Thèse : Développement d un protocole métrologique … · Remerciements Le travail que j’ai le plaisir de vous présenter au travers ce manuscrit est le fruit de nombreuses contributions

Université de Pau et des Pays de l’Adour Ecole Doctorale des Sciences Exactes et de leurs Applications

N°__________

THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR

Spécialité : Environnement et Matériaux

présentée et soutenue le 6 mai 2009 par

Sébastien SANNAC

DEVELOPPEMENT D’UN PROTOCOLE METROLOGIQUE POUR

L’ANALYSE DE SPECIATION DU SELENIUM ET DU MERCURE D ANS

DES MATRICES ENVIRONNEMENTALES ET AGROALIMENTAIRES

PAR HPLC-ID-ICP-MS

Directrices de thèse : Pr. Martine POTIN-GAUTIER, Pr. Florence PANNIER

JURY

M J.I. Garcia-Alonso, Rapporteur Professeur (Université d’Oviedo, Espagne)

Mme M.F. Grenier-Loustalot, Rapporteur Directrice de recherche au CNRS (Valbonne-Sophia-Antipolis)

M O.F.X. Donard Directeur de recherche (Université de Pau et des Pays de

l’Adour)

M S. Wunderli Responsable de laboratoire (METAS, Suisse)

Mme P. Fisicaro Responsable du Département Biomédical et Chimie Inorganique

(LNE, Paris)

M G. Labarraque Docteur Ingénieur (LNE, Paris)

Mme F. Pannier Professeur (Université de Pau et des Pays de l’Adour)

Mme M. Potin-Gautier Professeur (Université de Pau et des Pays de l’Adour)

2

Remerciements

Le travail que j’ai le plaisir de vous présenter au travers ce manuscrit est le fruit de nombreuses contributions. Il est délicat de réussir à démontrer la traçabilité de chaque participation individuelle, surtout en considérant l’incertitude associée à la mémoire humaine sur une période de trois années, cependant j’aimerai essayer. Tout d’abord, je tiens à remercier les personnes à l’origine de ce projet : Olivier Donard, Martine Potin-Gautier, Florence Pannier, Cédric Rivier et Guillaume Labarraque. Merci d’avoir créé l’opportunité de travailler sur un sujet aussi intéressant. La direction de ces travaux n’a pas toujours été facilitée au vu de la distance Pau-Paris, aussi j’aimerai souligné le sérieux et l’efficacité avec lesquels les recherches ont été encadrées, merci donc à Martine Potin-Gautier, Florence Pannier, Paola Fisicaro et Guillaume Labarraque pour cela. Merci aussi pour la confiance qu’ils ont placée en moi et surtout pour l’accompagnement qu’ils ont pu me fournir aux cours de ces trois années. Je n’oublierai pas de sitôt tout ce que vous avez pu m’apporter et j’en garderai une éternelle reconnaissance. De par leur fonction, certaines personnes ont contribué avec une plus grande distance à ces travaux. Cependant, leur importance n’en est pas atténuée, merci donc à Gilles Hervouet d’avoir contribué à la tenue de ses recherches au sein du LNE et merci à Sophie Vaslin-Reimann pour avoir pris le suivi en cours de route, tout en assurant que l’on arrive à bon port. Je voudrai également remercié les responsables du LCABIE, Olivier Donard et Martine Potin-Gautier, pour m’avoir offert la chance de travailler dans leur laboratoire. Mes remerciements vont aussi aux membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail : Marie-Florence Grenier Loustalot, Jose-Ignacio Garcia-Alonso et Samuel Wunderli. Merci pour le temps consacré à la lecture de ce manuscrit et merci également de venir donner votre appréciation. En particular, querré agradecido Jose-Ignacio Garcia-Alonso para tener evaluar este trabajo escrito en francés. Au cours de ces trois années de thèse entre le LCABIE et le LNE, j’ai eu la chance de rencontrer un nombre considérable de personnes issues des deux laboratoires. Beaucoup m’ont permis d’avancer et de progresser aussi je tiens à les remercier également ici. J’espère qu’elles m’excuseront de ne pas les nommer, leur nombre et la peur d’un oubli m’ont fait renoncer à cet exercice. Je fait seulement une exception en la personne de Caroline Oster. Sa présence au LNE lors de mon arrivée sur Paris m’a été d’une grande aide pour mon intégration. Ces travaux n’aurait pas du tout eu la même valeur sans ses nombreux conseils, avis et coups de main. Et puis aussi merci pour la bonne humeur que tu peux apporter au sein d’une équipe. Je tenais aussi à remercier les amis palois (Alex, Christel, Béné, Julien, Xav, Tof, Ben, Fred, Sim…), toujours présents lors d’un retour au pays, mais également ceux de la capitale (Aymeric, Willy, Mathias, Thierry, Romain, Eve…) sans qui je n’aurais pas autant apprécié la vie parisienne. Je souhaitais également remercier ma Mère et l’ensemble de ma famille (de Porto à Londres, en passant par Pau, Paris, et tous les lieux où l’on puisse trouver un Sannac, un Cardoso ou apparenté). Ils ont tous contribué à faire de moi ce que je suis aujourd’hui et m’ont toujours soutenu pour me permettre d’accomplir ces travaux. Je voudrai simplement terminer en remerciant Sophie, d’abord pour avoir réussi à me supporter au cours de ces derniers mois, mais surtout pour avoir été à mes côtés dans cette étape. Merci à vous tous.

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Sommaire

Remerciements............................................................................................................................... 3

Sommaire ....................................................................................................................................... 5

Glossaire ........................................................................................................................................ 9

Introduction Générale ................................................................................................................... 15

Chapitre I : Définitions du contexte de l’étude ............................................................................... 21

1 La métrologie ..................................................................................................................... 23

1.1 Définition ..................................................................................................................... 23

1.2 Intérêts de la métrologie.............................................................................................. 25

1.3 Organisation de la métrologie...................................................................................... 26

1.4 Méthodes primaires pour la quantité de matière.......................................................... 31

1.5 Calcul de l’incertitude .................................................................................................. 34

2 L’analyse de spéciation ...................................................................................................... 37

2.1 Définition ..................................................................................................................... 37

2.2 Intérêts ........................................................................................................................ 37

2.3 Démarche ................................................................................................................... 38

3 Métrologie appliquée à l’analyse de spéciation................................................................... 40

Chapitre II : Synthèse bibliographique........................................................................................... 43

1 Le sélénium........................................................................................................................ 45

1.1 Généralités.................................................................................................................. 45

1.2 Occurrence dans l’environnement ............................................................................... 47

1.3 Effets sur la santé humaine ......................................................................................... 49

1.4 Supplémentation alimentaire en sélénium ................................................................... 51

1.5 Protocoles d’analyses ................................................................................................. 57

1.6 Bilan et choix analytiques ............................................................................................ 73

2 Le mercure......................................................................................................................... 74

2.1 Généralités.................................................................................................................. 74

2.2 Occurrence dans l’environnement ............................................................................... 77

2.3 Effet sur la santé humaine........................................................................................... 81

2.4 Evaluation du risque lié aux produits de la pêche........................................................ 82

2.5 Protocoles d’analyses ................................................................................................. 83

2.6 Bilan et choix analytiques ............................................................................................ 93

Chapitre III : Mise en place des méthodes .................................................................................... 97

1 Instrumentation .................................................................................................................. 99

1.1 Four à micro-ondes ..................................................................................................... 99

6

1.2 HPLC .......................................................................................................................... 99

1.3 ICP-MS ..................................................................................................................... 100

2 Réactifs et étalons............................................................................................................ 102

3 Optimisation du couplage HPLC-ICP-MS ......................................................................... 104

3.1 Séparation des espèces séléniées ............................................................................ 104

3.2 Séparation des espèces mercurielles ........................................................................ 108

3.3 Détection................................................................................................................... 111

4 Double dilution isotopique ................................................................................................ 120

4.1 Principe ..................................................................................................................... 120

4.2 Spécificités................................................................................................................ 121

5 Calcul d’incertitude ........................................................................................................... 123

6 Traçabilité de l’analyse..................................................................................................... 127

Chapitre IV : Applications aux analyses de spéciation du sélénium ............................................ 129

1 Analyses des levures ....................................................................................................... 131

1.1 Optimisation de l’extraction sur LevTest .................................................................... 131

1.2 Analyses de la levure SELM-1 et de l’échantillon de CCQM-P86 .............................. 138

2 Analyses des farines de blé.............................................................................................. 156

2.1 Farine de Kamut........................................................................................................ 156

2.2 Echantillon de farine de la CCQM-K60 ...................................................................... 160

3 Conclusions sur l’analyse du sélénium............................................................................. 169

Chapitre V : Applications aux analyses de spéciation du mercure............................................... 173

1 Analyses des Matériaux de Références Certifiés lyophilisés ............................................ 175

1.1 Traitement de l’échantillon......................................................................................... 176

1.2 Mise en place des protocoles métrologiques ............................................................. 180

2 Analyses des Matériaux de Références Certifiés frais...................................................... 192

2.1 Traitement de l’échantillon......................................................................................... 192

2.2 Mise en place des protocoles métrologiques ............................................................. 194

3 Conclusions sur l’analyse du mercure .............................................................................. 199

Conclusion générale ................................................................................................................... 203

Références ................................................................................................................................. 209

Annexes...................................................................................................................................... 235

Annexe 1 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS avec appariements d’ions

pour l’analyse des espèces de sélénium ................................................................................. 237

Annexe 2 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS avec échange d’ions pour

l’analyse des espèces de sélénium ......................................................................................... 243

Annexe 3 : Revue bibliographique des séparations par HPLC-ICP-MS pour l’analyse des

espèces de mercure................................................................................................................ 253

7

Annexe 4 : Exemple d’un calcul d’incertitude obtenu avec Wincert.......................................... 261

Annexe 5 : Equations de la déconvolution des profils isotopiques ........................................... 271

Annexe 6 : Publications et communications sur ces travaux de thèse ..................................... 279

Glossaire

Techniques analytiques :

AX : Anion eXchange ; chromatographie d’échange d’anions

CC : Chiral Chromatography ; chromatographie chirale

CX : Cation eXchange ; chromatographie d’échange de cations

DI : Dilution Isotopique

ESI : ElectroSpray Ionisation ; ionisation par électrospray

GC : Gaz Chromatography ; Chromatographie en phase gazeuse

HPLC : High Performance Liquid Chromatography ; Chromatographie Liquide Haute Performance

ICP-MS : Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry ; spectrométrie de masse à couplage

inductif du plasma

IP-RP : Ion Pair - Reverse Phase ; chromatographie de phase inverse avec appariement d’ions

IX : Ion eXchange ; chromatographie d’échange d’ions

LD : Limite de Détection

MS : Mass Spectrometry ; spectrométrie de masse

RP : Reverse Phase ; chromatographie de phase inverse

SEC : Size Exclusion Chromatography ; Chromatographie d’exclusion stérique

SS-ID : Species Specific Isotope Dilution ; dilution isotopique par espèce marquée

Composés chimiques :

Espèces séléniées :

DMeDSe : Diméthyl-diséléniure

DMeSe : Diméthyl-séléniure

γγγγ-glutamyl-CH 3SeCys : γ-glutamyl-Se-méthyl-sélénocystéine

GPx : Glutathiones peroxydases

GSSeSG : sélénodiglutathione

MeSeCys : Se-méthyl-sélénocystéine

Se : sélénium

SeCys : sélénocystéine

SeCys 2 : sélénocystine

SeEt : sélénoéthionine

SeIV : sélénite, SeO32-

SeMet : sélénométhionine

SeVI : séléniate, SeO42-

TMeSe+ : ion triméthylsélénonium

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Espèces mercurielles :

EtHg+ : éthylmercure

Hg : mercure

Hg0 : mercure élémentaire

MeHg+ : méthylmercure

Me2Hg : diméthylmercure

PhHg+ : phénylmercure

Autres :

1-BS : 1-butanesulfonate de sodium

2-ME : 2-mercaptoéthanol

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ARN : Acide RiboNucléique

CHAPS : 3-[(3-cholamidopropyl)-diméthylammonio]-1-propane sulfonate

HFBA :Hepta-FluoroButyric Acid ; acide heptafluorobutyrique

L-Cys : L-cystéine

MeOH : méthanol

MeSA : Methyl Sulfonic Acid, acide méthane-sulfonique

PFPA : Penta-FluoroPropionic Acid, acide pentafluoropropionique

PS5 : pentane sulfonate de sodium

SDS : Sodium Dodecyl-Sulfate ; dodécylsulfate de sodium

TBAH : Tetra-Butyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-butyl ammonium

TEAH : Tetra-Ethyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-éthyl ammonium

TFA : Tri-Fluoroacetic Acid ; acide trifluoroacétique

TMAH : Tetra-Methyl Ammonium Hydroxide ; hydroxyde de tétra-méthyl ammonium

Tris : Tris-(hydroxyméthyl)aminométhane.

Agences, organismes ou comités :

AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

AIT : Applied Isotope Technologies

ATSDR : Agency for Toxic Substance and Disease Registry ; agence d’enregistrement des

substances toxiques et des maladies

BIPM : Bureau International des Poids et Mesures

BIPEA : Bureau InterProfessionnel d'Etudes Analytiques

CCQM : Comité Consultatif pour la Quantité de Matière

CGPM : Conférence Générale des Poids et Mesures

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CIPM : Comité International des Poids et Mesures

EFSA : European Food Safety Authority ; autorité européenne de sécurité des aliments

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations ; organisation des Nations Unies

pour l'alimentation et l'agriculture

IAEA : International Atomic Energy Agency ; agence internationale de l'énergie atomique

INERIS : Institut National de l'EnviRonnement industriel et des rISques

INM : Institut National de Métrologie

IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry ; union internationale de chimie pure et

appliquée

MRA : Mutual Recognition Arrangement ; arrangement de reconnaissance mutuelle

NAS : National Academy of Sciences ; académie nationale américaine des sciences

NIST : National Institut of Standards and Technology ; institut national de métrologie américain

NRCC : National Research Council Canada ; conseil national de recherches Canada

SCF : Scientific Committee for Food ; comité scientifique pour les aliments de la commission

européenne

US-EPA : United States Environmental Protection Agency ; agence américaine pour la protection

de l’environnement

WHO : World Health Organisation ; organisation mondiale de la santé

Divers :

CMC : Calibration and Measurement Capability ; capacité de mesure et d’étalonnage

COMAR : COde d’indexation des MAtériaux de Référence

CRM : Certified Reference Material ; matériau de référence certifié

DHTP : Dose Hebdomadaire Tolérable Provisoire

GUM : Guide to the expression of Uncertainty in Measurement ; guide pour l’expression de

l’incertitude de mesure

HIV : Human Immunodeficiency Virus ; virus de l'immunodéficience humaine

PEEK : Poly-Ether-Ether-Ketone ; poly-éther-éther-cétone

REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals ; enregistrement,

évaluation et autorisation des substances chimiques

ROHS : Restriction of the use of certain Hazardous Substances in electrical and electronic

equipment ; restriction de l'utilisation de certaines substances dangereuses dans les équipements

électriques et électroniques

SI : Système International des unités

tR : temps de rétention

UV : rayonnement Ultra-Violet

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Notation :

(A)ech : abondance naturelle de l’isotope A dans l’échantillon

(A)eta : abondance naturelle de l’isotope A dans l’étalon

(A)sp : abondance de l’isotope A dans l’étalon marqué

(B)ech : abondance naturelle de l’isotope B dans l’échantillon

(B)eta : abondance naturelle de l’isotope B dans l’étalon

(B)sp : abondance de l’isotope B dans l’étalon marqué

Ci : fraction de masse de la forme i

Ccert : concentration certifiée de l’analyte dans un CRM

Céch : concentration de l’analyte dans l’échantillon

Ceta : concentration de la solution étalon

Csp : concentration de l’analyte dans l’étalon marqué

∆∆∆∆M i : différence entre la masse molaire de l’isotope i et la masse molaire de l’isotope de référence

EN : écart normalisé

f : équation mathématique de Cech

fSe : facteur de formation d’hydrures

h : humidité de l’échantillon

I corrigée : intensité corrigée

I mesurée : intensité mesurée iI : intensité mesurée par l’appareil à m/z=i

K : biais en masse

k : facteur d’élargissement

LD : Limite de détection

méch : prise d’essai de l’échantillon

meta : prise d’essai de la solution étalon

mSe : masse de sélénium

mspd : masse de l’étalon marqué pour la dilution directe

mspi : masse de l’étalon marqué pour la dilution inverse

p : pente

P(xi) : poids du paramèrte xi sur l’inceritude composée

R : rendement d’extraction

Rd : rapport isotopique pour la dilution isotopique directe

Ri : rapport isotopique pour la dilution isotopique inverse

Ricorr : rapport isotopique corrigé entre la masse i et la masse de l’isotope de référence

Riexp : rapport isotopique mesuré entre la masse i et la masse de l’isotope de référence

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Rs : rapport isotopique mesuré au sein de l’échantillon

Rstd : rapport isotopique issu de la mesure faîte sur une solution étalon

Rithéo : rapport isotopique théorique entre la masse i et la masse de l’isotope de référence,

s : écart-type iSe : intensité corrigée pour m/z=i.

[Se]tot : concentration en sélénium de l’échantillon

t : coefficient de Student

ττττ : temps mort du détecteur

U : incertitude élargie

u(Ccert) : incertitude-type de Ccert

u(Cech) : incertitude-type de Cech

unat : incertitude-type associée la variabilité naturelle des isotopes

us : incertitude-type associée à Rs

ustd : incertitude-type associée à Rstd

u(xi) : incertitude-type du paramètre xi

V(Cech) : variance de Cech

xi : paramètre i

zapp : charge apparente

zi : charge de la forme i

14

Introduction Générale

16

17

Le développement d’un organisme vivant est en grande partie influencé par les substances qu’il

puise dans son environnement. Leur présence et leur disponibilité sont corrélées aux cycles bio-

géochimiques établis au cours des lentes évolutions qu’a connues la Terre au fil des âges.

Cependant, l’augmentation des activités humaines depuis les premières révolutions industrielles a

perturbé ces équilibres par des rejets massifs de composés chimiques. En particulier, les éléments

traces modifient leurs effets sur les écosystèmes à partir de faibles variations de leur

concentration. Il est donc primordial de pouvoir étudier et élucider les mécanismes qui régissent

leur comportement pour pleinement appréhender les risques qui leur sont associés.

La compréhension de l’impact d’un élément dans l’environnement passe par le développement

d’analyses capables de détecter et de quantifier sa présence. La détermination de sa

concentration totale est la première étape de l’analyse. Cependant, cette grandeur n’est pas

suffisante pour clairement élucider les mécanismes d’action. L’étude de la répartition de ses

formes chimiques, définie par l’Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC) sous le

terme d’« analyse de spéciation », permet d’améliorer la connaissance de son impact et de son

devenir. En effet, les dispositifs d’accumulation, d’incorporation, d’expulsion ou de stockage d’un

élément au sein d’un organisme sont dépendants des espèces chimiques mises en jeu. Pour ces

raisons, leurs identification et la mesure de leur quantité sont devenues des besoins essentiels

dans les études environnementales, agroalimentaires ou de santé publique.

Les analyses de spéciation font appel à une procédure complexe avant d’aboutir à un résultat.

Leur démarche peut se résumer en quatre étapes essentielles :

i) l’échantillonnage et le prélèvement d’une fraction représentative de la cible de l’étude ;

ii) le traitement de l’échantillon pour permettre l’extraction des analytes sous leur forme

originelle et les obtenir dans un état compatible avec la technique analytique retenue ;

iii) la séparation et l’isolement de chaque espèce issue de l’échantillon ;

iv) l’identification et ou la mesure de la quantité d’analyte.

Ces différentes phases demandent l’application de nombreux traitements sur l’échantillon ou sur

son extrait. De plus, chaque étape doit être quantitative, ne pas apporter de contamination et ne

pas modifier les équilibres des espèces et leur spéciation originelle. Dès lors, il est possible

qu’apparaissent des biais inhérents aux techniques et méthodes utilisées et, au final, des

questions quant à la justesse des résultats peuvent être soulevées.

Avec l’évolution de la législation européenne (règlement REACH, directive RoHS…), la notion de

la spéciation des métaux et des métalloïdes commence à être prise en compte par les pouvoirs

publics et des besoins en métrologie légale devraient apparaître au cours des prochaines années.

La bonne application de ces nouveaux règlements et directives dépend avant tout de la fiabilité

des mesures et des contrôles qu’ils imposent. En effet, les prises de décisions dans ces contextes

sont souvent suivies d’impacts lourds, qu’ils soient sociétaux avec des conséquences sur la santé

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et la sécurité publique ou qu’ils soient économiques avec des répercutions pour les entreprises. Il

est donc nécessaire d’assurer la fiabilité des expertises requises par la législation pour permettre

une prise de décision correcte en toute connaissance de cause.

Les principaux outils à la disposition des laboratoires d’analyses et de contrôles pour démontrer la

qualité des mesures sont les matériaux de références certifiés (CRMs) et la participation à des

intercomparaisons. Cependant, ces dispositifs manquent bien souvent eux-mêmes de validation et

leur traçabilité au Système International des unités (SI) n’est pas toujours assurée. Pour pallier ces

difficultés, des méthodes de mesures dites « primaires » doivent être développées afin de disposer

de valeurs de références directement reliées au SI. Dans l’organisation actuelle du maintien de la

stabilité des unités, à travers le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM), il est du ressort

des Instituts Nationaux de Métrologie (INMs) de développer des méthodes primaires de mesure et

de les utiliser pour la dissémination de la traçabilité jusqu’aux utilisateurs.

Le Laboratoire National de Métrologie et d’Essais (LNE) assure le pilotage de la métrologie

française. Dans le cadre de la quantité de matière, le LNE a décidé de mettre en place des

méthodes primaires appliquées à l’étude de la spéciation des métaux et métalloïdes dans des

matrices environnementales et agroalimentaires. Bien que depuis plusieurs années des méthodes

soient développées dans ce laboratoire pour l’analyse en concentrations totales des métaux et

celles des composés organiques (pesticides, hydrocarbures aromatiques polycycliques…), le LNE

ne disposait pas des techniques et de la méthodologie nécessaires pour mener des analyses de

spéciation. Ce projet a donc été conduit en collaboration avec le Laboratoire de Chimie Analytique,

Bio-Inorganique et Environnement (LCABIE) de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour,

reconnu pour ses compétences dans le domaine des analyses de spéciation.

La première étape du travail de thèse a donc consisté à mettre en œuvre au sein du LNE les

techniques pour réaliser des analyses de spéciation. Une fois mise en place et maîtrisée, la

méthode a été premièrement appliquée au sélénium. Du fait de ses propriétés bénéfiques

supposées, cet élément entre dans la composition de plusieurs types de compléments

alimentaires commercialisés en Europe. La directive européenne N°2002/46/CE fait état des

substances pouvant être utilisées lors de leur fabrication. De par les procédés employés pour la

fabrication de certains compléments, les espèces initiales se retrouvent rarement dans le produit

fini et de nouvelles formes peuvent être rencontrées en sortie de fabrication. Il est donc essentiel

de disposer d’une méthode pouvant caractériser des espèces de sélénium dans ce type

d’échantillons sachant que selon leur concentration, certaines peuvent se révéler bénéfiques ou

nocives et impacter la santé humaine.

Le second élément pris en considération dans la suite de l’étude a été le mercure. Ce métal, sous

la forme de méthylmercure, se révèle être un perturbateur du développement cérébral chez le

19

nourrisson et peut provoquer des troubles neurologiques chez l’adulte. Dans le cadre du règlement

européen N°466/2001, un seuil maximal de contaminat ion des produits de la pêche, qui

représentent une des voies principales de l’exposition des populations, a été fixé en concentration

totale de cet élément. Afin d’anticiper une évolution de la législation vers une prise en compte la

forme méthylée du mercure, l’analyse de cette espèce a été réalisée dans ce type de matrices.

Pour chacun de ces éléments, l’objectif final de l’étude était de disposer, au sein du LNE, de

procédures de mesures de référence pour leur analyse de spéciation. Ces procédures se devaient

d’être dûment validées et évaluées pour permettre d’assurer le raccordement du résultat avec le

Système International des unités. Une fois ces méthodes développées, le LNE sera en mesure de

fournir des valeurs de références traçables au SI pour ces analytes lors d’intercomparaisons ou

dans le cadre de la certification de matériaux.

Le document de thèse s’articule autour de cinq chapitres. Le premier pose les définitions des deux

notions clés du sujet : métrologie et analyse de spéciation. Dans un premier temps l’apport de la

science de la mesure dans les systèmes d’estimation des grandeurs, son organisation à travers la

Convention du Mètre et sa mise en pratique au sein du BIPM et des Instituts Nationaux de

Métrologie sont présentés. La méthode primaire relative à la mesure de la quantité de matière des

éléments traces, la dilution isotopique, est également exposée puis discutée. Dans un second

temps, l’analyse de spéciation est détaillée pour démontrer de l’intérêt croissant porté par les

laboratoires de recherches sur ce domaine.

Le deuxième chapitre regroupe une revue bibliographique portant sur les propriétés générales des

éléments de l’étude et des méthodes spécifiques utilisées par les laboratoires de recherche. La

présentation des choix analytiques effectués pour chaque élément est également exposée.

Le troisième chapitre porte sur la mise en place du couplage HPLC-ICP-MS pour réaliser l’analyse

de spéciation des deux éléments. Il présente en les justifiant les méthodes analytiques

employées : séparation des espèces sur des étalons, détection dans l’optique de mener une

dilution isotopique, mise en place d’un protocole métrologique et termine par le calcul des

incertitudes de mesure.

Les deux derniers chapitres sont consacrés respectivement à chacun des deux éléments de

l’étude. Ils regroupent les développements spécifiques pour les échantillons étudiés. Une fois tous

les protocoles analytiques établis, la mise en pratique s’est effectuée sur des matrices certifiées,

représentatives d’échantillons réels. L’apport métrologique est aussi présenté pour chaque

élément par le calcul des différentes incertitudes de mesures, la validation de méthode et la

démonstration de leur traçabilité au SI.

20

Chapitre I : Définitions du contexte de

l’étude

22

23

1 La métrologie

1.1 Définition

De tout temps, les Hommes ont cherché des moyens pour évaluer et comprendre leur

environnement. Une solution a été de comparer les éléments entre eux : rapportant, confrontant et

quantifiant les propriétés d’un phénomène avec des références qu’ils connaissaient.

Ce besoin de mesurer se situe à la base de la pratique de toute démarche scientifique puisque

pour comprendre un phénomène il est important avant tout de pouvoir le quantifier, lui ou ses

effets. Cependant, pour permettre l’interprétation à travers des mesures, il faut pouvoir donner une

information quantitative des événements en reliant ces indications aux mêmes références pour

obtenir des résultats comparables. L’étude et la recherche de la comparabilité des données

définissent les raisons de la métrologie.

Dans la normalisation du vocabulaire (ISO 2007), la métrologie découle du concept de

« mesurage », ou plus familièrement de la « mesure ». Cette notion se rattache à l’action de

mesurer qui elle-même est définie comme le processus visant à obtenir expérimentalement une

valeur qu’il est raisonnable d’attribuer à un phénomène ; ce phénomène possédant bien sûr la

propriété d’être quantifiable. L’étude des mécanismes et des moyens utilisés pour effectuer une

mesure se définit comme étant la métrologie. Elle comprend donc tous les aspects théoriques et

pratiques des mesurages quel que soit le domaine d’application. Son but final est de pouvoir

assurer la comparabilité des résultats entre eux en les reliant à une même et unique référence ; en

d’autre termes d’assurer leur traçabilité métrologique.

La métrologie se divise en trois catégories d’applications ayant chacune ses spécificités en termes

de complexité et d’exactitude.

Le qualificatif de « fondamentale » ou de « scientifique » est employé lorsque sa mission s’attache

à développer, faire reconnaître et améliorer les unités du Système International (SI). Le SI

s’articule autour de sept unités fondamentales (Tableau 1). De celles ci découle les unités dérivées

qui s’expriment en produit de puissances des unités de base. Le développement d’étalons de

références permet le maintien et le transfert aux utilisateurs de ces unités.

La métrologie « industrielle » a pour rôle d’assurer un fonctionnement adéquat des instruments de

mesures utilisés dans les entreprises. Le raccordement de ces appareils à des étalons,

l’étalonnage, améliore la maîtrise des procédés de fabrication et la garantie de la qualité des

produits.

24

La métrologie « légale » recouvre l'ensemble des dispositions réglementaires mises en place par

les pouvoirs publics pour garantir la qualité des instruments de mesure et des méthodes utilisées.

Elle est appliquée aux domaines la de santé, du risque public ou des transactions économiques.

Tableau 1: Unités de base du système international (BIPM 2006)

Mètre (m) Le mètre est la longueur du trajet parcouru dans le vide par la lumière pendant

une durée de 1/299 792 458 de seconde.

Kilogramme (kg)

Le kilogramme est la masse du prototype en platine iridié qui a été sanctionné

par la Conférence Générale des Poids et Mesures tenue à Paris en 1889 et qui

est déposé au Bureau International des Poids et Mesures.

Seconde (s)

La seconde est la durée de 9 192 631 770 périodes de la radiation

correspondant à la transition entre les deux niveaux hyperfins de l'état

fondamental de l'atome de césium 133.

Ampère (A)

L'ampère est l'intensité d'un courant électrique constant qui, maintenu dans deux

conducteurs parallèles, rectilignes, de longueur infinie, de section circulaire

négligeable et placés à une distance de un mètre l'un de l'autre dans le vide,

produirait entre ces conducteurs une force de 2.10-7 newton par mètre de

longueur.

Kelvin (K) Le kelvin est la fraction 1/273,16 de la température thermodynamique du point

triple de l'eau

Candela (cd)

La candela est l'intensité lumineuse, dans une direction donnée, d'une source

qui émet un rayonnement monochromatique de fréquence 540.1012 hertz et dont

l'intensité énergétique dans cette direction est 1/683 watt par stéradian.

Mole (mol)

La mole est la quantité de matière d'un système contenant autant d'entités

élémentaires qu'il y a d'atomes dans 0,012 kilogramme de carbone 12.

Lorsqu’on emploie la mole, les entités élémentaires doivent être spécifiées et

peuvent être des atomes, des molécules, des ions, des électrons, d’autres

particules ou des groupements spécifiés de telles particules.

Concrètement, la mise en pratique de la métrologie s’articule autour de deux notions

fondamentales pour permettre in fine la comparabilité des mesures. La première est la

détermination d’une indication quantitative sur la qualité d’un mesurage. Celle ci s’effectue par la

caractérisation de la dispersion des valeurs attribuées à un mesurande, c’est à dire le calcul de

l’incertitude de mesure (ISO 2007).

L’une de ses première définition faisait état d’une erreur associée au résultat (NF X 07-001 1970).

Ce n’est qu’à partir de 1984 (NF X 07-001 1984) que l’incertitude est devenue un « intervalle

contenant la valeur vraie » et n’a plus traduit une erreur de mesure, qui elle se définit comme « la

25

différence entre la valeur mesurée d’une grandeur et une valeur de référence » (ISO 2007). Ceci

explique pourquoi, encore de nos jours, il est fréquent de voir l’association des termes incertitude

et erreur (Drosg 2007).

La seconde notion propre à toute démarche en métrologie est la traçabilité. Elle s’effectue à

travers le raccordement d’une mesure à une référence via une chaîne ininterrompue d’étalonnages

dont chacun contribue à l’incertitude de mesure (ISO 2007). Contrairement à l’incertitude qui doit

être calculée, la traçabilité est une propriété du résultat qui se démontre (Quevauviller 2004).

Ces deux notions sont complémentaires car pour assurer la traçabilité d’une valeur, il est

nécessaire de calculer son incertitude, et pour comparer des résultats au moyen de leur incertitude

il faut que ces résultats soient traçables à la même référence.

1.2 Intérêts de la métrologie

Pour comprendre l’intérêt de la métrologie, il faut s’interroger sur les occasions qui demandent

qu’un mesurage soit réalisé. Celles ci sont multiples ; que ce soit en science, dans les échanges

économiques, ou dans la vie au quotidien, il est difficile d’imaginer une circonstance qui ne fasse

pas appel à une mesure. Ceci se traduit dans les économies européennes où la valeur marchande

des mesures réalisées atteint 6% de la somme des Produits Nationaux Bruts (Euramet 2008). Il

est ainsi compréhensible qu’une simple mesure ne soit pas suffisante et que sa traçabilité à des

références connues soit une condition indispensable.

En observant la métrologie suivant ses trois catégories, il est possible de dégager leur intérêt

propre :

- la métrologie fondamentale accroît la connaissance : elle permet de concevoir les conditions

d'observation d'un phénomène, de construire et qualifier les instruments de son observation, et

d'établir si les résultats obtenus sont significatifs,

- la métrologie industrielle améliore la compétitivité des entreprises : celle ci passe par la qualité

d'un produit, qui est son aptitude à satisfaire les besoins des consommateurs et utilisateurs.

Cette qualité peut être démontrée aux clients au moyen de la certification. De plus la

compétitivité suppose que l'industrie mesure et maîtrise finement les volumes et les

performances de l'appareil de production, tout en minimisant les coûts des rebuts et retouches,

- la métrologie légale protège les personnes (sécurité alimentaire, routière, protection de

l'environnement…) et régit les transactions (essence à la pompe ou sur oléoduc, pesage au

détail ou à la cargaison...).

Dans le domaine de la chimie, la métrologie permet également de valider des méthodes

d’analyses. En effet dans ce domaine particulier, les mesures à réaliser ne sont pas directement

accessibles et, le plus souvent, de nombreux traitements doivent être appliqués sur l’échantillon

26

pour libérer l’analyte. Des biais peuvent ainsi affecter la justesse de la mesure. Il est donc

essentiel en chimie analytique d’utiliser la métrologie pour s’assurer de la validation des protocoles

d’analyse. La Figure 1 illustre cette nécessité de validation des méthodes avec les résultats d’une

comparaison de mesures réalisées par plusieurs laboratoires sur la concentration en sélénium

total dans un même échantillon d’eau. Les résultats montrent une grande dispersion et de

l’analyse statistique des résultats il ressort une grande plage de concentrations tolérées pour la

valeur réelle (allant du simple au double).

Eau d'alimentation (BIPEA)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60Laboratoire

Se

µg/l

Figure 1 : Résultats d'une intercomparaison organis ée par le Bureau InterProfessionnel d'Etudes

Analytiques (BIPEA) sur le dosage du sélénium dans une eau d’alimentation – les barres

horizontales représentent les tolérances issues de l’analyse statistique des données

1.3 Organisation de la métrologie

Pour permettre une comparabilité des données, il est nécessaire d’utiliser des références uniques

à travers le monde. Une organisation internationale fut érigée afin de garantir le développement et

le maintien des références : le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM).

1.3.1 Bref historique

Les premières unités trouvaient leur origine en référence avec le corps humain ou la nature (pied,

coudée, grain …). Elles étaient souvent complexes à utiliser de par le manque de relation simple

entre subdivisions d’une grandeur et ne permettaient aucune comparaison de par un défaut

d’homogénéité dans les références (de Talleyrand 1790, BNM 2004).

Les premières réflexions sur une réforme et l’universalité d’un système de mesure sont apparues

dès le début du XVIIIe siècle dans plusieurs pays d’Europe. En France, la loi du 1er août 1793 a

27

instauré les bases d’un système décimal pour les subdivisions des unités. Cependant,

l'établissement véritable du système métrique décimal a été promulgué par la loi du 7 avril 1795

avec la création du mètre étalon en platine et l’édition de la nouvelle nomenclature des unités

comprenant le gramme, le mètre et leur préfixe associés. En raison des instabilités politiques de

l’époque, ce n’est que le 1er janvier 1840 que l’application du système métrique est effective. Entre

temps, d’autres nations ont déjà instauré et établi le système métrique.

Les échanges commerciaux entre pays commençant à se multiplier avec la première révolution

industrielle, le nouveau système métrique décimal continue à de se diffuser. De 1870 à 1875, les

différentes conférences internationales organisées furent un lieu de réflexion pour l’ébauche d’un

pilotage du système métrique. Celles ci ont débouché sur un traité diplomatique signé le 20 mai

1875 et réunissant 17 pays signataires de la « Convention du mètre ». Cet accord conduit à

l’instauration du Comité International des Poids et Mesures (CIPM) et son entité scientifique : le

Bureau International des Poids et Mesures (BIPM).

1.3.2 La Convention du Mètre

La Convention du Mètre a permis la mise en place d’une structure permanente, en la présence du

BIPM, permettant aux états membres d’avoir une action commune sur toutes les questions se

rapportant aux unités de mesure (BIPM 1995).

Tous les quatre ans, la Conférence Générale des Poids et Mesures (CGPM) réunit les états

membres (au nombre de 51 plus 27 nations associées au mois d’avril 2008) pour débattre de

l’amélioration du système métrique en relation avec les nouveaux besoins et les progrès

scientifiques réalisés. La CGPM définit ainsi l’organisation et le développement du BIPM. La

supervision et la direction des travaux du BIPM s’effectuent par le CIPM. De plus, ce comité

soumet un programme de travail lors des conférences générales CGPM pour permettre de

redéfinir les objectifs du BIPM à la lumière des avancées scientifiques. Ainsi, le Système

International des unités (SI) est institué au cours de la 10ème CGPM de 1960 avec l’apparition de

nouvelles unités. Puis lors de la 14ème CGPM de 1971, la mole fut introduite dans le SI. Pour

assister le CIPM, des groupes de travail appelés Comités Consultatifs et réunissant les experts de

chaque domaine ont été créés. Ils permettent d’étudier les progrès réalisés qui peuvent avoir une

influence sur la métrologie. Les Comités Consultatifs sont également responsables d’organiser les

intercomparaisons internationales entre Instituts Nationaux de Métrologie. Actuellement, ils sont au

nombre de 9, dont le Comité Consultatif pour la Quantité de Matière (CCQM) dans le domaine de

la chimie. Les Instituts Nationaux de Métrologie prennent le relais du BIPM au niveau national pour

l’assister dans le pilotage et la dissémination de la métrologie.

La Figure 2 illustre l’organisation de la métrologie au travers de la Convention du Mètre.

28

Figure 2 : Organigramme de la métrologie selon la C onvention du Mètre (BIPM 1995)

1.3.3 Les Instituts Nationaux de Métrologie

Les Instituts Nationaux de Métrologie (INMs) ont pour mission d’assurer la diffusion du SI au sein

de leur état. A travers l’arrangement de reconnaissance mutuelle (MRA) du 14 octobre 1999 (BIPM

2003), les INMs signataires adhèrent à un système permettant les reconnaissances mutuelles de

leur capacité de mesure. Cet accord a pour objectifs i) d’établir des degrés d’équivalence entre les

étalons nationaux de mesure conservés par les INMs, ii) de pourvoir à la reconnaissance mutuelle

des certificats d'étalonnage et de mesurage émis par les INMs et iii) de fournir ainsi aux

gouvernements et aux autres parties un fondement technique solide à d'autres accords plus

étendus liés au commerce international, au négoce et aux activités de réglementation (BIPM

2003).

Les moyens mis en œuvre sont :

- l’utilisation de comparaisons internationales de mesurages, désignées comparaisons clés

(dénommée K, de l’anglais Key) et qui servent à faire reconnaître les capacités de mesures

des INMs,

29

- l’utilisation de comparaisons internationales de mesurages supplémentaires (dénommée P, de

l’anglais Pilot study) qui sont utilisées pour établir un état de l’art et démontrer des capacités

actuelles de mesures ; des laboratoires experts dans leur domaine peuvent être invités à y

participer,

- l’établissement par les INMs de systèmes de qualité et de démonstration de leurs

compétences.

Suite à leur participation aux intercomparaisons, les INMs peuvent déclarer des aptitudes en

matière de mesures et d’étalonnage (CMC), inscrites dans la base de données gérée par le BIPM

et accessible sur internet. Par leur mission, les Comités Consultatifs sont chargés de préparer et

d’organiser les intercomparaisons internationales en fonction de l’identification des besoins

émergents auprès des utilisateurs.

En particulier dans le cadre de la quantité de matière, la réalisation d’un étalon primaire

représentatif de la mole n’est pas réalisable pour la mise en pratique du SI (Milton 2001). Des

étalons primaires de chaque analyte peuvent être fabriqués mais leur simple utilisation ne sert qu’à

permettre l’étalonnage des appareils de mesure et ne s’avère pas suffisante pour assurer la

relation de la mesure dans un échantillon réel avec le SI. La raison provient du fait que les

mesurandes ne sont pas directement accessibles et que des traitements de l’échantillon

complexes sont à effectuer avant de réaliser une mesure. De plus, des effets de matrice peuvent

modifier la réponse des appareils lors de mesures effectuées sur un échantillon par rapport à la

mesure sur un étalon.

Pour ces raisons, ce sont les méthodes d’analyses qui sont à évaluer et qui doivent assurer la

relation au SI. Les INMs développent donc des méthodes de référence dites « primaires ». Elles se

définissent comme des procédures permettant d’obtenir un résultat de mesure sans relation avec

un étalon d’une grandeur de même nature (ISO 2007). L’établissement des méthodes primaires

permet de mettre en pratique la réalisation de la traçabilité au SI dans le domaine de la quantité de

matière (Milton 2001). Le désavantage de cette démarche est que pour chaque analyte et pour

chaque matrice il est nécessaire de développer une methode primaire.

1.3.4 Dissémination de la traçabilité

Après le développement d’une méthode primaire et la reconnaissance de ses capacités de

mesures via la participation à une intercomparaison internationale entre INMs, il est du ressort des

Instituts Nationaux de Métrologie de diffuser le raccordement des utilisateurs au SI.

Au niveau de la chimie, la dissémination passe par l’application de ces méthodes primaires pour

fournir des valeurs traçables au SI. Ces mesures peuvent être utilisées dans le cadre de la

30

certification d’un matériau de référence (Rivier 2007) ou comme valeur de référence pour des

essais d’aptitudes (Fisicaro 2007 et 2008b).

Les matériaux de référence certifiés (CRMs) sont des outils quasi-indispensables dans la

validation de méthodes. Ils sont définis comme des matériaux suffisamment homogènes et stables

dont une ou plusieurs valeurs de leurs propriétés sont spécifiées avec leurs incertitudes et leurs

traçabilités associées (ISO 2007). Deux types de CRMs peuvent être rencontrés. Il peut s’agir

d’étalons de haute pureté qui ne contiennent que l’analyte d’intérêt ; ces CRMs servent à étalonner

les systèmes de mesure (Rivier 2007). D’autres CRMs sont des échantillons représentatifs d’un

type de matrice et pour lesquels la concentration d’au moins un analyte est certifiée. L’étude de

ces CRMs par les laboratoires d’analyses leur permet de s’assurer de la justesse de la méthode

utilisée. Si les résultats obtenus sont compatibles avec le certificat, l’analyse du CRM permet alors

de prétendre à la traçabilité des mesures effectuées par la méthode du laboratoire à condition que

le certificat atteste formellement du raccordement du matériau au SI et qu’il inclue des incertitudes

de mesure. La limite de l’utilisation des CRMs provient du fait qu’ils ne sont valables que pour un

type d’échantillon, un unique analyte le plus souvent et dans une seule gamme de concentration.

Leur développement est long et onéreux ce qui restreint leur nombre. Ainsi, la banque de données

COMAR recense plus de 20 000 CRMs mais qui ne couvrent que 10% des besoins des utilisateurs

(Fisicaro 2007).

Une seconde voie pour la validation de méthode repose sur la participation à des exercices

d’intercomparaison. Chaque laboratoire participant fournit son résultat suite à l’application de sa

méthode sur un même échantillon inconnu. De ces essais d’aptitudes découle une valeur

consensuelle issue de l’analyse statistique de l’ensemble des mesures. Même si une justesse

relative peut être obtenue par chaque participant avec la comparaison des résultats et de la valeur

consensuelle, aucune traçabilité n’est accordée à cette valeur. Il est donc nécessaire d’impliquer

une méthode primaire pour fournir une valeur de référence raccordée au SI. Comme pour les

CRMs, la limitation de tels schémas provient du coût de mise en pratique. De plus, chaque

intercomparaison ne peut s’appliquer que pour un analyte, une gamme de concentrations et une

matrice.

La Figure 3 schématise la mise en place de la métrologie. Il en ressort que l’établissement et le

développement de la métrologie est un processus souvent long et impliquant plusieurs acteurs aux

diverses fonctions. Seule leur action coordonnée peut permettre une amélioration de la traçabilité

des mesures.

31

Figure 3 : Implication des différents acteurs dans le développement de la métrologie

1.4 Méthodes primaires pour la quantité de matière

Une méthode est définie primaire par le CCQM si elle ne fait pas référence à la mesure d’un étalon

de même nature pour la détermination de la quantité de l’analyte dans un échantillon (ISO 2007).

Au niveau de la chimie analytique, plusieurs méthodes primaires sont disponibles pour permettre

d’atteindre cet objectif (Kaarls 1997, Richter 1997, Stumpf 2003) :

- La gravimétrie : l’analyte d’intérêt est séparé de l’échantillon sous une forme pouvant être

pesée. Cette méthode est également employée pour la préparation de solutions d’étalon à

partir d’un analyte de haute pureté.

- La titrimétrie : la quantité de matière est déterminée à partir du volume d’une solution titrante

utilisée pour réagir avec l’analyte de façon stœchiométrique.

- La coulométrie : la quantité d’analyte s’obtient par la mesure du courant et du temps

d’application lors d’une réaction électrochimique.

