuline(Fibrose)

* Coloration de Perls/fer (Hmosidrose)

* Coloration PAS (Priodic Acid Schiff) /glucides


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Coloration Hmatine-Eosine ou H&E


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Biopsie hpatique:L'hmosidrose est unesurcharge anormale des

organes(particulirement du foie)par l'hmosidrine, qui est unpigment insoluble contenantde l'hydroxyde de fer.

Coloration de Perls

Tissu Hpatique: Les capillairessinusodes sont entours par unrseau de fibres rticuliniques,soulignes ici par une

imprgnation argentique

Coloration au nitrate dargent

M t (1)


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Montage (1)

La coupe tissulaire se retrouve protge

entre lame et lamelle, colles lune lautre

laidedunliquide/rsine de montage = colle

Eukitt, No-Entellan

Mais ces colles ne sont pas miscibles leau

M t (2)


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Montage (2)

Aprs coloration:

* Dshydratation dans des bains croissants

dalcool suivie

* par un passage dans des bains de tolune

M t (3)


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Montage (3)

Periodic Acid Schiff: PASColoration des structures contenant


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Trichrome de Masson

Coloration des structures contenantune haute proportion deglucides tels que le glycogne, lesglycoprotines et les protoglycanes

Utilise pour la dtection de certainstroubles du stockage de glycognedans les muscles stris

L'hmaluncolore le noyau et lessubstances basophiles eu bleu-

violet; le ponceau-fuchsinecolore le cytoplasme en rouge-ros et le vert lumire ou le bleud'aniline colore les fibresconjonctives respectivement en

vert ou bleu.

( )


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LExamen Extemporan (1)

L'examen extemporan

- consiste raliser une coupe histologique dunprlvement ralis durant une intervention afind'orienterau mieux l'acte chirurgical.

- est indiqu pour :* un choix immdiatentre deux gestesthrapeutiqueschirurgicaux

* Apprciation des limites ou de l'extension d'unetumeurlors de son exrse

(2)


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Cet examen doit tre ralis dans des dlais

rduits (moins d'une demi-heure) alors que la

technique histopathologique standard est de

l'ordre de 24 heures aprs fixation.


LE E t (3)


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Technique* Fixation par conglationpermet:

La fixation Le durcissement de

lchantillontissulaire.

* Ceci permet dviterltapedinclusion.


L Mi O i S i (MOS)


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Les Microscopes Optiques Spciaux (MOS)

Les MOS les plus utiliss en mdecine sont

le microscope fluorescence

le microscope contraste de phase

Microscope fluorescence (1)


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Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications

qui portent sur la source lumineuse: UV au lieu de Visible

- Microscope fluorescence: microscope classique avec une

lampe vapeur de mercure sous pression.- Certaines substances: Fluorochromes ont la proprit

dmettreune lumire visible lorsquellesreoivent un flux

de rayons ultra-violets.

- Le tissu peut mettre directement cette lumire ou bien

aprs avoir t imprgn de substances fluorochromes.



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- Fluorescein IsoThioCyanate: FITC fluorescence verte,- Tetramethyl Rhodamine IsoThioCyanate: TRITC ,fluorescence rouge- Colorant fluorochrome DAPI = Di Aminido Phenyl lndolse fixe spcifiquement sur l'ADN



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1- il faut clairer la coupe histologique pour

exciter les molcules dont on veut obtenir lafluorescence.

2- Une molcule fluorescente ne pourra treexcite que par des radiations qu'elle peutabsorber.

3- Aprs avoir absorb la lumired'excitation, les molcules fluorescentes sedsexcitent en mettant des photons.



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Unsystme d'illumination sur le tube,

sous le bloc porte oculaire. Il comprend:

- une lampe vapeur de mercure entourd'un miroir collecteur et d'une lentillecollectrice pour rcuprer un maximum la

lumire d'excitation.

- la lumire rencontre le filtred'excitation.

- unintervalle spectral troit arrive sur lemiroir dichroquequi le rflchit vers lebas, sur la prparation.

- La lumire d'excitation claire laprparation par l'intermdiaire del'objectif.



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- Unepartiedes rayons diffusset mis par fluorescencerentrent dans l'objectif etremontent dans le tube o ils

rencontrent le miroirdichroque qui laisse passer lalumire sous cette incidence.

