thèse ap correction - ori-oai.u-bordeaux1.frori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2011/THONG_DENG_HONDA_2011.pdf · Je remercie, tout particulièrement, Mme Danielle Barth et M. Pierre Chaminade

N° ordre : 4351

THÈSE

présentée à

L'UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES par

Honda THONG DENG

pour obtenir le grade de

DOCTEUR

Spécialité : GENIE DES PROCEDES

———————————————

EXTRACTION ET MISE EN FORME (EN LIPOSOMES) DE

PHOSPHOLIPIDES ISSUS D’UN CO-PRODUIT PAR VOIE

SUPERCRITIQUE ———————————————

Soutenue le 15 novembre 2011

Devant la commission d'examen formée de :

M. E. DUFOURC Directeur de recherche, CNRS, Pessac Président

Mme D. BARTH Professeur, EEIGM, Nancy Rapporteur M. P. CHAMINADE Professeur, Univ Paris Sud Rapporteur

M. P. BOURSEAU Professeur, Univ Bretagne Sud Examinateur

Mme M. CANSELL Professeur, Univ bordeaux, Pessac Directeur de thèse Mme P. SUBRA Directeur de recherche, CNRS, Pessac Directeur de thèse

N° ordre : 4351

THÈSE

présentée à

L'UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES par

Honda THONG DENG

pour obtenir le grade de

DOCTEUR

Spécialité : GENIE DES PROCEDES

———————————————

EXTRACTION ET MISE EN FORME (EN LIPOSOMES) DE

PHOSPHOLIPIDES ISSUS D’UN CO-PRODUIT PAR VOIE

SUPERCRITIQUE ———————————————

Soutenue le 15 novembre 2011

Devant la commission d'examen formée de :

M. E. DUFOURC Directeur de recherche, CNRS, Pessac Président

Mme D. BARTH Professeur, EEIGM, Nancy Rapporteur M. P. CHAMINADE Professeur, Univ Paris Sud Rapporteur

M. P. BOURSEAU Professeur, Univ Bretagne Sud Examinateur

Mme M. CANSELL Professeur, Univ bordeaux, Pessac Directeur de thèse Mme P. SUBRA Directeur de recherche, CNRS, Pessac Directeur de thèse

i

Remerciements

Ce travail de thèse a débuté au laboratoire TREFLE et s’est achevé au laboratoire

CBMN, tous deux localisés sur le campus de Talence Pessac. Je souhaite remercier ici

l’ensemble des personnes de ces structures qui ont contribué à la réalisation de cette étude

ainsi que la région Aquitaine pour son support financier.

Je remercie en premier lieu mes directrices de thèse, Pascale Subra et Maud Cansell,

qui m’ont encadré et fait confiance pour cette thèse.

Je remercie, tout particulièrement, Mme Danielle Barth et M. Pierre Chaminade pour

avoir accepté d’examiner ce travail en qualité de rapporteurs.

Je souhaite également remercier Serge Laugier, Maitre de Conférences à l’ENSCBP,

pour son aide et son encadrement sur la partie thermodynamique de ce travail. Merci pour vos

conseils précieux et votre disponibilité.

Je remercie l’équipe d’Eric Dufourc et plus tout particulièrement Axelle Grélard et

Cécile Courreges qui m’ont apporté une aide indispensable lors de la caractérisation des

extraits. Votre patience et votre sympathie m’ont sincèrement fait apprécier ce temps passé

avec vous.

Mes remerciements vont également à Alain Sommier qui a su être l’homme de pas mal

de situations…

Je ne peux oublier les nombreux thésards du laboratoire TREFLE et CBMN avec qui

j’ai passé de bons moments. Je vous souhaite bonne chance pour la suite de vos carrières.

Je n’oublierai pas de remercier mes amis bordelais que j’ai pu rencontrer grâce à cette

thèse, à mon activité de monitorat ou qui avaient déjà fait un joli bout de chemin avec moi :

Nicolas, Mathieu (t et plusieurs t), Jenny, Vincent, JC… et mon « copain Viallon » !!! Merci

pour votre soutien et tous les bons moments que nous avons partagés ensemble.

Enfin, merci à ma compagne Aurélie, sans qui la vie ne serait pas ce qu’elle est.

ii

Sommaire

REMERCIEMENTS ............................................................................................ I

SOMMAIRE ....................................................................................................... II

INTRODUCTION .......................................................................................... - 1 -

CHAPITRE 1 : LIPIDES ET LIPOSOMES : DES TECHNIQUES CONVENTIONNELLES D’EXTRACTION ET DE MISE EN FORME AUX TECHNIQUES SUPERCRITIQUES – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................... - 5 -

I.1 Définition : Lipides et liposomes ................................................................................. - 6 -

I.1.1 Triglycérides ......................................................................................................... - 6 -

I.1.2 Phospholipides ..................................................................................................... - 8 -

I.1.3 L’autoassemblage des phospholipides en solution aqueuse ................................. - 9 -

I.1.4 Les liposomes ou vésicules lipidiques ............................................................... - 12 -

I.2 Extraction des lipides ................................................................................................. - 14 -

I.2.1 Méthodes classiques d’extraction des lipides ..................................................... - 14 -

I.2.1.1 Extraction de l’huile et des triglycérides ................................................... - 14 -

I.2.1.2 Extraction des phospholipides ................................................................... - 17 -

I.2.1.3 Extraction des lipides à l’échelle du laboratoire ........................................ - 22 -

I.2.2 Les méthodes supercritiques d’extraction .......................................................... - 23 -

I.2.2.1 Définition et propriétés générales des fluides supercritiques .................... - 23 -

I.2.2.2 CO2 supercritique pur et en mélange ......................................................... - 25 -

I.2.2.3 Principes généraux de l’extraction solide-liquide ...................................... - 26 -

I.2.2.4 Extraction supercritique des lipides ........................................................... - 29 -

I.2.3 Conclusion sur l’extraction ................................................................................ - 37 -

I.3 Les techniques de préparation des liposomes ............................................................ - 40 -

I.3.1 Les techniques conventionnelles ........................................................................ - 40 -

I.3.2 Les techniques supercritiques ............................................................................. - 43 -

iii

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES ................ ...................... - 51 -

II.1 Matière première ........................................................................................................ - 52 -

II.1.1 Nouvelle source : la coquille Saint Jacques ....................................................... - 52 -

II.1.2 Approvisionnement et stockage de la matière première .................................... - 53 -

II.1.3 Préparation de la matière première ..................................................................... - 53 -

II.1.4 Caractérisation de la matière première ............................................................... - 55 -

II.2 Les produits utilisés ................................................................................................... - 59 -

II.3 Dispositifs expérimentaux et protocoles .................................................................... - 60 -

II.3.1 Extraction CO2 pur et CO2-co-solvant en dispositif petit volume (charge en matière

traitée de 3 à 6 g) ............................................................................................................ - 60 -

II.3.1.1 Description du dispositif expérimental ...................................................... - 60 -

II.3.1.2 Protocole d’extraction au CO2 pur ............................................................. - 62 -

II.3.1.3 Protocole d’extraction au CO2-co-solvant ................................................. - 63 -

II.3.2 Extraction CO2 grand volume : déshuilage de 60 g de matière première .......... - 64 -


II.3.2.2 Protocole d’extraction au CO2 pur ............................................................. - 65 -

II.3.3 Extraction CO2-co-solvant en dispositif « grand volume » : traitement de 15 à 60 g

de matière déshuilée ....................................................................................................... - 66 -


II.3.3.2 Montage avec le réacteur tubulaire (V = 500 ml) ...................................... - 67 -

II.3.3.3 Montage avec le réacteur agité (V = 250 ml) ............................................ - 69 -

II.3.4 Mise en forme de liposomes en milieu CO2-éthanol-eau ................................... - 70 -

II.3.4.1 Extraction et mise en forme en ligne ......................................................... - 70 -

II.3.4.2 Modification de la taille des liposomes à base de lécithine commerciale (LC

60) ................................................................................................................... - 71 -

II.3.5 Caractérisation réacteur agité et étude du mélange CO2-éthanol-eau ................ - 73 -

II.3.5.1 Distribution des temps de séjour dans le réacteur agité ............................. - 73 -

II.3.5.2 Etude du mélange CO2-éthanol-eau-lécithine............................................ - 74 -

II.3.5.3 Etude cinétique du mélange CO2-éthanol-eau ........................................... - 76 -

II.4 Méthodes de caractérisation ....................................................................................... - 77 -

II.4.1 Analyse de la matière première solide et résidu d’extraction ............................ - 77 -

II.4.2 Analyse des extraits ............................................................................................ - 79 -

II.4.3 Analyse des dispersions de liposomes ............................................................... - 83 -

iv

CHAPITRE 3 : EXTRACTION DES LIPIDES PAR VOIE SUPERCRITIQUE ....................................................................................... - 84 -

III.1 Extraction des lipides à l’aide de CO2 supercritique ................................................. - 85 -

III.1.1 Résultats ............................................................................................................. - 85 -

III.2 Extraction des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant.............................. - 92 -

III.2.1 Plan des essais et paramètres étudiés ................................................................. - 93 -

III.2.2 Résultats ............................................................................................................. - 95 -

III.2.2.1 Intérêt du prétraitement de déshuilage au CO2 pur .................................... - 96 -

III.2.2.2 Reproductibilité de l’extraction ................................................................. - 98 -

III.2.2.3 Influence de la pression ........................................................................... - 100 -

III.2.2.4 Influence du pourcentage d’éthanol ......................................................... - 102 -

III.2.2.5 Influence de la température à différentes pressions ................................. - 105 -

III.2.2.6 Exploitation de la courbe d’extraction ..................................................... - 111 -

III.2.2.7 Récapitulatif des résultats obtenus avec le mélange CO2- éthanol .......... - 113 -

III.2.2.8 Remplacement de l’éthanol par l’isopropanol ......................................... - 117 -

III.2.3 Conclusion ........................................................................................................ - 121 -

III.3 Transposition de l’extraction des phospholipides sur de plus grands volumes ....... - 122 -

III.3.1 Utilisation d’un réacteur tubulaire de 500 mL ................................................. - 122 -

III.3.1.1 Etude de la reproductibilité de l’extraction .............................................. - 123 -

III.3.1.2 Influence de la masse introduite .............................................................. - 124 -

III.3.1.3 Comparaison des résultats obtenus selon les réacteurs 10 ml et 500 ml . - 126 -

III.3.2 Utilisation d’un réacteur agité de 250 ml ......................................................... - 130 -

III.3.2.1 Caractérisation du réacteur agité : étude hydrodynamique (DTS) .......... - 130 -

III.3.2.2 Modes opératoires proposés..................................................................... - 133 -

III.4 Variantes du procédé d’extraction ........................................................................... - 146 -

III.4.1 Fractionnement de l’utilisation de l’éthanol ..................................................... - 146 -

III.4.2 Utilisation d’un mélange eau-éthanol comme co-solvant ................................ - 148 -

v

CHAPITRE 4 : MISE EN FORME DE LIPOSOMES A PARTIR DE SOURCES MARINES PAR VOIE SUPERCRITIQUE ........................ - 151 -

IV.1 Mise en forme des extraits obtenus par voie supercritique ...................................... - 153 -

IV.2 Etude du mélange CO2-éthanol-eau-phospholipides ............................................... - 157 -

IV.2.1 Diagramme de phase CO2-éthanol-eau-lécithine sous pression ....................... - 157 -

IV.2.2 Etude cinétique du mélange CO2-éthanol-eau.................................................. - 160 -

IV.2.2.1 Impacts sur la mise en forme de liposomes ............................................. - 162 -

IV.3 Couplage de l’extraction des PL et de la mise en forme en liposomes.................... - 163 -

IV.4 Modification de la taille des liposomes par voie supercritique ............................... - 166 -

IV.4.1 Influence de la taille capillaire ......................................................................... - 169 -

IV.4.2 Influence débit CO2 .......................................................................................... - 171 -

IV.4.3 Influence débit phase aqueuse .......................................................................... - 174 -

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES.............................. - 177 -

REFERENCES ........................................................................................... - 181 -

TABLE DES FIGURES ............................................................................. - 185 -

TABLE DES TABLEAUX ........................................................................ - 189 -

ANNEXE 1 .................................................................................................. - 192 -

ANNEXE 2 .................................................................................................. - 196 -

ANNEXE 3 .................................................................................................. - 198 -

ANNEXE 4 .................................................................................................. - 201 -

ANNEXE 5 .................................................................................................. - 206 -

- 1 -

Introduction

Au cours des trente dernières années, la production mondiale de corps gras a été

multipliée par 2,7, passant de 29 millions à 70 millions de tonnes. 75% des ressources

mondiales sont d’origine végétale (tournesol, soja, palme…), le reste étant principalement de

source animale (Karleskind, 1993).

Composés des corps gras, les phospholipides (PL) sont des constituants mineurs mais

ils tiennent une place prépondérante de par leurs propriétés physico-chimiques. Ils sont

notamment capables de former des vésicules lipidiques (liposomes) qui peuvent être utilisées

dans de nombreux domaines d’applications (cosmétique, nutrition ou pharmaceutique).

Actuellement, les sources de phospholipides sont le soja, l’œuf et, dans une moindre mesure,

le colza et le tournesol.

Parallèlement, la pêche génère des sous et co-produits contenant des proportions de

lipides non négligeables. La pêche mondiale représente 91 millions de tonnes et seulement 50

% sont destinés à l’alimentation humaine (Ferraro et al., 2010) de par la capture d’espèces

non désirées et les parties (têtes, viscères etc.) non consommées par l’Homme. Généralement,

ces co-produits sont destinés à l’alimentation animale ou utilisés pour la fabrication d’engrais.

Par conséquent, la question se pose de savoir si les sous et co-produits de la pêche pourraient

constituer une nouvelle ressource marine de phospholipides.

Actuellement, les techniques d’extraction des lipides utilisent des solvants organiques

soumis à une réglementation stricte. Dans le cadre d’une démarche de développement

durable, les procédés supercritiques peuvent être une solution alternative à l’extraction des

lipides nécessitant l’utilisation de solvants organiques. En effet, le CO2 permet d’extraire les

lipides neutres (triglycérides principalement) tandis que le mélange CO2-éthanol

(généralement reconnu comme non dangereux, GRAS) est utilisé pour extraire les

phospholipides.

Ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre de la valorisation de la biomasse. Il porte sur

le développement d’un procédé supercritique pour l’extraction de phospholipides et la

formation de liposomes. Il se décompose en deux parties : la première concerne l’extraction

- 2 -

des phospholipides et la seconde traite de la mise en forme de liposomes. A terme, l’objectif

est de développer un procédé continu couplant l’extraction et la formation de liposomes selon

le principe suivant :

Néanmoins, comme nous le verrons dans l’étude bibliographique, la présence de

triglycérides dans le fluide enrichi nuit à la formation de liposomes. Il est donc nécessaire de

les éliminer par un premier traitement au CO2 pur. Les phospholipides sont extraits grâce à

l’ajout d’un co-solvant : l’éthanol. La mise en forme des PL par ajout d’eau conduit ensuite à

la formation des liposomes. Ainsi le procédé que nous souhaitons développer est représenté

par le schéma suivant :

- 3 -

Il se compose de trois étapes :

Ext

ract

ion

� Une extraction des lipides neutres : Cette étape permet d’extraire les

lipides indésirables de la matière première. De plus, il a été démontré que

réaliser cette première extraction permettait d’améliorer la sélectivité en

phospholipides de la seconde. Elle est réalisée avec du CO2 pur.

� Une extraction des phospholipides : C’est l’étape clé du procédé pendant

laquelle les phospholipides sont extraits avec un mélange CO2-éthanol.

Mis

e en

form

e

� Formation des liposomes par ajout d’eau : Il s’agit de la dernière étape

qui permet d’agencer les phospholipides extraits en liposomes.

Matièrepremière

Matièredéshuilée

CO2 CO2 +EtOH

CO2 + EtOH + phospholipides

Résidu

CO2 + lipides indésirables

Liposomes

eau

1ère extraction 2ème extractionM

iseen

form

e

- 4 -

Avant de réaliser les différentes expériences d’extraction et d’élaboration des

liposomes, nous avons recherché les différentes sources de sous-produits d’origine marine qui

présentent une composition en lipides intéressantes.

Concernant la partie « extraction », une étude a tout d’abord été menée avec un

dispositif de petit volume (5 et 10 ml) puis deux transpositions d’échelle ont été réalisées, une

avec le même type de réacteur (tubulaire) et l’autre avec un réacteur agité.

Pour la partie « mise en forme », une étude de faisabilité de la mise en forme de

liposomes à partir d’extraits supercritiques par une technique d’hydratation conventionnelle

est tout d’abord réalisée. Ensuite, une étude préliminaire du comportement du système {CO2-

éthanol-eau-phospholipides} a été réalisée afin de déterminer les domaines favorables à la

formation des liposomes. De plus, des essais de mise en forme en liposomes à partir d’extraits

lipidiques obtenus par voie supercritique ont été menés. Enfin, toujours sur la base du

quaternaire {CO2-éthanol-eau-phospholipides}, nous avons étudié une nouvelle technique de

modification de la taille de liposomes.

Ce travail de thèse a pour but de répondre aux interrogations suivantes :

• Avec quel rendement et quel degré de pureté extrait-on les phospholipides à

l’aide d’un procédé utilisant du CO2 et de l’éthanol ?

• Peut-on former des liposomes à partir des phospholipides extraits avec un

mélange CO2-co-solvant ?

• Peut-on envisager une application industrielle du procédé ?

Ce manuscrit s’organise autour de quatre chapitres. Le premier est dédié à une étude

bibliographique s’efforçant de fournir les bases nécessaires à la compréhension de ce travail.

Après une définition des différentes notions liées aux lipides, ce chapitre se poursuit par une

description de l’extraction des lipides puis un état de l’art sur la mise en forme de liposomes.

Le second présente les dispositifs et protocoles expérimentaux utilisés au cours de la thèse.

Les réactifs utilisés ainsi que les techniques de caractérisation mises en place y sont détaillés.

Le troisième chapitre traite de l’étude de l’extraction des lipides par des techniques

supercritiques développées dans le cadre de ce projet. Enfin, la mise en forme de liposomes en

milieu supercritique est abordée lors du dernier chapitre de ce mémoire de thèse.

Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux

techniques supercritiques – Etude Bibliographique

- 5 -

IChapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles

d’extraction et de mise en forme aux




- 6 -

I.1 Définition : Lipides et liposomes

Les lipides (appelés également corps gras) sont des composés insolubles dans l’eau

mais solubles dans des solvants organiques apolaires tels que l’isopropanol ou le chloroforme.

Ils regroupent un nombre varié de molécules tant du point de vue de leur composition que de

leur fonctionnalité. Nous nous limiterons à la présentation des triglycérides, classés dans les

lipides neutres, et des phospholipides qui appartiennent aux lipides polaires.

I.1.1 Triglycérides

Les triglycérides (TG) sont des triesters d’acides gras (Figure I-1). Ils constituent 95 à

99% des corps gras alimentaires. Ils se présentent soit sous forme solide, on parle alors de

graisses, soit à l’état liquide et on les qualifie d’huiles.

Figure I-1 : Représentation schématique d’un triglycéride

Un des rôles principaux des lipides dans l’organisme est de constituer une réserve

d’énergie (dans les tissus adipeux des animaux).

Les acides gras des triglycérides possèdent généralement une chaîne de carbone à

nombre pair (4 à 24 atomes). Selon le nombre de carbones, on parle de chaîne courte (4 à 8),

moyenne (10 à 14) ou longue (16 à 24). Une chaîne d’acide gras peut contenir jusqu’à 6

doubles liaisons ou insaturations. Ceci permet de distinguer trois classes : les Acides Gras

Saturés (AGS), Monoinsaturés (AGMI) et Polyinsaturés (AGPI). On définit la notion de série

(n ou ω) par la position de la première double liaison par rapport à l’extrémité méthyle

terminal. On distingue ainsi les familles d’acides gras n-9 (ω 9), n-7 (ω 7), n-6 (ω 6) et n-3 (ω

3). En résumé, un acide gras est symbolisé par « XX :Y n-Z» avec XX nombre de carbone, Y

le nombre de doubles liaisons et Z le numéro du carbone portant la première insaturation par

rapport au CH3.



- 7 -

Parmi les AGPI, les familles d’acides gras n-6 (ω 6) et n-3 (ou ω 3) présentent un fort

intérêt nutritionnel. L’acide linoléique (18:2 n-6) et l’acide alpha-linolénique (18:3 n-3) sont

qualifiés d’Acides Gras Indispensables (AGI) car ils ne peuvent être synthétisés par

l’organisme et doivent donc être apportés par l’alimentation. Ces acides gras sont les

précurseurs des Acides Gras Essentiels (AGE) puisqu’ils sont transformés par le métabolisme

en dérivés actifs à longues chaînes plus insaturées. Récemment, certains nutritionnistes

préconisent de considérer aussi l’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6 n-3) comme

indispensable bien qu’il soit synthétisable par l’Homme mais avec un taux de conversion du

18:3 n-3 en DHA faible (ANSES, 2011).

Le Tableau I-1 présente les principaux acides gras de corps gras naturels.

Acide Gras Symbole

Saturés

Laurique 12:0

Myristique 14:0

Palmitique 16:0

Stéarique 18:0

Monoinsaturés

Oléique 18:1 n-9

Polyinsaturés

Linoléique 18:2 n-6

γ-Linolénique 18:3 n-6

Arachidonique 20:4 n-6

α-Linolénique 18:3 n-3

Eicosapentanéoique (EPA) 20:5 n-3

Docosahexaénoïque (DHA) 22:6 n-3

Tableau I-1 : Principaux acides gras et symbolique associée



- 8 -

I.1.2 Phospholipides

Les phospholipides (PL) sont formés d'un glycérol lié à deux acides gras (R1 et R2) et à

un groupement phosphoryle. C’est ce groupement qui donne le nom aux différents PL :

phosphatidylcholine (PC), phosphatidyléthanolamine (PE), phosphatidylsérine (PS),

phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycérol (PG)…(Figure I-2).

Figure I-2 : Structure chimique de différents phospholipides et représentation du caractère amphiphile (Delattre et al., 1993)

Les phospholipides diffèrent les uns des autres par la nature des acides gras mais

essentiellement par leur tête polaire. Du fait de la présence au sein d’une même molécule

d’une partie hydrophile (groupe phosphoryle) et d’une partie hydrophobe (chaînes d’acides

gras), les PL présentent un caractère amphiphile (Figure I-2).



- 9 -

Cette classe de lipides est impliquée dans la constitution des membranes biologiques et

dans le fonctionnement du système nerveux (Fanni et al., 2004).

Dans le langage courant, on désigne par lécithine un mélange de lipides. A titre

d’exemple, en alimentaire la lécithine est répertoriée sous le code E322 dont la composition

est 49 % de PL, 39% de TG, 5% glycolipides, 4% de carbohydrates et 3% de stérols et

tocophérols.

I.1.3 L’autoassemblage des phospholipides en soluti on aqueuse

La nature amphiphile des phospholipides est à l’origine de leur propriété à

s’autoassembler en phase aqueuse. Les phospholipides s’agencent de manière à ce que les

têtes polaires interagissent avec la phase aqueuse minimisant ainsi les interactions des chaînes

hydrophobes avec cette dernière. Il en résulte différentes organisations spatiales. Ce

comportement dépend toutefois de la température, de la pression, de la structure du PL

(notamment de la nature de la tête polaire), de sa concentration ainsi que de la proportion

d’eau dans le mélange (Koynova et Caffrey, 2002).

La forme finale des assemblages dépend de la structure moléculaire des PL. En suivant

une approche géométrique introduite par Israelachvili (Ishaelachvili, 1991), la forme est

déterminée par le paramètre d’empilement P. Il est le rapport entre le volume de la tête (v)

polaire du PL et l’aire de cette dernière (a0) multipliée par la longueur critique (lc) de la

chaîne hydrophobe :

claP

0

ν=

Selon le paramètre P du PL, il s’organisera plutôt sous forme de bicouches planes, de

vésicules, de micelles sphériques, cylindriques ou inverses (Tableau I-2). La structure la plus

fréquente dans la nature est la bicouche lipidique. Dans cette configuration, deux

monocouches de PL sont apposées, les queues hydrophobes des acides gras étant alors prises

en sandwich entre les deux couches de têtes polaires. Si le PL possède un volume

tronconique, les bicouches peuvent présenter un rayon de courbure permettant la formation de

structures sphériques appelées liposomes.



- 10 -

Type de lipides cla

P0

ν= Forme Structure

Lipides monocaténaires à large tête polaire, surfactant à faible force ionique

P < 1/3

Micelles sphériques

Lipides monocaténaires à petite tête polaire, Surfactant à grande force ionique ou lipides non ioniques

1/3 < P < 1/2

Micelles cylindriques

Lipides bicaténaires à large tête polaire, chaînes fluides PC, PS, PA

½ < P < 1

Vésicules

Lipides bicaténaires à petites polaire, lipides anioniques à grande force

ionique, chaînes gelées PE, PS + Ca2+ P ~ 1

Bicouches planes

Lipides bicaténaires à petites tête polaire, lipides non ioniques, chaines

poly-cis-iunsaturées, température élevée PE insaturée, PA+ CA2+

P > 1

Micelles inverse

Tableau I-2 : Différents arrangements des phospholipides en solution aqueuse (Delattre et al., 1993)

A partir du diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) (Figure

I-3), on constate que la majorité des phases correspondent à des types lamellaires (tous sauf

Hα et Qα qui sont respectivement des phases hexagonales et cubiques). Néanmoins, la

formation de liposomes ne pourra avoir lieu que pour des températures supérieures à la

température de transition de phase des chaînes d’acides gras et un taux d’hydratation

suffisant.

Chapitre 1 : Lipides et liposomes

Figure I-3 : Diagramme de phase fraction massique en eau et de la températur

structures lamellaires, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonallamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993)

Le diagramme de phase de la lécithine d’œuf est beaucoup plus simple dans la mesure

où toutes les chaines d’acides gras sont au

(Figure I-4). Ainsi, la phase Lα

comporte comme un seul lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires

de PL.

Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux

techniques supercritiques –

: Diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide et L

, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonallamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993)


où toutes les chaines d’acides gras sont au dessus de leur température de transition de phase

. Ainsi, la phase Lα est majoritaire. D’autre part, on constate que la l

l lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires

: des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux

– Etude Bibliographique

- 11 -

en fonction de la : phase lamellaire fluide et Lβ, Lβ’ :

, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonal ; Pβ : structure


dessus de leur température de transition de phase

est majoritaire. D’autre part, on constate que la lécithine se

l lipide même si elle est constituée de plusieurs espèces moléculaires

Chapitre 1 : Lipides et liposomes

Figure I-4 : Diagramme de phase eau et de la températur

I.1.4 Les liposomes ou

Les liposomes, ou vésicules lipidiques, sont définis comme des structures

généralement sphériques composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume

aqueux (Keller, 2001) (Figure

Figure I

Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux

techniques supercritiques –

: Diagramme de phase de la lécithine d’oeuf en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide) (Delattre, 1993)

Les liposomes ou vésicules lipidiques


composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume

Figure I-5).

I-5 : Schéma d'un liposome (Keller, 2001)

: des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux

– Etude Bibliographique

- 12 -

en fonction de la fraction massique en (Delattre, 1993)


composées de bicouches lipidiques emprisonnant un certain volume



- 13 -

On attribue leur découverte à Bangham en 1961, lorsqu’il effectuait des recherches sur

le comportement de colloïdes dans le sang (Segota et Tezak, 2006). Les liposomes ont la

particularité de pouvoir encapsuler des molécules hydrosolubles dans l’espace interne aqueux

mais également liposolubles dans la membrane phospholipidique.

Les liposomes peuvent être classés selon leur nombre de lamelles (ou bicouches) et

leur taille. On distingue les liposomes multilamellaires (Multi Lamelar Vesicles, MLV), les

unilamellaires de diamètre inférieur (Small Unilamellar Vesicles, SUV) ou supérieur à 100

nm (Large Unilamelar Vesicles, LUV) (Laurin et al., 2004).

L’encapsulation simultanée de molécules lipophiles et hydrophiles rend les liposomes

attractifs notamment pour de nombreuses applications (Tableau I-3) (Keller, 2001 ; Massing

et Fuxius, 2000).

Domaine Exemples d’application

Sciences fondamentales Biophysique (taille, forme des liposomes)

Stabilité des systèmes membranaires

Chimie Catalyse chimique

Pharmacie et médecine

Systèmes de libération contrôle de principes actifs

Traitement des maladies infectieuses

Immun adjuvants

Thérapie anticancéreuse

Diagnostic médical Liposomes magnétiques

Cosmétique Application topique

Agroalimentaire

Encapsulation de molécules d’intérêt nutritionnel

Protection de molécules labiles

Masquage de goût

Tableau I-3 : Exemple de domaines d’application des liposomes (Delattre, 1993)



- 14 -

I.2 Extraction des lipides

I.2.1 Méthodes classiques d’extraction des lipides

I.2.1.1 Extraction de l’huile et des triglycérides

La Figure I-6 décrit le principe d’une extraction d’huile à partir de graines

oléagineuses, ou trituration. La trituration permet d’extraire tous les types de lipides sans

distinction, ce qui en fait un procédé non-sélectif.

Figure I-6 : Fabrication d'huile et de tourteaux à partir de graines (Pages, 2008)



- 15 -

Ce procédé présente deux étapes d’extraction, une principale qui correspond à l’action

mécanique d’une presse, et une en voie solvant complémentaire. En effet, en sortie de presse,

une quantité non négligeable de matières grasses est encore contenue dans les tourteaux.

La gamme de solvants utilisables d’extraction est très restreinte. L’hexane est le

solvant le plus couramment utilisé. De nombreux solvants ne sont pas envisageables pour des

raisons de sécurité industrielle, de toxicité ou d’impact négatif sur l’environnement (Norme :

Directive 88/344). Pour des applications alimentaires, l’utilisation industrielle de solvants est

réglementée par une série de directives européennes qui définissent les critères de pureté et les

conditions d’emploi (Normes : Règlement 1881/2006 et CODEX STAN 19).

Une fois l’extraction par solvant terminée, le tourteau déshuilé contient autour de 30 %

d’hexane (en poids) qu’il faut éliminer aussi parfaitement que possible pour le rendre

conforme aux spécifications requises pour l’alimentation animale et éviter tout risque

d’inflammation et d’explosion pendant son entreposage.

Bien que la majorité de l’hexane soit récupérée (par exemple, 99,92% pour le soja),

des quantités résiduelles d’hexane se retrouvent malgré tout dans :

� l’huile d’extraction (200 ppm)

� les tourteaux (400 ppm)

� l’air sortant de l’installation de désolvantation (100 ppm)

� l’air de l’installation de piégeage des vapeurs par absorption à l’huile minérale

(30% de la limite inférieur d’explosivité),

L’huile en sortie de presse contient une faible quantité de particules solides. Ces

particules, riches en lipases (enzymes hydrolysant les TG) doivent être éliminées efficacement

pour une bonne conservation de l’huile. On les élimine généralement en deux étapes : passage

de l’huile sur tamis statique ou vibrant, suivi d’une filtration.

Pour répondre aux attentes du consommateur et des industriels à savoir : une huile

inodore, incolore, insipide et stable à l’oxydation, l’huile brute doit être raffinée, selon le

protocole présenté Figure I-7.



- 16 -

Figure I-7 : Schéma des différentes opérations du raffinage (Pages, 2008)

Il existe deux types principaux de raffinage : le raffinage chimique et le raffinage

physique. Dans le raffinage chimique, les acides gras libres, la plupart des phospholipides et

d’autres impuretés sont éliminés à l’étape de neutralisation avec des solutions de bases, le plus

souvent de la soude. Dans le raffinage physique, les acides gras libres sont éliminés par

distillation à température élevée.

Le raffinage d’un corps gras met en œuvre une série d’étapes qui présentent chacune

ses objectifs. La démucilagination (ou dégommage) des huiles brutes consiste à appliquer un

traitement à l’eau, aux acides dilués (citrique ou phosphorique) ou, plus rarement, à la soude

diluée afin d’éliminer les phospholipides et les matières mucilagineuses. Cette étape permet

d’éviter la formation de précipités dans le produit fini liés à la présence de phospholipides et

d’eau. Les PL retiennent les métaux pro-oxydants, nuisent à la stabilité organoleptique de

Auxiliaire principal de fabrication

H3PO4 (H2O)Acide phosphorique

NaOHsoude

Eau

Terresactivées

Vapeursèchesous vide,

À haute température

Azote

Constituantséliminés

Phospholipides

Acides gras, phospholipidesH3PO4, métaux, certains pigments,

produitsd’oxydation,certains contaminants

Cires végétales

Savons,phospholipides

Pigments colorés,Traces de savons,

Phopholipidesrésiduels,Produits d’oxydation polaires

Cires végétales

Flaveurs,Peroxydes,

contaminant

Prédécirage

(tournesol)

Décirage

(tournesol)

Huile brute

Démucilagination

Neutralisation

LavagesSéchage sous vide

Décoloration

Filtration

désodorisation del’huile décolorée

Inertage

Huile raffinée



- 17 -

l’huile et provoquent des problèmes de coloration de l’huile au cours de son chauffage. Enfin,

ils présentent des propriétés émulsifiantes entraînant une augmentation des pertes au cours du

raffinage.

La trituration et le raffinage permettent ainsi d’obtenir une huile composée à 95-99%

de triglycérides. Industriellement, les PL sont ainsi un sous produit des huileries.

I.2.1.2 Extraction des phospholipides

Actuellement, les principales sources de lécithine sont le soja et le jaune d’œuf

(Gladkowki et al., 2011). Néanmoins, on commence à trouver sur le marché des lécithines

issues du tournesol et du colza. Par ailleurs, on note un intérêt croissant pour les lécithines

marines et les PL du lait. Ces lécithines diffèrent par le type de phopholipides et par leurs

profils d’acides gras (Tableau I-4) (Huopalahti et al., 2007).



- 18 -

Type phospholipides Lécithine

d’œuf Lécithine de soja

Lécithine marine

PL de lait

Phosphatidylcholine (PC) 73 23 85 26

Phosphatidyléthanolamine (PE)

18 22 10 23

Phosphatidylinositol (PI) 3 8 3 7

Acide Phosphatidique (PA) 1 6 - 2

Phosphatidylsérine (PS) - 1 1 8

Shingomyéline 3 - 1 26

Glycolipides - 11 - 8

Carbohydrates - 6 - -

Acides Gras

Palmitique 26 18 16 23

Stéarique 14 5 1 15

Oléique 36 11 20 36

Linoléique 15 58 3 9

Linolénique 1 7 1 1

Arachidonique 5 - 1 -

Eicosapentaenoique (EPA) - - 16 -

Docosahexaénoïque (DHA) 3 - 25 -

Tableau I-4 : Composition de quelques lécithines en fonction de l’origine (Schneider, 2011)

On remarque que les lécithines d’œuf et d’origine marine possèdent une grande

majorité de PC, et qu’elles contiennent du DHA (3% et 25%). De plus, la lécithine marine est

aussi source d’EPA : elle est donc particulièrement intéressante d’un point de vue

nutritionnel.

Les lécithines végétales sont des sous-produits des huileries. La Figure I-8 décrit

l’obtention de la lécithine de soja ainsi que les différents traitements possibles pour enrichir

les lécithines en PL.



- 19 -

.

Figure I-8 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine de soja et de ses dérivés (Schneider, 2011)

Les lécithines végétales sont obtenues après l’étape de dégommage qui consiste à

séparer les lipides polaires de l’huile par ajout d’eau. Cette opération est une étape de

raffinage des huiles. Ensuite, en fonction des applications visées, la lécithine obtenue peut

subir différents traitements :



- 20 -

• modification chimique : Il existe de nombreux procédés chimiques de

modification, mais le plus répandu consiste à effectuer une hydrogénation des

chaines d’acides gras des phospholipides

• extraction à l’éthanol : Seules la PC et la PE (dans une moindre mesure) sont

solubles dans l’éthanol. Ce traitement permet donc d’enrichir les lécithines en

PC.

• extraction à l’acétone : Les phospholipides sont insolubles dans l’acétone

contrairement aux TG. L’objectif est donc de déshuiler les lécithines.

• modifications enzymatiques : Selon l’enzyme (phospholipase A1, A2, C ou D)

utilisée, il est possible de faire des hydrolyses ou des modifications de tête

polaire du phospholipide

L’objectif de ces traitements est de modifier la composition de la lécithine de départ de

manière à obtenir des produits aux propriétés fonctionnelles différentes.

La lécithine d’œuf est obtenue par déshuilage à l’acétone de poudre de jaune d’œuf

puis extraction à l’éthanol pour obtenir les phospholipides (Figure I-9).

Figure I-9 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine d’œuf (Schneider, 2011)

Les lécithines marines sont extraites à partir du résidu de presse d’un poisson après

extraction de l’huile. Une première extraction à l’hexane permet d’obtenir l’ensemble des



- 21 -

lipides. Ensuite, tout comme pour les lécithines végétales, une étape de dégommage permet de

séparer les phospholipides de l’huile (Figure I-10).

Figure I-10 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine marine (Schneider, 2011)

Quant aux PL du lait, ils sont obtenus à partir de la crème qui est centrifugée pour

séparer l’eau de la matière grasse. Ensuite, une ultrafiltration sur la fraction sérique permet

d’obtenir la fraction phospholipidique (Figure I-11).

Figure I-11 : Schéma des différentes opérations d’obtention des PL du lait (Schneider, 2011)



- 22 -

Les techniques conventionnelles d’extraction des phospholipides sont complexes et

mettent en œuvre de nombreuses étapes. Elles sont dépendantes de la nature de la matière

première.