- La double dilution isotopique : le profil isotopique de l’analyte est modifié avec un étalon dont la

signature isotopique est différente de la naturelle (appelé étalon marqué). Le mélange étalon

marqué + échantillon subit la totalité du protocole d’analyse. La lecture du rapport entre

isotopes avec la connaissance de la quantité d’étalon ajoutée permet de déterminer la quantité

d’analyte dans l’échantillon.

D’autres méthodes peuvent potentiellement réunir les critères d’une méthode primaire, comme la

spectrophotométrie qui repose sur la lecture de l’absorbance d’un liquide pour déterminer sa

concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert (Richter 1997). L’activation neutronique suscite le

32

plus d’intérêt ces dernières années de la part du CCQM (Chajduk 2008). Cette technique consiste

à irradier l’échantillon dans un flux de neutrons et à identifier les isotopes radioactifs créés. Dans la

majorité des cas, les réactions mises en jeu sont celles produites par un flux de neutrons

thermiques (faible énergie) conduisant à un radio-isotope comprenant un neutron de plus que

l’isotope de l’élément recherché dans l’échantillon. Cette réaction s’accompagne d’une émission

de rayonnements gamma dont l’énergie est caractéristique de l’isotope étudié. Les limites d’une

telle technique résident dans la nécessité de disposer d’un réacteur nucléaire pour la source de

neutrons.

Dans le cadre de l’étude des éléments traces (≤ mg·kg-1), la méthode primaire de choix est la

dilution isotopique. Elle se révèle être une méthode de haute sensibilité, idéale pour les faibles

concentrations des analytes dans les échantillons.

Historiquement, l’invention du principe de la dilution isotopique (DI) est attribuée aux zoologistes

qui l’utilisaient pour réaliser le comptage des espèces animales (Vogl 2007, Meija 2008). Son

mode opératoire repose sur la modification d’une population par l’introduction d’une seconde

population portant un signe distinctif. Si le mélange entre les deux populations est atteint et que le

nombre d’espèces marquées est connu alors la mesure de la proportion entre les deux populations

permet d’obtenir le nombre d’individus non marqués initiaux (Meija 2008). Ce principe peut

s’appliquer indifféremment pour la zoologie ou la quantité de matière. Dans le domaine de la

chimie analytique, le marquage de l’élément s’opère sur ses isotopes, le mélange de l’étalon

marqué avec l’analyte à doser modifie le profil isotopique et la lecture de la nouvelle signature

isotopique permet d’obtenir la concentration initiale de l’élément (de Bièvre 1994). L’étalon marqué

joue alors le rôle d’un étalon interne idéal : une fois en équilibre avec l’échantillon, il réagit de la

même façon que l’analyte sans risque de modification des rapports isotopiques qui sont les seules

mesures à réaliser pour obtenir la concentration.

La Figure 4 illustre le principe de la dilution isotopique.

Figure 4 : Principe de la dilution isotopique –

application sur deux isotopes du sélénium ; R(78/76 ) représente les rapports isotopiques

33

La dilution isotopique présente plusieurs avantages (de Bièvre 1994, Sargent 2002, Stumpf 2003,

Rodriguez-Gonzalez 2005, Vogl 2007) :

- Caractère absolu de la méthode car ne nécessitant pas d’étalonnage préalable du détecteur,

- Non besoin de quantitativité sur le traitement de l’échantillon à condition que l’équilibre avec

l’étalon marqué soit atteint,

- Indépendance de l’évolution de l’analyte à condition que l’équilibre soit atteint,

- Indépendance de la réponse du spectromètre de masse ; la mesure des rapports isotopiques

n’est que peu affectée par les effets dus à la matrice ou à la dérive du détecteur,

- Sensibilité de la détection obtenue grâce aux spectromètres de masse,

- Sélectivité des mesures car elles ne sont basées que sur les isotopes d’un élément,

- Grande plage d’application ; des fractions de masse du niveau d’ultratraces (ng·kg-1) jusqu’à la

composition au niveau du pourcentage peuvent être déterminées.

Tous ces avantages font de la DI une méthode robuste permettant d’obtenir des résultats

réunissant justesse et fidélité. Cependant comme pour chaque méthode analytique, il existe des

limites et des exigences liées à son utilisation (de Bièvre 1994, Sargent 2002, Rodriguez-Gonzalez

2005, Vogl 2007) :

- Au moins deux isotopes de l’élément doivent être disponibles à l’état naturel ou des radio-

isotopes doivent être synthétisables avec une période de demi-vie suffisamment longue,

- L’étalon marqué doit être commercialement disponible ou facilement synthétisable,

- Les isotopes suivis doivent être libres de toutes interférences pour ne pas apporter de biais,

- L’équilibre entre l’analyte et l’élément marqué est primordial pour garantir le résultat, en

particulier aucune perte ne doit intervenir avant l’équilibre,

- L’utilisation d’éléments marqués et de spectromètres de masses est coûteuse,

- La DI est une analyse destructive.

La DI est applicable pour l’analyse d’environ 75 éléments du tableau périodique de Mendeleïev (de

Bièvre 1994).

Il peut être également remarqué que la dilution isotopique est basée sur l’utilisation d’un étalon

pour la détermination de la concentration de l’échantillon. Pour autant, son emploi n’invalide pas la

DI en tant que méthode primaire pour plusieurs raisons. D’abord, ce n’est pas une mesure sur une

quantité de matière issue de l’étalon qui est utilisée mais une mesure sur un rapport d’abondances

isotopiques issu du mélange échantillon/étalon marqué. De plus, la concentration de l’étalon de

référence est obtenue à partir d’une autre méthode primaire (la gravimétrie) et celle de l’échantillon

est connue grâce à une équation explicitement connue à partir de la concentration de l’étalon

(Richter 1997).

34

Au final, la DI peut donc être considérée comme une méthode primaire de mesure, à conditions i)

d’associer un calcul d’incertitudes sur la concentration finale et ii) de démontrer la traçabilité de

l’analyse au SI.

1.5 Calcul de l’incertitude

Dans le cadre d’une mesure de quantité de matière, plusieurs approches sont disponibles pour

réaliser le calcul de l’incertitude du résultat. Leur classification repose sur deux modes distincts

d’évaluation : l’approche menée par un laboratoire seul (intralaboratoire) et celle basée sur des

études issues de plusieurs laboratoires au cours de collaborations (interlaboratoire) (Désenfant

2007, Eurolab 2007, Fisicaro 2008a).

L’approche intralaboratoire repose, par définition, sur l’utilisation de données internes au

laboratoire. Si un modèle mathématique peut être associé au résultat du processus de mesure,

alors l’approche décrite par le guide GUM (Guide to the expression of Uncertainty in Measurement,

ISO/IEC 1995) est utilisée. Si aucun modèle ne peut décrire le processus de mesure, il est alors

nécessaire de répéter les mesures en faisant varier tous les facteurs influents. De cette répétition

des mesures découle l’estimation de la reproductibilité du processus d’analyse. L’association de

cette valeur à d’autres paramètres influents, comme l’estimation de la justesse, permet une

évaluation de l’incertitude du résultat.

L’approche interlaboratoire repose sur les résultats d’un essai d’intercomparaison mené pour

évaluer une méthode et dont les résultats ont été statistiquement analysés selon la norme NF ISO

5725 pour fournir les écarts-types de répétabilité et reproductibilité (données publiées). Dans ce

cas de figure, il est aussi important d’évaluer la justesse de la méthode pour pleinement estimer

l’incertitude de mesure. Une seconde alternative est possible, via la participation du laboratoire à

un essai d’aptitude : l’exploitation des dispersions des résultats entre laboratoires peut être un

indicateur de l’incertitude de mesure.

La Figure 5 représente les différentes approches pour la détermination des incertitudes.

35

Figure 5 : Approches pour l'évaluation de l'incerti tude de mesure (Désenfant 2007, Eurolab 2007,

Fisicaro 2008a)

La méthode préconisée par le GUM permet d’estimer les incertitudes de mesures sans la

participation à des intercomparaisons et tout en limitant le nombre d’essai à réaliser. De plus, elle

autorise l’identification des paramètres les plus influents sur le résultat final. Pour ces raisons, elle

est l’une des méthodes les plus utilisées dans la détermination des incertitudes de mesures.

Le GUM a été établi suite aux recommandations éditées par le BIPM pour l’expression de

l’incertitude expérimentale. Ces recommandations font suite à une volonté de créer un consensus

international sur l’évaluation de l’incertitude et avaient pour objectifs de i) contribuer à une

complète information sur la manière dont est exprimée l’incertitude et ii) fournir une base pour la

comparaison des résultats de mesure (ISO/IEC 1995).

La démarche associée à la méthode GUM peut être décrite en quatre étapes :

i. exprimer mathématiquement la relation entre le mesurande et les grandeurs d’entrée

ii. évaluer l’incertitude-type de chaque grandeur d’entrée

iii. déterminer l’incertitude-type composée du mesurande via la propagation des

incertitudes-types des grandeurs d’entrée

iv. donner le résultat accompagné de son incertitude élargie.

36

Pour déterminer l’incertitude-type composée, plusieurs méthodes sont disponibles : l’utilisation des

dérivées partielles du modèle mathématique avec la loi de propagation des incertitudes,

l’estimation expérimentale de l’effet de la variation d’un seul paramètre ou, plus récemment

proposée, la simulation numérique avec l’application de la méthode Monte-Carlo (ISO/IEC 1995,

JCGM 2008). Le guide Eurachem pour la quantification de l’incertitude de mesure, basé sur le

GUM mais en application pour la quantité de matière, fait également référence à autre méthode

numérique : la méthode de Kragten (Eurachem 2000). Contrairement à l’utilisation de la loi de

propagation des incertitudes, aucune dérivée partielle n’est à déterminer, leur valeur étant obtenue

par un calcul numérique (Kragten 1994, Désenfant 2007).

37

2 L’analyse de spéciation

Suite à l’augmentation des études menées par les laboratoires de recherche dans le domaine des

analyses de spéciation, le Comité Consultatif pour la Quantité de Matière (CCQM) a identifié ce

domaine comme un axe important du développement de la chimie analytique et a fortiori de la

métrologie. Des études ont donc commencé, dès 2002, pour permettre aux Instituts Nationaux de

Métrologie de comparer leur possibilité de mesure par l’application de leur méthode primaire à

l’analyse de spéciation (Sturgeon 2002).

2.1 Définition

Les éléments traces peuvent avoir plusieurs effets sur l’environnement : des propriétés

bénéfiques, une essentialité, une innocuité ou une toxicité. Pour permettre d’évaluer leur impact,

les études ont toujours portées sur une notion clé : la concentration d’exposition. Cependant,

depuis plusieurs années, un second concept est associé à cette information pour améliorer la

compréhension de l’influence des éléments traces sur l’environnement : l’espèce chimique

d’exposition. Les nouvelles études portent dorénavant sur la caractérisation et la détermination des

quantités des formes des éléments et associent ces nouvelles informations à l’observation des

effets (WHO 2006).

L’Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC) a défini en 2000 les termes relatifs à

la spéciation des éléments (Templeton 2000, Seby 2007) :

- L’espèce chimique est la forme spécifique d’un élément définie par sa composition isotopique,

sa structure électronique ou son état d’oxydation, sa présence sous forme de complexe et/ou

sa structure moléculaire.

- L’analyse de spéciation représente l’activité de chimie analytique qui permet l’identification

d’une ou plusieurs espèces et/ou la détermination de leur quantité.

- La spéciation d’un élément correspond à sa distribution entre ses différentes espèces dans un

système donné.

2.2 Intérêts

Dans toute science ayant trait aux éléments inorganiques (métaux et métalloïdes) il peut être

intéressant de mener une analyse de spéciation. En effet, les effets des éléments sont avant tout

intrinsèquement liés à leur capacité à être absorbés, transportés ou excrétés et ces mêmes

phénomènes ne sont pas seulement dépendants de l’élément mais aussi de la réactivité et de

l’arrangement spatial des espèces présentes. Pour ces raisons, il est difficilement envisageable de

réaliser des analyses dans le domaine de l’environnement, du bio-médical ou de l’agroalimentaire

sans avoir recours à la spéciation des éléments. Dans le domaine industriel, il est également

38

crucial de clairement élucider les procédés de fabrication mis en place. La spéciation est dans ce

cadre un outil supplémentaire pour répondre à la compréhension qui précède toute optimisation

des systèmes de production.

Les analyses de spéciation ont également un intérêt dans la mise en place d’une réglementation et

du contrôle des risques. L’étude de toxicité d’un élément menée avec une espèce faiblement

toxique sous-estime le risque associé s’il peut être présent sous une forme à plus fort impact

sanitaire. Inversement, une étude menée sur un élément avec une espèce hautement toxique mais

dont l’espèce d’exposition de l’élément est faiblement toxique sur-estime le risque et peut

engendrer un impact économique non négligeable.

Il est donc essentiel de clairement identifier les espèces d’exposition pour pleinement évaluer les

risques associés à chaque élément.

2.3 Démarche

Le développement des analyses de spéciation représente un pont entre les deux grands domaines

de la chimie analytique : l’inorganique et l’organique. En effet, pour permettre l’étude des espèces

d’un élément, les techniques jusqu’alors utilisées dans l’analyse de composés organiques ont été

adaptées afin de satisfaire les nouveaux besoins du domaine inorganique. Cette appropriation de

savoir-faire est surtout réalisée au niveau des traitements appliqués à l’échantillon avant son

analyse par le détecteur.

La première modification majeure se rencontre au niveau du protocole de mise en solution des

analytes contenus dans l’échantillon avant leur analyse. Dans le cas d’une détermination de la

concentration totale d’un élément, la mise en solution doit être réalisée avec des digestions

agressives utilisant des acides et des oxydants pour permettre de solubiliser la matrice de

l’échantillon et libérer l’élément. En analyse de spéciation, l’étape d’extraction se limite à une

solubilisation des analytes, leur intégrité devant être préservée pour conserver l’information sur la

spéciation originelle. Cette extraction « douce » doit cependant rester quantitative pour assurer la

justesse du résultat final.

Une fois cette étape de mise en solution réalisée, l’analyte de principal intérêt doit être séparé de

la matrice résiduelle de l’échantillon mais aussi des autres espèces de l’élément. La séparation de

composés se déroule dès lors en utilisant des techniques comme la chromatographie ou

l’électrophorèse.

Les autres étapes constitutives de l’analyse de spéciation sont également rencontrées dans le

cadre d’analyse en mode total : échantillonnage et détection de l’analyte. La Figure 6 résume la

démarche générale de l’analyse de spéciation. Il est à noter que d’autres étapes peuvent

compléter cette figure, comme le stockage des échantillons et de ses extraits ou des traitements

additionnels pour modifier l’état des analytes (comme la dérivation des espèces pour leur analyse

en chromatographie en phase gazeuse) (Monperrus 2004).

39

Figure 6 : Démarche générale de l'analyse de spécia tion

L’accumulation des différentes étapes conduisant au résultat final pose la question de la fiabilité de

la méthode. Ainsi, il est utile de démontrer que la méthode employée est valide. Cette validation

doit non seulement permettre de s’assurer de la fiabilité du résultat mais également démontrer qu’il

est traçable au SI et préciser avec quelle fidélité (grâce au calcul de l’incertitude du résultat). Une

fois cette étape réalisée, le résultat est comparable et peut être interprété.

40

3 Métrologie appliquée à l’analyse de spéciation

Depuis plusieurs années, il est devenu primordial que la métrologie prenne en compte les

analyses de spéciation pour améliorer la traçabilité des analyses. Des besoins en particulier ont

été notés pour l’évaluation des méthodes au travers du développement de i) CRMs (Larsen 1998,

Quevauviller 1999a, de Guillebon 2001, le Bouil 2007) et ii) des essais d’aptitudes (Quevauviller

1999b, Adams 2000). Néanmoins comme cela a déjà été souligné, ces outils ne permettent une

traçabilité au SI qu’à condition qu’une méthode primaire de mesure soit employée pour la

caractérisation des échantillons. En conséquence, le premier développement à réaliser de la part

des INMs est la mise en place d’une méthode primaire qui pourra être par la suite appliquée aux

échantillons en vue d’une certification ou destinés aux intercomparaisons.

La méthode primaire applicable aux analyses de spéciation des éléments traces est la dilution

isotopique (DI). Son utilisation dans ce domaine fait apparaître de nouveaux besoins.

En premier lieu, l’ajout de l’étalon marqué et son équilibre avec l’échantillon deviennent des étapes

essentielles et beaucoup plus difficiles à atteindre par rapport aux analyses de l’élément total. En

effet, l’utilisation de systèmes fermés pour minéraliser l’échantillon limitait les différences de

comportement entre analyte et étalon marqué en obtenant une mise en solution quantitative. Dans

le cas d’une analyse de spéciation, il est essentiel pour conserver l’information sur la spéciation

originelle d’extraire en douceur les analytes. Il doit donc être démontré que l’élément ou l’espèce à

mesurer soit extrait de façon quantitative pour assurer la justesse du résultat (Meija 2008).

La mise en pratique de la DI dans les analyses de spéciation conditionne également le choix des

techniques à mettre en œuvre pour la détection. Les facultés (nouvelles et anciennes) dont il est

nécessaire de disposer sont :

- autoriser le couplage en ligne avec la technique séparative,

- être capable de suivre plusieurs isotopes issus de signaux transitoires sans discrimination,

- être sensible,

- être spécifique.

Plusieurs techniques de spectrométrie de masse sont disponibles pour atteindre ces objectifs. Le

type d’ionisation utilisé conditionne en grande partie les différentes alternatives avec soit une

ionisation « douce » qui se réalise au niveau moléculaire comme avec l’électrospray (ESI-MS) ou

soit une atomisation de la molécule comme lors de la spectrométrie de masse à couplage inductif

du plasma (ICP-MS). L’avantage de méthodes telles que l’ESI-MS repose sur un plus grand choix

de marquage de l’étalon marqué impliqué dans la DI : sur un hydrogène (deutérium), sur

éventuellement un atome d’azote (15N), sur un carbone (13C) ou sur l’élément (Meija 2008).

Cependant cette technique souffre d’effets de matrices plus important entre isotopes (surtout pour

un marquage au deutérium) et de limites de détection supérieures à l’ICP-MS (Meija 2008, Ogra

41

2008). L’utilisation d’une technique qui réduit la molécule à l’état d’atome procure plusieurs

avantages. Outre une meilleure sensibilité, ce type d’ionisation est moins affecté par les effets de

matrices entre isotopes et procure une plus grande spécificité des mesures. Par contre, cette

technique d’ionisation souffre également de biais sur la transmission des isotopes jusqu’à

l’analyseur (fractionnement isotopique). De plus, l’ICP-MS limite l’utilisation de la DI aux espèces

marquées sur l’élément et non plus sur les composants de la matière organique (N, H ou C).

Cependant, l’utilisation du marquage sur l’élément ajoute également un avantage avec la

possibilité d’élucider des transformations inter-espèces et d’en corriger les résultats (Hintelmann

2002, Rodriguez 2005).

Dans le cadre de ces travaux de thèse, il est donc proposé de mettre en place des méthodes dites

primaires pour permettre d’assurer la traçabilité des mesures d’analyses de spéciation.

L’application de la dilution isotopique a été réalisée pour le sélénium et le mercure en raison de

l’intérêt croissant de la législation pour ces deux éléments. Les études ont porté particulièrement

sur les traitements à apporter aux échantillons pour s’assurer d’une extraction quantitative des

espèces de principaux intérêts, garante d’un résultat juste en DI. Les techniques séparatives ont

été mises au point pour assurer une isolation efficace des espèces tout en étant compatibles avec

l’ICP-MS. La détection par ce spectromètre de masse a aussi été optimisée pour limiter les biais

inhérents à cette technique. Suite à la mise en place des techniques analytiques, l’apport

métrologique a été étudié par le calcul des incertitudes finales, via l’utilisation de la méthode du

GUM, et la démonstration de la traçabilité des résultats au SI.

Une fois l’ensemble du protocole métrologique mis en place, il a été validé par l’analyse de CRMs

et la participation à une intercomparaison entre Instituts Nationaux de Métrologie.

42

Chapitre II : Synthèse bibliographique

44

45

1 Le sélénium

1.1 Généralités

1.1.1 Propriétés physico-chimiques

Le sélénium (Se) est un des éléments les plus rares avec une abondance dans la croûte terrestre

le situant à la 70ème place sur les 88 corps naturellement présents (Reilly 2006). Il a été isolé pour

la première fois par le suédois Jöns Jakob Berzélius en 1817. Cependant dès le treizième siècle,

l’italien Arnold de Villanova décrit un « soufre rouge » dont il est probable que ce soit la première

évocation du sélénium (Reilly 2006).

En 1943, le risque cancérigène de Se est évoqué suite à une exposition de populations de rat à du

séléniure de potassium (K2Se), du sélénium présent dans du blé ou du maïs (Nelson 1943). Cette

étude a été à l’origine de la mauvaise réputation de l’élément. Ce n’est qu’en 1957 que son

importance pour la santé a été mise en évidence par les travaux de Schwarz et Foltz ; démontrant

son rôle en tant qu’oligo-élément et suggérant qu’il prend part à des réactions d’oxydoréduction du

métabolisme (Schwarz 1957). Depuis plusieurs études ont confirmé son rôle essentiel pour les

organismes vivants et plus particulièrement sur la santé humaine (Rayman 2000, Hatfield 2006).

Le sélénium appartient à la classe des métalloïdes, ou semi-métalliques, ce qui lui confère des

propriétés intermédiaires à celles d’un métal et qui explique ses diverses applications industrielles.

En particulier, sa faculté de semi-conducteur explique ses nombreux usages dans l’électronique.

Les principales caractéristiques de cet élément sont regroupées dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Propriétés physico-chimique générales d e Se (WHO 1987 ; IUPAC 2003 ; Reilly 2006)

Numéro atomique 34

Période / groupe 4 / 16 (VIa) chalcogène

Structure électronique [Ar] 3d10 4s2 4p4

-II 0 +IV +VI Degré d’oxydation à l’état naturel

séléniure sélénium sélénite séléniate

Masse molaire 78.96 ± 0.03 g·mol-1

A l’état naturel, le sélénium est composé de six isotopes stables (Tableau 3). Des isotopes

radioactifs peuvent être rencontrés comme 75Se à la période de demi-vie de 120.4 jours et utilisé

comme traceur dans des études biologique (Reilly 2006) ou 79Se issu de la fission de l’uranium 235

dans les réacteurs nucléaires au temps de demi-vie de 3.77.105 ans (Bienvenu 2007).

46

Tableau 3 : Composition isotopique du sélénium à l’ état naturel (IUPAC, 2003)

Isotope 74 76 77 78 80 82

Répartition (%) 0.89 ± 0.04 9.37 ± 0.29 7.63 ± 0.16 23.77 ± 0.28 49.61 ± 0.41 8.73 ± 0.22

1.1.2 Espèces séléniées

Le sélénium a des propriétés chimiques analogues avec le soufre et avec le tellure, ce qui explique

la similitude rencontrée entre leurs composés et ceux de Se (Reilly 2006). Ainsi tout comme le

soufre, Se à la possibilité de former de nombreuses espèces organiques principalement issues du

métabolisme des êtres vivants (Barceloux 1999). Plus particulièrement, la découverte en 1973 de

séléno-protéines (Rotruck 1973), protéines nécessitant Se pour être fonctionnelles, a été le point

de départ de recherches sur la biochimie du sélénium afin d’élucider les processus mis en place

dans le métabolisme des êtres vivants (Hatfield 2006). Depuis de nombreuses espèces

organiques ont pu depuis être mises en évidence (Casiot 1999b, McSheehy 2002) et grâce aux

avancées technologiques, il est toujours possible d’aller plus loin dans l’identification de ces

composés (Tastet 2008). Le Tableau 4 répertorie quelques exemples d’espèces rencontrées dans

les organismes vivants.

Tableau 4 : Exemples d’espèces de sélénium rencontré es dans l’environnement (Barceloux 1999,

Reilly 2006, Dumont 2006)

Composé Espèce

Sélénométhionine, SeMet

Sélénocystéine, SeCys

Se-méthyle-sélénocystéine, MeSeCys

Ion triméthylsélénonium, TMeSe+

Diméthyle-diséléniure (DMeDSe) H3C-Se-Se-CH3

Diméthyle-séléniure (DMeSe) H3C-Se-CH3

Méthane sélénol (MeSeH) H3C-SeH

47

1.2 Occurrence dans l’environnement

1.2.1 Sols

Le sélénium est largement réparti à travers les différents compartiments environnementaux mais

de manière hétérogène. Les concentrations sous lesquelles il est rencontré sont fortement

dépendantes de la localisation géographique des sols (Dumont 2006, INERIS 2008). Ainsi des

zones séléniprives ont pu être identifiées en Nouvelle-zélande avec des taux de 0.1 mg·kg-1 et des

zones sélénifères comme en Irlande avec une valeur maximale de 1200 mg·kg-1 (WHO 1987,

Barceloux 1999). L’apport du sélénium dans les sols provient essentiellement de l’érosion de la

roche mère où le sélénium se retrouve sous forme de sélénites (SeIV) et séléniures associés à

des minéraux sulfurés et à des fractions de masse inférieures à 1 mg·kg-1 (WHO 1987, Barceloux

1999). Une fois dans les sols, Se est rencontré sous forme de sélénium élémentaire, de sels de

séléniates, de complexes insolubles de sélénite ferrique ou de composés organiques issus de la

dégradation d’organismes vivants (Barceloux 1999, Reilly 2006).

1.2.2 Air

L’atmosphère joue un rôle important dans le cycle bio-géochimique du sélénium, influant sur son

transport et sa transformation. Comme pour beaucoup d’éléments, sa présence est liée aux

activités naturelles (érosion des sols, volcanisme, feux de forêt, biosphère…) et anthropiques

(combustion d’énergies fossiles, incinération d’ordures ménagères…) (WHO 1987, Wen 2007).

Les concentrations en Se sont généralement estimées à moins de 10 ng·m-3 (WHO 1987). De par

leur différence de comportements dans l’atmosphère, trois catégories de sélénium y sont

répertoriées :

- Les composés organiques volatils : DMeSe, DMeDSe, méthane sélénol (MeSeH)…

- Les composés inorganiques volatils : sélénium élémentaire, séléniure de dihydrogène (H2Se),

dioxyde de sélénium (SeO2)

- Le sélénium particulaire : Se0 lié à des cendres ou des particules (Wen 2007).

1.2.3 Eaux

Dans les eaux, le sélénium est peu présent et provient de dépôts issus de l’atmosphère ou par

drainage des sols et sous-sols. Les concentrations les plus souvent rencontrées sont les

suivantes (Barceloux 1999) :

- entre 0.06 et 400 µg·kg-1 pour les eaux de surface et souterraine

- entre 0.04 et 0.12 µg·kg-1 dans l’eau de mer

- inférieures à 10 µg·kg-1 dans l’eau potable, cette concentration représente la valeur limite

recommandée par l’organisation mondiale de la santé et celle en application dans la législation

européenne (INERIS 2008).

48

Occasionnellement, des concentrations plus élevées peuvent être rencontrées dans des puits de

zones riches en sélénium ou suite à la contamination des eaux par ruissellement sur des sols

sélénifères (Reilly 2006).

Dans les eaux, le sélénium est retrouvé sous forme de sels des acides sélénique (H2SeO4) ou

sélénieux (H2SeO3) (Barceloux 1999) et la présence d’organismes aquatiques peut entraîner la

métabolisation du sélénium sous des formes organiques (acide séléno-aminés, Se méthylé)

(INERIS 2008). Cependant, ces espèces sont rapidement dégradées via les bactéries ce qui limite

leur concentration (Barceloux 1999).

1.2.4 Organismes vivants

Dans les organismes vivants, la concentration en sélénium dépend fortement de plusieurs

paramètres tels que leur positionnement dans la chaîne alimentaire, leur métabolisme, la

biodisponibilité et la concentration des formes auxquelles ils sont exposés.

Chez les végétaux, le sélénium est principalement assimilé depuis la forme de séléniate qui

semble utiliser les transporteurs spécifiques du sulfate au niveau des racines (Barceloux 1999). Se

est par la suite réduit en séléniures au sein de composés organiques comme les acides aminés

SeMet ou SeCys. Une voie d'élimination passe par la synthèse de composés méthylés (DMeSe,

DMeDSe) (Dumont, 2006). Généralement les fruits ne contiennent que de faibles fractions de

masse en Se, dépassant rarement les 10 µg·kg-1 (Barceloux 1999, Navarro 2008). Des

concentrations plus élevées sont rencontrées dans des plantes possédant de forts taux de

protéines, comme la noix du Brésil : valeur moyenne de 3800 µg·kg-1 (Navarro 2008). D’autres

plantes sont capables d’accumuler efficacement Se, comme l’ail, l’oignon ou le genre des Brassica

(choux, broccoli, moutardes…) en raison de son analogie avec le soufre (Dumont 2006). Les

plantes céréalières ont aussi la possibilité de stocker Se au niveau de leur graine : la moyenne

mondiale des fractions de masse du blé varie entre 20 et 600 µg·kg-1 (Lyons 2003).

Dans le règne animal, les concentrations en sélénium reflètent celles rencontrées dans leur

nourriture qui reste leur principal apport (Barceloux 1999). Se est ingéré sous forme d’espèces

organiques et stocké également sous la forme de composés organiques. Généralement, les

organes (rein, foie) accumulent plus le sélénium que les muscles (Reilly 2006, Navarro 2008).

Contrairement à d’autres éléments comme le mercure, le sélénium ne subit pas de bioamplification

tout au long de la chaîne alimentaire. Les processus rapides d’élimination de Se par les

organismes limitent ce phénomène. Les facteurs de bioconcentration les plus importants se

retrouvent en général sur les premiers niveaux trophiques de la chaîne alimentaire (Barceloux,

1999).

49

1.3 Effets sur la santé humaine

1.3.1 Métabolisme du sélénium

La Figure 7 représente un chemin métabolique pour le sélénium chez l’Homme proposé par

Rayman et al. (2008). Suite à son ingestion, Se peut être incorporé au sein de protéines

générales, avec la substitution d’une méthionine par la sélénométhionine (SeMet). Dans ce cas Se

n’est pas incorporé de façon spécifique (Gromdzinska 2008). Le sélénium peut également être

intégré par le codon UGA au sein de séléno-protéines pour les rendre fonctionnelles (Johansson

2005). L’excès de Se est excrété par la respiration et les urines.

Figure 7 : Schéma du métabolisme du sélénium chez l’ Homme selon Rayman et al. (2008)

Chez l’Homme, il a été relevé la présence d’au moins 25 séléno-protéines (Lenz 2009,

Gromdzinska 2008). Elles sont en majorité associées a un rôle de protection des organismes

contre des agents oxydants, cependant l’ensemble de leur fonction n’a pu être identifiée (Tapiero

2003, Gromdzinska 2008). Le Tableau 5 récapitule quelques séléno-protéines et leur rôle reconnu.

50

Tableau 5 : Séléno-protéines et leur fonction chez l 'Homme (Tapiero 2003, Johansson 2005)

Séléno-protéines Fonction

Glutathiones peroxydases

(incluant les séléno-protéines P et W)

Enzymes anti-oxydantes,

responsables de la réduction des hydroperoxydes

Thioredoxine reductase

Régule les processus redox intracellulaires,

stimule la prolifération des cellules,

participe à la réduction des nucléotides impliqués dans la

synthèse et la réparation de l’ADN

Iodothyronine déionase Produit et régule les hormones thyroïdiennes

L’action des séléno-protéines semble à l’origine d’un rôle préventif du sélénium vis à vis du

cancer : la réduction du stress oxydatif (par la présence d’agents anti-oxydants) ou la réduction

des dommages sur l’ADN, sont des processus cellulaires pouvant limiter le développement d’un

cancer (Rayman 2005).

D’autres effets bénéfiques pour la santé humaine sont hypothétiquement associés à la présence

de sélénium dans l’organisme et souvent corrélés à son rôle antioxydant :

- amélioration du système immuno-défensif des patients atteints du HIV ou d’autres maladies

virales (Rayman 2000, Tapiero 2003)

- essentialité pour la reproduction, plus particulièrement dans la synthèse de la testostérone et

des spermatozoïdes (Rayman 2000)

- action sur l’humeur générale ; limitation de troubles comme la dépression, l’anxiété (Rayman

2000)

- protection contre les risque cardio-vasculaires (Rayman 2000)

- action sur la lutte contre le vieillissement (Tapiero 2003)

- protection des dommages de la peau entraînés par le rayonnement UV (Tapiero 2003)

- défense contre les métaux lourds (WHO 1987, Yoneda 1997, Li 2008).

1.3.2 Carences en sélénium

Etant donnée son importance dans la santé humaine, des maladies liées à un manque en

sélénium sont plus souvent observées que des intoxications. Hormis des troubles sur les fonctions

précédemment attribuées à Se, des affections peuvent survenir en cas de déficit en sélénium

(Tableau 6).

51

Tableau 6 : Exemples de maladies liées à un manque e n sélénium (Barceloux 1999)

Maladie Troubles engendrés

Maladie de Keshan Atteinte du système cardio-vasculaire,

risque mortel

Maladie de Kashin-Beck Atteinte des articulations avec atrophie,

dégénérescence et nécrose des cartilages

Dystrophie musculaire Dégénérescence des fibres musculaires

1.3.3 Excès en sélénium

Suite à une exposition à de fortes concentrations de sélénium, des cas d’intoxications peuvent être

observés.

Une exposition chronique mène à une sélénose et se manifeste par une odeur alliacée de

l’haleine, des éruptions cutanées, une fragilité des ongles et des cheveux (Yang 1983, Barceloux

1999). D’autres symptômes peuvent apparaître comme des caries, des vomissements, nausées,

tremblements ou troubles émotionnels (nervosité, dépression, irritabilité…) (Yang 1983, Barceloux

1999, Reilly 2006).

Une exposition aiguë au sélénium suite à une intoxication par voie orale ou par inhalation conduit à

des troubles respiratoires, une perte de l’odorat, diarrhées, vomissements, goût métallique dans la

bouche (Barceloux 1999, WHO 1987, INERIS 2008). La mort peut survenir suite à de trop fortes

expositions (Lech, 2002).

Bien que des indications semblent indiquer un caractère tératogéne d’une alimentation trop riche

en sélénium (Reilly 2006), aucun effet de cet ordre n’a pu être mis en évidence chez les

mammifères (Barceloux 1999).

Seul le sulfure de sélénium (SeS) peut s’avérer cancérigène (INERIS 2008).

1.4 Supplémentation alimentaire en sélénium

Il est à noter que dans le chapitre suivant, les concentrations évoquées sont les concentrations

totales en Se sans référence aux espèces du sélénium en raison du manque d’information de la

littérature sur la question.

1.4.1 Généralités

Une grande variabilité des valeurs de recommandation pour un apport adéquat en sélénium peut

être relevée dans la littérature :

- le Comité Scientifique pour les Aliments de la Commission Européenne (SCF) évoque une

valeur de 55 µg·j-1 pour les adultes (SCF 2000)

52

- l’Académie Américaine des Sciences (NAS) donne aussi la valeur de 55 µg·j-1 pour les adultes

(Rayman 2000, SCF 2000) bien que la révision du calcul, effectuée par Rayman, conduise à

une valeur de 73 µg·j-1 (Rayman 2000)

- un consortium réunissant l’Organisation Mondiale de la Santé (WHO), l’Agence Internationale

de l’Energie Atomique (IAEA) et l’Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et

l'Agriculture (FAO) estime l’apport minimal à 40 µg·j-1 pour les hommes et à 30 µg·j-1 pour les

femmes (Rayman 2000)

- Schrauzer (2003) évoque un apport optimal en sélénium de 70 µg·j-1 pour un homme de 79 kg.

Ces valeurs sont sensées correspondre à l’apport quotidien en sélénium supposé nécessaire pour

une activité optimale des glutathiones peroxydases (GPx) chez l’Homme adulte (Rayman 2000,

Schrauzer 2003). La différence peut s’expliquer par la provenance des données utilisées pour leur

calcul et de la non prise en compte de la spéciation pour mener les études toxicologiques.

Cependant, ces valeurs sont insuffisantes pour obtenir les qualités immunologiques

précédemment citées du sélénium (paragraphe 1.3). Rayman (2004) évoque une plage d’apport

se situant entre 75 et 125 µg·j-1 pour l’effet chémopréventif du sélénium tandis que Schrauzer

(2003) cite un apport de 200 µg·j-1 comme étant nécessaire pour une protection contre le cancer et

une production d’anticorps satisfaisante.

Au vu des apports moyens rencontrés dans certains pays (Tableau 7), certaines populations se

retrouvent en deçà d’un apport optimal en sélénium. Il s’avère donc crucial de réaliser une

supplémentation en sélénium pour éviter les effets notoires liés à une carence, et ce d’autant plus

que les activités humaines, comme l’utilisation de fertilisants soufrés, l’acidification des sols et

l’intensification des rendements des cultures, risquent de diminuer encore la mobilisation de Se du

sol dans la chaîne alimentaire (Lyons 2003, Murphy 2008).

53

Tableau 7 : Apports moyens par jour en sélénium (Ra yman 2000, Rayman 2004, Dumont 2006,

Navarro 2008)

Pays Apport (µg·j-1)

Allemagne 47

Chine (région du Enshi) 3200 - 6690

Chine (région du Keshan) 3 - 11

Etats-Unis 98

Avant l’utilisation de fertilisants 25 Finlande

Après l’utilisation de fertilisants 67 - 110

France 29 - 43

Japon 104 - 199

Royaume-Unis 29 - 39

Turquie 30

Plusieurs possibilités de supplémentation en sélénium des populations ont été proposées. Parmi

celles ci :

- l’utilisation de suppléments nutritionnels : en Chine, les travaux de Xia et al. (2005) ont

démontré une amélioration du statut de Se dans les populations vivant en zones séléniprives

grâce à l’utilisation de compléments alimentaires composés de sélénométhionine (SeMet) ou

de sélénite (SeIV),

- la fertilisation des sols : depuis 1984, les autorités finlandaises ont favorisé l’utilisation des

fertilisants séléniés pour enrichir leurs sols agricoles. En conséquence, des taux suffisants

d’apports en Se ont été atteints (Hartman 2002, Hawkesford 2007).

1.4.1.1 Supplémentation via les levures séléniées

Depuis plus de dix ans, le marché pharmaceutique s’est emparé de l’engouement face aux

propriétés anti-oxydantes de Se pour proposer plusieurs types de compléments nutritionnels. Cela

passe entre autres par le simple ajout de sélénium inorganique à des préparations de multi-

vitamines ou de multi-minéraux (Dumont 2006). Une seconde possibilité, déjà employée pour

d’autres oligo-éléments, est l’utilisation de levures (Mazo 2007). Ainsi, Saccharomyces cerevisiae

a la capacité d’accumuler de fortes concentrations de Se lors de sa croissance dans un milieu de

culture contenant du sélénite de sodium (Na2SeO3) (Korhola 1986, Suhajda 2000). Bien que de

nombreuses espèces organiques puissent y être détectées (McSheehy 2002), la majorité du

sélénium se retrouve sous la forme de SeMet (Korhola 1986, Gilon 1996, Casiot 1999a, Larsen

2001, Hinojosa 2004, McSheehy 2005, Ayouni 2006).

L’utilisation des levures présente plusieurs avantages :

54

- le comportement des composés de Se de la levure montre des similitudes avec la physiologie

des espèces rencontrées dans la nourriture (Schrauzer 2003, Hawkes 2008)

- le sélénium est plus biodisponible à partir de SeMet que depuis SeIV (Xia 2005)

- la sélénométhionine s’avère moins toxique que le sélénite de sodium à partir de tests de

toxicité menés sur des animaux (Schrauzer 2003, Dumont 2006)

- SeMet est un moyen efficace et réversible de stocker du sélénium puisque dès l’arrêt de la

supplémentation, les taux de Se diminuent rapidement (Schrauzer 2004, Hawkes 2008)

- un apport quotidien de 200 µg de Se depuis des levures pendant au moins sept ans n’a montré

aucun effet négatif notoire sur les personnes exposées ; une diminution de l’incidence de

certains cancers a même été constatée (Clark 1996)

- la culture des levures se caractérise par des cycles courts et rapides de production sur un

milieu de culture relativement peu onéreux, indépendants des conditions climatiques ou de

saisons (Mazo 2007).

L’utilisation de levures se révèle une solution efficace pour la supplémentation alimentaire en

sélénium à condition de connaître précisément la qualité de l’apport en sélénium, c’est à dire la

quantité des espèces présentes.

1.4.1.2 Fertilisations des sols agricoles

La fortification des sols agricoles par le sélénium permet d’introduire directement Se dans la

chaîne alimentaire sous forme d’espèces naturellement présentes dans les aliments. Dans le but

d’un maximum d’efficacité, les cultures soumises à une supplémentation doivent pouvoir être

largement consommées par la population visée et être capables d’assimiler suffisamment de Se.

Les céréales répondent à ces exigences et plus particulièrement le blé qui i) est largement utilisé

par l’ensemble de la population et ii) parmi les différentes plantes céréalières (maïs, riz, orge ou

avoine) semble être le plus efficace pour incorporer le sélénium (Lyons 2003). Par exemple, en

France, la consommation moyenne de produits céréaliers est de 203 et 294 g·j-1 chez les femmes

et les hommes respectivement (AFSSA 2007).

Le séléniate est l’espèce recommandée pour réaliser la supplémentation des sols car il est

facilement assimilable par la plante et n’est pas adsorbé sur les particules des sols (Barceloux

1999). Son utilisation repose aussi sur un coût faible de mise en pratique. Lyons et al. (2003)

évoquent un surcoût de 1.15 € à l’hectare pour fortifier un sol à hauteur de 10 g·ha-1 de séléniate.

En Finlande, la fertilisation a permis d’augmenter les fractions de masse en sélénium dans les

céréales d’une valeur initiale inférieure à 10 µg·kg-1 à des gammes allant de 50 à 250 µg·kg-1

(Hawkesford 2007).

Généralement, le sélénium se retrouve majoritairement sous forme de SeMet dans le blé (Polec

2005, Wolf 2007) ce qui lui permet d’être biodisponible (Barceloux 1999, Lyons 2003). Warburton

et al. (2007) ont montré qu’une fois assimilé dans le blé, le sélénium provenant d’un sol enrichi en

séléniate se retrouve encore majoritairement sous forme de SeMet dans la farine. Ils ont

55

également démontré que SeMet est le composé majoritaire dans le pain fabriqué à partir de cette

farine.

La fertilisation des sols doit également être effectuée avec pour but d’optimiser l’accumulation de

Se et non pas la maximiser. De plus, l’augmentation de la concentration des plantes ne doit pas

être réalisée en compétition avec d’autres éléments essentiels (comme le soufre) (Hawkesford

2007). Suite à la fortification du sol, aucun effet phytotoxique ni de pollution d’autres

compartiments environnementaux n’a été observé jusqu’à présent (Lyons 2003).

Les espèces utilisées dans les apports en sélénium doivent également être précisément connues

pour pleinement évaluer les risques associés à leur consommation.

1.4.2 Risques liés à la supplémentation

Le risque majeur lié à une supplémentation en Se est d’atteindre des niveaux d’apports où la

toxicité du sélénium se manifeste. Plusieurs études ont été menées pour déterminer la dose

maximale de sélénium n’induisant pas d’effets notoires.

Yang et al. (1983) ont étudié plusieurs populations chinoises de la région sélénifère du Enshi où

des cas de sélénose ont été observés. Une intoxication est survenue pour des apports en

sélénium compris entre 3200 et 6690 µg·j-1 (moyenne de 4990 µg·j-1 sur 6 individus) tandis

qu’aucun effet n’est enregistré pour des doses de 240 à 1510 µg·j-1 (moyenne de 750 µg·j-1 sur 3

individus).

Longnecker et al. (1991) ont suivi pendant un an deux populations composées de 78 et 64

individus vivant dans des zones sélénifères du Dakota et du Wyoming (USA). L’apport journalier

moyen y était de 239 µg·j-1 et aucun cas de sélénose n’a été observé y compris sur les sujets les

plus exposés (jusqu’à 724 µg·j-1).

De ces deux études il ressort donc qu’une dose d’environ 750 µg·j-1 en Se ne produit aucun effet

sur la santé humaine.

En 2000, le comité scientifique pour les aliments de la commission européenne s’est prononcé sur

des valeurs de limite supérieure d’apport en Sélénium selon l’âge (Tableau 8). Ces valeurs sont

dérivées de celles n’induisant aucun effet auxquelles sont affectées un coefficient de sécurité

tenant compte des incertitudes liées à leur détermination.

56

Tableau 8 : Limites supérieures d'apport quotidien en sélénium (SCF 2000)

Population Limite supérieure (µg·j-1)

1-3 ans 60

4-6 ans 90

7-10 ans 130

11-14 ans 200

15-17 ans 250

Adultes, femmes enceintes ou allaitant 300

La Figure 8 résume la connaissance des effets et des apports en sélénium sur la santé. Il apparaît

donc que la population peut se trouver en déficit mais, du fait d’une plage étroite des

concentrations entre essentialité et toxicité, la supplémentation peut s’avérer risquée si elle n’est

pas correctement contrôlée et encadrée.