- Lefiltre d'arrt bloque enfin lalumire diffuse et seule lalumire misepar fluorescenceremonte pour former l'image.



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FILTREDEXCITATION

FILTREDARRET

Rsolution = 0.1m

Techniques dImmunofluorescence (1)


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La protine cellulaire mettre en videnceestrvle grce un anticorps- spcifique cette protine- coupl un fluorochrome:fluorescine, rhodamine

- La raction antigne-anticorps sur coupehistologique est rvle par lmission de lafluorescence

- La lecture de la lame se fait au microscope fluorescence




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Techniques d Immunofluorescence (1)



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- Couplage direct de lAc un fluorochrome: mthodedirecte

- Application de lAc coupl au fluorochrome sur

coupe histologique susceptible de contenir lAgspcifique

- Lavage liminant les Ac fluorescents non fixs par

lAg spcifique

- Observationau microscope fluorescence

du complexe Ac-Ag rendu fluorescent

Techniques d Immunofluorescence (1)

Estomac de souris Noyaux colors au DAPI


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Neurones


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Neurones du cervelet

Le Microscope Contraste de Phase (1)


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- La diffraction est le comportement

des ondes lumineuses lorsquelles rencontrent unobjet

- londeest diffusepar les points de l'objet.

- La diffraction se manifeste par le fait qu'aprs larencontre dunobjet, la densit de l'onde lumineuse

nestpas conserve

- La diffraction est le rsultat de linterfrence desondesdiffuses par chaque point.



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- Le microscope contraste de phase possde un

systme optique conu pour exploiter les propritsde diffraction des cellules vivantes.

- La lumire traversant les parties relativement denses

ou paisses de la cellule est retarde par rapport celle qui traverse une rgion voisine plus mince.

Cration des effets dinterfrences

produits par la recombinaison de cesdeux sries dondes

Images fortement contrastes



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Quand les ondes lumineuses traversent

un objet non color:

- leur amplitude est trs peu change

- leur phase est modifie, ce qui cre

des interfrences.Les effets de ces interfrences sont

exploits pour crer une image

Le MCP est quip dobjectifsspciaux qui transforme lesdiffrences d'amplitude endiffrences de phase.



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o op o ( )

La lame de phase a deux effetssur la composante de rflexion :

elle attnue considrablement sonintensit de manire la ramenerdans l'ordre de grandeur del'intensit de la diffusion

Un dispositif imageur faitconverger les deux ondes au pointimage P'.

L'intensit du point image est lersultat de l'interfrence des deux

ondes.- deux ondes sont en phase lepoint est brillant.

- deux ondes sont en oppositionde phase le point est sombre.

Les dfauts responsables de ladiffusion par diffraction apparaissentainsi par contraste.



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Kratinocyte de la muqueuse

buccale observ aumicroscope lumiretransmise. Seul le noyau estclairement observable

Kratinocyte de la muqueuse

buccale observ au microscope contraste de phase .Le noyau, ainsi que de nombreuxconstituants cytoplasmiques,probablement principalement des

mitochondries, sont observables.



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Cellules pithliales de Hamster

en culture observes aumicroscope contraste de phase

Microscopie Electronique (ME)


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principal intrt:Augmenter lagrandissement

Permettre lobservation

de lultrastructure

(organites) et desreliefs cellulaires.

Rsolution = 1 2 nm

Microscopie Electronique (ME)

Microscope Electronique Transmission (1)


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Au lieu dtreclair, lobjet

est bombardpar un faisceau

dlectrons.

Limagemettra en videnceles structures plus ou moins

opaques aux lectrons.

Le condenseur, lobjectif etloculaire sont des bandesmagntiques




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Un systme de lentilles

magntiques permet de dvierou focaliser le rayond'lectrons sur un chantillon"extrmement fin".

L'image ou clich de diffractionobtenue peut tre vue sur uncran phosphorescent,enregistre sur un filmphotographique ou biendtecte par un capteur CCD.

Capteur CCD


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Capteur CCD

- Le capteur CCD est une mmoire analogique quiaccumule des charges proportionnellement son tempsdexposition.