I.2.1.3 Extraction des lipides à l’échelle du labor atoire

Des techniques normalisées existent pour la détermination du taux de matière grasse

en fonction de la nature de l’échantillon. Elles sont réalisées et distribuées par l’AFNOR

(Tableau I-5).

Type d’échantillon

Produit animale ou

végétale

Produit agricole ou alimentaire

Amidons et fécules, natifs

ou transformés

Produits laitiers et produits à base de lait

Référence normes

NF ISO 935 V03-030 NF EN ISO

3947 NF ISO 8262

Tableau I-5 : Références des techniques normalisées d’extraction des lipides

En laboratoire, l’extrait lipidique est obtenu généralement selon les protocoles de

Folch ou de Bligh et Dyer qui font appel à des extractions au chloroforme et au méthanol.

L’avantage de la méthode de Bligh et Dyer par rapport à la méthode de Folch est la réduction

de la quantité de solvants utilisée (Iverson et al., 2001). En effet, pour des masses

d’échantillons identiques, la technique de Bligh et Dyer utilise trois volumes équivalents d’un

mélange chloroforme/méthanol (1:2) suivi par un ou deux volumes de chloroforme tandis que

pour la méthode de Folch utilise vingt volumes équivalents d’un mélange

chloroforme/méthanol (2 :1).

Il est également possible d’utiliser un extracteur de type soxhlet. Il s’agit d’un appareil

spécialement conçu pour l'extraction continue solide-liquide. Le solvant est porté à ébullition,

puis condensé avec un réfrigérant, dans le réservoir à siphon, contenant le solide à extraire

dans une cartouche de papier épais. Pour l’extraction des lipides avec ce type d’appareillage,

on utilise comme solvant de l’éther de pétrole.



- 23 -

I.2.2 Les méthodes supercritiques d’extraction

Les techniques supercritiques d’extraction ont été développées dans le but d’éviter

l’utilisation de solvants organiques toxiques. L’objectif de cette partie est de présenter

brièvement les propriétés d’un fluide supercritique puis de développer plus spécifiquement les

études relatives aux huiles (triglycérides) et aux phospholipides afin de déduire le domaine de

variation des paramètres essentiels du procédé.

I.2.2.1 Définition et propriétés générales des flui des supercritiques

Les corps purs peuvent se trouver à l’état solide, liquide ou gazeux. Sur le diagramme

température-pression (Figure I-12, cas du CO2), il est possible de distinguer les régions

correspondant à ces trois états grâce aux courbes de changement d’état. La courbe de

vaporisation (liquide-gaz) présente un point d’arrêt dit point critique correspondant à un

couple de pression-température. Dans le cas du dioxyde de carbone (CO2), la pression critique

(Pc) est de 74 bar et la température critique (Tc) de 31,1°C. Au-delà de cette pression et de

cette température, le fluide est dit supercritique. Les fluides supercritiques possèdent des

caractéristiques intermédiaires (viscosité, masse volumique, diffusivité etc…) entre celles de

l’état liquide et de l’état gazeux. Une propriété intéressante de cette zone du diagramme de

phase est le contrôle aisé de ces propriétés physico-chimiques par action sur la pression et/ou

la température. Les fluides supercritiques sont donc des solvants aux caractéristiques très

modulables.



- 24 -

Figure I-12 : Diagramme de phase du CO2 (Penchev, 2001)

Dans les procédés d’extraction, on tire profit des propriétés physico-chimiques des

fluides supercritiques :

� La masse volumique : Les fluides supercritiques ont une densité proche de

celle des liquides. Plus elle est élevée, plus le pouvoir solvant est important.

� La viscosité : Les fluides supercritiques ont une viscosité supérieure à celle des

gaz mais inférieure à celle des liquides. Une faible valeur de viscosité favorise

le transfert de matière par une meilleure pénétration dans la matrice et permet

de diminuer l’apport énergétique nécessaire pour déplacer le fluide.

� La diffusivité : Les fluides supercritiques ont une diffusivité inférieure à celle

des gaz mais supérieure à celle des liquides. Le transfert de matière est donc

plus favorable dans des conditions supercritiques que dans un liquide.

C’est la combinaison de ces propriétés qui détermine le pouvoir solvant qui est donc

directement lié à la pression et à la température de travail.



- 25 -

I.2.2.2 CO2 supercritique pur et en mélange

Le CO2 est le composé le plus couramment employé dans des conditions

supercritiques en recherche et dans l’industrie puisqu’il présente de nombreux avantages

comme des coordonnées critiques facilement accessibles [Tc = 31°C et Pc = 73,8 bar]. Son

utilisation possible à une température proche de l’ambiante fait qu’il est particulièrement

adapté aux produits thermosensibles. De plus, le CO2 présente les avantages suivants :

� Une forte disponibilité et un prix peu onéreux

� Une non toxicité

� Il est non combustible

� Il est non polaire

� Il est non explosif

� Une élimination aisée (redevient gazeux à pression atmosphérique)

De nombreux procédés ont été développés sur la base des propriétés des fluides

supercritiques. Néanmoins, de nombreuses applications nécessitent l’utilisation de mélanges

qui permettent de renforcer les pouvoirs solvants vis-à-vis de certains composés à extraire.

La Figure I-13 présente le diagramme de phase du CO2- éthanol en fonction de la

pression et de la composition. Quelle que soit la composition, après 100 bar, le mélange est

monophasique. On a donc une très grande miscibilité de l’éthanol avec le CO2.



- 26 -

Figure I-13 : Diagramme de phase du CO2-éthanol (49,5 °C) (Seung et al., 2001)

I.2.2.3 Principes généraux de l’extraction solide-l iquide

L’extraction est l’opération qui a pour but, par contact avec un solvant, d’extraire un

ou plusieurs constituants d’une matrice. Il s’agit d’une opération de transfert ou d’échange de

matière entre une phase généralement solide contenant la masse à extraire et le solvant. Le

solvant dissout un ou plusieurs constituants dénommé(s) soluté(s) pour donner une solution

ou extrait. Le solide appauvri en soluté est appelé résidu ; il est inerte ou insoluble.

L’extraction est réalisée par contact du solvant avec le solide. Elle se définit comme le

résultat du transfert du soluté présent dans le solide vers le solvant. Ce transfert exige un

certain temps et introduit une notion de vitesse d’extraction qui est régie par trois processus

(Figure I-14) :

� Passage du solvant dans le solide et dissolution du soluté au sein des

particules du solide (1)

� Diffusion du soluté du cœur vers la surface de la particule (2)

� Diffusion du soluté depuis la surface de la particule vers le cœur du solvant

(3)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Pre

ssio

n (

ba

r)

Composition molaire en CO2

Données expérimentales (Seung N. J., 2001)

Données calculées par Prophys



- 27 -

Figure I-14 : Mécanisme de transfert du soluté de la matrice vers le solvant au cours de l’extraction

La Figure I-15 présente un exemple de courbe d’extraction par percolation à travers un

lit fixe, c'est-à-dire la quantité totale extraite en fonction de la masse de solvant passée.

Figure I-15 : Exemple de courbe d’extraction (masse cumulée)

La courbe d’extraction met en évidence deux régimes d’extraction gouvernés par deux

phénomènes. La première partie de la courbe est linéaire [1], la pente initiale est limitée par la

solubilité et le transfert de matière à travers le lit de matière. Le coefficient directeur de la

solide

soluté à extraire

solvant pur

solvant + soluté

(1) (2) (3)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

ma

sse

ex

tra

ite

(g

)

masse de solvant (g)

(1) (2)

(1) (2) (3)



- 28 -

droite est inférieur ou égale à la solubilité du soluté dans le solvant.

La seconde partie de courbe caractérisée par un ralentissement puis un arrêt de

l’extraction (asymptote horizontale) [2]. Le transfert de matière du soluté vers le solvant est

beaucoup plus long à cause de son accessibilité. En effet, tout le soluté des premières couches

en contact avec le solvant étant totalement extrait, le soluté doit migrer du cœur de la matière

vers l’extérieur. Ce processus est long, c’est pourquoi on observe un ralentissement de la

courbe puis l’arrêt de l’extraction quand il n’y a plus de soluté accessible ou quand tout le

soluté a été extrait.

L’extraction est un procédé dépendant des caractéristiques phyico-chimiques de la

matière à extraire (granulométrie, forme des particules, hydratation, interactions soluté-

matrice), du lit (compactage/porosité), du soluté (interaction avec la matrice, diffusion,

solubilité dans le fluide extractant), du fluide extraction (solvatation du soluté etc.), de son

débit d'alimentation et des conditions de température et de pression.



- 29 -

I.2.2.4 Extraction supercritique des lipides

Dans cette partie, l’extraction des lipides neutres puis de celle des phospholipides sont

détaillées afin de cerner les conditions opératoires susceptibles de conduire à une extraction

sélective des PL. Il est généralement admis que le CO2 étant un composé apolaire, il ne

dissout donc pas les composés polaires de type PL. Depuis une vingtaine d’années, il a été

utilisé comme solvant d’extraction pour les lipides d’origines animale et végétale.

I.2.2.4.1 Extraction des lipides neutres

Le CO2 a donc la particularité d’extraire préférentiellement (voire de manière

sélective) les lipides neutres. A titre d’exemple, l’extraction des lipides de la peau de colin en

utilisant le CO2 supercritique montre que 96% des TG (initialement présent dans la matière)

sont extraits (Rodriguez et al., 2008). Une autre étude sur des sous produits de calamar

indique qu’il est aussi possible d’extraire 51 % de cholestérol (initialement présent dans la

matière) (Kang et al., 2005)). Les phospholipides quant à eux ne sont pas ou très peu extraits

(Boutin et al., 2009 ; Dunford et Temelli, 1995).

Le Tableau I-6 résume les rendements d’extraction ainsi que les conditions opératoires

considérées comme optimales pour l’extraction des lipides neutres déterminées par différentes

études.

Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux techniques supercritiques – Etude Bibliographique

- 30 -

Matière première P / T Débit

Durée extraction

(min)

Masse traitée (g)

Quantité de CO2 utilisée /

matière traitée (g/g)

Rendement (masse de lipides

extraite/masse lipides initiale) (%)

Analyse des espèces de

lipides extraits

Référence

Flocons de soja 320 bar / 80°C NC NC 600 NC 96,7 Oui : pas de

PL (Montanari et

al., 1999) Graines de tournesol

450 bar / 75°C 19 kg/min 120 1000 38 78,5 Oui : pas de

PL (Boutin et al.,

2009) Graines de

colza 450 bar / 75°C 19 kg/min 120 1000 38 89,8

Oui : pas de PL

(Boutin et al.,

2009) Graines de

colza 552-621 bar /

45-70°C NC 180 45 NC NC

Oui :pas de PL

(Dunford et

Temelli, 1997) Graines de

colza 360 bar / 55°C 0,7 g/min 360 4 ou 7 36 ou 63 95 Non

(Fattori et al.,

1988)

Œufs déshydratés

414 bar / 45°C 10 g/min 40 10 40 68

Oui : lipides neutres

(98%) et PC (2%)

(Shah et al.,

2004)

Œufs déshydratés

517 bar / 40°C 0,35 mg/min 120 1 42 100 Oui : TG, PL (26,3%) et cholestérol

(Boselli et

Carbon, 2000)

Peau de colin 250 bar / 40°C 10 kg/h 180 100 300 96,5 Oui :

« huile » (Rodriguez et al.,

2008) Chair de sardine

lyophilisée 180bar / 40°C 10 g/min NC NC NC NC

Oui : TG et cholestérol

(Esquivel et al.,

1997)

Crevettes (têtes et queues)

300 bar / 50°C 2,5 g/min 200 7 71 46 Oui : lipides non polaires

(Sanchez-

Camargo et al.,

2001)

Tableau I-6: Récapitulatif des conditions d'extraction des lipides par CO2 supecritique

NC : Non Calculable



- 31 -

D’une manière générale, l’ensemble des études présentées dans le Tableau I-6

concerne une extraction en continu dans des réacteurs tubulaires de type piston à des échelles

analytiques ou pilotes. Les rendements d’extraction sont variables d’une étude à l’autre mais

peuvent atteindre des valeurs importantes, signe d’un fort potentiel de ce genre de technique.

Les différences de performance peuvent être expliquées par la nature de la matière première

mais également le taux de phospholipides présent dans la matrice qui ne sont pas extraits par

le CO2. Dans la majorité des cas, la quantité de solvant est similaire et de l’ordre de 40 g de

CO2 par g de matière première. Pour la peau de colin et les sous-produits de crevettes, les

masses de solvant utilisées sont plus importantes mais on peut penser que ce paramètre n’a

pas été optimisé.

En résumé, les gammes de pression, de température et de masse de solvant utilisées

pour l’extraction des lipides neutres sont :

180 bar < P < 621 bar

35°C < T < 80°C

pour 1 g de matière première 36 g de CO2 < masse de solvant < 300 g de CO2

Il est intéressant de noter que, dans des conditions d’extraction utilisant des mêmes

gammes de pression et température, Boselli et al., (Boselli et Carbon, 2000) ont obtenu un

extrait lipidique à partir d’œuf contenant 26% de PL alors que Dunford et al. (Dunford et

Temelli, 1997), n’ont pas extrait de phospholipides à partir de graines de colza. Ceci met en

évidence l’importance de la matière première. En effet, on peut penser que dans le premier cas

les phospholipides sont plus « accessibles » que dans le second ou que la teneur initiale en PL

des matières premières est différente. Pour une même matière première (par exemple les

graines de colza), on peut obtenir des rendements d’extraction élevé en utilisant des

paramètres d’extraction variables (Montanari et al., 1999 ; Boselli et Carbon, 2000 ;

Rodriguez et al., 2008).



- 32 -

Un autre point intéressant de ces études est l’importance du couple pression-

température. En effet, à faible température, il faut généralement travailler à haute pression et

inversement. Pour expliquer ce comportement, il existe un modèle reliant la solubilité (noté C

en g d’huile par litre de CO2) de l’huile végétale en fonction de la température (T en K) et de

la masse volumique (ρ en g/l) qui dépend de la pression et de la température (Numan et al.,

1988) :

ln � = 40,361 − 18708� + 2186840

�² + 10,724 ln �

Cette équation est valable pour :

148 bar < P < 868 bar

20°C < T < 80°C

Cette loi illustre le lien entre la température et la pression dans la mesure où la masse

volumique dépend de pression (pour une température donnée) sur la solubilité.

I.2.2.4.2 Extraction supercritique des phospholipid es

Pour extraire les phospholipides, il est nécessaire de modifier la polarité du solvant du

CO2 qui permet plutôt l’extraction des lipides neutres. Pour cela, l’ajout d’un co-solvant est

nécessaire. Généralement, c’est l’éthanol qui est utilisé puisqu’il solubilise certains

phospholipides. De plus, il est considéré comme GRAS (generally recognized as safe) ce qui

permet d’élargir les domaines d’application visés. D’après ce qui est connu sur l’utilisation de

l’éthanol dans le fractionnement des lécithines (cf I.2.1.2), l’association CO2-éthanol devrait

extraire majoritairement la PC et la PE (dans une moindre mesure).

Cependant, en utilisant comme solvant d’extraction un mélange CO2-éthanol

directement sur la matrice, les PL sont extraits et les lipides neutres également. L’extrait ainsi

obtenu présente une proportion faible en phospholipides. C’est pourquoi, pour l’obtention

d’extraits enrichis en phospholipides, une procédure en deux étapes est généralement réalisée.

La première consiste à extraire les lipides neutres avec du CO2 pur. La seconde consiste à

extraire les phospholipides avec du CO2-éthanol. La première étape peut être assimilée à un

« déshuilage » de la matrice, la seconde, est l’extraction des phospholipides proprement dite.

Le Tableau I-7 résume les conditions opératoires utilisées dans différentes études pour



- 33 -

l’extraction des phospholipides.

Matière première Flocons de soja*

Tourteaux de colza

Lécithine de soja Œufs déshydratés*

P (bar) /T (°C) 689 / 70 552 / 70 207 / 60 414 / 60

Ethanol (% molaire)

10 7,5 10 50

Masse traitée (g) 4,5 65 3 8

Durée de l’extraction (min)

30 90 150 40

Débit de CO2

(g/min) 1,7 7,3 2 10

Débit d’éthanol (g/min)

0,19 0,6 0,22 12

Quantité de CO2 utilisée / matière

traitée (g/g) 11,33 10,10 100 50

Quantité d’éthanol utilisée / matière

traitée (g/g) 1,27 0,83 11 60

Rendement (masse PL extraite / masse

PL échantillon) (%)

100 22,5 NC 17,9

Pureté NC 39% de PL

dans l’extrait lipidique

95% de PC dans la fraction PL

93% de PL dans l’extrait lipidique

Référence (Montanari et

al., 1999) (Dunford et

Temelli, 1995) (Tebericker et al.,

2001) (Shah et al.,

2004)

Tableau I-7 : Conditions d'extraction des phospholipides

(*procédé en 2 étapes : CO2 pur puis CO2-éthanol)

L’ensemble des extractions est réalisé dans des réacteurs tubulaires. Les quantités de

matière première traitées vont de 3 à 65 g. Les rendements d’extraction sont variables d’une

étude à l’autre mais une valeur de 100% est obtenue pour une extraction à partir de flocon de

soja à 689 bar et 70°C. Le traitement préalable au CO2 n’est pas toujours efficace pour

éliminer les lipides neutres comme le montrent les résultats obtenus sur les œufs (Shah et al.,

2004)



- 34 -

A l’exception du cas de l’œuf, les pourcentages d’éthanol utilisés sont de l’ordre de

10%. Le taux élevé d’éthanol utilisé pour l’extraction des PL de l’œuf peut être nécessaire

pour détruire des interactions lipides/protéines. Par ailleurs, l’intérêt du déshuilage est mis en

évidence sur la pureté des extraits obtenus (Shah et al., 2004).

D’après ces données, les conditions opératoires pour extraire les phospholipides sont :

200 bar < P < 700 bar

60°C < T < 80°C

7,5 % < % éthanol < 50%

Pour 1 g de matière première 10 g de CO2 < masse de CO2< 100 g de CO2

Pour 1 g de matière première 0,8 g d’éthanol < masse d’éthanol< 60 g d’éthanol

Il est intéressant de noter qu’il possible d’extraire les phospholipides à « basse

pression ». Par contre, il faut faire attention lorsqu’on utilise des proportions de co-solvant

importantes car cela risque de diminuer la pureté des extraits. En effet, plus le pourcentage

d’éthanol est grand, plus d’espèces polaires seront extraites. Les températures mises en jeu

semblent être importantes et risquent de dégrader la matière première et donc aboutir à un

extrait de qualité moindre. Il n’y a pas d’information à ce sujet dans la littérature.

Les paramètres opératoires sont probablement tous liés. Par exemple, une grande

proportion d’éthanol peut compenser une faible pression ou inversement une faible pression

peut permettre de réduire la teneur en alcool.

I.2.2.4.3 Influence de la préparation de la matière première sur l’extraction des lipides

L’extraction supercritique des lipides dépend des paramètres tels que la pression et la

température notamment à cause de leur action sur la solubilité. Cependant, la matière

première a également un impact important sur l’extraction puisqu’elle va principalement

influer sur la résistance au transfert de matière. Dès lors, on peut être amené à prétraiter la

matière première notamment en réalisant un broyage, un séchage ou un trempage.



- 35 -

Fragmenter un l’échantillon à traiter permet d’augmenter la surface spécifique afin de

favoriser le transfert de matière. Cette action conduit également à une destruction de la

structure de la matière première susceptible de rendre accessibles des zones de la structure qui

ne l’était auparavant.

Dans le cas spécifique de l’extraction de lipides, Fattori (Fattori et al., 1988) a

comparé l’impact sur le rendement d’extraction (η, masse de lipides extraits/masse de lipides

de l’échantillon) de cinq prétraitements de réduction de tailles différents effectués sur des

graines de colza :

� Broyage à l’aide d’un broyeur à rouleaux puis cuisson à 90°C pendant 30

min [η=86%]

� Broyage à l’aide de couteaux mis en rotation sur une période de 5 min

[η=79%]

� Dépressurisation rapide de l’échantillon [η=79%] saturé en gaz

� Broyage à l’aide d’un pilon et mortier [η=55%]

Le meilleur prétraitement pour l’extraction des lipides est le broyage à l’aide de

rouleaux. De plus, cette étape permet d’inactiver certaines enzymes. Si le broyage permet

globalement d’améliorer l’extraction, c’est une opération qui n’est dépourvue d’inconvénients

(rendement énergétique très faible, contrôle de la taille limité, pas applicable aux produits

thermosensibles, nécessite parfois l’utilisation d’adjuvant…).

La teneur en eau de la matière première est également susceptible de modifier

l’extraction. Le pourcentage d’eau contenu dans l’échantillon influe sur l’affinité de l’huile

avec le CO2 supercritique. Par exemple, sur la peau de colin, 96,5% de lipides sont extraits

pour des humidités faibles (8,4 et 17,8%) alors que seulement 73,3% des lipides sont

récupérés pour des humidités plus élevées (51,5%) (Rodriguez et al., 2008). Par conséquent,

un prétraitement de séchage améliore l’extraction mais une élimination complète de l’eau

n’est pas recommandée : cela n’améliore pas les rendements d’extraction et ce n’est pas

économiquement rentable.



- 36 -

Une technique de préparation d’échantillons spécifique à l’extraction des

phospholipides consiste à faire macérer la matière première dans de l’éthanol (Dunford et

Temelli, 1995). Cela permet d’améliorer les rendements en lipides polaires (20,8% à 30,4%)

mais l’apparition d’un « gâteau » très compact finit par créer des problèmes de colmatage

dans le réacteur.

Dans certaines études, l’échantillon est mélangé à des billes de verre, de la celite (1 :1

en masse) ou du sable (1 :1 en masse) (Boselli et Carbon, 2000 ; Shah et al., 2004). Il est

probable que cela permette d’éviter que le solvant ait des chemins préférentiels dans la

matière première.



- 37 -

I.2.3 Conclusion sur l’extraction

Le Tableau I-8 présente une comparaison de l’extraction des lipides neutres par

solvant et par fluides supercritiques.

Extraction conventionnelle

(Solvant)

Extraction supercritique par du CO2 pur

(180 bar < P < 621 bar/ 35°C < T < 80°C)

Résidus de solvants toujours présents dans

l’extrait (quelques ppm) dépendant du type

de solvant utilisé (généralement hexane)

L’extrait ne contient aucune trace de solvant

Présence de métaux lourds et de sels

inorganiques dans l’extrait inévitable et

dépendant du type de solvant utilisé

Pas d’extraction de ces deux types de

composés

Nécessite l’élimination des phospholipides Forte sélectivité pour les lipides neutres

Opération supplémentaire pour éliminer les

solvants résiduels dans l’équipement mais

également dans la matière délipidée

Nécessite un retraitement/recyclage de

l’hexane

Pas d’utilisation de solvant toxique

Prétraitement : aplatissage et/ou broyage Prétraitement : déshydratation et broyage

Coût élevé d’utilisation Coût élevé de l’installation

Tableau I-8 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des lipides neutres

Les avantages de l’extraction supercritique des lipides neutres par rapport aux

techniques conventionnelles sont la diminution du nombre d’étapes, la non utilisation de

solvants toxiques et polluants. De plus, il est possible de recycler le CO2 et son coût est

largement inférieur à celui de l’hexane. Par contre, le coût d’une installation haute pression

est important et doit donc être rentabilisé sur une longue période ou sur l’extraction de

matières à forte valeur ajoutée.



- 38 -

Plusieurs études (Rodriguez et al., 2008 ; Esquivel et al., 1997) indiquent qu’il n’y a

pas de différences significatives du profil d’acides gras obtenus avec les deux types

d’extraction. Les rendements atteints peuvent être très élevés (98%) mais dépendent des

paramètres opératoires et de la matière première utilisée.

Dans le cas des phospholipides, le Tableau I-9 présente une comparaison des

techniques conventionnelles et supercritiques.

Extraction conventionnelle

(Solvant)

Extraction supercritique avec un mélange CO2-éthanol

(200 bar < P < 700 bar/ 60°C < T < 80°C/ 7,5 % < éthanol < 50%)

Résidus de solvants toujours présents dans

l’extrait (quelques ppm) dépendant du type

de solvant utilisé (généralement éthanol ou

acétone)

Extrait mélangé au co-solvant (généralement

l’éthanol)

Extraction de tous les types de

phospholipides

Extraction de PC et PE (dans une moindre

mesure)

Nécessite une étape de fractionnement pour

obtenir de la PC pure

Présence de triglycérides

Possibilité d’obtenir des extraits très purs en

PC

Opération supplémentaire pour éliminer les

solvants résiduels dans l’équipement mais

également dans la matière délipidée

Pas d’utilisation de solvant toxique

Tableau I-9 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des phospholipides



- 39 -

Pour l’extraction des phospholipides, hormis dans le cas d’une matière première

contenant très peu de lipides neutres, les deux techniques nécessitent plusieurs étapes. En

effet, pour les méthodes conventionnelles, on extrait tous les lipides et ensuite on sépare les

PL des autres espèces. Pour les techniques supercritiques, une étape préalable d’extraction des

lipides neutres est nécessaire pour obtenir un extrait de PL contenant peu voire pas d’autres

lipides.

En résumé, cette analyse bibliographique permet d’envisager un procédé d’extraction

de lipides par techniques supercritiques. Pour obtenir un extrait pur en phospholipides, il est

nécessaire d’effectuer une première extraction des lipides neutres avec du CO2 pur, puis une

seconde avec un mélange CO2-éthanol (5-50% massique de co-solvant) pour extraire les

phospholipides. Que ce soit dans le cas des lipides neutres ou des phospholipides, les

conditions de pression et de température requises sont de :

180 bar < P < 700 bar

35°C < T < 80°C

De plus, un prétraitement de séchage et de broyage de la matière première à traiter doit

être effectué. L’objectif est de diminuer le taux d’humidité afin d’améliorer l’extraction et de

diviser la matrice.



- 40 -

I.3 Les techniques de préparation des liposomes

I.3.1 Les techniques conventionnelles

Il existe de nombreuses techniques de préparation de liposomes. Tous les moyens

conventionnels nécessitent l’utilisation d’une phase aqueuse et d’une phase organique. Cette

dernière sert généralement à solubiliser les lipides avant d’être dispersée dans la seconde

phase.

Quelle que soit la technique utilisée pour mettre en contact les deux phases, un post

traitement complémentaire peut être réalisé afin de réduire la taille des liposomes ou de

modifier leur lamellarité. Les plus courantes sont la sonication, l’extrusion sur membrane ou

encore l’homogénisation à l’aide d’un microfluidiseur.

Le Tableau I-10 résume les principales techniques de préparation de liposomes telles

que :

� Technique du film (hydratation d’un film phospholipidique)

La technique du film aussi appelée méthode de Bangham est un procédé courant. La

première étape consiste à dissoudre les lipides dans un solvant organique. Ensuite, on évapore

ce même solvant méticuleusement pour aboutir à la formation d’un film lipidique. La

formation des liposomes s’obtient par simple hydratation du film avec une solution aqueuse

tout en maintenant une agitation nécessaire au détachement des couches lipidiques.

Les liposomes obtenus sont multilamellaires avec une taille de l’ordre de quelques

micromètres. Il s’agit d’une technique simple (formation spontanée de liposomes) mais la

qualité du film est le point crucial.



- 41 -

� Technique d’injection d’éthanol ou d’éther

Les phospholipides sont initialement dissous dans l’éthanol ou l’éther, puis la solution

est injectée dans une phase aqueuse via une aiguille. En utilisant de l’alcool éthylique, les

liposomes obtenus sont hétérogènes du fait de la pauvre solubilité de certains lipides dans ce

dernier. De plus, il est possible d’avoir des traces de solvant dans la dispersion si rien n’est

entrepris pour le retirer entièrement. En substituant l’éther à l’éthanol, la technique est plus

performante. En effet, ce dernier n’est pas miscible avec l’eau ce qui permet, par simple

chauffage, d’éliminer le solvant. Cependant, la technique est difficilement contrôlable.

Les liposomes obtenus sont de tailles variables (dépendant des dimensions de

l’aiguille et de l’injection en général), unilamellaires et très concentrés.

� Evaporation en phase inverse

La formation des liposomes est rendue possible par la dispersion de gouttelettes d’eau

sous forte agitation dans un solvant organique contenant les phopholipides. Initialement, des

micelles d’eau/phospholipides sont produites. Puis, par évaporation de la phase organique,

généralement réalisée à l’aide d’un évaporateur rotatif, les liposomes se forment.

Les liposomes obtenus sont unilamellaires ou multilamellaires selon la concentration

en phospholipides.

� Passage par des émulsions doubles

Une autre possibilité consiste à former au préalable une émulsion eau/huile : à une

grande quantité de phase organique contenant les phospholipides solubilisés, il faut ajouter

une petite proportion de solution aqueuse tout en ayant une forte agitation. Spontanément, les

phopholipides vont se mettre à l’interface pour former une monocouche lipidique. Ensuite,

l’émulsion simple est transformée en une émulsion double en ajoutant le mélange précédent à

un excès de phase aqueuse. Un flux de diazote, barbotant dans l’émulsion double permet

d’éliminer le solvant organique et de former les liposomes.

On obtient des liposomes unilamellaires.



- 42 -

� Elimination du détergent de micelles mixtes

Dans cette méthode, les phospholipides sont d’abord formulés dans des micelles

mixtes lipides/tensio-actifs dans un milieu aqueux. En éliminant le tensio-actif à vitesse

contrôlée des liposomes unilamellaires se forment.

La taille des liposomes varie selon la technique d’élimination du détergent. La plus

courante est la dialyse mais elle présente l’inconvénient d’être lente. On peut aussi utiliser

l’adsorption du détergent sur des résines hydrophobes (Delattre, 1993). L’inconvénient de

cette technique est qu’il faut s’assurer de l’élimination totale du tensio-actif des membranes

des liposomes.

Méthode Type de

liposomes Taille des liposomes

(µm) Référence

Technique du film MLV 1-3 (Delattre, 1993)

Technique d’injection d’éthanol ou d’éther

LUV ou SUV Variable (dépend de

l’injection) (Laurin et al.,

2004)

Evaporation en phase inverse

MLV ou LUV (dépend de la concentration)

<1 (Meure et al.,

2008)

Passage par des émulsions doubles

SUV 0,05 (Shum et al., 2008)

Elimination du détergent de micelles

mixtes SUV ou LUV

Variable (dépend de l’élimination)

(Delattre, 1993)

Tableau I-10 : Les méthodes classiques de formation de liposomes (MLV : Multi Lamellar Vesicles, LUV : Large Unilamellar Vecicles et SUV : Small Unilamellar Vesicles)

En conclusion, les techniques conventionnelles de formation des liposomes permettent

d’avoir des vésicules de l’ordre d’une vingtaine de nanomètres à quelques micromètres.

Certaines ont l’avantage d’être simples à mettre en œuvre. Elles comptent toutes plusieurs

étapes et sont principalement utilisées sur de petits volumes de solution. Il est difficilement

concevable d’utiliser ce genre de technique à grande échelle notamment pour la plus courante

(Bangham). De plus, elles ont l’inconvénient majeur d’utiliser des solvants organiques ce qui

limite les applications (notamment au domaine médical).

On peut également ajouter que certaines étapes telles que l’agitation impliquent

parfois un cisaillement important et une élévation locale de température qui risquent de



- 43 -

dénaturer les composés lipidiques notamment les acides gras polyinsaturés. Pour ces raisons,

il est nécessaire de développer de nouvelles techniques. L’utilisation de fluides supercritiques

peut permettre de formuler des liposomes en réduisant les inconvénients évoqués

précédemment.

I.3.2 Les techniques supercritiques

Les techniques de préparation de liposomes par voie supercritique ont été développées

pour résoudre les problèmes induits par les techniques conventionnelles de préparation

(utilisation de solvants toxiques, nombreuses étapes…). Plusieurs méthodes ont vu le jour

pour l’obtention de liposomes en utilisant des conditions supercritiques, nous détaillerons

certaines de ces méthodes en explicitant leurs avantages et inconvénients.

Le Tableau I-11 compare les différentes techniques basées sur l’utilisation de CO2

supercritique, à noter que nous ne faisons pas apparaître celles nécessitant une phase de

réhydratation.

Chapitre 1 : Lipides et liposomes : des techniques conventionnelles d’extraction et de mise en forme aux techniques supercritiques – Etude Bibliographique

- 44 -

Méthode Solvant

(hormis CO2) Phospholipides

Pression (bar)

Température (°C)

Taille des liposomes (µm)

(type) Référence

Méthode des liposomes

« supercritiques » Ethanol

Palmitoyl oléoyl phosphatidylcholine

250 60 0,02 – 0,25

(unilamellaire et multilamellaire)

(Frederiksen et

al., 1997)

Décompression et d’injection

Ethanol Phosphatidylcholine et

phophastidyléthanolamine 130-200 60

Décompression : 0,01 – 0,3

(unilamellaire) Injection :

0,06- 2 (multilamellaire)

(Castor, 1994)

SCRPE Ethanol L-α-

dipalmitoyphosphatidylcholine 150-250 20-55

0,1 – 1,5 (unilamellaire)

(Otake et al.,

2001)

ISCRPE Aucun L-α-dipalmito/α-dipalmito/1-α-distéaroyl/1-α-dioléoyl-

phosphatidylcholine 200 60


(Otake et al.,

2006)

DESAM Ethanol ou

chloroforme Distéaroyl-

phosphatidylcholine 60 22 et 75


(Laurin et al.,

2004)

Tableau I-11 : Conditions opératoires des techniques supercritiques d’obtention de liposomes



- 45 -

� Méthode des liposomes « supercritiques »

La première technique de préparation de liposomes a été développée par Frederiksen

en 1994 (Frederiksen et al., 1997). Cette méthode en deux étapes consiste à préparer une

solution {CO2-éthanol 5-7 (% molaire)} et phospholipides dans une unité de dissolution (P =

250 bar et T = 50°C) au moyen d’une recirculation en boucle fermée, puis à introduire la

phase dans le capillaire de détente (Figure I-16). Le capillaire de détente est également

l’endroit où se forment les liposomes. Pour éviter d’introduire une trop grande quantité d’eau

et par conséquent trop diluer la quantité de phospholipides, un système de recirculation est

mis en place.

A partir de cette méthode, deux populations de liposomes sont obtenues : une très

grande majorité de SUV d’une taille comprise entre 0,02 µm et 0,05 µm et des MLV d’une

taille d’environ 0,25 µm.

Figure I-16: Schéma simplifié de la technique de préparation de liposomes développée par Frederiksen (Meure et al., 2008)

Unité de dissolution



- 46 -

� Méthode d’injection et de décompression

La technique d’injection consiste à mélanger les phospholipides et un fluide

supercritique qui est généralement du CO2 puis à injecter ce mélange à travers une buse dans

une solution aqueuse, maintenue dans des conditions ambiantes : les liposomes sont formés.

La méthode de décompression est une variante de la précédente dans la mesure où la

solution aqueuse est mise en contact avec le mélange (CO2 + PL) sous pression. C’est ce

mélange ternaire (Eau + CO2 + PL) qui est ensuite injecté par une buse dans une enceinte.

La dépressurisation, la taille de la buse, le fluide, le co-solvant éventuellement utilisés

et la pression sont des facteurs qui influent sur la taille finale des objets (Castor, 1994). En

optimisant le procédé, en formulant des liposomes d’une taille de l’ordre de 100-200 nm

peuvent être obtenus.

Une pression comprise en 130 et 200 bar et une température de 60°C sont nécessaires.

L’étape clé du procédé est clairement la solubilisation des lipides lors de la première étape qui

est de l’ordre d’au moins une heure. Les liposomes sont de type SUV.

� « Supercritical Phase Reverse Evaporation »

Ce procédé, contrairement aux deux autres, est de type Batch, c'est-à-dire qu’il est

impossible de récupérer le produit fini sans stopper le processus. Le principe est illustré

Figure I-17 dans les deux variantes. « SuperCritical Phase Reverse Evaporation » (SCPRE)

est une technique très simple à mettre en place. Il suffit de mélanger les phospholipides (0,3%

massique), l’éthanol (0-15% massique) dans une cellule puis d’introduire le CO2 jusqu’à une

pression de 200 bar (T = 60°C) : le mélange devient homogène. Après 30 min à l’équilibre,

une solution aqueuse est introduite toujours à pression constante. La quantité d’eau ajoutée

n’est pas précisée par les auteurs mais on peut imaginer qu’elle est en excès par rapport à

l’éthanol. Ensuite, la cellule est dépressurisée et on obtient une suspension homogène de

liposomes. Toutes les étapes sont réalisées sous agitation magnétique (Otake et al., 2001).

Le procédé a ensuite été simplifié en ce sens qu’il ne fait plus intervenir d’alcool

(nouvelle appellation : Improved SuperCritical Phase Reverse Evaporation) (Otake et al.,

2006) (Figure I-17). Les phospholipides et la solution aqueuse sont introduits dans le réacteur.

On chauffe le système puis on introduit le CO2 pour atteindre une pression de 200 bar.



- 47 -

L’agitation est maintenue pendant 40 min et est suivie d’une dépressurisation pour obtenir la

dispersion.

Pour le premier procédé, la solution aqueuse est progressivement introduite dans un

mélange homogène de phospholipides, d’éthanol et de CO2. Ceci entraine la formation d’une

émulsion eau/CO2. Quand suffisamment d’eau est introduite dans le milieu, l’émulsion

s’inverse et devient CO2/eau (Figure I-17 c). La dépressurisation conduit à la formation de la

dispersion souhaitée. Pour la technique ISCPRE, le mélange de PL et de solution aqueuse est

inhomogène (Figure I-17 e). L’ajout de CO2 permet d’obtenir l’émulsion CO2/eau, la

dépressurisation aboutit à la formation des liposomes.