Figure 8 : Classification des apports journaliers e n sélénium sur une échelle logarithmique

1.4.3 Législation

La législation sur les compléments alimentaires est fixée dans le droit européen par la directive

2002/46/CE. Elle définit les substances pouvant être utilisées pour leur fabrication. Concernant le

sélénium, ces substances sont le séléniate de sodium (Na2SeO4), l’hydrogénosélénite de sodium

(NaHSeO3) et le sélénite de sodium (Na2SeO3). L’ambiguïté de cette directive réside dans le fait

que seules apparaissent les espèces pouvant servir à la fabrication des suppléments et non celles

figurant dans leur composition finale. Dans le cas des levures, celles-ci sont largement différentes

dans le produit fini.

57

La transposition de cette directive dans le droit français (arrêté du 9 mai 2006) reprend les mêmes

contraintes de fabrication mais se révèle moins équivoque car la possibilité d’utiliser des levures

séléniées est autorisée jusqu’au 31 décembre 2009. De plus, l’arrêté fixe un apport maximal en

sélénium total par le traitement de 50 µg·j-1.

Récemment, l’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA), au travers d’un avis

scientifique d’un groupe de travail sur les additifs alimentaires, a émis un rapport sur l’utilisation de

levures séléniées comme complément alimentaire (EFSA 2008). Ses conclusions portent sur

l’utilisation de cinq levures commerciales dont les caractéristiques de chacune ont été détaillées et

fournies par le fabricant :

- concentration totale en sélénium

- concentration en SeMet, Se inorganiques et autres espèces organiques

- source de sélénium pour la culture des levures.

Au vu de ces informations, de la possibilité d’un apport de la part des compléments de 100 ou 200

µg·j-1 de Se et d’une contribution liée à l’alimentation de 30 à 70 µg·j-1, le panel d’experts est arrivé

à la conclusion que la limite supérieure de 300 µg·j-1 n’était pas atteinte et que l’utilisation de ces

compléments, précisément caractérisés, ne présentait pas de problèmes de santé alimentaire.

Il est donc essentiel de pouvoir correctement et exactement définir les propriétés d’un complément

alimentaire mis sur le marché pour s’assurer de son innocuité. Leur caractérisation permet de

juger s’ils sont acceptables au yeux des autorités (AFSSA 2002a) ou s’ils ne risquent pas

d’entraîner des intoxications au sélénium (Sutter 2008).

L’utilisation de la fortification des champs agricoles relève plus du ressort des pouvoirs publics

pour décider d’une politique générale d’amélioration de la santé publique, comme celle menée

avec succès par la Finlande en 1984. Néanmoins, les méthodes servant à caractériser les

céréales doivent être également mises en place et éprouvées pour réaliser un suivi fiable des

concentrations en sélénium et de leur qualité au sein de tels échantillons.

1.5 Protocoles d’analyses

Comme vu précédemment, il est essentiel de pouvoir accéder aux caractéristiques des

échantillons de levures et de blé, et plus précisément à leur contenu en espèce majoritaire : la

sélénométhionine. Sa détermination permet de définir la qualité du produit, de s’assurer que le

sélénium sera bien disponible et assimilable pour l’organisme et surtout d’évaluer les dangers liés

à la toxicité du sélénium.

1.5.1 Méthodes de traitement de l’échantillon

L’étape d’extraction est cruciale pour l’analyse de spéciation. Son objectif premier est de rendre

solubles les analytes contenus dans l’échantillon solide afin qu’ils soient compatibles avec leur

58

analyse. Les contraintes associées à cette étape résident dans l’obligation d’être quantitatif pour

permettre un résultat fiable tout en ne modifiant pas la répartition originelle de l’échantillon.

1.5.1.1 Extraction depuis des levures

En fonction de la fraction du sélénium étudiée dans les levures, plusieurs agents et protocoles

d’extraction sont proposés dans la littérature.

Casiot et al. (1999a) ont comparé la capacité de plusieurs réactifs à mettre en solution les espèces

séléniées d’une levure :

- l’eau seule, un milieu tamponné par le Tris-HCl (Tris-(hydroxyméthyl)aminométhane) ou un

mélange HCl/méthanol pour récupérer la fraction hydrosoluble de la levure

- le dodécylsulfate de sodium (SDS) qui solubilise les chaînes polypeptidiques par formation de

paires d’ions avec les peptides

- la Driselase, composée du mélange d’enzymes (laminarinase, xylanase et cellulase), dont

l’action vise les parois cellulaires

- l’utilisation combinée d’une enzyme protéolytique (décomposition des protéines en acides

aminés) comme la pronase E et d’une enzyme capable de digérer les lipides : la lipase VII

- l’hydroxyde de tétra-méthyl ammonium (TMAH) qui produit une hydrolyse alcaline des

échantillons.

L’efficacité d’extractions de ces différents solvants a été comparée par ces auteurs. Hormis dans le

cas du TMAH, un résidu solide a été observé après la mise en solution. L’étude de la spéciation de

l’extrait de TMAH a démontré, bien que l’extraction fût quantitative, qu’elle ne respectait pas la

spéciation initialement présente dans l’échantillon. Le protocole utilisant le mélange pronase/lipase

a montré qu’il était le plus efficace avec 88% d’extraction. Les autres protocoles ont montré une

efficacité inférieure à 50%. Ce résultat confirme que le sélénium au sein des levures séléniées est

contenu majoritairement dans ses protéines sous forme d’acides aminés. Les principales

limitations de l’extraction enzymatique sont liées à i) une extraction non quantitative du sélénium et

ii) un temps d’action long puisque l’hydrolyse se réalise à 37 °C pendant 16 h. En dépit de ces

inconvénients, ce protocole s’est révélé comme la technique la plus utilisée dans la quantification

des acides sélénoaminés depuis son introduction par Gilon et al. en 1996. Des comparatifs ont été

menés sur les différentes enzymes disponibles pour mener cette extraction (Larsen 2003, Yang

2004c) cependant le mélange Protéase XIV/ Lipase VII (aux proportions 2/1 entre enzymes et 10/1

entre échantillon/protéase) s’avère l’un des plus efficaces.

Pour améliorer les rendements globaux d’extraction, des études ont été orientées vers l’utilisation

d’extractions séquentielles combinant les différentes propriétés des réactifs.

Ruiz Encinar et al. (2003) ont proposé le schéma d’extractions successives suivant :

- eau

- Driselase

59

- SDS

- hydrolyse enzymatique (pronase + lipase)

- TMAH.

Ce protocole permet d’atteindre une extraction quantitative mais sans garantie du maintien de la

spéciation tout au long du procédé (en particulier avec l’utilisation finale de TMAH). De plus, son

application sur plusieurs échantillons de levures a démontré la difficulté d’être reproductible entre

différentes matrices. Les recherches de Ruiz Encinar et al. avaient pour but d’étudier les chaînes

polypeptidiques dans lequel se situent les acides aminés séléniés. Ce protocole n’est donc pas

adapté pour l’analyse des acides aminés seules, et son utilisation pour cet objectif demande de

soumettre la plupart des surnageants à une hydrolyse enzymatique (Polatajko 2004).

Une autre possibilité pour améliorer l’extraction par des enzymes protéolytiques est la répétition de

leur action. Polatajko et al. (2005) ont reproduit trois fois l’extraction par le mélange Protéase XIV

et Lipase VII (37 °C pendant 17 h) avec pour but de déterminer la concentration en

sélénométhionine d’une levure. Ils obtiennent sur leur échantillon un rendement d’extraction de

93% en sélénium total. Ils ont testé par la suite l’extraction du résidu par de l’eau, de la Driselase,

du TMAH ou du SDS. La plus grande efficacité est atteinte par l’utilisation du SDS qui solubilise

35% du Se du culot. Dans cet extrait, ils ont reporté que SeMet représente 40 % du sélénium

résiduel, soit une part de 1 à 1.5 % de la totalité de SeMet extraite. La soumission de cet extrait

par les auteurs à une hydrolyse enzymatique a diminué la quantité de SeMet présente à cause de

son oxydation au cours du temps (même en présence d’agents anti-oxydants).

Hinojosa et al. (2006) ont aussi utilisé les propriétés complémentaires de plusieurs agents avec

l’action dans un premier temps de la Driselase sur la levure. Après une première incubation de 4 h,

ils ajoutent dans le mélange échantillon/Driselase de la protéase XIV pour une seconde incubation

de 20 h. Leur protocole permet d’être quantitatif sur la moitié des échantillons analysés mais il

n’est pas démontré que l’étape préliminaire avec la Driselase améliore l’efficacité de l’extraction

protéolytique.

La méthode développée par Peachey et al. (2008) repose sur deux étapes de 20 h avec en

premier lieu l’utilisation du mélange protéase/lipase puis l’action de la Driselase. Leur protocole a

pu être validé avec l’analyse d’un CRM de levure certifié pour sa fraction de masse en SeMet

(SELM-1) par dilution isotopique.

L’utilisation de la Driselase semble nécessaire pour mettre en solution un maximum de SeMet.

Outre sa présence au sein de protéines séléniées, atteintes par l’utilisation de protéases, SeMet

semble lié physiquement aux parois cellulaires (Polatajko 2004). L’action de la Driselase cible

celles ci et peut potentiellement améliorer le rendement d’extraction de SeMet.

60

Comme évoqué précédemment, l’utilisation de l’hydrolyse enzymatique demande un temps long

d’action avec une incubation variant de 16 à 20 h. Plusieurs études ont été menées afin de

diminuer le temps d’action.

Capelo et al. (2004) ont employé un stick à ultra-son permettant de focaliser l’énergie des ondes

directement dans l’échantillon. Ainsi, ils sont arrivés à réduire le temps de réaction à 30 s mais

avec seulement une efficacité d’extraction de 87% de la valeur estimée en SeMet. Hinojosa et al.

(2004) ont également testé cette technologie en utilisant la dilution isotopique (où l’extraction

quantitative n’est pas une nécessité si l’équilibre entre l’étalon marqué et analyte est atteint). Leur

résultat est aussi inférieur à celui obtenu par une extraction protéolytique. La modification de la

spéciation a également été observée par l’apparition de SeMet oxydée suite à l’application du stick

à ultra-sons (Pedrero 2007b). Une autre limite du dispositif réside dans l’introduction de la sonde

directement dans l’échantillon, ce qui peut être une source de contamination ou de pertes

d’analytes. De plus un seul échantillon est préparé à la fois.

Ayouni et al. (2006) ont utilisé le bain à ultrasons pour ne soumettre l’échantillon qu’à 3 h

d’extraction. Sur une levure séléniée et une tablette pharmaceutique, ils arrivent à identifier entre

60 et 65% des espèces de sélénium contenues en démontrant que SeMet est le composé

majoritaire dans chaque échantillon.

Peachey et al. (2008) ont réalisé une activation des enzymes assistée par les micro-ondes. Ils

utilisent un four permettant de focaliser les ondes sur l’échantillon. Les analyses d’un CRM (SELM-

1) et d’un échantillon provenant d’un exercice d’intercomparaison ont permis de valider la méthode

mise au point. Les limites d’un tel dispositif résident dans l’utilisation de faibles quantités

d’échantillon (40 mg) pour mener l’analyse. Généralement, les prises d’essais sont de l’ordre de

100 à 200 mg pour assurer l’homogénéité du matériau. De si faibles prises d’essai peuvent poser

des problèmes dans le cas d’analyse d’échantillons hétérogènes. De plus, l’observation sur les

chromatogrammes de la présence de SeMet oxydée laisse présumer d’une dégradation des

analytes au cours du protocole (même si l’emploi de la dilution isotopique a limité son impact sur la

détermination de SeMet).

L’hydrolyse acide des protéines est une technique alternative à l’utilisation d’enzymes pour libérer

les acides aminés des chaînes polypeptidiques (Anders 2002). L’échantillon est mis en présence

d’acide, dans un montage à reflux pour 1 à 24 h. Des conditions anoxiques sont souvent

nécessaires pour éviter l’oxydation des acides aminés libérés.

Wrobel et al. (2003) ont utilisé l’acide méthane-sulfonique (MeSA) en présence de

mercaptoéthanol pour limiter l’oxydation lors de l’hydrolyse de l’échantillon de levure. Ils sont

arrivés à la conclusion qu’un temps de 8 h était nécessaire pour atteindre une extraction maximale

(65% de Se extrait). La comparaison avec l’extraction enzymatique laisse suggérer d’une meilleure

efficacité de l’utilisation d’acide pour digérer les protéines (seulement 46% de Se extrait avec les

61

enzymes). Cependant ce résultat ne permet pas de totalement trancher entre les deux méthodes,

car le protocole utilisé pour les enzymes ne reposait par sur leur emploi dans des conditions

optimales : 100 mg de levure extrait par 20 mL de Tris-HCl en présence de 20 mg de protéinase K

pendant 18 h à 50 °C, puis répétition avec une nouv elle quantité de protéinase K pendant 6 h et

finalement ajout de 20 mg de protéase XIV et incubation à 37 °C pendant 6 h.

L’utilisation des micro-ondes en système ouvert a permis d’accélérer l’hydrolyse acide avec un

protocole de 2 h d’extraction à 300 W en présence de MeSA à 8 mol·L-1 (Yang 2004a). Cependant,

la comparaison menée par les auteurs a montré que cette extraction n’était pas aussi efficace que

l’hydrolyse acide (menée avec MeSA).

McSheehy et al. (2006) ont étudié l’efficacité de l’hydrolyse acide sur une chaîne polypeptidique

synthétique et sur une protéine de levure. Ils sont arrivés aux conclusions que cette technique est

efficace pour libérer et préserver les acides aminés pendant l’extraction.

La comparaison entre hydrolyse acide et hydrolyse enzymatique a été menée par Yang et al.

(2004c) : l’extraction par l’acide méthane-sulfonique se révèle plus efficace que celles utilisant les

enzymes (différents protocoles et d’enzymes sont testés).

Les auteurs ont également optimisé l’hydrolyse enzymatique pour arriver à être quantitatif. Il en

résulte deux choix de protocoles pour analyser 100 mg d’échantillons :

- utiliser 200 mg de protéase XIV pendant 72 h

- employer 400 mg de protéase XIV pendant 24 h.

L’utilisation de telles quantités d’enzymes pose cependant un problème sur la contamination des

échantillons par l’hydrolyse même des protéases qui peut libérer une quantité non négligeables

d’acides aminés séléniés (Cuderman 2009).

Une autre comparaison des techniques d’extraction a été réalisée au cours de la campagne de

certification du seul matériau garanti pour sa concentration en sélénométhionine : la levure

séléniée SELM-1 (Mester 2006). L’intercomparaison a montré que les deux techniques

d’extractions fournissent des résultats fiables. Elle met surtout en avant la difficulté que représente

la caractérisation d’un échantillon pour sa concentration en SeMet : sur les sept laboratoires

comparés, quatre seulement ont obtenu des résultats proches de la valeur certifiée alors que

l’échantillon ne contenait pas Se sous forme de traces (fraction de masse totale de 2059 ± 64

mg·kg-1).

1.5.1.2 Extraction depuis du blé

Au sein de la farine de blé, SeMet est principalement incorporée au niveau des chaînes

polypeptidiques (Barceloux 1999). L’extraction de SeMet doit donc être réalisée en ciblant ce

compartiment de la céréale.

62

La littérature permet de référencer les mêmes techniques que celle développées pour la levure. Il

est donc principalement utilisé pour extraire SeMet de la farine de blé :

- l'hydrolyse en présence d’acide méthane-sulfonique (Wolf 2007)

- l’extraction enzymatique (Diaz Huerta 2003, Moreno 2004, Polec 2005, Warburton 2007).

Les protocoles mis en place au cours de l’étude ont donc pu être testés sur chaque type

d’échantillon analysé (levure ou farine de blé).

1.5.2 Techniques séparatives

Différentes stratégies peuvent être envisagées pour réaliser la séparation des espèces du

sélénium. Les méthodes les plus utilisées reposent sur l’électrophorèse capillaire et la

chromatographie en phase gazeuse ou liquide (Uden 2005). Les choix analytiques dépendent des

objectifs visés qui sont de i) séparer efficacement les espèces de sélénium et ii) disposer d’un

mécanisme robuste pour assurer au maximum la répétabilité de cette étape en terme de rétention

et d’intensité de pic.

L’électrophorèse offre comme avantages une forte résolution sur la séparation, des temps

d’analyse relativement court. De plus, il n’y a pas d’interactions entre les analytes et une phase

stationnaire, ce qui limite la possible modification des équilibres entre les espèces au sein de

l’échantillon (Pyrzynska 2001). Cependant, son utilisation présente aussi des inconvénients. Une

faible quantité d’échantillons est analysée (quelques nanolitres) ce qui demande une parfaite

homogénéité de l’échantillon et soulève la question de la représentativité. Le haut voltage appliqué

à l’échantillon et la composition électrolytique du tampon peut aussi perturber l’équilibre des

espèces et limiter le respect de leur répartition en solution (Michalke 2003).

Pour ces raisons, la chromatographie a été le plus souvent préférée pour mener la séparation des

échantillons et plus précisément la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Elle a

comme principal avantage, par rapport à la chromatographie gazeuse (GC), de ne pas nécessiter

d’étape de dérivation des composés pour leur volatilisation (Yang 2004b, Wolf 2007). Ainsi, les

risques de contamination, de perte ou de conversion des analytes peuvent être évités. De plus,

cette méthode dispose de nombreux mécanismes de séparation de composés de diverses

propriétés physico-chimiques.

Dans la littérature, parmi les principaux composés du sélénium sont étudiés le sélénite (SeIV), le

séléniate (SeVI), la sélénocystine (SeCys2) et la sélénométhionine (SeMet) dans différents types

de matrices (levures, eaux, végétaux ou tissus biologiques). Plusieurs mécanismes sont proposés

permettant le plus souvent la séparation simultanée des composés organiques et inorganiques.

63

Les principaux rencontrés sont :

- La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) permettant de séparer les protéines et les

chaînes polypeptidiques selon leur taille (Yoneda 1997, Casiot 1999a, Cases 2001, Moreno

2004, Ogra 2005).

- La chromatographie chirale (CC) pour la séparation des différents énantiomères d’une même

molécule, comme les acides aminés séléniés (Sutton, 2000, Perez-Mendez, 2000, Ponce de

Leon, 2000).

- La chromatographie d’échange d’ions (IX : Ion eXchange) qui selon la charge des

groupements fonctionnels de la phase stationnaire permet la séparation des cations ou des

anions contenus dans l’échantillon injecté (Goessler 1997, Bird 1997, Casiot 1999a, Li 1999,

Moreno 2001, Larsen 2001, Ketavarapu 2005).

- La chromatographie de phase inverse avec appariements d’ions (IP-RP) où les composés

forment une paire d’ion avec l’agent présent dans la phase mobile. Celui-ci possède en général

une ou plusieurs chaînes alkyles qui interagissent avec la phase stationnaire apolaire (Bird

1997, Casiot 1999a, Zheng 2000).

Plusieurs mécanismes de séparations peuvent être mis en place simultanément par l’utilisation de

colonnes consécutives ou de chromatographie multidimensionnelle où les types de séparations

deviennent complémentaires (McSheehy 2002, Bierla 2008).

Les mécanismes de phase inverse avec appariement d’ions (IP-RP) et d’échange d’ions (IX) ont

démontrées leur capacités à séparer les espèces séléniées présentes dans des échantillons de

levures et de blé (Bird 1997, Casiot 1999a, B’Hymer 2000, Diaz Huerta 2003, Kotrebai 2000, Polec

2005, Warburton 2007). En conséquence, elles seront détaillées plus précisément du fait de leur

utilisation dans nos travaux.

Les phases mobiles compatibles avec le mécanisme de séparation retenu ont été utilisées. La

principale restriction sur leur composition, dans le cadre de notre étude, porte sur sa compatibilité

avec le détecteur choisi : l’ICP-MS. Les phases mobiles utilisées sur cet appareillage ne doivent

pas contenir de solvants organiques (tels que le méthanol ou l’acétonitrile) en trop grandes

proportions pour ne pas obturer les cônes de l’ICP-MS par un dépôt trop important de matières

organiques, déstabiliser le plasma ou entraîner une dérive du signal. Les concentrations en sels et

en solutions tampons sont également à limiter pour les mêmes raisons (nécessité d’une

concentration en sels inférieure à 1g·L-1).

Une précaution à prendre lors de l’utilisation de colonnes chromatographiques est de les équiper

d’une pré-colonne, composée de la même phase stationnaire ou de filtres, pour éviter leur

détérioration prématurée et la diminution de leur capacité de séparation par l’analyse de matrices

chargées.

64

1.5.2.1 Séparation par appariements d’ions

L’Annexe 1 regroupe les principales séparations par appariement d’ions couplées à une détection

par ICP-MS rencontrées dans la littérature pour l’analyse du sélénium.

La chromatographie d’appariements d’ions est utilisée dans la littérature majoritairement pour la

séparation des acides aminés séléniés.

La phase stationnaire est constituée d’un gel de silice greffé de chaînes de huit ou dix-huit

carbones.

Les différentes phases mobiles rencontrées dans la littérature comportent des compositions de

natures similaires. Un solvant organique est présent avec un agent d’appariement d’ions (composé

d’une tête chargée et d’une chaîne apolaire hydrophobe). Le méthanol est le solvant le plus

souvent rencontré avec des concentrations ne dépassant pas les 10% pour éviter les dépôts de

matières organiques au niveau de l’ICP-MS. Il est efficace pour diminuer la polarité de la phase

mobile, ce qui augmente sa force d’élution et réduit le temps d’analyse. Par contre il est préférable

d’éviter les gradients en phase organique car des effets mémoires au niveau du nébuliseur ont été

observés entraînant des augmentations de signal de Se sans lien avec sa concentration (Larsen

1998).

Habituellement, la séparation sur phase inverse avec appariement d’ions est réalisée en présence

d’une phase mobile composée majoritairement d’un solvant organique pour assurer l’élution des

composés. L’utilisation de l’ICP-MS limite sa présence, ce qui peut entraîner une séparation moins

performante. Cependant des solutions techniques existent pour permettre d’augmenter la quantité

de solvant organique. L’utilisation de micro-colonnes, d’un diamètre de 1 ou 2 mm au lieu de 4.6

mm, permet d’opérer avec des débits de phase mobile plus faibles, de l’ordre de 0.2 mL·min-1

(Montes 2006). La quantité de matière organique transportée est moindre même si la phase

mobile est plus chargée en méthanol. Ce type d’appareillage nécessite en contre partie un

nébuliseur adapté aux faibles débits pour la connexion avec l’ICP-MS. Une autre solution est

l’utilisation combinée d’un faible débit de phase mobile et l’ajout d’une arrivée d’oxygène dans le

plasma pour la combustion des matières organiques résiduelles. Bird et al. (1997) utilisent ainsi

une phase mobile composée de 65% de méthanol. Dans le cas de l’ajout d’oxygène dans le

plasma, l’utilisation de cônes en platine est préconisée pour éviter leur dégradation par oxydation.

La Figure 9 présente différents agents d’appariements d’ions reportés dans la littérature.

65

Figure 9 : Agents d’appariement d’ions utilisés

Les agents les plus employés pour la formation de paire d’ions sont (Bird 1997, Casiot 1999a,

Kotrebai 2000, Montes 2006) :

- l’acide trifluoroacétique (TFA)

- l’acide pentafluoropropionique (PFPA)

- l’acide heptafluorobutyrique (HFBA).

La partie ionique de ces trois agents est formée par une fonction acide. Leur différence provient de

la longueur de la chaîne carbonnée. L’utilisation de ces composés par rapport à d’autres agents

d’appariement, possédant généralement une chaîne alkyle et une fonction sulfonique, permet

d’obtenir de faibles pH idéaux pour la protonation de la fonction amine contenue dans certains

composés organoséléniés. De plus, la chaîne carbonnée perfluorée permet de meilleures

interactions hydrophobiques avec la phase stationnaire.

Kotrebai et al. (2000) ont testé ces trois agents sur des échantillons de levures et d’aulx. Ils sont

parvenus à la conclusion que le pouvoir de séparation augmentait avec le nombre de carbone

mais en contre partie le temps d’analyse était rallongé.

L’agent d’appariement d’ions le plus utilisé est le TFA. Ceci est dû au fait qu’il est plus volatil que

d’autres composés, ce qui permet de limiter les dépôts de carbone sur les cônes. Une autre raison

est qu’il est disponible en très grande pureté, limitant les possibilités de contamination des

échantillons.

Toutefois, l’utilisation de ce type d’agent ne permet pas toujours une résolution suffisante sur les

composés inorganiques du sélénium (B’Hymer 2000).

66

Une méthode pour permettre aussi la séparation des espèces inorganiques du sélénium est

l’utilisation combinée de deux agents de paires d’ions de charge opposée. Zheng et al. (2000)

utilisent l’hydroxyde de tétraméthyl d’ammonium (TMAH) pour les espèces anioniques et le 1-

butanesulfonate de sodium (1-BS) pour les cations en présence d’acide malonique contenant

0.05% de méthanol à un pH de 4.5. Ainsi, ils sont arrivés à séparer efficacement les deux formes

de sélénium inorganique et plusieurs composés organiques. Zheng et al. (2003) ont aussi testé

l’utilisation d’un agent cationique seul, l’hydroxyde de tétraéthyl d’ammonium (TEAH) à 10 mmol·L-

1 dans 4.5 mmol·L-1 d’acide malonique à un pH de 6.8. La plupart des composés du sélénium

(organiques et inorganiques) sont séparés efficacement par cette phase mobile, seuls la

sélénocystine (SeCys2) et l’ion triméthylsélénonium (TMeSe+) sortent à des temps de rétention

similaires gênant leur détermination.

Si le pH de la phase mobile doit être ajusté, l’acide conseillé est l’acide nitrique. La base

préconisée est l’hydroxyde d’ammonium à cause de sa volatilité et pour éviter l’utilisation d’autres

bases composées de sodium, pouvant obstruer les cônes de l’ICP-MS et créer des interférences

non-spectroscopiques.

1.5.2.2 Séparation par échanges d’ions

L’annexe 2 répertorie les différentes analyses de spéciation du sélénium rencontrées dans la

littérature utilisant l’échange d’ions comme technique séparative, associée à une détection par

ICP-MS.

Sur la phase stationnaire de la colonne composée de polymères (styrène et/ou divinylbenzène) ou

de silice sont greffés des groupements sulfonique ou carboxylique pour l’échange de cations ou

des fonctions amines primaires ou quaternaires pour l’échange d’anions.

Pour ce mécanisme, le pH est un paramètre essentiel à maîtriser. En fonction de celui-ci, les

différents composés à analyser comportent différentes charges, ce qui modifie leurs interactions

avec la phase stationnaire. Pour cette raison, les phases mobiles rencontrées dans la littérature

sont composées de solutions tampons toutefois à des concentrations inférieures à 100 mmol·L-1

pour ne pas encrasser le nébuliseur (Szpunar 2000).

La force ionique de la phase mobile influe également sur l’élution des composés, une trop forte

concentration en ion développeur augmente l’élution des acides aminés séléniés, pouvant

provoquer leur recouvrement avec d’autres espèces en sortie de colonne (Moreno 2001).

Pour la chromatographie d’échanges d’anions, l’ion développeur qui semble le mieux adapté pour

une détection par ICP-MS est le citrate d’ammonium (Bird 1997, Li 1999, Moreno 2001, Darrouzès

2005). Contrairement à d’autres réactifs, il n’est pas composé de sels métalliques qui risquent de

déstabiliser le plasma. Moreno et al. (2001) l’ont comparé avec les tampons salicylate et tartrique.

Ils ont trouvé que le tampon citrate était le plus efficace pour éviter le recouvrement des pics et

qu’il améliorait le profil du pic de sélénométhionine.

67

Le citrate d’ammonium est utilisé à une concentration voisine de 5 mmol·L-1 et d’un pH de 5 (de

4.8 à 5.5) par les différents auteurs. Ainsi plusieurs espèces : TMeSe+, SeCys2, SeIV, SeMet et

SeVI peuvent être séparées efficacement à partir de leur mélange dans des solutions

synthétiques.

Lors de l’utilisation de la chromatographie d’échanges de cations, le solvant rencontré est la

pyridine en présence d’acide formique (Goessler 1997, Moreno 2001, Larsen 2003, Ketavarapu

2005). La pyridine est utilisée à cause de sa volatilité qui évite l’obstruction des cônes de l’ICP-MS.

Différentes conditions de concentrations et de pH sont testées par les auteurs. La comparaison

des résultats montre que la séparation des composés séléniés dépend fortement du type de

matrice étudiée. Afin de favoriser l’élution de certains composés, un gradient de phase mobile peut

être employé jouant sur différentes concentrations de pyridine à différents pH mais cela entraîne

une modification du bruit de fond et peut éventuellement déstabiliser le plasma (Ketavarapu 2005).

Afin d’augmenter la sensibilité de l’ICP-MS vis à vis du sélénium, comme pour la chromatographie

d’appariements d’ions, un pourcentage de 2 ou 3% de méthanol peut être ajouté à la phase mobile

(Bird 1997, Guerin 1997, Ketavarapu 2005).

1.5.3 Technique de détection : l’ICP-MS

1.5.3.1 Généralités

Afin de pouvoir utiliser la dilution isotopique comme méthode de quantification du sélénium, la

détection se réalise par un spectromètre de masse à couplage inductif du plasma (ICP-MS)

capable de trier les éléments selon leur masse, donc d’analyser individuellement chacun de ses

isotopes. Grâce à une grande sensibilité, cet appareillage permet une analyse des éléments à

l’état de traces et d’ultratraces.

Au sein d’un ICP-MS, l’échantillon nébulisé est introduit dans la torche à plasma (opérant à des

températures comprises entre 5 000 et 10 000 K) pour permettre l’atomisation des molécules et

l’ionisation au premier degré des éléments. Les cations ainsi formés sont guidés par une interface

composée de cônes et de lentilles optiques jusqu’à l’analyseur. Le plus souvent, ce dernier est

composé d’un quadripôle permettant de trier les particules selon leur rapport masse sur charge

(noté m/z). En fin de parcours, les ions sont ensuite comptés par un détecteur. La Figure 10

représente le schéma général d’un ICP-MS quadripolaire.

68

Figure 10 : Schéma général d'un ICP-MS de type quadr ipolaire (Potin Gautier 2001)

La détection par ICP-MS souffre principalement d’une forte sensibilité à la matrice de l’échantillon.

Cette sensibilité est également exacerbée par la formation d’interférences.

1.5.3.2 Interférences

Les interférences se divisent en deux catégories :

- spectroscopiques issues d’un recouvrement de signal par un élément de même masse,

doublement chargé, un assemblage de plusieurs éléments ou la formation d’oxydes.

- non spectroscopiques provenant de la viscosité de la matrice, d’effets d’espaces (ions les plus

légers déviés hors de la trajectoire) ou d’une perte d’ionisation par le transfert sur d’autres

éléments (Darrouzes 2006).

Alors que la résolution de la plupart des interférences non spectroscopiques peut être facilement

obtenue par le biais de la dilution de la matrice de l’échantillon, par l’utilisation d’étalons internes

ou de techniques de dosages autres que l’étalonnage externe (Vanhaecke 2003), les interférences

spectroscopiques posent plus de problèmes, d’autant plus pour un appareil muni d’un quadripôle

qui ne dispose que d’une faible résolution égale à une demi-unité atomique (Vanhaecke 2003).

Les isotopes du sélénium sont particulièrement perturbés par les interférences spectroscopiques

de par l’utilisation d’argon pour la génération du plasma (Tableau 9). Leur présence a d’ailleurs

limité l’analyse du sélénium avec ce détecteur pendant de nombreuses années.

69

Tableau 9 : Listes de plusieurs interférents possib les sur les isotopes du sélénium (May 1998)

Isotope Abondance (%) Interférences

74 0.89 37Cl37Cl+, 36Ar38Ar+, 38Ar36S+, 40Ar34S+

76 9.37 40Ar36Ar+, 38Ar38Ar+

77 7.63 40Ar37Cl+, 36Ar40Ar1H+, 38Ar21H+,

78 23.77 40Ar38Ar+

80 49.61 40Ar40Ar+

82 8.73 40Ar21H+, 35Cl2

12C+

L’introduction sur le marché des ICP-MS munis de cellules de collisions et/ou de réactions a

permis de limiter leur impact. Il s’agit d’analyseurs de type quadripolaire composés de quatre, six

ou huit barres (en fonction des fabricants) positionnés avant le quadripôle principal (Figure 11). La

cellule est le plus souvent remplie d’un gaz « tampon » (de type hélium) et d’un second gaz de

« réaction » (de type hydrogène).

Figure 11 : Configuration de l'ICP-MS PQ-Excell (Therm o)

Le gaz « tampon » permet la thermalisation partielle des ions par collisions, c’est à dire qu’il

ramène les particules introduites par le plasma dans un équilibre thermodynamique avec les

molécules présentes dans la cellule. Cette thermalisation a pour principale conséquence de

diminuer l’énergie cinétique des ions et ainsi d’augmenter les réactions dans la cellule et améliorer

l’efficacité de transmission des ions (Feldmann 1999, Tanner 2002). Les interférences sont par la

suite éliminées au contact du gaz de réaction (Iglesias 2002, Tanner 2002, Darrouzes 2006) :

- par transfert de charge : ++ +→+ XMXM

- par transfert de proton : MHHMH +→+ ++32

70

- par transfert d’hydrogène : XMHXHM +→+ ++

- par transfert d’atome : XMOXOM +→+ ++ .

Les collisions entre les interférents et le gaz tampon permettent également une réduction des

interférences par fragmentation de l’ion moléculaire mais ce phénomène est secondaire (Tanner

2002).

Un troisième phénomène prend place dans la cellule : la discrimination par l’énergie cinétique.

L’application d’un potentiel électrique continu et négatif à la cellule de collision/réaction génère une

barrière d’énergie permettant d’éliminer les ions de moindres énergies (comme les nouvelles

interférences produites dans la cellule) (Feldmann 1999, Tanner 2002). Ce phénomène n’est

possible que par la partielle thermalisation des ions issus du plasma ; si elle était complète tous les

ions disposeraient de la même énergie (Tanner 2002).

1.5.3.3 Sensibilité

En raison de son énergie de première ionisation élevée (9.75 eV), le sélénium n’est que

partiellement ionisé dans le plasma avec un taux de 33% (Jarvis 1992). Pour remédier à cet

handicap, plusieurs solutions ont été proposées.

L’augmentation de la quantité d’aérosol introduite dans le plasma peut s’avérer être une solution

intéressante. En effet, les nébuliseurs conventionnels de type pneumatiques ne transportent

seulement que 1 à 3% de l’échantillon vers le plasma. L’utilisation de modèles ultrasoniques

permet un transfert dix fois supérieur, de 10 à 30% (Potin-Gautier 2001). Ainsi, Goenaga et al.

(2004) ont amélioré avec ce système leur limite de détection (LD) d’un facteur 3 sur SeMet (3.7

ng·L-1). Ce procédé n’est pas dépendant de l’analyte, et un gain en sensibilité peut être espéré sur

l’ensemble du spectre de masse.

Pour améliorer le transport de Se dans le plasma, la génération d’hydrures peut également être

utilisée. Dans ce cas, le sélénium est transformé en phase gazeuse pour être directement introduit

dans la torche de l’ICP-MS. Darrouzes et al. (2008) ont diminué par deux la LD sur SeMet (8 ng·L-1

sur 80Se).

Larsen et al. (1994) ont agi sur l’ionisation du sélénium. Pour cela, ils utilisent un solvant organique

pour augmenter la densité de population de carbone ionisé dans un plasma à forte puissance

(1350 W). L’énergie de première ionisation du carbone (11.26 eV) étant supérieure à celle du

sélénium, les atomes de Se non ionisés le deviennent par transfert d’électrons aux cations du

carbone. Ainsi un gain de sensibilité compris entre 3 et 4 peut être obtenu et l’effet peut être utilisé

pour tout élément difficilement ionisable dont le potentiel de première ionisation est inférieur à celui

du carbone.

Warburton et al. (2007) ont utilisé le même effet en introduisant du méthane directement dans le

plasma d’argon. Ainsi, ils obtiennent une augmentation du signal par un facteur 9 et même par un

71

facteur 11 si l’échantillon est contenu dans 2 % de méthanol. La LD obtenue sur la détermination

de SeMet est de 0.49 ng·L-1.

L’utilisation de la cellule de collisions/réactions permet également une augmentation du signal par

l’augmentation de l’efficacité de transmission des ions jusqu’au quadripôle.

1.5.4 Dilution isotopique

Seulement quelques travaux ont été réalisés sur le dosage de la sélénométhionine par dilution

isotopique (DI) avec utilisation d’un ajout de SeMet marqué isotopiquement.

Wolf et al. (2001) ont été les premiers à utilisé un étalon de 74SeMet sur des échantillons de gluten

de blé et de levures analysés par GC-MS. Par la suite, ils ont amélioré leur technique afin d’arriver

à une méthode fiable et robuste sur ces deux types de matrices (Wolf 2004 et 2007, Mester 2006).

Le groupe de recherche du Conseil National de Recherches Canada (NRCC) a aussi appliqué la

dilution isotopique à l’analyse de SeMet dans le but de certifier une levure séléniée. Leur

démarche est passée par la mise en place de différentes techniques :

- utilisation d’un étalon marqué en 13C pour le dosage par GC-MS et HPLC-MS (Yang 2004a,

McSheehy 2005)

- utilisation d’un étalon marqué en 74Se pour le dosage par GC-MS, GC-ICP-MS, et HPLC-ICP-

MS (Yang 2004b, McSheehy 2005).

Leur approche a permis de valider les méthodes pour pouvoir certifier un CRM. La principale

restriction provient de l’emploi d’une unique technique d’extraction comme préparation de

l’échantillon, même si elle fut sélectionnée après une comparaison de plusieurs modes possibles

(Yang 2004c) et par la suite confortée par un essai d’intercomparaison (Mester 2006).

Ruiz Encinar et al. (2004) ont utilisé la dilution isotopique pour doser SeMet contenue dans les

protéines du sérum humain. Leur méthode n’a pas permis de bénéficier de tous les avantages de

la DI, vu que l’ajout de l’étalon marqué est réalisé en cours d’extraction et non pas dès le départ.

Un frein au développement de la dilution isotopique menée à partir des espèces marquées (SS-ID)

en sélénium est le manque d’étalons disponibles commercialement.

Plenneveaux et al. (1987) ont proposé un schéma réactionnel pour synthétiser SeMet à partir de

sélénium élémentaire pour son utilisation dans des diagnostics cliniques.

Hinojosa et al. (2004 et 2006) ont utilisé une voie biochimique par l’emploi de levures cultivées sur

un milieu riche en sélénite de sodium marqué isotopiquement. Une fois que l’étalon marqué de

SeMet est extrait de la levure et purifié, il est utilisé pour mener la dilution isotopique sur une

levure séléniée. Leur application de la DI a été élaborée en plusieurs étapes pour démontrer

l’efficacité de leur protocole. En particulier, ils mettent en évidence qu’un résultat issu d’une

72

intercomparaison n’est pas suffisant pour se prononcer sur une valeur de référence d’un matériau,

mais qu’il ressort seulement une valeur consensuelle.

Dans le développement de la dilution isotopique au sein des différents laboratoires, les principales

difficultés rencontrées concernent l’extraction des analytes de l’échantillon. Même avec l’utilisation

de la DI, les contraintes n’ont pas pu toutes être levées, en partie en raison de la difficulté d’obtenir

un équilibre entre la molécule d’intérêt (en phase solide) et celle marquée isotopiquement (en

phase liquide). Les avantages de la DI ne peuvent être acquis que par l’élaboration d’un protocole

d’extraction i) quantitatif et ii) ne créant pas de différences entre l’étalon marqué et l’analyte avant

sa mise en solution.

Malgré ces limitations, la DI s’avère la méthode la plus efficace pour doser des analytes. Elle offre

la plus grande justesse possible (Mester 2006) et la plus grande robustesse face à l’évolution des

analytes, une fois l’équilibre avec l’étalon marqué obtenu (Pedrero 2007b).

1.5.5 Approche métrologique

L’apsect métrologique est présent dans beaucoup d’articles précédemment cités, même si le

terme n’y apparaît pas toujours. A partir du moment où des questions sont soulevées concernant

le processus de mesure, sa fidélité, sa justesse, sa validation ou l’association d’une incertitude au

résultat, il s’agit de métrologie. Le problème provient du manque de comparabilité des mesures par

manque de traçabilité au SI.

Ce manque de traçabilité provient également d’une insuffisance dans l’estimation des incertitudes

de mesures. Jusqu’à présent, dans le cadre de l’analyse de SeMet, peu de bilans sur l’incertitude

ont été développés. L’usage veut qu’il soit seulement associé au résultat l’écart-type de la mesure,

éventuellement affecté d’un coefficient de student pour élargir sa probabilité de représenter la

dispersion des résultats. Pourtant l’association au résultat d’une incertitude, outre l’attribution d’une

donnée quantitative sur sa valeur, est un outil indispensable dans la démonstration de la traçabilité

de la méthode au SI. L’incertitude permet également, si le bilan est réalisé sous certaines

conditions, de mettre en avant les paramètres importants affectant la fidélité du résultat. Cette

mise en avant des paramètres influents est également une première étape dans l’amélioration du

processus de mesure pour renforcer la fidélité de la mesure.

Un autre aspect de la métrologie passe par sa dissémination aux niveaux des utilisateurs pour leur

permettre de se raccorder aux mêmes références. La production de CRMs est un des moyens

utilisés dans le cas de l’analyse des quantités de matière. Au niveau de l’analyse de spéciation du

sélénium, une première étape a pu être franchie avec la mise sur le marché du SELM-1 (Mester

2006), cependant ce matériau ne répond pas à tous les cas de figures et d’autres matériaux seront

à développer au cours des prochaines années. Il est donc du ressort des Instituts Nationaux de

73

Métrologie, et donc a fortiori du LNE, de mettre en place des protocoles métrologiques pour

permettre la certification de tels matériaux et leur raccordement au SI.

1.6 Bilan et choix analytiques

Au cours de cette revue bibliographique des choix ont pu être affirmés pour mener à bien le

développement d’un protocole métrologique pour l’analyse du sélénium dans des matrices

environnementales et agroalimentaires.

L’étude d’échantillons de levure et de blé s’avère intéressante au vu de leur potentiel d’apport

nutritionnel en sélénium. Pour pleinement juger de leur impact dans la chaîne alimentaire, une

simple étude de leur concentration en Se total ne suffit pas et la détermination de leur composition

en espèces se révèle nécessaire, en particulier l’accession à leur concentration en SeMet, du fait

de ses propriétés bénéfiques sur la santé.

La mise en place de l’analyse de la spéciation demande une optimisation à plusieurs niveaux :

- l’extraction des composés avec la plus grande efficacité possible tout en préservant la

répartition originelle des espèces dans l’échantillon, les hydrolyses acide et enzymatique ont

été retenues au vu de leur potentiel pour libérer SeMet dans ces types d’échantillons,

- la séparation efficace des espèces par l’utilisation de la chromatographie liquide avec soit un

mécanisme d’échange d’ions soit un mécanisme en phase inverse avec appariement d’ions,

- la détection par ICP-MS avec pour objectifs d’être sélectif, sensible et reproductible.

Une fois ces étapes maîtrisées, l’apport métrologique a été abordé avec i) le calcul de l’incertitude

sur les différents résultats, ii) la validation de méthode par l’analyse d’un CRM, iii) la

reconnaissance des capacités de mesures au niveau du BIPM par le biais d’une participation à

une intercomparaison. Au final la traçabilité au SI des mesures doit être assurée.

74

2 Le mercure

2.1 Généralités

2.1.1 Propriétés physico-chimiques

Depuis plus de 3000 ans, l’Homme a utilisé le mercure (Hg) pour de nombreuses applications. Les

chinois employaient le minerai rouge de cinabre, composé de sulfure de mercure (HgS), comme

colorant d’encre ; les orpailleurs utilisaient le mercure élémentaire pour extraire l’or (activité

toujours d’actualité) ; le calomel (Hg2Cl2) rentrait dans la composition de « poudres à dentition » au

XXéme siècle, utilisées pour prévenir les douleurs liées à la pousse des dents chez les nouveaux

nés (Clarkson 2006). Ces multiples utilisations ont surtout mis en évidence la toxicité du mercure

et de ses composés pour la santé humaine et sur l’environnement.

Le mercure est un métal qui présente l’unique particularité d’être liquide à température ambiante

avec un point de fusion de -38.8°C (Qvarnström 2003 ). Cette propriété justifie son nom latin :

Hydrargyrum signifiant « argent liquide » et son symbole Hg (Clarkson 2006). Cette faculté unique

dans le monde des métaux engendre des propriétés physiques comme une faible viscosité, une

haute densité ou une forte conductivité qui expliquent en partie ses nombreuses utilisations

(Clarkson 2006).

Les principales propriétés du mercure sont regroupées dans le Tableau 2.

Tableau 10 : Propriétés physico-chimique générales de Hg (WHO 1989 ; IUPAC 2003)

Numéro atomique 80

Période / groupe 12 / 6 (IIb)

Structure électronique [Xe] 4f14 5d10 6s2

0 +I +II Degré d’oxydation à l’état naturel

mercure mercureux mercurique

Masse molaire 200.59 ± 0.02 g·mol-1

Le mercure possède à l’état naturel sept isotopes stables (Tableau 11).