- Les trois lettres CCD signifie Charged Coupled Device

en franais DTC:dispositif transfert de chargesquiproduit un signal vido partir des charges accumulesdans les lments du capteur.


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Grille porte-objet

Tube sous vide

MET

MET


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Prparations biologiques pour le MET :


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Lobjet doit tre pralablement:

* coup en tranches ultrafines

* imprgn de sels de mtauxlourds qui vont:

- se fixer diffrentiellement surles diffrentes structures

intracellulaires

- les rendre plus ou moinsopaques aux lectrons.

Prparations biologiques pour le MET :Coupe ultramince (1)



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Fixation: double fixation au glutaraldhyde puis auttroxyde dosmiumLe glutaraldhyde pontages covalents

entre molcules protiques

Le ttroxyde dosmium stabilisation desdoubles couches lipidiques et des protines mal ounon fixes par le glutaraldhyde.

Inclusion : fait intervenir des rsines de synthse,trs dures et transparentes aux lectrons (rsinesEpoxy, Araldite).

Coupe ultramince (2)



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Ultramicrotomie: coupes ultraminces (50-80 nm)ralises par lultramicrotome quip dun couteauen verre ou en diamant. Coupes recueillies sur desgrilles mtalliques.

Contrastage : Par des sels de mtaux lourds(osmium, plomb, uranium) qui sont denses auxlectrons.

Les structures cellulaires apparaissent plus ou moinsdenses (noir et blanc) sur un fond clair

Coupe ultramince (3)


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Pour augmenter le contraste des constituantscellulaires, les coupesultraminces sont trempesdans une solution de sels de mtaux lourds(actate duranyl et citrate de plomb)

Aspect Ultrastructural, MET


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REG

Noyau

Aspect Ultrastructural, MET


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Mitochondrie

Citernes deREG

Prparations biologiques pour le MET :Coloration Ngative (1)


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Rappel:En microscopie lectronique Transmission:

- lobjet ne peut tre visibleque si, aprs fixation, ilest imprgnde substances contenant des atomesde mtaux lourds opaques aux lectrons.

- La fixation et les ractions ultrieures peuventmodifier notablement la structure de l'objetbiologique.

Coloration Ngative (1)



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Le contraste ngatif permet

d'assombrir le fond sans

colorer l'objet lui-mme et

donc de le rendre visible sans

le modifier,par simple

contraste.


Nuclocapside virusde la rougeole



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Technique :

- Suspension dans une

solutionopaque aux e- :

Acide Phosphotungstique

- dptdunegoutte de

cette suspension sur

une grille mtallique

- schage


Immunoglobine G: IgG



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Technique :

la substance opaque aux

e- se dpose autour de la

particule qui apparatra

clairesur un fond sombre

contrasteinverse oungatif


Papillomavirus Humain



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a) Particules virales,isoles d'une verrue,observes aprs colorationngative l'acide

phosphotungstique.

b) Virions observs dans lenoyau d'un kratinocyte des

couches superficielles del'pithlium malpighien.Coloration par l'actated'uranyl et le citrate deplomb.


Microscope Electronique Balayage (1)


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-

Permet lobservation desreliefs ou images cellulairesen 3 dimensions (3D).

Il est constitu :

-dunmicroscope faisceaulectronique

- dundtecteur de-

- dunconvertisseur de-

- dunmoniteur (cran tl)

p q y g ( )



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- Le microscope

lectronique balayage

utilise un faisceau trsfin qui balaie point par

point la surface de

l'chantillon.

p q y g ( )



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Matriel biologique :cellules, bactries et virus.

Ces structures sont:- fixes- dshydrates

- recouvertes dune mincecouche de mtal (Or-Palladium, Platine)vaporisesous vide.

Prparations biologiques pour le MEB

p q y g ( )



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- la surface mtallise de lchantillonsubit un balayagergulier par un faisceau dlectrons

- les surfaces en reliefs entranent lmissiondlectronssecondaires(points lumineux)

- Les dpressionssont sansmission dlectrons(pointssombres)

- Les lectrons mis sont collects par un dtecteurdlectrons puis convertis en image par unconvertisseur dlectrons. Limagefinale apparat en 3dimensionssur un cran de tlvision.