La taille des vésicules est de l’ordre du micromètre et elles sont de type unilamellaire

(Otake et al., 2001).

Figure I-17 : Schéma du mécanisme SCPRE (a-d) et ISCPRE (e-g) (Otake et al., 2006)



- 48 -

� “Depressurisation of an Expanded Solution into an Aqueous Media”

(DESAM)

Cette technique consiste à dépressuriser un fluide contenant les phospholipides dissous

dans un solvant organique (chloroforme ou éthanol) dans une solution aqueuse. A la

différence des techniques précédentes, on ne cherche pas à faire un mélange CO2 + PL

monophasique. La solution solvant organique + phospholipides est simplement saturée en

CO2 et c’est la détente de cette solution CO2 saturée dans la phase aqueuse qui provoque la

formation de liposomes.

Les liposomes obtenus sont unilamellaires et ont une taille comprise entre 50 et 200

nm en utilisant de l’éthanol et un diamètre moyen de 400 nm avec du chloroforme.

Un schéma de l’installation est présenté Figure I-18. On discerne les deux parties

majeures du procédé à savoir la chambre d’expansion et celle de formation des liposomes.

Dans la première chambre, les phospholipides sont solubilisés dans un solvant organique

(avec une concentration de 5 à 20 mg.ml-1). Ensuite le CO2 est introduit à une pression de 60

bar et une température de 22°C pour ne pas risquer la précipitation des PL. Le mélange (CO2

+ PL+ solvant) biphasique est ensuite injecté dans la chambre de dépressurisation via une

buse qui trempe dans la solution aqueuse (Meure et al., 2009). La température de 75°C de la

chambre des liposomes favorise l’élimination du solvant.

L’inconvénient majeur de ce procédé est la présence résiduelle de traces de solvant

dans la dispersion de liposomes et l’utilisation de solvant organique de manière générale.



- 49 -

Figure I-18 : Schéma de l'installation DESAM (Meure et al., 2008)

� Recristallisation puis hydratation de poudre de phospholipides

Cette technique est radicalement différente des précédentes en ce sens qu’elle est

basée, comme dans une méthode traditionnelle, sur l’hydratation de poudre de PL préparée

par une voie dite « CO2 antisolvant » ou bien par évaporation d’une solution chloroformique

toujours à l’aide de dioxyde de carbone. Ensuite, de l’eau est ajoutée à la poudre de PL pour

former des liposomes.

Les liposomes obtenus peuvent être unilamellaires ou multilamellaires et de taille

variable, la phase d’hydratation étant déterminante (Badens et al., 2001).

T= 22°C

P= 60 bar

T= 75°C

P= P atmosphérique



- 50 -

En conclusion, les techniques supercritiques de formation de liposomes font

généralement intervenir quatre constituants qui sont le CO2, l’éthanol, les phospholipides et

l’eau. Ce système quaternaire est complexe et son comportement est actuellement peu connu.

Pour la réalisation de ce mélange, il y a deux possibilités, la première étant l’ajout d’eau sous

pression au système (CO2-éthanol-PL) ou lors de la dépressurisation de ce dernier. Cependant,

certaines interrogations se posent :

� Quel est l’impact du moment de l’ajout d’eau au système sur la formation

de liposomes ?

� A quelle étape y a-t-il formation des liposomes? Est-ce sous pression ou

lors de la dépressurisation ?

Ces questions restent ouvertes aujourd’hui et nécessitent une investigation sur le

système quaternaire pour tenter d’apporter des éléments de réponse.

De plus, les phospholipides forment spontanément des liposomes en excès d’eau, ce

qui nous amène à nous demander quel est le degré d’impact du CO2 sur les vésicules.

Les procédés supercritiques de formation de liposomes utilisent généralement de

l’éthanol. Ce solvant est donc présent dans les dispersions obtenues, cela peut constituer un

problème selon l’application visée.

Enfin, les techniques supercritiques de formation de liposomes permettent d’éviter ou

d’annuler l’utilisation de solvant(s) non GRAS ce qui constitue l’intérêt majeur de cette voie.

De plus, il est possible d’avoir un contrôle de la granulométrie. Cependant, les procédés

supercritiques nécessitent un apport énergétique supérieur aux techniques conventionnelles

notamment à cause des pressions requises et un investissement initial dans l’équipement

conséquent.

Chapitre 2 : Matériels et méthodes

- 51 -

IIChapitre 2 : Matériels et méthodes


- 52 -

II.1 Matière première

II.1.1 Nouvelle source : la coquille Saint Jacques

La coquille Saint-Jacques (nom scientifique Pecten maximus) est un mollusque

bivalve de la famille des Pectinidés. Parmi toutes les espèces de cette famille, celle qui est

utilisée dans cette étude reconnaissable à sa coquille pourvue de côtes en éventail, dont la

valve supérieure est totalement plate, et par sa grande taille comparée aux autres espèces du

genre Pecten et aux pétoncles ou vanneaux dont les deux valves sont bombées.

La coquille Saint-Jacques, est présente dans les eaux tempérées européennes depuis les

côtes de Norvège jusqu'au nord de l'Espagne. Sa pêche est strictement réglementée en France,

où elle n'est autorisée, que du 1er octobre au 15 mai par arrêté ministériel. En revanche, sa

pêche est autorisée toute l'année à Jersey, aussi bien à la plongée qu'au dragage. Les coquilles

mettent deux ans en Manche est et trois ans en Manche ouest et Atlantique pour atteindre leur

maturité. La taille marchande de la coquille Saint Jacques est de 11 cm pour la Manche et de

10,2 cm pour la Manche ouest et les autres gisements. C'est une taille communautaire qui

s'applique donc à tous les pêcheurs européens. La production française est de 17 000 tonnes

au total par an (FranceAgiMer, 2009).

La Figure II -1 présente l’anatomie de la coquille Saint Jacques. Le muscle et le corail

sont les parties généralement consommées le reste étant la plupart du temps jeté. La matière

première utilisée de cette étude est donc l’ensemble des parties « non comestibles » du

mollusque c'est-à-dire tout sauf le corail et le muscle.


- 53 -

Figure II -1 : Photographie de la coquille Saint Jacques

II.1.2 Approvisionnement et stockage de la matière première

La matière première a été récupérée entre octobre 2008 et avril 2009 chez un

poissonnier local. Elle provient de la côte Atlantique française. Une fois récupérée, elle est

datée et congelée à -18°C en attendant d’être prétraitée. Elle n’est pas triée, ni rincée.

II.1.3 Préparation de la matière première

La matière première est prétraitée pour réaliser les essais d’extraction. Elle est tout

d’abord séchée par zéodratation puis broyée puis conservée sous vide, à l’abri de la lumière.

La zéodratation est une opération de déshydratation à basse température qui consiste à

éliminer l’eau par sublimation. Cela permet une conservation à long terme de la matière

première grâce à un abaissement de l’activité de l’eau du produit. Un zéodratateur (Bucher

zeodratation) comprend trois éléments : une source chauffante, un piège de récupération d’eau

(contenant des zéolythes) et une pompe à vide (Figure II -2).


- 54 -

Figure II -2 : Principe de la zéodratation (Marin et René, 2008)

La séquence de séchage se déroule de la manière suivante : quatre barquettes

alimentaires contenant 250 g de matière première congelée sont introduites dans l’enceinte.

La pression est diminuée fortement et maintenue à une valeur 1 mBar pendant toute

l’opération. Ensuite, il y a apport de chaleur pour réaliser la sublimation de l’eau par

conduction. La durée de l’opération est de 2,5 jours et la température est de 25°C.

Le broyage est la matière première est réalisé dans un broyeur de type « robot coupe »

(R8, Robotcoupe). C’est une opération consistant à diviser un solide, pour augmenter sa

surface spécifique (surface développée de la poudre par unité de masse) et donc sa réactivité.

Le broyage est réalisé sous vide, à 4°C et pendant 2 min. La masse de matière première

zéodratée introduite est d’environ 50 g.

Une évaluation de la distribution granulométrique de la matière après broyage est

réalisée par tamisage d’environ 350 g de poudre (durée 45 min). La méthode consiste à

superposer des tamis de maille décroissante et l’on mesure le poids de matière retenue sur

chaque tamis. La Figure II-3 présente les résultats obtenus. On constate une distribution large

et hétérogène des particules avec une majorité de la population présentant un diamètre

compris entre 150 et 200 µm.


- 55 -

Figure II-3 : Distribution granulométrique de la matière première zéodratée et broyée

II.1.4 Caractérisation de la matière première

L’ensemble des techniques utilisées pour caractériser la matière première sont

détaillées dans la partie II.4.1.

La matière première avant prétraitement est caractérisée par une humidité de 80 ± 3%

(n = 3), un taux de cendres de 33,0 ± 0,6% (n = 5) et comporte 53,4% (n = 1) de composés

hydrosolubles. L’humidité de la matière première après prétraitement (zéodratation et

broyage) est de 4,9 ± 0,9% (n = 5).

La matière première possède un taux de lipides totaux de 8,6 ± 1,7 (n = 3) (g de

lipides/100 g de matière zéodratée) déterminé par la technique de Folch. La Figure II -4

présente les différentes espèces lipidiques séparées par chromatographie sur couche mince

(CCM) montrant la présence d’esters de cholestérol, TG, acides gras libres, cholestérol,

glycérides partiels et phospholipides.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

50<d<100 100<d<150 150<d<200 200<d<300 300<d<400 400<d<500 500<d<600 600<d<1000 1000<d

% m

ass

iqu

e

d (µm)


- 56 -

Figure II -4 : Photographie de la chromatographie sur couche mince de l’extrait lipidique de la matière première. Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di

éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v)

Le taux de phospholipides (déterminé par la méthode de Ames) est de 21,3 ± 6,4% (n

= 3) (g de lipides/100 g de lipides totaux). Cela équivaut à 18,13 ± 1,78 mg de phospholipides

par gramme de matière première.

Le Tableau II -1 présente les profils d’acides gras des lipides totaux et des

phospholipides déterminés par chromatographie en phase gazeuse sur deux échantillons

(mesures réalisées par l’ITERG).


- 57 -

Lipides totaux Phospholipides

Acides gras saturés 70,33 62,96

12 :0 0,07 - 14 :0 11,32 9,43 15 :0 1,52 1,14 16 :0 DMA 0,77 0,45 16 :0 iso 0,35 0,29 16 :0 37,72 36,94 17 :0 2,82 2,35 18 :0 DMA 2,49 1,42 18 :0 13,08 10,85 22 :0 0,18 0,09

Acides gras mono-insaturés 17,70 23,44

14 :1 0,22 0,21 16 :1 (n-9) 0,25 0,40 16 :1 (n-7) 5,76 8,53 17 :1 0,78 0,62 18 :1 DMA 0,20 0,28 18 :1 (n-11) 0,08 0,09 18 :1 (n-9) 2,72 3,78 18 :1 (n-7) 4,83 6,27 20 :1 (n-11) 0,50 0,48 20 :1(n-9) 1,06 1,20 20 :1 (n-7) 1,14 1,35 22 :1 (n-11) 0,06 0,13 22 :1 (n-9) 0,11 0,10

Acides gras poly-insaturés 11,97 13,60

16 :2(n-4) 1,37 0,97 16 :3 (n-4) 0,27 0,32 18 :2 (n-4) 0,19 0,30 20 :2 (n-7) (7, 13) 0,14 0,24 20 :2 (n-7) (7, 15) 0,07 0,05

Acides gras poly-insaturés (n-6) 2,38 2,46

18 :2 (n-6) 0,64 0,79 18 :3 (n-6) 0,08 0,07 20 :3 (n-6) 0,03 0,05 20 :4 (n-6) 1,29 - 22 :4 (n-6) 0,10 0,14 22 :5 (n-6) 0,24 0,11

Acides gras poly-insaturés (n-3) 7,54 9,27

18 :3 (n-3) 0,07 0,28 18 :4 (n-3) 0,38 0,56 20 :3 (n-3) 0,00 0,03 20 :5 (n-3) 2,07 3,11 22 :4 (n-3) 1,47 1,19 22 :5 (n-3) 10,10 0,13 22 :6 (n-3) 3,45 3,96

Tableau II -1 : Profil d’acides gras des lipides totaux et des PL de la matière première


- 58 -

Le spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première est présenté Figure II-5.

Outre le pic de la référence (-6,8 ppm), le spectre se caractérise par un pic majoritaire (-0,69

ppm), relativement large à sa base et par un second pic à 20 ppm. Le déplacement de ce

second pic permet d’affirmer qu’il ne s’agit pas d’espèces de nature phospholipidique. La

nature exacte de ces composés n’a pas été identifiée mais il pourrait s’agir de phosphonate.

Concernant le pic majoritaire, sa position par rapport à la référence indique qu’il s’agit en très

grande proportion de phosphatidylcholine. La largeur du pic peut traduire la présence d’autres

phospholipides tels que sphingomyéline, phosphotidisérine ou phosphatidyléthanolamine.

Figure II-5 : Spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première


- 59 -

II.2 Les produits utilisés

Le dioxyde de carbone de qualité technique (pureté de 99,5%) est fourni par la société

Air Liquide. L’éthanol de qualité technique (pureté de 96%) provient de Xylab. L’isopropanol

(pureté de 99,8%) est fourni par Scharlau. Le chloroforme (99%) et le méthanol (99%) utilisés

pour l’extraction des lipides totaux sont fournis par Aldrich Sigma. Le chloroforme (99,8%,

1% TMS v/v) et le méthanol (99,8% d4) deutéré utilisés pour les analyses RMN sont fournis

par Eurisotop.

Les liposomes sont préparés dans une solution tampon HEPES (10 mM de N-[2-

hydroxyéthyl] pipérazine-N’-[acide 2-éthane sulfonique] Sigma Aldrich ajusté à pH 7,4).

La lécithine (LC 60), d’origine marine, est fournie par la société Phosphotech. Le

Tableau II -2 présente sa composition en lipides totaux.

Lipides neutres

(%massique)

Phospholipides

(%massique)

LC 60 35 – 40 %

(3-4% de TG, 27 % de cholestérol) 60 – 65 %

(35-40% de PC, 15-20% PE)

Tableau II -2 : Composition en lipides de la lécithine LC 60


- 60 -

II.3 Dispositifs expérimentaux et protocoles

II.3.1 Extraction CO 2 pur et CO 2-co-solvant en dispositif petit volume (charge en matière traitée de 3 à 6 g)

II.3.1.1 Description du dispositif expérimental

Le dispositif « petit volume » est utilisé pour l’extraction des lipides neutres avec du

CO2 pur et celles des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant pour des charges en

matière traitée de 3 à 6 g.

La Figure II -6 présente le montage expérimental. Le CO2 liquifié par le bain

thermostaté à -0,4°C est pompé par une pompe volumétrique de type HPLC (Gilson, modèle

305 possédant une tête SC 5 de plage de débit entre 0 et 5 ml/min) qui est associée à un

module d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les variations de débit. Le

co-solvant est quant à lui acheminé par un système équivalent (Gilson, modèle 305 possédant

une tête SC 10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min). Un clapet anti-retour, une vanne

d’arrêt et une vanne de purge sont installés sur la ligne du co-solvant permettant de s’assurer

du bon acheminement du co-solvant. Cela permet également de couper ou de ne pas utiliser

cette pompe. Le CO2 avec ou sans co-solvant est ensuite réchauffé en entrée de l’étuve (WTC

binder, Tfonctionnement < 150°C) et arrive au pied de la colonne d’extraction (Top Industrie,

diamètre de 1 cm et longueur de 5 cm ou 10 cm selon la charge introduite) en acier

inoxydable qui est placée dans une étuve. La colonne est équipée en tête et en pied de deux

frités métalliques (Top Industrie, diamètre de 1 cm et porosité de 5 µm) surmontés d’un

disque filtrant de type filtre à café empêchant l’entrainement de particules solides dans le

circuit. En sortie, un débitmètre (Kobolt, modèle MS-4009, plage de fonctionnement de 0 à

3,75 g/min de CO2) monté sur la ligne de sortie du solvant indique le volume cumulé de

solvant gazeux utilisé lors de l’extraction. Connaissant le temps, on calcule le débit de CO2

gazeux (��(��)) et on en déduit le débit de CO2 massique (��

(!�""#$��)) par la formule :

��(!�""#$��) = ��

(��)

%!(��!&)��'(��

avec Vm(Tamb) : Volume molaire à température ambiante (22,4 L/mol)

et MCO2 : Masse molaire du dioxyde de carbone, 44 g/mol


- 61 -

Le débitmètre fonctionne seulement pour une extraction au CO2 pur. Une vanne de

laminage précédé par une vanne d’arrêt (V5) en sortie de l’enceinte permet de réguler le débit

et la pression au sein de la colonne. D’autres robinets permettent d’isoler le réacteur (V2 et

V3), l’admission de CO2 (V1) ou la stabilisation du flux dans le circuit (V4).

Figure II -6 : Montage expérimental « petit volume » pour l’extraction des lipides (masse traitée : 3 à 6 g)

Deux capteurs de pression à membrane Pcol et Pcir (Asco PR 711F), mesurent

respectivement la pression d’extraction et la pression du circuit (comprises entre 0 et 400 ±

0,1 bar). Un thermocouple de type K (Watlow, précision de 1°C) placé sur la ligne

d’alimentation de la colonne mesure la température d’extraction. La ligne de sortie est

chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour éviter la formation de carboglace (CO2 solide)

consécutive à la dépressurisation.

CO2

Bouteille de CO2

Colonne (P, T)contenant la matière 1ère

Flacon laveur ou éprouvette contenant

l’extrait phospholipidiques

V1

V2

V3

V4

T Pcir

Pcol

D

Co-solvant

V6

purge

V5


- 62 -

II.3.1.2 Protocole d’extraction au CO 2 pur

Les essais concernent la matière première zéodratée et broyée. Pour ces essais, le CO2

pur est utilisé pour l’extraction, la ligne de co-solvant est donc fermée. Le temps nécessaire

pour un essai avec 6 g de matière est d’environ 7 h et 3,5 h pour 3 g. L’extraction se déroule

de la manière suivante :

� Remplissage et introduction de la colonne contenant la matière première dans

l’enceinte thermostatée

� Mise en température du système

� Pressurisation du système et de la colonne en deux temps : de la pression

atmosphérique jusqu’à la pression de bouteille (de l’ordre de cinq secondes)

puis de la pression de bouteille à celle d’extraction souhaitée (utilisation de la

pompe CO2)

� Isolation de la colonne d’extraction pendant une dizaine de minutes à l’aide de

V2 et V3 le temps de stabiliser le flux de CO2

� Stabilisation du flux de CO2 dans le circuit et réglage du débit d’extraction

désiré à l’aide de la vanne de laminage V5

� Début de l’extraction, le CO2 passe à travers le lit pendant un temps donné

� Fin de l’extraction, la colonne est dépressurisée par sa tête

Il faut noter que ce système n’est pas adapté à la collecte quantitative de l’extrait,

notamment de par les faibles masses d’échantillons traitées. La quantification de l’extraction

est réalisée sur la matière récupérée dans le réacteur après traitement au CO2.


- 63 -

II.3.1.3 Protocole d’extraction au CO 2-co-solvant

Les essais sont réalisées sur la matière déshuilée c'est-à-dire celle ayant subi un

traitement préalable au CO2 pur. L’utilisation d’un co-solvant fait que les deux pompes sont

utilisées. Par contre, le débitmètre de sortie est seulement utilisé pour la stabilisation du flux

de CO2, ensuite il est déconnecté. Par la suite, on supposera que le débit de CO2 reste

inchangé lors du démarrage de la pompe co-solvant. En sortie de la vanne de laminage, on

récupère un extrait dans du co-solvant.

L’extraction se déroule de la manière suivante :

� Remplissage et introduction de la colonne contenant environ 6g de matière

première dans l’enceinte thermostatée

� Mise en température du système

� Mise en pression de la colonne avec du CO2 pur jusqu’à la pression souhaitée

� Isolement de la colonne

� Stabilisation du flux de CO2 et vérification du débit

� Démarrage de la pompe amenant le co-solvant et stabilisation du flux CO2 +

co-solvant

� Mise en circuit de la colonne et début de l’extraction

� Collecte des effluents sous forme de fractions d’éthanol contenant la masse

extraite : fractions notées Fi, i= 1 à 5.

� Arrêt de la pompe amenant le co-solvant et séchage du résidu et du circuit par

flux de CO2 à 2 g/min pendant 45 min

� Dépressurisation de la colonne

Sur l’ensemble des essais menés, le débit de CO2 est fixé à 1 g/min et le débit de co-

solvant est ajusté pour obtenir le pourcentage de co-solvant souhaité dans le flux. La collecte

est effectuée à volume de co-solvant constant, c'est-à-dire que les fractions colletées dans les

expériences à pourcentages de co-solvant différents sont récupérées sur des plages de temps


- 64 -

variables. Ce protocole est adopté afin d’avoir toujours un volume d’extrait suffisant pour les

analyses ultérieures.

Les analyses sont réalisées sur les fractions prélevées et non pas sur le résidu

d’extraction contrairement à l’étude de l’extraction au CO2 pur. Par contre, la partie lipidique

des derniers prélèvements n’est pas analysée au delà de la 3ème fraction car la quantité de

lipides est trop faible.

II.3.2 Extraction CO 2 grand volume : déshuilage de 60 g de matière première


Le dispositif décrit ci-après est utilisé pour l’extraction des lipides neutres avec du

CO2 pur sur une quantité de matière première zéodratée et broyée d’environ 60 g.

Le principe du montage expérimental est identique à celui qui permet de traiter 3 à 6 g

de matière première broyée (Figure II -6), le volume du réacteur et les caractéristiques des

pompes étant adaptés pour traiter plus de matière. Le dispositif est constitué d’une enceinte

haute pression cylindrique (Top Industrie) en acier inoxydable (Volume interne : 490 ml,

hauteur : 20,5 cm et diamètre interne : 4,5 cm). Les pressions et températures maximales de

service sont de 315 bar et 250°C, respectivement. Un capteur de pression (716-139 HD

9408T, mesure une pression entre 0 et 400 ±0,1 bar) et un thermocouple (Watlow, type K,

précision 1°C) mesurent les conditions au sein du réacteur. Un système de régulation de

température (Watlow) couplé à un ruban chauffant (Horst, longueur : 3 m et puissance : 400

W relié à un régulateur électrique) enroulé autour du réacteur, permet de travailler à une

température donnée.

La matière première est placée (et séparée par des disques de papier type « filtre à

café ») entre deux lits de billes de verre (d = 2 mm) en entrée et en sortie qui servent de

garnissage inerte tout en permettant de distribuer le flux sur toute la section de la colonne. En

effet, avec 60 g de matière, la colonne n’est pas complètement remplie.

Le réacteur est alimenté en CO2 préalablement liquéfié à -0,4°C par une pompe à

membrane (Lewa EK3, course des trois pistons et fréquences modulables, débit maximum de

33 ml/min pour chaque tête). Le fluide, préchauffé à la température de travail à l’aide d’un

bain thermostaté, est introduit par le haut du réacteur.


- 65 -

Une vanne d’arrêt et une vanne de laminage sont présentes en sortie du réacteur

permettant de réguler la pression et d’évacuer le CO2 par le bas du réacteur. Un système de

séparation de type cyclonique et un ruban chauffant sont installés en sortie dispositif

expérimental. Un compteur gaz est installé sur ligne de sortie permettant de contrôler le débit

d’extraction.

II.3.2.2 Protocole d’extraction au CO 2 pur

Le protocole est identique à celui décrit II.3.1.2. Les essais réalisés avec le dispositif

permettant de traiter environ 6 g de matière étaient faits avec un débit de CO2 de 1 g/min.

Pour la transposition à 60 g, nous avons choisi de conserver la vitesse de CO2 au sein de la

colonne et le taux de solvant (la masse de CO2 par gramme de matière première). Quel que

soit le montage expérimental, nous avons :

�)!*/!#, =%)!/!#,'-)!²

avec F : débit volumique de CO2 dans la colonne

V : vitesse du CO2 à l’intérieur de la colonne

S : section de la colonne

Pour un débit massique (F) exprimé en g/min, il vient :

��/!#, = �)!*/!#,'��/)!* =%)!/!#,'-)!²'��/)!*

ρ étant la masse volumique.

Pour des conditions de température et de pression identiques, le rapport des débits

massiques varie comme le rapport des vitesses multipliées par le carré des rapports des

sections, soit :

�./� = �.�' %./�%.�

'(-./-.

)²


- 66 -

Pour un débit massique pour 6 g de matière de 1 g/min et pour conserver une même

vitesse dans les deux cas :

�./� = 1'1' 04,51 23= 204/567

Ainsi, des lots de 60 g de matière sont traités à 300 ± 10 bar, 45 ± 1°C et 20 g/min de

CO2. Pour conserver un taux de solvant de 60 g de CO2 par gramme de matière (quantité

déterminée lors de l’étude de l’étape de déshuilage), on doit passer 60 x 60 = 3600 g de CO2.

Avec un débit de 20 g/min, cela correspond à une durée de traitement de 3 heures.

II.3.3 Extraction CO 2-co-solvant en dispositif « grand volume » : traitement de 15 à 60 g de matière déshuilée


Le dispositif décrit ci-après est utilisé pour l’extraction des phospholipides avec un

mélange CO2-co-solvant. Les quantités traitées vont de 15 à 60 g. Deux types de réacteur sont

utilisés.

L’installation (Figure II-7) est constituée de deux pompes volumétriques de type

HPLC (Gilson, modèle 305 possédant une tête SC10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min)

associées à un module d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les

variations de débit. Cela permet la circulation du CO2 [A] (préalablement refroidi à l’aide

d’un cryostat [B]) et du co-solvant [C]. Une vanne d’arrêt, un clapet anti-retour et un système

de purge assurent le bon acheminement du co-solvant dans le circuit. Avant l’entrée dans le

réacteur, un réchauffeur (Top Industrie, Puissance de 400 W) met le fluide à la température de

travail [D]. En sortie, une vanne d’arrêt et une vanne de laminage permettent de réguler le

débit de sortie ainsi que la pression au sein du réacteur. L’extrait est évacué par un capillaire

d’une longueur de 35 cm et d’un diamètre interne de 1 mm. Il est récupéré dans une

éprouvette graduée en verre (100 : 1 ml, +/- 0,5 ml) [E].

Un système de vannes permet d’isoler le réacteur et de stabiliser le flux de solvants

dans le circuit. Un compteur gaz (non représenté) est placé en sortie lors de la pressurisation

au CO2 du réacteur pour vérifier le débit imposé. Il est ensuite déconnecté avant le démarrage

de la pompe co-solvant. La ligne de sortie est chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour

éviter la formation de carboglace (CO2 solide) consécutive à la dépressurisation. Par la suite,


- 67 -

on suppose que le débit ne change pas lors de l’essai.

Deux capteurs de pression à membrane Préac et Psort (TC direct, 716-139 HD 9408T),

mesurent respectivement la pression d’extraction et la pression en sortie (comprise entre 0 et

400 ± 0,1 bar). Un ensemble de thermocouples de type K (watlow, précision de 1°C)

mesurent les températures du circuit, du réacteur et de sortie (Tcirc, Tréac et Tsort). Les pressions

et températures sont enregistrées sous Labview.

Figure II-7 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g)

II.3.3.2 Montage avec le réacteur tubulaire (V = 50 0 ml)

Le réacteur tubulaire ainsi que le système de régulation thermique sont les mêmes que

ceux décrits II.3.2.1. Le protocole opératoire est similaire à celui décrit II.3.1.3. Les fractions

sont récupérées toutes les 20 minutes, le séchage du résidu au CO2 pur est fait sur une durée

d’environ 1 h avec un débit de 10 g/min.

Dans cette partie, nous avons effectué un scale-up d’une colonne de 10 ml (1 cm de

Co-solvant

Bouteille de CO2

[A]

[C]

[B] [D]

[E]

Extrait alcooliquecontenant l’extrait

Tcirc

Réacteur

purge

Psort

Préac

Tréac

Tsort

Co-solvantcontenant l’extrait


- 68 -

diamètre) à une colonne de 500 ml (4,5 cm de diamètre). Pour ne pas modifier l’extraction, il

aurait fallu travailler à vitesse de flux constant. Cependant cela n’a pas été techniquement

possible (limitation due aux pompes du dispositif). En effet, il faudrait un facteur 20 entre le

débit du dispositif « petit volume » et celui du dispositif« grand volume » :

� = 8'-

89 = :;<�=;� et 8� = :>

<�=>�

898� =

�9 ��?@93 @�3?

F : débit volumique de solvant

v : vitesse du flux de solvant dans la colonne

S : section de la colonne

r : rayon de la colonne

A vitesse de flux de solvant identique on obtient :

@93@�3 = �9

��

120,25 = �9

��

Ce qui donne, �� ≈ 20'�9

Nous avons travaillé à un débit inférieur, ce qui devrait améliorer l’extraction puisque

les temps de contact soluté-solvant seront plus grands.

Tout comme pour l’extraction utilisant le dispositif « grand volume », la matière

première est placée entre deux lits de billes de verre (d = 2 mm) en entrée et en sortie qui

servent de garnissage inerte en permettant de distribuer le flux sur toute la section de la

colonne. Pour 15, 30 et 60 g, la hauteur du lit de matière première est respectivement


- 69 -

d’environ 4 cm, 7 cm et 10 cm.

II.3.3.3 Montage avec le réacteur agité (V = 250 ml )

Le réacteur agité est en inox et est de forme cylindrique. Il a été construit par la société

Top Industrie. Le volume intérieur (V = 250 ml) accueille un panier (taille des pores de 1

mm) retenant les solides en suspension (fine poudre par exemple) dans le réacteur. Un

système d’agitation avec une turbine de type Rushton permet une agitation du milieu dans un

domaine de 0 à 1500 tours/min. Des orifices sur l’agitateur assurent l’injection du solvant

dans le réacteur. La Figure II -8 présente l’ensemble des dimensions du réacteur.

� Ha = 7,7 cm

� Hp = 8,1 cm

� Hr = 10,7 cm

� Da = 2,5 cm (8 pâles et hauteur de

pale =1 cm)

� Dp = 3,5 cm en intérieur et 4,2 cm

en extérieur

� Dr = 6 cm

Figure II -8 : Caractéristiques géométriques du réacteur

Un collier chauffant d’une puissance de 800 W régulé par un système « Proportionnel

Intégrale Dérivé » dit PID (Tmax = 100°C) permet de contrôler la température de l’enceinte.

Le protocole utilisé est décrit lors de l’étude de l’extraction avec ce réacteur (III.3.2.2).


- 70 -

II.3.4 Mise en forme de liposomes en milieu CO 2-éthanol-eau

II.3.4.1 Extraction et mise en forme en ligne

Le dispositif Figure II-9 est utilisé pour l’extraction des phospholipides avec un

mélange CO2-co-solvant couplée à une mise en forme des liposomes par ajout d’eau dans le

flux de sortie. Les quantités de matières traitées sont de 30 g. Il s’agit d’un montage très

proche de celui décrit II.3.3.1, un système d’ajout d’eau dans le flux est intégré en fin de

process. Le réacteur tubulaire ou le réacteur agité peuvent être utilisés.

Figure II-9 : Montage expérimental du procédé de couplage d’extraction des phospholipides et de mise en forme des liposomes

La partie relative à l’extraction reste inchangée, on se focalise donc sur la ligne d’ajout

d’eau permettant la mise en forme de liposomes. La phase aqueuse, contenue dans une

éprouvette graduée (pour mesurer le débit réel), est acheminée sous pression par une pompe

volumétrique (LDC Analytical, débit compris entre 0 et 10 ml/min). Cette ligne, réalisée avec

des tubes en inox de 1/8’’ (diamètre interne de 1,3 mm), est munie d’une vanne d’arrêt et d’un

clapet anti-retour. En sortie de la vanne de laminage, on trouve un capillaire de 35 cm de long

et d’un diamètre de 1 mm. La récupération de la dispersion se fait soit à l’aide d’un flacon en

verre de 1 litre agité par une pale, contenant environ 100 ml d’eau tamponnée à l’instant

initial, le capillaire plonge de manière continue dans la phase aqueuse tout au long de l’essai

Co-solvant

Bouteille de CO2

[A]

[C]

[B] [D][E]

Tcirc

Réacteur

purge

Psort

Préac

Tréac

Tsort

Eau (Tampon Hepes)

purge


- 71 -

ou encore dans un système d’évaporation d’éthanol (ampoule à décanter tri-col enroulée par

un ruban chauffant).

II.3.4.2 Modification de la taille des liposomes à base de lécithine commerciale (LC 60)

II.3.4.2.1 Préparation des liposomes

Les suspensions de liposomes sont préparées à partir de la lécithine LC 60. Cinq g de

lécithine sont dissous dans 35 ml d’hexane puis 150 ml d’acétone à 4°C sont ajoutés sous

agitation pour faire précipiter les phospholipides. Le mélange est ensuite placé 15 minutes

dans un bain glacé et centrifugé pendant 5 min à 1500 g. Le surnageant est éliminé, le solvant

résiduel étant évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif.

La technique de préparation des liposomes utilisée est basée sur l’hydratation d’un

film lipidique. Un film de lipides est préparé en dissolvant les lipides dans du chloroforme

dans un ballon de 250 ml. Celui-ci est ensuite évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif puis

zéodraté une nuit afin d’éliminer toute trace de solvant résiduel. Le film lipidique obtenu est

ensuite hydraté avec une solution tampon HEPES sous agitation jusqu’au décollement du film

(environ 2 heures). La concentration de lipides finale est de 5 g/l.

II.3.4.2.2 Descriptif du montage expérimental

Un schéma du montage expérimental utilisé pour réduire la taille des liposomes est

présenté Figure II -10. Le CO2, préalablement liquéfié par un bain thermostaté à -0,4°C, est

acheminé par une pompe volumétrique de type HPLC (Gilson, modèle 305 possédant une tête

SC 10 de plage de débit entre 0 et 10 ml/min) associée à un module manométrique

d’amortissement (Gilson modèle 806) permettant de limiter les variations de débit. Le CO2 est

ensuite mis à la température souhaitée avec un réchauffeur (Top Industrie, Puissance de 400

W). La dispersion de liposomes est, quant à elle, introduite à l’aide d’une pompe

volumétrique (LDC Analytical, débit compris entre 0 et 10 ml/min). Pour vérifier le débit

réel, la dispersion de liposomes est pompée dans une éprouvette graduée de 100 ml (100 : 1

ml, +/- 0,5 ml). Cette ligne, réalisée avec des tubes en inox de 1/8’’ (diamètre interne de 1,3

mm), est munie d’une vanne d’arrêt et d’un clapet anti-retour. En sortie, un capillaire de 38

cm et de diamètre interne variable est installé.


- 72 -

Figure II -10 : Montage expérimental de modification de la taille de liposomes avec du CO2

A cause des phénomènes thermiques liés à l’utilisation de CO2 et d’eau (formation de

carboglace qui génère des problèmes de colmatage), les dispersions sont diluées avec de

l’éthanol technique : 10 ml d’alcool sont ajoutés à 90 ml de dispersion.

La ligne de sortie est chauffée à l’aide d’un ruban chauffant pour éviter la formation

de carboglace (CO2 solide) consécutive à la dépressurisation. Le protocole et le système de

récupération utilisé sont détaillés dans le chapitre relatif à cette étude.

Bouteille de CO2

Liposomes(10 % volumiqueéthanol)

Psort

TCO2

Liposomes obtenus

purge

Tsort


- 73 -

II.3.5 Caractérisation réacteur agité et étude du m élange CO 2-éthanol-eau

II.3.5.1 Distribution des temps de séjour dans le r éacteur agité

Le réacteur agité (II.3.3.3) est inséré dans le montage présenté Figure II-11. Une

pompe volumétrique de type HPLC (Gilson modèle 305, débit de fonctionnement entre 0 et

25 ml/min) [A] assure la circulation de l’eau. Une vanne 6 voies [B] permet l’introduction de

la solution. Elle assure une injection très rapide sans perturber le flux d’entrée. En sortie, une

cellule de conductivité [C] associée à un système d’acquisition qui permet de relever des

valeurs au cours du temps (∆t=8s). Le volume entre l’injecteur de la solution saline et l’entrée

du réacteur ainsi que celui entre la cellule de conductivité et la sortie du réacteur est

négligeable (de l’ordre de 1 à 2 ml) devant le volume intérieur du réacteur.

Figure II-11 : Montage expérimentale pour l’étude des DTS

Pour réaliser cette étude, le système étudié est mis en fonctionnement (remplissage du

réacteur par de l’eau distillée, circulation de fluide en continue). On introduit à l’entrée du

réacteur une solution saline (NaCl, 1 mM) à l’instant t = 0. On suit la conductivité en sortie du

réacteur en fonction du temps. Elle est proportionnelle à la concentration de notre traceur ce

qui nous permet de suivre le temps passé par les molécules entre l’entrée et la sortie ce qui

aboutie à la Distribution des Temps de Séjour (DTS).


- 74 -

II.3.5.2 Etude du mélange CO 2-éthanol-eau-lécithine

Le dispositif expérimental Figure II-12 est constitué d’une cellule d’observation (en

saphir, de diamètre intérieur : 1cm et longueur : 5 cm) [A] à volume variable de façon à

pouvoir visualiser les changements macroscopiques au sein du mélange. Elle est placée dans

un bain thermostaté [B] dont la température est régulée à 27°C ou 45°C. Un agitateur entraine

un barreau aimanté placé dans la cellule. L’introduction du CO2 est réalisée à l’aide d’une

pompe à cabestan [C] maintenue à une température et pression constantes ce qui permet une

maitrise de la quantité introduite. Le déplacement du piston de la cellule est réalisé par

l’introduction d’eau sous le piston via une pompe volumétrique de type HPLC (LDC

analytical, CP 3000) [D] qui permet son déplacement vertical. Lors de l’ajout de CO2 dans la

cellule, la pression est maintenue constante par évacuation de l’eau située sous le piston.