Tableau 11 : Composition isotopique du mercure à l’ état naturel (IUPAC, 2003)

Isotope 196 198 199 200 201 202 204

Répartition (%) 0.15 ± 0.01 9.97 ± 0.20 16.87 ± 0.22 23.10 ± 0.18 13.18 ± 0.09 29.86 ± 0.26 6.87 ± 0.15

75

2.1.2 Espèces mercurielles

Les espèces de Hg peuvent être regroupées en trois catégories (Qvarnström 2003, Tessier 2004,

Horvat 2005) :

i. Le mercure élémentaire ne regroupant qu’une seule espèce : Hg0 ;

ii. Le mercure inorganique réunissant le mercure monovalent (Hg+) et divalent (Hg2+)

sous forme de sels ou pouvant former des complexes avec des ligands ;

iii. Le mercure organique rassemblant les espèces formées à partir d’une liaison

covalente entre le mercure divalent (Hg2+) et au moins un atome de carbone.

Dans l’environnement, Hg se retrouve naturellement sous la forme de mercure élémentaire (Hg0),

mercure inorganique divalent (Hg2+), méthylmercure (MeHg+) et diméthylmercure (Me2Hg) (Tessier

2004, Horvat 2005). La dénomination méthylmercure peut regrouper un ensemble de composés

formé par l’association du cation MeHg+ avec un simple anion (comme Cl-) ou une molécule

chargée plus importante (comme une protéine) (Horvat 2005). D’autres espèces peuvent

éventuellement être identifiées dans l’environnement, comme l’éthylmercure, mais leur présence

est une conséquence de l’activité anthropique.

2.1.3 Utilisations

Le Tableau 12 regroupe les principales formes de Hg utilisées par l’Homme.

76

Tableau 12: Principaux composés du mercure utilisés dans l’industrie et leur application

(Qvarnström 2003, Jitaru 2004, Clarkson 2006)

Composé Espèce Utilisation

Mercure élémentaire Hg0 Appareil de mesures (baromètres, thermomètres),

lampes fluorescentes, orpaillage…

Méthylmercure CH3-Hg+

Ethylmercure CH3CH2-Hg+

Phénylmercure C6H5- Hg+

Métoxy-éthylmercure CH3OCH2CH2-Hg+

Applications agricoles

(fongicide, pesticide, désinfectant)

Mercurochrome

Antiseptique

Thimerosal

Conservateur pour l’industrie pharmaceutique

La Figure 12 détaille les principaux secteurs où le mercure est utilisé ainsi que sa consommation

associée. Ces applications industrielles font principalement appel à du mercure élémentaire ou

inorganiques. L’emploi d’espèces organiques tend à diminuer : plusieurs gouvernements ont

interdit leur utilisation dans les activités agricoles (Horvat 2005) tandis que dans l’industrie

pharmaceutique, le mercurochrome est remplacé par d’autres molécules antiseptiques pour éviter

tous risques d’allergies (Galindo 1997) et l’utilisation du thimerosal est réduite de par la suspicion

d’effets délétères sur la santé humaine (Clarkson 2002).

La production du mercure provient essentiellement de son extraction minière : à partir de cinabre

(50% du mercure produit en 2003) ou comme sous produit de l’extraction de certains métaux

(30%). Son recyclage permet également de répondre à environ 20% de la demande (Maxson

2005).

77

composants électriques

(150)

batteries (900)

électrolyse chlore-alcaline

(800)

catalyseur dans la

production de PVC (150)

autres (150)

amalgame dentaire (270)

appareils de mesures (160)

éclairage (100)

orpaillage artisanal (900)

Figure 12 : Consommation estimée de mercure dans le monde en 2003 - valeurs exprimées en tonne

(Maxson 2005)

2.2 Occurrence dans l’environnement

2.2.1 Sources de mercure

2.2.1.1 Emissions naturelles

Les sources naturelles de mercure concernent majoritairement le dégazage de la croûte terrestre

et les activités tectoniques comme les éruptions volcaniques et les sources géothermales (Nriagu

1989, WHO 1989, Tessier 2004). L’émission depuis les écosystèmes marins et terrestres constitue

également une source importante pour la mobilisation naturelle du mercure. Cependant, cette

seconde voie n’est souvent que la conséquence de précédents dépôts atmosphériques sur ces

environnements (dépôts pouvant provenir de sources naturelles ou anthropiques) (Pacyna 2006).

L’évaluation des émissions naturelles est sujette à de fortes incertitudes. Outre la difficulté

d’identification et de quantification des différentes sources à travers le globe, ces émissions ne

sont pas constantes d’une année sur l’autre rendant l’estimation délicate. Nriagu (1989) a évalué à

2500 tonnes par an les émissions du mercure libéré par voie naturelle.

2.2.1.2 Emissions anthropiques

Les principales émissions dans l’environnement de Hg ne sont pas uniquement liée à son

utilisation dans des procédés industrielles (responsable d’environ 25% des émissions totales

atmosphériques). La combustion d’énergies fossiles avec 65%, la production de ciment (6%) et

Consommation totale : 3580 tonnes

78

l’incinération des déchets (3%) représentent des sources importantes de mobilisation de Hg dans

l’atmosphère. L’ensemble des émissions anthropiques dans cet environnement est estimé à 2100

tonnes en 2000, soit un chiffre équivalent aux émissions naturelles (Pacyna 2006).

D’autres émissions de Hg peuvent survenir dans les cours d’eaux par l’évacuation de rejets

industriels ou sur les sols suite à l’épandage de boues et l’utilisation des composés de Hg dans

l’agriculture. Stein et al. (1996) ont annoncé une répartition des émissions anthropiques de 80%

pour les rejets atmosphériques, 15% au niveau des sols et 5% au niveau des écosystèmes

aquatiques.

Depuis les années 1970, des législations restrictives ont été mises en place au sein de l’Union

Européenne pour limiter voire interdire les rejets du mercure et de ses composés (Tessier 2004)

faisant chuter les émissions européenne de 860 à 239 tonnes entre 1980 et 2000 (Pacyna 2005).

Cependant, le mercure reste largement utilisé dans le monde et l’essor économique de certains

pays ne permet pas d’entrevoir une diminution durable de sa consommation ; entre 1995 et 2000,

les émissions atmosphériques ont augmenté de 90% en Afrique (à 400 tonnes), 10% en Asie

(1100 t), 20% en Océanie (130 t) et 56% en Amérique du Sud (90 t) (Pacyna 2002 et 2006).

2.2.2 Cycle bio-géochimique

Les rejets naturels et anthropiques de mercure sont principalement réalisés dans l’atmosphère en

raison de sa caractéristique de métal volatil. En conséquence, il est aisément diffusé via

l’atmosphère sur de longues distances pour atteindre des écosystèmes éloignés des sources

d’émissions ; Hg0 possède un temps de résidence dans l’atmosphère estimée entre 0.4 et 3 ans

(WHO 1990). Cette caractéristique fait de la pollution au mercure un problème global sur l’échelle

de la planète.

Les réactions et processus contrôlant la distribution des espèces du mercure dans l’environnement

sont basés sur des phénomènes d’oxydation/réduction, méthylation/déméthylation,

précipitation/dissolution et sorption/désorption (Jitaru 2004). Ces évolutions de Hg sont régies par

des phénomènes abiotiques et biotiques.

La Figure 13 illustre le cycle bio-géochimique du mercure dans la biosphère. Ce dernier a été

fortement perturbé depuis les révolutions industrielles par l’introduction massive de mercure liée

aux activités anthropiques : les concentrations des différents compartiments environnementaux

sont en moyenne trois fois supérieures à celles de l’ère pré-industrielle (Tessier 2004).

79

Figure 13 : Cycle du mercure dans la biosphère d’ap rès Horvat (2005)

La production de méthylmercure (MeHg+) au cours du cycle biogéochimique représente un des

principaux dangers liés à ce métal. En effet, après assimilation cette espèce est capable de former

une liaison stable avec les groupes thiols (-SH) des protéines (Harris 2003) qui n’est que

lentement dégradée et excrétée par les organismes (Horvat 2005). Ainsi, MeHg+ diffuse

rapidement et s’accumule le long de la chaîne alimentaire pour atteindre des fortes concentrations

sur les niveaux supérieurs des réseaux trophiques en dépit de faibles concentrations dans les

écosystèmes (WHO 1990, Horvat 2005).

Les différents compartiments environnementaux ne sont pas égalitaires face à ce risque. Les

systèmes aquatiques présentent une plus forte concentration en MeHg+ au niveau de leur biote en

comparaison avec les systèmes terrestres malgré des concentrations équivalentes dans leurs

sédiments (Dietz 2000). Une des raisons provient d’une meilleure biodisponibilité de cette espèce

dans les écosystèmes aquatiques liée à une méthylation de Hg2+ en MeHg+ pouvant aussi bien

intervenir dans les sédiments que dans la colonne d’eau (Monperrus 2004). Une seconde

explication proviendrait de réseaux trophiques plus étendus dans les milieux aquatiques qui

augmenteraient le facteur global de bioconcentration (Dietz 2000). Cependant, même si l’apport de

la contamination en MeHg+ impacte majoritairement les systèmes aquatiques à l’heure actuelle, la

pression anthropique toujours plus importante sur le cycle du mercure risque, à terme, de conduire

à l’introduction de MeHg+ dans une plus grande échelle au sein des écosystèmes terrestres

(Cristol 2008).

80

2.2.3 Exposition humaine

L’exposition des Hommes au mercure est principalement réalisée par l’inhalation de mercure

élémentaire et l’ingestion de méthylmercure. Hormis lors d’une exposition aiguë en relation avec

une activité professionnelle, la population ne semble que faiblement exposé à Hg0 (Gochfeld

2003). Les apports liés à la pollution atmosphérique et à l’utilisation d’amalgames en médecine

dentaire semblent négligeables (Clarkson 2002). Il est à noter qu’une grande incertitude est liée à

l’évaluation de l’impact sanitaire d’amalgame de mercure (Gotchfeld 2003) cependant ces effets

sur la santé semblent réversibles (Horvat 2005).

L’ingestion et l’exposition des populations au mercure se réalise majoritairement à travers la

consommation de produits de la pêche (WHO 1990, Dietz 2000) dans lesquels MeHg+ représente

75 à 95% du mercure total (Gotchfeld 2003). La consommation d’espèces se situant aux niveaux

supérieurs des réseaux trophiques y représente la plus grande exposition en MeHg+, comme

l’illustre la Figure 14. Elle éclaire surtout sur l’importance de contrôler les apports en mercure dans

ces denrées alimentaires.

Figure 14 : Bioconcentration et bioamplification du mercure dans les réseaux trophiques aquatiques

(Tessier 2005)

81

2.3 Effet sur la santé humaine

Les principaux symptômes d’une exposition chronique à de faibles doses de mercure sont

regroupés dans le Tableau 13.

Tableau 13 : Symptômes d'une exposition chronique à de faibles doses de composés du mercure

(Jitaru 2004, INERIS 2006)

Eréthisme (nervosité, irritabilité)

Changement de personnalité

Tendance suicidaire

Paresthésie

Altération auditive

Troubles du langage

Dégradation des réflexes

Troubles visuels

Urémie

Dommages rénaux

Tremblement

Gingivite

Insomnie

Infertilité

Pneumonite

Trouble du système immunitaire

Du point de vue des risques sur la santé humaine, les formes les plus préoccupantes sont la

vapeur de mercure élémentaire et les composés organiques à courtes chaînes alkyles (WHO

1976). En particulier, le méthylmercure représente une véritable menace en tant qu’espèce

majoritaire de l’exposition humaine.

Au cours du XXème siècle, l’extrême toxicité du méthylmercure a d’abord pu être illustrée à travers

plusieurs cas d’intoxications massives de populations, à Minamata et Niigata au Japon via la

consommation de poissons et en Irak avec la fabrication de pains à partir de graines traitées

(WHO 1990, Gochfeld 2003). Une fois dans l’organisme, le méthylmercure cible en premier lieu le

cerveau et le système nerveux (Mergler 2007). Cette espèce possède surtout une activité de

neurotoxique par l’inhibition de la synthèse des protéines et de l’ARN (WHO 1990, Monperrus

2004). Ses effets sont irréversibles (Horvat 2005) et peuvent entraîner la mort (WHO 1990, INERIS

2006). Dans le cas d’exposition prénatale, les dommages causés par MeHg+ sont encore plus

importants provoquant des malformations congénitales, des retardements psychomoteurs et

empêchant le bon développement du système nerveux (WHO 1990, Monperrus 2004). Des

enfants peuvent présenter des symptômes d’intoxication au mercure même si la mère ne présente

aucun signe d’empoissonnement (Mergler 2007, Grandjean 2008). Ceci démontre surtout que le

cerveau en cours de développement est encore plus sensible à une exposition au méthylmercure.

Bien que l’exposition générale des populations soit inférieure à celles observées lors

d’intoxications massives, un nombre grandissant de preuves existe démontrant que l’exposition de

certaines populations est suffisante pour induire des altérations de plusieurs systèmes, ce qui

représente un important problème de santé publique (Mergler 2007). Il est donc important de

82

pouvoir contrôler et quantifier les apports en méthylmercure dans les produits de la pêche pour

pleinement rendre compte des risques associés à leur consommation.

2.4 Evaluation du risque lié aux produits de la pêc he

Plusieurs organismes officiels ont évalué la Dose Hebdomadaire Tolérable Provisoire (DHTP) pour

le méthylmercure (EFSA 2004, INERIS 2006) :

- l’agence américaine pour la protection de l’environnement (US-EPA) propose la valeur de 0.7

µg par kg de poids corporel et par semaine (noté µg·kg-1·s-1)

- l’agence américaine d’enregistrement des substances toxiques et des maladies (ATSDR)

suggère une valeur de 2.1 µg·kg-1·s-1

- l’organisation mondiale pour la santé (WHO) propose la valeur de 1.6 µg·kg-1·s-1.

Toutes ces valeurs sont exprimées en concentration de méthylmercure. La différence entre les

doses hebdomadaires tolérables s’explique par les études épidémiologiques prises en comptes et

leur mode de calcul (EFSA 2004, INERIS 2006). Les agences en liaison avec les pouvoirs publics

(AFSSA pour la France et EFSA au niveau de l’Europe) prennent préférentiellement en compte la

valeur préconisée par la WHO (AFSSA 2004, EFSA 2004).

Plusieurs études ont été menées sur la probabilité de dépasser la DHTP en France via la

consommation de produits de la pêche (AFSSA 2004, Tressou 2004). Différents scénarios et

méthodes de calcul ont été utilisés. Les scénarios conservateurs (« données agrégées »), qui

peuvent mener à surestimer l’exposition réelle, révèlent que la probabilité de dépassement de la

DHTP est au moins égal à 10% pour l’ensemble de la population (de 10% pour les adolescents

jusqu’à 35% pour les enfants en bas âge). Les scénarios plus réalistes (« données

désagrégées »), qui peuvent sous estimer l’exposition, montrent que la probabilité d’exposition est

plus faible mais reste critique pour les populations jeunes (supérieure à 10% de 0 à 6 ans). Suite à

ces études, l’AFSSA a préconisé pour les femmes enceintes et allaitantes ainsi que pour les

jeunes enfants de favoriser une alimentation diversifiant les espèces de poissons en évitant une

consommation exclusive de poissons prédateurs sauvages tels que daurade, espadon, marlin,

requin ou thon (AFSSA 2002b et 2004).

Au vu des risques probables associés à la consommation des produits de la mer, il est essentiel

de disposer d’une législation permettant de contrôler ces denrées alimentaires. En Europe, la

législation est fixée par le règlement (CE) N°466/2 001, révisé par le règlement (CE) N°221/2002.

L’ambiguïté de cette loi réside dans l’utilisation du terme méthylmercure dans le texte pour

dénoncer les risques liés à une contamination au mercure, mais qui se traduit dans la fixation des

fractions de masse maximales par leur expression en mercure total. Une évolution de ce

règlement, avec des fractions de masse explicitement exprimées en méthylmercure, doit être

envisagée pour permettre de mieux appréhender les risques des denrées issus de la pêche. A

83

l’heure actuelle, les fractions de masse maximales autorisées sont de 0.5 mg·kg-1 en mercure total

pour tous les produits de la pêche sauf pour certaines espèces de poissons prédateurs (thon,

espadon, requin…) où la loi autorise jusqu’à 1 mg·kg-1 de mercure. Selon l’AFSSA, le respect des

limites réglementaires européennes entraîne un rejet de 3 à 4% des échantillons (AFSSA 2004).

Dans l’optique d’une possible évolution de la prise de risque, il est essentiel de pouvoir disposer de

méthodes fiables et traçables pour réaliser des mesures de méthylmercure dans les produits de la

pêche.

2.5 Protocoles d’analyses

2.5.1 Extraction du mercure depuis des matrices bio logiques marines

La première étape de l’analyse consiste à récupérer les analytes avant leur séparation. La

recherche bibliographique a principalement été limitée aux analyses menées par HPLC-ICP-MS,

qui a été le montage analytique utilisé, depuis des échantillons biologiques marins afin que les

solvants utilisés soient compatibles avec ce dispositif d’analyse. En effet, les fractions de masse

analysées sont faibles dans ce type d’échantillons (de l’ordre du mg(Hg)·kg-1) si bien que les

extraits sont souvent étudiés sans dilution après la mise en solution des analytes.

Souvent dans le cas d’échantillons frais, les auteurs ont dû procéder à une étape préliminaire à

l’extraction. Les échantillons frais ont soit subis une première étape de lyophilisation pendant 24 h,

puis un broyage pour augmenter leur homogénéité (Rai 2002), soit ils ont d’abord été séchés

avant d’être broyés puis tamisés à 100 µm (Chang 2007).

Plusieurs types de solvants d’extraction sont rencontrés dans la littérature pouvant être regroupés

en quatre catégories :

- l’hydroxyde de tétra-méthyle ammonium (TMAH) à une concentration de 5 à 25% (w/v) ou la

potasse (KOH) à 25% (w/v) pour réaliser une extraction alcaline de l’échantillon. Les réactifs

sont employés en phase aqueuse ou dilués dans du méthanol (Hintelmann 1997a, Qvarnstrom

2002, Vidler 2006, Reyes 2008),

- un composé soufré, tel que 2-ME et/ou L-Cys, employé en phase aqueuse (Chiou 2001, Hight

2006) ou en complément d’un solvant organique comme le méthanol (Clough 2003c, Chang

2007),

- une extraction acide menée avec l’utilisation d’acide chlorhydrique (Vallant 2007, Wang 2007)

ou de l’acide nitrique (Reyes 2008). Wang et al. (2007) combine son effet avec l’ajout d’un

composé soufré (2-ME) et de KCl,

- une extraction enzymatique avec l’utilisation de protéase XIV, en présence de cystéine et dans

un milieu tamponné par la présence de phosphate d’ammonium (Rai 2002).

84

Le traitement associé aux différentes extractions consise en une élévation de la température du

mélange solvant et échantillon. Seuls Wang et al. (2007) ont réalisé la solvatation à température

ambiante. Dans ce but, plusieurs méthodes ont été proposées. La plus simple réside à l’incubation

en bain-marie avec agitation (manuelle, mécanique ou magnétique), les températures allant de 25

à 60°C en fonction du solvant et le temps d’action variant de 2 à 25 heures (Hintelmann 1997a,

Rai 2002, Clough 2003c, Hight 2006, Wang 2007). Pour accélérer le temps de traitement de

l’échantillon, deux techniques sont disponibles. La première fait appel aux ultra-sons (US) :

l’énergie transmise par les ondes échauffe l’extrait et augmente les contacts entre la phase liquide

du solvant et celle solide de l’échantillon (Luque-Garcia 2003). Cette technique peut être employée

avec des solvants acides (Chang 2007) ou lors d’extractions alcalines (Qvarnstrom, 2002) avec

des temps d’action allant de 15 min à 2 h. La seconde technique pour accélérer l’incubation entre

le solvant et l’échantillon est l’utilisation de micro-ondes (Chiou 2001, Vidler 2006, Chang 2007).

Elle s’utilise en digestion alcaline (en présence de TMAH) et réduit le temps de traitement à moins

de 5 minutes pour une puissance d’onde de l’ordre de 40 W équivalent à une élévation de la

température jusqu’à environ 60 °C. Cependant, il es t nécessaire de vérifier la stabilité des

composés durant le traitement car l’action des micro-ondes peut provoquer une désalkylation du

méthylmercure en mercure inorganique (Tseng 1997).

Reyes et al. (2008) ont testé les différentes possibilités d’extraction du mercure pour des analyses

de spéciation. Ils ont ainsi démontré que dans le cas d’une analyse en routine les différentes

méthodes ne permettaient pas toujours d’obtenir une extraction quantitative. Cependant,

l’utilisation de la dilution isotopique, sous certaines conditions, a permis d’atteindre des résultats en

accord avec la valeur certifiée.

En marge des différentes techniques d’extraction présentées, Falter et al. (1997) ont développé

une méthode reposant sur la distillation de l’échantillon. Ils utilisent un solvant composé de

chlorure de potassium (20%) et d’acide sulfurique (8 mol·L-1). L’opération dure 45 minutes à 180°C

sous atmosphère d’azote et 9 mL de distillat sont récupérés. Outre la lourdeur d’un tel montage, il

est nécessaire de pré-concentrer sur une colonne spécifique les analytes avant toute séparation

des espèces.

Un paramètre important pour la conservation de la spéciation de l’échantillon est le matériau des

tubes utilisés pour la mise en solution et le stockage des extraits. En fonction des différents

matériaux, les espèces peuvent évoluer différemment (Yu 2003). Les tubes peuvent être en verre

(Rai 2002), verre ambré (Hight 2006), Téflon (Chiou 2001) ou polypropylène (Wang 2007). Hight et

al. (2006) ont testé leur effet en relation avec la quantité d’échantillon analysée et ont conclu que

pour une prise d’essai de 0.2 g de matériel lyophilisé, le récipient présentant le moins

d’interactions était le verre ambré. Pour la préparation des solutions étalons de mercure

85

inorganique et de méthylmercure pour une concentration proche de 1 g(Hg)·kg-1, il est conseillé

d’utiliser des tubes en verre pour les formes organiques et en polypropylène pour le mercure

inorganique ; la diminution du pH par l’ajout d’acide chlorhydrique (0.1% (v/v)) permet également

une meilleure stabilité de Hg2+ sur le long terme (Yu 2003). Leur stockage doit se faire dans

l’obscurité et ce jusqu’une période de six mois (Hight 2006, Yu 2003). Les solutions intermédiaires

d’étalons peuvent être préparées dans des tubes en polypropylène en présence de 0.02% L-Cys,

HCl, H2O et stockées dans l’obscurité jusqu’à quatre jours (Hight 2006).

Toutes ces différentes études ont permis l’analyse de plusieurs types d’échantillons marins : foie et

muscle de poissons, pancréas de homard, moules ou huîtres. Il en ressort que seulement deux

espèces de mercure ont pu être identifiées, le mercure inorganique et le méthylmercure ; la

seconde espèce étant largement majoritaire (> 90% Hgtotal) pour des matrices poissons et

légèrement inférieure à Hg2+ (environ 40% Hgtotal) pour les autres matrices (Hight 2006).

Pour chaque méthode proposée, les auteurs ont testés la validité des protocoles par l’analyse d’un

matériau à références certifiés (CRM), en mercure total et en méthylmercure. Plusieurs effets

pouvant affecter la fiabilité du résultat ont pu être identifiés :

- méthylation du mercure inorganique (Hintelmann 1997a, Qvarnstrom 2002, Reyes 2008),

- déméthylation du méthylmercure (Qvarnstrom 2002, Hight 2006, Reyes 2008),

- extraction non quantitative (Clough 2003c, Vidler 2007, Reyes 2008),

- instabilité du stockage des extraits avant leur analyse (Hight 2006, Vidler 2007).

2.5.2 Analyse par couplage HPLC-ICP-MS

2.5.2.1 Techniques séparatives

L’analyse des espèces de mercure est préférentiellement réalisée par l’utilisation de la

chromatographie en phase gazeuse (Jitaru 2004, Monperrus 2004, Tessier 2004). Cependant,

depuis plusieurs années, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée au

spectromètre de masse avec ionisation par plasma induit (ICP-MS) se révèle comme une

technique intéressante (Boszke 2005). L’amélioration des limites de quantification de ce détecteur

élémentaire a rendu son utilisation compatible avec l’HPLC pour la détermination du mercure dans

des fractions de masse usuellement rencontrées au sein d’échantillons naturels (de l’ordre du

mg(Hg)·kg-1). Contrairement à la chromatographie en phase gazeuse (GC), l’HPLC permet

l’analyse de composés thermolabiles et ne nécessite pas d’étape de dérivation des analytes, ce

qui limite le risque de conversion des espèces et la contamination par l’ajout de réactifs. Point et

al. (2008) ont aussi démontré que la réponse des espèces à la dérivation était fonction de leur

état : la présence de ligands modifie leur réactivité par rapport à des espèces libres ce qui, en

dilution isotopique avec l’addition d’un étalon marqué, peut être critique pour la justesse du

86

résultat. Pour toutes ces raisons, il a été choisi d’utiliser l’HPLC comme technique séparative des

espèces mercurielles.

L’annexe 3 répertorie les différentes séparations utilisées dans la littérature pour réaliser l’analyse

de spéciation du mercure par couplage HPLC-ICP-MS.

L’emploi de l’HPLC engendre également des restrictions, principalement liée à la composition de la

phase mobile qui doit être compatible avec le type de détection choisie. L’analyse en phase liquide

du mercure souffre également d’effets mémoires par l’adsorption de Hg sur les parois des

matériaux. Pour remédier à ce phénomène, il est conseillé d’utiliser des composés soufrés pour

lesquels le mercure possède une certaine affinité ce qui entraîne la formation de complexes. Les

molécules les plus souvent utilisées sont le 2-mercaptoéthanol (2-ME) ou la L-cystéine (L-Cys).

Ceux ci possèdent une fonction thiol qui réagit avec le mercure (Boszke 2005) :

RHgCl + HS(CH2)2OH → RHgS(CH2)2OH + H+ + Cl-

L’utilisation préférentielle de poly-éther-éther-cétone (PEEK) au niveau de l’appareillage en

défaveur de l’acier inoxydable limite aussi l’effet mémoire du mercure. En particulier dans le

système HPLC, plusieurs éléments peuvent être en matière composite, tels que la boucle

d’injection, le système interne de l’échantillonneur ou même la colonne chromatographique.

La plupart des mécanismes de rétention déjà répertoriés pour mener l’analyse de spéciation du

sélénium peuvent être employées dans le cas du mercure. Plusieurs espèces mercurielles peuvent

être séparées : mercure inorganique (Hg2+), méthylmercure (MeHg+), l’éthylmercure (EtHg+), le

phénylmercure (PhHg+), l’acide mersalyle et des protéines liées à du mercure.

2.5.2.1.1 Séparation par appariement d’ions

La formation de paires d’ions est employée pour la séparation des espèces cationiques du

mercure (Hg2+, MeHg+, EtHg+ et PhHg+). L’agent de paires d’ions peut être du pentanesulfonate

d’ammonium (PS5) à une concentration de 5 mmol·L-1 (Shum 1992) ou de sodium à des

concentrations 7.5 mmol·L-1 (Acon 2001). Un autre réactif utilisé dans ce sens est le bromure de

tétrabutylammonium (Harrington 1997) selon le mécanisme suivant (Boszke 2005) :

2R4NX + HgX2 → (R4N)2HgX4

R4NX + R’HgX → (R4N)R’HgX2

87

De plus, la phase mobile peut contenir une proportion de solvant organique qui diminue sa polarité

(méthanol ou acétonitrile), ceci dans le but d’accélérer l’élution des composés. En fonction des

équipements disponibles, une plus ou moins grande proportion de solvant peut être tolérée. Acon

et al. (2001) ajoute 20% d’acétonitrile avec une colonne micro-bore (diamètre interne inférieur à 2

mm), tandis que Harrington et al. (1997), avec l’ajout d’oxygène dans le gaz nébuliseur et l’emploi

d’une chambre à nébulisation refroidie à -17 °C, on t utilisé une concentration de 60% pour le

méthanol et de 45% pour l’acétonitrile.

Harrington et al. (1997) ont aussi testé l’ajout de 2-mercaptoéthanol (2-ME) à 0.01% dans la phase

mobile pour la séparation de MeHg+ et de Hg2+ afin d’augmenter la sensibilité pour les deux

composés (hauteur de pics multipliée par deux pour MeHg+ et par cinq pour Hg2+). De plus l’ordre

de sortie des espèces a été inversée, avec une forte diminution du temps de rétention sur le

mercure inorganique. Il est possible que l’ajout du 2-mercaptoéthanol ait donné lieu à une

formation préférentielle du complexe Hg-S au détriment de la paire d’ions pour expliquer la

différence dans les temps de rétention et qu’une fraction du mercure qui pouvait s’adsorber sur la

colonne soit mis en solution par la formation du complexe. Chang et al. (2007) ont utilisé aussi le

mélange des deux agents (2-ME et PS5) mais pour réaliser l’analyse de spéciation simultanée du

mercure avec celle du plomb, en soulignant que le 2-ME est présent pour Hg et PS5 pour former

des paires d’ions avec les espèces de Pb.

2.5.2.1.2 Séparation par phase inverse

Les éluants de la phase inverse sont généralement composés d’un agent complexant soufré, avec

éventuellement l’ajout d’un solvant organique et l’emploi possible d’un tampon pH.

Concernant l’agent complexant soufré, le 2-ME et la L-Cys restent largement majoritaires pour des

concentrations allant de 0.005% à 0.5% dans la phase mobile. Chiou et al. (2001) ont comparé

leurs efficacités et démontrent que le 2-ME favorise l’interaction hydrophobe entre le complexe et

la phase stationnaire de la colonne, tandis que la cystéine possède un caractère plus hydrophile

qui ne permet pas toujours une bonne séparation des espèces, surtout sur une colonne C8. Ils ont

donc optés pour l’utilisation combinée des deux agents complexant pour une séparation efficace

de Hg2+, MeHg+ et EtHg+ en sept minutes. D’autres agents complexant Hg sont rencontrés dans la

littérature. Falter et al. (1997) et Wilken et al. (1998) ont utilisé l’ion pyrrolidinedithiocarbamate

dans le but de pré-concentrer en ligne les espèces sur une cartouche C18. L’inconvénient de ce

composé est sa durée de vie en solution limitée sous des conditions acides, il nécessite donc le

contrôle du pH des différents éluants. Un composé similaire, le diéthyldithiocarbamate de sodium,

a été utilisé par Chen et al. (2009) toujours dans le but de réaliser une pré-concentration des

espèces de Hg, cependant cette étape n’est pas réalisée en ligne avec le couplage HPLC-ICP-MS.

Hasegawa et al. (2005) ont employé le 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane

sulfonate (CHAPS) déposé sur la phase stationnaire et présent dans l’éluant. Ce réactif permet par

88

plusieurs interactions (hydrophiles et électrostatiques) de séparer des macromolécules, comme

des protéines liées aux composés du mercure.

Les solvants organiques utilisés en général sont l’acétonitrile et le méthanol. Tout comme pour la

séparation avec appariement d’ions leur concentration varie en fonction du système d’introduction

de l’échantillon dans l’ICP-MS ou de l’utilisation de colonne micro-bore. Morton et al. (2002) ont

spécifié qu’une plus grande instabilité du plasma est observée avec l’utilisation de l’acétonitrile

(même pour des concentrations de 5%), ils conseillent donc de préférer le méthanol comme

modificateur organique.

Bien que le pH ne semble avoir qu’une faible incidence sur la rétention des espèces du mercure

(Wan 1997, Castillo 2006), plusieurs auteurs ont proposé de tamponner la phase mobile. Le réactif

préférentiellement utilisé est l’acétate d’ammonium, avec des concentrations allant de 5 à 200

mmol·L-1 (Bushee 1988, Han 2003, Shen 2005). Une solution intéressante a été proposée par

Hight et al. (2006) avec l'emploi de la cystéine à la fois comme agent complexant et comme

tampon pH. Ils ont utilisé une solution de L-Cys à 0.1% en association avec L-Cys, HCl, H2O à

0.1% pour tamponner la phase mobile, et sont arrivés ainsi à séparer Hg2+, MeHg+ et EtHg+ en

neuf minutes.

Il est à noter aussi, que le mode isocratique est à préférer pour l’élution. Castillo et al. (2006) par

l’emploi d’un gradient avec la multiplication par un facteur dix des concentrations en agent

complexant, en solvant organique et en tampon, ont provoqué une augmentation du signal de la

ligne de base de leur chromatogrammes ; ceci pouvant s’expliquer par l’augmentation de la

contamination apportée par les réactifs.

D’autres possibilités de mécanismes ont été appliquées à l’analyse de la spéciation du mercure.

2.5.2.1.3 Séparation par exclusion stérique

Pour la séparation de protéines liées à du mercure, probablement par une liaison Hg-S, la

chromatographie d’exclusion stérique (SEC) peut s’avérer efficace bien que longue : entre 15 et 45

min pour un chromatogramme (Hasegawa 2005, Kameo 2005, Ketavarapu 2007, Shi 2007, Wang

2008). Dans cette séparation, le tampon Tris est le plus utilisé avec des concentrations comprises

entre 25 et 100 mmol·L-1. Ketavarapu et al. (2007) sont les seuls auteurs à avoir utilisé aussi du 2-

mercaptoéthanol dans leur phase mobile mais avec le risque de modifier les équilibres entre Hg et

les protéines.

2.5.2.1.4 Séparation par échange d’ions

Peu d’auteurs ont utilisé la chromatographie d’échange d’ions couplée à l’ICP-MS pour réaliser la

spéciation du mercure.

Ikemoto et al. (2004) ont utilisé une séparation par échange d’anions pour analyser le mercure lié

à des protéines après une première étape de préparation des échantillons par une

89

chromatographie d’exclusion stérique. Ils ont simplement employé un gradient de tampon Tris

comme phase mobile.

Une autre méthode a été développée consistant à la séparation par chromatographie d’échange

de cations. Vallant et al. (2007) ont utilisé une phase mobile comportant un agent complexant (L-

Cys), un modificateur organique (méthanol) et la présence de pyridine (solvant souvent rencontré

pour la séparation d’espèces cationiques). Ils parviennent ainsi à séparer Hg2+ et MeHg+ en sept

minutes.

2.5.2.2 Détection par ICP-MS

L’analyse du mercure en phase liquide par l’ICP-MS pose également des problèmes à cause de

l’effet mémoire de ce métal ; même à faible concentration, Hg adhère aux parois de la chambre de

nébulisation et des tubes du système d’introduction de l’échantillon (Li 2006). L’utilisation dans la

phase mobile de l’HPLC d’un agent complexant le mercure permet de résoudre ce problème, et

pour les analyses en mode total son utilisation est également préconisée (Li 2006).

Outre l’effet mémoire du mercure, l’ICP-MS ne souffre pas de problèmes majeurs spécifiques.

Contrairement au sélénium, les isotopes du mercure ne sont pas perturbés par des interférences

polyatomiques. Il n’est donc pas nécessaire d’utiliser une cellule de collision dans ce sens. En

revanche, certains de ses isotopes partagent des masses en commun avec d’autres éléments : 196Hg et 196Pt, 198Hg et 198Pt ou et 204Hg et 204Pb. La technique séparative doit donc permettre de

séparer Hg de ces interférents potentiels.

Le besoin en sensibilité, relativement important dans le cadre de l’analyse d’éléments traces peut

amener à utiliser plusieurs dispositifs pour augmenter le signal.

Une première solution réside dans l’utilisation de la cellule de collisions de l’ICP-MS pour améliorer

la transmission des ions (Tanner 2002). Dans ce cadre, la cellule doit être pressurisée avec des

gaz inertes (tels que l’hélium ou l’argon) pour ne pas réagir avec les ions présents et limiter la

formation d’interférences spectroscopiques.

Une seconde solution réside dans la génération de vapeur froide pour améliorer la quantité de

mercure introduite dans l’interface de l’ICP-MS. Lin et al. (2008) ont utilisé un montage leur

permettant de réaliser la séparation des espèces de mercure avant l’introduction de l’éluant dans

l’ICP-MS via une génération de vapeurs froides en ligne. Ils ont obtenu des limites de détection de

0.8, 0.6 et 1.2 pg pour Hg2+, MeHg+ et EtHg+ respectivement, c’est à dire des valeurs inférieures à

certains montages utilisant une préconcentration hors ligne des analytes avant leur analyse en

HPLC-ICP-MS (Cairns 2008).

90

2.5.3 Dilution isotopique

Les études menées sur l’analyse du méthylmercure par dilution isotopique reposent sur deux

approches. La première consiste à utiliser un ajout d’un étalon marqué en méthylmercure pour

permettre la seule quantification de MeHg+, la seconde comprend un autre ajout d’étalon marqué

sur une seconde espèce (Hg2+) qui autorise la quantification des deux espèces. Le marquage du

mercure inorganique doit aussi s’effectuer sur un autre isotope que l’étalon marqué en MeHg+.

Cette seconde approche est utilisée pour permettre d’observer des interconversions d’espèces et

corrigées ainsi les résultats.

2.5.3.1 Etude du méthylmercure seul

Plusieurs auteurs se sont intéressés au dosage du méthylmercure par dilution isotopique, que ce

soit en GC-ICP-MS (Snell 2000), en HPLC-ICP-MS (Clough 2003b), en simultané avec d’autres

éléments (Monperrus 2003) ou avec d’autres espèces de Hg mais sans corrections des

interconversions entre espèces (Taylor 2008).

Concernant l’utilisation du couplage HPLC-ICP-MS, Clough et al. (2003a, b et c) ont mené une

étude approfondie de la caractérisation du méthylmercure dans des CRMs (sol et poisson) par

dilution isotopique. L’étalon marqué de MeHg+ a été synthétisé puis caractérisé par spectroscopie

à résonance magnétique nucléaire (Clough 2003a). L’étude de l’ajout de l’étalon marqué a permis

de mettre en évidence que l’équilibre entre l’ajout marqué et l’analyte natif était obtenu au bout de

6 min d’agitation magnétique à 25°C en présence de méthanol (50%) et de 2-mercaptoéthanol

(0.01%). Le résultat en DI était compatible avec la valeur de référence du CRM malgré une

extraction non quantitative et avec un rendement inférieur à 50%, ce qui démontre de l’efficacité

d’une telle méthode de dosage (Clough 2003c).

La principale limitation concernant la mise en pratique de la dilution isotopique en analyse de

spéciation réside dans l’obtention d’étalons marqués d’espèces mercurielles. Ces étalons n’étant

pas encore largement disponibles commercialement, plusieurs auteurs les ont synthétisés pour

leurs applications (Hintelmann 1997b, Snell 2000, Demuth 2001). Cependant, plusieurs

organismes ont commencé à s’intéresser à la fabrication de tels composés pour pouvoir les

proposer commercialement. Snell et al. (2004) de l’IRMM ont synthétisé puis certifié une solution

étalon de chlorure de méthylmercure (Me202HgCl). L’analyse en GC-ICP-MS de la solution a

montré une contamination inférieure à 2% en mercure inorganique. La certification a été menée en

plusieurs étapes avec i) l’étude de la stabilité de MeHg+ sur une période de douze mois, ii) la

détermination de la composition isotopique de MeHg+, iii) la mesure de la concentration en

mercure inorganique par étalonnage externe et iv) l’analyse par dilution isotopique du mercure

total contenu dans la solution. La concentration certifiée de MeHg+ découle de ses informations

mais surtout, par ce protocole, Snell et al. ont permis d’assurer la traçabilité au SI de leur

certification en utilisant des références appropriées. Cependant, à l’heure actuelle cet étalon

91

enrichi de méthylmercure n’est plus disponible commercialement. Rahman et al. (2003) ont aussi

développé dans un but commercial, en association avec Applied Isotopes Technologies (AIT,

USA), un étalon de chlorure de méthylmercure enrichi en isotope 201. Il a été caractérisé par

dilution isotopique inverse et HPLC-ICP-MS, aucune impureté de mercure inorganique n’a pu être

détectée et la stabilité a été étudiée sur six mois. Cet étalon est à l’heure actuel toujours proposé

par AIT en complément avec d’autres marquages pour différents isotopes de Hg.

En analyse de spéciation, l’ajout d’un seul étalon marqué ne permet pas de quantifier d’éventuelles

conversions entre espèces comme la déméhtylation de MeHg+.

2.5.3.2 Etude de la conversion inter-espèces

La dilution isotopique en spéciation menée sur plusieurs espèces, outre leur quantification

simultanée, autorise l’identification et la quantification des conversions d’espèces. Ainsi la justesse

des résultats est améliorée et l’impact des protocoles expérimentaux est mieux évalué.

Depuis le premier calcul développer par Hintelmann et Evans (1997b), plusieurs méthodes ont été

développées pour permettre de remonter aux facteurs de transformations inter-espèces.

Rodriguez et al. (2007) ont comparé les différentes approches pour l’analyse de spéciation des

organoétains. Elles ont toutes permis d’obtenir les mêmes résultats sur les concentrations et

seulement de légères différences ont été observées sur les facteurs de conversion (ces

différences n’étant pas significatives au regard des incertitudes associées).

L’application à l’étude du méthylmercure et du mercure inorganique a été réalisée par plusieurs

auteurs pour différents types d’échantillon :

− sur des sols et des sédiments (Hintelmann 1997b, Martin-Doimeadios 2004, Rahman

2004 et 2005, Monperrus 2008)

− sur des eaux de surfaces (Monperrus 2008)

− sur des produits de la pêche lyophilisés (Qvarnstrom 2002, Clough 2005, Point 2007,

Monperrus 2008, Point 2008, Reyes 2008)

− sur des tissus biologiques marins frais (Qvarnstrom 2002, Davis 2007, Point 2007,

Monperrus 2008, Point 2008).

Dans l’étude des produits de la mer, la comparaison des résultats obtenus par dilution isotopique

sur une ou deux espèces montre que les résultats sur la détermination de MeHg+ ne sont pas,

pour la plupart des cas, statistiquement différents pour des échantillons frais ou lyophilisés

(Qvarnstrom 2002, Point 2007, Monperrus 2008). En effet la majorité des échantillons était

constitués de muscles de poissons dans lesquels le mercure inorganique n’est présent qu’à de

faibles concentrations, donc son éventuelle méthylation n’a que peu d’impact sur MeHg+. A fortiori,

la détermination de Hg2+ est plus délicate dans ces échantillons car elle est plus influencée par une

92

éventuelle déméthylation de MeHg+ (Qvarnstrom 2002). Il ressort ainsi qu’il est important de mettre

en place la DI sur deux espèces lorsqu’elles sont présentes à des concentrations équivalentes

dans les échantillons ou pour caractériser un composé minoritaire (Qvarnstrom 2002).

L’utilisation de la DI sur deux espèces semble également améliorer la justesse de la quantification

(Point 2007, Reyes 2008). Concernant la fidélité des résultats, Clough et al. (2005) montre qu’elle

est améliorée tandis que Monperrus et al. (2008), au contraire, obtiennent une incertitude

supérieure avec cette technique par rapport à la DI avec une seule espèce.

Des études ont été menées pour identifier les points favorisant les conversions d’espèces. Point et

al. (2008) démontrent que l’étape de dérivation des analytes en composés volatils peut être une

source importante de déméthylation au sein d’échantillons lyophilisés. Monperrus et al. (2008)

établissent également que l’évolution de la spéciation originelle n’est pas seulement dépendante

de la préparation de l’échantillon mais aussi de sa matrice. Qvarnstrom et al. (2002) démontrent

que l’utilisation d’ultrasons ne favorise pas les conversions d’espèces. Au final, plusieurs

paramètres influencent les interconversions d’espèces, il paraît donc délicat de pouvoir élaborer un

protocole d’analyse libre de toute évolution. En conséquence, les protocoles développés ont été

contrôlés pour identifier d’eventuelles conversions.

La principale limitation de la DI en présence de deux espèces est principalement liée à l’obtention

d’étalons marqués de pureté clairement connue pour limiter l’erreur sur l’interprétation des

conversions interespèces (Davis 2007).

2.5.4 Aspect métrologique

Les questions métrologiques liées à la détermination du méthylmercure dans des produits de la

pêche tout en assurant la traçabilité des mesures ont été traitées par plusieurs auteurs.

Clough et al. (2003c et 2005) ont mis en place une méthode primaire basée sur l’utilisation du

couplage HPLC-ICP-MS pour la DI avec une seule espèce (MeHg+) ou en dosant simultanément

les deux espèces de mercure présentes dans ces échantillons (MeHg+ et Hg2+). Une étude de

l’incertitude de mesure est réalisée et la traçabilité des analyses au SI est assurée.

Point et al. (2007) ont aussi élaboré un protocole métrologique assurant la comparabilité de leur

résultat au SI par le calcul de leurs incertitudes de mesures et la démonstration de leur traçabilité.

Ce protocole a été mis en place pour l’analyse simultanée du mercure inorganique et du

méthylmercure dans des échantillons marins frais et lyophilisés via leur analyse par le couplage

GC-ICP-MS.

La disponibilité de ces protocoles métrologiques sont un atout pour permettre la certification de

CRMs et en conséquence le transfert de la traçabilité aux utilisateurs. De par l’évolution des

législations, les besoins de demain seront plus exigeants sur le raccordement au SI des

laboratoires. La mise en place de protocoles métrologiques complémentaires permettront

93

d’améliorer l’évaluation des nouveaux CRMs. Il est donc important que les Instituts Nationaux de

Métrologie mettent en place en leur sein des méthodes qui puissent prétendre à la traçabilité au SI

de leur mesure des espèces mercurielles.

2.6 Bilan et choix analytiques

Pour réaliser l’analyse de spéciation du mercure dans des produits marins, il est essentiel de

pouvoir séparer les deux espèces majoritairement présentes dans ce type d’échantillon : Hg2+ et

MeHg+. La majorité des techniques répertoriées permettent d’atteindre cet objectif.