Prparations biologiques pour le MEB

p q y g ( )



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p q y g ( )

Globules Rouges

Chromosomes X et Y


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METHODES DETUDE

- BIOCHIMIQUE

- DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE


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METHODES DETUDE BIOCHIMIQUE

Fractionnement cellulaire par


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Spare en fractionsles diffrents organites dela cellule (noyau, mitochondries, etc.) en vuedunetude biochimique.

Se droule en quatre tapes :- Dissociation

- Isolement- Eclatement- Fractionnementcellulaire ou

subcellulaire

ultracentrifugation

La Dissociation cellulaire


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- Consiste dissocier les cellules

dun mme tissu- ralise mcaniquement ou

chimiquement.

Dissociation mcanique : dansun milieu isotonique 0C avecun broyeur cellulaire ou Potter.

Dissociation enzymatique : par

des enzymes protolytiques(trypsine ou collagnase) et desChlateurs de calcium (EDTA :Ethylne Diamine Ttractique

Acide).

Broyeur dePotter

LIsolement / Tri cellulaire (1)


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Spare les diffrentes catgories cellulaires rsultantde la dissociation cellulaire.

Fait intervenir des anticorps fluorescents spcifiques

chaque catgorie cellulaire

Lisolement des cellules couples lanticorps

marqu est ralis par un appareil spcial pour le tricellulaire, le cytofluorimtre ou cytomtre en flux.

Cytomtrie en Flux: CMF

LIsolement / Tri cellulaire (2)


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Principe et but de la

CMF:

Mesure (-mtrie) desproprits optiques de

cellules (cyto-)transportes par unliquide vecteur (flux)

jusquune source

dexcitation lumineuse(souvent un laser)

Puis Tri Cellulaire

LEclatement cellulaire


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Permet de recueillir le contenu de la cellule par lune

des techniques suivantes :

- Broyagemcanique au Potter

- Choc osmotique en milieu hypotonique (0,5% NaCl)- Vibration ultrasonique

- Passage des cellules travers un petit orifice.

Au terme de cette tape, un lysat (homognat) avecles diffrents organites mlangs est obtenu.

Le Fractionnement cellulaire


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Les organites cellulaires sont sparsen plusieurs

fractions contenant chacune un seul typedorganites

La sparation se base sur la forme, la tailleet ladensitdes organites.

Deux procds diffrents sont utiliss :

- ultracentrifugation diffrentielle- ultracentrifugation en gradient dedensit

Ultracentrifugation diffrentielle

d f d l l


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- Cestune successionde centrifugationsde plus en plusrapideset de plus en plus prolonges.

- On retire le culot chaque tape et onrecentrifuge le surnageant.

- Lordrede sdimentation des organites est :

1. noyaux,2. mitochondries,

3. lysosomes,

4. microsomes,5. ribosomes,

6. ARN et cytosol

Ultracentrifugation en gradient de densit (1)


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Ultracentrifugation :

- dans une solution (saccharose, chlorure dcsium) prsentant un gradient de concentratio

dcroissant du bas vers le haut

- dans un tube essai avec des graduations d

concentrationsralises artificiellement.

Ultracentrifugation en gradient de densit (2)


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Les organites mlangs sont

- introduits dans le tubegradu- centrifugs une seule foisen utilisant le temps et la

vitesse les plus levs.

chaque type dorganites se rpartit- sous forme dune bande spare- dans la zone de gradient de densit voisine ou gale

la sienne.

Coefficient de sdimentation


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- unit de vitesse de sdimentation (VS)dans un champs centrifuge

- est exprime en Svedberg(S)

- propre chaque organite cellulaire.Ex:

Ribosome procaryote : 70 S ;Ribosome eucaryote : 80 S.


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METHODES DETUDE DU

FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

Culture cellulaire (1)


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Technique permettant demaintenir des cellulesvivanteshors de lorganisme(in vivo) dans des rcipients

de culture (in vitro)contenant des milieuxnutritifs (pour la

prolifration cellulaire) touten respectant les conditionsadquates de strilit, detemprature et de pH.

Kratinocytes en culture



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Technique*Prlvement dun fragment tissulaire vivant

*Digestion par une enzyme dissociant les cellulesex : trypsine, collagnase

*Numration cellulaire

*Addition dun milieu de culture (106cellules/10ml)

*Repiquage des cellules


Milieux de culture

liquides ou solides (gel)


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- liquides ou solides (gel)

- composition chimique de base : eau, sels minraux,

vitamines, acides amins ou protines, glucose,antibiotiques, srum de veau ftal(SVF) et facteurs decroissance.