Figure II-12 : Montage expérimental pour l’étude du système quaternaire CO2-Eau-éthanol-phospholipides


- 75 -

� Préparations des mélanges initiaux introduits dans la cellule d'observation

Cinq mélanges comportant des proportions massiques croissantes d’éthanol sont

utilisés (Tableau II-3. La concentration en lécithine LC 60 est de 5 mg/ml pour tous les

mélanges.

Mélange % massique d’éthanol Aspect initial

Mél. 5 0,0% Turbide Mél. 4 15,7% Turbide Mél. 3 42,1% Turbide Mél. 2 83,3% Limpide Mél. 1 95,0% Limpide

Tableau II-3 : % initiaux d’éthanol des mélanges étudiés

Pour préparer les mélanges, 100 mg de lécithine sont pesés puis l’éthanol est ajouté.

Ensuite, le mélange est homogénéisé pendant 20 minutes. Enfin, 1 ml par minute de solution

tampon Hepes est ajouté.

� Protocole des essais

1 g du mélange éthanol/eau/lécithine est introduit dans la cellule, à température

ambiante. Ensuite, le bain thermostaté est mis en température (27 ou 45°C). On introduit 0,3

cm3 de CO2 (P = 150 bar) puis le mélange est agité pendant 5 min et une observation visuelle

est réalisée. Cette opération est reproduite 5 fois. Après le dernier ajout de CO2, l’agitation est

maintenue pendant 30 min avant l’observation visuelle. La cellule est ensuite dépressurisée

par déplacement du piston, une diminution de la température et l’évacuation du CO2 gazeux.


- 76 -

II.3.5.3 Etude cinétique du mélange CO 2-éthanol-eau

La configuration du mélangeur eau et CO2-éthanol est un Té correspondant au

montage mis en place dans le dispositif de mise ne forme de liposomes. Le capillaire

d’observation est en silice (diamètre interne : 250 ± 6 µm.). Le capillaire est plongé dans un

bain thermostaté et un système de vidéo d’acquisition ultrarapide permet d’observer le

comportement du mélange à 6 cm et à 30 cm après le Té. Le principe du montage de

l’ICMCB est présenté Figure II-13, des modifications pour les besoins de cette étude ont été

réalisé (modification du système de pompage).

Figure II-13 : Schéma du montage du montage microfluidique de l'ICMCB (Marre et al., 2009), pour l’étude un pré-mélange CO2-éthanol remplace la partie CO2 et l’eau est

acheminée par la pompe HPLC


- 77 -

II.4 Méthodes de caractérisation

II.4.1 Analyse de la matière première solide et rés idu d’extraction

Cette partie traite de la caractérisation de la matière solide qui peut être, soit la matière

première zéodratée et broyée, soit un résidu d’extraction.

� Teneur en eau

La détermination de l’humidité d’un échantillon est réalisée à l’aide d’une

thermobalance (Ohaus, MB45). Il s’agit d’une combinaison d’une balance et d’un four

(utilisant un chauffage à infrarouges). Une double pesée séparée d’une phase de chauffe à

105°C permet de mesurer, par différentiel, le poids de la quantité de matière évaporée après

stabilisation et donc le taux d’humidité.

� Taux de matière grasse

Les lipides totaux sont extraits selon la méthode de Folch (Folch et al., 1957) par un

mélange chloroforme/méthanol (2/1 ; v/v) à raison de 20 volumes par volume de matériel.

Afin de prévenir de l’oxydation des lipides, on additionne au mélange de solvant 1%

(masse/volume) de butyl hydroxy toluène (BHT). L’extraction est réalisée sous agitation

magnétique pendant une heure au terme de laquelle 0,2 volume d’une solution aqueuse de

KCl à 0,8% sont ajoutés par volume de mélange d’extraction. On provoque ainsi une

séparation de la phase hydroalcoolique et de la phase chloroformique. Cette dernière est lavée

3 fois par 0,2 volume du mélange chloroforme/méthanol/KCl 0,8% (3/48/47 ; v/v/v). La phase

chloroformique finale est filtrée puis le solvant est évaporé sous vide à l’aide d’un

évaporateur rotatif. L’extrait brut est ensuite repris par de petits volumes de chloroforme pur.

L’extrait chloroformique est filtré et évaporé à sec sous courant d’azote. L’extrait sec dit

« extrait de Folch » est conservé dans un mélange chloroforme/ méthanol (2/1 ; v/v) à 4°C. Le

taux de phospholipides est donné par :

�BC'DE5BF6è@E4@BHHE = 5BHHEI6J6DEHE'F@B6FE5BHHEéLℎB7F6IIN7676F6BIE x100


- 78 -

� Séparation des classes de lipides

Les lipides totaux (l’extrait de Folch) sont déposés sur une plaque en verre recouverte

de silicagel (60H Merck, France) activée à 110°C pendant une heure et conservée à 80°C

jusqu’à utilisation. La séparation des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM)

est réalisée avec un mélange d’éther/acétone dans les proportions 60/20 en volume. Tous les

composés, à l’exception des phospholipides, migrent sur la phase stationnaire. Les différentes

classes de lipides sont révélées à la vapeur d’iode. La zone correspondant aux lipides

recherchés (les phospholipides ici) est délimitée et transférée dans un tube pour être analysée.

� Teneur en phospholipides

Les phospholipides séparés par CCM sont quantifiés par le dosage du phosphore

(Ames, 1966). Il s’agit d’un dosage colorimétrique dans lequel le phosphore organique est

minéralisé à une température élevée en présence de nitrate de magnésium et d’eau bidistillée.

Les pyrophosphates éventuellement formés sont hydrolysés par l’acide chlorhydrique. Le

phosphore minéral est alors converti en acide phosphomolybdique par l’addition du

molybdate d’ammonium. L’acide réagit avec l’acide ascorbique pour donner un complexe

bleu qui est détecté par spectrométrie à 820 nm (Hitachi U-2810).

Les principales étapes de ce dosage sont résumées dans la séquence de réactions

suivante :

Une courbe de référence (obtenue dans les mêmes conditions expérimentales à partir

d’une gamme de phosphate de potassium) permet de calculer le nombre de nano-atomes de

phosphore présents dans l’échantillon. Le nombre de moles de phospholipides est obtenu en

supposant un atome de phosphore par molécule de phospholipide et en considérant une masse

molaire moyenne de 775 g.mol-1 pour les phospholipides.

Minéralisation

15 min., 100°C

20 min., 45°C

Phosphore minéral + pyrophosphate

Phosphore minéral

Complexe acide phosphomolybdique-acide ascorbique

Phosphore organique + eau bidistillée

Pyrophosphate + HCl (0,5 N)

Phosphore minéral + molybdate d’ammonium

(3,4 mM dans un mélange acide sulfurique 1 N)


- 79 -

Le taux de phospholipides par rapport aux lipides totaux est donné par :

�BC'PQ = RSHé)T�,U#VVW, − RSH=éX(5BHHECF6I6HéE)'YE7FE)W�=&�=éX

'775'10Z[

avec Absréf : ordonné à l’origine de la droite de référence

et Pentecourbe réf : coefficient directeur de la droite

� Taux de cendres (Geneau-Sbartai et al., 2008)

Le taux de cendres est basé sur l'élimination des matières organiques d'un échantillon

de matériau par calcination à température définie durant un temps donné. La calcination est

réalisée sur trois échantillons de 1 g de matière dans une étuve à 550°C sur une durée de 5 h.

Le taux de cendres est donné par :

�BC'DELE7D@EH = 5BHHE@éH6DCBJ@èHLBIL67BF6N75BHHEéLℎB7F6IIN7676F6BIE '100

� Taux de composés hydrosolubles (Geneau-Sbartai et al., 2008)

Une extraction de 2 g de matière à l’eau bouillante pendant une heure est réalisée. La

pesée de la matière première et du résidu obtenu par filtration sous vide puis séché permet de

connaître le taux de composés solubles dans l’eau par différence. Le taux de composés

hydrosolubles est donnée par :

�BC'DELN5JNHéHℎ\D@NHNICSIEH = 5BHHE676F6BIE − 5BHHE@éH6DC5BHHE676F6BIE '100

II.4.2 Analyse des extraits

Cette partie décrit les caractérisations réalisées sur les extraits alcooliques (les

différentes fractions récoltées).

� Masse totale extraite : gravimétrie

Deux ml d’extrait alcoolique sont prélevés puis évaporés dans un tube préalablement

taré sous un flux d’azote. Une fois le solvant évaporé, le récipient est pesé pour déterminer la

masse extraite.


- 80 -

� Quantité de lipides extraits : Extraction de Folch (Folch et al., 1957) (cf. II.2)

On utilise 20 ml d’extrait pour réaliser cette caractérisation. Les volumes de

chloroforme et méthanol utilisés sont respectivement de 20 et 10 ml. Les règles de calcul des

volumes de solutions de KCL et de phase de Folch s’appliquent ensuite.

� Identification et quantification des phospholipides extraits par RMN

(collaboration équipe Dufourc E. (CBMN) : Grélard A. et Courreges C.)

Pour l’identification et la quantification des phospholipides des extraits obtenus par

voie supercritique, des spectres RMN du phosphore sont réalisés. Cette technique est basée

sur le spin nucléaire non nul de certains noyaux (1H, 13C ou 31P). Une expérience de RMN 1D

se décompose classiquement en 3 étapes :

1. L’équilibre : Lorsqu’on applique à ces noyaux un champ magnétique B0, leurs

spins précessent à une certaine fréquence dite de Lamor :

]/ =^_/2`

γ étant le rapport gyromagnétique, caractéristique de chaque noyau.

L’aimantation résultante le long de l’axe z (colinéaire à B0) est notée M0.

2. La perturbation : On applique un second champ B1 qui est perpendiculaire à

B0 et oscille à une fréquence ν0. Le champ B1 perturbe la distribution des spins

due à B0 pendant une durée de τ =θ/γB1 de sorte que M0 bascule le long de

l’axe y’.


- 81 -

3. La relaxation : On arrête B1, le système retourne à l’équilibre initial. Il se

décompose en deux parties, une relaxation longitudinale selon l’axe z

(caractérisé par un temps T1z) et une transversale (caractérisé par un temps T2)

selon le plan xy. L’évolution de la première relaxation par rapport à l’axe des z

est de type exponentielle, la seconde est sinusoïdale amortie par rapport à l’axe

des y.

Le passage du domaine temporel au fréquentiel est assuré par un outil mathématique,

la transformée de Fourier. Cela conduit à l’obtention d’un spectre composé de raies dont la

position en fréquence est lié à l’environnement électronique du noyau et dont la largeur

dépend de la dynamique des molécules.

L’identification des phospholipides est déterminée par le déplacement chimique

spécifique de leur noyau phosphore. La quantification est réalisée par intégration des pics

(d’intensité proportionnelle à la quantité de phosphore) de l’ensemble des phospholipides par

rapport à celui d’une référence interne.

L'ensemble des spectres RMN du phosphore est réalisé sur un spectromètre RMN

Bruker 400 MHz (DPX) équipé d'une sonde 5 mm QNP 1H-13C/31P/19F. Les expériences sont

θ

Relaxation longitudinale

Relaxation transversale: FID


- 82 -

faites avec une régulation en température à 25°C ± 0.5°C, dans des tubes de 5 mm, contenant

un volume fixe de 400 µl d'échantillon et en présence d'un capillaire interne contenant 0,24

mg d’une référence interne, le pyrophosphate (Sigma Aldrich, pureté de 99%), dans 60 µL

d’eau deutérée. La séquence impulsion utilisée est l'impulsion simple (90°-acq) avec

découplage des protons pendant l'acquisition, à la fréquence de résonance de 161.9 MHz pour

le 31P, une fenêtre spectrale de 50 kHz, un nombre de scans variant de 64 à 1000 selon les

échantillons, un nombre de point de 32K, un temps de recyclage de 5 s et une impulsion 90°

de 14 µs pour le phosphore. Le traitement des données est réalisé à l'aide du logiciel Topspin

2.1, un filtrage numérique (LB = 10 Hz) est appliqué avant transformée de Fourier.

Pour l’analyse, une quantité connue d’extrait obtenu par voie supercritique

préalablement séché sous flux d’azote puis zéodraté (pendant 12 h) est dissoute dans 400 µl

d’un mélange (2/1 : volume) de chloroforme et de méthanol (solvants deutérés) dans un tube

RMN. On détermine la quantité de phospholipides par la relation suivante :

5PQDEIaE'F@B6FHCJE@L@6F6bCE= (7SBFN5EDEY)'c5NI=éXd'(((5N\E77EDEHYe)'R6@EPQ

5BHHEFNFBIEDEIaE'F@B6F5BHHEDB7HFCSEf(g

5PQDEIaE'F@B6FHCJE@L@6F6bCE= 2'5,38'10Zh'775000'R6@EPQ

5BHHEFNFBIEDEIaE'F@B6F5BHHEDB7HFCSEf(g

Pour déterminer le déplacement chimique phosphore associé aux différents

phospholipides, des standards seuls et en mélange (binaire) sont analysés par RMN du

phosphore. Les spectres sont fournis en annexe 1. Analysés de manière isolée et en mélange,

les déplacements chimiques sont identifiables et attribuables à chaque type de phospholipides

(Tableau II -4). Dans les extraits obtenus par voie supercritique (mélanges complexes),

compte tenu de la largeur de pics liée à la distribution des longueurs de chaînes et à la

présence d’autres espèces chimiques dans le mélange, il n’est pas possible de quantifier de

manière exacte chaque type de phospholipides. Par conséquent, les classes de phospholipides

obtenues sont indiquées de manière qualitative.


- 83 -

Déplacement chimique

des phospholipides seuls

(ppm)

Déplacement chimique des

phospholipides en mélange

(ppm)

PC -0,54 PC + PE PC : -0,51 et PE : 0,56 PE 0,52 PA + PE PA : 2,41 et PE : 0,75 PA 2,86 PC + PE + PA PC : -0,52, PE : 0,69 et PA : 2,04

Tableau II -4 : Déplacement chimique des phospholipides seuls et en mélange déterminés par RMN 31P

L’ensemble de ces caractérisations permettre de calculer les proportions de chaque

espèces

Les différents résultats d’analyse obtenus nous permettent de déterminer les quantités

de chaque espèce (Lipides non phosphorés, espèce non lipidique) par les relations suivantes :

(BHHEV#9#i�",W,9TW"9TW=é" =5BHHEV#9#i�"UWU�� −5BHHEPQ

(BHHE,W,V#9#i#$�� =5BHHEUWU�V��U=�#U� −5BHHEV#9#i�"UWU��

II.4.3 Analyse des dispersions de liposomes

Cette partie décrit les caractérisations relatives aux suspensions de liposomes.

� Détermination de la distribution de taille par granulométrie laser

Une lumière laser qui éclaire une particule n'est pas seulement diffractée, mais aussi

réfléchie et diffusée. La quantité de lumière déviée et l'importance de l'angle de déviation

permettent de mesurer la taille des particules. Selon les échantillons analysés, le milieu de

dispersion est soit une solution tampon HEPES seul ou un mélange solution tampon HEPES-

éthanol. Les mesures sont réalisées trois fois sur un granulomètre Mastersizer 2000 SM

(Malvern). Les diamètres caractéristiques des liposomes ainsi que la distribution des

particules sont obtenus.

� Observation par microscopie optique

L'appareil utilisé est un Olympus® BX-51 (Zeiss, Germany) à contraste de phase,

équipé d’un objectif à immersion d’huile x60 et x100. Il est relié à une caméra numérique

permettant la capture d'image. Les images sont ensuite traitées par le logiciel Analysis, qui

permet d’estimer la taille et le type des objets.

Chapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique

- 84 -

IIIChapitre 3 : Extraction des lipides par voie supercritique


- 85 -

Ce chapitre porte sur le développement du procédé d’extraction de phospholipides.

Dans un premier temps, nous présenterons l’extraction des lipides au CO2 pur qui,

comme indiqué dans la partie bibliographique, permet d’augmenter la sélectivité vis-à-vis des

PL. Dans un second temps, les résultats concernant l’extraction des PL avec un mélange CO2-

éthanol sont discutés. Les essais sont réalisés avec une quantité de matière faible (de l’ordre

de 2 à 6 g).

La seconde partie de ce chapitre traite du changement d’échelle pour l’extraction des

PL. L’objectif est de traiter davantage de matière pour obtenir une masse de phospholipides

suffisante pour réaliser des essais de mise en forme de liposomes. Pour cela nous avons

travaillé avec deux types de réacteur (tubulaire et agité) aux fonctionnements différents, avec

des conditions opératoires spécifiques.

III.1 Extraction des lipides à l’aide de CO2 supercritique

L’analyse bibliographique a permis de cerner les conditions opératoires susceptibles

de conduire à l’extraction des lipides neutres :

180 bar < P < 621 bar

35°C < T < 80°C

pour 1 g de matière première 36 g de CO2 < masse de solvant < 300 g de CO2

Ces conditions opératoires servent de base pour l’étude de l’extraction des lipides mais

sont appliquées avec les limitations techniques du matériel à disposition.

III.1.1 Résultats

Le Tableau III-1 présente les conditions opératoires utilisées et les résultats obtenus.

Les masses de solvant utilisées et de lipides totaux extraits sont normalisées, c'est-à-dire

ramenées à la masse d’échantillon initialement introduite pour s’affranchir des variations de

quantité initiale utilisée (et par conséquent des volumes différents de colonne d’extraction).

Les essais sont réalisés sur 6 g (volume de colonne 10 ml, extractions suivies par « * ») et sur

2-3 g (volume de colonne 5 ml).


- 86 -

L’extraction est faite dans un réacteur cylindrique contenant la matière première

préalablement zéodratée et broyée. L’enceinte est mise sous pression puis un flux continu de

CO2 traverse le lit de matière première pendant toute la durée de l’expérience.

Les taux de lipides initialement présents dans la matière première (exprimés en masse

de lipides / masse de matière première) et sur le résidu solide d’extraction (exprimés en masse

de lipides / masse de résidu) sont déterminés. Ces données permettent de déduire le taux de

lipides extrait par rapport à la masse de matière première selon les relations suivantes :

initiale

extraiteextrait

finaleinitialeextraite

finalfinalefinale

initialinitialeinitiale

première) m(matière

m(lipides) lipides deTaux

m(lipides) m(lipides) m(lipides)

lipides deTaux m(résidu)m(lipides)

lipides deTaux première) m(matièrem(lipides)

=

−=⇒

×=×=


- 87 -

Extraction

Pression (bar) (± 5 bar)

T (°C) (±

1°C)

m (CO2) utilisée (g/g de matière

première)

Taux de lipides initial (g de

lipides / 100 g de matière

première)

Taux d’eau initial

(g d’eau / 100 g de matière

première)

Taux de

lipides final (g de

lipides / 100 g

de résidu)

Taux d’eau final (g

d’eau/ 100 g

de résidu)

Taux de lipides extrait (g de

lipides extrait/ 100 g de matière

première) Masse initiale : 3 g

Extract7 300 60 62,7 17,1 18,6 7,9 6,1 11,3

Extract8 300 45 61,1 10,6 12,4 8,2 5,9 3,7

Extract9 300 60 59,8 16,2 18,7 6,5 14,7 10,5 Extract10 300 60 58,5 2,7 19,5 2,1 12,7 0,8 Extract11 300 60 57,7 2,7 19,5 2,2 13,7 0,7

Extract14 300 35 56,4 3,0 17,3 2,6 14,3 0,6 Extract15 300 70 58,9 2,6 17,3 1,9 9,2 0,9 Extract16 200 45 64,9 4,0 7,8 3,1 5,1 1,0 Extract17 200 60 59,9 3,4 6,3 2,6 3,4 0,9

Extract22 300 45 128,0 7,6 4,5 3,6 3,1 4,2

Extract25 300 60 128,3 7,6 4,3 4,4 2,3 3,4

Masse initiale : 6 g Extract20* 300 45 63,8 7,6 3,9 3,1 3,7 4,7 Extract23* 300 60 63,8 7,6 5,3 4,2 2,3 3,6

Une deuxième extraction est réalisée après la première

(extract21 après extract20 et extract24 après extract23 ; masse initiale de 3 g)

Extract21 300 45 62,6 3,1 3,7 3,5 3,4 0

Extract24 300 60 64,4 4,2 2,3 3,8 2,2 0

Tableau III-1 : Conditions opératoires et masse de lipides extraite à l’aide de CO2 pur (Débit CO2 = 1 g/min sauf pour extract9 : 1,6 g/min)

A partir des résultats du Tableau III-1, il est possible de calculer les rendements

d’extraction correspondant aux rapports de la masse de lipides extraite par rapport à celle des

lipides initialement contenue dans la matière première avant extraction (Figure III-1).


- 88 -

Figure III-1 : Rendement d’extraction des lipides par CO2 supercritique (en bleu : extraction sur 3 g ; en rouge : extraction sur 6g ; en vert : 2ème extraction)

Dans la mesure où il a été montré une meilleure extraction des lipides pour des taux

d’humidité entre 8 et 18%, nous avons zéodraté la matière première pour nous placer dans

cette plage de valeurs. Les taux de lipides et d’eau initiaux sont variables car nous avons

commencé les essais en travaillant sur des petits lots de matière première différents.

Néanmoins, à partir de l’essai 20, un même lot est utilisé.

D’une manière générale, le traitement au CO2 supercritique entraine une extraction à

la fois de l’eau et de lipides quelles que soient les conditions opératoires, ce qui est en accord

avec la littérature (Rodriguez et al., 2008 ; Dunfort et Temelli, 1997). Pour les extractions 7 à

17 (sauf 7 et 9 correspondant à un taux de lipides élevé), le taux d’extraction se situe entre 20

et 35%. Pour ces essais, le broyage des échantillons est réalisé avec un broyeur ménager

(Moulinex, « moulin à café »). Pour les extractions 20 à 25, l’utilisation d’un broyeur

industriel permet de travailler sur matière première homogénéisée. Le rendement d’extraction

se situe entre 45 et 60%.

Il est difficile de dégager une influence des paramètres opératoires à cause de la

disparité (humidité et taux de lipides initiaux) de la matière première. A conditions

opératoires identiques, les taux d’extraction d’eau et de lipides dépendent des quantités d’eau

et de lipides initiales (extrait 7 et 10 par exemple). Néanmoins, la comparaison des extractions

20 et 23 (6 g) d’une part et des extractions 22 et 25 (6 g) d’autre part, caractérisées par une

0

10

20

30

40

50

60

70

ren

de

me

nt

d'e

xtr

act

ion

(%

)


- 89 -

teneur en eau initiale comparable (de l’ordre de 4-7%), c’est la combinaison 45°C et 300 bar

qui conduit à une masse de lipide extraite plus importante que pour le couple 60°C et 300 bar.

En revanche, la comparaison des extractions 7 et 8 correspondant à des teneurs en eau

comprises en entre 12 et 18% indique des meilleurs rendements d’extractions à 60°C.

De plus, l’influence de la masse de CO2 est évaluée pour les extractions 20 et 22 (T =

45°C) et pour les extractions 24 et 25 (T = 60°C). Il n’y a pas d’incidence notable sur la

quantité de lipides extraite en passant d’une masse de solvant d’environ 60 g à 130 g. Une

quantité de 60 g de CO2 suffit pour extraire le maximum de lipide dans ces conditions

opératoires.

L’influence de la masse de matière première (3 ou 6 g) est également évaluée pour les

extractions 20 et 22 et pour les extractions 23 et 25. Il n’y a pas d’incidence notable sur la

quantité de lipides extraite en doublant la quantité de matière introduite dans le réacteur.

Les essais 21 et 24 montrent l’effet d’une 2ème extraction. L'objectif est de doubler la

durée du déshuilage avec une étape de dépressurisation/compression rapide susceptible de

casser la structure ou des liaisons protéines-lipides. D’après la littérature, cela doit permettre

d’améliorer l’extraction (Fattori et al., 1988). Nos résultats indiquent que cela n’a pas permis

d’extraire plus de lipides.

A 300 bar et à 45°C avec un débit de 1 g/min, 60 g de CO2 par gramme de matière

première permet d’extraire le plus de lipides. Les rendements d’extraction obtenus sont de

61,9 % (extraction 20) et 55,8% (extraction 22). Des résultats similaires sont obtenus à 60 °C

mais pour limiter la dégradation de molécules thermolabiles (vitamines par exemple) et pour

diminuer le coût énergétique du procédé on décide de travailler à 45°C. Des conditions

opératoires d’extraction de lipides à partir de sous-produits marins proches de celles-ci ont été

utilisées par d’autres auteurs : Sanchez-Camargo et al. (Sanchez-Camargo et al., 2011), 300

bar et 50°C pour des crevettes ; Rubio Rodriguez et al. (Rodriguez et al., 2008), 250 bar et

40°C pour de la peau de colin. Les rendements d’extraction obtenus étaient respectivement de

64% et de 96,4%.

Le Tableau III-2 présente les taux et les masses de PL avant et après extraction au CO2

pur. Les taux en PL initiaux et finaux correspondent pour chaque échantillon au rapport de la

masse de PL divisée par la masse de lipides totaux, respectivement avant et après extraction.


- 90 -

Extraction

Taux PL initial

(g de PL / 100 g de lipides totaux

de la matière première)

Taux PL final

(g de PL / 100 g de lipides totaux du résidu)

Masse de PL avant

extraction (mg)

Masse de PL après

extraction (mg)

Masse initiale : 3 g Extract7 14,1 39,7 45,9 ±4,6 43,8 ±4,4 Extract8 10,0 20,0 17,7 ±1,8 22,9 ±2,3 Extract9 6,0 15,0 20,7 ±2,1 18,2 ±1,8 Extract10 36,0 67,0 21,4 ±2,1 27,5 ±2,8 Extract11 34,0 63,0 22,1 ±2,2 29,7 ±3,0 Extract14 35,0 55,0 21,4 ±2,1 26,5 ±2,7 Extract15 37,0 58,0 19,2 ±1,9 19,0 ±1,9 Extract16 45,0 67,0 36,1 ±3,6 40,5 ±4,1 Extract17 52,0 64,0 41,4 ±4,1 37,3 ±3,7 Extract22 25,0 60,0 59,4 ±5,9 63,1 ±6,3 Extract25 25,0 40,0 51,0 ±5,1 44,9 ±4,5

Masse initiale : 6 g Extract20 25,0 56,0 113,2 ±11,3 96,7 ±9,7 Extract23 25,0 45,0 99,3 ±9,9 93,7 ±9,4

Une deuxième extraction est réalisée après la première

(extract21 après extract20 et extract24 après extract24 ; masse initiale de 3 g) Extract21 56,0 57,0 44,1 ±4,4 50,2 ±5,0 Extract24 45,0 45,0 47,2 ± 4,7 42,4 ±4,2

Tableau III-2 : Taux et masses de PL avant et après extraction au CO2 pur

Quelles que soient les conditions opératoires, il n’y a pas d’extraction de PL, les

différences entre les masses de PL avant et après extraction n’étant pas significatives. Par

conséquent, les proportions relatives des PL par rapport aux lipides totaux augmentent après

traitement pour représenter jusqu’à 67% des lipides du résidu.

De plus, les essais 21 et 24 montrent également qu’il n’y a pas d’influence d’une

dépressurisation/compression rapide sur la perte de phospholipides pendant le traitement.

Sur les extraits obtenus avec les extractions 16 et 21, une analyse qualitative des

lipides restant dans les résidus est donnée par CCM. L’extraction au CO2 supercritique

élimine majoritairement les TG, les esters de cholestérol (Figure III-2). Ces résultats sont en

accord avec la littérature vis-à-vis de l’extraction des TG (Boutin et al., 2009). En revanche,

nos extraits restent relativement riches en cholestérol. Dans la suite, nous appellerons la


- 91 -

matière première traitée au CO2 supercritique : matière déshuilée.

Figure III-2 : Séparation par CCM des lipides des extraits 16 (16ap) et 21 (21ap) obtenus par CO2 supercritique (en comparaison la séparation de l’extrait des lipides totaux est rappelé). Deux

mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v)

Compte tenu de l’ensemble de ces résultats, nous avons décidé de travailler dans les

conditions opératoires suivantes :

P = 300 bar, T = 45°C et une masse de 60 g de CO2 par gramme de matière première.

après

extraction

après

extraction

avant

extraction


- 92 -

III.2 Extraction des phospholipides avec un mélange CO2-co-solvant

Cette partie s’attache au développement de l’étape d’extraction des phospholipides à

l’aide d’un mélange de CO2 et de co-solvant. Il y a peu d’études sur l’extraction des

phospholipides issus d’organismes marins, la majorité des travaux portant sur d’autres types

de matière première (sources végétales ou à partir de sous produits d’œufs). L’objectif de

cette partie est donc de démontrer la possibilité d’extraire des phospholipides à partir d’une

nouvelle source complexe à savoir les parties « non comestibles » de la coquille Saint

Jacques.

D’après la littérature, l’extraction des phospholipides peut être réalisée avec un

mélange CO2-éthanol dans les conditions suivantes (cf. chapitre I) :

200 bar < P < 700 bar

60°C < T < 80°C

7,5 % < % éthanol < 50%

Pour 1 g de matière première 10 g de CO2 < masse de CO2< 100 g de CO2

Pour 1 g de matière première 0,8 g d’éthanol < masse d’éthanol< 600 g d’éthanol

Compte tenu de la complexité de la matière première, l’utilisation d’un co-solvant tel

que l’éthanol peut effectivement permettre d’extraire les phospholipides mais conduira

probablement à la co-extraction d’autres composés présents dans la matière première. Ainsi,

nous devons définir deux critères sur lesquels optimiser l’extraction :

� Le rendement d’extraction exprimé en masse de PL extraite pour 1 g de

matière déshuilée qui doit être maximal

� La pureté qui doit être la meilleure ce qui correspond à une masse d’espèces

non phospholipides dans l’extrait la plus faible


- 93 -

III.2.1 Plan des essais et paramètres étudiés

Pour s’affranchir de la disparité des lots de matière première en termes de teneur en

eau et de charge lipidique, nous avons utilisé de la matière première plus homogène et réalisé

des déshuilages sur des grands lots. Ce sont des aliquots (d’environ 6 g) de ces lots déshuilés

qui sont utilisés.

Nous avons réalisé une vingtaine d’essais en faisant varier différents paramètres. Le

Tableau III-3 résume l’ensemble des essais. La colonne « lot » se réfère à la provenance de la

matière première et au déshuilage associé, le volume de réacteur utilisé est de 10 ml, le débit

de CO2 est de 1 g/min. Sauf indication contraire, le co-solvant utilisé est l’éthanol. Trois

essais avec de l’isopropanol sont aussi réalisés.

Pour choisir les paramètres opératoires, nous avons dû tenir compte des limitations

techniques des appareils à notre disposition (Pmax = 315 bar et Tmax = 150°C). Nous avons

donc décidé de travailler à des pressions basses (250 et 300 bar) et à une température

maximale de 60°C. Les différents paramètres étudiés à travers ces différents essais sont :

� La reproductibilité de l’extraction

� La pression

� Le pourcentage massique de co-solvant du flux d’extraction

� La température

� Le co-solvant utilisé (éthanol ou isopropanol)


- 94 -

Extraction

Masse de matière

déshuilée (g)

P (bar)

T (°C)

% massique co-solvant

dans le mélange

Volume total de co-

solvant utilisé (ml)

Débit de co-solvant

(g/min) Remarques

Lot 1

Pls15 6,18 1 27 100 90 1,0

Pas de traitement de déshuilage au

CO2

Pls16 6,02 1 27 100 90 1,0

Pls17 6,03 300 27 30 49 0,5

Pls20 6,37 300 45 50 94 1,0

Pls21 6,16 300 60 30 50 0,5

Pls22 6,33 250 27 50 138 1,0

Pls23 6,50 250 60 50 120 1,0

Pls24 6,29 300 60 50 124 1,0

Lot 2

Pls32 7,03 250 45 50 116 1,0

Pls31a 6,66 250 45 50 117 1,0

Pls33 6,20 250 27 50 115 1,0

Pls34 6,46 250 27 30 73 0,5

Pls35 6,55 250 45 15 45 0,2

Pls36 6,38 250 45 30 81 0,5

Pls37 6,05 250 45 30 79 0,5

Pls38 6,71 250 45 50 116 1,0

Pls39 6,50 1 27 100 126 1,0

Pls40 6,68 250 45 30 80 0,5

Pls41 6,68 250 27 50 113 0,9 Co-solvant = Isopropanol



Pls44 6,63 250 60 30 79 0,5

Tableau III-3 : Conditions opératoires des extractions des phospholipides

(débit de CO2 = 1 g/min, volume du réacteur : 10 ml)


- 95 -

III.2.2 Résultats

Cette partie présente les résultats obtenus pour l’extraction des phospholipides. Pour

l’ensemble des essais, l’extraction est faite dans un réacteur cylindrique de 10 ml contenant la

matière première déshuilée. Ensuite, l’enceinte est mise sous pression avec du CO2 pur puis

un flux continu de CO2-co-solvant traverse le lit de matière pendant toute la durée de

l’expérience. Le temps initial correspond au temps de perçage du lit de l’alcool, c’est à dire à

l’apparition des premières gouttes d’alcool en sortie. Cinq collectes sont réalisées au cours de

l’extraction. La masse totale extraite est déterminée sur la totalité de l’extrait alcoolique en

sortie de colonne. Pour des raisons de sensibilité de techniques d’analyse, généralement, les

deux premières fractions sont analysées en termes de masses de lipides totaux et de PL.

Pour comparer les différentes conditions opératoires, nous avons introduit plusieurs

facteurs qui nous permettrons d’évaluer les performances de l’extraction :

� La masse de phospholipides extraite sur la masse totale extraite : rapport de

phospholipides de l’extrait

fPQ/��U = 5PQ5UWU��U=�#U�

� La masse de phospholipides extraite sur la masse de lipides extraite : rapport de

phospholipides de la partie lipidique de l’extrait

fPQ/V#9 = 5PQ5V#9#i�"��U=�#U

� La masse de lipides extraite sur la masse totale extraite : rapport de lipides de

l’extrait

fV#9/��U = 5V#95UWU��U=�#U

L’ensemble des courbes présentées par la suite correspond à des masses normalisées

par la masse initiale d’échantillon introduite et cumulées d’une fraction à une autre.


- 96 -

III.2.2.1 Intérêt du prétraitement de déshuilage au CO2 pur

La première étape du procédé consiste à extraire les lipides neutres avec du CO2 pur.

Pour s’assurer de l’intérêt de ce premier traitement nous avons comparé les résultats d’une

extraction à l’éthanol sur deux échantillons, un ayant subi un prétraitement de déshuilage au

CO2 et l’autre non.

Les Figure III-3 et Figure III-4 présentent respectivement l’influence d’un

prétraitement au CO2 sur la masse totale extraite (rapporté à 1 g de matière première) et sur la

partie lipidique en fonction du temps.

Figure III-3 : Influence du prétraitement sur la masse totale extraite (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol, débit : 0,8 g/min)

Les allures des courbes d’extraction sont proches. La quantité extraite pour l’essai sans

déshuilage est plus importante.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

sans déshuilage au CO2 (pls15)

avec déshuilage au CO2 (pls16)


- 97 -

Figure III-4 : Influence du prétraitement sur l'extraction des lipides totaux et des phospholipides (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol)

L’allure des courbes d’extraction est semblable dans les deux cas. Sans prétraitement

de déshuilage, la quantité de lipides disponibles pour l’extraction est supérieure, et donc la

masse extraite est plus importante que dans le cas de la matière prétraitée. On constate par

contre que la quantité de phospholipides extraite est du même ordre de grandeur. Le

traitement de déshuilage conduit donc principalement à un abattement en lipides de nature

non phospholipidique.

Le Tableau III-4 compare la qualité des extraits obtenus avec et sans prétraitement.

Les fractions F1 et F2 correspondent respectivement aux collectes de 0 à 25 min et de 25 à 50

min.

jkl/mno

F1

jkl/mno

F2

jkl/mno

Total

jkl/pqr Total

Masse de PL extraite (mg) / g de matière

Sans prétraitement

0,35 0,27 0,34 0,11 16,0

Avec prétraitement

0,45 0,57 0,48 0,11 13,0

Tableau III-4 : Bilan en phospholipides des extractions avec et sans déshuilage au CO2 (P = 1 bar, T = 27°C, 100% éthanol) (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des

fractions)

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

Ma

sse

s d

e l

ipid

es

to

tau

x e

t d

e P

L (m

g)

ex

tra

ite

s /

g d

e m

ati

ère

Temps (min)

sans déshuilage au CO2 lipides totaux (pls15)

avec déshuilage au CO2 lipides totaux (pls16)

sans déshuilage au CO2 PL (pls15)

avec déshuilage au CO2 PL (pls16)


- 98 -

Que ce soit pour les fractions 1 et 2 ou pour l’ensemble, le taux phospholipides par

rapport aux lipides totaux (fPQ/V#9) est supérieur avec prétraitement au CO2 pur. Par ailleurs,

la quantité de phospholipides extraite par gramme d’échantillon est légèrement inférieure

quand il y a prétraitement. Une explication pourrait être un effet « co-solvant » provenant des

lipides neutres plus abondants dans une matière non déshuilée.

Pour conclure, le prétraitement permet d’obtenir des extraits plus sélectifs en

phospholipides par rapport aux lipides totaux.