Nous avons retenu comme mécanisme de séparation la chromatographie de partage en phase

inverse sur colonne C18 permettant de séparer efficacement trois espèces de mercure : Hg2+,

MeHg+ et EtHg+ en moins de dix minutes. Les critères pris en compte pour le choix de la phase

mobile ont été la simplicité de sa composition (en nombre de réactifs et sur leur concentration) afin

i) de limiter les contaminations, ii) d’éviter l’instabilité du plasma et iii) d’empêcher les effets

mémoires inhérents à l’analyse du mercure par l’utilisation d’un composé soufré. Parmi la liste des

phases mobiles disponibles, celle qui permet d’atteindre le mieux ces objectifs semble être la

méthode développée par Hight et al. (2006). Ces auteurs utilisent un mélange de deux réactifs : L-

Cys et L-Cys, HCl, H20 à une concentration de 1 g·L-1 pour chaque composé. De plus, ce mélange

sert également de solution tampon (pH=2.3) ce qui permet une meilleure stabilité de la séparation

lors des injections des échantillons.

Pour réaliser l’extraction depuis des matrices poissons, le choix a été dicté par celui de la phase

mobile. En effet, les concentrations en mercure dans ce type d’échantillon, relevant du niveau de

traces, ne permettent pas toujours une dilution du surnageant avant son analyse. Celui ci doit donc

être adapté pour son introduction en HPLC avec seulement une étape de filtration (à 0.45 µm). Les

conditions choisies, dans un premier temps, ont été celles de Hight et al. (2006) : extraction par 10

g·L-1 L-Cys, HCl, H2O avec incubation à 60 °C pendant 2 h. Ce protocole a été optimisé par ces

auteurs puis validé par l’analyse de CRMs de produits de la mer.

Les essais réalisés ont porté dans un premier temps à s’assurer d’une séparation efficace des

espèces mercurielles. Par la suite, il a été étudié l’efficacité d’extraction du protocole sélectioné sur

le méthylmercure. Une étape d’amélioration de la mise en solution a été envisagée par la

diminution du temps de réaction grâce à l’utilisation des micro-ondes ou des ultrasons. Une fois le

protocole analytique établi, il a été mis en place le dosage du méthylmercure par dilution

isotopique. Dans un premier temps, il a été abordé le dosage seul de MeHg+ puis des essais avec

l’utilisation de deux espèces marquées ont pu être élaborés pour étudier les conversions entre

espèces.

94

La validation du processus a été réalisée par l’analyse de plusieurs CRMs se présentant sous la

forme de poudre lyophilisée ou de matériaux frais. L’étude de matériau frais a permis d’étudier le

comportement du protocole sur des échantillons réels, ceci dans le but de rendre la méthode

développée directement applicable pour le contrôle du méthylmercure sur des produits de la

pêche. Une fois toutes les étapes du processus de mesure validées, l’apport métrologique a été

abordé avec i) le calcul de l’incertitude sur les différents résultats, ii) la démonstration de la

traçabilité des mesures au SI.

95

Chapitre III : Mise en place des méthodes

98

99

1 Instrumentation

1.1 Four à micro-ondes

Le four à micro-ondes utilisé est un modèle Ethos 900 à système fermé de chez Milestone (Italie).

Les échantillons y sont minéralisés dans des godets en téflon. La minéralisation se déroule en

présence d’acide nitrique concentrée (65%, 5 mL) et d’eau oxygénée (30%, 1 mL) pour une

quantité d’échantillon de l’ordre de 200 mg s’il est solide ou de 2 mL s’il est liquide, ces choix

opératoires ont été déterminés après optimisation. Le Tableau 14 récapitule le programme retenu

pour la minéralisation de 9 échantillons. La puissance délivrée par le four est fonction du nombre

de minéralisats à réaliser.

Tableau 14: Programme du four à micro-ondes pour mi néraliser 9 godets simultanément

Etape Temps (min) Puissance (W)

1 10 280

2 5 0

3 10 550

4 5 0

5 6 720

6 7 0

7 10 280

1.2 HPLC

Le système de chromatographie liquide haute performance utilisé est un ensemble

SpectraSYSTEM (Thermo Fisher Scientific, USA). Il est composé d’un dégazeur en ligne à

membranes poreuses (SCM1000), d’une pompe quaternaire inerte (P4000) et d’un passeur inerte

avec système de refroidissement des échantillons (AS3500). La boucle d’échantillonnage utilisée

est de 100 µL pour les analyses du sélénium et de 50 µL pour celles liées au mercure.

La première séparation des composés séléniés a été effectuée sur une colonne en acier

inoxydable d’échange d’anions composée d’une phase stationnaire de polystyrène-divinylbenzène

avec des groupements échangeurs d’ions en ammonium quaternaires (PRP-X100, 250 mm x

4.1mm id x 10 µm taille des particules, Hamilton Company, USA) équipée d’une pré-colonne de

phase stationnaire identique. Les liaisons entre l’HPLC, la colonne et l’ICP-MS ont été réalisées

avec des tubes en Poly-éther-éther-cétone (PEEK, 0.010’’ ou 0.25 mm id et 1/16’’ ou 1.6 mm od).

100

La seconde séparation a été effectuée sur une colonne à phase inverse en acier inoxydable. Il

s’agit d’une colonne C18 avec des fonctions polaires greffées au niveau des silices pour permettre

d’accepter une phase mobile composée jusqu’à 100% de solvant aqueux. Le modèle de colonne

choisi a été la Synergi-Hydro de chez Phenomenex (150 x 4.6 mm ; 4 µm) équipée d’une pré-

colonne. Cette seconde colonne a également été utilisée pour les analyses de spéciation du

mercure.

Avant son introduction dans le système chromatographique, chaque phase mobile a été filtrée à

0.45 µm (nylon) par un système de trompe à eau. Chaque échantillon a aussi été filtré à 0.45 µm

(acétate de cellulose) sur seringue avant son injection dans le système chromatographique. Le

débit était fixé à 1 mL·min-1 pour chaque séparation.

1.3 ICP-MS

Le spectromètre de masse à ionisation par couplage inductif du plasma (ICP-MS) était le modèle

PQ-ExCell (Thermo Fisher Scientific, USA). L’appareil est de type quadripolaire avec une cellule

de collisions/réactions, nommée CCT (Collision Cell Technology, technologie de cellule à

collisions), composée d’un hexapôle. Les gaz de la CCT utilisés ont été l’hydrogène et l’hélium à

des débits de 3.1 et 3.8 mL·min-1 respectivement, ces réglages ont été choisis suite à l’optimisation

de la détection pour le sélénium. Dans le cadre de l’analyse de mercure, seul de l’hélium a été

introduit dans la CCT, à un débit de 4.5 mL·min-1. Le système d’introduction de l’échantillon était

composé d’un nébuliseur de type concentrique et d’une chambre à nébulisation refroidie par effet

Pelletier à 3°C. Les cônes étaient composés de nick el. Le Tableau 15 répertorie les réglages de

l’appareil.

101

Tableau 15: Paramètres de l'ICP-MS

Paramètre Réglage

Débit d’argon plasma (mL·min-1) 14

Débit d’argon auxiliaire (mL·min-1) 0.80 à 1.00

Débit d’argon de nébulisation (mL·min-1) 0.98 à 1.03

Se Hg Débit d’hydrogène dans la CCT

(mL·min-1) 3.1 0

Se Hg Débit d’hélium dans la CCT

(mL·min-1) 3.8 4.5

Puissance incidente (W) 1350

Tension de la lentille d’extraction (V) -320 à -380

Pole Bias (V) -5.2 à -4.8

Tension de la lentille de focalisation (V) 3.8 à 4.5

Lors d’analyses en mode total, l’acquisition s’est faité en mode « Peak Jump », avec 3 canaux par

masse et un balayage réalisé 650 fois. Lors du couplage avec l’HPLC, l’obtention du signal s’est

réalisée en mode transitoire avec un temps d’acquisition variant de 100 à 300 ms en fonction des

échantillons analysés et des masses suivies.

Le logiciel permettant de piloter l’ICP-MS était PlasmaLab fourni par Thermo (version 1.06.2007). Il

est également utilisé pour l’intégration des pics obtenus par des signaux transitoires.

L’ICP-MS a été pré-réglé chaque nouveau jour d’utilisation par une solution de Tune multi-

élémentaire à 1 µg·kg-1 en suivant la masse 115 (indium). Suite à la mise en route de la CCT,

l’intensité du signal était à nouveau optimisée sur une solution de l’élément d’intérêt à 20 µg·kg-1

(en suivant les masses 78 et 80 pour le sélénium et les masses 200 et 202 pour le mercure).

102

2 Réactifs et étalons

L’eau ultra-pure a été obtenue à partir d’un système composé de deux modules. Le premier était

un Elix 3 (Millipore Co., Bedford, Massachusetts, USA) permettant la production d’eau osmosée

depuis le réseau d’eau de ville. L’Elix était en liaison avec un système Milli-Q Element (Millipore

Co.) permettant la préparation d’eau ultra-pure (résistivité supérieure à 18.2 MΩ·cm).

L’eau oxygénée (30%, suprapur), l’acide chlorhydrique (30%, suprapur), l’acide nitrique (65%,

suprapur), l’acide fluorhydrique (40%, suprapur) et le gel de silice utilisé dans le dessiccateur (SiO2

avec indicateur d’humidité, gel orange) ont été fabriqués par Merck (UK) acquis chez VWR

(France). Le mercure métallique utilisé pour caractériser l’étalon marqué de mercure dans le cadre

des analyses en total a également été acquis chez Merck. Il affiche une pureté de 99.9999%

(Suprapur).

La solution de Tune servant à optimiser l’ICP-MS a été fournie par AccuStandard INC. (USA).

La majorité des réactifs ont été obtenus chez Sigma-Aldrich (France) :

- L-cystéine (pureté ≥ 98.5%)

- L-cystéine, HCl, H2O (pureté ≥ 99%)

- tris (Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, pureté ≥ 99.8%)

- dodécylsulfate de sodium (SDS, pureté ≥ 99.0%)

- acide citrique (pureté ≥ 99.5%)

- citrate d’ammonium dibasique (pureté ≥ 99.0%)

- méthanol (LC-MS Chromasolv, pureté ≥ 99.9%)

- hydroxyde d’ammonium (concentration à 30-33%)

- pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride, pureté ≥98.0%)

- lipase de Candida rugosa type VII

- driselase de Basidiomycetes sp.

- protease de Streptomyces griseus type XIV

- acide méthane sulfonique (pureté ≥ 99.5%)

- β-mercapto-éthanol (pureté ≥ 99.0%)

- acide trifluoroacétique (TFA, ≥ 99.0%)

- acide heptafluorobutirique (HFBA, ≥ 99.5%).

L’acide pentafluoropropionique (PFPA) provenait de Acros Organics (pureté ≥ 97%).

Les étalons en sélénium provenaient de Sigma Aldrich :

- séléno-DL-méthionine (pureté à 99%), SeMet

- sélénite de sodium (pureté à 99%), SeIV

- séléniate de sodium (pureté à 99%), SeVI

- Se-méthyl-sélénocystéine (pureté à 95%), MeSeCys.

103

Un second étalon de SeMet (pureté > 99%) a été obtenu chez Acros Organics (Belgique).

Contrairement à l’étalon de chez Sigma, il n’est composé que de l’isomère L-SeMet. Le sélénium

élémentaire (pureté à 99.995%) provenait d’Alfa Aesar (Karlsruhe, Allemagne).

Les solutions étalons en sélénium ont été préparées gravimétriquement à 1 g·kg-1 dans de l’acide

nitrique à 2% (v/v) pour les sels inorganiques et dans de l’acide chlorhydrique à 0.1 mol·L-1 pour

les formes organiques. Ces étalons ont été conservés à -20 °C dans l’obscurité trois mois

maximum. Les solutions de travail ont été préparées quotidiennement par gravimétrie à partir

d’étalons dilués à 1 mg·kg-1 préparés chaque semaine et conservés à 4°C dans l’ obscurité.

Les étalons marqués de sélénium utilisés lors de la dilution isotopique en total ont été obtenus

chez Spectrascan (Teknolab, Kolbotn, Norvège), leur concentration est proche de 10 mg·kg-1 et

sont enrichis à plus de 95% en isotope 78Se ou 82Se. L’étalon de sélénométhionine enrichi en 76Se

(environ 1 mg de 76SeMet) a été fourni par les organisateurs lors des participations aux

intercomparaisons (CCQM-P86 et CCQM-K60).

Les étalons en espèces de mercure provenaient de Sigma Aldrich :

- chlorure de méthylmercure (pureté à 99.5%)

- dichlorure de mercure (pureté à 99.999%).

L’étalon de chlorure d’éthylmercure a été fourni par Alfa Aesar (France).

Les solutions étalons en mercure ont été préparées gravimétriquement à 1 g·kg-1 dans de l’acide

chlorhydrique à 0.1% (v/v) et dans des tubes en polypropylène pour le mercure inorganique et

dans 20% de méthanol dans des tubes en verres ambrés pour les espèces organiques. Ces

solutions ont été stockées à 4 °C dans l’obscurité et ont été utilisées sur une période 3 mois pour

les analyses en DI. Les solutions intermédiaires ont été diluées avec la phase mobile dans des

tubes en polypropylène et conservées à 4 °C dans l’ obscurité pendant une semaine.

L’étalon marqué de méthylmercure a été fourni par Applied Isotope Technologies (USA). Il est

enrichi en isotope 200 et se présente sous la forme d’une solution de chlorure de méthylmercure à

une fraction de masse de 10.5 mg(Hg)·kg-1 en présence de thiosulfate de sodium (0.5%).

Pour les analyses en mercure total, l’étalon marqué utilisé (IRMM-640) provenait de l’IRMM. Il est

enrichi en isotope 202 et se présente également sous la forme d’une solution (à 2.97 mg·kg-1). Un

troisième étalon a été utilisé dans le cadre des analyses de mercure. Il s’agissait d’une solution de

mercure (à 9.85 mg·kg-1) certifiée pour son isotopie (IRMM-639).

104

3 Optimisation du couplage HPLC-ICP-MS

3.1 Séparation des espèces séléniées

3.1.1 Mécanisme d’échange d’anions

Après la réception de l’unité chromatographique et la mise en place du couplage avec le

spectromètre de masse de type ICP, des tests de séparation de trois formes de Se (SeMet,

sélénite de sodium et séléniate de sodium) ont été entrepris sur la colonne d’échange d’anions. Ils

ont été réalisés avec une phase mobile à différents pH pour une concentration en citrate

d’ammonium de 5.10-3 mol·L-1 en présence de 2% de méthanol. L’objectif était d’arriver à séparer

les différents étalons en un minimum de temps. Les chromatogrammes obtenus en suivant le

rapport m/z=80 sont regroupés sur la Figure 15. Ces tests sur le pH n’ayant pas été menés le

même jour, les concentrations des étalons utilisés ne sont pas identiques, ceci explique la

différence dans la hauteur des pics.

0

10000

20000

30000

0 5 10 15 20t (min)

Inte

nsité

(cps

)

4.8 5.2 5.6

Figure 15 : Chromatogrammes de 3 étalons de Se en f onction du pH de la phase mobile

L’étude des charges apparentes pour les espèces de sélénium et pour l’acide citrique permettent

d’expliquer les différences de comportement en fonction du pH (Figure 16). Les valeurs des pKa

des composés séléniés proviennent de la littérature (Goessler 1997). Le calcul des charges

apparentes a été réalisée avec l’équation suivante :

(pH) SeIV SeMet

SeVI

105

∑∑=

i

iiapp C

zCz Éq. 1

avec :

- zapp : charge apparente

- Ci : fraction de masse de la forme i

- zi : charge de la forme i

Au pH étudiés, les trois espèces de Se restent sous la même forme ionique : à savoir anionique

pour les composés inorganiques et zwitterionique pour le sélénium organique. La différence de

comportement, provient de l’acide citrique dont les proportions des formes doublement et

triplement chargées augmentent avec le pH, ce qui améliore son pouvoir d’élution. Le fait que la

rétention SeMet ne soit pas affectée par le pH laisse présumer qu’elle n’est pas induite par des

phénomènes d’échange d’ions.

Le pH retenu de la phase mobile pour mener les analyses du sélénium est de 5.6. Cette valeur

permet d’obtenir la séparation des trois composés étudiés tout en limitant le temps d’analyse.

Figure 16 : Charge apparente et espèce prédominante en fonction du pH

106

Les performances analytiques du couplage ont été étudiées par le calcul des limites de détection

(LDs) pour SeMet sur plusieurs isotopes (76Se, 78Se, 80Se et 82Se). La détermination des LD s’est

faite selon la définition proposée par l’IUPAC :

p

tsLD = Éq. 2

avec :

− t : coefficient de Student, pris égal à trois pour un intervalle de confiance de 99.86%

− s : écart-type de la hauteur de pic obtenu sur la mesure de 10 blancs

− p : pente obtenue par l’analyse d’une gamme étalon en utilisant la hauteur de pic.

Les hauteurs des pics obtenus pour les solutions d’étalons de SeMet ont été utilisées pour la

détermination des LDs.

Le Tableau 16 regroupe les différentes LDs obtenues sur chaque isotope, exprimées en fraction

de masse et en quantité de matière pour 100 µL d’échantillon injecté.

Tableau 16 : Limites de détection pour la séparatio n avec échange d'anions couplée à l'ICP-MS,

exprimées en fraction de masse et en masse absolue pour 100 µL injecté

m/z µg(Se)·kg-1 pg(Se)

76 1.09 109

78 0.45 45

80 0.14 14

Limite de

détection

82 0.65 65

Chaque limite de détection a été validée par l’analyse d’un étalon à une fraction de masse égale à

sa valeur et la vérification de l’obtention de hauteurs de pic significativement différentes de la ligne

de base. Il est à noter que pour l’isotope 76, la LD est plus forte que celle obtenue pour l’isotope

82 alors que leur abondance isotopique est proche. Cette masse est la plus interférée au niveau

du bruit de fond, ce qui explique cette valeur plus élevée.

Darrouzes et al. (2005) avec des conditions similaires d’analyses ont obtenu des limites de

détections du même ordre de grandeur sur SeMet (32 pg, 18 pg et 47 pg pour 78Se, 80Se et 82Se

respectivement).

3.1.2 Mécanisme avec appariement d’ions

En raison du nombre et de la complexité des espèces de sélénium qu’il est possible d’extraire

depuis des matrices environnementales, des risques de co-élution de composés sont possibles.

107

Cette raison a motivé la mise en place d’une séparation complémentaire à la séparation par

échange d’anions.

Dans le cadre de l’appariement d’ions, la phase mobile était composée de l’agent d’appariement, à

hauteur de 0.1% (v/v), et de méthanol à 2% (v/v), toujours pour l’augmentation du signal de Se.

Trois agents d’appariements d’ions ont été étudiés :

- l’acide trifluoroacétique (TFA)

- l’acide pentafluoropropionique (PFPA)

- l’acide heptafluorobutyrique (HFBA).

Cette technique séparative n’est d’efficace, avec ces agents d’appariements, que pour la

séparation des espèces organiques du sélénium et en particulier l’analyte de principal intérêt :

SeMet. Les tests ont donc été réalisés sur des étalons de sélénométhionine (SeMet) et de Se-

méthyl-sélénocystéine (MeSeCys). La Figure 17 représente les séparations obtenues avec les

différents agents.

m/z=80

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 5 10 15 20 25t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

TFA PFPA HFBA

Figure 17 : Chromatogrammes de SeMet et de MeSeCys par différents agents d'appariement d’ions ;

SeMet est le second composé pour chaque phase mobil e

Comme prévu, l’augmentation de la chaîne perfluorée de l’appariement d’ions accroît les

interactions avec la phase solide et améliore la séparation des espèces. Toutefois, cette

amélioration se fait au détriment du temps d’analyse et de la largeur des pics. Cette propriété a

permis de s’assurer de la spécificité de la séparation lors de l’analyse d’échantillons réels : en effet

la comparaison des différents agents peut mettre en évidence d’éventuelles co-élution.

Les LDs sur SeMet de cette méthode ont été également déterminées pour évaluer les

performances de cette séparation (Tableau 17).

108

Tableau 17 : Limites de détection pour la séparatio n avec appariement d'ions couplée à l'ICP-MS,

exprimées en fraction de masse et en masse absolue pour 100 µL injecté

m/z µg(Se)·kg-1 pg(Se)

76 1.04 104

78 0.12 12

80 0.02 2

Limite de

détection

82 0.12 12

L’analyse d’étalons à des fractions de masse similaires à leur LD a permis de vérifier ces valeurs.

Pour l’isotope 76, l’analyse d’un étalon à 0.5 µg(Se)·kg-1 a montré qu’il était statistiquement

différent de la ligne de base et donc détectable. Cet effet montre les limites de la détermination de

LDs via une analyse statistique des données.

La comparaison des LDs entre les deux méthodes de séparations (Tableau 16 et Tableau 17)

montre que le mécanisme reposant sur l’appariement d’ions conduit à une meilleure sensibilité

pour la détection de SeMet. Ainsi, si des échantillons de faible fraction de masse sont analysés,

cette méthode séparative sera préférentiellement utilisée.

3.2 Séparation des espèces mercurielles

Les conditions de séparation des espèces du mercure retenues sont basées sur la littérature

(Clough 2003c, Hight 2006). Elles reposent sur la formation d’un complexe entre le mercure et un

composé soufré pour éviter les effets mémoires de Hg. Le composé soufré utilisé (L-cystéine) est

aussi employé pour réaliser une solution tampon (mélange des réactifs L-Cys et L-Cys, HCl, H2O).

L’effet d’un ajout de méthanol dans la phase mobile est également testé. La Figure 18 représente

l’optimisation de la composition de la phase mobile pour la séparation du mercure inorganique

(Hg2+) et du méthylmercure (MeHg+).

109

Figure 18 : Optimisation de la composition de la ph ase mobile pour la séparation, par ordre de sortie,

de Hg 2+ et MeHg+ ; les étalons sont à des concentrations voisines de s 10 µg·kg -1

Le premier essai a consisté à reproduire les conditions chromatographiques de Hight et al. (2006) :

L-Cys (1 g·L-1) et L-Cys, HCl, H2O (1 g·L-1) (Figure 18-a). La séparation obtenue laisse apparaître

une traînée à la suite des pics pouvant s’expliquer par des phénomènes d’adsorption dus à Hg ou

aux complexes. Une nouvelle composition de la phase mobile est donc testée pour augmenter sa

force d’élution avec l’ajout de méthanol (MeOH) à hauteur de 2% en présence de L-Cys (1 g·L-1) et

de L-Cys, HCl, H2O (1 g·L-1) (Figure 18-b). L’ajout de méthanol a pour effet de diminuer les temps

de rétention des composés mais n’empêche pas la traînée des pics chromatographiques et ne

représente donc pas une amélioration de la séparation. La première composition a donc été

retenue afin de limiter les réactifs. Cependant, l’utilisation répétée de cette phase mobile a

engendré des perturbations au niveau de la détection avec l’apparition d’intensité nulle lors de

l’acquisition de signaux transitifs (Figure 18-c). Ces troubles ont été attribués à la trop forte

concentration de réactifs (2 g·L-1 au total). Une nouvelle composition a donc été testé pour limiter

la concentration totale à 1 g·L-1 (0.5 g·L-1 de chaque réactif). Le chromatogramme obtenu (Figure

18-d) montre que dans ces conditions, les deux espèces sont efficacement séparées. Les

analyses suivantes ont donc été réalisée avec ces concentrations de réactifs (L-Cys à 0.5 g·L-1 et

L-Cys, HCl, H2O à 0.5 g·L-1). Dans ces conditions, il est également possible de séparer

110

l’éthylmercure (EtHg+) en moins de huit minutes (chromatogramme non montré). Cette nouvelle

composition de phase mobile n’a engendré aucune interférence au niveau de l’ICP-MS.

L’analyse du mercure depuis des matrices biologiques demande de quantifier des teneurs au

niveau de traces, voire d’ultratraces. Le montage analytique se doit donc d’afficher une sensibilité

optimale. Dans le but d’améliorer les capacités de détection du couplage HPLC-ICP-MS, la cellule

de collisions/réactions (dénommée CCT) est activée et pressurisée avec un gaz de collision

(hélium à 4.5 mL·min-1). La Figure 19 compare les chromatogrammes obtenus pour l’analyse d’un

étalon de méthylmercure avec et sans l’activation de la CCT. Les chromatogrammes ont été

obtenus au cours de la même journée d’analyse.

m/z=202

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

sans CCT avec CCT

Figure 19 : Chromatogrammes du méthylmercure avec e t sans CCT ; injection de MeHg + (5 µg·kg -1)

L’utilisation de la cellule CCT améliore la sensibilité du détecteur ; pour un même étalon injecté sa

hauteur du pic est multipliée par deux. Le bruit de fond subit également une élévation de son

signal. Cette augmentation de sensibilité est attribuée à une meilleure transmission des ions

jusqu’à l’analyseur quadripolaire (Tanner 2002).

Les performances du couplage HPLC-ICP-MS ont été évaluées en comparant les deux réglages

de l’ICP-MS (Tableau 18).

111

Tableau 18 : Limites de détection avec et sans CCT sur MeHg +, exprimées en fraction de masse et en

masse absolue pour 50 µL injecté

µg(Hg)·kg-1 pg(Hg) m/z

sans CCT avec CCT sans CCT avec CCT

199 0.43 0.02 22 1.1

200 0.26 0.03 13 1.5

201 0.27 0.03 13 1.6

Limite de

détection

202 0.27 0.02 14 0.9

La comparaison des LDs obtenues confirme la meilleure sensibilité avec l’utilisation de la CCT, le

gain de sensibilité est compris entre 8 et 20 selon les isotopes. Ces LDs sont comparables à celle

obtenue par Chang et al. (2007), égale à 1 pg, qui utilisent une colonne microbore (1 mm de

diamètre) et un nébuliseur à haute efficacité permettant d’être quantitatif sur la nébulisation. Même

si notre montage permet de se rapprocher de certaines valeurs obtenues en chromatographie en

phase gazeuse, Yan et al. (2008) évoquent une LD de 0.5 pg, il ne permet pas de tenir la

comparaison avec la plupart des couplages GC-ICP-MS : Martin-Doimeadios et al. (2002)

obtiennent des LDs de 21 et 28 fg pour les isotopes 202Hg et 201Hg respectivement.

3.3 Détection

Avant la mise en place de la dilution isotopique, des tests ont été réalisés pour améliorer

l’exactitude et la justesse des comptages de l’ICP-MS. Le biais en masse, le temps mort du

détecteur ou la formation d’hydrures dans la chambre de collisions (concernant le sélénium) sont

les principaux facteurs perturbant la justesse de comptage. Il faut donc en tenir compte afin de

limiter ces interférences soit par un réglage adéquat de l’ICP-MS soit par une correction des

données.

3.3.1 Temps mort du détecteur

Lors de l’utilisation d’un détecteur multiplicateur d’électrons fonctionnant en mode « Pulse

counting », son temps mort doit être préalablement réglé. Ce temps correspond à la période

nécessaire au détecteur pour prendre en compte l’impulsion induite par un ion. Durant cet instant,

tout nouvel ion arrivant au niveau du multiplicateur d’électrons n’est pas détecté, entraînant un

comptage erroné de l’ion suivi.

Le temps mort de l’appareil a été déterminé par la méthode proposée par Russ (Vanhaecke 1998).

Elle consiste à analyser des solutions de différentes concentrations pour plusieurs valeurs de

réglages du temps mort. Une fois les données recueillies, pour chaque concentration étudiée le

rapport isotopique normalisé (Robservé/Rthéorique) est tracé en fonction du temps mort. L’intersection

des différentes courbes donne la valeur du temps mort du détecteur (Figure 20).

112

Figure 20 : Méthode de Russ pour la détermination d u temps mort d’un détecteur, d’après Vanhaecke

et al. (1998)

Dans la pratique, plusieurs valeurs de temps mort peuvent être déterminées à partir du graphique

mais toutes assez proches les unes des autres. Pour obtenir la meilleure estimation, la moyenne

des différents résultats est retenue.

Il est à noter que des phénomènes (appelés « sag ») peuvent gêner la détermination du temps

mort et mener à une valeur plus importante de celui-ci (cf. courbe en pointillés sur la Figure 20).

Ceci peut arriver lors du comptage d’une solution trop concentrée. Les impulsions générées au

sein du détecteur par un trop grand nombre d’ions ne disposent pas toutes d’une amplitude

suffisante pour être détectées. Grâce à la méthode de Russ, il est aisé de repérer ces

phénomènes de « sag » (Vanhaecke 1998).

Dans le cadre d’un multiplicateur d’électrons à dynodes discrètes (utilisé dans le PQ-ExCell), le

temps mort est indépendant du rapport m/z observé (Vanhaecke 1998).

L’étude du temps mort du détecteur a été réalisée avec la solution de Tune à différentes

concentrations. Son utilisation a permis de suivre plusieurs éléments afin de s’assurer de

l’indépendance du temps mort du détecteur vis à vis du rapport m/z analysé.

La Figure 21 représente les résultats obtenus sur les éléments baryum (m/z suivies 138 et 137) et

thallium (m/z suivies 205 et 203).

113

Tl205/Tl203

0.950

0.960

0.970

0.980

0.990

1.000

20 25 30 35 40 45 50 55 60

temps mort (ns)

rapp

ort n

orm

alis

é

1ppb 10ppb 20ppb

Ba138/Ba137

0.900

0.950

1.000

1.050

0 10 20 30 40 50 60

temps mort (ns)

rapp

ort n

orm

alis

é

1ppb 10ppb 20ppb

b)

a)

Figure 21 : Rapport normalisé en fonction du temps mort réglé sur l'ICP-MS pour le baryum (a) et le

thallium (b)

Aucun phénomène de « sag » n’a été observé au cours de la détermination du temps mort. En

regardant chaque valeur de temps mort déterminée pour un élément, il a été observé une

estimation de 48 ns (s=4 ns) pour le baryum et une valeur de 52 ns (s=4 ns) pour le thallium. Il

apparaît donc que dans le cas du détecteur multiplicateur d’électrons à dynodes discrètes, le

temps mort soit indépendant de la masse suivie, comme observé dans la littérature (Vanhaecke

1998).

En relevant les différentes valeurs de temps mort observées, la valeur expérimentale moyenne est

de 50 ns (s=4 ns). Cette valeur a été utilisée pour le réglage de l’ICP-MS pour les futures

expériences. Il est conseillé de régulièrement déterminer le temps mort car il évolue avec l’âge du

détecteur (Hill 2000).

Une fois le temps mort déterminé, les intensités sont automatiquement corrigées par le logiciel de

l’ICP-MS grâce à l’équation suivante (Held 1999) :

)1( mesurée

mesuréecorrigée I

II

τ−= Éq. 3

114

avec :

- I corrigée et I mesurée : les intensités corrigée et mesurée, respectivement,

- ττττ : le temps mort du détecteur.

3.3.2 Correction de la formation d’hydrures de sélé nium

Lors de l’analyse par ICP-MS, l’hydrure de sélénium (SeH+) se forme au niveau de la cellule de

collisions/réactions, probablement à cause de la matrice de l’échantillon et de l’hydrogène introduit

(gaz de réactions). Cet hydrure peut affecter la mesure d’un rapport isotopique si les ions 77 ou 78

sont suivis. Il faut donc apporter une correction mathématique aux intensités obtenues après avoir

déterminé un facteur d’hydruration (fSe) (Hinojosa 2003).

Le suivi des rapports m/z 82 et 83 avec l’analyse d’une solution étalon de sélénium permet

d’évaluer fSe. La correction d’hydrures est appliquée aux masses 77 et 78 comme tels :

77Se = 77I - fSe76I Éq. 4

78Se = 78I - fSe77Se Éq. 5

avec :

- iI : intensité mesurée par l’appareil à m/z=i,

- iSe : intensité corrigée pour m/z=i.

Le facteur de formation d’hydrures (fSe) a été estimé à partir d’une solution étalon de

sélénométhionine à 50 µg·kg-1 analysées trois fois.

La valeur calculée est de 3.42 10-2 (s=2.1 10-3), ce qui représente un taux de formation d’hydrures

de presque 4%. Cette valeur est en accord avec la littérature (Hinojosa 2003 et 2004).

Ce facteur a besoin d’être estimé régulièrement, car il a été observé qu’il varie au cours du temps

(Figure 22).

Lors de l’analyse d’une séquence d’échantillon, il a été déterminé tous les deux échantillons.

115

R2 = 0.8942

0.0100

0.0300

0.0500

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

temps d'analyse (h)

f(Se)

f(Se)

Figure 22 : Evolution de fSe au cours d’une journée d’analyse

3.3.3 Biais en masse

De par le type d’ionisation utilisée (ICP), un phénomène, appelé biais en masse, doit être pris en

compte pour corriger les intensités délivrées par le détecteur.

Lors de la formation du plasma, les ions les plus légers subissent une discrimination par rapports

aux plus lourds. Ils sont envoyés à la périphérie du plasma et sont donc plus facilement exclus lors

du passage à travers l’interface de l’ICP-MS (Hill 2000). Deux phénomènes survenant au niveau

de l’interface peuvent expliquer ce biais (Heumann 1998) :

i. La séparation par effet de tuyère ou « nozzle separation effect » (Figure 23). La

production d’un jet supersonique venant buter sur le cône écorceur enrichit le centre du

faisceau d’ions en éléments lourds.

ii. La séparation par effet de charges. Les anions issus du plasma ont tendance à se

repousser et les plus légers sont donc plus facilement expulsés sur la périphérie du

faisceau.

116

Figure 23 : Illustration de l’effet de tuyère, d’ap rès Heumann et al. (1998)

Bien que le biais en masse soit influencé par la matrice de l’échantillon, il est déterminé grâce à

une solution étalon afin d’éviter la présence d’interférences isobariques qui fausseraient sa

détermination.

La correction s’effectue avec un modèle exponentiel (Hinojosa 2003). En prenant l’exemple du

sélénium, un étalon de Se a été analysé en suivant les masses de 76 à 82. Ces différentes

intensités sont d’abord corrigées de l’interférence SeH+ puis la courbe représentant le logarithme

népérien des rapports isotopiques normalisés en fonction de la différence de masse est tracée :

)()( expii

théo

i

MfR

RLn ∆=

Éq. 6

avec :

- iRexp : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80, déterminé expérimentalement ;

- ithéoR : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80 théorique, fourni par la table IUPAC

des abondances isotopiques (IUPAC 2003);

- iM∆ : différence entre la masse molaire i et la masse molaire de l’isotope 80.

Le coefficient directeur de cette courbe qui représente le facteur de correction du biais en masse

(K) a été obtenu grâce à une régression linéaire (Figure 24).

117

y = -0.025x + 0.0007R2 = 0.9941

-0.12

-0.08

-0.04

0.00

0.04

0.08

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

M(80)-M(i)

Ln(Rexp/Rthéo)

Figure 24 : Estimation graphique du facteur de biai s en masse

Une fois K déterminé, les rapports isotopiques peuvent être rectifiés suivant l’équation :

)(exp

iMKiicorr eRR ∆−= Éq. 7

avec :

- icorrR : rapport isotopique entre la masse i et la masse 80 corrigé du biais en masse.

Grâce à ces corrections, les rapports isotopiques obtenus sont proches de l’isotopie naturelle

(Tableau 19).

Tableau 19 : Rapports isotopiques corrigés de la fo rmation d’hydrures puis du biais en masse, sur

l’aire de SeMet d’un extrait de levure analysé en H PLC-ICP-MS

Rapport expérimental

normalisé

Rapport corrigé des

hydrures

Rapport corrigé des hydrures

et du biais en masse

Rapport

isotopique Rexp/Rthéo Rcorr(SeH)/Rthéo Rcorr/Rthéo

76/80 0.9075 0.9075 1.0029

77/80 0.9813 0.9293 1.0017

78/80 0.9734 0.9587 1.0078

82/80 1.0603 1.0603 1.0086

La valeur du facteur de biais en masse semble évoluer au cours du temps avec une légère

tendance allant vers la diminution de sa valeur (Figure 25). Ce paramètre a donc été déterminé

régulièrement au cours des analyses (en même temps que le calcul du facteur fSe soit tous les

deux échantillons).

118

-0.0300

-0.0250

-0.0200

0 1 2 3 4 5 6

n° expérience

K

K

Figure 25 : Evolution du facteur de biais en masse au cours des analyses (moyenne sur trois

injections accompagnée de son écart-type)

Cette démarche (hormis pour la correction de la formation d’hydrures) est aussi utilisée pour la

détermination du biais en masse lors des analyses du mercure. Dans le cas de cet élément, il a

également été observé une évolution du facteur K au cours du temps, il est donc périodiquement

déterminé dans une journée d’analyse.

Le facteur du biais en masse est dépendant de l’élément analysé : sa valeur est d’environ 2.5%

par unité de masse pour le sélénium et inférieure à 0.5% dans le cadre du mercure. Ces valeurs

confirment une influence plus importante du biais en masse sur les éléments les plus légers.

3.3.4 Vérifications de l’absence d’interférences

L’utilisation de la dilution isotopique (DI) requiert la mesure d’isotopes libres de toutes

interférences. Des essais ont donc été réalisés pour vérifier cette hypothèse avec l’utilisation de

l’écart normalisé. Ce test provient de la norme ISO 13528, auquel nous avons introduit une

modification. Cet outil statistique permet de comparer deux valeurs au regard de leur incertitude

pour déterminer si elles sont significativement différentes. Le calcul de l’écart normalisé (EN)

s’effectue grâce à l’équation suivante :

222natSstd

SstdN

uuu

RRE

++

−= Éq. 8

avec :

- Rstd : le rapport isotopique issu de la mesure faîte sur une solution étalon

- RS : le rapport isotopique mesuré au sein de l’échantillon

119

- ustd et uS : les incertitudes de Rstd et RS respectivement

- unat : la variabilité naturelle sur le rapport théorique (IUPAC 2003). L’introduction de ce dernier

terme est la modification apportée à la formule originelle.

Le test est satisfait si EN est inférieur à 2 (pour un intervalle de confiance de 95%). Bien que EN

soit assez efficace pour mettre en avant une ou plusieurs interférences sur les isotopes, il ne peut

permettre de détecter que celles provenant de la matrice de l’échantillon. En effet, les valeurs

mesurées sur l’échantillon sont comparées à celle d’un étalon, donc si une interférence est

également présente sur cet étalon, EN ne suffit pas pour la détecter. Pour s’affranchir de cet

inconvénient, il suffit de comparer la valeur de l’étalon à la valeur théorique issue des tables

IUPAC (IUPAC, 2003).

L’écart normalisé est déterminé sur les différents échantillons (en l’absence d’étalon marqué) juste

avant la mise en place de la DI aussi bien en analyse totale qu’en analyse de spéciation.

120

4 Double dilution isotopique

4.1 Principe

La dilution isotopique consiste à déterminer la concentration d’un élément dans un échantillon par

ajout d’une quantité connue de ce même élément mais dont la composition isotopique a été

modifiée artificiellement, appelé étalon marqué par la suite.

La concentration de l’élément à doser est déterminée à partir de la mesure du rapport des deux

isotopes A et B dans le mélange échantillon-étalon marqué ; cette étape est la dilution isotopique

directe.

Lors de la double DI, l’étalon marqué utilisé est lui aussi caractérisé par dilution isotopique. Un

mélange entre l’étalon marqué et un étalon à l’abondance naturelle est réalisé. Cette étape est la

dilution isotopique inverse, en raison du rôle d’inconnu joué cette fois par l’étalon marqué.

La Figure 26 récapitule la démarche utilisée pour mener la double DI.

Figure 26 : Démarche de la double dilution isotopiq ue

Une fois les rapports isotopiques obtenus (étalon marqué plus étalon et échantillon plus étalon

marqué), les concentrations sont déterminées grâce aux équations suivantes :

• concentration de l’analyte dans l’étalon marqué Csp :

121

( ) ( )( ) ( )

−−=

spisp

etaetai

spi

etaetasp BRA

ABR

m

CmC Éq. 9

• concentration de l’analyte dans l’échantillon Cech :

( )( ) ( )

( ) ( )

−−

−=

echdech

spspd

ech

spspdech BRA

ABR

hm

CmC

1 Éq. 10

avec :

-meta : prise d’essai de la solution étalon

-Ceta : concentration de la solution étalon

-(A)eta : abondance naturelle de l’isotope A dans l’étalon

-(B)eta : abondance naturelle de l’isotope B dans l’étalon

-Ri : rapport isotopique pour la dilution isotopique inverse

-Rd : rapport isotopique pour la dilution isotopique directe

-(A)sp : abondance de l’isotope A dans l’étalon marqué

-(B)sp : abondance de l’isotope B dans l’étalon marqué

-mspi : masse de l’étalon marqué pour la dilution inverse

-mspd : masse de l’étalon marqué pour la dilution directe

-mech : prise d’essai de l’échantillon

-(A)ech : abondance naturelle de l’isotope A dans l’échantillon

-(B)ech : abondance naturelle de l’isotope B dans l’échantillon

-h : humidité de l’échantillon.

4.2 Spécificités

Les étapes préliminaires du dosage par dilution isotopique consistent à réaliser une évaluation de

la concentration de l’échantillon par étalonnage externe puis par ajouts dosés. Au delà de la semi-

quantification de l’échantillon, ces étapes permettent de repérer d’éventuels interférents, par le

calcul de l’écart normalisé, et de sélectionner le rapport isotopique de travail. Une fois celui-ci

choisi, la DI peut être mise en place.

La préparation de toutes les solutions et prises d’essai a été réalisée par pesée sur des balances

périodiquement étalonnées et quotidiennement vérifiées par des masses étalons. En particulier, la

concentration de la solution étalon de haute pureté servant à caractériser l’étalon marqué a été

obtenue par préparation gravimétrique (solution primaire). Pour chaque DI, deux solutions

primaires ont été réalisées avec l’étalon de l’analyte et depuis chacune d’entre elle, deux réplicats

122

de DI Inverse ont été préparés. Au final, l’étalon marqué a donc été caractérisé par quatre réplicats

de DI Inverse (indépendants deux à deux). Les solutions d’étalons primaires ont également été

utilisées pour la détermination du taux d’hydrures et du facteur du biais en masse afin de corriger

les rapports isotopiques mesurés par l’ICP-MS. Quatre réplicats de DI Directes ont été réalisés

pour caractériser l’échantillon.

La préparation des mélanges étalon marqué/échantillon pour la DI Directe et étalon marqué/étalon

pour la DI Inverse ont été réalisée de telle sorte que les rapports isotopiques mesurés soient

égaux entre eux (à 5% près). Cette méthode, dénommée « matched method » et traduite comme

méthode des analogues, a été développée par Henrion (1994) puis simplifiée par Catterick et al.

(1998). Son utilisation limite l’impact de sources d’erreurs (comme le biais en masse) sur le

résultat final de l’échantillon. Elle permet également de diminuer l’impact sur la détermination de

l’échantillon d’un étalon marqué mal caractérisé en isotopie ou en concentration (Catterick 1998).

Pour pleinement bénéficier des avantages de cette méthode, la même quantité d’étalon marqué (à

la même dilution) doit être employée pour la préparation des DI Inverses et Directes. Le rapport

isotopique à mesurer par ICP-MS doit également être proche de un. L’acquisition de deux isotopes

d’intensités similaires permet d’obtenir la meilleure justesse de mesure de la part du spectromètre

de masse (Fassett 1989, Sargent 2002). Les effets de paramètres comme le temps mort du

détecteur et la statistique de comptage des ions sont ainsi limités. La justesse est également

améliorée par l’analyse de fortes intensités (lorsque la concentration des échantillons le permet).

L’analyse des échantillons par le montage HPLC-ICP-MS a été réalisée à des temps de comptage

suffisants pour obtenir une justesse de mesure satisfaisante (typiquement de 250 à 300 ms sont

utilisées par isotope pour obtenir des écart-types relatifs de mesures inférieurs à 0.5%). Lors de

l’analyse en total, le temps de comptage a été fixé à 10 ms mais le nombre de comptage a été

augmenté jusqu’à 650 balayages. Chaque réplicat a été analysé cinq fois lors de son analyse.

La réalisation de la double dilution isotopique dans ces conditions a réuni les critères pour

reconnaître le processus de mesure comme une méthode primaire, à condition d’associer une

incertitude au résultat correctement définie.

123

5 Calcul d’incertitude

L’association de l’incertitude au résultat d’une mesure est une étape importante pour i) assurer la

traçabilité et la comparabilité des valeurs et ii) soutenir la validation de la méthode appliquée.

La démarche élaborée dans le cadre de cette étude pour associer une incertitude repose sur la

méthode analytique préconisée par le GUM (ISO/IEC 1995).

Il est possible de découper le calcul de l’incertitude en quatre étapes :

i. Définition du mesurande avec l’écriture du modèle mathématique le représentant.

Chaque grandeur d'entrée du modèle est estimée et la valeur du résultat (mesurande) est

déterminée. Dans le cadre de la DI, le mesurande est la concentration de l’échantillon à

déterminer (Cech), son modèle mathématique l’équation générale de la DI à laquelle se

rajoute les différentes corrections des données (taux d’hydrures, biais en masse…). Les

différents paramètres pris en compte dans le calcul de Cech et donc de u(Cech) sont

représentés dans un diagramme de cause et effets dans le cas su sélénium (Figure 27).