Ex. de milieu de culture : MEM , RPMI 1640

Facteur de croissance

- petit peptide scrt par un tissu pour stimuler lacroissance, la multiplication et la diffrenciation de ses

cellules et ou des cellules dautrestissus- non vhicul par le sang et possde un rcepteurspcifique au niveau des cellules de ce tissu ; ex. :EGF, NGF (Epidermal Growth Factor, Nerve GrowthFactor).

Rcipients de culture


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- sont en verre ou en plastique(mono-usage).

- Exemples: les flacons, les

botes de Ptri, les tubes essai, les plaques de puits.

Microscope invers- La lumire arrive sur lchantillon

l h l d l


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par le haut: la source de lumireest place au-dessus de

lchantillon- Lobservationse fait par le dessus- les objectifs en dessous.

Cette configuration non-standard

dobservation peut tre adapte toutes les mthodes de microscopie(fluorescence, contraste de phase).

Utilisation du microscope inversCe microscope est utilis pour lobservationde cellules en culturein vitro, mais peut ltre en gnral pour observer des objetspaisou situs sur le fond de botes de culture.

Conditions de culture

Strilit : maximum en


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Strilit : maximum enutilisant une hotte flux

laminaire, des lampesUV germicides.

pH : 7 7, 4

Temprature : + 37C(tuve)

Ambiance : 95 % dairet 5 % de CO2 (tuve)qui permet le maintiendu pH.


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Comportement des cellules en culture (1)

Les cellules normales se divisent un certain

nombre de fois puis meurent (50 100 fois pourles cellules de la peau) alors que les cellulescancreuses sont immortelles in vitro; ellesconstituent des lignes cellulaires spciales.

Ex de lignes cellulaires communes et immortelles invitro :


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vitro :- souche Hla : cellules pithliales du col de

lutrusdHenriette Lacks dcde en 1953.- souche KB : carcinome oral humain- souche MRC-5 : poumon ftushumain.

Comportement des cellules en culture (2)


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LInhibition de Contact : proprit des

cellules normales in vitro et qui se manifestepar un arrt de leurs divisions lorsquellesconfluent(se touchent).

Marquage cellulaire (1)


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Marquage par les isotopes radioactifs (IR)

Les IR sont des corps naturels qui

- diffrent lgrement par la masse de leurs noyaux- ont le mme nombre dlectronspriphriques- sont instables- subissent des dsintgrations et des missions de particules

nergtiques ou radiations.

Les IR sont des traceurs du mtabolisme cellulaire. Ilspermettent de suivre la synthse dunemolcule donne dans lacellule.

Permet la dtection dune molcule cellulaire prcise aprs

marquage soit par des isotopes radioactifs soit par des anticorps.



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Dtection des IR

Compteur Geiger : les radiations desIR ionisent un gaz qui se trouve danslappareil. La dtection se fait alors pardes bip Sonores.

Compteur scintillation ou

scintigraphe- permet la dtection visuelle desradiations des IR qui ionisent un liquidescintillant dans lappareil

- Il y a mission de petits clairslumineux.

- Autoradiographieou autohistoradiographie : permet dedtecter et de localiser les radiations des

IR sur des coupes histologiques.

Technique



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Technique

- Injection de lIR lanimalou additionaux cellulesen culture

- Prlvement des intervalles varis (t0, t1, t2, ...) de cellules ayantintgres les IR

- Fixation et prparation des cellules pour le MOou pour le ME

- Application dunemulsion photographique sur les coupes

- Maintien des coupes lobscurit pendant une dure (des jours ou dessemaines) ncessaire la dsintgration des IR

Observationdes coupes au

- MO ou- ME (dpts sombres sur leszones de la coupe prsentantdes IR).



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Explication :

- Lmulsionphotographiqueest compose de bromuredargent(Br-, Ag+).

- Les radiations mises parles IR rduisent les grainsde bromure dargent

invisibles en grains dargentvisibles au niveau de la zone

Documents

Technique d'étude de la cellule