III.2.2.2 Reproductibilité de l’extraction

Dans un premier temps, nous avons analysé la reproductibilité des expériences, en

répétant trois fois deux séries d’extraction pour deux taux d’éthanol différentes (Tableau

III-5).

Extraction [Masse de matière

déshuilée utilisée (g)]

P (bar) T (°C)

% massique éthanol dans le

mélange

Débit de CO2

(g/min)

Débit d’éthanol

moyen (g/min)

Volume total d’éthanol utilisé (ml)

Pls32 [7,03]

Pls31a [6,66] 250± 5 45± 1 50 1,0 0,97 116+/- 1

Pls38 [6,71]

Pls36 [6,38]

Pls37 [6,05] 250 ± 5 45 ± 1 30 1,0 0,50 79+-/2

Pls40 [6,68]

Tableau III-5 : Conditions opératoires d’étude de la reproductibilité de l’extraction des phospholipides (durée d’extraction : environ 100 min)

La Figure III-5 présente l’évolution des masses moyennes extraites (totale, lipides et

phospholipides) en fonction du temps pour les deux conditions testées. Les extractions ont été

répétées 3 fois.


- 99 -

Figure III-5 : Reproductibilité de l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min) ou 50% (débit total = 2 g/min) d’éthanol) (n = 3)

Pour les deux conditions opératoires, les courbes suivent une tendance classique

d’extraction à savoir une première partie qui correspond à l’extraction du soluté le plus

« disponible », par exemple proche de la surface de la poudre où il y a peu de limitation au

transfert. Par la suite, le transfert plus difficile dans la matrice limite la quantité de soluté qui

migre vers le fluide d’où l’apparition d’une pente plus faible, voire d’un plateau si la matrice

est épuisée ou si le transfert est trop lent.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 50% (pls32, pls31a et pls38)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36, pls37 et pls40)

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40

Ma

sse

de

lip

ide

s t

ota

ux

ex

tra

ite

(mg

)/

g d

e m

ati

ère

Temps (min)

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)


- 100 -

Quelle que soit la masse extraite considérée (totale, lipides ou phospholipides), le

procédé d’extraction peut être considéré comme répétable pour les conditions opératoires

testées. De ces résultats, nous avons calculé un pourcentage d’erreur relatif moyen pour

chaque type d’extrait :

� Erreur relative moyenne sur la masse totale extraite : 5,8% ± 1,3 (n = 10)

� Erreur relative moyenne sur la masse de lipides totaux : 4,5% ± 2,2 (n = 4)

� Erreur relative moyenne sur la masse de PL : 3,3% ± 2,6 (n = 4)

Ce pourcentage a été appliqué sur les autres résultats d’extraction.

III.2.2.3 Influence de la pression

Deux pressions (250 et 300 bar) sont utilisées (Tableau III-6 ).



P (Bar) T (°C) % massique

éthanol dans le mélange

Débit de CO2

(g/min)

Débit d’éthanol

moyen (g/min)

Volume total

d’éthanol utilisé (ml)

Pls23 [6,50]

250 ± 5 60 ± 1 50% 1,0 0,99 120

Pls24 [6,29]

300 ± 5 60 ± 1 50% 1,0 1,02 123

Tableau III-6 : Conditions opératoires pour étudier l'influence de la pression sur l’extraction des lipides

La Figure III-6 présente l’influence d’une variation de pression entre 250 et 300 bar

sur les rendements d’extraction des différentes fractions.


- 101 -

Figure III-6 : Influence de la pression sur l’extraction (T = 60°C, 50% éthanol, débit total = 2 g/min)

Pour la quantité totale et de lipides totaux, les courbes obtenues pour les deux

pressions étudiées sont superposables. Dans ces conditions, l’extraction des PL est légèrement

plus importante à 250 bar (pour 1 g de matière, 11,65 ± 0,38 mg contre 10,21 ± 0,34 mg).

Augmenter la pression ne modifie pas de manière significative les propriétés

physiques du mélange CO2-éthanol. Le Tableau III-7 compare les viscosités et les masses

volumiques à 250 et 300 bar calculées à l’aide du logiciel Prophys, basé sur le modèle

thermodynamique MHV 2 (Modified Huvon-Vidal mixing rule).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps(min)

P = 250 bar T = 60°C %étOH = 50% (pls23)

P = 300 bar T = 60°C %étOH = 50% pls(24)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50

Ma

sse

de

lip

ide

s t

ota

ux

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)


- 102 -

P (bar)

T

(°C) % massique d’éthanol

dans le mélange Viscosité (Pa.s) Masse volumique (kg/m3)

250 60 50 2,61 x 10-4 825

300 60 50 2,68 x 10-4 833

Tableau III-7 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol

(P = 250 ou 300 bar, T = 60°C, 50% éthanol ; obtenues par Prophys)

Les propriétés des fluides étant assez proches ni le transfert de matière ni la solvatation

ne devraient subir de variations importantes d’où le peu de différence observée sur

l’extraction. Les études menées par d’autres auteurs qui étudient l’influence de la pression

n’utilisent pas cette proportion d’éthanol. Cependant, dans le cas d’une extraction

supercritique à 10% massique d’éthanol et une température de 80 °C sur le soja (Montanari et

al., 1999), augmenter la pression de 239 bar à 301 bar permettait d’augmenter la quantité de

phospholipides extraits, qui passe de 2,9 mg de PL par gramme de matière première déshuilé

à 3,2 mg/g. Notre résultat, obtenu dans le cas d’un fluide extractant très riche en éthanol, peut

niveler ou masquer un effet à plus faible pourcentage.

Pour des raisons économiques, il est préférable de travailler à 250 bar.

III.2.2.4 Influence du pourcentage d’éthanol

Dans cette partie nous étudions l’effet de la proportion d’éthanol utilisée pour

l’extraction. Le Tableau III-8 fournit les conditions opératoires utilisées.





Durée extraction

(min)

Débit d’éthanol

moyen (g/min)

Volume total d’éthanol utilisé (ml)

Pls35 [6,55] 250 ± 5 45 ± 1 15 240 0,15 45

Pls36 [6,38] 250 ± 5 45 ± 1 30 90 0,51 81

Pls31a [6,66] 250 ± 5 45 ± 1 50 90 0,98 117

Tableau III-8 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (débit de CO2 = 1 g/min)


- 103 -

La Figure III-7 présente les résultats obtenus. A noter que nous avons fait le choix de

travailler à débit de CO2 fixe (1 g/min) et que nous avons donc du adapter celui de l’éthanol

en fonction de la proportion souhaitée. Pour avoir des volumes d’extraits identiques, le temps

de prélèvement est par conséquent différent.

Figure III-7 : Influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 1 g/min)

Plus le pourcentage d’éthanol est important, plus les quantités totales, de lipides et de

phospholipides extraites sont importantes, hormis pour le cas à 15% où le mélange « peine » à

extraire les phospholipides.

Le Tableau III-9 présente les masses volumiques et les viscosités des essais présentés

dans cette partie.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150 200 250ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 15% (pls35)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 50% (pls31a)


- 104 -

P (bar)

T (°C)

% massique d’éthanol dans le mélange

Viscosité (Pa.s) Masse volumique (kg/m3)

250 45 15 1,29 x 10-4 982

250 45 30 1,78 x 10-4 939

250 45 50 2,61 x 10-4 850

Tableau III-9 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar,

T = 45°C ; obtenues par Prophys)

En considérant seulement les caractéristiques physiques du solvant, les conditions les

plus favorables à l’extraction sont obtenues à 15% d’éthanol. En effet, à ce pourcentage

d’éthanol, le mélange conjugue une masse volumique forte (meilleure solvatation) et une

viscosité faible (moins de résistance au transfert de matière). Cependant, l’ajout d’un co-

solvant tel que l’éthanol permet d’augmenter la polarité du solvant. Plus cette proportion est

élevée, plus la polarité est élevée, et donc, plus il y aura d’espèces polaires susceptibles d’être

extraites. Il y a donc peu d’extraction de PL à 15% d’éthanol car le pouvoir solvant n’est pas

suffisant. Pour une pression d’environ 400 bar et une température de 60°C, il est impossible

d’extraire des PL à partir de résidu d’œufs avec de bas pourcentages d’éthanol (5 à 20%

massique) (Shah et al., 2004). Inversement, pour une pression d’environ 200 bar et une

température de 60°C et à partir d’une lécithine de soja (contenant 73% de phospholipides),

Teberikler et al. (Teberikler et al., 2001) ont observé une augmentation du rendement

d’extraction d’un facteur quatre en utilisant 12,5% d’éthanol par rapport à une utilisation de

10% de co-solvant. Dans ces conditions, plus la quantité d’alcool utilisée est importante plus

l’extraction des PL est favorisée.

Le Tableau III-10 fournit les caractéristiques des fractions obtenues pour chaque essai.

P (bar)

T (°C)

% massique d’éthanol dans le

mélange

jkl/pqr jmno/pqr jkl/mno

F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total

250 45 50 0,39 0,15 0,32 0,58 0,19 0,47 0,68 0,77 0,69

250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87

250 45 15 0,59 0,51 0,58 0,67 1,00 0,72 0,88 0,50 0,80

Tableau III-10 : Influence du pourcentage d'éthanol sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)


- 105 -

Plus la proportion d’éthanol est importante, plus le rapport des PL de l’extrait

( fPQ/��U ) est faible car on solubilise alors bien plus d’autres matières lipidiques non

phospholipidiques ou non lipidiques. Le taux de lipides de l’extrait (fV#9/��U diminue au

cours de l’extraction, dans tous les cas sauf pour 15% d’éthanol. Le taux de PL par rapport

aux lipides totaux de l’extrait (fPQ/V#9 est supérieur pour F2 par rapport à F1 pour 30% et 50%

d’éthanol tandis que pour 15% c’est l’inverse.

A 15 % d’éthanol, la totalité de la masse extraite est de nature lipidique pour la

deuxième fraction, et il s’agit des conditions où l’on a la meilleure sélectivité en lipides

totaux. Par contre, sur la deuxième fraction, nous avons une proportion phospholipides/lipide

totaux de seulement 0,5. Avec 30% d’éthanol, on peut avoir une fraction lipidique très riche

en phospholipides (>87%) mais dans laquelle il reste une part importante de composés non

lipidiques.

III.2.2.5 Influence de la température à différentes pressions

L’effet de la température à 250 et 300 bar est analysé. Le Tableau III-11 regroupe les

conditions opératoires testées et regroupe les essais qui peuvent être comparés.



P (Bar) T (°C) % massique éthanol dans le mélange

Débit d’éthanol

moyen (g/min)

Volume total

d’éthanol utilisé (ml)

Pls34 [6,46] 250 ± 5 27 ± 1 30 0,65 73

Pls36 [6,38] 250 ± 5 45 ± 1 30 0,65 81

Pls44 [6,63] 250± 5 60 ± 1 30 0,61 80

Pls17 [6,03] 300 ± 5 27 ± 1 30 0,65 49

Pls21 [6,16] 300 ± 5 60 ± 1 30 0,67 50

Pls20 [6,37] 300 ± 5 45 ± 1 50 1,25 94

Pls24 [6,29] 300 ± 5 60 ± 1 50 1,26 124

Tableau III-11 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence de la température sur l’extraction (Débit de CO2 : 1 g/min)


- 106 -

III.2.2.5.1 Pression de 250 bar

La Figure III-8 présente les résultats obtenus à 250 bar et 30% d’éthanol à 3

températures (27, 45 et 60°C).

Figure III-8 : Influence de la température sur l’extraction (P= 250 bar, 30% d’éthanol, débit total de 1,5 g/min)

Les courbes ont des évolutions au cours du temps comparables. L’impact de la

température est significatif à 60°C pour les phospholipides, alors que l’extraction des lipides

totaux y est sensible dès 45°C.

D’une façon générale, l’extraction des lipides est d’autant plus rapide que la

température est basse (pente à l’origine plus élevée à 27°C). L’extraction des lipides totaux ne

semble pas être totalement terminée pour l’ensemble des températures.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 250 bar T = 27°C %étOH = 30% (pls34)

P = 250 bar T = 45°C %étOH = 30% (pls36)

P = 250 bar T = 60°C %étOH = 30% (pls40)

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100

Ma

sse

de

lip

ide

s t

ota

ux

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

0

5

10

15

20

25

0 50 100

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)


- 107 -

La température modifie la masse volumique et la viscosité du mélange CO2-éthanol

(Tableau III-12).

P

(bar)

T

(°C)


Viscosité (Pa.s) Masse volumique (Kg/m3)

250 27 30 1,43 x 10-4 986

250 45 30 1,20 x 10-4 939

250 60 30 1,12 x 10-4 896

Tableau III-12 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol à 3 températures (P = 250 bar, 30 % éthanol)

A débit massique constant, une diminution de la masse volumique entraine une

augmentation de la vitesse d’écoulement dans le lit de matière qui est défavorable au transfert

de matière. Par contre, une faible viscosité, comme c’est le cas à 60°C, est quant à elle

propice à faciliter le transfert. La masse volumique qui diminue aura tendance à diminuer le

pouvoir solvant du fluide extractant. Au vu des résultats exprimé ici, il semblerait que l’effet

de diminution de pouvoir solvant du mélange CO2-éthanol à 60°C et l’augmentation de la

vitesse du flux de solvant l’emporte sur le gain en terme de transfert de matière.

En s’intéressant aux différents taux (Tableau III-13), on observe une variation de ce

paramètre en fonction la température. Il n’y a pas de tendances simples liées à la température.

Cependant on note tout de même le faible rapport de PL par rapport aux lipides totaux

(fPQ/V#9) pour la fraction F2 obtenue à 60°C.

P

(bar)

T

(°C)

% massique

d’éthanol dans le mélange



250 27 30 0,55 0,44 0,51 0,80 0,41 0,64 0,69 1,00 0,79

250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87

250 60 30 0,48 0,22 0,40 0,48 0,50 0,49 0,99 0,44 0,82

Tableau III-13 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)


- 108 -

L’ensemble des essais met en évidence qu’il n’est pas nécessaire de travailler à des

températures très élevées pour extraire les phospholipides de la matrice. Une température de

27 ou 45°C suffit. Dans la littérature, de telles températures « basses » ne sont pas explorées

puisque les auteurs font généralement leurs essais entre 45 et 80°C. Par conséquent, les

risques de dégradation sont donc plus importants dans leur cas.

Quelle que soit la température, les résultats obtenus à 250 bar et 50 % d’éthanol ne

sont pas significativement différents (figures non représentées). Le Tableau III-14 présente les

caractéristiques des solvants d’extraction.

P

(bar)

T

(°C)


Viscosité (Pa.s) Masse volumique

(kg/m3)

250 27 50 3,11 x 10-4 878

250 45 50 2,61 x 10-4 850

250 60 50 2,27 x 10-4 825

Tableau III-14 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, 50% éthanol ; obtenues par Prophys) à 3 températures

Tout comme explicité précédemment, le gain sur le transfert de matière obtenu à

température plus élevée est compensé par la diminution du pouvoir solvant.

III.2.2.5.2 Pression de 300 bar

La Figure III-9 compare, pour deux pourcentages d’éthanol, les résultats obtenus à 300

bar à 27°C, 45°C et 60°C.


- 109 -

Figure III-9 : Influence de la température sur l’extraction (P = 300 bar, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) et 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min))

A 30 % d’éthanol, c’est surtout l’extraction des lipides totaux qui est affectée par la

variation de température.

A 50 % d’éthanol, il apparait qu’on extrait moins de matière totale et de

phospholipides à la température la plus haute, ce qui se traduit une vitesse d’extraction plus

importante à 45°C qu’à 60°C.

Le Tableau III-16 compare les caractéristiques du solvant d’extraction.

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 300 bar T = 45°C %étOH = 50% lot 2 (pls20)




0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60

Ma

sse

de

lip

ide

s to

tau

x e

xtr

ait

e (

mg

) /

g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)


- 110 -

P

(bar)

T

(°C)

% massique d’éthanol

dans le mélange

Viscosité

(Pa.s)

Masse volumique (kg/ m3)

300 27 30 1,43 x 10-4 997

300 60 30 1,12 x 10-4 913

300 45 50 2,03 x 10-4 857

300 60 50 1,79 x 10-4 833

Tableau III-15 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 300 bar, 30% et 50% d’éthanol; obtenues par Prophys) à 3 températures

On remarque qu’à 30 % d’éthanol, la masse volumique et la viscosité du mélange

CO2-éthanol sont légèrement supérieures à 27°C qu’à 60°C. Ainsi, à 60°C, la plus faible

viscosité du mélange favoriserait le transfert de matière mais cet effet est contrebalancé par

une plus faible masse volumique. Selon les espèces à extraire (lipidiques ou non), l’effet

viscosité prédomine ou non sur l’effet masse volumique.

A 50 % d’éthanol, la masse volumique varie très peu entre 45 et 60°C tandis que la

viscosité diminue avec la température. En considérant seulement ces deux paramètres, le

transfert de matière devrait être plus important à 60°C. Or expérimentalement, l’extraction est

favorisée à 45°C. Dans la littérature (Letisse et al., 2006 ; Sanchez-Camargo et al., 2011), la

température a, soit un effet positif, soit négatif sur l’extraction, ce qui montre la difficulté à

anticiper des tendances pour ce paramètre opératoire.

Le Tableau III-16 présente les sélectivités pour ces conditions d’extraction.

P

(bar)

T

(°C)

% massique

d’éthanol

dans le mélange



300 27 30 0,19 0,10 0,16 0,43 0,24 0,36 0,45 0,42 0,44

300 60 30 0,20 0,18 0,20 0,63 0,63 0,63 0,33 0,30 0,32

300 45 50 0,13 0,15 0,13 0,37 0,28 0,36 0,35 0,52 0,37

300 60 50 0,17 0,12 0,16 0,56 0,26 0,48 0,30 0,45 0,32

Tableau III-16 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)

Pour un pourcentage d’éthanol donné, les rapports fPQ/��Uet fV#9/��U de l’extrait sont

plus importants à 60°C. Par contre, la tendance s’inverse pour le rapport

phospholipides/lipides totaux (fPQ/V#9) puisque c’est à basse température que cette sélectivité


- 111 -

est la plus importante. La température influe donc sur la sélectivité de l’extraction ce qui est

en accord avec les observations de la littérature, menées généralement sur la gamme 60-80°C

pour l’extraction des phospholipides.

III.2.2.6 Exploitation de la courbe d’extraction

Dans la mise au point du procédé d’extraction et de la compréhension des effets, il est

utile d’exploiter la première partie de la cinétique d’extraction car elle correspond à la fraction

la plus facilement accessible des composés à extraire. A titre d’exemple, la Figure III-10

présente la masse de PL extraite par g de matière déshuilée en fonction de la quantité de

solvant. En effet, puisque le débit de fluide extractant est connu, il est facile de convertir le

temps d’extraction en quantité de solvant utilisée.

Figure III-10 : Exemple de courbe d’extraction (Pls33) exprimée en fonction de la masse de solvant utilisée (P = 250 bar, T = 27°C, 50% éthanol (débit total : 2 g/min)

La pente de cette courbe s’apparente alors à une solubilité apparente puisqu’elle

représente une quantité solubilisée par unité de solvant. Nous avons donc calculé le rapport

masse extrait / m(CO2-éthanol) pour les lipides totaux et les phospholipides de la première

fraction F1 des différents essais (Tableau III-17).

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

Masse de solvant (g)


- 112 -

Extraction P (bar)

T (°C)


mélange

Solubilité apparente des lipides (mg / g de

solvant)

Solubilité apparente des PL (mg / g de

solvant)

100 % éthanol

Pls15 (lot 1) 1 27 100 11,63 4,03

Pls16 (lot 1) 1 27 100 6,17 2,79

Pls39 (lot 2) 1 27 100 7,20 4,47

Lot 1

Pls17 300 27 30 2,56 1,14

Pls20 300 45 50 4,21 1,48

Pls21 300 60 30 3,14 1,02

Pls22 250 27 50 3,61 1,27

Pls23 250 60 50 4,10 1,41

Pls24 300 60 50 3,92 1,19

Lot 2

Pls32 250 45 50 5,12 3,06

Pls31a 250 45 50 4,84 3,28

Pls33 250 27 50 4,31 2,89

Pls34 250 27 30 4,36 3,02

Pls35 250 45 15 0,53 0,47

Pls36 250 45 30 2,98 2,53

Pls37 250 45 30 3,26 2,47

Pls38 250 45 50 4,55 3,13

Pls40 250 45 30 3,30 2,68

Pls44 250 60 30 2,39 2,38

Tableau III-17 : Solubilités apparentes des lipides et phospholipides pour les différentes conditions opératoires étudiées

Les valeurs de solubilité apparente varient de 0,5 à 5,1 mg/g de solvant pour les lipides

totaux et de 0,5 à 3,3 mg/g de solvant pour les phospholipides. A 15% d’éthanol, on observe

la plus faible solubilité apparente des lipides et des phospholipides. A titre de comparaison,

les expériences réalisées avec 100% d’éthanol sur une matière première sans déshuilage

conduisent à des solubilités apparentes élevées (11,6 mg/g de solvant pour les lipides totaux et

de 4,0 mg/g de solvant pour les phospholipides.


- 113 -

Les solubilités apparentes des lipides et des PL augmentent avec le pourcentage

d’éthanol (PLs35 (15%) < PLs37 (30%) PLs32 (50%)). Cette tendance est retrouvée dans les

études sur des graines de maïs pour des pourcentages d’éthanol allant de 0 à 10% massique

(Ronyai et al., 1998).

L’influence de la température sur les solubilités apparentes n’est pas clairement

établie. A 30% d’éthanol et 250 bar, les solubilités augmentent quand la température

augmente (PLs34 (27°C) > PLs37 (45°C)). En revanche, à 30% d’éthanol et 300 bar, les

solubilités diminuent quand la température augmente (PLs17 (27°C) < PLs21 (60°C)).

Montanari et al. (Montanari et al., 1999), ont trouvé expérimentalement une solubilité de PL

de 0,25 mg/g de solvant à 239 bar, 80°C et 10% d’éthanol. Cette valeur est cohérente avec nos

résultats : une solubilité apparente de PL égale à 0,47mg/g (250 bar, 15% d’éthanol, 45°C)

dans la mesure où nous utilisons davantage de co-solvant.

Peu d’auteurs utilisent une proportion d’éthanol de 50%. Shah et al., (Shah et al.,

2004) extraient des phospholipides à partir d’œufs non commercialisables par un procédé

similaire au notre (un traitement de déshuilage au CO2 seul puis une extraction CO2-éthanol).

Cependant, les données de solubilité ne sont mentionnées dans leurs travaux.

En résumé, si on tient compte uniquement du critère « solubilité », les meilleures

conditions opératoires sont : 250 bar, 45°C et 50 % d’éthanol. Néanmoins, le critère de pureté

est aussi à prendre en considération pour donner des recommandations en termes de pression,

température et % de co-solvant.

III.2.2.7 Récapitulatif des résultats obtenus avec le mélange CO2- éthanol

Nous avons calculé un rendement d’extraction sur la base des extractions réalisées par

la méthode de Folch qui donnent la totalité des PL disponibles dans la matière déshuilée (3,8

± 0,6 % de lipides totaux par rapport à la matière déshuilée et 50,3 ± 9,3 % de PL par rapport

aux lipides totaux, soit 18,9 ± 1,9 mg de PL / g de matière déshuilée). Le Tableau III-18

récapitule les conditions opératoires, les puretés et les rendements d’extraction obtenus en

utilisant l’éthanol comme co-solvant. Les résultats sont classés, pour un lot donné, en fonction

de la quantité de phospholipides extraite par rapport à la masse de matière déshuilée traitée.


- 114 -

Les conclusions suivantes peuvent être énoncées :

� Sur l’ensemble des essais menés, la première étape d’extraction permet

généralement de récupérer plus de 50% de matière totale. Cela se retrouve dans

le fait que fV#9/��U diminue au cours de l’extraction (F1>F2) (sauf pour Pls35

qui correspond à 15% d’éthanol).

� On observe des rendements très variables en fonction du lot de matière

utilisée : 90-100 % pour le lot 2 et 40-65 % pour le lot 1. Cette disparité

pourrait être liée au fait que le sous produit utilisé est un mélange de barbes,

foies … ce qui rend les prélèvements « homogènes » délicats.

� Si on considère le lot 2, toutes les conditions opératoires sauf celle qui n’utilise

que 15 % d’éthanol conduisent à des rendements élevés. Cela suggère qu’il

faut une quantité minimum de co-solvant pour que l’extraction des PL soit

efficace.

� Les conditions opératoires jouent sur la pureté des extraits qui présentent ou

non une partie de lipides neutres et de composés non-lipidiques. Notre objectif

est de sélectionner les conditions qui conduisent aux extraits les plus purs en

PL que ce soit par rapport à la masse totale extraite ou par rapport aux lipides

totaux. Les conditions qui répondent à ces critères sont (Figure III-11). :

o 250 bar 30% d’éthanol et 27°C (Pls34) : plus de 50% de phospholipides

(par rapport à la matière totale extraite) et 79% de PL par rapport aux

lipides totaux. De plus, on travaille à faible température (en dessous de

la température critique, liquide dense).

o 250 bar 15% d’éthanol et 45°C (Pls35) : 58% de phospholipides (par

rapport à la matière totale extraite) et 80% de PL par rapport aux lipides

totaux. Dans ce cas, on a aussi le meilleur fPQ/��U.

o 250 bar 30% d’éthanol et 45°C (Pls36, Pls37 et Pls40) : environ 42%

de phospholipides (par rapport à la matière totale extraite) et environ

83% de PL par rapport aux lipides totaux. Dans ce cas, on a aussi le

meilleur fPQ/V#9.


- 115 -

Figure III-11 : Répartition des masses extraites (mg/g matière déshuilée) (non lipidiques, lipides non phosphorés et phospholipides) des extraits aux conditions opératoires

sélectionnées (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)

0

5

10

15

20

25

30

35

250 bar 30% 27°C

250 bar 15% 45°C

250 bar 30% 45°C

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

reFraction 1 (0 à 25 min)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

250 bar 30% 27°C

250 bar 15% 45°C

250 bar 30% 45°C

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Fraction 2 (25 à 50 min)

0

10

20

30

40

50

250 bar 30% 27°C 250 bar 15% 45°C 250 bar 30% 45°C

ma

sse

ex

tra

ite

/ g

de

ma

tiè

re

(mg

)

Ensemble des fractions (0 à 50 min)

non lipidiques

lipides non phosphorés

PL


- 116 -

Extraction P

(bar)

T

(°C)

% massique

d’éthanol dans le mélange

RPL/ext (g/g) Rlip/ext (g/g) RPL/lip (g/g) mg de PL extrait/g matière déshuilée

Rendement (g de PL extrait/g de PL

disponibles)

(%) F1 F2 Total F1 F2 Total F1 F2 Total

Lot 1

Pls16 1 27 100 0,15 0,10 0,14 0,34 0,17 0,28 0,45 0,57 0,48 12,42 65,7

Pls20 300 45 50 0,13 0,15 0,13 0,37 0,28 0,36 0,35 0,52 0,37 12,30 65,1

Pls23 250 60 50 0,20 0,13 0,18 0,58 0,21 0,48 0,35 0,61 0,38 11,65 61,6

Pls22 250 27 50 0,18 0,15 0,17 0,51 0,36 0,48 0,35 0,42 0,36 10,82 57,2

Pls24 300 60 50 0,17 0,12 0,16 0,56 0,26 0,48 0,30 0,45 0,32 10,21 54,0

Pls21 300 60 30 0,20 0,18 0,20 0,63 0,63 0,63 0,33 0,30 0,32 7,98 42,2

Pls17 300 27 30 0,19 0,10 0,16 0,43 0,24 0,36 0,45 0,42 0,44 7,68 40,6

Lot 2

Pls36 250 45 30 0,48 0,30 0,43 0,57 0,30 0,49 0,85 0,99 0,87 19,56 100

Pls33 250 27 50 0,44 0,27 0,39 0,66 0,30 0,55 0,67 0,89 0,71 19,41 100

Pls38 250 45 50 0,38 0,23 0,34 0,56 0,26 0,47 0,69 0,87 0,72 19,37 100

Pls37 250 45 30 0,46 0,23 0,40 0,61 0,24 0,51 0,76 0,95 0,78 19,20 100

Pls40 250 45 30 0,53 0,24 0,44 0,65 0,23 0,52 0,81 1,00 0,84 19,03 100

Pls31a 250 45 50 0,39 0,15 0,32 0,58 0,19 0,47 0,68 0,77 0,69 18,88 99,9

Pls34 250 27 30 0,55 0,44 0,51 0,80 0,41 0,64 0,69 1,00 0,79 18,86 99,7

Pls39 1 27 100 0,29 0,07 0,21 0,47 0,13 0,35 0,62 0,51 0,61 18,51 97,9

Pls32 250 45 50 0,30 0,21 0,28 0,51 0,24 0,43 0,60 0,85 0,64 18,07 95,6

Pls44 250 60 30 0,48 0,22 0,40 0,48 0,50 0,49 0,99 0,44 0,82 17,11 90,5

Pls35 250 45 15 0,59 0,51 0,58 0,67 1,00 0,72 0,88 0,50 0,80 11,87 62,8

Tableau III-18 : Récapitulatif des résultats de l’extraction avec un mélange CO2-éthanol (pureté et rendement, (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions))


- 117 -

III.2.2.8 Remplacement de l’éthanol par l’isopropanol

Nous avons réalisé plusieurs essais en substituant l’éthanol par de l’isopropanol dans

les conditions opératoires sont résumées dans le Tableau III-19. A notre connaissance, il n’y a

pas, dans la littérature, d’études d’extraction de phospholipides réalisée avec un mélange

CO2-isopropanol. Néanmoins, l’isopropanol associé à l’hexane est utilisé pour extraire les

lipides totaux (Wolff, 1993).

Extraction [masse de matière

déshuilée (g)]

P

(Bar)

T

(°C)

% massique isopropanol dans le flux d’extraction

Débit de

CO2

(g/min)

Débit d’isopropanol moyen (g/min)

Volume total d’isopropanol

utilisé (ml)

pls41

[6,68] 250± 5 27 ± 1 50 1,0 0,91 96

Pls42

[6,71] 1 27± 1 100 0 0,98 132

Pls43

[6,55] 250± 5 45 ± 1 50 1,0 0,95 117

Tableau III-19 : Conditions opératoires des essais d’extraction des phospholipides avec un mélange CO2-isopropanol


- 118 -

Figure III-12 : Courbes d’extraction obtenues avec un mélange CO2-isopropanol (P = 250 bar, 50% de co-solvant)

L’allure des courbes est similaire à celles obtenues en utilisant de l’éthanol comme co-

solvant, c'est-à-dire une augmentation rapide de la quantité de matière extraite en début de

cinétique puis un ralentissement de l’extraction pour enfin atteindre un pallier. A 27°C, la

quasi-totalité de la masse extraite est de nature phospholipidique d’où une très forte pureté.

Quelle que soit la température (45 ou 27°C), la quantité de phospholipides extraite est la

même. Par contre, la partie non phospholipidique varie fortement, et croît quand la

température augmente.

Comparons à présent les extractions utilisant de l’éthanol et de l’isopropanol dans les

mêmes conditions de pression, de température et de pourcentage de co-solvant (Figure

III-13).

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 120

Ma

sse

to

tale

et

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 250 bar T = 27°C %isoP = 50% masse totale (pls41)

P = 250 bar T = 45°C %isoP = 50% masse totale (pls43)

P = 250 bar T = 27°C %isoP = 50% masse PL (pls41)

P = 250 bar T = 45°C %isoP = 50% masse PL (pls43)


- 119 -

Figure III-13 : Comparaison des résultats obtenus avec de l'éthanol ou de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60 80 100 120

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)P = 1 bar T = 27°C 100% isopropanol (pls42)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60Ma

sse

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

P = 1 bar T = 27°C 100% éthanol (pls39)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120

ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

/ g

de

ma

tiè

re

(mg

)

Temps (min)

P = 250 bar T = 45°C % co-solvant = 50% co-solvant: isopropanol (pls43)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 20 40 60

ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

/ g

de

ma

tiè

re

(mg

)

Temps (min)

P = 250 bar T = 45°C % co-solvant = 50% co-solvant: éthanol (pls32)

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100

ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

/ g

de

ma

tiè

re (

mg

)

Temps (min)

P = 250 bar T = 27°C % co-solvant = 50% co-solvant: isopropanol (pls41)

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80ma

sse

PL

ex

tra

ite

/ g

de

ma

tiè

re

(mg

)

Temps (min)

P = 250 bar T = 27°C % co-solvant = 50% co-solvant: éthanol (pls34)


- 120 -

D’une manière générale, que ce soit pour la masse totale extraite ou pour la quantité de

phospholipides, les quantités extraites sont plus importantes avec l’utilisation de l’éthanol

comme co-solvant. L’isopropanol a donc un pouvoir solvant vis-à-vis des phospholipides plus

faible que celui de l’éthanol.

Les histogrammes de la Figure III-14 présentent la proortion de phospholipides dans

chaque fraction.

Figure III-14:Comparaison de la répartition des masses extraites (PL et autres (non lipidiques et lipides non phosphorés) obtenues avec de l'éthanol et de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température

0

10

20

30

40

50

60

10

0%

Iso

pro

pan

ol

10

0%

éth

ano

l

25

0b

ar 4

5°C

50

%

iso

pro

pan

ol

25

0b

ar 4

5°C

50

%

éth

ano

l

25

0b

ar 2

7°C

50

%

iso

pro

pan

ol

25

0b

ar 2

7°C

50

%

éth

ano

l

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re


0

5

10

15

20

25

30

35

10

0%

Iso

pro

pan

ol

10

0%

éth

ano

l

25

0b

ar 4

5°C

50

%

iso

pro

pan

ol

25

0b

ar 4

5°C

50

%

éth

ano

l

25

0b

ar 2

7°C

50

%

iso

pro

pan

ol

25

0b

ar 2

7°C

50

%

éth

ano

lMa

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

100% Isopropanol

100% éthanol

250bar 45°C 50%

isopropanol

250bar 45°C 50% éthanol

250bar 27°C 50%

isopropanol

250bar 27°C 50% éthanol

ma

sse

(m

g)

Masse totale extraite (mg)

autres PL


- 121 -

Il apparaît clairement que la pureté de l’extrait est bien meilleure avec l’isopropanol

qu’avec l’éthanol. Néanmoins, le prix de cette haute pureté est un moins bon rendement en

quantité extraite puisqu’il est d’environ 40% avec le traitement au CO2-isopropanol contre 90-

100% avec le mélange CO2-éthanol (les essais ayant tous été réalisé sur le lot 2). Ainsi, le

mélange CO2-isopropanol n’épuise pas totalement la matrice.

III.2.3 Conclusion

Cette étude nous permet à présent d’affirmer que :

� Il est possible d’extraire les phospholipides à partir de sous-produits de la

coquille Saint Jacques

� Le traitement en CO2 pur permet de concentrer les PL dans la matière

déshuilée et donc d’améliorer la pureté en PL des extraits lorsqu’on passe sur

des mélanges CO2-co-solvants

� Les conditions opératoires influent sur le rendement et sur la sélectivité de

l’extraction

� Il est possible d’utiliser en tant que co-solvant l’éthanol et ou l’isopropanol

� D’après les analyses RMN 31P, la PC représente la majorité des lipides extraits

Les conditions opératoires retenues pour le passage sur de plus grands volumes de

matière à extraire sont :

� 250 bar 30% d’éthanol et 27°C (température basse et rendement d’extraction

de 100%)

� 250 bar 15% d’éthanol et 45°C (pureté en PL de 50%)

� 250 bar 30% d’éthanol et 45°C (rendement d’extraction 100% et meilleur

rapport RPL/lip)

� 250 bar 50% d’isopropanol et 27°C (température basse et pureté en PL de

90%)


- 122 -

III.3 Transposition de l’extraction des phospholipides sur de plus grands volumes

Le jeu d’expériences précédemment réalisés sur des lots de 6 g a permis de cerner les

conditions opératoires donnant un bon compromis entre quantité extraite et pureté en

phospholipides. L’objectif ici est de transposer les résultats sur de plus grands volumes

(quantité traité d’environ 30 g) pour les raisons suivantes :

� Réduire l’impact de la variabilité des lots sur les résultats

� Valider, dans un objectif de valorisation industrielle, le traitement de charge

plus importante

� Améliorer l’efficacité de l’extraction en se rapprochant de la saturation du

fluide extractant, et ce en utilisant un réacteur agité isolé

� Produire un flux plus riche en phospholipides dans l’optique de la mise en

forme continue de phospholipides en liposomes qui suppose l’addition d’eau.

III.3.1 Utilisation d’un réacteur tubulaire de 500 mL

La première transposition est réalisée avec le même type de réacteur qu’utilisé

précédemment à savoir de type piston (tubulaire). La différence se situe donc sur les

dimensions (diamètre et longueur) de la colonne qui sont donc plus grandes. Le protocole

opératoire utilisé est le même, à savoir une première pressurisation au CO2 puis un flux de

CO2-co-solvant traverse le lit pendant toute la durée de l’extraction.

Nous avons décidé de limiter notre nombre d’essais par rapport au plan d’expériences

déjà réalisé avec la petite colonne. Nous avons donc testé la reproductibilité, étudié

l’influence de la masse initiale introduite dans le réacteur pour les conditions opératoires

sélectionnées qui correspondaient à des sélectivités et des rendements en phospholipides

importants. Comme précédemment, nous allons représenter l’évolution des masses extraites

(totale, lipidique et phospholipidique) normalisées par la masse de matière traitée en fonction

de la masse de solvant (elle aussi normalisée) de façon à s’affranchir aux différences de débit

ou de masse initialement introduite.