Figure 27 : Diagramme de causes et effets permettan t de visualiser les facteurs pris en compte dans

le calcul de l'incertitude de Cech

ii. Evaluation de l'incertitude-type de chaque grandeur d'entrée. A chaque paramètre de

l’équation de Cech est associé son type de variable (type A pour des valeurs expérimentales

ou type B pour des valeurs tabulées ou certifiées), son incertitude-type et une loi de

124

distribution (qui représente la répartition des valeurs selon leur probabilité de présence

dans l’intervalle donné). L’association d’une loi de distribution est primordiale pour les

incertitudes tabulées car elle permet de définir l’incertitude-type d’un paramètre à partir de

son incertitude élargie. Le Tableau 20 récapitule l’estimation des incertitudes-types pour

chaque catégorie de facteurs. L’intérêt de la méthode du GUM réside dans sa capacité à

traiter indifféremment des données expérimentales (Type A) et tabulées (Type B).

Tableau 20 : Estimation des incertitudes-types pour chaque catégories de paramètre pris en compte

dans l'incertitude finale sur la concentration de l 'échantillon déterminée par dilution isotopique

Catégorie de

paramètres

Type de

variables

Incertitude-type

u(xi) Mode de calcul de u(xi)

Masse B u(m) Incertitude établie lors de

l’étalonnage de la balance

Taux d’hydrures

( SeHf ) A )( SeHfσ

Ecart-type (σ) issu des 3 mesures

réalisées lors de sa détermination

Biais en masse (K) A ∑ − 2)(

)(

XX

V

i

iε

Incertitude d’une valeur déterminée par une

régression linéaire à partir des observations (Xi) et

de la variance (V) issue des résidus (εi) du modèle

Abondance

isotopique naturelle B

3

a

Loi uniforme où a représente l’incertitude fournie

par les tables IUPAC

Pureté de l’étalon B 18

)( ab−

Loi triangle rectangle où aet b représentent les

bornes de spécificités de la pureté de l’étalon

Répétabilité

instrumentale A )(Rσ

Ecart-type issu des 5 mesures

des rapports isotopiques

Répétabilité de la

méthode A

n

Yi )(σ Ecart-type issu des n résultats (Yi) obtenu avec

chaque réplicat indépendant de la méthode

iii. Détermination de l'incertitude-type composée du résultat grâce à la loi de propagation

des incertitudes qui donne la valeur de la variance (égale à l’incertitude-type au carré) de

Cech :

)()()(1

2

2

2i

N

i iechech xu

x

fCuCV ∑

=

∂∂== Éq. 11

avec :

-xi : paramètre de l’équation de Cech

125

-u(Cech), u(xi) : incertitude-type de Cech ou xi

-V(Cech) : variance de Cech

- f : équation mathématique de Cech.

Cette loi est valable dans l’hypothèse d’un développement à l’ordre 1 de Taylor de la

variance de Cech et dans le cadre de faibles variations des différents paramètres. De plus

cette expression ne tient pas compte des covariances des différents paramètres que l’on

considère nul (pas de corrélation entre les xi).

Les dérivés partielles (ix

f

∂∂

), appelées coefficients de sensibilité, décrivent comment varie

le résultat final en fonction des variations d’un paramètre. Elles permettent donc de

quantifier, en prenant aussi en compte l’incertitude du paramètre, son importance sur

l’expression finale de U. Le poids du paramètre se calcule donc par l’équation suivante :

)()( ii

i xux

fxP

∂∂=

Éq.12

La part du paramètre xi (en %) se calcule par la suite, tel que :

( ) ( )( )2

2

100%ech

ii

Cu

xPx = Éq. 13

iv. Expression du résultat accompagné de son incertitude élargie. Cette valeur représente

un intervalle dont il est attendu qu’il comprenne une fraction élevée de la distribution des

valeurs qui pourraient être raisonnablement attribuées au mesurande (définition du GUM).

)( echCkuU = Éq. 14

avec :

- U : incertitude élargie

- k : facteur d’élargissement ; généralement k=2 pour un intervalle de confiance

proche de 95% si le mesurande tend vers une loi de distribution normale.

Le calcul de l’incertitude-type du mesurande est effectué grâce au logiciel Wincert permettant la

propagation des incertitudes-types (version 3.11.2002.0115, Implex, France). Une fois la liste des

paramètres influant établie et leur incertitude-type déterminée, ces données sont entrées dans le

logiciel (Figure 28-a). Les différentes fonctions qui permettent d’aboutir au résultat final sont aussi

saisies dans le programme (Figure 28-b). L’étape suivante, consistant à la propagation des

126

incertitudes-types, est réalisée par Wincert. Ce logiciel a été validé au sein du LNE par la

comparaison des incertitudes de résultats délivrées avec celles obtenues suite au calcul manuel

des dérivées partielles.

Figure 28 : Paramètres (a) et fonctions (b) utilisé es dans le calcul de l’incertitude ; illustration a vec le

cas de la détermination de la sélénométhionine

Une fois les incertitudes déterminées sur les différentes mesures, il peut être comparé les valeurs

mesurées avec les valeurs certifiées. L’écart normalisé (ISO 13528) est aussi utilisé dans ce sens :

( ) ( )22certech

certechN

CuCu

CCE

+

−= Éq. 15

avec :

- Cech : valeur déterminée

- Ccert : valeur certifiée

- u(Cech) : incertitude-type de Cech

- u(Ccert) : incertitude-type de Ccert

Si EN est inférieur à 2 alors il n’y a pas de différence significative entre les deux valeurs (pour un

intervalle de confiance de l’ordre de 95%).

127

6 Traçabilité de l’analyse

Le guide Eurachem/Citac (2003) énonce les critères qui doivent être pris en considération pour

prétendre à la traçabilité de l’analyse :

- Définition du mesurande

- Choix d’une méthode de référence pour estimer sa valeur

- Démonstration à travers la validation que le calcul et les conditions de mesures incluent tous

les paramètres influents sur le résultat

- Identification de l’importance relative de chaque quantité prise en compte

- Choix et application des étalons de références appropriés

- Estimation de l’incertitude.

Le dosage des concentrations au sein des divers échantillons a été effectué avec l’utilisation de la

double dilution isotopique, reconnue par le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM)

comme étant une méthode primaire. De ce fait, le mesurande est raccordé à la solution d’étalon

préparée de façon gravimétrique. Le calcul de l’incertitude par la méthode analytique du GUM

permet de mettre en avant parmi les paramètres pris en compte et ceux de plus grande influence.

La validation de la méthode se fait à travers l’utilisation de CRMs.

Le protocole développé au cours de ces travaux permet donc de prétendre à la traçabilité au SI

des résultats obtenus.

128

Chapitre IV : Applications aux analyses

de spéciation du sélénium

130

131

Le couplage HPLC-ICP-MS, les protocoles pour la mise en pratique de la DI et pour le calcul des

incertitudes des résultats étant établis, l’application à l’analyse d’échantillons réels a pu être

envisagée.

La démarche abordée repose sur des tests préliminaires pour extraire Se des échantillons et pour

séparer les espèces extraites. Suite à ces optimisations, le protocole métrologique

(DI→incertitude→traçabilité) a été appliqué pour caractériser les échantillons.

1 Analyses des levures

Les premiers échantillons testés ont été des levures séléniées, utilisées comme complément

alimentaire. Trois échantillons différents ont été analysés. Le premier était une levure

précédemment étudiée par le LCABIE dénommé dans ce mémoire LevTest (fraction de masse

totale proche des 2000 mg·kg-1). Le deuxième échantillon de levure (SELM-1) était un matériau

certifié (en sélénium total et sélénométhionine, Tableau 21) provenant du National Research

Council Canada (NRC, Canada). Le dernier échantillon a été fourni par les organisateurs lors de la

participation à l’intercomparaison CCQM-P86 et se présentait sous la forme de composés

pharmaceutiques dans lesquels la levure est enrobée d’excipients composés de cellulose, de

phosphate de calcium, de sels de magnésium et de dioxyde de titane (Goenaga 2008). Les

valeurs de références issues de l’intercomparaison pour ce matériau sont présentées dans le

Tableau 21. Les principaux défis liés à l’analyse de cet échantillon ont été i) la nouvelle matrice

avec les excipients recouvrant la levure qui peuvent modifier l’action de l’exraction et ii) sa

concentration en SeMet inférieure d’un facteur 6 par rapport au SELM-1. La participation du LNE à

l’intercomparaison CCQM-P86 ne s’est faîte qu’à travers la mesure du sélénium total, le couplage

n’étant pas encore réceptionné aux dates de soumission des résultats.

Tableau 21 : Valeurs certifiées du SELM-1 et valeur s de références pour la CCQM-P86

Analyte Sélénium total

(mg(Se)·kg-1)

Sélénométhionine

(mg(SeMet)·kg-1)

Selm-1 2059 ± 64 3389 ± 173

CCQM-P86 337.6, s=9.7 (n=13) 562, s=44 (n=11)

*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (s) sur

les n mesures (Goenaga 2008)

1.1 Optimisation de l’extraction sur LevTest

Les analyses ont débuté par l’étude des compléments alimentaires constitués de levures

séléniées. Le but final a été de disposer d’une méthode de référence pour la détermination de leur

concentration en sélénométhionine.

132

Des tests préliminaires ont visé à mettre en place un protocole d’extraction du sélénium la plus

quantitative possible. L’hypothèse de départ a été que si la totalité de Se se retrouve en solution, il

en sera de même pour SeMet à condition aussi de briser les liaisons entre cet acide aminé et les

macromolécules le contenant (les chaînes polypeptidiques par exemple). L’optimisation de la mise

en solution de Se a donc été réalisée en analyse totale du sélénium dans un premier temps. La

levure LevTest est utilisée pour mener ces essais préliminaires.

1.1.1 Comparaison des solvants d’extractions

La première étape a été la détermination du sélénium total contenu dans la levure. Ainsi 200 mg

de levure ont été minéralisés en présence d’acide nitrique (5 mL) et d’eau oxygénée (1 mL) sous

l’action d’un champ micro-onde. La valeur a été estimée à 1941 mg·kg-1 par étalonnage externe

sur produit humide avec un écart-type (s) de 69 mg·kg-1 pour 3 prises d’essais. La connaissance

de la concentration en sélénium dans la levure a permis d’établir des bilans de matières entre les

différentes fractions (extrait et culot) pour le calcul des rendements d’extraction.

Plusieurs modes d’extractions recueillis dans la littérature ont été comparés. Les protocoles testés

sur 200 mg de levures et sous agitation magnétique sont :

-5 mL d’eau milli-Q. Incubation à 90°C pendant 1 h. (Casiot 1999a)

-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) en présence d’un inhibiteur de protéases (Pefabloc,

10 mmol.L-1) plus l’action de la driselase (200 mg). Incubation 1 h à 25°C. (Casiot 1999a)

-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) avec un solubilisateur de protéines, le

dodécylsulfate de sodium (SDS à 200mg). Incubation 1 h à 25°C (Casiot 1999a).

-5 mL de tampon Tris-HCl (30 mmol·L-1, pH 7) avec 20 mg de protéase type XIV et 10 mg de

lipase VII. Incubation 16 h à 37°C. Protocole de Ca siot et al. (1999a) avec l’utilisation d’un tampon

Tris-HCl au lieu d’un tampon phosphate.

Afin d’accélérer l’incubation pour l’hydrolyse enzymatique de la levure, les échantillons ont

également été placés dans un bain à ultrasons (US) pendant trois heures au lieu de l’agitation

magnétique à 37 °C pendant 16 h.

Le dernier mode opératoire testé consistait en une hydrolyse acide de la levure. 500 mg

d’échantillon sont mis à reflux pendant 16 h en présence de 48 mL d’acide méthane sulfonique (4

mol·L-1) plus 1 mL de β-mercapto-éthanol pour éviter l’oxydation des acides aminés libérés

(Anders 2002, Wrobel 2003, Mester 2006, McSheehy 2005).

Après l’application de chaque protocole, le surnageant a été séparé du culot par centrifugation

(2500 rpm, 10 min). Les deux fractions (la totalité du culot ou 2 mL de surnageant) ont subi une

minéralisation en présence d’acide nitrique (5 mL) et d’eau oxygénée (1 mL) sous l’action d’un

champ micro-ondes. Suite à cette étape, les échantillons ont été dilués pour l’analyse du sélénium

133

total par ICP-MS avec un étalonnage externe. Les résultats ont permis de calculer le rendement

d’extraction grâce à l’équation suivante :

[ ] 100totéch

Se

Sem

mR = Éq. 16

avec :

- R : rendement d’extraction en pourcentage

- mSe : masse de sélénium dans le surnageant ou le culot

- méch : masse de la prise d’essai

- [Se]tot : concentration en sélénium de l’échantillon.

Les résultats obtenus en fonction du type d’extraction sont regroupés dans la Figure 29, où les

barres d’erreur représentent l’écart-type des 3 réplicats.

0

20

40

60

80

100

120

140

Drisela

seSDS

prona

se+lip

ase

eau

hydr

olyse a

cide

enzy

mes ave

c US

nature du solvant

%

% culot % extrait

Figure 29 : Pourcentages d'extraction du sélénium t otal en fonction du mode opératoire considéré

Il est important de noter que les divers protocoles employés permettent d’obtenir des rendements

en sélénium bien distincts. Ceci est attribué à leur mode d’action spécifique. Pour la plupart des

modes utilisés, le bilan de matière (somme des deux fractions) se situe à une valeur proche de

100% mais lors des extractions réalisées avec l’hydrolyse acide ou les enzymes plus des

ultrasons, l’estimation se situe vers 140%. Cela a représenté une motivation pour re-déterminer la

fraction de masse totale en sélénium de la levure. La nouvelle estimation a été de 1875 mg·kg-1

(s=23 mg·kg-1, n=3), soit sans différences significatives avec la première valeur. Pour expliquer ces

résultats, plusieurs hypothèses ont été envisagées, soit une contamination extérieure des fractions

134

soit un effet de matrice lors du dosage. Il a été difficile de conclure sur l’action de ces deux modes

d’extractions, même si l’accélération de l’action des enzymes avec les ultrasons peut être

supposée. L’utilisation du montage à reflux lors de l’hydrolyse acide s’avère délicate et ne permet

pas une action simultanée sur plusieurs réplicats, ce protocole n’a donc pas été retenu.

Concernant l’effet des autres réactifs, leur bilan de matière permet une interprétation des résultats.

L’action de l’eau seule permet de mobiliser la fraction hydrosoluble de Se qui représente 13% de

Se total. L’utilisation de la driselase permet d’atteindre 33% de Se représentant la partie contenue

dans les parois cellulaires et la fraction hydrosoluble. Le SDS libère 53% du sélénium total grâce à

la solubilisation des chaînes polypeptidiques qui contiennent une partie du sélénium. Enfin, l’action

du mélange protéase XIV et Lipase VII permet de recueillir jusqu’à 84% du sélénium total. Ceci

atteste le fait qu’il peut être contenu en grande partie dans les protéines, cible de l’action de la

protéase XIV. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits par Casiot et al. (1999a).

Il peut donc être présumé que l’action successive des différents réactifs permettra d’atteindre une

mise en solution plus importante du sélénium. De par les rendements établis et ceux de la

littérature (Korhola 1986, Casiot 1999a, Wrobel 2003), il peut être supposé que la majorité du

sélénium se situe dans la fraction composée par les chaînes polypeptidiques, donc cibler l’action

de l’extraction sur ce compartiment de la levure. La suite des travaux a donc été consacrée à

l’étude d’extractions séquentielles.

1.1.2 Extractions séquentielles

Deux protocoles d’extractions séquentielles ont été testés, le premier (nommé protocole A) repose

sur un mode opératoire mis en place par Polatajko et al. (2005). Il consiste à répéter trois fois

l’extraction avec un nouveau mélange d’enzymes protéase XIV et lipase VII dans 5 mL de Tris-HCl

après chaque incubation de 16 h à 37°C. Les différe nts surnageants ont été analysés

indépendamment en sélénium total après la minéralisation d’une fraction de 2 mL. Le culot a

également été minéralisé pour déterminer le sélénium non extrait et pouvoir réaliser un bilan de

matière (Figure 30).

135

Figure 30 : Extraction par protéase/lipase réalisée trois fois, protocole A (d’après Polatajko 2005)

Les résultats sont présentés dans la Figure 31.

Protocole A

82

10

12

1 protéase+lipase I

protéase+lipase II

protéase+lipase III

culot

Figure 31 : Efficacité d'extraction (en %) de l'hyd rolyse enzymatique répétée trois fois (protocole A)

Le bilan de matière est de l’ordre de 105% (s=2 pour n=2). Le rendement global de ce mode

opératoire avoisine les 90% du sélénium total contenu dans la levure, soit une valeur comparable

à celle obtenue par Polatajko et al. (93 ± 4%) sur un autre échantillon de levure séléniée. Si

chacun des surnageants est analysé séparément, la première étape montre une efficacité

d’extraction d’environ 80%, la seconde mobilise 10% de Se tandis que l’ultime extraction n’offre

136

que 1% de rendement. Cette dernière étape apporte donc un gain relativement faible entre son

temps d’action (16 h d’incubation) et son efficacité.

Ce protocole est consommateur de temps pour le traitement de l’échantillon (trois fois 16 h

d’incubation), comme souvent dans le cadre d’analyses de spéciation depuis des matrices solides.

Il a donc été intéressant d’essayer de diminuer le temps relatif à l’extraction de Se par l’emploi de

réactifs différents mais en conservant une efficacité d’extraction au moins égale à celle obtenue.

Ainsi, un second mode opératoire (protocole B) a donc été mis en place. Comme vu

précédemment, les différentes propriétés des réactifs testés permettent d’atteindre différentes

fractions de sélénium dans la levure. Après application deux fois de l’extraction à l’aide d’un

mélange d’enzymes (lipase VII plus protéase XIV), le culot a subi une nouvelle extraction

enzymatique, cette fois ci non protéolytique, avec l’utilisation de la driselase qui vise son action sur

les parois cellulaires. La dernière étape de l’extraction a consisté à récupérer les chaînes

polypeptidiques n’ayant pu être digérées par les enzymes avec du SDS. Comme précédemment,

le dosage en Se total a été effectué par étalonnage externe après minéralisation des surnageants

et des culots pour établir les rendements d’extraction (Figure 32).

Figure 32 : Schéma des extractions séquentielles (p rotocole B)

Les résultats de cette extraction sont présentés dans la Figure 33.

137

Protocole B

80

8.0

1.86

3

protéase+lipase I

protéase+lipase II

Driselase

SDS

culot

Figure 33 : Efficacité d’extraction (en %) du secon d protocole (B) mis en place

Le bilan de matière (99% s=4 pour n=3) est correct. Le rendement total des extractions est

d’environ 96%, soit la meilleure mise en solution testée. Dans le détail, les extractions révèlent

plusieurs informations. Pour les étapes identiques au précédent protocole, les mêmes rendements

d’extractions ont été retrouvés, respectivement autour de 80 et 10% d’efficacité. Ensuite, il est à

noter le faible taux de recouvrement de la Driselase. Comparée au rendement obtenu lors de son

utilisation seule, l’action de la Driselase est réduite par les deux premières étapes du protocole

(2% d’extraction contre 40%). Ceci s’explique d’abord par le fait que le sélénium hydrosoluble a

été lessivé par les deux premières extractions (mélange d’enzymes protéase plus lipase),

représentant moins de 20% de Se. Il est aussi supposé qu’une action similaire est menée par les

deux types d’enzymes sur la levure, bien que le mélange d’enzymes de la Driselase (laminarinase,

xylanase et cellulase) agisse plus spécifiquement sur les polysaccharides tandis que la protéase

cible les chaînes polypeptidiques. 6% du sélénium ont été extraits par le dernier solvant (SDS).

Généralement, le SDS est utilisé pour la solubilisation de peptides, ce qui laisse sous-entendre

qu’une fraction de sélénium serait encore contenue dans ce type de molécules. L’action des

enzymes protéolytiques ne serait donc pas totale mais ne peut être améliorée par le mélange

d’enzymes utilisé au vu des résultats obtenus lors de la précédente extraction séquencée (1% de

Se mis en solution au bout de la troisième action des enzymes).

La mise en place du protocole B a permis d’améliorer le rendement global d’extraction de Se en

mode total par rapport au protocole A. Cependant pour s’assurer du maintien de la répartition

initiale des espèces séléniées, il est important d’étudier la spéciation des extraits.

138

1.2 Analyses de la levure SELM-1 et de l’échantillo n de CCQM-

P86

LLaa ddéétteerrmmiinnaattiioonn ddeess ffrraaccttiioonnss ddee mmaassssee eenn SSeeMMeett ddeess ddeeuuxx éécchhaannttiilllloonnss nn’’aa ééttéé eeffffeeccttuuééee qquuee ppaarr

llaa ccoolloonnnnee dd’’éécchhaannggee dd’’aanniioonnss dduu ffaaiitt qquu’’aauu mmoommeenntt ddee llaa mmiissee eenn ppllaaccee ddeess pprroottooccoolleess dd’’aannaallyyssee

eenn DDII,, sseeuullee cceettttee ssééppaarraattiioonn ééttaaiitt ddiissppoonniibbllee aauu llaabboorraattooiirree..

Des tests ont été menés pour juger des espèces mises en solution par les deux protocoles A et B

depuis l’échantillon de levure SELM-1 certifié pour sa concentration en SeMet et sur l’échantillon

de l’intercomparaison CCQM-P86 (la levure LevTest n’étant pas certifiée pour sa teneur en

SeMet).

Les conditions chromatographiques de la séparation par la colonne d’échange d’anions sont :

- une phase mobile composée de 5.10-3 mol·L-1 citrate d’ammonium en présence de 2% de

méthanol

- un volume d’injection de 100 µL.

Du fait du calendrier des recherches, le LNE n’a pu participer à l’intercomparaison CCQM-P86

pour fournir une valeur sur l’analyse de la sélénométhionine. En effet à la date stipulée aux

participants de l’essai inter-laboratoires, le protocole métrologique pour mesurer SeMet n’était pas

encore en place. En conséquence, le LNE n’a pu fournir qu’une valeur sur la concentration en Se

total.

Les deux protocoles d’extractions séquentielles ont donc été testés avec le couplage HPLC-ICP-

MS. Les surnageants ont été conservés à 4°C et en p résence de β-mercapto-éthanol (0.1%) pour

limiter leur oxydation (Polatajko 2005) jusqu’à l’analyse.

1.2.1 Mise en solution des espèces par le protocole A

1.2.1.1 SELM-1

La Figure 34 représente le chromatogramme obtenu par l’échange d’anions de l’extrait seul après

sa dilution et avec un ajout de 20 µg·kg-1 d’un étalon de SeMet. Il est à noter qu’entre la mise en

place du couplage et les premières analyses d’échantillon, des réglages ont été apportés

permettant de diminuer le temps mort du système. Ceci explique la différence dans les temps de

rétention pour SeMet entre les étalons et les extraits.

Sur le chromatogramme de l’extrait de SELM-1, un composé est largement majoritaire tandis que

deux élévations de la ligne de base sont présentes respectivement à 1.3 et 1.8 min. L’ajout de 20

µg·kg-1 de SeMet a permis d’identifier le pic majoritaire comme étant la sélénométhionine ce qui

est en accord avec la bibliographie (Mester 2006). Les autres « pics » ne correspondent pas aux

formes inorganiques (SeIV et SeVI), ils ne sont donc pas identifiés.

139

m/z=80

0

25000

50000

75000

100000

125000

0 1 2 3 4 5 6 7

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

extrait extrait+20µg/kg SeMet

Figure 34: Chromatogramme du surnageant issu du pro tocole A du SELM-1 (extrait seul et dopé avec

un étalon de SeMet) sur la colonne d’échange d’anio ns

1.2.1.2 CCQM-P86

Le protocole A a également été appliqué à l’échantillon de CCQM-P86, avec ajout d’une étape

préliminaire. Cet échantillon se présentant sous la forme de comprimés pharmaceutiques, ces

derniers ont été broyés à l’aide d’un mortier et d’un pilon en agate avant toute mise en solution.

La Figure 35 représente l’analyse de l’extrait par la colonne d’échange d’anions.

Le profil des pics est identique à celui obtenu pour l’extrait de SELM-1. SeMet est le composé

majoritaire et deux élévations de la ligne de base sont présentes à des temps de rétention de 1.3

et 1.8 min laissant supposer la présence des mêmes composés secondaires.

m/z=80

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 1 2 3 4 5 6t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

Figure 35 : Chromatogramme du surnageant issu du pr otocole A de la CCQM-P86 sur la colonne

d’échange d’anions

140

1.2.2 Mise en solution des espèces par le protocole B

1.2.2.1 SELM-1

Lors de l’application du protocole B sur le SELM-1, les différents surnageants issus de l’extraction

séquentielle ont été analysés individuellement pour juger de leur efficacité propre à libérer SeMet.

La Figure 36 regroupe les chromatogrammes des différents extraits.

m/z=80

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 1 2 3 4 5 6 7

t (min)

Inte

nsi

té (

cps)

protéase/lipase driselase SDS

Figure 36 : Chromatogramme des extraits de SELM-1 p ar le protocole B sur la colonne d’échange

d’anions

Quel que soit le type de solvant utilisé pendant le protocole B, le composé majoritaire dans les

surnageants est la sélénométhionine (conforme à la première extraction). Au vu de l’intensité des

pics de SeMet et s’il est tenu compte des facteurs de dilutions des divers surnageants (x100 pour

prot./lip., x20 pour driselase et x50 pour SDS), l’étape du protocole qui solubilise le maximum de

SeMet est celle avec les enzymes protéase plus lipase. Les deux mêmes composés secondaires

sont observables avec cette seconde extraction séquentielle, seule l’utilisation de SDS semble

mettre en solution un composé supplémentaire au temps de rétention de 1.1 min.

1.2.2.2 CCQM-P86

La Figure 37 représente l’analyse de l’échantillon de CCQM-P86 par le protocole B (analyse des

surnageants mutualisés). Une fois de plus SeMet représente quasiment l’unique espèce présente

dans le surnageant. Comme pour le SELM-1, les mêmes pics sont observés sur les

chromatogrammes de l’échantillon de CCQM-P86 avec l’application des deux protocoles

d’extraction.

141

m/z=80

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

0 1 2 3 4 5 6t (min)

cps

Figure 37: Chromatogramme de l’extrait de CCQM-P86 issu du protocole B sur la colonne d’échange

d’anions

1.2.3 Evaluation de l’oxydation de SeMet

Afin de vérifier si les deux composés sortant entre 1 et 2 min pouvaient être attribués à une

oxydation de SeMet, l’oxydation de ce composé a été simulée.

L’oxydation a été réalisée par l’action d’eau oxygénée sur l’étalon de 76SeMet. L’étalon marqué a

été choisi pour éviter toute confusion des produits de l’oxydation avec une éventuelle

contamination pendant le temps de réaction. 25 mL de solution à une fraction de masse de 40

µg(SeMet)·kg-1 est mis en présence de 5 mL d’eau oxygénée (30%), le mélange est laissé à

température ambiante pendant 72 h. Avant son analyse, l’échantillon oxydé a été dilué par 2 avec

la phase mobile pour limiter d’interférer la séparation par la présence d’eau oxygénée.

La Figure 38 présente les chromatogrammes de l’étalon 76SeMet avant et après oxydation.

142

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 1 2 3 4 5 6

temps, min

SeMetOx

m/z=76

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 1 2 3 4 5 6temps, min

Inte

nsité

, cps

SeMet SeMetOx

Figure 38 : Chromatogramme de 76SeMet oxydé sur la colonne d’échange d’anions ; a)

chromatogramme entier b) zoom

La comparaison des chromatogrammes obtenus avant et après l’oxydation sur 76SeMet montre

que le protocole se révèle quantitatif. Par contre l’analyse de l’étalon de 76SeMet, révèle que

l’échantillon avait naturellement commencé à s’oxyder : le composé au temps de rétention

d’environ 1.3 min correspond à un produit issu de la réaction menée sur 76SeMet. Les conditions

de stockage, 6 mois à 4 °C et à une fraction de mas se de 40 µg(SeMet)·kg-1 ne sont pas optimaux

pour assurer la stabilité de l’étalon. L’oxydation de SeMet mène à la formation de trois espèces

séléniées. Il est à noter aussi la faible intensité des trois pics en comparaison avec celui de SeMet,

bien qu’il y ait un facteur de dilution de 2 entre SeMet et ses produits d’oxydation. Ce résultat a

déjà été observé et expliqué par Gammelgaard et al. 2003 qui ont proposé un schéma réactionnel

(Figure 39).

b)

a)

143

COOHNHCHCHSeCHCH )( 2223

COOHNHCHCHCHOSeCH )()( 2223

COOHOHCHCHCHOSeCH )()( 223

SeOOHCH3 33SeSeCHCH+

COOHNHCHCHSeCHCH )( 2223

COOHNHCHCHCHOSeCH )()( 2223

COOHOHCHCHCHOSeCH )()( 223

SeOOHCH3 33SeSeCHCH+

Figure 39 : Schéma réactionnel de l'oxydation de Se Met d’après Gammelgaard et al. (2003)

Il y est montré que l’oxydation de SeMet conduit à la formation de quatre produits dont le diméthyl-

disélénide qui se volatilise. Ceci expliquerait les trois pics observés dans cette étude plus la

diminution d’intensité des pics par la volatilisation de deux atomes de Se avec le diméthyl-

disélénide.

La Figure 40 montre les chromatogrammes de 76SeMet oxydée et de l’extrait avec le protocole B

du SELM-1.

m/z=76

0

25000

50000

75000

0 1 2 3 4 5 6

Inte

nsité

, cp

s

SeMetOx Selm-1 (Protocole B)

0

2000

4000

6000

8000

0 1 2 3 4 5 6

temps, min

Figure 40 : Comparaison de l'oxydation de 76SeMet avec l'extrait du protocole B du SELM-1 (tail le

normale et avec un zoom) ; chromatogrammes obtenus sur la colonne d’échange d’anions

Parmi les deux composés obervés sur l’échantillon de SELM-1, seul le premier à 1.3 min peut

correspondre à un des composés de la dégradation de SeMet. Au vu de la faible intensité du pic, il

144

est difficile d’être affirmatif. La présence éventuelle d’une oxydation de SeMet dans l’extrait de

levure pose la question de savoir si celle-ci est apparue au cours du traitement de l’échantillon ou

s’il s’agit d’espèces présentes au sein de l’échantillon. Néanmoins, la mesure de SeMet ne devrait

pas être affectée à condition que son oxydation intervienne après l’équilibre avec l’étalon marqué.

1.2.4 Mise en place du protocole métrologique

Suite à l’optimisation de l’extraction et de la séparation des espèces de sélénium, les échantillons

ont été caractérisés pour leur fractions de masse en sélénium total et en SeMet.

1.2.4.1 Détermination du taux d’humidité

La première étape a été la détermination de la teneur en humidité de l’échantillon.

La procédure consiste à sécher trois prises d’essai d’environ 200 mg (pesées précisément) à 100

± 5 °C (température contrôlée à l’aide d’une sonde de température dûment étalonnée) jusqu’à

l’obtention d’une masse constante (∆m < 1 mg). Entre la sortie de l’étuve et le relevé de la masse,

les échantillons ont été ramenés à température ambiante dans un dessiccateur pendant 30 min.

Les valeurs déterminées sont de 4.6% (s de 0.2%) pour le SELM-1 et de 3.6% (s de 0.2%) pour la

CCQM-P86.

1.2.4.2 Analyse du sélénium total

1.2.4.2.1 Procédure de préparation des échantillons

Les étapes préliminaires à la DI visant à la semi-quantification de l’échantillon ont permis

également de repérer d’éventuels interférents par le calcul des écarts normalisés (EN). Le Tableau

22 récapitule les EN déterminés.

Tableau 22 : Ecarts normalisés sur les rapports iso topiques utilisés pour la DI du sélénium total

EN sur les différents rapports

Echantillons 78/82 80/78

SELM-1 1.08 -

CCQM-P86 4.32 0.23

Concernant le SELM-1, le rapport 78/82 n’est pas interféré et a donc été utilisé pour mener la DI.

L’échantillon CCQM-P86 par contre montre la présence d’une interférence sur l’isotope 82Se,

probablement due à sa matrice plus complexe comprenant entre autres des excipients. Le rapport

80/78 libre de toute interférence a été utilisé pour cet échantillon.

Pour l’échantillon de SELM-1, les calculs ont montré que pour atteindre un rapport proche de

l’unité, il fallait introduire une masse d’étalon marqué trop importante (3 g à une fraction de masse

145

proche de 10 mg·kg-1) et des effets de dilution risquaient de diminuer l’efficacité de la

minéralisation. Il a donc été choisi de prendre un rapport égal à 2 avec une prise d’essai de 100

mg de levure pour n’introduire que 600 mg de l’étalon marqué en 82Se. Le mélange échantillon

plus étalon marqué a été minéralisé selon le protocole déjà détaillé (Chapitre III, paragraphe 1.1).

Pour la préparation des DI Inverses, deux solutions de sélénium ont été préparées à partir d’une

minéralisation de Se élémentaire. Elles ont servi d’étalons primaires de haute pureté pour

caractériser la concentration de l’étalon marqué. De la poudre de Se(0) (50 mg) a été placée dans

un tube en présence de 2 mL d’eau et de 3 mL d’acide nitrique concentré. Le tout a été porté en

température (80 °C) jusqu’à dissolution totale du s élénium puis complété jusqu’à 50 mL pour

obtenir une fraction de masse de 1 g·kg-1. Depuis chaque solution primaire, deux DI inverses ont

été préparées avec la même quantité d’étalon marqué que pour les DI Directes.

Pour l’échantillon de la CCQM-P86, la prise d’essai a été de 100 mg de comprimé broyé. 1 g de

l’étalon marqué en 78Se (à 10 mg·kg-1) a été rajouté pour mener à un rapport de un. Ce mélange a

été par la suite minéralisé comme précédemment, seulement un ajout de 200 µL d’acide

fluorhydrique dans les réactifs a été opéré afin d’améliorer la digestion (la présence d’excipients

rend plus difficile l’attaque de l’échantillon). Les DI Inverses ont été préparées de la même manière

que pour le SELM-1 mais avec la quantité de l’étalon marqué utilisée pour les DI Directes.

1.2.4.2.2 Résultats de la DI avec son incertitude

Les résultats sur le dosage du sélénium total sont rassemblés dans le Tableau 23.

Tableau 23 : Résultats de la DI en sélénium total s ur les deux échantillons de levures, l'incertitude

est fournie avec un coefficient d'élargissement (k) égal à deux

Echantillon [Se] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1

SELM-1 2090 ± 110 2059 ± 64

CCQM-P86 347 ± 19 337.6 ; s=9.7 (n=13) *

*valeurs de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type sur les n mesures (Goenaga 2008)

Les résultats sur les deux échantillons sont compatibles avec leur valeur de référence (EN<2). Ils

ont donc permis de valider la méthode utilisée pour deux gammes de concentrations et surtout de

démontrer sa robustesse sur les différentes matrices envisageables pour les compléments

alimentaires (levure lyophilisée seule ou enrobée d’excipients).

Grâce au calcul des incertitudes par la méthode analytique du GUM (dont la démarche est

détaillée dans le chapitre III-5), la part de chaque facteur a pu être calculée. La Figure 41 donne le

pourcentage de la participation des plus influents sur le résultat final pour les deux échantillons.

146

0 5 10 15 20 25 30 35

masse du godet plus l'échantillon

masse du godet vide

répétabilité de la méthode pour Cech

répétabilité pour la mesure du rapport inverse

répétabilité pour la mesure du rapport direct

masse du tube plus étalon

masse du tube vide

effet sur l'incertitude finale (%)

Selm-1 CCQM-P86

Figure 41 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination du sélénium total par DI

Les paramètres les plus influents sont les mêmes pour les deux échantillons. La plus grande part

de l’incertitude provient des masses des prises d’essais (> 50%). Ceci s’explique par le mode

opératoire consistant à peser la prise d’essai (de l’ordre de 100 mg) dans un godet de

minéralisation (d’une masse de 160 g) ce qui a pour effet de générer une forte incertitude sur la

prise d’essai.

Les autres paramètres influents sont la répétabilité de la méthode sur la détermination de la

concentration de la CCQM-P86 et la répétabilité de la mesure faite sur le rapport inverse pour le

Selm-1. Cette différence s’explique par le fait que certains paramètres (comme la répétabilité de la

mesure d’un rapport isotopique) sont dépendants de la concentration dans l’échantillon ; leur poids

relatif dans la participation à l’incertitude finale devient donc important comparé à ceux issus de

paramètres ne dépendant pas de la concentration de l’échantillon (comme la répétabilité de la

mesure de Cech).

La détermination des paramètres influents permet de se rendre compte des faiblesses pouvant

survenir dans un protocole analytique. En conséquence, l’amélioration des qualités métrologiques

de celui ci peut être envisagée. Dans ce cas présent, il sera possible d’améliorer la mesure de la

prise d’essais, de sorte qu’elle ne soit plus dépendante de la masse du godet de minéralisation ce

qui conduira à obtenir un résultat final avec une plus faible incertitude.

1.2.4.3 Analyse de spéciation

1.2.4.3.1 Préparation de la dilution isotopique

La première étape a été de s’assurer que suite aux corrections apportées aux intensités, il n’y avait

pas d’interférences résiduelles gênant la mesure du rapport isotopique choisi, 78/76. L’écart

147

normalisé a donc été calculé pour chaque échantillon (SELM-1 et CCQM-P86), et pour l’analyse

en spéciation ou en sélénium total (Tableau 24).

Tableau 24 : Ecart Normalisé pour le dosage avec l’ étalon marqué en 76SeMet

EN sur 78/76

Echantillon Analyse en total Analyse de spéciation

SELM-1 0.22 0.12

CCQM-P86 0.86 0.45

De l’étude des EN, il est ressorti qu’aucune interférence n’est détectée. Le rapport 78/76 a donc pu

être suivi pour réaliser la DI en mode total et en spéciation pour les deux échantillons. L’analyse

des surnageants en sélénium total (après leur minéralisation) a permis d’établir les rendements

d’extractions. La présence de l’étalon marqué 76SeMet a servi aussi bien à la DI en spéciation qu’à

la DI en mode total.

La seconde étape a été la caractérisation de l’isotopie de l’étalon marqué de sélénométhionine

(76SeMet) par son analyse avec le couplage HPLC-ICP-MS. Le couplage a été utilisé pour éviter

que la présence d’autres espèces ou de contaminations n’entâche la détermination d’erreurs. Les

résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau 25.

Tableau 25 : Abondances déterminées de l’étalon mar qué en 76SeMet

Isotopes Abondance (%) Incertitude, k=2 (%)

74 0.14 0.06

76 99.44 0.23

77 0.21 0.22

78 0.08 0.02

80 0.11 0.07

82 0.02 0.03

Comme attendu, l’isotope majoritaire est celui de masse 76. En dehors de cet isotope, il est à

noter que les incertitudes sur chaque abondance sont particulièrement élevées (de 25 à 150% de

la valeur). Ceci est dû à la méthode et l’appareillage utilisés pour déterminer ces différentes

abondances. L’ICP-MS de type quadripolaire n’est pas la détection la plus adaptée pour ce type de

détermination de par son manque de résolution en masse (proche des 200). Malgré tout, le

résultat final ne devrait pas être influencé par ce manque de fidélité dans les résultats : en effet,

seule l’isotope 76 devrait avoir une influence sur l’incertitude du résultat final et son incertitude est

relativement faible (0.2 %).

148

Pour préparer les DI directes, les prises d’essai des échantillons ont été de 100 mg. 500 mg

d’étalon marqué 76SeMet à 20 mg(SeMet)·kg-1 pour le SELM-1 et 390 mg pour la CCQM-P86 ont

été ajoutés aux échantillons afin d’obtenir des rapports isotopiques (78Se/76Se) de 2 et 1

respectivement. Après l’ajout de l’étalon marqué, le mélange a été agité pendant une minute avant

le début de l’extraction.

Les DI inverses ont été préparées pour chaque échantillon et avec les mêmes quantités d’étalon

marqué. Les solutions d’étalon utilisées pour caractériser l’étalon marqué sont préparées pour

chaque échantillon à partir de l’étalon commercial de SeMet d’abondance naturelle.

1.2.4.3.2 Efficacité des protocoles d’extraction en sélénium total

La comparaison de l’efficacité sur les deux échantillons et pour les deux protocoles d’extraction a

été faite grâce au calcul du rendement en sélénium total. Pour cela, le rapport de la quantité de

sélénium présente dans le surnageant sur la quantité disponible dans la totalité de l’échantillon

avant extraction a été calculé.

Les résultats sont regroupés dans le Tableau 26.

Tableau 26 : Rendements d'extractions des deux prot ocoles sur les deux échantillons associés à

leur incertitude (k=2)

Echantillon Protocole

d’extraction

Efficacité

d’extraction (%)

A 87 ± 3 SELM-1

B 99 ± 3

A 93 ± 5 CCQM-P86

B 91 ± 4

Les résultats ont confirmé que le protocole B conduit à l’extraction quantitative du sélénium depuis

une levure séléniée conditionnée sous forme de poudre lyophilisée (SELM-1) ; les premiers tests

effectués l’avaient démontré sur une levure non certifiée (LevTest). Cependant, le dosage

s’effectuant en DI où la mesure n’est pas une quantité de matière mais celle d’un rapport

isotopique, ce résultat n’est pas une preuve sur l’efficacité d’extraction. Par contre, deux

hypothèses peuvent être émises pour expliquer ce résultat : i) l’équilibre entre l’étalon marqué et la

totalité des espèces de Se est atteint, ou ii) l’extraction est quantitative. Comme il est difficile

d’imaginer un équilibre total entre l’étalon marqué de 76SeMet et les différentes espèces de

sélénium présentes dans l’échantillon, ce résultat ne peut être obtenu que par l’extraction

quantitative du sélénium total.

L’obtention d’un tel résultat apporte plusieurs avantages : une plus grande crédibilité à l’analyse

peut être accordée au résultat final, il ne peut pas être suspecté de la présence significative de

149

SeMet dans le résidu solide. De plus, dans le cadre d’une dilution isotopique, il n’est pas

nécessaire de démontrer que l’équilibre entre l’étalon marqué et l’échantillon ait été atteint avant

l’extraction : la quantitativité assure que tout l’étalon marqué plus l’analyte issu de l’échantillon vont

se retrouver en solution. Elle permet également une meilleure traçabilité des analyses. En effet,

cette étape est souvent considérée comme une rupture de la chaîne de traçabilité du fait du

manque d’information et d’efficacité du rendement (Rivier 2007). La démonstration d’une étape

quantitative permet de relier les échantillons aux processus de mesure réalisés par le système

HPLC-ICP-MS sans rupture de la chaîne de traçabilité.

Sur le complément alimentaire CCQM-P86, le protocole B n’a pas permis d’atteindre une

extraction quantitative. La même efficacité a été observée quel que soit le mode opératoire. Une

explication peut être trouvée par la formulation sous laquelle se présente l’échantillon. En effet, il

s’agit d’une levure séléniée enrobée par des excipients. La présence de cette matrice peut avoir

diminué l’efficacité des agents d’extraction sur la levure avec, par exemple, un effet de dilution.

1.2.4.3.3 Détermination de la sélénométhionine

Suite à l’évaluation de l’efficacité des protocoles sur la mise en solution du sélénium total,

l’efficacité des protocoles A et B sur le respect de l’intégrité des espèces a été étudiée.

La Figure 42 représente les chromatogrammes des extraits obtenus à partir de chaque échantillon

pour les isotopes 78 et 76.

SELM-1 (protocole A)

0

10000

20000

30000

40000

m/z=76 m/z=78

SELM-1 (protocole B)

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 1 2 3 4 5 6

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

CCQM-P86 (protocole A)

0

10000

20000

CCQM-P86 (protocole B)

0

10000

20000

30000

40000

0 1 2 3 4 5 6t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

Figure 42 : Chromatogrammes des extraits de levures sur la colonne d’échange d’anions

150

Ces chromatogrammes confirment la présence de SeMet dans les extraits des deux échantillons

avec les protocoles A et B.

Les résultats obtenus sur le dosage de SeMet par DI sont regroupés dans le Tableau 27.

Tableau 27 : Résultats sur le dosage de la sélénomé thionine par DI associés à leur incertitude (k=2)


d’extraction

Analyse de spéciation

(mg(SeMet)·kg-1)

Valeur certifiée

(mg(SeMet)·kg-1)

A 3330 ± 210 SELM-1

B 3340 ± 290 3389 ± 173

A 580 ± 22 CCQM-P86

B 571 ± 17

562; S= 44 *

(n=11)

*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (Goenaga 2008)

Les résultats sont en accord avec les valeurs certifiée ou consensuelle. La compatibilité entre les

valeurs de références pour les deux échantillons permet de valider les deux protocoles

expérimentaux pour la détermination de SeMet sur les deux gammes de concentrations.

Il est à noter qu’aucune différence significative d’efficacité n’est observée entre les deux

extractions : elles permettent toutes les deux d’atteindre la sélénométhionine contenue dans les

deux types d’échantillons.

Outre le fait que le protocole B peut s’avérer plus efficace pour l’extraction du sélénium dans sa

totalité, il permet également d’avoir un traitement de l’échantillon plus court avec deux étapes

d’incubation pendant une heure plutôt qu’une seule de 16 h. Bien que le temps de traitement de

l’échantillon ne soit pas le seul paramètre jouant sur la conservation de l’intégrité des espèces, le

fait de limiter son temps permet de réduire le risque d’oxydation des espèces. Par contre,

l’augmentation des extractions successives peut entraîner une dilution plus importante des

échantillons (dans le cadre d’analyse de levures séléniées, ce problème ne se pose pas au vu des

concentrations élevées en Se rencontrées).