- 123 -

III.3.1.1 Etude de la reproductibilité de l’extraction

La reproductibilité de l’extraction est évaluée sur trois essais à P = 250 bar, T = 45°C

et 30% d’éthanol sur des lots de 30 g. La Figure III-15 présente l’évolution des différentes

masses extraites en fonction du temps pour les trois essais. Il apparaît que les essais sont

reproductibles quelle que soit la famille considérée (totale, lipidique ou phospholipidique).

Figure III-15 : Reproductibilité du réacteur tubulaire de grand volume (à P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol et une masse traitée de 30 g) (n = 3)

De ces résultats, nous avons calculé un pourcentage d’erreur relatif moyen pour

chaque type d’extrait :

� Erreur relative moyenne sur la masse totale extraite : 1,5 % ± 0,5 (n = 24)

� Erreur relative moyenne sur la masse de lipides totaux : 0,6 % ± 0,4 (n = 24)

� Erreur relative moyenne sur la masse de PL : 3,0 % ± 0,3 (n = 24)

Ce pourcentage a été appliqué sur les autres résultats.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

Temps (min)

PL

Masse totale

Lipides totaux


- 124 -

Les erreurs relatives obtenues avec 30 g sont inférieures à celles obtenues pour les

extractions sur 6 g de matière déshuilée. On peut attribuer cet écart au lot plus important

traité, il y a moins d’hétérogénéité dans l’échantillon. De plus, les masses pesées sont plus

importantes.

III.3.1.2 Influence de la masse introduite

Dans l’étude à petit volume, la colonne est complètement remplie par les 6 g. Avec

cette quantité, les extraits nous permettent tout juste de réaliser les caractérisations. Le

changement de réacteur (500 mL) nous permet de faire varier ce paramètre, entre 15 et 60 g.

Le volume non occupé est comblé par des billes de verre (d = 2 mm). Les débits, le temps de

fractionnement, la durée de l’extraction et les conditions d’extraction (P = 250 bar, T = 45°C

et 30% d’éthanol) restent les mêmes. Les courbes d’extraction des masses extraites non

normalisées et normalisées par la masse de matière déshuilée initiale en fonction du temps

sont présentées Figure III-16.


- 125 -

Figure III-16 : Influence de la masse introduite sur l’extraction avec le réacteur piston de

« grand volume » (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min, débit total = 10 g/min)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 50 100 150

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

Temps (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

15g

30g

60g

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 50 100 150

Ma

sse

lip

ide

s to

tau

x e

xtr

ait

e (

mg

)

Temps (min)

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150

Ma

sse

lip

ide

s to

tau

x e

xtr

ait

e (

mg

)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

15g

30g

60g

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 50 100 150

Ma

sse

PL

ex

tra

ite

(m

g)

Temps (min)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150Ma

sse

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

15 g

30g

60 g


- 126 -

D’après la représentation en masse non normalisée, plus la masse initiale introduite est

importante, plus les quantités extraites sont grandes quelle que soit la famille considérée

(masse totale extraite, lipides non phosphorés et PL). De plus, le rapport de proportionnalité

entre les masses initiales introduites dans le réacteur et les différentes masses récupérées est

conservé. Avec cette représentation, il semble avantageux d’augmenter la charge initiale dans

la mesure où, pour un temps donné, la quantité de PL en sortie est plus grande.

Si l’on observe les courbes d’extraction représentées avec les masses extraites

normalisées, concernant la masse totale extraites et de lipides totaux, les quantités de matière

obtenues sont d’autant plus importantes que la masse traitée (initiale) est faible. Par rapport

aux PL extraits, la courbe d’extraction avec 60 g de matière traitée est toujours inférieure aux

deux autres. Cette représentation met en évidence un impact de la masse initiale sur le

transfert de matière. Il semblerait qu’avec 60 g, bien que les quantités de soluté disponible

soient plus importantes, on en extrait moins. La résistance aux transferts serait donc plus

grande. La densité de lit (notion de remplissage de la colonne) mesurée pour 15, 30 et 60 g est

respectivement de 0,24 g/ml, 0,27 g/ml et 0,38 g/ml. Plus la quantité introduite est grande,

moins il y a de « vide » dans le lit. Par conséquent le transfert de matière devrait être le plus

favorable pour 60 g de matière traitée, contrairement à ce qui est obtenu expérimentalement.

A l’heure actuelle, nous n’avons pas d’explication pour ces résultats.

III.3.1.3 Comparaison des résultats obtenus selon les réacteurs 10 ml et 500 ml

Dans cette partie, nous comparons des essais réalisés sur 6 g avec le réacteur de 10 ml

avec ceux obtenus sur 15 à 60 g avec le réacteur de 500 ml pour plusieurs conditions

d’extraction (Tableau III-20).


- 127 -

Extraction T

(°C)

% massique de co-solvant dans le flux d’extraction

Débit CO2

(g/min)

Débit de co-solvant

moyen (g/min)

Masse initiale

(g) Co-solvant

Réacteur 500 ml lipoplsI 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsJ 45 ± 1 30 7 2,9 15 éthanol lipoplsK 45 ± 1 30 7 3,0 60 éthanol lipoplsL 27 ± 1 30 7 3,1 30 éthanol lipoplsM 45 ± 1 15 7 3,0 30 éthanol lipoplsN 27 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsP 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol lipoplsQ 27 ± 1 50 7 2,9 30 isopropanol lipoplsS 45 ± 1 30 7 3,1 30 éthanol lipoplsT 45 ± 1 30 7 3,0 30 éthanol

Réacteur 10 ml Pls36 45 ± 1 30 1 0,5 6,38 éthanol Pls34 27 ± 1 30 1 0,5 6,46 éthanol Pls35 45 ± 1 15 1 0,15 6,55 éthanol Pls41 27 ± 1 50 1 1,0 6,68 isopropanol

Tableau III-20 : Conditions opératoires testées avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar)

La Figure III-17 présente un exemple d’extraits obtenus. La coloration de l’extrait

diminue au cours de l’extraction, les premières fractions sont de couleur marron foncée et les

dernières sont jaune/vert clair.

Figure III-17 : Photographie d’extraits obtenus avec un mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T= 45°C, 15% d’éthanol, réacteur tubulaire de 500 ml)


- 128 -

A titre d’exemple, la Figure III-18 présente les résultats d’extraction obtenus à 6 et 30

g (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol). Nous avons normalisé les données (masse

extraite et de solvant) en ramenant les données à 1 g de matière déshuilée. On s’affranchit

ainsi des différences de débit mais également de masse initiale introduite. Les courbes

obtenues pour les autres conditions sont présentées en annexe.

Figure III-18 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol)

Quelle que soit la masse considérée, l’extraction est plus efficace avec la colonne de

petit volume. Cela ne correspond pas à ce qui est attendu dans la mesure où la vitesse de

passage du solvant est inférieure avec la colonne de 500 ml (30 g) par rapport à celle utilisée

avec le réacteur de 10 ml (6 g) (limitation due aux pompes du montage « grand volume »).

Quand on effectue une montée en échelle, les paramètres importants à prendre en

considération sont la vitesse du solvant mais également la densité du lit (masse introduite /

volume occupé). Pour le réacteur de 10 ml, il est égal à environ 0,6 g/ml et avec le réacteur de

500 ml, il est de l’ordre de 0,27 g/ml (pour une masse de 30 g). Expérimentalement, le tassage

est beaucoup plus difficile avec la grande colonne. On a donc moins de « vide » pour le

premier cas ce qui favorise l’extraction (Pronyk et Mazza, 2009).

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

g de solvant (CO2 éthanol) / g de matière

30 g (masse totale)

30 g (lipides totaux)

30 g (PL)

6 g (masse totaux)


6 g (PL)


- 129 -

De plus, le ratio longueur de lit par rapport au diamètre de colonne est de 10 avec la

colonne de 10 ml et de 1,6 celle de 500 ml. Les effets de bords (des parois de la colonne) ne

sont pas les mêmes, ce qui entraine des modifications des profils de vitesse du flux de solvant

différents selon le réacteur utilisé. Ce ratio est important pour les opérations de montée en

échelle (Pronyk et Mazza, 2009).

Ensuite, le flux de solvant pour la colonne de 500 ml se fait de haut en bas et

inversement pour la colonne de 10 ml. Le sens de passage du solvant peut influer sur

l’extraction (Rodriguez et al., 2008). La direction du flux a notamment un impact sur le

compactage du lit et donc la mise en contact du solvant et de la matière première.

Le Tableau III-21 présente la comparaison des résultats d’extraction obtenus pour

chaque condition opératoire testée.

T (°C)

Co-solvant

% massique de co-solvant

dans le flux d’extraction

mg de PL extrait / g de matière

déshuilée

mg de lipides totaux extrait / g de

matière déshuilée

mg extrait total / g de matière déshuilée

10 ml 500 ml 10 ml 500 ml 10 ml 500 ml

27 ± 1 éthanol 30 18,86 12,7 24,0 20,55 54,57 60,68 45 ± 1 éthanol 15 11,87 6,93 14,9 10,79 20,59 19,01 45 ± 1 éthanol 30 19,56 13,94 22,4 20,85 57,95 51,39 27 ± 1 isopropanol 50 8,08 4,79 8,08 4,71 8,88 8,84

Tableau III-21: Comparaison des résultats obtenus avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar)

A 250 bar, 45°C, on extrait deux fois plus de matière (PL et lipides totaux) à 30 %

d’éthanol qu’à 15 %, quel que soit le volume de réacteur utilisé. On retrouve avec le réacteur

de 500 ml, le fait que l’isopropanol est moins efficace pour extraire les lipides.

De manière générale, pour ce qui est de la partie lipidique, les quantités de PL

extraites sont significativement inférieures avec le réacteur de 500 ml quelles que soient les

conditions opératoires. Par contre, les masses totales extraites sont assez proches. D’un point

de vue rendement, il semblerait que les conséquences d’une augmentation d’échelle

interviennent principalement sur la partie lipidique de l’extrait. Ceci suggère que la partie non

lipidique serait plus facilement extractible. Il en résulte que la « qualité » des extraits (la

pureté) est impactée et qu’elle est moins bonne avec le réacteur de 500 ml.


- 130 -

III.3.2 Utilisation d’un réacteur agité de 250 ml

La seconde transposition est réalisée en modifiant le type de réacteur. En effet, dans

cette partie, en plus d’augmenter la charge de 6 g à 15 g (ou 30 g), un réacteur agité est utilisé

pour l’extraction. Contrairement aux dispositifs expérimentaux précédemment utilisés qui

possèdent tous un fonctionnement relativement simple, les réacteurs agités ont un

comportement hydrodynamique qui peut varier en fonction des conditions opératoires et de

d’agitation. Par conséquent, avant la présentation des résultats d’extraction, cette partie débute

par une étude succincte de la caractérisation du réacteur utilisé. Les détails sont présentés en

annexe.

III.3.2.1 Caractérisation du réacteur agité : étude hydrodynamique (DTS)

L’approche théorique de la caractérisation des réacteurs utilise le concept de réacteur

idéal faisant appel à deux types d’écoulement simples (en régime permanent) :

� l’écoulement piston caractérisé par un temps de séjour unique pour toutes les

molécules ;

� l’écoulement en mélange parfait où les temps de séjour sont a priori très

différents d’une molécule à l’autre et où l’on suppose la composition uniforme

en tout point.

Les molécules séjournent en réalité dans le volume réactionnel pendant des temps

variés qui dépendent notamment du profil hydrodynamique et de la géométrie du réacteur. Il

existe donc une DTS E(t) correspondant à la répartition des différents temps passés dans le

réacteur de toutes les molécules. En particulier nous avons, E(t) x dt la fraction du débit de

sortie contenant des molécules ayant séjourné un temps t dans le réacteur. Pour déterminer

une DTS, on introduit dans le système un traceur (qui ne modifie pas l’hydrodynamique du

milieu) selon une fonction de type « échelon » ou « impulsion » et l’on suit en sortie les

modifications de la fonction.

Le principe pour l'établissement d'une fonction de DTS est le suivi au cours du temps

de la concentration en sortie de l'installation que l’on normalise en divisant par la

concentration totale. Mathématiquement cela correspond à :

s(F) = �(F)t �(F)DF∞

/


- 131 -

Etudier la DTS correspond donc à une caractérisation de l’écoulement au sein d’un

milieu par une étude statistique des temps passés par chaque molécule.

On mesure le temps passé pour un élément du fluide entre l’entrée et la sortie du

réacteur. Par intégration de l’ensemble des différents éléments, on obtient la DTS. Certaines

hypothèses sont faites :

� Le système est en état stationnaire

� Le fluide considéré est incompressible

Il existe deux cas idéaux, le réacteur tubulaire (ou piston) et le parfaitement agité

(RAC). Le premier n’a qu’une fonction retardatrice (tout ce qui est injecté à l’entrée se

retrouve à la sortie après un certain temps). Toutes les molécules ont le même temps de séjour

qui correspond au temps de séjour moyen (τ) donné par le rapport entre le volume réactionnel

Vr sur le débit volumique d’entrée Q.

u = %=v

Pour un réacteur parfaitement agité continu, lors de l’introduction au temps t= 0 d’un

échantillon nb0 moles de traceur dans le réacteur nous avons :

�(F = 0) = 7S/%@

Avec C concentration du traceur et Vr Volume du réacteur.

Le milieu étant parfaitement agité, la composition est identique en tout point du

réacteur en particulier en sortie. L’équation bilan en traceur conduit à la relation suivante :

%= × D�(F)DF = −v × �(F)

Ce qui donne, par résolution de cette équation différentiel :

�(F) = �(F = 0) × E'JZUx

Puis s(F) = yx × �(F)


- 132 -

La Figure III-19 représente la DTS pour trois cas (I= RAC, II = Piston et III= Réacteur

réel).

Figure III-19 : DTS d’un réacteur piston, agité et réel

D’après la Figure III-19, on peut voir que la distribution des temps de séjour du

réacteur parfaitement agité est de type exponentiel décroissante. Nous avons donc, dans ce

cas, « instantanément » en sortie des molécules. Pour un réacteur piston, on obtient le même

échantillon introduit initialement mais « décalé », « retardé » d’un temps τ. Le comportement

d’un réacteur réel est intermédiaire entre ces deux cas. Connaître la DTS d’un réacteur est un

élément nous permettant d’optimiser son utilisation.

Dans le cas du réacteur agité utilisé dans cette étude, les trois paramètres qui

influencent de manière importante les DTS sont le débit d’entrée, le panier et la vitesse

d’agitation:

Le débit d’entrée : C’est celui qui a la plus grande influence. Il a été étudié à [5, 10, 15

et 25 ml/min]

Le panier : Deux paniers de dimension identique mais ayant des porosités différentes

(1mm et 200 µm) ont été testés. Ils seront désignés dans le tableau par [petite et grosse

maille]

La vitesse du mobile d’agitation : Elle peut varier de 0 à 1500 tr/min, l’agitateur

homogénéise le milieu et modifie le régime [100, 200 et 500 tr/min]. On se restreint à ces

valeurs pour des raisons techniques.


- 133 -

La Figure III-20 présente les DTS d’un réacteur agité (I), piston (II), réel (III)

(Villermaux, 1994) et celles obtenues avec deux paniers différents. Ils diffèrent par la taille de

leurs mailles qui est soit « petite » (taille caractéristique : 200 µm) soit « grande » (taille

caractéristique : 1 mm).

Figure III-20 : Courbes de DTS d’un réacteur parfaitement agité (I), piston (II) et réel (III) (VILLERMAUX, 1994) et comparaison de l’influence du panier sur la DTS du réacteur agité

Les résultats expérimentaux sont détaillés en annexe. Pour avoir un comportement qui

se rapproche de l’idéalité, nous avons donc choisi de travailler avec le panier « grosse

maille ». Les notions théoriques et les détails de ce travail sont présentés en annexe 4. A

présent, le réacteur peut être considéré comme parfaitement agité.

III.3.2.2 Modes opératoires proposés

Nous avons envisagé trois protocoles opératoires (Mode) qui pourraient avoir des

effets favorables pour l’extraction. Nous rechercherons le mode d’extraction qui présente le

meilleur compromis entre performance (le plus de phospholipides) et pureté (moins de lipides

non phospholipidiques dans l’extrait).

Pour l’ensemble de ces essais, nous avons procédé à 8 récupérations d’extrait à

intervalle de temps réguliers (20 min) en prenant pour temps initial le début de sortie

d’éthanol. Nous avons choisi arbitrairement les conditions indiquées dans le Tableau III-22

(correspondant à Pls36), les débits de CO2 et d’éthanol étant choisis en fonction de

caractéristiques des pompes du montage.


- 134 -

P (bar) T (°C) Débit CO2

(g/min)

Débit éthanol (g/min)

% massique d’éthanol

dans le flux d’extraction

Masse de matière

déshuilée introduite (g)

250 45 7 3 30 15

Tableau III-22: Conditions opératoires des essais de transpositions au réacteur agité

Comme il a été décrit II.3.3.3, le réacteur possède un panier poreux de 125 ml (taille

de maille : 1 mm) qui accueille la matière première, c’est donc lui qui détermine la charge. De

plus, il faut tenir compte du volume occupé par la pale d’agitation. Une charge de 15 g est

choisie car elle permet de ne pas remplir complètement le panier et d’assurer une bonne

agitation. Le schéma du montage expérimental est rappelé Figure III-21.

Figure III-21 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g)

Mode A : Pressurisation avec du CO2-éthanol et phase d’isolement de 20 min

A l’état initial, le réacteur est à pression atmosphérique et 45°C correspondant à la

température d’extraction. Les deux pompes CO2 et éthanol sont activées simultanément

jusqu’à atteindre 250 bar dans le réacteur. A pression atmosphérique, le mélange arrive dans

Co-solvant

Bouteille de CO2

[A]

[C]

[B] [D]

[E]

Extrait alcooliquecontenant l’extrait

Tcirc

Réacteur

purge

Psort

Préac

Tréac

Tsort

Co-solvantcontenant l’extrait

Panierporeux


- 135 -

le réacteur sous forme biphasique, avec une phase liquide riche en éthanol et une phase gaz

principalement constituée de CO2. Au fur et à mesure que la pression augmente, le mélange

devient monophasique. Etant donné que l’introduction du mélange CO2-éthanol est faite par la

pale d’agitation, la phase liquide rentre en contact direct avec la matière première. On peut

supposer qu’il y a alors l’équivalent d’une macération à l’éthanol de la charge, le temps

d’atteindre une pression à laquelle les deux solvants sont miscibles. Dans la littérature, il a été

montré qu’un prétraitement de trempage de la charge en éthanol à pression atmosphérique

était favorable à l’extraction des phospholipides (Dunford et Temelli, 1995).

Une fois la pression de 250 bar atteinte, le réacteur est isolé pendant 20 min afin de

permettre la diffusion des espèces dans le milieu extractant.

Mode B : Pressurisation au CO2 pur et pas de phase d’isolement

Le réacteur est pressurisé à 250 bar en utilisant du CO2 seul, puis les deux pompes

sont activées et les vannes de sortie sont ouvertes. Il n’y a pas de période statique. Etant donné

que nous avons un réacteur de type agité, le pourcentage d’éthanol va évoluer au sein du

réacteur. En effet, durant les premiers instants, nous avons en sortie un flux avec un faible

essentiellement composé de CO2 pur puisque les premiers volumes de co-solvant introduits

sont immédiatement répartis dans le réacteur. Par ailleurs, le temps pour atteindre la

composition d’éthanol fixée est de l’ordre de 3 temps de séjour moyen puisque l’étude de la

DTS a montré qu’il s’agit d’un réacteur de type « parfaitement agité » ; et tant que t < 3 τ,

nous sommes en régime transitoire et l’extraction aura lieu avec une composition en éthanol

inférieure à celle visée. Au delà, le régime permanent devrait s’établir à la composition égale

à celle du binaire CO2 + éthanol imposé par les pompes. Dans les conditions étudiées (P = 250

bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit massique totale de 10 g/min), 3 τ moyen correspondent à

environ 75 minutes.

Mode C : Montée en pression du réacteur en CO2 pur, pied du réacteur contenant de l’éthanol

On introduit initialement une quantité de 55 ml d’éthanol dans le fond du réacteur.

Cela correspond à une hauteur d’environ 2 cm, on n’a pas de contact entre le co-solvant et la

matière première. Ce volume d’éthanol est calculé pour correspondre à une composition finale

massique à 250 bar de 30%-70% éthanol - CO2, en supposant que la totalité du volume du

réacteur (250 ml) est occupé par le fluide et que la masse volumique du mélange finale est de

930 kg.m-3 (calculée par ProPhys). On obtient une masse de solvant totale de 232 g et une


- 136 -

quantité d’éthanol de 69g.

Du CO2 pur est ensuite ajouté jusqu’à obtenir une pression de 250 bar puis le réacteur

est isolé 20 min, ensuite un flux de CO2 et d’éthanol est réalisé pour permettre la récupération

de l’extrait. Comme dans le premier protocole, pendant la phase de pressurisation, au fur et à

mesure de l’ajout du CO2, le CO2 se répartit entre une phase gaz et une phase liquide,

initialement de 100% éthanol, qui voit sa composition s’enrichir en CO2 (Figure I-13). La

phase liquide subit alors une augmentation de volume, à un moment donné, la phase

inférieure liquide contenant du CO2 et de l’éthanol entre en contact avec la matière première.

III.3.2.2.1 Résultats

Les résultats sont présentés sous deux formes : des courbes représentant les masses

cumulées en distinguant toujours les familles : masse totale extraite, lipides totaux et

phospholipides, des histogrammes expriment le contenu de chaque fraction.

Quel que soit le mode appliqué, chaque fraction correspond à des temps identiques

(F1 : 0 à 20 min, F2 : 20 à 40 min…), le temps initial correspond à l’apparition d’éthanol en

sortie. Pour chaque mode, les essais ne sont réalisés qu’une seule fois, hormis pour celui du

protocole A où ils sont répétés 3 fois.

Mode A : Pressurisation avec du CO2-éthanol et phase d’isolement de 20 min

La Figure III-22 présente les résultats obtenus avec le mode A.


- 137 -

Figure III-22 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode A, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,

T = 45°C et 30% d’éthanol)

� Evolution par fraction

La masse totale extraite diminue avec le temps de façon exponentielle, ce qui est

conforme aux résultats obtenus lors de l’étude de la DTS et au fait que le réacteur fonctionne

de manière parfaitement agité. Cependant, selon la nature de l’extrait (non lipidique, lipides

non phosphorés et PL), l’évolution temporelle est plus complexe. La masse de phospholipides

extraite diminue avec le temps de manière qui semble exponentielle. La variation de la part

des lipides non phosphorés est différente : elle diminue jusqu’à la quatrième fraction puis

augmente fortement pour diminuer à nouveau. Par conséquent, on est amené à supposer qu’il

y a une reprise de l’extraction entre les fractions 4 et 5. De plus, ce comportement nous

informe que l’extraction des lipides neutres n’est pas totalement réalisée pendant la phase

statique, contrairement à celle des phospholipides.

A part pour les fractions inférieures à 4, la quasi totalité de l’extrait est de nature

lipidique. La partie non lipidique est extraite principalement de F1 à F4, c'est-à-dire pendant

les 80 premières minutes. Cela pourrait s’expliquer par l’effet de la macération en éthanol qui

permettrait de solubiliser une matière non lipidique (polaire), ce qui entraine une extraction

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

autres (non lipidiques)


PL

masse de PL cumulée

masse de lipides totaux cumulée

masse totale cumulée


- 138 -

100 % lipidique au-delà 80 minutes.

� Evolution cumulée

Les masses cumulées sont croissantes au cours du temps, il n’y a pas de plateau

atteint. A l’issue de l’extraction, on obtient majoritairement des lipides : on a, avec ce mode

de fonctionnement, un faible pourcentage de matière non lipidique (de l’ordre de 20 – 25%).

Mode B : Pressurisation au CO2 pur et pas de phase d’isolement

La Figure III-23 présente les résultats obtenus avec le mode B.

Figure III-23 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode B, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,



Dans ce mode de fonctionnement, on constate que l’évolution des masses extraites

n’est pas aussi simple que dans le mode A. On note notamment la présence d’un « pic » de

matière non lipidique notamment dans les fractions 4 et 6. Par contre, les premières fractions

n’ont pas d’espèces non lipidiques. Ceci est la conséquence d’une augmentation croissante de

la proportion d’éthanol dans le réacteur. Etant donné qu’elle commence par être faible au

0

10

20

30

40

50

60

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

autres (non lipidques)


PL





- 139 -

début, on extrait préférentiellement des lipides avec un mélange CO2-éthanol (à faible

proportion). Ensuite, la proportion d’éthanol est suffisamment importante pour permettre

l’extraction de la partie non lipidique, qui est majoritairement présente dans la fraction 4, qui

devrait correspondre au moment où le pourcentage d’éthanol doit commencer à être constant.

On a une extraction importante de matière non lipidique à partir de ces fractions probablement

car c’est la matière la plus facilement disponible.


On observe une augmentation de la masse totale extraite, qui est plus rapide après la

contribution de F4. L’avantage de ce protocole est la faible proportion de fractions non

lipidiques au début de l’extraction. Dans ce cas ci, on obtient un extrait qui contient

majoritairement des espèces non lipidiques.

Mode C : Montée en pression du réacteur en CO2 pur, pied du réacteur

contenant de l’éthanol

La Figure III-24 présente les résultats obtenus avec le mode C.


- 140 -

Figure III-24 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode C, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar,



Ce comportement d’extraction se rapproche de celui du mode A, cohérent avec un

mode de pressurisation impliquant un système biphasique, avec une phase liquide qui imbibe

en partie la matière première. La différence dans les résultats réside dans le fait qu’une

matière non lipidique est extraite tout au long de l’extraction alors que dans les précédents

modes, les fractions 1 et 2 en contenaient peu (correspondant à 40 minutes d’extraction).


Dans ce cas de figure, on a un comportement encore différent par rapport uax deux

autres modes. La masse et la proportion de phospholipides diminuent avec le temps. On

remarque que dans la première fraction, il n’y a pas de lipides non phosphorés.

III.3.2.2.2 Comparaison des trois modes

Quand on compare les trois modes, ce qui est remarquable c’est la cinétique

d’extraction des phospholipides qui est assez peu sensible au protocole contrairement à ce qui

est observé pour les autres lipides et pour les composés non lipidiques.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re



PL





- 141 -

Le Tableau III-23 présente les quantités de matière totale, de lipides et de

phospholipides extraites par gramme de matière première et les rapports masses de

phospholipides divisée par la masse totale extraite ou par la masse de lipides totaux.

Mode

mg de masse totale extraite / g de matière

déshuilée

mg de lipides totaux extraite / g de matière

déshuilée

mg de PL extraite / g de


RPL/ext RPL/lip

A (pressurisation

au CO2+éthanol)

45,94 35,73 12,08 0,26 0,34

B (CO2 pur puis CO2 éthanol)

46,81 22,18 6,82 0,15 0,31

C (éthanol au

pied du réacteur)

47,48 26,84 10,12 0,21 0,38

Tableau III-23 : Quantités totales extraites avec les trois modes sur l’ensemble des 8 fractions

Les quantités totales extraites sont similaires quel que soit le mode d’extraction

envisagé. Dans le mesure où nous cherchons le mode d’extraction qui conduit au meilleur

compromis entre performance (le plus de phospholipides) et qualité (moins de lipides non

phospholipidiques dans l’extrait), le mode B peut d’ores et déjà être écarté dans la mesure où

nous avons une quantité de PL extraite faible : 6,8 mg de PL par g de matière première. Par

ailleurs, sa pureté est médiocre : 15% de PL, 32% de lipides non phosphorés et 53% d’espèces

non lipides (Figure III-23).

Les modes A et C se différencient peu lorsqu’on considère le processus global

d’extraction. Néanmoins, si on analyse plus finement ce qui se passe aux niveau des fractions,

on note qu’on obtient, avec le mode A, sur les 5 premières fractions une pureté élevée et une

quantité de PL importante qui ne sont atteintes que sur les 8 premières fractions avec le mode

C (Tableau III-24). Le choix du mode A permet ainsi d’arrêter la collecte des échantillons

après 100 min d’extraction.

Mode RPL/ext RPL/lip A après 5 fractions 0,41 0,62 C après 8 fractions 0,27 0,60

Tableau III-24 : Qualité des extraits des modes A et C, respectivement pour les fractions 1 à 5 et 1 à 8

Le Tableau III-25 compare les rendements des extractions réalisées avec le réacteur


- 142 -

tubulaire de 10 ml et celles réalisés avec le réacteur agité (250 ml) en mode A.

Réacteur

mg de PL extraite / g de


mg de lipides totaux

extraite / g de matière

déshuilée

mg de masse totale extraite / g de matière

déshuilée

g de solvant / g de matière

déshuilée

Agité (250 ml) : Mode A

12,08 35,73 45,94 53,1

Tubulaire (10 ml)

19,26 35,50 51,79 30,4

Tableau III-25 : Comparaison des résultats obtenus avec le réacteur agité de 250 ml et le réacteur tubulaire de 10ml

Les quantités de solvant (CO2-éthanol) utilisées pour le réacteur agité sont supérieures

par rapport à celles du réacteur tubulaire. Les quantités extraites sont similaires sauf pour les

phospholipides où le réacteur tubulaire se révèle être plus efficace. Il est possible que les

phospholipides soient moins « accessibles » dans le réacteur agité, ce qui sous entend un

transfert de matière plus lent dans ce réacteur.

III.3.2.2.3 Amélioration du mode A

� Ajout de billes de verre

Sur les trois modes testés, une fois l’extraction réalisée, à l’ouverture du réacteur, nous

constatons que la matière première reste agrégée sur le mobile d’agitation en formant un

« gâteau » (Figure III-25), ce qui peut nuire au transfert de matière. Pour éviter la formation

de ce « gâteau », il est possible de faire un pré-mélange de la matière première avec des billes

de verre.


- 143 -

A B

Figure III-25 : Photographie de la matière première après extraction sans bille (A) et avec

ajout de billes de verre (B)

Après ajout de billes, on constate que la poudre est alors plaquée contre les parois du

panier (Figure III-25). Cela devrait améliorer l’extraction dans la mesure où la couche de

matière doit être traversée et que l’introduction du solvant dans le milieu par le mobile sera

facilitée.

� Augmentation de la charge

Cette partie n’est pas une optimisation à proprement parler. En effet, lors de nos

premiers essais, nous avons pu constater que le rendement d’extraction était inférieur à ceux

obtenus avec le réacteur tubulaire de « petit volume ». Nous avons décidé de travailler sur une

masse initiale introduite de 30 g pour augmenter les quantités de PL recueillies en sortie.

� Augmentation de la phase statique

Le protocole que l’on a mis en place prévoit une phase d’isolement du réacteur

pendant laquelle l’extraction peut se produire. Elle était initialement de 20 min, elle a été

multipliée par 3.


- 144 -

La Figure III-26 présente les résultats obtenus par fraction et en masses cumulées. La

comparaison avec la fraction 1 en mode A (Figure III-22), il semble que la matière première

ait tendance à absorber l’éthanol dans le mode A « optimisé », ce qui se traduit par un

rendement moindre sur cette fraction.

Figure III-26 : Répartition des masses extraites par fraction pour le mode A « optimisé » en réacteur agité (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol)

En revanche, ce « retard » à l’extraction de modifie pas de manière importante les

proportions des 3 familles extraites : espèces non lipidiques, lipides non phosphorés dans les

premières fractions (Tableau III-26). En revanche, à partir de la fraction 4, les fractions

obtenues par le mode A « optimisé » ou non sont nettement différentes en termes de

composition.

0

5

10

15

20

25

30

35

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re



PL


masse de lipîdes totaux cumulée



- 145 -

Tableau III-26 : Masse de PL extraite par g de matière déshuilée et répartition des familles (PL, lipides non phosphorés et espèces non lipidiques) de l’extrait pour chaque fraction, Mode A (sans bille, temps d’isolement de 20 min et 15 g de matière déshuilée et Mode A

« optimisé » (ajout de billes en verre, temps d’isolement de 60 min et 30 g de matière déshuilée)

De manière générale, les modifications apportées au mode A ne permettent pas

d’augmenter le rapport PL / matière grasse déshuilée (12,0 mg/g pour le mode A et 6,1 pour

mg/g pour le mode A « optimisé ») comme espéré même si on obtient en fin d’extraction la

même quantité de PL.

Fraction

g extrait / g de matière totale extraite (%)

Mode A Mode A « optimisé »

Espèces non lipidiques 21 20

F1 Lipides non phosphorés 46 53

Phospholipides 33 27




















F8 Lipides non phosphorés 56 0 Phospholipides 13 9

mg de PL extrait / g de matière déshuilé

12,0 6,1


- 146 -

III.4 Variantes du procédé d’extraction

L’extraction des phospholipides s’accompagne de la co-extraction d’autres composés

lipidiques et non lipidiques. Par ailleurs, la législation française limite l’utilisation de solvants

dans les procédés traitant des matières destinées à l’alimentation humaine. Ainsi, des

quantités d’éthanol supérieures à 30% ne sont pas autorisées pour une application alimentaire.

Pour élargir les possibilités d’application de cette technique, deux autres essais sont réalisés

avec le montage expérimental comprenant le réacteur tubulaire de 500 ml. Le premier a pour

objectif d’obtenir des extraits plus sélectifs en réalisant une extraction en deux étapes, l’une

avec 15% d’éthanol l’autre avec 30%, et le second doit permettre une application alimentaire

en utilisant un mélange eau-éthanol (70%-30%).

III.4.1 Fractionnement de l’utilisation de l’éthanol

La sélectivité de l’extraction dépend du pourcentage d’éthanol utilisé comme il a été

vu au paragraphe III.2.2.4. A 15% d’éthanol, on extrait une quantité non négligeable

d’espèces non lipidiques avec une perte en PL faible (ce pourcentage correspondant au

rendement d’extraction de la matière totale le plus faible). On propose une extraction en deux

temps : le premier avec un pourcentage d’éthanol de 15% pour la première fraction (20

premières minutes) de manière à éliminer des d’espèces non lipidiques et le second avec 30%

d’éthanol pour le reste des fractions. Le Tableau III-27 donne les conditions opératoires

utilisées.

Phase Réacteur P (bar) T(°C)

Masse initiale de matière

déshuilée (g)

Débit de CO2

(g/min)

Débit éthanol (ml/min)


mélange

Temps de

collecte (min)

Tubulaire 500 ml

250 ± 5 45 ± 1 30 7

1 1,5 15 0 - 20

2 3,7 30 20 - 160

Tableau III-27 : Conditions opératoires extraction en deux temps avec le réacteur tubulaire 500 ml

La Figure III-27 présente les résultats obtenus (masse cumulée) et rappelle ceux

obtenus pour des extractions réalisés séparément avec 15 et 30 % d’éthanol.


- 147 -

Figure III-27 : Courbes d’extraction en mode fractionné (15 puis 30% d’éthanol) et à pourcentage d’éthanol fixe (P = 250 bar, T = 45°C, réacteur tubulaire de 500 ml avec 30 g

de matière déshuilée, débit de CO2 = 7 g/min, débit éthanol = 3 g/min et 1,2 g/min pour respectivement 30 et 15% d’éthanol)

Les courbes d’extraction présentent des profils similaires à savoir une forte

augmentation en début de cinétique puis un ralentissement jusqu’à un plateau. Pour la masse

totale extraite, sur les 50 premières minutes pour l’essai en mode fractionné et celui à 15%,

les courbes sont identiques. Puis la courbe en mode fractionné rejoint celle obtenue à 30%.

Pour les phospholipides, les courbes en mode fractionné et à 15 % sont identiques tandis que

celle à 30% est deux fois plus élevée. L’extraction des lipides totaux en mode fractionné est

intermédiaire entre les extractions à 15 et 30% d’éthanol.

La Figure III-28 suivante présente la répartition de la masse totale extraite pour chaque

fraction.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

Ma

sse

to

tale

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)

extraction en mode fractionnée: 15% puis 30% d'éthanol

extraction à 15% d'éthanol

extraction à 30% d'éthanol

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200

Ma

sse

de

lip

ide

s to

tau

x e

xtr

ait

e

(mg

) /

g d

e m

ati

ère

Temps (min)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150 200

Ma

sse

de

PL

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

Temps (min)


- 148 -

Figure III-28 : Répartition des PL, lipides non phosphorés et matière non lipidique pour les extractions en mode fractionné, et séparément à 15 % et 30 % d’éthanol

En mode fractionné, et pour une fraction collectée donnée, la proportion de

phospholipides est généralement inférieure aux conditions utilisant l’éthanol à 15 ou 30%,

séparément. Contrairement à notre hypothèse de départ, les espèces non lipidiques sont

systématiquement plus présentes dans les fractions obtenues en mode d’extraction fractionné.

Avec cet essai, on s’aperçoit que l’extraction des phospholipides dépend des

paramètres opératoires : l’application de 15% d’éthanol au système induirait des

modifications dans la matrice de sorte que même en repassant à 30% on ne récupère pas tous

les PL escomptés. Les mécanismes de transfert de matière sont surement complexes puisqu’en

revanche, en mode d’extraction fractionné, on récupère une masse extraite du même ordre de

grandeur que celle obtenue à 30%. Cela suggère que de nouvelles espèces non lipidiques sont

extraites.

III.4.2 Utilisation d’un mélange eau-éthanol comme co-solvant

Dans cette partie, une extraction est réalisée en utilisant un mélange eau-éthanol (70%

- 30%, massique) en tant que co-solvant. Le Tableau III-28 fournit les conditions opératoires

utilisées.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

F1 (

frac

tio

nn

é)

F1 (

15

%)

F1 (

30

%)

F2 (

frac

tio

nn

é)

F2 (

15

%)

F2 (

30

%)

F3 (

frac

tio

nn

é)

F3 (

15

%)

F3 (

30

%)

F4 (

frac

tio

nn

é)

F4 (

15

%)

F4 (

30

%)

F5 (

frac

tio

nn

é)

F5 (

15

%)

F5 (

30

%)

F6 (

frac

tio

nn

é)

F6 (

15

%)

F6 (

30

%)

F7 (

frac

tio

nn

é)

F7 (

15

%)

F7 (

30

%)



PL


- 149 -

P (bar)

T (°C)

Masse Initiale

(g) % CO2

% massique

co-solvant dans le

mélange

Débit CO2

(g/min)

Débit co-solvant (eau-éthanol/70%-

30%) (g/min)

Réacteur

250 45 30 70 30 7 3 Tubulaire 500

ml

Tableau III-28 : Conditions opératoires extraction avec un mélange eau-éthanol

La Figure III-29 présente une photographie des extraits obtenus. Par rapport aux

extractions CO2-éthanol, la coloration des extraits est plus foncée pour les 3 premières

fractions mais diminue fortement après pour devenir jaune très clair.

Figure III-29 : Extrais obtenus avec un mélange eau-éthanol (70-30% massique) comme co-solvant (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 7 g/min, débit de co-solvant = 3,7 ml/min)

Le Tableau III-29 présente les masses extraites ainsi que sa répartition

(phospholipides, lipides neutres et non lipides). Il apparait que plus de 98% dans les extraits

sont représentés par des espèces de nature non lipidique, ce qui n’a jamais été atteint dans les

extractions précédentes. Dans les conditions de pression et de température utilisées, le

mélange eau-éthanol est diphasique. L’eau n’extrait pas les lipides hydrophobes.


- 150 -

Masse (mg) F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Lipides non phosphorés

58 25 - - - - - -

Phospholipides 62 14 - - - - - -

Non lipidiques 8487 2347 873 380 194 382 280 124

Tableau III-29 : Répartition de la masse extraite pour l’extraction avec un mélange eau-éthanol comme co-solvant

Ce type d’extraction peut être une solution pour améliorer la pureté des extraits en la

faisant suivre d’une extraction au CO2-éthanol. En effet, elle s’apparente à une étape

d’élimination des éléments indésirables (hydrophiles) en limitant la perte en lipides.

Cependant, après une extraction avec le mélange eau-éthanol, le lit de matière est saturé en

eau et une étape de séchage doit donc être réalisée.

Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique

- 151 -

IVChapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines

par voie supercritique


- 152 -

Ce chapitre vise à élaborer des liposomes à partir de phospholipides d’origine marine.

La première partie traite de l’aptitude des PL extraits de la coquille Saint-Jacques à

s’agencer en liposomes. En effet, la présence d’espèces non phospholipidiques (hydrophiles

ou hydrophobes) peut nuire à la formation de bicouches malgré une forte proportion de PC

parmi les PL (Annexe), PC connue pour son aptitude à former spontanément des liposomes.

Pour cette approche, nous avons utilisé une technique conventionnelle de formation de

liposomes (hydratation d’un film de lipides et agitation).

Comme présenté dans le chapitre bibliographique (I.1.3), l’assemblage des PL sous

forme de liposomes nécessite la présence d’eau. Dans le cadre de la mise en forme de ces

structures par voie supercritique, cela suppose donc une connaissance du diagramme de

composition du mélange quaternaire CO2-éthanol-eau-PL. L’établissement d’un diagramme

quaternaire est long et complexe, seuls plusieurs types d’information nous intéressent pour la

mise au point du procédé :

• Le diagramme ternaire CO2-éthanol-eau, nécessaire pour connaître la

miscibilité des constituants en fonction des conditions T, P

• Le comportement macroscopique des PL dans le milieu CO2-éthanol-eau : Y a-

t-il précipitation des PL lorsque l’eau est ajoutée à CO2-éthanol-eau ?

La seconde partie vise à répondre à ces questions. Dans la mesure où nous ne

disposons pas de quantités importantes de PL extraits de la coquille Saint-Jacques, ces études

sont réalisées sur une lécithine marine commerciale. Par ailleurs, ces études sont complétées

par une étude dynamique de l’injection d’eau dans un flux CO2-éthanol par microfluidique

(collaboration avec l’Institut de la Chimie et de la Matière Condensée de Bordeaux

Dans une troisième partie, des résultats sur les essais de couplage entre l’extraction de

PL et la mise en forme de liposomes sont présentés.

La dernière partie concerne une étude de modification de taille de liposomes par voie

supercritique.


- 153 -

IV.1 Mise en forme des extraits obtenus par voie supercritique

Nous travaillons sur les 3 premières fractions (F1, F2 et F3 correspondant

respectivement à : 0 à 20 min, 20 à 40 min et 40 min à 60 min de l’extraction) obtenues avec

le réacteur de type tubulaire de 500 ml à différentes conditions de pression, débit et de masse

de matière déshuilée initialement introduite. On dispose ainsi de fractions caractérisée par des

proportions variables de PL par rapport à la masse totale de l’extrait et par rapport aux lipides

totaux (Tableau IV-1).

Les « liposomes » (ou tout autre objet) sont préparés par hydratation d’un film de

lipides. Il est important de noter que la concentration en phospholipides est fixée à 5 mg/ml

pour tous les essais. Par conséquent, selon les extraits, la concentration en espèces « autres »

(espèces lipidiques non phosphorées ou espèces polaires) varie.

Pour déterminer s’il y a présence ou non de liposomes des observations au microscope

optique sont réalisées. Nous avons fait le choix de ne pas mesurer de distribution

granulométrique car elle pourrait être faussée par la présence d’autres objets non lipidiques

dans nos dispersions.

D’une manière générale, les échantillons sont turbides après hydratation. Leur

coloration est d’intensité variable (Figure IV-1). Par ailleurs, au cours du temps, on observe

une sédimentation dans tous les échantillons.


- 154 -

Figure IV-1 : Echantillons réalisés à partir d’extraits obtenus par voie supercritique

Les observations microscopiques révèlent la présence d’agrégats sur l’ensemble des

dispersions. Nous avons pu créer 3 catégories de conclusion pour les différents clichés

réalisés :

� Les clichés sont vides : soit la taille des objets formés est inférieure à la limite

de résolution du microscope optique (300 nm), soit il n’y a pas d’objet formé.

� Présence de liposomes : Des vésicules lipidiques sont observées. Il s’agit

majoritairement de MLV de formes sphérique et ellipsoïdale. La taille des

objets varie entre quelques µm et 10-15 µm (Figure IV-2)

Sédiments

échantillon après

agitation


- 155 -

Figure IV-2 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls I F2

� Emulsion huile dans eau: On observe de nombreuses et très petites gouttes et

quelques unes plus grosses (Figure IV-3).

Figure IV-3 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls K F1

agrégat

Goutte

d’huile

MLV


- 156 -

Extraction [masse de matière

déshuilée (g)]

Fraction T (°C)

%massique de co-

solvant dans le mélange

Masse de PL (g) /

g de lipides totaux

Masse de PL (g) /

g de masse totale

extraite

R L E

LipoplsI** [30]

F1 45 30 0,75 0,51 � F2 45 30 0,78 0,38 � F3 45 30 0,69 0,17 �

LipoplsJ** [15]

F1 45 30 0,75 0,51 � F2 45 30 0,78 0,38 � F3 45 30 0,69 0,17 �

LipoplsK** [60]

F1 45 30 0,50 0,38 � F2 45 30 1,00 0,51 � F3 45 30 0,66 0,30 �

LipoplsL** [30]

F1 27 30 0,67 0,46 � F2 27 30 0,79 0,29 � F3 27 30 0,64 0,11 �

LipoplsM** [30]

F1 45 15 0,33 0,23 � F2 45 15 0,90 0,41 � F3 45 15 0,75 0,38 �

LipoplsN** [30]

F1 27 30 0,62 0,56 �

F2 27 30 0,88 0,32 � F3 27 30 0,66 0,16 �

LipoplsP** [30]

F1 45 30 0,29 0,22 � F2 45 30 1,00 0,69 � F3 45 30 0,73 0,46 �

LipoplsQ* [30]

F1 27 50 0,79 0,64 � F2 27 50 0,80 0,58 � F3 27 50 0,95 0,46 �

Tableau IV-1 : Structures observées après hydratation des extraits obtenus par voie supercritique (F1, F2 et F3 : 1ère, 2ème et 3ème fractions, P = 250 bar, R : pas d’objets visibles,

L : liposomes, E : émulsion huile dans eau, * co-solvant : isopropanol et ** co-solvant : éthanol)

La majorité des extraits obtenus par voie supercritique permettent la mise en forme de

liposomes. On remarque qu’une proportion importante d’espèces non lipidiques dans l’extrait

ne semble pas rédhibitoire à la formation de liposomes puisqu’il est possible d’en former

même moins de 20% de phospholipides (Lipopls I F3, J F3, L F3). On constate qu’à chaque

fois, il s’agit à des fractions 3, qui sont plus pauvres en PL.

Pour les clichés où aucun objet n’est visible en microscopie optique, le taux élevé de

PL dans les extraits suggère qu’il y aurait une formation de liposomes mais de très petites

tailles. La taille finale des liposomes pourrait être conditionnée par la nature des espèces co-

extraites avec les PL.


- 157 -

Les extraits qui conduisent à des émulsions ont une composition en PL faible par

rapport aux lipides totaux (inférieure à 50%). On suppose que les PL présents servent à

stabiliser les structures engendrées par les lipides non phosphorés.

IV.2 Etude du mélange CO 2-éthanol-eau-phospholipides

IV.2.1 Diagramme de phase CO 2-éthanol-eau-lécithine sous pression

Il s’agit d’observer au niveau macroscopique un mélange contenant du CO2, de

l’éthanol, de l’eau et une lécithine marine commerciale, sous pression. L’objectif est de

connaître la ou les proportions pour lesquelles il y a une précipitation ou tout autre

phénomène (agrégation par exemple).

D’après l’étude portant sur l’extraction des phospholipides, les conditions opératoires

envisagées sont P = 250 bar, T = 27°C ou 45°C et 30% éthanol (massique). La cellule

d’observation haute pression utilisée ici a une limitation de 150 bar, c’est donc à cette

pression que l’on travaille. Les deux températures 27°C et 45°C sont testées.

Le Tableau IV-2 présente l’aspect initial des mélanges d'eau, éthanol et lécithine

initiaux introduits dans la cellule de mesure pour les différents % d’éthanol testés avant ajout

du CO2.

Mélange % massique d’éthanol Aspect initial Mél. 5 0,0 Turbide Mél. 4 15,7 Turbide Mél. 3 42,1 Turbide Mél. 2 83,3 Limpide Mél. 1 95,0 Limpide

Tableau IV-2 : Compositions massiques en éthanol et aspect macroscopique des mélanges introduits dans la cellule

Cinq ajouts successifs de CO2 sont réalisés. Les échantillons sont agités pendant 5

minutes après chaque ajout et observés visuellement. Après le dernier ajout de CO2,

l’agitation est maintenue 30 min. La Figure IV-4 présente sur un diagramme ternaire les

compositions du mélange après chaque ajout de CO2, la quantité de lécithine n’étant pas prise

en compte dans le calcul des proportions. Le point de départ des mélanges se situe sur l’axe

éthanol-eau et chaque composition est représentée par un point sur la droite d’évolution des

compositions du mélange. La courbe rouge représente la limite entre le milieu monophasique


- 158 -

(partie supérieure) et diphasique (composée de deux liquides). Elle est calculée grâce au

modèle de thermodynamique MHV 2 (Modified Huvon-Vidal mixing rule). Il n’y a pas de

modification significative du diagramme ternaire pour les 2 températures étudiées (27 ou

45°C).

Figure IV-4 : Evolution des compositions des mélanges après chaque ajout de CO2

Le Tableau IV-3 présente les compositions finales des mélanges juste avant

dépressurisation.

Mélange % de CO2 % d’éthanol % d’eau Mél. 5 58,0 0,0 42,0 Mél. 4 58,0 6,5 35,5 Mél. 3 58,0 17,5 24,5 Mél. 2 58,0 35,0 7,0 Mél. 1 58,0 40,0 2,0

Tableau IV-3 : Compositions finales (après les 5 ajouts de CO2) des mélanges étudiés

MHV2

conodales cal.MHV2

sol.5

sol.4

sol.3

sol.2

sol.1

0.1

0.7

0.6

0.50.40.30.20.1

1.0

0.2

0.3

0.4

0.50.5

0.6

0.6

0.7

0.7

0.8

0.8

0.8

0.9

0.9

0.9

0.1

0.2

0.3

0.4

0.0

0.0

0.01.0

1.0

XCO2

XEau (Massique)

XEt

EAUCO2

Ethanol

15.2MPa27 C

Mél.5

Mél.4

Mél.3

Mél.2

Mél.1


- 159 -

� Mélanges riches en éthanol (% massique initial > 80%)

Les compositions finales des mélanges riches en éthanol sont respectivement de 58%

de CO2, 40% d’éthanol et 2% d’eau et 58% de CO2, 35% d’éthanol et 7% d’eau pour les

mélanges 1 et 2. La lécithine initialement soluble dans les mélanges reste solubilisée en

présence de CO2 : il n’y a pas de changement de phase. Nous n’avons pas observé l’apparition

de mousse pendant la dépressurisation.

� Mélanges pauvres en éthanol (% massique initial < 45%)

Les mélanges (3 à 5) sont turbides avant traitement, deviennent plus clairs lors de

l’introduction du CO2. Lors de la détente, le système redevient turbide et de la mousse

apparait. Une observation microscopique des échantillons avant et après traitement par du

CO2 ne fait pas apparaitre de différences de morphologie des objets. La modification d’aspect

pendant l’ajout de CO2 traduit une réorganisation des espèces au sein du mélange.

L’éthanol qui est miscible à la fois avec le CO2 et l’eau : il va se répartir dans chacune

des phases. Pour ces mélanges, d’après le diagramme ternaire (P = 150 bar et T = 27 ou

45°C), le système est constitué de deux phases : une phase inférieure riche en eau et une

supérieure riche en CO2 (Figure IV-5) avec des proportions finales équivalentes d’eau et de

CO2.

Figure IV-5 : Mélange 5 (58% CO2 - 42% eau, massique) à 150 bar et 45°C

Les systèmes initialement turbides supposent une organisation en bicouches puisqu’ils

contiennent des phospholipides dans un excès d’eau. Au fur et à mesure de l’introduction du

Phase supérieure riche en CO2

Phase inférieure riche en eau


- 160 -

CO2, la turbidité des systèmes disparait. Certaines études (Lesoin et al., 2011 ; Otake et al.,

2001) suggèrent que l’introduction de CO2 sur des bicouches préformées favoriserait la

formation d’une émulsion CO2/eau. La formation de liposomes se ferait au moment de la

dépressurisation. Dans notre cas, la diminution de turbidité pourrait aussi s’apparenter à la

formation de cette émulsion CO2/eau. Les phospholipides étant des espèces amphiphiles, ils

se devraient se placer naturellement à l’interface entre la phase aqueuse-éthanol et la phase

CO2-éthanol. Ainsi, la présence d’éthanol semble ne pas perturber la formation de cette

émulsion. Le phénomène d’apparition de mousse pendant la dépressurisation semble être en

accord avec une déstructuration transitoire des liposomes qui permet à une partie des PL de se

positionner à l’interface eau/air qui se traduit par l’apparition de mousse).

Par rapport à nos objectifs de mise en forme de liposomes en milieu supercritique,

nous avons mis en évidence qu’il n’y a pas de précipitation des lipides dans un mélange CO2-

éthanol-eau. De plus, la présence de PL ne modifie pas significativement les transitions

mono- et di-phasique du ternaire CO2-éthanol-eau.

IV.2.2 Etude cinétique du mélange CO 2-éthanol-eau

Les diagrammes de phases sont des données thermodynamiques donnant la

composition à l’équilibre et le volume des phases éventuellement en présence. Le couplage de

l’extraction et de la mise en forme est de type dynamique puisqu’il s’agit d’un ajout d’eau

sous pression au flux CO2-éthanol contenant l’extrait. Il est donc important de visualiser à

quoi conduit l’injection d’eau dans un flux de CO2-éthanol. Cela apportera des réponses aux

conditions à appliquer pour favoriser la mise en forme en liposomes. Pour cela, nous avons pu

accéder au dispositif microfluidique de l’ICMCB (S. Marre). Les conditions choisies pour

cette études sont : P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min et débit

d’éthanol = 3,7 ml/min, correspondant à des conditions d’extraction préalablement

sélectionnées. La transposition des conditions d’écoulement du réacteur d’extraction (et de

mise en forme) à celui de microfluidique se fait sur la base de conservation de vitesse

d’écoulement.

Dans cette partie, on visualise, à l’aide d’une caméra ultra-rapide, le capillaire de

sortie à 6 et 30 cm après la zone d’injection de l’eau dans le flux de CO2-éthanol. Le débit

d’eau est le paramètre étudié. Observations en microfluidique

Il n’y a pas de différence entre les observations à 6 et 30 cm. Le régime permanent


- 161 -

semble être établi au maximum à partir de 6 cm après la zone de contact entre l’eau et le CO2-

éthanol. Les résultats obtenus à 6 cm sont résumés dans le Tableau IV-4.

Proportion de CO2 (%)

[débit]

Proportion d’éthanol

(%) [débit]

Proportion d’eau (%)

[débit] Résultat

67,3% [305 µL/min]

27,9% [137 µL/min]

4,8% [18 µL/min]

Observation du régime : Deux rubans

64,2% [305 µL/min]

26,6% [137 µL/min]

9,2% [37 µL/min]

Observation du régime : Rubans et « Slugs »

47,0% [305 µL/min]

19,5% [137 µL/min]

33,5% [185 µL/min]

Observation du régime : « Slug » de CO2 dans de l’eau à cause de la

mouillabilité de la silice par l’eau

35,2% [305 µL/min]

14,6% [137 µL/min]

50,2% [370 µL/min]

Observation du régime : « Slug » plus court

23,5% [305 µL/min]

9,7% [137 µL/min]

66,8% [740 µL/min]

Observation du régime : gouttes

Tableau IV-4 : Photographies du capillaire à 6 cm de la zone d’injection en fonction des mélanges CO2-éthanol-eau


- 162 -

On distingue clairement deux comportements :

� les fluides ne se mélangent pas mais restent sous forme de deux rubans

� des gouttelettes apparaissent (à partir d’un débit d’eau de 185 µl/min). L’eau

mouillant préférentiellement la silice (matériau du capillaire), le CO2 constitue

la phase dispersée dans le continuum d’eau

Ces comportements peuvent probablement être expliqués d’un point de vue

énergétique. En effet, à grande vitesse (c'est-à-dire à forte proportion d’eau), le flux d’eau

possède une grande énergie cinétique (proportionnelle au carré de la vitesse et à la masse) ce

qui lui permet de « pénétrer » dans le flux de {CO2-éthanol} et ensuite il se décompose en

gouttelettes. Le raisonnement inverse peut être fait pour les faibles débits.

IV.2.2.1 Impacts sur la mise en forme de liposomes

Cette étude a été mise en place dans le but de trouver des conditions opératoires

favorables à la mise en forme de liposomes. Il faudrait se placer dans le domaine de formation

de gouttes. En effet, les phospholipides étant des entités amphiphiles, l’apparition d’une

émulsion CO2 dans eau peut leur permettre de se placer à l’interface des gouttes ce qui

favoriserait la mise en forme des liposomes. En effet, d’après Lesoin et al., (Lesoin et al.,

2001) l’agencement des phospholipides en liposomes sous pression résulterait d’une

succession d’étapes de changement de phase conduisant à la formation de micelles et

d’émulsion pour aboutir aux liposomes lors de la dépressurisation lorsque le CO2 passe en

forme gazeuse. Ce même mécanisme de passages successifs d’une émulsion eau dans CO2

vers une autre de type CO2 dans eau puis une dernière transition vers une émulsion CO2 dans

eau a aussi été proposé par Otake et al. (Otake et al., 2006), pour leur procédé de mise en

forme qui consiste à ajouter continuellement une phase aqueuse à un mélange de CO2-éthanol

contenant les phospholipides.


- 163 -

IV.3 Couplage de l’extraction des PL et de la mise en forme en liposomes

Le principe du couplage est d’ajouter une solution aqueuse au flux de CO2-éthanol

contenant les phospholipides issus de l’extraction. Cette partie présente les essais menés. On

s’appuiera, pour la définition du plan d’essais sur les résultats de l’étude des mélanges CO2-

éthanol-eau. Si on se base sur les études de microfluidique, il faudrait travailler à un débit de

5 ml/min (IV.2.2.1).

Deux séries d’essais sont réalisés, l’un en réacteur agité, l’autre en réacteur tubulaire

dans les conditions décrites dans le Tableau IV-5.





Débit d’éthanol

moyen (ml/min)

Débit d’eau moyen

(ml/min)

Réacteur

30 250 45 30 3,7 10 Agité de 250

ml

30 250 45 30 3,7 2,5 Tubulaire de

500 ml

Tableau IV-5 : Conditions opératoires du couplage de l’extraction et de la mise en forme

Avec le réacteur agité, la première fraction récoltée est turbide, les suivantes sont

limpides, de coloration jaune pâle d’intensité décroissante en fonction du temps de

récupération (Figure IV-6). Néanmoins, les clichés de microscopie optique n’ont pas permis

de déceler la présence de vésicules même dans la fraction 1. Ce résultat pourrait s’expliquer

par les faibles proportions de phospholipides obtenues dans chaque fraction (Tableau IV-6).

Par ailleurs, les volumes de fraction récupérés étant d’environ 400 ml, les concentrations en

phospholipides sont inférieures à 1 mg/ml ce qui fait que le système est peut être trop dilué

pour permettre l’observation de liposomes.

Pour augmenter la pureté des fractions en PL et diminuer le facteur de dilution, un

second essai est réalisé en recueillant les fractions toutes les 5 minutes. Ce second essai a

également été infructueux.


- 164 -

Figure IV-6 : Photographie de la phase aqueuse recueillie (F1) au cours de l’essai de mise en forme

F1 (0 à 40 min) F2 (40 à 80 min) F3 (80 à 120 min)

Masse (mg)

masse de l’espèce/

masse totale extrait

Masse (mg)



Masse (mg)



Phospholipides 85 24% 65 22% 33 18% Lipides non phosphorés

220 62% 171 58% 60 32%

Espèces non lipidiques

53 14% 61 20% 93 50%

Total 358 297 186 Masse de PL (g)/ masse de lipides totaux

(g)

0,28 0,28 0,35

Tableau IV-6 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur agité (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 10 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30%

d’éthanol)

Avec le réacteur tubulaire, utilisé dans les conditions d’extraction décrites dans le

Tableau IV-5, les fractions 1 et 2 sont turbides, contrairement aux suivantes. Néanmoins,

aucun liposome n’est observé en microscopie optique. Si on se réfère aux études de faisabilité

de mise en forme des liposomes réalisés par voie classique (IV.1), les teneurs en PL des

extraits auraient du être suffisantes (notamment pour F2) pour former des liposomes (Tableau

IV-7), d’autant plus que nous avons mis en place en système d’évaporation de l’éthanol en

sortie de réacteur (moins de 25 % massique d’éthanol dans la fraction) pour ne pas perturber

le système. La non formation de liposomes pourrait s’expliquer par le débit d’eau utilisé

inférieur à celui déterminé par microfluidique et qui ne favoriserait pas la présence de


- 165 -

gouttelettes ou par la faible concentration finale en phospholipides (3,6 et 2,25 mg/ml

respectivement pour F1 et F2).

Tableau IV-7 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur tubulaire de 500 ml (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 2,5 ml/min, P = 250 bar, T

= 45°C, 30% d’éthanol).

En conclusion, le couplage extraction de PL-mise en forme de liposomes est sans

doute possible sur le principe mais il apparait très délicat à réaliser à cause :

� du pourcentage d’éthanol nécessaire à l’extraction de PL qui peut empêcher la

formation des liposomes si il y en a trop

� du faible niveau de concentration des phospholipides dans le milieu extractant

en sortie de réacteur

� de la variation des concentrations des phospholipides au cours du temps

d’extraction

� de la présence d’espèces non lipidiques et lipidiques non phosphorées qui

peuvent nuire à l’organisation des bicouches

F1 (0 à 15 min) F2 (15 à 30 min) F3 (30 à 45 min)

Masse (mg)



Masse (mg)



Masse (mg)



Phospholipides 60 26% 90 38% 120 56% Lipides non phosphorés

90 40% 15 12% 31 14%

Espèces non lipidiques

75 34 20 16% 62 29%

Total 225 125 213 Masse de PL (g)/ masse de lipides totaux

(g)

0,40 0,86 0,77

Chapitre 4 : Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie

IV.4 Modification de la taille des liposomes par voie supercritique

Il existe dans la littérature des études qui montrent qu’il est possible de mettre en

forme des liposomes grâce à des techniques supercritiques (

connaissance, il n’existe pas de post

supercritique. Nous avons envisagé cette technique pour réduire la taille d’une dispersion de

liposomes.

Quand un flux de CO2

de la dépressurisation, il y a formation d’un spray. C’est l’existence de ce spray en fin de

procédé que nous souhaitons exploiter. La

formation du spray en présence de CO

Figure IV-7 : Principe du post traitement supercritique de liposomes

Pour un mélange CO2

fonction des paramètres opératoires tels que le débit et les dimensions géométriques du

système. Les photographies Figure

spray. En modifiant les caractéristiques géométriques du montage, il est possible de contrôler

l’atomisation du spray (angle et longueur) du spray de sortie. En effet, ce qui influence les

caractéristiques apparentes du spray (atomisation

atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO

en sortie du capillaire liée aux dimensions de ce dernier.

: Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie

Modification de la taille des liposomes par voie supercritique


forme des liposomes grâce à des techniques supercritiques (cf I.3.2). Cependant, à notre

connaissance, il n’existe pas de post-traitement des suspensions de liposomes au CO


2 rencontre un flux contenant une dispersion de liposomes, lors


procédé que nous souhaitons exploiter. La Figure IV-7 présente le principe global de

formation du spray en présence de CO2 supercritique.

: Principe du post traitement supercritique de liposomes

2-éthanol-eau qui se détend dans un milieu, le spray varie en


Figure IV-8 illustrent l’impact des conditions op



caractéristiques apparentes du spray (atomisation dans la sortie du capillaire, jet plein avant

atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO

en sortie du capillaire liée aux dimensions de ce dernier.

: Mise en forme de liposomes à partir de sources marines par voie supercritique

- 166 -

Modification de la taille des liposomes par voie


I.3.2). Cependant, à notre

traitement des suspensions de liposomes au CO2


rencontre un flux contenant une dispersion de liposomes, lors


présente le principe global de

: Principe du post traitement supercritique de liposomes

eau qui se détend dans un milieu, le spray varie en


illustrent l’impact des conditions opératoires sur le



dans la sortie du capillaire, jet plein avant

atomisation, longueur du spray…), ce sont les compositions du mélange CO2-eau, la vitesse


- 167 -

Débit de phase aqueuse = 1 ml/min, diamètre

du capillaire = 0,25 mm Débit de phase aqueuse = 5 ml/min, diamètre

du capillaire = 1 mm

Débit de phase aqueuse = 1ml/min, diamètre

du capillaire =0,5 mm, Pas de CO2, Débit de phase aqueuse = 10

ml/min, diamètre du capillaire =1 mm

Figure IV-8 : Photographies de sprays pour différents débits de phase aqueuse et différents diamètres de capillaire de sortie (débit de CO2 = 7 g/min)


- 168 -

Nous avons réalisé une trentaine d’essais à une pression de 200 bar et une température

de 45°C à partir d’une suspension de liposomes préparés avec une lécithine commerciale (LC

60). Nous avons fait varier les paramètres suivants :

� le diamètre interne du capillaire de sortie [0,18 mm - 0,25 mm - 0,5 mm - 1

mm]

� le débit de CO2 [2 g/min - 7 g/min - 10 g/min]

� le débit de la phase aqueuse [2,5 ml/min - 5 ml/min - 10 ml/min]

On note qu’il n’est pas possible de comparer de manière quantitative les vitesses de

sortie du fluide car ses propriétés physiques varient en fonction de la pression (qui n’est pas

constante dans le capillaire) et donc on ne peut pas appliquer les lois permettant le calcul de

ces vitesses. Nous pourrons donc seulement comparer les vitesses de manière relative.

Les distributions granulométriques observées étant multimodales, nous utiliserons des

diamètres particuliers pour discuter les résultats :

� D10 : diamètre équivalent en dessous duquel on trouve 10% de la population

totale


totale


totale

La Figure IV-9 présente un exemple de l’aspect final des dispersions obtenues en

sortie du spray. Elles sont turbides et de couleurs jaunes.


- 169 -

Figure IV-9 : Exemple de dispersions obtenues en sortie du spray

IV.4.1 Influence de la taille capillaire

La Figure IV-10 et le Tableau IV-8 présentent les résultats obtenus à un débit de CO2

de 7 g/min et un débit de suspension de liposomes à 10 ml/min, le diamètre interne du

capillaire étant modifié.

Figure IV-10 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les distributions granulométriques des liposomes (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes =

10 ml/min)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0,01 0,1 1 10 100 1000

% e

n v

ol

D (µm)

spray8j (diamètre interne du capillaire = 1 mm)

spray1c (diamètre interne du capillaire = 0,5 mm)

spray1d (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)

spray5d (diamètre interne du capillaire = 0,18 mm)

témoins


- 170 -

Spray Conditions opératoires Diamètre (µm)

Débit de

CO2 (g/min)

Débit suspension liposomes

moyen (ml/min)

Diamètre interne du capillaire

(mm)

D10 D50 D90

Spray5d 7 10 0,18 1,3 9,0 45,9

Spray1d 7 10 0,25 0,8 5,9 29,8

Spray1c 7 10 0,5 1,8 7,3 21,5

Spray8j 7 10 1 0,5 2,8 12,5

Témoins

2,5 5,3 9,8

Tableau IV-8 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement

La dispersion témoin est unimodale avec une population de liposomes centrée sur 5

µm. Après traitement, on a apparition de nouvelles populations par rapport au témoin,

notamment une plus petite centrée sur un diamètre d’environ 0,15 µm. L’intensité et la largeur

des pics varient avec le diamètre du capillaire : on observe une diminution du D10 qui

correspond à l’apparition d’une population de faible diamètre entre 0,1 et 0,5 µm qui n’existe

pas dans la suspension initiale. On observe aussi une augmentation du D90 qui s’explique par

un élargissement de la distribution des liposomes après traitement. Le D50 est toujours

augmenté après traitement sauf pour un diamètre interne de capillaire de 1 mm.

A titre d’exemple, la Figure IV-11 compare une suspension de liposomes avant et

après traitement. Les liposomes initiaux sont isolés contrairement à ceux issus du spray qui

sont agrégés. Cette agrégation est cohérente avec l’augmentation du D90 mentionnée.


- 171 -

Figure IV-11 : Clichés de microscopie (grossissement de 100) de la suspension initiale (gauche) et de la suspension après spray (Spray5d) (droite) (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de

suspension de liposomes = 10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 0,18 mm)

Le capillaire de 1 mm est le diamètre qui permet aux vésicules lipidiques de rester le

plus éloignées les unes des autres. C’est donc celui qui est le moins favorable à l’agrégation

des liposomes. L’apparition de liposomes de petites tailles correspondrait à une

restructuration des bicouches par un effet de cisaillement. Le capillaire de 1 mm qui

correspond à la vitesse de sortie des liposomes la plus faible laisserait le temps aux liposomes

de se reformer.

IV.4.2 Influence débit CO 2

La Figure IV-10 et le Tableau IV-9 présentent l’influence du débit de CO2 pour un

débit d’eau constant de 10 ml/min et deux diamètres de capillaire 0,25 mm et 1 mm.


- 172 -


Débit de CO2

(g/min)


moyen (ml/min)

Diamètre interne du

capillaire (mm) D10 D50 D90

Spray8f 10 10 0,25 0,7 4,2 45,9

Spray8h 7 10 0,25 1,2 8,1 41,2

Spray8c 2 10 0,25 0,8 8,1 26,7

Spray9d 10 10 1 0,6 2,8 21,5

Spray9e 7 10 1 0,6 3,4 63,4

Spray9f 2 10 1 0,7 6,5 121,4

Témoins

2,6 5,6 11,3

Tableau IV-9 : Influence du débit de CO2 sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm et 1 mm)

Figure IV-12 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 1 mm)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0,01 0,1 1 10 100 1000

% e

n v

ol

D (µm)

spray9 temoins

spray9f (débit de CO2 = 2 g/min)

spray9e (débit de CO2 = 7 g/min)

spray9d (débit de CO2 = 10 g/min)


- 173 -

Avec le capillaire de 1 mm, dans tous les cas, on observe une petite population centrée

sur 0,2 µm qui fait que le D10 diminue par rapport à la suspension témoin. L’influence du

débit de CO2 est surtout visible sur la partie des liposomes agrégés, de sorte que, plus le débit

diminue, plus l’agrégation est importante. Cette agrégation est visible sur les clichés de

microscopie (Figure IV-14) dans lesquels on note aussi l’apparition de structures aux formes

variées et qui seraient plutôt de nature unilamellaire.

Figure IV-13 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)

Pour un diamètre de capillaire de 0,25 mm, on retrouve les mêmes tendances qu’avec

le capillaire de 1 mm à l’exception qu’avec un débit de CO2 de 10 g/min, on favorise

l’apparition de petite population.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0,01 0,1 1 10 100 1000

% e

n v

ol

D (µm)

témoin

spray8f (débit de CO2 = 10 g/min)

spray8h (débit de CO2 = 7 g/min)

spray8c (débit de CO2 = 2 g/min)


- 174 -

Figure IV-14 : Cliché de microscopie (grossissement de 100) de la suspension après spray (spray9f) (débit de CO2 = 2 g/min, débit de suspension de liposomes =10 ml/min, diamètre

interne du capillaire = 1 mm)

Modifier le débit de CO2 a deux conséquences. La première est une modification de la

composition du mélange CO2-eau. La seconde est une augmentation de la vitesse de sortie

puisque le débit total est supérieur. Le fait de jouer simultanément sur ces deux facteurs rend

les interprétations difficiles.

IV.4.3 Influence débit phase aqueuse

La Figure IV-10 et le Tableau IV-10 présentent l’influence du débit d’eau pour un

débit de CO2 fixe de 10 g/min et deux diamètres de capillaire 0,25 et 0,5 mm sur les diamètres

des liposomes.


- 175 -


Débit de CO2

(g/min)


moyen (ml/min)

Diamètre interne du

capillaire (mm) D10 D50 D90

Spray9a 10 10 0,5 0,25 1,29 63,45

Spray9b 10 5 0,5 0,28 2,75 21,50

Spray9c 10 2,5 0,5 1,04 4,24 12,52

Spray8f 10 10 0,25 0,67 4,24 45,86

Spray8e 10 5 0,25 1,60 5,27 26,70

Spray8d 10 2,5 0,25 1,79 5,27 26,70

Témoins

2,6 5,6 11,3

Tableau IV-10 : Influence du débit de la phase aqueuse sur les diamètres granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 et 0,25 mm)

Figure IV-15 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 mm)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0,01 0,1 1 10 100 1000

% e

n v

ol

D (µm)

spray9 temoins

spray9a (débit de suspension de liposomese = 10 ml/min)

spray9b (débit de suspension de liposomes = 5 ml/min)

spray9c (débit de suspension de liposomes = 2,5 ml/min)


- 176 -

Figure IV-16 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,25 mm)

Avec le capillaire de diamètre 0,5 mm, le spray permet nettement de diminuer la

granulométrie de la suspension initiale d’autant plus que le débit d’eau est important. De plus,

on réduit aussi les phénomènes d’agrégation avec le débit élevé.

Les mêmes tendances sont observées avec le capillaire de diamètre 0,25 mm mais les

variations de granulométrie sont moins prononcées.

En conclusion, il apparait que passer une suspension de liposomes à travers un

capillaire en présence d’eau et de CO2 supercritique permet de faire varier la distribution

granulométrique. Les phénomènes mis en jeu sont complexes avec, d’une part, une

réorganisation des structures en d’autres objets soit plus grands soit plus petits (selon les

conditions opératoires), et, d’autre part, un phénomène d’agrégation. Dans l’objectif d’obtenir

des liposomes de petite taille, il semble que l’utilisation d’un capillaire avec un grand

diamètre, un débit de CO2 et d’eau importants sont à préconiser.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0,01 0,1 1 10 100 1000

% e

n v

ol

D (µm)

spray8 temoin

spray8f (débit de suspension de liposomes = 10 ml/min)

spray8e (débit de suspension de liposomes = 5 ml/min)

spray8d (débit de suspension de liposomes = 2,5 ml/min)

Conclusion générale et perspectives

- 177 -

VConclusion générale et perspectives


- 178 -

Ce travail de thèse s’inscrit dans trois thématiques principales : i) la valorisation de la

biomasse ; ii) la diminution de l’utilisation des solvants organiques dans les procédés

d’extraction et iii) le développement d’un procédé supercritique continu couplant l’extraction

de phospholipides d’une part et la formation de liposomes, d’autre part.