L’annexe 4 représente un exemple d’un calcul de l’inceritude mené avec le logiciel Wincert.

Les incertitudes associées à la concentration du Selm-1 sont relativement plus importantes (7% en

moyenne) que celles pour la CCQM-P86 (3%). Comme déjà expliqué pour l’analyse du sélénium

total, l’influence de certains paramètres est proportionnelle à la concentration de l’échantillon et en

conséquence leur effet est majoré sur le résultat de l’incertitude finale pour le SELM-1 dont la

teneur en Se est la plus importante. Cette différence inter-échantillons est plus accentuée dans le

cadre de l’analyse de spéciation par rapport à l’analyse de Se total (où l’incertitude relative est de

5% pour chaque échantillon) à cause de la différence des protocoles d’analyse (par exemple les

151

tubes d’extraction de SeMet sont beaucoup plus légers que les godets utilisés pour minéraliser et

ont donc une incidence moindre sur l’incertitude finale).

La Figure 43 présente les contributions des facteurs les plus importants sur l’incertitude pour les

deux échantillons avec chaque protocole d’extraction.

0 10 20 30 40 50 60 70

abondance naturelle de l'isotope 76

répétabilité de la méthode pour Csp





Selm-1 (A) Selm-1 (B)

0 10 20 30 40 50 60 70

masse de l'échantillon humide

masse de l'échantillon sec






CCQM-P86 (A) CCQM-P86 (B)

Figure 43 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination de SeMet par DI

Pour le SELM-1, les facteurs les plus influents sont ceux proportionnels à la concentration de

l’échantillon, répétabilité des mesures et abondances isotopiques, étayant l’hypothèse expliquant

la différence des incertitudes relatives entre échantillons. Dans le cas de l’échantillon de la CCQM-

P86, ces paramètres ont également une influence non négligeable. D’autres paramètres

interviennent dans l’incertitude finale comme les masses liées à la détermination du taux

d’humidité. Un autre paramètre influent pour les deux échantillons est la répétabilité de la méthode

pour déterminer leur concentration. Ce terme permet de prendre en compte des paramètres dont

les effets ne peuvent être mesurés ou modélisés pour figurer directement sur le modèle

mathématique représentant le mesurande. Plus particulièrement, sa participation permet

d’introduire la variabilité du traitement de l’échantillon dans l’incertitude finale. De ce fait, il peut

152

être supposé une meilleure répétabilité dans l’action du protocole B car sur les deux échantillons

sa participation sur l’incertitude finale est moins importante qu’avec le protocole A.

Le Tableau 28 récapitule les pourcentages de sélénium dosé et identifié pour les différentes

extractions.

Tableau 28 : Récapitulatif des pourcentage de sélén ium extrait et identifié pour chaque échantillon

par les protocoles A et B

Se total extrait SeMet extraite

Echantillon Setotal

mg(Se)·kg-1

Protocole

d’extraction mg(Se)·kg-1 % mg(Se)·kg-1 % sur Se

extrait

% sur Se

total

A 1815 87 1341 74 64 SELM-1 2090

B 2080 99 1345 65 64

A 322 93 234 73 67 CCQM-P86 347

B 317 91 230 73 66

Il est à noter que le pourcentage de SeMet sur chaque échantillon équivaut à 65% du sélénium

total. Cette concentration en SeMet représente aussi de 65 à 75% du sélénium extrait mais

souligne surtout le fait qu’une fraction de Se extrait n’est pas identifiée lors de l’analyse.

1.2.4.3.4 Etude de l’étalon de SeMet d’abondance na turelle

Le protocole d’analyse a reposé sur la caractérisation de la fraction de masse en SeMet des

échantillons en référence à un étalon de SeMet commerciale dont la pureté n’est pas certifiée mais

simplement contrôlée. L’analyse de l’étalon par le couplage HPLC-ICP-MS a permis de s’assurer

qu’une seule espèce de Se est présente, cependant cette analyse n’autorise pas de la non

présence d’autres composés (autres que des espèces séléniées).

Des tests ont donc été menés avec deux étalons provenant de différents fournisseurs (Sigma-

Aldrich et Acros Organics). Ainsi, la DI sur le SELM-1 avec le protocole A a été reproduite dans les

conditions présentées précédemment (paragraphe 1.2.4.3.1) et en utilisant l’étalon de chez Acros

pour caractériser l’étalon marqué dans les DI Inverses.

Le Tableau 29 récapitule les résultats obtenus pour les DI menées avec chaque étalon.

153

Tableau 29 : Résultats de la DI sur le SELM-1 en fo nction de l’étalon de SeMet,

incertitude fournie en prenant k=2

Etalon Analyse de spéciation

(mg(SeMet)·kg-1)

Certificat

(mg(SeMet)·kg-1)

Sigma-Aldrich 3330 ± 210

Acros Organics 3330 ± 350 3389 ± 173

Les deux résultats sont similaires et justes ; ils ne montrent donc pas d’incidence du choix de

l’étalon sur le résultat de la DI en SeMet. De plus, le mélange d’isomères de l’étalon n’affecte pas

non plus le résultat (mélange de D- et L-SeMet pour Sigma et une composition à 99 % de L-SeMet

pour Acros).

La seule différence provient de l’incertitude du résultat final qui a augmentée passant de 6 à 10%

de la valeur mesurée. Elle s’explique par la valeur de la répétabilité obtenue sur la mesure du

rapport inverse supérieure pour ce second échantillon. Le jour de l’analyse, l’ICP-MS était deux

fois moins sensible sur la détection de Se ce qui a dégradé la répétabilité des mesures. Comme il

s’agit du paramètre ayant le plus d’influence sur U(SeMet) (cf. Figure 43), son augmentation

augmente l’incertitude finale. Ce phénomène met en lumière l’importance d’avoir de fortes

intensités pour améliorer la fidélité du résultat.

1.2.5 Validation de la séparation sur la colonne d’ appariements d’ions

Dès la diponibilité de la colonne de phase inverse, le mécanisme d’appariements d’ions a pu être

testé sur des échantillons réels. Les extraits préparés en DI et déjà analysés sur la colonne

d’échanges d’anions sont de nouveau analysés sur cette nouvelle séparation. La phase mobile est

composée de 0.1% de TFA en présence de 2% de méthanol. Le volume d’injection est de 100 µL.

Les échantillons ont été conservés à 4 °C en présen ce de β-mercapto-éthanol pendant plusieurs

mois. Le but étant de valider la séparation des espèces pour l’analyse de SeMet.

La Figure 44 montre les chromatogrammes obtenus pour ces différents extraits.

154

CCQM-P86 (Protocole A)

0

10000

20000

30000

SELM-1 (Protocole A)

0

10000

20000

30000

76 78

CCQM-P86 (Protocole B)

0

10000

20000

0 1 2 3 4 5t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

SELM-1 (Protocole B)

0

10000

20000

30000

0 1 2 3 4 5t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

Figure 44 : Chromatogrammes des extraits de levures sur la colonne d’appariements d’ions

Sur tous les extraits, SeMet est le composé majoritairement présent. Seul le surnageant issu de

l’analyse du SELM-1 avec le protocole B ne permet pas d’analyse de par la présence

d’interférences. Sur les différents extraits, il est possible de voir d’autres espèces non négligeables

(contrairement à la séparation par échange d’anions). En particulier, une espèce de Se dont le

temps de rétention est de 2.8 min est présente sur les différents chromatogrammes. L’observation

de son isotopie sur les extraits de la CCQM-P86 (où l’étalon marqué fut ajouté tel que 78Se/76Se

soit égal à un) met en évidence que cette espèce n’est pas issue de la dégradation de SeMet. En

conséquence, il peut être supposé que cette espèce est issue de la dégradation d’autres

composés présent dans le surnageant ou qu’elle n’était pas séparée sur la colonne d’échange

d’anions.

L’analyse des DI Inverses conservées dans les mêmes conditions que les DI Directes ne montre

aucune évolution de SeMet par l’apparition de nouveaux pics.

Les différents extraits ont donc été de nouveau analysés pour déterminer la concentration en

SeMet par DI (Tableau 30).

155

Tableau 30 : Résultat sur la DI de SeMet après stoc kage des surnageants ;

IP-RP : colonne de phase inverse avec appariement d ’ions ; AX : colonne échange d’anions


d’extraction

Age du

surnageant

(mois)

Résultat avec

IP-RP

(mg(SeMet)·kg-1)

Résultat avec AX

(mg(SeMet)·kg-1)

Certificat

(mg(SeMet)·kg-1)

A 17 3260 ± 250 3330 ± 210 SELM-1

B 18 Non analysé 3340 ± 290 3389 ± 173

A 15 553 ± 21 580 ± 22 CCQM-P86

B 14 554 ± 20 571 ± 17

562; S= 44 *

(n=11)

*valeurs issues de l’intercomparaison, représentant la moyenne et l’écart-type (Goenaga 2008)

Les résultats obtenus avec la séparation par appariements d’ions sont compatibles avec les

concentrations de références. Il n’y a pas de différences significatives avec la première analyse

par la colonne d’échanges d’anions, bien que les trois nouvelles valeurs sont toutes inférieures aux

précédentes déterminations. L’utilisation de la séparation par appariement d’ions a donc pu être

considérée comme validée pour l’analyse de SeMet dans des extraits de levures pour les deux

gammes de concentrations.

Même si le stockage des surnageants pendant une période aussi longue ne peut être envisagé

pour espérer caractériser de manière la plus juste possible un échantillon, l’accord des résultats

obtenus entre le jour de leur extraction et leur seconde analyse montre que la dilution isotopique

est une méthode robuste de quantification.

Les incertitudes des nouveaux résultats ont été calculées de la même manière que lors de la

première analyse avec la séparation par échange d’anions et montre les mêmes facteurs

prédominants que ceux précédemment pointés (paragraphe 1.2.4.3.3).

156

2 Analyses des farines de blé

Pour la participation à l’intercomparaison CCQM-K60, le LNE a reçu un échantillon de farine de blé

à analyser pour déterminer ses fractions de masse en sélénium total et en sélénométhionine. Cet

échantillon, hormis le fait qu’il s’agit d’une nouvelle matrice, a représenté, dans le présent travail,

un défi analytique de par la faible fraction de masse annoncée (de l’ordre de 10 µg·kg-1). Avant

d’appliquer la méthode de référence développée pour les levures sur ce nouvel échantillon, des

tests ont été effectués sur une farine commerciale afin d’identifier les points sensibles liés à

l’analyse d’une telle matrice. Cette farine de blé (dénomination commerciale : Kamut) a été

acquise auprès d’un magasin proposant des produits de l’agriculture biologique. Il s’agit d’une

farine produite en Amérique du Nord et distribuée par La Vie Claire (France). Le choix s’est porté

sur cet échantillon en espérant obtenir une farine suffisamment riche en sélénium de par sa

provenance : l’Amérique du Nord pouvant offrir des sols sélénifères, les concentrations en Se des

blés cultivés dans ces régions sont souvent plus élevées qu’en Europe (Hawkesford 2007).

2.1 Farine de Kamut

2.1.1 Détermination du sélénium total

La première étape a été de déterminer la concentration en sélénium total. 200 mg d’échantillons

ont donc été minéralisés suivant le protocole déjà détaillé (Chapitre III paragraphe 1.1).

Le dosage a été effectué en étalonnage externe et en ajouts dosés sur trois réplicats (Tableau 31).

Les résultats ont été corrigés de l’humidité de l’échantillon (10.25% ; s = 0.09%).

Tableau 31 : Analyse de la fraction de masse en sél énium total de la levure de Kamut ;

Dosage par étalonnage externe et ajouts dosés

Etalonnage externe

(mg·kg-1)

Ajouts dosés

(mg·kg-1) Isotope

moyenne s (n=3) moyenne s (n=3)

76 0.36 0.07 1.51 0.13

78 0.33 0.06 1.39 0.19

80 0.48 0.08 1.50 0.14

82 1.06 0.65 2.27 0.32

Moyenne des isotopes 0.56 0.42 1.67 0.41

Moyenne des isotopes (82 exclu) 0.39 0.09 1.47 0.15

157

La différence de résultats entre l’étalonnage externe et les ajouts dosés montre la présence d’un

important effet de matrice ; probablement lié à la quantité de carbone organique dissous dans la

solution suite à la minéralisation. De plus, une grande variabilité a été observée entre les isotopes

étudiés. En particulier, 82Se est fortement interféré. La variabilité observée entre chaque isotope

démontre également le manque d’homogénéité de l’échantillon pour une prise d’essai de 200 mg.

Pour tenter de s’affranchir des interférents liés à la matrice, il a été décidé d’analyser les

minéralisats après leur dilution par couplage HPLC-ICP-MS avec la colonne d’échange d’anions.

La minéralisation de l’échantillon doit permettre d’obtenir tout le sélénium sous une même espèce

inorganique qui devrait être séparée d’une partie des interférents de la matrice.

La concentration en sélénium total dans les minéralisats a été déterminée par ajouts dosés à partir

d’une solution préparée depuis la digestion de sélénium élémentaire et dont la fraction de masse

est connu par gravimétrie (protocole similaire à la préparation des solutions d’étalon primaires pour

l’utilisation en DI Inverse). Les résultats sont regroupés dans le Tableau 32.

Tableau 32 : Dosage des minéralisats de Kamut par a jouts dosés ; en utilisant la colonne d’échange

d’anions

Isotope Moyenne intra-isotopes

(mg·kg-1) Ecart-type

76 1.18 0.25

78 1.28 0.09

80 1.32 0.18

82 1.43 0.19

Moyenne inter-isotopes 1.30 0.18

Sur l’ensemble des isotopes et au vu des écarts-types associés, aucune différence significative

n’est observable. En particulier l’isotope 82 n’est plus interféré par la matrice. Il ressort donc que la

moyenne entre tous les isotopes peut être utilisée pour quantifier cet échantillon (1.30 mg·kg-1

avec 0.18 d’écart-type). La méthode employée visant à séparer l’analyte des interférents de la

matrice semble satisfaisante pour quantifier le sélénium total.

2.1.2 Détermination de la sélénométhionine

En raison de la faible concentration en sélénium total présente dans l’échantillon de Kamut, le

protocole d’extraction appliqué a été l’hydrolyse enzymatique répétée trois fois (protocole A). Le

protocole B s’effectuant en quatre étapes, il génère une plus grande dilution de l’échantillon.

La Figure 45 représente l’analyse de l’extrait par la colonne d’échange d’anions.

158

Kamut (Protocole A)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

0 5 10 15 20t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

75 76 80

Figure 45 : Chromatogramme de l'extrait de Kamut (P rotocole A) sur la colonne d’échange d'anions

Le chromatogramme obtenu montre clairement la présence d’interférence sur la masse 76 : le

profil du pic de SeMet est différent sur cette masse de celui des autres isotopes de Se suivis. Par

le suivi de la masse 75, il est observé un pic de forte intensité au même temps de rétention qui

expliquerait ce profil différent sur l’isotope 76 par son hydruration. Il est peu probable que ce soit

une espèce d’arsenic (75As), car lors de l’analyse du total une faible intensité (inférieure à 3000

cps) a été observée dans le spectre de masse des minéralisats. Sur la masse 80, SeMet se

retrouve le composé majoritaire et seule une seconde espèce sort vers 1.3 min.

Le dosage de la fraction de masse a été réalisé par étalonnage externe sur les masses 78 ; 80 et

82. Sur trois réplicats d’extraction, elle est estimée à 1.07 mg(Se)·kg-1 (s=0.04).

Ce même extrait a également été analysé par phase inverse avec le TFA comme agent

d’appariement d’ions (Figure 46).

159

Kamut (Protocole A)

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 1 2 3 4 5 6 7 8t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

76 80

Figure 46 : Chromatogramme de l'extrait de Kamut (P rotocole A) sur la colonne d'appariement d'ions

Avec cette seconde séparation, les interférents présents au temps de rétention de SeMet sur le

chromatogramme de l’échange d’anions se retrouvent en début du chromatogramme et aucune

interférence ne semble perturber la masse 76. Ce mécanisme de séparation (IP-RP) confirme la

présence du sélénium majoritairement sous forme de SeMet. Une seconde espèce est encore

observable sur le chromatogramme vers 3 min.

Le dosage des extraits a été réalisé par étalonnage externe. La fraction de masse est estimée à

0.93 mg(Se)·kg-1 (s=0.03 sur 3 réplicats). Les isotopes 76Se, 78Se, 80Se et 82Se ont pu être utilisés

pour la quantification et aucune différence significative n’a été détectée.

Une différence significative est observable entre les résultats obtenus sur les deux colonnes. Cela

peut provenir i) d’un effet de matrice plus important pour l’IP-RP marqué par le fait que le dosage

est effectué par étalonnage externe et qui engendre une sous estimation de SeMet ou ii) une co-

élution dans le cas de l’échange d’anions qui surestime SeMet. Le fait que SeMet soit déterminée

par au moins 3 isotopes de Se limite la possibilité d’interférences isobariques qui elles aussi

surestimeraient SeMet.

Au final, l’analyse de cet échantillon de farine a permis de mettre en avant des difficultés sur la

détermination de sa fraction de masse totale par ICP-MS. L’analyse par couplage HPLC-ICP-MS a

révélé être une alternative pour limiter l’impact des interférents de la matrice sur le dosage.

L’utilisation du protocole A pour l’extraction de SeMet a montré qu’il était possible d’atteindre cette

espèce mais le résultat sur la mesure de sa fraction de masse a été dépendant de la séparation

utilisée. En chromatographie d’échange d’anions, des interférents ont été observés sur la masse

76 et au temps de rétention de SeMet, ce qui peut limiter l’utilisation de l’étalon marqué 76SeMet

pour quantifier la sélénométhionine. L’utilisation de la phase inverse a permis de réduire ces

interférents sur la détermination de SeMet.

160

Ces informations ont permis d’aborder l’intercomparaison en connaissant les points critiques pour

l’analyse d’une farine de blé.

2.2 Echantillon de farine de la CCQM-K60

Les protocoles développés pour l’analyse des levures ont été appliqués à ce nouvel échantillon ce

qui a permis d’étudier leur robustesse entre les différents types de matrices.

La mesure du sélénium total a été réalisée selon les méthodes similaires déjà présentées lors du

dosage des levures mais par une autre équipe du LNE. Cette étude n’a donc pas été intégrée aux

travaux de thèse et ne sera pas détaillée dans ce document. La valeur déterminée est de 17.33 ±

0.46 mg(Se)·kg-1 (k=2).

2.2.1 Travaux préliminaires à l’utilisation de la D I

L’étude de la concentration en SeMet de la CCQM-K60 a débuté par une analyse par étalonnage

externe et par ajouts dosés. Au vu de la faible concentration en SeMet de l’échantillon, le protocole

A a été préféré pour mener l’extraction (l’effet de dilution de l’échantillon est moindre par rapport

au protocole B). Une autre raison d’utiliser ce protocole est de limiter des effets matrices par une

mise en solution trop importante de molécules pouvant interférer sur la séparation ou la détection.

L’emploi du protocole B avec différents agents complémentaires augmente le nombre des

molécules extraites de toutes natures (en particulier la solubilisation des chaînes polypeptidiques

par le SDS) et comme l’échantillon possède une faible concentration en Se il ne peut être dilué

avant son analyse par couplage HPLC-ICP-MS pour limiter leur impact.

Au final, une prise d’essai d’environ 200 mg a été extraite par l’action répétée des enzymes

Protéase XIV et Lipase VII dans le Tris-HCl (30 mmol·L-1). Trois réplicats ont été réalisés pour

réaliser l’analyse de spéciation du sélénium.

2.2.1.1 Séparation par la colonne d’échange d’anion s

La Figure 47 représente le chromatogramme obtenu pour l’analyse de l’extrait de blé.

161

CCQM-K60 (Protocole A)

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 2 4 6 8t (min)

Inte

nsité

(cps

)

80 76

Figure 47 : Chromatogramme de l'extrait de blé sur la colonne d’échange d'anions

Le chromatogramme montre la présence de SeMet comme espèce majoritairement présente et la

présence d’au moins deux autres espèces aux temps de rétention (tR) de 1.3 et 7.8 min. Le

composé au tR de 1.3 min a déjà été identifié comme un produit de l’oxydation de la

sélénométhionine (paragraphe 1.2.3). Sur la masse 76, une interférence est visible cependant et

contrairement à l’analyse du Kamut, le profil de 76SeMet ne diffère pas de celui de 80SeMet ce qui

ne devrait pas perturber la mesure de cette isotope.

Les résultats des dosages par étalonnage externe et ajouts dosés des trois extraits sont de 30.13

mg(SeMet)·kg-1 (s=0.63) et de 22.6 mg(SeMet)·kg-1 (s=2). La différence entre les deux méthodes

de quantification montre un fort effet de matrice lié à l’échantillon. La valeur déterminée est

également supérieure à celle annoncée par les organisateurs (10 mg(SeMet)·kg-1). L’évaluation de

l’écart normalisé pour détecter des interférences sur le rapport 78Se/76Se montre qu’il n’est pas

interféré (EN=1.33).

2.2.1.2 Séparation par phase inverse avec apparieme nt d’ions

Les surnageants précédemment préparés ont également été analysés par chromatographie de

phase inverse avec le TFA comme agent d’appariement d’ions. La Figure 48 présente le

chromatogramme obtenu.

162

CCQM-K60 (Protocole A)

0

10000

20000

30000

40000

0 1 2 3 4 5 6t (min)

Inte

nsi

té (

cps)

80 76

Figure 48 : Chromatogramme de l'extrait de blé sur la colonne d’appariement d’ions

Avec cette séparation l’espèce majoritaire est SeMet et un second composé est également

détecté. Comme pour l’analyse de l’échantillon de Kamut, les interférents observés sur la masse

76 se retrouvent en début de chromatogramme.

Les dosages de SeMet dans les extraits sont de 17.90 mg(SeMet)·kg-1 (s=0.50) par étalonnage

externe et de 12.68 mg(SeMet)·kg-1 (s=0.80) pour les ajouts dosés. Avec ce mécanisme

également, un effet de matrice induit une différence de résultats entre les deux techniques de

dosage. La valeur déterminée par ajouts dosés est en accord avec l’indication de concentration

fournie par les organiseurs. La différence de résultats entre les deux séparations soulève

l’hypothèse d’une co-élution sur la colonne d’échange d’anions. En conséquence la technique

séparative qui a été utilisée pour mener la DI est la phase inverse avec le TFA comme agent

d’appariement des ions.

L’écart normalisé pour le rapport 78Se/76Se (égal à 0.07) confirme qu’il peut être utilisé en DI.

2.2.2 Mise en place du protocole métrologique

Pour atteindre un rapport de un entre les isotopes 78 et 76, 200 mg d’échantillons ont été mis en

présence de 180 mg de l’étalon marqué 76SeMet à 2 mg(SeMet)·kg-1. Quatre réplicats ont été

réalisés. De même que pour la DI Inverse préparés avec le même ajout de l’étalon marqué et avec

une quantité d’étalon telle que le rapport isotopique soit de un.

L’étude du chromatogramme de l’étalon marqué obtenu sur la colonne de phase inverse et le TFA

comme agent d’appariement d’ions montre la présence d’impuretés (Figure 49). Elle met surtout

en avant la nécessité de caractériser l’étalon marqué pour sa teneur en SeMet par DI Inverse et

qu’il ne faut pas se fier à la fraction de masse obtenue par gravimétrie lors de la dilution de la

poudre de l’étalon marqué. Il est à noter que sur la colonne d’échange d’anions, aucune impureté

n’avait pu être détectée sur cet étalon.

163

m/z=76

0

200000

400000

600000

800000

0 1 2 3 4 5 6

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 1 2 3 4 5 6

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

b)

a)

Figure 49 : Chromatogramme de 76SeMet sur la colonne d’appariements d’ions - a) chr omatogramme

entier ; b) zoom

2.2.2.1 Rendement d’extraction

La minéralisation des surnageants des échantillons de DI Directe et de DI Inverse a été réalisée

afin de déterminer la fraction de masse totale présente dans les extraits.

Le résultat obtenu est de 20% (s = 2%), soit un rendement assez faible. Pour confirmer ce résultat,

un bilan de matière a été réalisé par le dosage par étalonnage externe des culots de l’extraction

minéralisés. La fraction de masse associée est de 28 mg(Se)·kg-1 (s=6). Cette valeur représente

moins de 0.2% du sélénium contenu initialement dans l’échantillon, soit une extraction quantitative

du sélénium par le protocole A.

Pour expliquer les différentes valeurs de rendement déterminées, il est probable qu’une

interférence sur l’isotope 76 soit responsable de la diminution du contenu dans l’extrait de blé

minéralisé. D’autant plus qu’en analyse de spéciation, il avait été remarqué la présence

d’interférents sur cette masse (Figure 48).

En conséquence, seul le résultat sur l’analyse des culots a été pris en considération et le

rendement de l’extraction est considéré quantitatif.

164

2.2.2.2 Dosage de SeMet

L’analyse des extraits de la farine de blé a été menée avec le mécanisme de phase inverse et

appariement des ions en présence de TFA.

Le résultat de la DI pour SeMet est de 28.16 mg(SeMet)·kg-1 (s de 0.65) avec une mesure du

rapport 78Se/76Se proche de 1.5. Cette fraction de masse est bien supérieure à celles déterminées

précédemment avec cette même séparation. Elle se situe plus dans l’ordre de grandeur des

fractions de masses définies avec la colonne d’échange d’anions. Cette détermination a mis en

avant la possibilité de co-élution avec le mécanisme de phase inverse et l’utilisation du TFA.

En conséquence, les extraits ont été analysés qualitativement avec une phase mobile composée

soit de PFPA, soit de HFBA comme agents d’appariement dans le but de s’assurer qu’aucune co-

élution n’était présente. La Figure 50 montre les chromatogrammes obtenus pour les extraits seuls

et avec un ajout de l’étalon de SeMet.

m/z=78 avec PFPA

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 2 4 6 8 10 12 14t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

DI Directe DI Directe plus SeMet SeMet

m/z=78 avec HFBA

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 5 10 15 20 25 30

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

DI Directe DI Directe ajout deSeMet SeMet

Figure 50 : Chromatogrammes des DI directes avec di fférents appariements d’ions

L’analyse des extraits de DI directes avec différents agents d’appariements d’ions au pouvoir de

séparation plus importants que le TFA ne met pas en évidence la présence de composés

supplémentaires. Seuls les temps de rétention sont augmentés et avec l’utilisation du PFPA un

dédoublement de pic pour la SeMet dans l’extrait est observé. Ce dédoublement pourrait

s’expliquer par le pH de la phase mobile : en effet autour d’un pH de 2.2 SeMet se retrouve sous

deux charges différentes (cf. Figure 16) et celles ci peuvent être séparées grâce à l’augmentation

de la chaîne perfluorée des agents d’appariements d’ions.

L’hypothèse de co-élution d’autres composés avec SeMet n’étant pas vérifiée, la première

estimation par ajouts dosés de la fraction de masse en SeMet a donc été remise en question. Une

165

analyse de la farine de blé par DI a donc été répétée avec comme estimation de sa fraction de

masse celle obtenue par la première DI (28.16 mg(SeMet)·kg-1).

Un rapport de 1.2 a été choisi pour cette nouvelle DI, ce qui demande l’addition de 210 mg d’étalon

marqué d’une fraction de masse de 3 mg(SeMet)·kg-1 à 200 mg de prise d’essai.

Les extraits ont été analysés par les deux mécanismes de rétention.

La Figure 51 représente le chromatogramme obtenu sur la colonne d’échange d’anions.

DI directe

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

0 1 2 3 4 5 6

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

76 78 80

Figure 51 : Chromatogramme de la DI Directe sur la CCQM-K60 sur la colonne d’échange d'anions

L’extrait de la DI directe met en évidence, sur la masse 80, un épaulement du pic de SeMet par

l’élution d’un composé sortant juste avant la sélénométhionine. De plus, le résultat de la DI menée

avec cette séparation est de 41 mg(SeMet)·kg-1 (s=3). Ceci confirme donc la mauvaise séparation

de SeMet pour l’échantillon avec cette colonne chromatographique ; les extraits ont donc été

analysés sur la colonne de phase inverse. Le TFA a été utilisé comme agent d’appariement des

ions du fait qu’aucune co-élution n’a pu être mise en avant sur cette séparation.

L’analyse des DI avec le TFA a donné un résultat final pour la farine de blé de 27.49 ± 0.79

mg(SeMet)·kg-1 (k=2). Ce résultat est en accord avec la première valeur fournie par DI et a donc

été la valeur de SeMet fournie pour la participation à l’intercomparaison. L’incertitude sur le résultat

final représente moins de 3% de sa valeur.

La Figure 52 représente la part des facteurs les plus influents sur le calcul de l’incertitude.

166

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50





masse (tube + solution mère étalon)

masse (tube + solvant de dilution)

masse (tube + spike), DI Inverse

pureté de l'étalon


CCQM-K60

Figure 52 : Contribution des principaux paramètres sur la détermination de SeMet de CCQM-K60

Les paramètres déjà mis en avant comme les plus influents sur le calcul de l’incertitude pour les

échantillons de levures (répétabilité des mesures et répétabilité des méthodes) sont aussi ceux

avec les plus fortes contributions sur l’incertitude finale.

Il est à noter que la farine étudiée affiche une teneur relative en SeMet de 65% (comme pour les

levures analysées) ce qui est en contradiction avec la littérature. Wolf et Goldschmidt (2007) ont

montré dans la farine de blé une possible corrélation entre les fractions de masse total en

sélénium et en SeMet : sur plusieurs farines le pourcentage de SeMet avoisinait les 53% pour des

fraction de masses en Se total allant de 0.076 à 44 µg(Se)·kg-1.

2.2.2.3 Résultats de l’intercomparaison

Les résultats de l’intercomparaison sur le sélénium total (Figure 53) montrent l’accord du résultat

fourni par le LNE (participant n°12) avec le reste des laboratoires. Sur la figure, les résultats

marqués en vert proviennent des différents Instituts Nationaux de Métrologie et ceux marqués en

noir de laboratoires invités reconnus pour leur expertise dans le domaine de l’analyse de

spéciation de Se.

167

9

11

13

15

17

19

21

23

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22Ten

eur

en s

élén

ium

tota

l / m

g(S

e).k

g-1

Participants

9

11

13

15

17

19

21

23

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22Ten

eur

en s

élén

ium

tota

l / m

g(S

e).k

g-1

Participants

Figure 53 : Résultats de l’intercomparaison CCQM-K6 0 sur la mesure du sélénium total

Les résultats sur la mesure de SeMet sont regroupés dans la Figure 54.

15

20

25

30

35

40

45

18 2 16 6 10 12 17 19 13 14 15 3 1 22

Ten

eur

en s

élén

omét

hion

ine

/ mg(

Se

Met

).kg

-1

Participants

15

20

25

30

35

40

45

18 2 16 6 10 12 17 19 13 14 15 3 1 22

Ten

eur

en s

élén

omét

hion

ine

/ mg(

Se

Met

).kg

-1

Participants

Figure 54 : Résultats de l’intercomparaison CCQM-K6 0 sur la mesure de la sélénométhionine

Le résultat obtenu dans le cadre de ce travail par le LNE en partenariat avec le LCABIE (n°12) est

en accord avec les valeurs consensuelles issues des différents participants : 28.30 mg(SeMet)·kg-1

pour la moyenne, 28.28 pour la médiane et un écart-type de 1.03 sur les 14 résultats. Pour la

majorité des participants, la méthode d’extraction utilisée a reposé sur l’extraction enzymatique.

Seuls deux laboratoires (n°6 et 13) ont utilisé une méthode différente : l’hydrolyse acide en

présence d’acide méthane-sulfonique. Ces deux équipes (n°6 et 13) ont obtenu des résultats en

accord avec les valeurs consensuelles (moyenne et médiane). La limitation de ce genre d’exercice

provient du manque de diversité des méthodes utilisées pour mener l’extraction.

168

Il est à noter aussi les performances du dosage par dilution isotopique menée avec le couplage

d’une technique séparative à l’ICP-MS : l’ensemble des résultats (n° 6, 10, 12, 17, 13, et 14) sont

compris dans les bornes issues de l’analyse statistique des données.

L’accord de la valeur déterminée dans ce travail avec les valeurs consensuelles permet de valider

le protocole métrologique pour cette nouvelle matrice mais aussi d’augmenter les capacités de la

méthode développée sur des fractions de masse 20 fois inférieures à celles déjà analysées.

Suite à la réussite de la participation à cette intercomparaison, une reconnaissance des capacités

de mesure de SeMet pour cette gamme de fraction de masse dans ce type d’échantillons par le

LNE va pouvoir être déposée auprès du BIPM.

169

3 Conclusions sur l’analyse du sélénium

L’objectif principal de l’étude du sélénium était de disposer d’un protocole métrologique pour

déterminer sa spéciation dans des compléments alimentaires. Cette analyse a été focalisée sur la

détermination de l’espèce majoritaire contenue dans de tels échantillons : la sélénométhionine. La

mise en place du protocole métrologique demandait de réaliser plusieurs développements d’ordre

analytiques ou métrologiques sur les différentes étapes d’une telle analyse.

Les défis analytiques reposaient premièrement sur la nécessité de développer un protocole

d’extraction efficace de SeMet, puis de séparer cette espèce et de détecter au moins deux

isotopes libres de toutes interférences pour permettre l’utilisation de la dilution isotopique. La mise

en solution du sélénium a été réalisée par deux protocoles faisant appel à des extractions

séquentielles, principalement basées sur l’utilisation d’enzymes protéolytiques. Ces deux

protocoles se sont révélés être quantitatifs pour solubiliser SeMet et sur certains échantillons ils

ont également permis d’atteindre la totalité du sélénium. La limite de leur utilisation repose sur la

durée de l’extraction. Le traitement nécessite trois jours de manipulation pour mettre en œuvre les

différentes étapes de l’hydrolyse enzymatique ou l’action des différents réactifs. Au final, en

comptabilisant le temps passé à analyser les échantillons, une semaine entière est requise pour

réaliser l’analyse d’un échantillon. Une diminution des temps d’extraction, par l’utilisation des

micro-ondes ou du stick à ultrasons, est donc à envisager pour faciliter l’application de la méthode

mise au point au cours de ces travaux.

La séparation des espèces de Se a été réalisée par deux mécanismes chromatographiques

différents dans le but d’augmenter la robustesse de la détermination de SeMet. En effet, la co-

élution de composés dans le cadre de Se étant possible, l’utilisation de deux types de séparation

permet de limiter le risque d’erreur sur la mesure de SeMet. Ainsi, sur chaque colonne

chromatographique, SeMet a pu être analysée en moins de six minutes et de par leur

complémentarité les erreurs peuvent être limitées. Cependant, hormis pour SeMet, il a été difficile

d’observer d’autres espèces via ces séparations.

La détection a été réalisée par ICP-MS pour permettre la mise en oeuvre de la dilution isotopique.

L’intérêt d’une telle technique repose également sur sa sensibilité ce qui permet d’analyser des

échantillons de faible concentration. Par contre, son utilisation engendre de multiples biais qu’il est

nécessaire de corriger au niveau des intensités délivrées. De plus, ce détecteur est sensible à la

matrice introduite. Il a donc limité le choix de la composition des phases mobiles avec pour effet de

diminuer les capacités de séparation des systèmes chromatographiques.

L’approche métrologique a été abordée par la mise en place de la double dilution isotopique

permettant la caractérisation de l’étalon marqué et de l’échantillon. La méthode a pu être validée

par l’analyse de plusieurs échantillons de référence dont un disposant de références certifiées.

Trois matrices différentes ont pu être analysées : une levure lyophilisée, un complément

170

pharmaceutique composé d’une levure enrobée d’excipients et une farine de blé, démontrant la

robustesse du protocole développé. Ainsi la méthode a été validée sur trois gammes de fractions

de masse différentes en SeMet (de 10 à 2000 mg(Se)·kg-1). Le budget d’incertitude associé au

résultat peut également être vu en soi comme faisant partie intégrante de la validation de méthode

grâce à la démarche de mise en avant des facteurs influents sur le résultat final. Les incertitudes

associées ont d’ailleurs permis de caractériser les échantillons avec une fidélité relative comprise

entre 3 et 10% de la fraction de masse. Cette fidélité de mesure est fonction du contenu de

l’échantillon.

Sous les conditions utilisées, la dilution isotopique appliquée au sélénium (total et SeMet) est

reconnue comme une méthode primaire de mesure ce qui permet de prétendre à la traçabilité des

analyses. Le calcul complet de l’incertitude finale prend également part à la démonstration de la

traçabilité par la prise en compte et la caractérisation de l’influence de chaque paramètre sur le

résultat final. Des réserves peuvent cependant être émises sur la traçabilité de l’analyse de

spéciation du fait que la référence utilisée pour caractériser l’étalon marqué repose sur l’utilisation

d’un étalon commercial de SeMet dont les caractéristiques ne sont par certifiées. Même s’il a été

vérifié que cette caractérisation n’était pas dépendante de la provenance de l’étalon commercial, il

est nécessaire de disposer d’un étalon clairement certifié sur sa pureté et son isotopie pour

prétendre à une parfaite traçabilité.

Au final, il est donc retenu que la méthode est au point pour assurer la traçabilité d’une mesure

d’un échantillon sur sa fraction de masse en SeMet. Cependant, il a été vu que cette fraction de

masse ne représente que 65% du sélénium total pour les différents types d’échantillons, ce qui

signifie que 35% du sélénium n’est pas encore caractérisé. Des progrès doivent donc encore être

réalisés sur les autres espèces présentes dans ce type d’échantillons pour permettre de

pleinement évaluer l’impact d’un complément alimentaire sur la santé.

171

Chapitre V : Applications aux analyses de

spéciation du mercure

174

175

Un protocole métrologique pour l’analyse de spéciation du mercure, et en particulier du

méthylmercure, dans les produits de la pêche a été développé. Les applications ont été réalisées

sur deux types de matériaux de références certifiés : lyophilisés ou frais. Depuis peu de temps,

l’Institut National de Métrologie Américain (NIST : National Institut of Standards and Technology)

propose des CRMs frais conservés à - 80 °C. Ce nouv eau type de matériaux permet de mieux

représenter les échantillons traités par les laboratoires d’analyses (Davis 2007). Il est donc

essentiel de s’assurer que les protocoles mis en place permettent la caractérisation de tels

matériaux.

Les conditions chromatographiques utilisées pour l’analyse de spéciation du mercure ont été celles

précédemment établies (chapitre III paragraphe 3.2) : une phase mobile composée de L-Cys à 0.5

g·L-1 et L-Cys, HCl, H2O à 0.5 g·L-1 et un volume d’injection de 50 µL.

1 Analyses des Matériaux de Références Certifiés

lyophilisés

Plusieurs CRMs ont été utilisés pour valider le protocole métrologique sur la détermination du

méthylmercure, le Tableau 33 regroupe leurs caractéristiques.

Tableau 33 : Caractéristiques des CRMs lyophilisés

Méthylmercure

CRM Matrice Mercure total

(mg(Hg)·kg-1) (mg(Hg)·kg-1) % par rapport

au Hgtotal

BCR-464 Muscle de thon 5.24 ± 0.10 5.12 ± 0.16 97

BCR-463 Muscle de thon 2.85 ± 0.16 2.83 ± 0.15 99

Dolt-4 Foie de chien-de-mer 2.58 ± 0.22 1.33 ± 0.12 52

L’analyse de ces matériaux a permis l’étude de différentes matrices pour différentes gammes de

concentrations en présence de plusieurs proportions des espèces : les muscles de thons

contiennent une teneur en MeHg+ représentant plus de 95% du mercure total tandis que pour le

foie de chien-de-mer, MeHg+ n’est présent qu’à hauteur de 50%. Le mercure restant est attribué

au mercure inorganique.

La mise en place du protocole métrologique a demandé d’étudier au préalable i) la mise en

solution de Hg et ii) la séparation d’espèces issues d’une matrice réelle. Suite à ces

développements, le protocole analytique a pu être appliqué au dosage du mercure total et du

méthylmercure avec quantification par la dilution isotopique.

176

1.1 Traitement de l’échantillon

Le CRM BCR-463, de concentration intermédiaire en MeHg+, a été utilisé pour mener l’étude de

l’extraction du mercure depuis des produits de la mer.

Les mises en solution testées reposent sur le protocole développé par Hight et al. (2006) avec

l’emploi d’un réactif soufré. Ils préconisent l’utilisation de 50 mL d’un solvant composé de L-Cys,

HCl, H2O à 10 g·L-1 pour extraire 200 mg d’échantillon, le mélange est ensuite placé au bain-marie

pendant 120 min à 60 °C avec une agitation manuelle aux temps : 0, 60 et 120 min. Toutefois,

l’application directe de ce solvant d’extraction n’a pu être envisagée dans notre étude : une aussi

forte concentration en cystéine contamine l’échantillon en mercure inorganique comme le confirme

la Figure 55 obtenue suite à l’analyse chromatographique du mélange d’extraction en phase

inverse.

m/z=202

0

250

500

750

1000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

Hg2+

Figure 55 : Chromatogramme d'une solution à 10 g·L -1 de L-Cys, HCl, H 2O sur la colonne de phase

inverse

La quantification par étalonnage externe de cette contamination a révélé une fraction de masse de

l’ordre de 10 µg·kg-1 (s=1) de mercure inorganique au sein du réactif L-Cys, HCl, H2O. Cette

fraction de masse représente une contamination de l’ordre de 5 ng de mercure inorganique

apportée par le solvant d’extraction.

Afin de limiter la contamination des échantillons, des essais ont donc été menés en utilisant la

phase mobile, dix fois moins concentrée en cystéine et contenant 0.5 g·L-1 de L-Cys, HCl, H2O et

0.5 g·L-1 de L-Cys, comme solvant d’extraction. L’avantage a également été de disposer de

surnageants directement compatibles avec la séparation chromatographique.

177

En plus du protocole proposé par Hight et al. (2006), plusieurs modes d’assistance ont été testés

pour accélérer le temps de préparation des échantillons. Les essais ont porté sur l’extraction d’une

prise d’essai de 200 mg en présence de 40 mL de phase mobile avec suivant les cas :

- 120 min d’incubation au bain-marie à 60 °C avec a gitation magnétique,

- 15 min de bain à ultrasons (US) et agitation manuelle toutes les 15 min,

- 30 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min,

- 45 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min,

- 60 min de bain à US et agitation manuelle toutes les 15 min.

L’activation de l’extraction par un champ micro-ondes (MW) a également été testée. En raison de

la capacité des godets, les quantités de matières ont dû être réduites : 150 mg d’échantillon ont

été mis en présence de 20 mL de phase mobile. La puissance délivrée par le four micro-ondes

était de 70 W pendant 6 min, ces paramètres sont basés sur les travaux de Tseng et al. (1997)

qui activaient ainsi l’extraction par l’hydroxyde de tétraméthylammonium et obtenaient des

rendements d’extraction quantitatifs.

Pour juger de l’efficacité des protocoles d’extraction, la concentration en méthylmercure a été

déterminée, plutôt que la teneur totale en mercure, afin de s’assurer du respect de la spéciation

tout au long du protocole. A l’issue des mises en solution, les surnageants ont été dosés par

étalonnage externe. Cette valeur a été ramenée à la concentration initiale contenue dans la prise

d’essai et corrigée du taux d’humidité de l’échantillon (procédure détaillée dans le Chapitre IV,

paragraphe 1.2.4.1). Pour évaluer le rendement d’extraction du protocole, cette concentration a

été rapportée à la valeur de référence en MeHg+ fournie par le certificat.

La Figure 56 présente les résultats obtenus par les différents protocoles accompagnés de leur

écart-type (n=3).

178

0

20

40

60

80

100

2 hd'incubation à

80 °C

15 min US 30 min US 45 min US 60 min US 6 min à 70 WMW

% [MeHg+]extrait

Figure 56 : Efficacité d'extraction des protocoles testés

La modification du solvant d’extraction lors de l’utilisation du bain-marie (diminution de la teneur en

agent soufré) ne semble pas avoir d’effet sur l’extraction : ce protocole reste efficace pour atteindre

une mise en solution quantitative de MeHg+.

L’observation des résultats obtenus à partir de l’utilisation des ultrasons (US) montre que ce mode

opératoire ne permet pas une amélioration de la mise en solution, le rendement d’extraction

augmente avec le temps d’action mais pour n’atteindre qu’un maximum de 45% au bout d’une

heure de traitement. Cette technique n’étant pas concluante pour accélérer efficacement

l’extraction de l’échantillon, elle a été abandonnée pour la suite des tests.

L’action du champ micro-onde par contre est intéressante car avec seulement 6 min d’action à une

puissance de 70 W, un rendement de 70% est obtenu. Il a donc été choisi d’optimiser son action

avec des essais portant sur différents temps d’exposition (6 min et 11 min) et pour différentes

puissances d’ondes (70, 100, 140 et 210 W).

La Figure 57 présente les résultats obtenus accompagnés de leur écart-type (n=3).

179

0

20

40

60

80

100

70 W 100W 140 W 210 W

% [MeHg+] extrait

6 min 11min

Figure 57 : Efficacité d'extraction des protocoles utilisant les micro-ondes

De par la variabilité de certains résultats, il est délicat de comparer les efficacités d’extraction entre

les différents protocoles. Toutefois, le mode opératoire utilisant 140 W pendant 11 min mène à une

extraction quantitative du méthylmercure. Il a donc été sélectionné pour diminuer le temps de

traitement de l’échantillon. Ce protocole a été appliqué à 150 mg d’échantillon en présence de 20

mL de phase mobile. Il a été testé et comparé à l’incubation au bain-marie pendant 120 min (200

mg extrait par 40 mL de phase mobile) du CRM BCR-463.