En ce qui concerne la valorisation de la biomasse, nous avons identifié dans la coquille

Saint-Jacques un sous-produit potentiellement intéressant du fait de sa teneur relativement

élevée en phospholipides (9% de lipides totaux dont 20% de phospholipides, sur matière

sèche), correspondant à tout ce qui n’est pas le muscle et le corail. En effet, par rapport aux

sources plus classiques de phospholipides (16 à 30 mg de phospholipides pour 1 g de graine

de soja (10% d’eau) et 16 mg pour 1 g d’œuf (51,1 % d’eau) (Chanussot, 2008)), cette

matière première se situe dans le même ordre de grandeur en termes de teneur. De plus, cette

source a l’avantage d’être abondante sur les côtes européennes. Par ailleurs, en tant que

produit de la mer, elle présente une composition en acides gras polyinsaturés à longues

chaines intéressante d’un point de vue nutritionnel, pour des applications alimentaires ou

diététiques. Nous avons montré que la matière première d’origine est très hétérogène. Elle

doit donc être soigneusement homogénéisée avant extraction. Par ailleurs, la richesse en eau

de la matière première (80 %) impose une de déshydratation, réalisée par zéodratation. De

plus, avant de procéder à l’extraction par du CO2, un broyage est aussi appliqué de façon à

réduire la matière première en une poudre, ce qui favorisera le processus d’extraction ultérieur

par augmentation des surfaces d’échange.

En ce qui concerne la diminution de l’utilisation des solvants organiques dans les

procédés d’extraction, l’ensemble des expérimentations utilise du CO2 supercritique ou

liquide comme fluide principal. Lorsqu’un co-solvant est utilisé, il s’agit de l’éthanol ou de

l’iso-propanol, solvants reconnus comme GRAS (Generally Recognized as Safe).

En ce qui concerne le développement d’un procédé supercritique continu couplant

l’extraction de phospholipides et la formation de liposomes, les questions suivantes étaient

posées :


- 179 -

• Avec quel rendement et quel degré de pureté est-il possible d’extraire les

phospholipides à l’aide d’un procédé utilisant du CO2 et un co-solvant ?

• La formation des liposomes à partir des phospholipides extraits est-elle

envisageable avec un mélange CO2-co-solvant ?

• Le procédé peut-il être exploité industriellement ?

Ces problématiques ont été abordées par étape. Dans un premier temps, nous avons

travaillé sur l’étape de déshuilage à l’aide de CO2 pur. Nous avons montré que cette étape

permet ensuite d’augmenter de manière significative la pureté des extraits de phospholipides

avec une diminution d’espèces non phospholipides dans l’extrait. Dans un deuxième temps,

nous avons évalué l’impact de divers paramètres (pression, température, pourcentage de co-

solvant, nature du co-solvant, type et dimension de réacteur) sur les rendements d’extraction

des phospholipides et la pureté des extraits obtenus. Il est important de souligner que les

extraits obtenus par voie supercritique sont complexes, car ils comprennent une partie non

lipidique et une partie lipidique, elle-même constituée de molécules qui ne sont pas toutes de

nature phospholipidique. Malgré cette complexité et selon les conditions expérimentales

appliquées, nous avons pu obtenir extraire jusqu’à 100% des phospholipides présents dans la

matrice déshuilée. Comparativement à l’éthanol, l’utilisation d’isopropanol conduit à des

extraits de pureté supérieure en phospholipides (jusqu’à 90% de phospholipides) mais les

rendements d’extraction sont plus faibles (de l’ordre de 40%). Dans un troisième temps, nous

avons montré que les extraits obtenus à l’issue du traitement supercritique s’organisent

effectivement sous forme de liposomes lorsque l’extrait sec est hydraté par une technique

conventionnelle, à condition que les extraits présentent une proportion de phospholipides (par

rapport aux lipides totaux) supérieure ou égale à 50%. Le couplage des étapes d’extraction et

de mise en forme en milieu supercritique n’a pas donné de résultats concluants. En effet, les

concentrations en phospholipides dans le flux CO2-éthanol du réacteur d’extraction ne sont

pas suffisante pour permettre l’organisation en liposomes.

L’ensemble des résultats obtenus reste malgré tout encourageant. Le procédé

d’extraction des phospholipides par voie supercritique est une alternative intéressante aux

techniques conventionnelles dans la mesure où il est plus respectueux de l’environnement. Il

permet aussi de travailler à des températures modérées préservant les molécules

thermolabiles. Il nécessite un investissement en équipement important et un prétraitement de


- 180 -

la matière première (déshydratation et broyage), deux opérations coûteuses en matériel et en

énergie. Néanmoins, le coût de fonctionnement est ensuite faible (pas d’élimination des

solvants des extraits, pas de recyclage des solvants). Compte-tenu de la demande croissante en

phospholipides pour des applications alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques et de la

forte valeur ajoutée de ces molécules, leur extraction par voie supercritique pourrait être

intéressante à développer à l’échelle industrielle.

Les perspectives de ce travail sont nombreuses. La caractérisation des extraits obtenus

doit être approfondie aussi bien sur la partie lipidique que non lipidique. Les extraits

contiennent éventuellement des composés (céramides, collagène) pouvant présenter des

activités biologiques intéressantes. Au niveau de la matière première, si une étape de

déshydratation est nécessaire, il serait aussi intéressant d’envisager des prétraitements

supplémentaires pour diminuer les interactions lipides avec les autres composants de la

matrice (action de protéases pour hydrolyser les protéines par exemple). La recherche d’autres

matières premières notamment d’origine végétale (telle que les tourteaux) devrait être réalisée

pour diversifier les sources de phospholipides et donc leur composition et acides gras

associés, sachant qu’un changement de matrice nécessitera certainement une adaptation des

conditions d’extraction. Par ailleurs, pour valider un intérêt industriel, il est indispensable de

travailler sur des lots traités plus importants permettant également de valider l’idée du

couplage extraction et mise en forme en liposomes.

L’optimisation des rendements d’extraction sur des quantités traitées importantes est

indispensable pour valider la possibilité de couplage de l’étape d’extraction avec celle de mise

forme des liposomes. Par exemple, une optimisation des paramètres d’extraction avec le

mélange CO2-isopropanol peut être envisagée puisqu’on a vu que tous les PL n’étaient pas

extraits de la matrice. Par ailleurs, il pourrait être intéressant de focaliser les prochains essais

sur le réacteur tubulaire puisqu’il permet d’obtenir des profils de concentration en PL élevés

par rapport au réacteur agité (Annexe 5).

Enfin, les liposomes obtenus peuvent contenir de l’éthanol. Une étude des propriétés

physicochimiques de ces structures ainsi que des domaines d’application devra être entreprise

de manière à mettre en lumière les potentialités de ces « nouveaux » liposomes.

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Table des figures

- 185 -

VIITable des figures

Figure I-1 : Représentation schématique d’un triglycéride ................................................... - 6 - Figure I-2 : Structure chimique de différents phospholipides et représentation du caractère amphiphile (Delattre et al., 1993) .......................................................................................... - 8 - Figure I-3 : Diagramme de phase de la dipalmitoylphosphatidylcholine en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide et Lβ, Lβ’ : structures lamellaires, chaînes aliphatiques formant un réseau hexagonal ; Pβ : structure lamellaire ondulée) (Delattre et al., 1993) ........................................................................... - 11 - Figure I-4 : Diagramme de phase de la lécithine d’oeuf en fonction de la fraction massique en eau et de la température (Lα : phase lamellaire fluide) (Delattre, 1993) ............................. - 12 - Figure I-5 : Schéma d'un liposome (Keller, 2001) .............................................................. - 12 - Figure I-6 : Fabrication d'huile et de tourteaux à partir de graines (Pages, 2008) .............. - 14 - Figure I-7 : Schéma des différentes opérations du raffinage (Pages, 2008)........................ - 16 - Figure I-8 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine de soja et de ses dérivés (Schneider, 2011) ................................................................................................... - 19 - Figure I-9 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine d’œuf (Schneider, 2011) .................................................................................................................................... - 20 - Figure I-10 : Schéma des différentes opérations d’obtention de la lécithine marine (Schneider, 2011) ................................................................................................................ - 21 - Figure I-11 : Schéma des différentes opérations d’obtention des PL du lait (Schneider, 2011) - 21 - Figure I-12 : Diagramme de phase du CO2 (Penchev, 2001) .............................................. - 24 - Figure I-13 : Diagramme de phase du CO2-éthanol (49,5 °C) (Seung et al., 2001) ............ - 26 - Figure I-14 : Mécanisme de transfert du soluté de la matrice vers le solvant au cours de l’extraction .......................................................................................................................... - 27 - Figure I-15 : Exemple de courbe d’extraction (masse cumulée)......................................... - 27 - Figure I-16: Schéma simplifié de la technique de préparation de liposomes développée par Frederiksen (Meure et al., 2008) ......................................................................................... - 45 - Figure I-17 : Schéma du mécanisme SCPRE (a-d) et ISCPRE (e-g) (Otake et al., 2006) .. - 47 - Figure I-18 : Schéma de l'installation DESAM (Meure et al., 2008) .................................. - 49 - Figure II -1 : Photographie de la coquille Saint Jacques ..................................................... - 53 - Figure II -2 : Principe de la zéodratation (Marin et René, 2008) ........................................ - 54 - Figure II-3 : Distribution granulométrique de la matière première zéodratée et broyée ..... - 55 - Figure II -4 : Photographie de la chromatographie sur couche mince de l’extrait lipidique de la matière première. Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v) ................. - 56 - Figure II-5 : Spectre RMN 31P des lipides totaux de la matière première........................... - 58 - Figure II -6 : Montage expérimental « petit volume » pour l’extraction des lipides (masse traitée : 3 à 6 g) .................................................................................................................... - 61 -

Table des figures

- 186 -

Figure II-7 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g) .................................................................................................... - 67 - Figure II -8 : Caractéristiques géométriques du réacteur .................................................... - 69 - Figure II-9 : Montage expérimental du procédé de couplage d’extraction des phospholipides et de mise en forme des liposomes ...................................................................................... - 70 - Figure II -10 : Montage expérimental de modification de la taille de liposomes avec du CO2 .. - 72 - Figure II-11 : Montage expérimentale pour l’étude des DTS ............................................. - 73 - Figure II-12 : Montage expérimental pour l’étude du système quaternaire CO2-Eau-éthanol-phospholipides ..................................................................................................................... - 74 - Figure II-13 : Schéma du montage du montage microfluidique de l'ICMCB (Marre et al., 2009), pour l’étude un pré-mélange CO2-éthanol remplace la partie CO2 et l’eau est acheminée par la pompe HPLC ........................................................................................... - 76 - Figure III-1 : Rendement d’extraction des lipides par CO2 supercritique (en bleu : extraction sur 3 g ; en rouge : extraction sur 6g ; en vert : 2ème extraction) ......................................... - 88 - Figure III-2 : Séparation par CCM des lipides des extraits 16 (16ap) et 21 (21ap) obtenus par CO2 supercritique (en comparaison la séparation de l’extrait des lipides totaux est rappelé). Deux mélanges de solvants sont utilisés successivement : 1) éther di éthylique/acétone (60/20 v/v) ; 2) hexane/éther/acide acétique (90/10/1 v/v/v) .......................................................... - 91 - Figure III-3 : Influence du prétraitement sur la masse totale extraite (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol, débit : 0,8 g/min) ...................................................................................... - 96 - Figure III-4 : Influence du prétraitement sur l'extraction des lipides totaux et des phospholipides (P = 1 bar, T = 27°C, 100% d’éthanol) ...................................................... - 97 - Figure III-5 : Reproductibilité de l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min) ou 50% (débit total = 2 g/min) d’éthanol) (n = 3) .................................. - 99 - Figure III-6 : Influence de la pression sur l’extraction (T = 60°C, 50% éthanol, débit total = 2 g/min) ................................................................................................................................ - 101 - Figure III-7 : Influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 1 g/min) .................................................................................................... - 103 - Figure III-8 : Influence de la température sur l’extraction (P= 250 bar, 30% d’éthanol, débit total de 1,5 g/min) ............................................................................................................. - 106 - Figure III-9 : Influence de la température sur l’extraction (P = 300 bar, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) et 30% d’éthanol (débit total = 1,5 g/min)) ............................................. - 109 - Figure III-10 : Exemple de courbe d’extraction (Pls33) exprimée en fonction de la masse de solvant utilisée (P = 250 bar, T = 27°C, 50% éthanol (débit total : 2 g/min) .................... - 111 - Figure III-11 : Répartition des masses extraites (mg/g matière déshuilée) (non lipidiques, lipides non phosphorés et phospholipides) des extraits aux conditions opératoires sélectionnées (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ................ - 115 - Figure III-12 : Courbes d’extraction obtenues avec un mélange CO2-isopropanol (P = 250 bar, 50% de co-solvant) ............................................................................................................ - 118 - Figure III-13 : Comparaison des résultats obtenus avec de l'éthanol ou de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température.................. - 119 -

Table des figures

- 187 -

Figure III-14:Comparaison de la répartition des masses extraites (PL et autres (non lipidiques et lipides non phosphorés) obtenues avec de l'éthanol et de l'isopropanol comme co-solvant dans différentes conditions de pression et de température ................................................ - 120 - Figure III-15 : Reproductibilité du réacteur tubulaire de grand volume (à P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol et une masse traitée de 30 g) (n = 3) ............................................... - 123 - Figure III-16 : Influence de la masse introduite sur l’extraction avec le réacteur piston de « grand volume » (P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol, débit de CO2 = 7 g/min, débit total = 10 g/min) ........................................................................................................................ - 125 - Figure III-17 : Photographie d’extraits obtenus avec un mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T= 45°C, 15% d’éthanol, réacteur tubulaire de 500 ml) ................................................... - 127 - Figure III-18 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .......................................................................................................................... - 128 - Figure VIII-1 : DTS d’un réacteur piston, agité et réel ..................................................... - 132 - Figure III-19 : Courbes de DTS d’un réacteur parfaitement agité (I), piston (II) et réel (III) (VILLERMAUX, 1994) et comparaison de l’influence du panier sur la DTS du réacteur agité - 133 - Figure III-20 : Montage expérimental « grand volume » pour l’extraction des phospholipides (masse traitée : 15 à 60 g) .................................................................................................. - 134 - Figure III-21 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode A, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 137 - Figure III-22 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode B, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 138 - Figure III-23 : Répartition des masses extraites par fraction et évolution des masses cumulées extraites (Mode C, Fi correspondant à une récupération toutes les 20 minutes) (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................................................................. - 140 - Figure III-24 : Photographie de la matière première après extraction sans bille (A) et avec ajout de billes de verre (B) ................................................................................................ - 143 - Figure III-25 : Répartition des masses extraites par fraction pour le mode A « optimisé » en réacteur agité (P = 250 bar, T = 45°C et 30% d’éthanol) .................................................. - 144 - Figure III-26 : Courbes d’extraction en mode fractionné (15 puis 30% d’éthanol) et à pourcentage d’éthanol fixe (P = 250 bar, T = 45°C, réacteur tubulaire de 500 ml avec 30 g de matière déshuilée, débit de CO2 = 7 g/min, débit éthanol = 3 g/min et 1,2 g/min pour respectivement 30 et 15% d’éthanol) ................................................................................ - 147 - Figure III-27 : Répartition des PL, lipides non phosphorés et matière non lipidique pour les extractions en mode fractionné, et séparément à 15 % et 30 % d’éthanol ........................ - 148 - Figure III-28 : Extrais obtenus avec un mélange eau-éthanol (70-30% massique) comme co-solvant (P = 250 bar, T = 45°C, débit de CO2 = 7 g/min, débit de co-solvant = 3,7 ml/min) ..... - 149 - Figure IV-1 : Echantillons réalisés à partir d’extraits obtenus par voie supercritique ...... - 154 - Figure IV-2 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls I F2 - 155 -

Table des figures

- 188 -

Figure IV-3 : Cliché de microscopie optique (grossissement de 60), extrait Lipopls K F1 . - 155 - Figure IV-4 : Evolution des compositions des mélanges après chaque ajout de CO2....... - 158 - Figure IV-5 : Mélange 5 (58% CO2 - 42% eau, massique) à 150 bar et 45°C .................. - 159 - Figure IV-6 : Photographie de la phase aqueuse recueillie (F1) au cours de l’essai de mise en forme ................................................................................................................................. - 164 - Figure IV-7 : Principe du post traitement supercritique de liposomes ............................. - 166 - Figure IV-8 : Photographies de sprays pour différents débits de phase aqueuse et différents diamètres de capillaire de sortie (débit de CO2 = 7 g/min) ............................................... - 167 - Figure IV-9 : Exemple de dispersions obtenues en sortie du spray .................................. - 169 - Figure IV-10 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les distributions granulométriques des liposomes (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes = 10 ml/min) ......................................................................................................................... - 169 - Figure IV-11 : Clichés de microscopie (grossissement de 100) de la suspension initiale (gauche) et de la suspension après spray (Spray5d) (droite) (Débit de CO2 = 7 g/min, débit de suspension de liposomes = 10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 0,18 mm) .......... - 171 - Figure IV-12 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 1 mm) ....... - 172 - Figure IV-13 : Influence du débit de CO2 sur les distributions granulométriques (Débit de suspension de liposomes = 10 ml/min et un diamètre interne du capillaire = 0,25 mm) .. - 173 - Figure IV-14 : Cliché de microscopie (grossissement de 100) de la suspension après spray (spray9f) (débit de CO2 = 2 g/min, débit de suspension de liposomes =10 ml/min, diamètre interne du capillaire = 1 mm) ............................................................................................ - 174 - Figure IV-15 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 mm) .. - 175 - Figure IV-16 : Influence du débit de suspension de liposomes sur les distributions granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,25 mm) - 176 - Figure V-1 : Spectre RMN 31P de la PE seul .................................................................... - 193 - Figure V-2 : Spectre RMN 31P de la PC seul (avec référence interne : pyrophosphate) .. - 193 - Figure V-3 : Spectre RMN 31P de la PA ........................................................................... - 194 - Figure V-4 : Spectre RMN 31P de la PE et PA .................................................................. - 194 - Figure V-5 : Spectre RMN 31P de la PC et PA .................................................................. - 195 - Figure V-6 : Spectre RMN 31P de la PE et PC .................................................................. - 195 - Figure VII-1 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 50% d’isopropanol) ................................................................................................................... - 199 - Figure VII-2 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 30% d’éthanol ............................................................................................................................ - 199 - Figure VII-3 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 15% d’éthanol ............................................................................................................................ - 200 - Figure IX-1 : Comparaison des concentrations moyennes de PL obtenues pour les réacteurs agité et tubulaire ............................................................................................................... - 207 -

Table des tableaux

- 189 -

VIIITable des tableaux Tableau I-1 : Principaux acides gras et symbolique associée ............................................... - 7 - Tableau I-2 : Différents arrangements des phospholipides en solution aqueuse (Delattre et al., 1993) .................................................................................................................................... - 10 - Tableau I-3 : Exemple de domaines d’application des liposomes (Delattre, 1993) ............ - 13 - Tableau I-4 : Composition de quelques lécithines en fonction de l’origine (Schneider, 2011) .. - 18 - Tableau I-5 : Références des techniques normalisées d’extraction des lipides ................... - 22 - Tableau I-6: Récapitulatif des conditions d'extraction des lipides par CO2 supecritique ... - 30 - Tableau I-7 : Conditions d'extraction des phospholipides .................................................. - 33 - Tableau I-8 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des lipides neutres ............................................................................................................................................. - 37 - Tableau I-9 : Comparaison de l’extraction conventionnelle et supercritique des phospholipides ............................................................................................................................................. - 38 - Tableau I-10 : Les méthodes classiques de formation de liposomes (MLV : Multi Lamellar Vesicles, LUV : Large Unilamellar Vecicles et SUV : Small Unilamellar Vesicles)......... - 42 - Tableau I-11 : Conditions opératoires des techniques supercritiques d’obtention de liposomes - 44 - Tableau II -1 : Profil d’acides gras des lipides totaux et des PL de la matière première .... - 57 - Tableau II -2 : Composition en lipides de la lécithine LC 60 ............................................. - 59 - Tableau II-3 : % initiaux d’éthanol des mélanges étudiés .................................................. - 75 - Tableau II -4 : Déplacement chimique des phospholipides seuls et en mélange déterminés par RMN 31P .............................................................................................................................. - 83 - Tableau III-1 : Conditions opératoires et masse de lipides extraite à l’aide de CO2 pur (Débit CO2 = 1 g/min sauf pour extract9 : 1,6 g/min) .................................................................... - 87 - Tableau III-2 : Taux et masses de PL avant et après extraction au CO2 pur ....................... - 90 - Tableau III-3 : Conditions opératoires des extractions des phospholipides ........................ - 94 - Tableau III-4 : Bilan en phospholipides des extractions avec et sans déshuilage au CO2 (P = 1 bar, T = 27°C, 100% éthanol) (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) - 97 - Tableau III-5 : Conditions opératoires d’étude de la reproductibilité de l’extraction des phospholipides (durée d’extraction : environ 100 min) ...................................................... - 98 - Tableau III-6 : Conditions opératoires pour étudier l'influence de la pression sur l’extraction des lipides .......................................................................................................................... - 100 - Tableau III-7 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol .......................... - 102 - Tableau III-8 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence du pourcentage d'éthanol sur l’extraction (débit de CO2 = 1 g/min) ................................................................................ - 102 - Tableau III-9 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, T = 45°C ; obtenues par Prophys) ............................................................................................ - 104 - Tableau III-10 : Influence du pourcentage d'éthanol sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ...................................... - 104 -

Table des tableaux

- 190 -

Tableau III-11 : Conditions opératoires de l'étude de l'influence de la température sur l’extraction (Débit de CO2 : 1 g/min) ................................................................................ - 105 - Tableau III-12 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol à 3 températures (P = 250 bar, 30 % éthanol) ...................................................................................................... - 107 - Tableau III-13 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ............................................. - 107 - Tableau III-14 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 250 bar, 50% éthanol ; obtenues par Prophys) à 3 températures ............................................................. - 108 - Tableau III-15 : Viscosité et masse volumique du mélange CO2-éthanol (P = 300 bar, 30% et 50% d’éthanol; obtenues par Prophys) à 3 températures .................................................. - 110 - Tableau III-16 : Influence de la température sur la pureté des extraits en lipides et PL (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions) ................................................. - 110 - Tableau III-17 : Solubilités apparentes des lipides et phospholipides pour les différentes conditions opératoires étudiées ......................................................................................... - 112 - Tableau III-18 : Récapitulatif des résultats de l’extraction avec un mélange CO2-éthanol (pureté et rendement, (F1 et F2 : 1ère et 2ème fractions ; total : ensemble des fractions)) .. - 116 - Tableau III-19 : Conditions opératoires des essais d’extraction des phospholipides avec un mélange CO2-isopropanol ................................................................................................. - 117 - Tableau III-20 : Conditions opératoires testées avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar) .................................................................................................................... - 127 - Tableau III-21: Comparaison des résultats obtenus avec les réacteurs tubulaire de 500 et 10 ml (P = 250 ± 5 bar) ............................................................................................................... - 129 - Tableau III-22: Conditions opératoires des essais de transpositions au réacteur agité ..... - 134 - Tableau III-23 : Quantités totales extraites avec les trois modes sur l’ensemble des 8 fractions- 141 - Tableau III-24 : Qualité des extraits des modes A et C, respectivement pour les fractions 1 à 5 et 1 à 8 ............................................................................................................................... - 141 - Tableau III-25 : Comparaison des résultats obtenus avec le réacteur agité de 250 ml et le réacteur tubulaire de 10ml ................................................................................................. - 142 - Tableau III-26 : Masse de PL extraite par g de matière déshuilée et répartition des familles (PL, lipides non phosphorés et espèces non lipidiques) de l’extrait pour chaque fraction, Mode A (sans bille, temps d’isolement de 20 min et 15 g de matière déshuilée et Mode A « optimisé » (ajout de billes en verre, temps d’isolement de 60 min et 30 g de matière déshuilée) .......................................................................................................................... - 145 - Tableau III-27 : Conditions opératoires extraction en deux temps avec le réacteur tubulaire 500 ml ................................................................................................................................ - 146 - Tableau III-28 : Conditions opératoires extraction avec un mélange eau-éthanol ............ - 149 - Tableau III-29 : Répartition de la masse extraite pour l’extraction avec un mélange eau-éthanol comme co-solvant ................................................................................................. - 150 - Tableau IV-1 : Structures observées après hydratation des extraits obtenus par voie supercritique (F1, F2 et F3 : 1ère, 2ème et 3ème fractions, P = 250 bar, R : pas d’objets visibles, L : liposomes, E : émulsion huile dans eau, * co-solvant : isopropanol et ** co-solvant : éthanol) .............................................................................................................................. - 156 -

Table des tableaux

- 191 -

Tableau IV-2 : Compositions massiques en éthanol et aspect macroscopique des mélanges introduits dans la cellule .................................................................................................... - 157 - Tableau IV-3 : Compositions finales (après les 5 ajouts de CO2) des mélanges étudiés .. - 158 - Tableau IV-4 : Photographies du capillaire à 6 cm de la zone d’injection en fonction des mélanges CO2-éthanol-eau ................................................................................................ - 161 - Tableau IV-5 : Conditions opératoires du couplage de l’extraction et de la mise en forme - 163 - Tableau IV-6 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur agité (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 10 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol) .......................................................................................................................... - 164 - Tableau IV-7 : Caractéristique des extraits obtenus avec le réacteur tubulaire de 500 ml (débit de CO2 = 7g/min, débit d’éthanol = 3 g/min, débit d’eau = 2,5 ml/min, P = 250 bar, T = 45°C, 30% d’éthanol). ................................................................................................................. - 165 - Tableau IV-8 : Influence du diamètre interne du capillaire sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement ................................................... - 170 - Tableau IV-9 : Influence du débit de CO2 sur les diamètres granulométriques des suspensions de liposomes avant et après traitement (diamètre interne du capillaire = 0,25 mm et 1 mm) .... - 172 - Tableau IV-10 : Influence du débit de la phase aqueuse sur les diamètres granulométriques (Débit de CO2 = 10 g/min, diamètre interne du capillaire = 0,5 et 0,25 mm) ................... - 175 - Tableau VI-3 : Composition massique des mélanges étudiés en microfluidique en fonction du débit du réacteur de formation de liposomes .................................................................... - 197 - Tableau VI-4 : Débit et nombre de Reynolds (Re) associés au montage expérimental de mise en forme et microfluidique (P = 250 bar, 30% d’éthanol) ................................................ - 197 - Tableau VIII-1 : Conditions opératoires utilisées pour l’étude de la DTS ........................ - 202 - Tableau VIII-2 : Résumé des résultats des DTS ............................................................... - 203 - Tableau VIII-3 : Reynolds d’agitation de l’étude des DTS en fonction de la vitesse d’agitation ........................................................................................................................................... - 205 - Tableau VIII-4 : Reynolds d’agitation des essais d’extraction en CO2-éthanol en fonction de la vitesse d’agitation .............................................................................................................. - 205 -

Annexe 1

- 192 -

IXAnnexe 1 : Spectres RMN 31P

Annexe 1

- 193 -

Dans cette annexe, il est présenté les différents spectres RMN 31P des standards de

phospholipides seuls et en mélanges. Les conditions d’analyses sont détaillées dans le chapitre

2 : Matériel et méthodes.

Figure IX-1 : Spectre RMN 31P de la PE seul

Figure IX-2 : Spectre RMN 31P de la PC seul (avec référence interne : pyrophosphate)

Annexe 1

- 194 -

Figure IX-3 : Spectre RMN 31P de la PA

Figure IX-4 : Spectre RMN 31P de la PE et PA

Annexe 1

- 195 -

Figure IX-5 : Spectre RMN 31P de la PC et PA

Figure IX-6 : Spectre RMN 31P de la PE et PC

Annexe 2

- 196 -

XANNEXE 2 : Complément à l’étude

cinétique du mélange CO2-éthanol-eau

Annexe 2

- 197 -

• Correspondance des conditions réacteur de mise en forme des liposomes et

conditions de l’étude microfluidique

Les conditions d’analyse sont ajustées par rapport à celle du dispositif de mise en

forme de liposomes. Dans notre montage expérimental, le débit de CO2 et d’éthanol est de 7

g/min et de 3,7 ml/min et que le débit d’eau sera modifié entre 0,5 ml/min et 20 ml/min (plage

de fonctionnement de la pompe). Le Tableau X-1 fournit les compositions massiques des

mélanges qui seront alors obtenus.

Débit d’eau

(ml/min)

Composition massique (%)

CO2 Ethanol Eau

0,5 67,3 27,9 4,8

1 64,2 26,6 9,2

5 47,0 19,5 33,5

10 35,2 14,6 50,2

20 23,5 9,7 66,8

Tableau X-1 : Composition massique des mélanges étudiés en microfluidique en fonction du débit du réacteur de formation de liposomes

Sur le dispositif de mise en forme, les capillaires ont un diamètre interne de 1,3 mm.

Le dispositif microfluidique utilise des capillaires de 250 µm de diamètre interne. Le calcul

des débits de CO2+ éthanol et d’eau à imposer en microfluidique sont calculés sur la base

d’une conservation des vitesses dans les capillaires (Tableau X-2).

La modification du diamètre de l’écoulement peut entrainer une modification du

régime hydrodynamique. Le calcul du nombre de Reynolds dans les deux installations

(Tableau X-2) montre que le régime restera laminaire quelque soit le dispositif utilisé.

Réacteur de mise

en forme

Microfluidique

Flux {CO2+ethanol}

(ρ=0,900 g.cm-3

et η=0,12 mPa.s)

Re 1348 259

Débit 11 ml/min 410 µL/min Flux d’eau

(ρ=0,997g.cm-3

et η=0,89 mPa.s)

Re 9-458 2-88

Débit 0,5-20 ml/min 18-740 µL/min

Tableau X-2 : Débit et nombre de Reynolds (Re) associés au montage expérimental de mise en forme et microfluidique (P = 250 bar, 30% d’éthanol)

Annexe 3

- 198 -

XIANNEXE 3 : Comparaison des réacteurs

tubulaire de 10 et 500 ml

Annexe 3

- 199 -

Figure XI-1 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 50% d’isopropanol)

Figure XI-2 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 27°C et 30% d’éthanol

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re

g de solvant (CO2-éthanol) / g de matière

60 g (PL)

60 g (masse totale)

6 g (PL)

6 g (masse totale)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re


60 g (masse totale)


60 g (PL)

6 g (masse totale)


6 g (PL)

Annexe 3

- 200 -

Figure XI-3 : Courbes d’extractions pour 6 g et 30 g traitées (P = 250 bar, T = 45°C et 15% d’éthanol

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50

Ma

sse

ex

tra

ite

(m

g)

/ g

de

ma

tiè

re


60 g (masse totale)


60 g (PL)

6 g (masse totale)


6 g (PL)

Annexe 4

- 201 -

XIIAnnexe 4 : Résultats expérimentaux

de l’étude des DTS du réacteur agité de

250 ml

Annexe 4

- 202 -

• Le plan des essais

Numéro

manip

Débit d’entrée

(ml/min)

Vitesse d’agitation

(tr/min)

Panier

1 5 100 grosses mailles 2 5 200 grosses mailles

3 5 500 grosses mailles












15 5 500 petites mailles










Tableau XII-1 : Conditions opératoires utilisées pour l’étude de la DTS

• Les résultats obtenus

Le Tableau XII-2 présente les temps de séjour moyens théoriques et ceux obtenus

expérimentalement.

Annexe 4

- 203 -

Numéro

manip

Débit

d’entrée

(ml/min)

Vitesse

d’agitation

(tr/min)

Panier τthéorique

(min)

τexpérimentale

(min)

1 4,73 100 grosses mailles 54 56 2 4,79 200 grosses mailles 54 56 3 4,94 500 grosses mailles 52 52 4 9,29 100 grosses mailles 28 29 5 9,77 200 grosses mailles 26 27 6 9,79 500 grosses mailles 26 26 7 13,98 100 grosses mailles 18 19 8 14,31 200 grosses mailles 18 18 9 14,64 500 grosses mailles 18 18

10 14,31 500 grosses mailles 18 17 11 14,29 500 grosses mailles 18 18 12 24,58 200 grosses mailles 10 11 13 23,47 100 grosses mailles 11 11 14 20,20 500 grosses mailles 13 14 15 4,98 500 petites mailles 54 109 16 9,74 100 petites mailles 26 62 17 9,69 200 petites mailles 26 48 18 9,67 500 petites mailles 26 51 19 14,90 100 petites mailles 17 30 20 15,05 200 petites mailles 17 20 21 15,06 500 petites mailles 17 31 22 24,91 100 petites mailles 10 12 23 24,20 200 petites mailles 10 13 24 24,51 500 petites mailles 11 11

Tableau XII-2 : Résumé des résultats des DTS

D’une manière générale, l’ensemble des essais réalisés avec le panier de type « grosses

mailles » permet d’avoir un comportement très proche d’un réacteur parfaitement agité. En

effet, l’allure des courbes est similaire au cas idéal. De plus, les temps de séjours moyens

expérimentaux sont proches des théoriques.

Par contre, les tests menés avec le second panier dit « petites mailles » donnent des

DTS différents de ceux obtenus avec l’autre. De plus, les temps de séjour moyens théoriques

sont plus importants. Le panier a donc un impact important sur l’hydrodynamique du milieu.

Les pertes de charges induites par les petites mailles empêchent l’agitation à l’extérieur du

panier. Le volume à l’intérieur du panier (de l’ordre de 80 ml) représente près d’un tiers du

volume total (d’environ 250 ml). La majorité du milieu n’est donc pas homogénéisée. Le

transfert de matière de l’intérieur vers l’extérieur est essentiellement assuré par la diffusion,

ce qui augmente donc les temps de séjours.

Annexe 4

- 204 -

• Extrapolation des résultats pour les essais sous pression

Les valeurs de DTS expérimentales ont été mesurées dans des conditions différentes

de celles de nos essais. En effet, cette détermination a été effectuée avec de l’eau à une

pression de 1 bar et à une température de 25°C. Les essais seront eux réalisés avec un

mélange CO2-éthanol pour un domaine de P= 250 bar et T= 27-45°C. De plus, le réacteur sera

chargé initialement de matière première sous forme de poudre et ensuite, lors de l’extraction

le solvant contiendra des lipides.

Déterminons, le régime hydrodynamique du milieu en fonction des conditions

opératoires. Pour cela, nous calculons le nombre de reynolds, Re. Il correspond au rapport

entre la force d’inertie et la force visqueuse. Celui-ci détermine le régime du fluide : le fluide

est en régime laminaire stable et stationnaire quand la valeur de Re est faible (Re=1 à 10) et

est turbulent instable et chaotique, quand sa valeur est plus élevée (Re>104).

Dans le cas d’un réacteur agité, il se calcule par la formule suivante (TI j4010) :

fE = 7�z²μ

� n : vitesse d’agitation en tours/s

� D=2,5 cm

� Pour l’eau, ρ= 1000 kg.m-3 et µ=0,001

Pa.s

Le régime ne dépend, dans le cas de l’eau et à température constante, que de la vitesse

d’agitation.

Annexe 4

- 205 -


(tr/min)

100 200 500

Re 1042 2083 5208

Tableau XII-3 : Reynolds d’agitation de l’étude des DTS en fonction de la vitesse d’agitation

Pour une vitesse d’agitation comprise entre 100 et 500 tours/min, le régime est

intermédiaire.

Le mélange CO2-éthanol va modifier les valeurs de masse volumique et de viscosité.

D’une manière générale, dans nos conditions de pression et de température, la masse

volumique est de l’ordre de 900 kg/m3 et la viscosité sera de l’ordre de 1-2 x 10-4 Pa.s. (250

bar et T = 27-45°C). On fait l’hypothèse que la présence de la matière première modifie peu la

viscosité.

Pour une masse volumique de 900 kg/m3 et une viscosité de 2 x 10-4 Pa.s, on obtient

les valeurs de Reynolds suivantes :


(tr/min)

100 200 500

Re 4688 9375 23438

Tableau XII-4 : Reynolds d’agitation des essais d’extraction en CO2-éthanol en fonction de la vitesse d’agitation

Pour 100 et 200 tours/min, le régime est transitoire et est turbulent à 500 tr/min.

L’homogénéisation du milieu est équivalente ou meilleure dans ces conditions que lors de la

détermination des DTS avec l’eau.

L’utilisation du panier possédant des mailles de 1 µm et dans ces conditions de

pression et de température (P = 250 bar et T = 27 ou 45°C) permet d’avoir un comportement

de type parfaitement agité pour le réacteur.

Annexe 5

- 206 -

XIIIAnnexe 5 : Comparaison des profils

de concentration des grands réacteurs

Annexe 5

- 207 -

Pour les deux types de réacteur, on peut estimer les concentrations en phospholipides

dans le flux CO2-éthanol de sortie (mg de PL / g de solvant), à partir des masses collectées

dans chaque fraction, en supposant que l’intégrale de la fraction peut être représentée par une

concentration moyenne selon :

5BHHEPQ = |�PQ'��}�U�~'DF

Il vient :

5BHHEPQ = �PQ��'��}�U�~'∆F

Ce qui conduit à la concentration :

�PQ�� = 5BHHEPQ��}�U�~'∆F

Les deux réacteurs donnent des profils de concentration de sortie différents (Figure

XIII-1), le réacteur tubulaire donnant une concentration plus importante pendant les 80

premières minutes (jusqu’à F4).

Figure XIII-1 : Comparaison des concentrations moyennes de PL obtenues pour les

réacteurs agité et tubulaire

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Ma

sse

de

PL

(mg

) /

g d

e

solv

an

t (C

O2-é

tha

no

l)

réacteur piston de 500ml (30 g)

réacteur agité de 250 ml (30 g)

Documents

thèse ap correction - ori-oai.u-bordeaux1.frori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2011/THONG_DENG_HONDA_2011.pdf · Je remercie, tout particulièrement, Mme Danielle Barth et M. Pierre Chaminade