L’application des deux protocoles sélectionnés à l’échantillon de BCR-463 permet de mettre en

solution du mercure inorganique et du méthylmercure, efficacement séparés par la colonne de

phase inverse (Figure 58).

180

m/z=202

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

Incubation MW

Hg2+

MeHg+

Figure 58 : Chromatogramme des espèces de mercure e xtraites depuis le BCR-463 par les deux

protocoles sélectionnés (Incubation au bain-marie o u micro-ondes : MW)

1.2 Mise en place des protocoles métrologiques

Les protocoles d’extraction de Hg étant sélectionnés, leur application sur des CRMs dans les

conditions d’une méthode primaire de mesure a permis de vérifier de leur validité. Les trois CRMs

lyophilisés ont été utilisés pour mener cette validation. La démarche a reposé sur i) la

détermination du taux d’humidité, ii) le dosage du mercure total et iii) la mesure de la fraction de

masse en méthylmercure.

Dans un premier temps, la dilution isotopique sur MeHg+ a été réalisée avec l’ajout d’un seul

étalon marqué (en Me200Hg+). Dans les échantillons pour lesquels les concentrations en mercure

inorganique sont faibles (BCR-463 et BCR-464), cette méthode a été satisfaisante au vu des

incertitudes de mesures : même si une forte méthylation de Hg2+ intervient l’augmentation du

signal de MeHg+ est comprise dans les valeurs du certificats (98% de Hg est sous forme de

MeHg+). Par contre pour les échantillons où les teneurs entre les deux espèces sont proches (le

Dolt-4 affiche 52% de Hg sous forme de MeHg+), l’évaluation des transformations des espèces,

par la DI avec deux étalons marqués (MeHg+ et Hg2+), est un plus pour améliorer la justesse de la

mesure du méthylmercure.

1.2.1 Détermination du taux d’humidité

La démarche utilisée pour la détermination des taux d’humidité repose sur celle employée pour les

échantillons de sélénium (procédure détaillée dans le Chapitre IV, paragraphe 1.2.4.1).

Le Tableau 34 présente les résultats obtenus sur trois réplicats.

181

Tableau 34 : Détermination des taux d'humidité des CRMs

CRM Moyenne (%) Ecart-type (s)

BCR-464 6.2 0.1

BCR-463 6.6 0.2

Dolt-4 6.9 0.3

1.2.2 Analyse en total

Les études préliminaires de la concentration en mercure dans les CRMs ont permis la sélection

d’un rapport isotopique (199Hg/202Hg) libre de toutes interférences (EN < 2) pour mener la DI.

L’étalon de Hg2+ marqué en isotope 202Hg (IRMM-640) a été utilisé pour caractériser les CRMs.

Après sa dilution à une fraction de masse de 0.09 mg·kg-1, des masses de 1 g (pour le BCR-463 et

le Dolt-4) ou de 2 g (pour le BCR-464) ont été introduites dans les prises d’essais des échantillons

afin de modifier le rapport isotopique naturelle (égal à 0.56) jusqu’à une valeur proche de 0.4. Les

mélanges ont par la suite été minéralisés sous champ micro-onde (procédure détaillée dans le

Chapitre III, paragraphe 1.1).

Les DI Inverses ont été préparées avec une quantité de 2 g de la même dilution de l’étalon

marqué. La caractérisation de l’étalon marqué a été effectuée à partir de 2 solutions

indépendantes obtenues par la dissolution de mercure métallique. Au total, trois réplicats de DI

directes et inverses ont été préparées pour la caractérisation des échantillons et de l’étalon

marqué.

L’étalon IRMM-639, d’abondances certifiées et proches des naturelles, a été analysé en continu le

temps des acquisitions pour la correction du biais de masse.

Les mesures des rapports isotopiques ont été réalisée avec la cellule de collision/réaction de l’ICP-

MS pressurisée par de l’hélium (à 4.5 mL·min-1) dans le but d’augmenter la sensibilité du

spectromètre de masse.

Les résultats obtenus accompagnés de leur incertitude sont présentés dans le Tableau 35.

Tableau 35 : Résultats en DI sur le mercure total, l'incertitude est fournie avec un coefficient

d'élargissement égal à deux

CRM [Hg] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1

BCR-464 5.20 ± 0.22 5.24 ± 0.10

BCR-463 2.807 ± 0.097 2.85 ± 0.16

Dolt-4 2.76 ± 0.17 2.58 ± 0.22

182

Selon le calcul de l’écart normalisé, aucune différence significative n’a été observée entre les

valeurs déterminées et les certificats des CRMs. Le protocole métrologique mis en place a donc

été validé pour l’analyse du mercure total dans ces deux types de matrices (muscles et foie de

poissons), pour les deux gammes de concentration et avec différentes répartitions des espèces

dans les échantillons.

Les incertitudes relatives sont du même ordre de grandeur pour l’ensemble des CRMs (entre 4 et

6%). Comme dans le cas du sélénium, la part de chaque facteur contribuant à l’incertitude finale a

été calculée (Figure 59).

0 10 20 30 40 50 60

masse (barquette + Hg)

masse (barquette vide)





abondance naturelle de l'isotope 199


BCR-464 BCR-463 Dolt-4

Figure 59 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du mercure total

Les facteurs les plus influents sur l’incertitude finale sont ceux déjà désignés lors de l’analyse du

sélénium : répétabilités associées aux mesures des rapports isotopiques et aux méthodes.

Lors du calcul des incertitudes pour le sélénium total, il avait été remarqué que le protocole utilisé

pour la pesée de la prise d’essai d’échantillon apportait une forte contribution à l’incertitude finale.

En conséquence, le protocole a été modifié pour limiter son impact en utilisant des barquettes de

faibles masses (de l’ordre de 5 g) plutôt que directement les godets de minéralisation (de masses

de 170 g). Ainsi, l’incidence de la masse associée à l’échantillon n’est plus visible comme un

paramètre important de l’incertitude et son impact est limité. Ceci met en évidence un intérêt du

calcul de l’incertitude par la méthode du GUM (ISO/IEC 1995) : la possibilité de diminuer la valeur

de l’incertitude de mesure en agissant sur les paramètres influents.

Les autres paramètres mis en évidence dans la Figure 59 sont les masses associées à la prise

d’essai du mercure métallique utilisé pour la caractérisation de l’étalon marqué (masses sur

lesquelles repose la quantification). Le dernier paramètre remarqué, seulement dans le cas du

BCR-464, est l’abondance isotopique naturelle de 199Hg. Dans le cadre de l’analyse de Se, il avait

été suggéré que pour certains paramètres, leur participation était fonction de la concentration de

183

l’échantillon comme les abondances isotopiques, ce qui peut expliquer une participation

prépondérante de l’isotopie de 199Hg pour l’échantillon de plus forte concentration : le BCR-464.

1.2.3 Analyse de spéciation

1.2.3.1 Préparation de la dilution isotopique

La première étape de la DI en spéciation a été la caractérisation de l’étalon marqué en

méthylmercure (Me200HgCl). Cet étalon est synthétisé par le fabricant (AIT Technologies) à partir

d’un étalon marqué de mercure inorganique (200HgO) en provenance du NIST et certifié pour son

isotopie. Au cours de la synthèse de MeHg+, des modifications sur son isotopie peuvent survenir. Il

est donc nécessaire de déterminer les abondances isotopiques. Le fabricant indique une isotopie

mesurée par ICP-MS, toutefois aucune traçabilité n’est associée aux mesures. Il a donc été décidé

de déterminer cette isotopie par le couplage HPLC-ICP-MS. L’étalon IRMM-639, certifié pour son

isotopie et se présentant sous la forme de mercure inorganique, a été utilisé pour la correction du

biais en masse. Le Tableau 36 présente les résultats obtenus pour la détermination de l’isotopie

de l’étalon comerciale de MeHg+.

Tableau 36 : Isotopie fournie et mesurée de l'étalo n marqué de méthylmercure (Me 200HgCl)

Isotopes Abondances fournies (%) Abondances déterminées (%)

196 0.0018 ± 0.0006 0.0035 ± 0.0090

198 0.1828 ± 0.0187 0.123 ± 0.027

199 1.1131 ± 0.0354 1.052 ± 0.086

200 96.0332 ± 0.1637 96.41 ± 0.22

201 1.5101 ± 0.0282 1.431 ± 0.057

202 1.0330 ± 0.0666 0.87 ± 0.11

204 0.1261 ± 0.0181 0.107 ± 0.047

Comme attendu, l’isotope 200 est majoritaire. Des différences significatives sont observables entre

les valeurs indiquées et déterminées. Elles peuvent être expliquées par les méthodes employées :

HPLC-ICP-MS qui ne prend en compte que l’isotopie de MeHg+, contre des mesures effectuées

directement par ICP-MS où la possiblité de contamination est plus importante. Les valeurs que

nous avons déterminées ont été utilisées dans la suite des travaux en raison de leur traçabilité

jusqu’à l’étalon de l’IRMM-639.

Des études préliminaires menées sur les CRMs pour les deux protocoles d’extraction ont montré

que le rapport 202Hg/200Hg ne souffrait d’aucune interférence (EN < 2). L’ajout d’étalon marqué a été

réalisé pour atteindre un rapport isotopique de 0.8 (à l’état naturel : 1.3).

184

La préparation des DI Directes s’est déroulée selon les étapes suivantes :

- prise d’essai de l’échantillon (150 mg pour le four micro-ondes MW et 200 mg pour l’incubation

au bain-marie),

- ajout de 10 mL de solvant d’extraction (composition similaire à la phase mobile),

- agitation manuelle pendant 10 s pour homogénéiser l’humidification de l’échantillon,

- ajout de l’étalon marqué (entre 0.4 et 1.3 g de solution, en fonction de la prise d’essai et de la

concentration de l’échantillon),

- agitation manuelle pendant 10 s,

- ajout de la quantité nécessaire de la solution d’extraction (10 mL pour MW et 20 mL pour

l’incubation).

Ce mode opératoire a été retenu afin d’assurer la meilleure homogénéisation possible entre

l’échantillon, l’étalon marqué et le solvant d’extraction. Il est à noter qu’un biais peut survenir avec

le début de l’extraction de l’échantillon avant l’ajout de l’étalon marqué. En raison du rendement

d’extraction total théorique des protocoles utilisés, l’influence de ce biais est limitée s’il est

considéré que durant l’intervalle de temps entre l’ajout de la solution d’extraction et l’ajout de

l’étalon marqué la spéciation de l’échantillon n’évolue pas.

Les DI inverses ont été préparées dans des conditions similaires aux DI directes (même quantité

d’étalon marqué et même rapport isotopique visé) à partir de deux solutions indépendantes de

chlorure de méthylmercure. L’isotopie de l’étalon naturel de MeHgCl a été vérifiée pour s’assurer

d’abondances naturelles en utilisant l’étalon IRMM-639 pour corriger le biais de masse.

Quatre réplicats ont été préparés pour chaque DI.

1.2.3.2 Dosage du méthylmercure

Les figures suivantes présentent les chromatogrammes obtenus en phase inverse pour les

différents extraits préparés en DI (Figure 60, Figure 61 et Figure 62).

185

BCR-463 MW

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)200 202

0

500

1000

1500

2000

0 1 2

BCR 463 Incubation

0

5000

10000

15000

20000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

0

500

1000

1500

2000

0 1 2

Figure 60 : Chromatogrammes des extraits de BCR-463 sur la colonne de phase inverse

BCR-464 MW

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 1 2 3 4

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

0

1000

2000

3000

4000

0 1 2

BCR 464 Incubation

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cps

)200 202

0

1000

2000

3000

4000

0 1 2

Figure 61 : Chromatogrammes des extraits de BCR-464 sur la colonne de phase inverse

Dolt-4 MW

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

0 1 2 3 4

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202 Dolt-4 Incubation

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

0 1 2 3 4t (m in)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

Figure 62 : Chromatogrammes des extraits de Dolt-4 sur la colonne de phase inverse

Pour les trois CRMs avec les deux protocoles d’extractions utilisés, seules deux espèces ont été

détectées et identifiées : le mercure inorganique et le méthylmercure. Ceci est en accord avec les

186

données issues de la littérature. Les deux matrices étudiées révèlent aussi des répartitions

différentes pour ces espèces : les muscles semblent accumuler préférentiellement MeHg+ tandis

que le foie possède des teneurs équivalentes entre les deux espèces.

Les résultats de la quantification par DI pour les différents CRMs et en fonction du protocole

d’extraction appliqué sont présentés dans le Tableau 37.

Tableau 37 : Résultats sur la détermination du méth ylmercure par DI associés à leur incertitude (k=2)

Analyse de spéciation (mg(Hg)·kg-1) CRM

Incubation Micro-ondes

Certificat

(mg(Hg)·kg-1)

BCR-463 3.07 ± 0.19 2.87 ± 0.19 2.83 ± 0.15

BCR-464 5.21 ± 0.27 5.12 ± 0.29 5.12 ± 0.16

Dolt-4 1.390 ± 0.067 1.434 ± 0.078 1.33 ± 0.12

Tous les résultats obtenus sont compatibles avec les valeurs certifiées (EN<2). Les deux

protocoles peuvent donc être considéré comme validés pour la détermination du méthylmercure

dans les produits de la mer pour ces gammes de concentrations.

Cependant, même si statistiquement les valeurs obtenues ne sont pas différentes des valeurs

certifiées, des biais de mesure peuvent être suspectés. En particulier, l’application de l’incubation

sur le BCR-463 montre une surestimation de la fraction de masse en méthylmercure. De par la

faible concentration de Hg2+ supposée dans cet échantillon, sa méthylation ne peut être

responsable d’une telle augmentation de la concentration en méthylmercure (Hg total est certifié à

2.85 ± 0.16 mg(Hg)·kg-1). Des explications peuvent être avancées à partir i) d’une éventuelle

contamination du surnageant, ii) d’un mauvais équilibre entre étalon marqué et analyte, iii) d’une

adsorption de l’étalon marqué ou iv) de taux de conversion (en Hg2+) différents pour l’étalon

marqué et l’analyte durant le protocole d’extraction. Une étude complémentaire a donc été menée

pour élucider la cause de cette surestimation (voir le paragraphe 1.2.3.3).

L’observation de la mesure effectuée sur le Dolt-4 par micro-ondes souligne également une

possible surestimation de la valeur contenue. Une source de cette surévaluation peut être trouvée

dans la méthylation de Hg2+ présent dans cet échantillon. Contrairement aux muscles de thons

(BCR) où Hg2+ est présent à une faible teneur, une faible méthylation dans le Dolt-4 peut perturber

la mesure de la quantité de méthylmercure. Pour s’assurer de la justesse de l’analyse, la dilution

isotopique sur le Dolt-4 a été réalisée en présence de deux étalons marqués (Hg2+ et MeHg+).

La détermination des incertitudes de mesures a été menée suivant les indications précédemment

exposées (Chapitre III paragraphe 5). Des incertitudes relatives comprises entre 5 et 7% ont été

187

déterminées ce qui associe une fidélité convenable aux méthodes développées. L’étude des

facteurs prépondérants a mis en avant les mêmes paramètres : répétabilité des mesures des

rapports isotopiques et des méthodes (Figure 63).

0 10 20 30 40 50 60

répétabilité de la méthodepour Cech

répétabilité de la méthodepour Csp

répétabilité pour la mesuredu rapport inverse

répétabilité pour la mesuredu rapport direct

effet sur l'incertitude finale pour l'incubation (% )


0 10 20 30 40 50 60 70





effet sur l'incertitude finale pour les micro-ondes (%)


Figure 63 : Contribution des principaux paramètres sur MeHg + pour chaque protocole d’extraction

Le dosage du méthylmercure a démontré que des biais peuvent être soulevés malgré une

validation et une traçabilité assurées des protocoles analytiques. Ceci démontre des limites de la

validation de méthodes par la simple analyse de CRMs. Pour son perfectionnement, il est essentiel

d’améliorer la justesse et surtout la fidélité des mesures effectuées et des valeurs certifiées car

des incertitudes trop importantes ne permettent pas de différencier des valeurs de résultats.

1.2.3.3 Etude de l’extraction de MeHg + par application de l’incubation sur le

BCR-463

Sur la base des résultats obtenus sur le BCR-463 extrait par incubation pendant 120 min, les

sources identifiées comme pouvant conduire à une surestimation de la concentration en

méthylmercure ont plus particulièrement été étudiées.

L’équilibre entre l’étalon marqué et l’échantillon a été étudié par une étape consistant à leur mise

en contact pendant 24h (sous agitation magnétique) en préambule de l’extraction (expérience 1).

188

Ce type d’ « équilibrage » est souvent réalisé lors du dopage de matériaux pour évaluer les

rendements d’extraction ou pour la mise en œuvre de la DI.

Pour éliminer la possibilité d’une éventuelle contamination durant la procédure, le protocole a été

répété dans les mêmes conditions que précédemment décrit au paragraphe 1.2.3.1 (expérience

2).

Les autres sources potentielles de biais identifiées sont soit l’adsorption de l’étalon marqué, soit sa

conversion spécifique en une autre espèce, conduisant à un comportement différent de celui de

l’analyte. L’adsorption sur le matériel employé (tube, barreau aimanté…) semble peu plausible au

regard des bons résultats obtenus sur les autres CRMs. Cependant cette possibilité a été étudiée

en même temps que l’éventualité d’une adsorption sur les particules du matériau. Ainsi, l’ajout de

l’étalon marqué a été réalisé après les deux heures d’incubation permettant d’extraire les espèces

du mercure (expérience 3). Cette expérience a permis de s’affranchir d’une éventuelle évolution de

l’étalon marqué durant l’incubation. Une dernière expérience a été envisagée afin d’éviter

l’adsorption de l’étalon marqué et son évolution spécifique, par son ajout réalisé en fin de

préparation des échantillons : après la filtration des surnageants et avant leur stockage pour

l’analyse (expérience 4).

Ces expérimentations ont été réalisées en simultanée avec quatre réplicats pour chacune d’entre

elles. La Figure 64 résume la démarche expérimentale utilisée.

Figure 64 : Démarche expérimentale pour l’identific ation du biais de mesure

189

La répétition de la DI dans les mêmes conditions (expérience 2) a conduit à une valeur de 3.07

mg(Hg)·kg-1 pour MeHg+, avec un écart-type (s) de 0.04. Une contamination durant le protocole

d’application de la DI est donc à exclure.

Avec un temps d’équilibre de 24h entre l’échantillon et l’étalon marqué en amont de l’extraction

(expérience 1), un résultat similaire a été obtenu : 3.04 mg(Hg)·kg-1, s = 0.04. L’équilibre n’est donc

pas atteint par cette étape préliminaire.

Les expériences 3 et 4 ont mené aux mêmes résultats de 2.83 mg(Hg)·kg-1, avec des écarts-types

de 0.12 pour l’ajout de l’étalon marqué juste après l’extraction (expérience 3) et de 0.04 pour l’ajout

après la filtration (expérience 4). L’obtention de cette justesse de résultats confirme i) qu’aucune

adsorption de méthylmercure n’est observable et ii) que la différence de comportement de l’étalon

marqué n’intervient pas durant son équilibre avec l’analyte lorsqu’ils sont tous deux en solutions (c.

à d. au terme de l’extraction), mais plutôt au cours de l’extraction. La surestimation des

concentrations de MeHg+ durant son analyse en DI a donc été identifiée comme le résultat d’une

conversion du méthylmercure issu de l’étalon marqué en mercure inorganique pendant les deux

heures d’extraction et survenant avant son équilibre en solution avec MeHg+ originel de

l’échantillon.

L’hypothèse abordée au cours de ce travail de thèse pour s’affranchir de l’équilibre entre l’étalon

marqué (en phase liquide) et l’analyte (en phase solide) avant l’étape d’extraction était de procéder

à une extraction quantitative. L’application de ce concept a montré les limites d’une telle démarche

dans le cas où il est possible que l’étalon marqué évolue durant la durée de l’extraction en

préambule de son équilibre avec l’analyte en solution.

Il est également intéressant de remarquer que ce comportement de l’étalon marqué n’a pas été

observé de manière significative pour l’analyse du BCR-464 et du Dolt-4 avec ce même protocole

d’extraction. Il peut donc être présumé que ce phénomène ne soit pas seulement dépendant du

mode d’extraction mais que d’autres paramètres, tels que les concentrations des espèces et la

matrice de l’échantillon peuvent également l’influencer.

1.2.4 Analyse en DI avec deux étalons marqués

Lors de l’analyse en simple DI en MeHg+ menée sur le Dolt-4, une fraction de masse élevée pour

cette espèce a été déterminée. La concentration élevée du mercure inorganique au sein de cet

échantillon a été présumée responsable de cet écart de justesse en raison d’une méthylation

possible de Hg2+ en MeHg+. L’étude de la conversion des espèces au cours du protocole d’analyse

a donc été étudiée sur le Dolt-4.

Les deux protocoles d’extraction ont été appliqués en présence cette fois de deux étalons

marqués : en méthylmercure (Me200Hg+) et en mercure inorganique (202Hg2+). L’isotope 201Hg, ne

présentant aucun signe d’interférences, a été sélectionné comme l’isotope de référence de

190

l’échantillon. Les étalons marqués ont été additionnés de telle sorte que les rapports mesurés

soient proches de 0.3 pour 201Hg/202Hg sur le mercure inorganique (égal à 0.44 à l’état naturel) et

de 0.4 pour 201Hg/200Hg sur le méthylmercure (égal à 0.57 à l’état naturel).

Les DI directes ont été préparées suivant le même protocole présenté pour la DI menée avec

seulement MeHg+ (paragraphe 1.2.3.1), seul l’ajout de l’étalon marqué de Hg2+ intervient après

celui du méthylmercure.

Pour la caractérisation des étalons marqués, les DI inverses ont été préparées en utilisant les

mêmes quantités d’espèces marquées et avec un rapport isotopique proche des DI directes.

Chaque étalon marqué a été préparé séparément pour éviter toute conversion au sein des DI

inverses. La pureté, en termes d’espèces de mercure, a été vérifiée par l’analyse avec le couplage

HPLC-ICP-MS pour s’assurer qu’aucun biais ne puisse impacter les résultats sur les taux de

conversions. Quatre réplicats ont été réalisés pour chaque DI.

Le traitement des données permettant d’identifier les conversions et de corriger leur effet peut se

réaliser selon quatre méthodes différentes détaillées par Rodriguez et al. (2007). Le mode de

calcul sélectionné pour notre étude reposait sur la déconvolution des profils isotopiques. Cette

approche, proposée pour la première fois par Meija et al. (2006), consiste en un traitement des

aires de pics obtenus en relation avec les profils isotopiques associés à chaque étalon marqué

ainsi qu’à celui de l’échantillon d’abondances naturelles. L’annexe 5 présente les détails des

calculs réalisés pour aboutir aux fractions de masses de l’échantillon et aux facteurs de

conversions. Deux possibilités d’évolution des espèces ont été prises en considération : la

déméthylation de MeHg+ et la méthylation de Hg2+.

Le Tableau 38 présente les résultats obtenus pour i) le traitement des données comme s’il

s’agissait de simples DI en utilisant l’isotope 201Hg comme référence (les abondances des étalons

marqués étant inférieures à 2% sur cette isotope, leur conversion n’impacte que faiblement le

résultat), noté DI simple et ii) les données corrigées des transformations d’espèces et

accompagnées des facteurs de conversions, notées DI corrigée.

191

Tableau 38 : Résultats du dosage sur le Dolt-4 avec traitements des données en simple DI ou avec

calcul des conversions des espèces (DI corrigée)

Incubation (mg(Hg)·kg-1) Micro-onde (mg(Hg)·kg-1)

Moyenne (Ecart-type) Moyenne (Ecart-type)

Certificat

(mg(Hg)·kg-1)

DI simple 1.41 (0.04) 1.47 (0.03) MeHg+

DI corrigée 1.37 (0.04) 1.41 (0.04) 1.33 ± 0.12

DI simple 1.44 (0.06) 1.33 (0.04) Hg2+

DI corrigée 1.41 (0.05) 1.31 (0.03) 1.25* ± 0.15

Facteur de déméthylation (%) 3.2 (0.8) 1.9 (1.0)

Facteur de méthylation (%) 2.2 (1.4) 3.4 (2.1)

* valeur indicative issue de la différence entre les valeurs de Hg total et du méthylmercure

Les valeurs déterminées par la correction du taux de conversion des espèces sont en adéquation

avec les valeurs certifiées ou consensuelles (EN<2). La comparaison des résultats des DI avant et

après corrections ne met pas en évidence une forte variation des fractions de masses : elles ont

seulement sensiblement diminué après corrections. En effet, pour chaque mode d’extraction, les

transformations, c’est à dire méthylation ou déméthylation, se sont faites à des taux sensiblement

identiques (entre 2 et 3%) et en raison des teneurs proches entre les deux espèces, leur impact

sur le résultat de la simple DI est limité. Les écart-types associés au facteur de conversion (entre

20 et 60% de la valeur) attestent de la difficulté de caractériser ses effets avec une bonne fidélité.

Qvarnstrom et al. (2002) ont déterminé pour le CRM Dolt-2, matrice similaire au Dolt-4, des taux

de conversions du même ordre de grandeur en utilisant une extraction alcaline assistée par

ultrasons (2.38 ± 0.09 % et 1.7 ± 0.56 % pour la déméthylation et la méthylation respectivement).

Bien que Monperrus et al. (2008) aient souligné la dépendance des conversions avec la matrice, la

détermination de faibles taux de transformations permet de supposer que pour des échantillons de

muscle de poissons, pour lesquels les teneurs en mercure inorganique sont beaucoup plus faibles

que celles en méthylmercure, la méthylation de Hg2+ ne peut avoir qu’un impact très limité sur la

détermination de MeHg+.

L’utilisation de la DI avec l’ajout multiple d’étalons marqués s’avère être un outil prometteur pour la

caractérisation des matériaux, mais également pour l’évaluation des protocoles analytiques.

L’application à des échantillons ayant des concentrations d’espèces similaires, ou pour la

quantification d’espèces minoritaires, peut permettre d’améliorer la justesse des résultats par la

mise en évidence, et la correction, d’évolutions de la spéciation au cours des protocoles

d’analyses. Cependant, tout comme pour l’utilisation de la simple DI, l’équilibre entre les ajouts

d’étalons et les analytes initialement présents dans l’échantillon est primordial pour assurer la

justesse des résultats et ne pas corriger artificiellement les teneurs en analytes (en raison d’un

comportement différent de l’étalon marqué vis à vis des espèces originelles).

192

2 Analyses des Matériaux de Références Certifiés fr ais

Après avoir développé les protocoles d’analyses sur des échantillons lyophilisés, leur efficacité sur

des échantillons plus représentatifs d’échantillons réels a été contrôlée. Pour atteindre ce but, des

matrices de poissons frais et contenant de plus faibles teneurs en MeHg+ ont été analysées.

Ainsi, les protocoles métrologiques développés sur les CRMs lyophilisés ont été appliqués à ces

échantillons frais. Le NIST propose des CRMs issus d’échantillons frais homogénéisés, conservés

à -80 °C et certifiés pour leur fraction de masse e n méthylmercure (Davis 2007). Le Tableau 39

présente les propriétés des deux CRMs étudiés. Outre la différence de matrice avec les analyses

précédemment développées, le défi analytique repose également sur les capacités des méthodes

mises en places à atteindre d’aussi faibles concentrations dans de tels échantillons (valeurs dix

fois moins importantes que pour l’analyse de matrices lyophilisées).

Tableau 39 : Propriétés des CRMs frais (en poids fr ais)

CRM Matrice Mercure total

(mg(Hg)·kg-1)

Méthylmercure

(mg(Hg)·kg-1)

SRM-1946 Filet de truite 0.433 ± 0.009 0.394 ± 0.015

SRM-1947 Filet de truite 0.254 ± 0.005 0.233 ± 0.010

2.1 Traitement de l’échantillon

Les deux protocoles d’extraction développés ont été appliqués aux CRMs frais. Seules les prises

d’essais ont été modifiées pour augmenter les quantités de mercure mises en solution : 300 mg

ont été extraits par 20 mL de phase mobile avec l’assistance micro-ondes et l’incubation au bain-

marie.

Leur efficacité a été testée dans un premier temps sur le SRM-1946. La Figure 65 présente les

chromatogrammes obtenus par l’analyse des extraits en phase inverse.

193

m/z=202

0

2500

5000

7500

10000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

MW Incubation

Figure 65 : Chromatogrammes des extraits de SRM-194 6 sur la colonne de phase inverse

Les deux protocoles ont permis de mettre en solution le mercure inorganique et le méthylmercure

contenus dans le SRM-1946. Cependant, l’observation de la hauteur des pics laisse présumer une

différence de comportement de l’échantillon durant son extraction en fonction des protocoles

utilisés. En effet, le mercure inorganique fournit une plus forte intensité de pic pour l’extraction via

l’incubation alors que pour le méthylmercure, c’est la mise en solution avec l’utilisation des micro-

ondes qui donne le signal le plus intense. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces différences :

soit l’un des modes opératoires est plus efficace sur une des espèces (le micro-onde pour MeHg+

ou l’incubation pour Hg2+), soit l’un des protocoles engendre des conversions entre espèces

(l’application du champ micro-ondes entraîne une méthylation de Hg2+ ou l’incubation engendre la

déméthylation de MeHg+).

Le dosage par étalonnage externe et ajouts dosés du méthylmercure dans les deux extraits a été

effectué pour vérifier l’efficacité des deux protocoles (Figure 66). Il est à noter, que de par une

faible quantité d’échantillon disponible, ces essais n’ont été réalisés que sur une seule prise

d’essai ; les intervalles associés aux mesures sont issus des écart-types obtenus entre les

isotopes de Hg (199, 200, 201 et 202), ce qui explique la faible variabilité associée.

194

0

20

40

60

80

100

120

140

extraction par micro-ondes extraction par incubation

Protocole

% [MeHg +] extrait

étalonnage externe ajouts dosés

Figure 66 : Efficacité des protocoles d'extraction appliqués sur le SRM-1946 en fonction de la

méthode de quantification utilisée

L’observation des résultats, compte tenu des incertitudes de mesure (de l’ordre de 10 à 20% avec

ces techniques de quantification), montre que l’extraction quantitative du méthylmercure est

atteinte. Les deux protocoles sont donc également efficaces sur des échantillons frais. Ils ont donc

été appliqués pour mener la DI sur le méthylmercure.

2.2 Mise en place des protocoles métrologiques

Les protocoles métrologiques développés pour les échantillons lyophilisés ont été appliqués de

façon similaire. Seule la détermination du taux d’humidité n’a pas été réalisée du fait que ces

matériaux sont certifiés sur leur poids frais. La valeur du mercure total a tout d’abord été

déterminée puis celle du méthylmercure, avec la seule utilisation d’un étalon marqué en Me200Hg+.

2.2.1 Analyse du mercure total

L’étalon marqué en 202Hg (IRMM-640) a été utilisé pour mener ces DI après sa dilution à une

fraction de masse de 20 µg·kg-1. Le rapport isotopique 200Hg/202Hg a été modifié pour atteindre une

valeur proche de 0.5 (à l’état naturel : 0.77). Ainsi, 1 g et 0.5 g d’étalon marqué ont été rajoutés

respectivement à une prise d’essai de 300 mg de SRM-1946 et SRM-1947. Quatre réplicats ont

été préparés pour chaque échantillon.

L’étalon marqué a aussi été caractérisé par dilution isotopique inverse, toujours à partir de deux

solutions mères indépendantes préparées à partir de mercure métallique. Pour cela, quatre DI

Inverses ont été réalisées à partir de 1 g d’étalon marqué auquel est ajouté la quantité nécessaire

d’étalon de mercure permettant d’atteindre un rapport proche de 0.5. Les analyses des deux

CRMs s’étant déroulées simultanément, les mêmes DI Inverses ont été utilisées pour chacun

195

d’entre eux et analysées en même temps que chacun des échantillons. Les deux fractions de

masses déterminées pour la solution de l’étalon marqué sont d’ailleurs identiques : 20.58 ± 0.82

µg·kg-1 lors de l’analyse du SRM-1947 et 20.60 ± 0.85 µg·kg-1 pour le SRM-1946.

Les résultats obtenus sur le dosage du mercure total sont présentés dans le Tableau 40.

Tableau 40 : Résultats en DI sur le mercure total, l'incertitude est fournie avec un coefficient

d'élargissement égal à deux

CRM [Hg] mg·kg-1 Certificat mg·kg-1

SRM-1946 0.448 ± 0.017 0.433 ± 0.009

SRM-1947 0.264 ± 0.015 0.254 ± 0.005

Malgrè les faibles incertitudes associées aux valeurs certifiées (de l’ordre de 2%), les deux valeurs

déterminées sont compatibles avec les certificats des CRMs (EN<2). Le protocole mis en place a

donc été validé pour l’analyse du mercure total dans des d’échantillons frais pour ces gammes de

concentrations. Cependant, l’obtention de deux résultats supérieurs à la limite haute fixée par le

certificat pour les deux échantillons soulève la question d’une éventuelle contamination au cours

du protocole. Avant de pouvoir directement appliquer ce protocole sur des échantillons similaires, il

sera nécessaire de mener une étude approfondie pour s’assurer qu’aucune contamination

n’intervient au cours de la méthode développée.

Les incertitudes associées aux résultats sont du même ordre de grandeur que précédemment

(entre 4 et 6%), et de même les composantes majoritaires sont identiques à celles déjà mises en

évidences (Figure 67).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

masse (barquette + Hg)

masse (barquette vide)






SRM-1946 SRM-1947

Figure 67 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du mercure total dans des

échantillons frais

196

2.2.2 Analyse de spéciation

2.2.2.1 Préparation de la dilution isotopique

Les DI ont été préparées de la même manière que lors de l’analyse des CRMs lyophilisés : ajout

de l’étalon marqué de Me200Hg+ tel que le rapport mesuré soit proche de 0.8 pour 202Hg/200Hg,

après vérifications qu’aucune interférence ne soit présente (EN<2). Le protocole pour la réalisation

pratique des DI directes et permettant d’assurer l’homogénéité du mélange est resté identique :

ajout d’une partie du solvant d’extraction sur la prise d’essai puis ajout de l’étalon marqué avant de

compléter avec le reste du solvant.

L’étalon marqué a également été caractérisé par la préparation de DI Inverses à partir d’un étalon

de MeHgCl d’abondance naturelle et en utilisant les mêmes quantités de matière pour

correspondre aux concentrations des DI directes.

Quatre réplicats ont été préparés pour chaque DI.

2.2.2.2 Dosage du méthylmercure

La Figure 68 et la Figure 69 montrent les chromatogrammes obtenus après l’application des deux

modes d’extraction sur les matériaux frais.

SRM-1946 MW

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 1 2 3 4

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

0

500

1000

1500

0 1 2

SRM-1946 Incubation

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

0

500

1000

1500

2000

2500

0 1 2


197

SRM-1947 MW

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 1 2 3 4

t (min)

Inte

nsité

(cp

s)

200 202

0

500

1000

1500

2000

0 1 2

SRM-1947 Incubation

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 1 2 3 4t (min)

Inte

nsité

(cps

)

200 202

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2


Les deux espèces identifiées dans les échantillons de poissons lyophilisées ont également été les

seuls composés présents dans ces échantillons frais pour les protocoles d’extraction utilisés :

mercure inorganique et méthylmercure.

Les résultats sur le dosage du méthylmercure sont présentés dans le Tableau 41.

Tableau 41 : Résultats sur la détermination du méth ylmercure par DI associés à leur incertitude (k=2)

Analyse de spéciation (mg(Hg)·kg-1) CRM

Incubation Micro-ondes

Certificat

(mg(Hg)·kg-1)

SRM-1946 0.459 ± 0.053 0.407 ± 0.040 0.394 ± 0.015

SRM-1947 0.262 ± 0.029 0.256 ± 0.027 0.233 ± 0.010

Hormis pour le CRM-1946 extrait par l’incubation, les résultats sont compatibles avec les valeurs

certifiées (EN<2). Malgré le manque de fidélité des dosages (les incertitudes sont de l’ordre de

10%), l’efficacité du protocole avec les micro-ondes sur ces échantillons a été confirmée pour

atteindre la faible teneur en méthylmercure des échantillons frais. En conséquence seul ce

protocole a été validé pour des matériaux représentatifs d’échantillons réels (en termes de

concentrations et de matrices).

Un comportement différent de l’étalon marqué de Me200Hg+ par rapport à l’analyte originel a été

suspecté, expliquant le manque de justesse associé aux extractions par l’incubation.

L’analyse des incertitudes a révélé que ce sont toujours les mêmes paramètres qui influencent sa

valeur (Figure 70).

198

0 10 20 30 40 50 60





effet sur l'incertitude finale pour l'incubation (% )

SRM-1946 SRM-1947

0 10 20 30 40 50 60 70





effet sur l'incertitude finale pour les micro-ondes (%)

SRM-1946 SRM-1947

Figure 70 : Contribution des principaux paramètres sur le dosage du méthylmercure dans les

échantillons frais en fonction des protocoles d’ext raction

La nature de l’échantillon semble affecter la détermination des composés. En particulier, la mesure

des rapports isotopiques a été plus délicate dans les surnageants des échantillons frais : l’écart-

type relatif associé était de l’ordre de 1%, alors que sur les échantillons lyophilisés il se situait

autour des 0.5%. Lors de l’analyse d’extraits d’échantillons frais, une plus grande variabilité dans

les aires des pics a pu être observée. Des effets de matrice plus prononcés, en raison de la faible

quantité de mercure à analyser, peuvent affecter la séparation et la détection. Même si pour mener

la DI, ce sont les rapports des aires qui sont utilisés, leurs mesures sont affectées par la variabilité

des aires. Cette dispersion des mesures a été identifiée comme responsable de l’augmentation de

l’incertitude finale jusqu’à 10% de la valeur de la fraction de masse mesurée. Dans ces conditions,

il peut être envisagé que les limites de la procédure sont atteintes pour une détermination fidèle du

méthylmercure dans des échantillons de poissons. Les efforts futurs devront donc être consacrés

à améliorer la lecture des rapports isotopiques pour améliorer la fidélité de la méthode et permettre

une meilleure évaluation de la justesse des résultats. En effet, diminuer les incertitudes de

mesures permet une meilleure comparaison des données.

199

3 Conclusions sur l’analyse du mercure

La mise en place de protocoles métrologiques pour l’analyse du mercure (en mode total et en

spéciation) a été réalisée pour des matrices de poissons, ce type d’échantillons représentant l’une

des principales voies d’exposition de la population à travers leur consommation. L’analyse de

spéciation a été réalisée principalement pour la détermination d’une espèce présentant le plus

grand impact sur la santé humaine : le méthylmercure. La démarche utilisée permet de prétendre à

la traçabilité des résultats au SI de par une validation des protocoles sur des CRMs, le calcul des

incertitudes associées et l’utilisation de références à la traçabilité avérée.

Les développements analytiques ont surtout porté sur l’étape d’extraction des analytes. Un

protocole permettant un traitement rapide a pu être développé et s’est montré plus adapté pour la

mise en pratique de la dilution isotopique comme méthode de dosage.

Par contre, l’extraction quantitative a montré que, dans le cadre de l’analyse du mercure avec

l’utilisation de la dilution isotopique, son obtention n’assurait pas toujours une détermination juste

du méthylmercure. En effet, l’application du protocole d’extraction menée avec l’incubation a

montré que l’étalon marqué pouvait évoluer avant que la mise en solution ne soit totale. Cette

conversion entraînait par la suite une surestimation des résultats. Toutefois, cet effet n’a pu être

identifié lors de la mise en pratique du protocole d’extraction développé avec l’utilisation des micro-

ondes, ce qui laisse penser que, s’il intervient, il n’impacte pas le résultat de manière significative.

Malgré ce fait, la question de l’équilibre entre l’analyte contenu dans l’échantillon et l’étalon marqué

reste une interrogation importante à résoudre pour s’assurer de la justesse des résultats obtenus

en DI lors de l’analyse de composés de faible stabilité.

La dilution isotopique menée en spéciation avec l’ajout de plusieurs étalons marqués, développée

depuis quelques années dans plusieurs laboratoires pour permettre l’étude des conversions entre

espèces tout au long du protocole d’analyse, a également été testée sur un échantillon. Cette

méthode s’est révélée intéressante et prometteuse dans le cadre d’analyses où les conversions

peuvent influer de manière significative sur la détermination individuelle de chaque espèce.

L’utilisation d’un tel outil pourra aussi à l’avenir permettre une meilleure évaluation de l’utilisation

de plusieurs protocoles sur des analytes et permettre de sélectionner celui de moindre impact sur

les résultats finaux. Cependant, tout comme pour la DI avec l’utilisation d’un seul étalon marqué,

l’équilibre échantillon/étalon avant le début de l’analyse est primordial pour éviter toutes erreurs

dans la correction des concentrations. En conséquence, lors de son utilisation, des études devront

être au préalable menées pour s’assurer de l’atteinte d’un tel équilibre.

La mise en pratique des protocoles métrologiques a pu être réalisée sur différents types

d’échantillons. Premièrement, des CRMs se présentant sous forme de poudres lyophilisées, avec

200

des teneurs relativement élevées en mercure, ont été analysés. Dans un deuxième temps, des

échantillons plus représentatifs de ceux analysés par les laboratoires, ont été étudiés. La

différence provenait du fait qu’ils soient conservés frais et congelés. L’implication de ce mode de

conservation était une fraction de masse en mercure plus faible dans ces seconds types

d’échantillons. Les protocoles se sont révélés être, sur la plupart des échantillons, efficaces pour

doser le méthylmercure ou le mercure total. En particulier, la procédure développée pour mener

l’analyse de MeHg+ avec l’utilisation des micro-ondes a pu montrer ses capacités de mesures sur

deux matrices distinctes et pour différentes gammes de concentrations (typiquement allant de 0.2

à 5 mg·kg-1). Ce protocole est donc considéré comme validé dans le cadre des applications

abordées.

Les limites des protocoles développées ont pu également être en partie identifiées. Premièrement,

l’application de la simple DI en méthylmercure peut fournir une concentration erronée pour des

échantillons où le mercure inorganique se retrouve à une teneur non négligeable. En effet sa

méthylation peut mener à une surestimation de sa concentration. L’implication de la DI avec deux

étalons marqués devient alors indispensable pour améliorer la justesse des résultats. Une

seconde limitation des protocoles développés réside dans la fidélité de la détermination des

concentrations pour des valeurs basses. En effet, pour ces seconds échantillons les incertitudes

associées étaient de l’ordre de 10% ce qui ne permet pas toujours de détecter un écart de justesse

entre les valeurs déterminées et celles certifiées. L’étude des facteurs importants a révélé que

cette augmentation de l’incertitude relative (pour les échantillons lyophilisés elle n’était que

d’environ 5%) provenait majoritairement de la lecture des rapports isotopiques des DI.

L’amélioration des performances du couplage HPLC-ICP-MS par une augmentation des capacités

de détection de l’ICP-MS et également par une efficacité de la séparation pourra permettre

d’envisager de diminuer l’impact de la lecture des rapports isotopiques sur les incertitudes finales.

L’amélioration des capacités de mesures des techniques analytiques permettra également

d’abaisser les plages d’applicabilités de nos protocoles sur des échantillons aux teneurs plus

faibles en méthylmercure comme rencontrées chez les mollusques ou dans des sédiments.

Au final, la mise en place des protocoles métrologiques pour la détermination du méthylmercure

par le couplage HPLC-ICP-MS s’avère être efficace dans les gammes des échantillons analysés.

L’utilisation de telles techniques se révèle surtout être une alternative à l’application de la GC-ICP-

MS pour le dosage de MeHg+ dans ce type d’échantillons. L’existence de plusieurs possibilités

techniques pour mener une analyse s’avère intéressante pour améliorer la compréhension de

l’impact des procédés analytiques sur les résultats finaux en comparant les déterminations

obtenues avec chaque couplage.

201

Conclusion générale

204

Le but des recherches entreprises au cours de cette thèse reposait sur la mise en place de

protocoles métrologiques pour assurer la traçabilité des analyses de spéciation au Système

International des unités (SI), cette traçabilité permettant par la suite la comparabilité dans le temps

et dans l’espace. Le LNE, laboratoire national de métrologie pour la France, se devait de disposer

de telles techniques pour répondre aux besoins en qualité (actuels et futurs) des analyses

engendrées par les évolutions de la législation. Ainsi, en partenariat avec le LCABIE (UMR CNRS

de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour), il a été décidé de développer des méthodes pour

réaliser des analyses de spéciation tout en assurant leur traçabilité au SI.

Les applications choisies reposaient sur l’étude d’éléments pouvant se retrouver dans le régime

alimentaire des populations. Ainsi, un élément essentiel pour la santé humaine, le sélénium, et un

élément reconnu pour son impact nocif, le mercure, ont été sélectionnés comme premières

applications du protocole métrologique développé. Sur ces deux éléments, les espèces retenues

ont été celles représentant la principale forme d’exposition des populations par les échantillons

choisis : à savoir la sélénométhionine (SeMet) présente dans les compléments alimentaires issus

de levures séléniées et dans la farine de blé et le méthylmercure (MeHg+) qui se bioaccumule le

long de la chaîne alimentaire des réseaux aquatiques pour atteindre des teneurs élevées au sein

des échantillons de poissons.

Les techniques analytiques utilisées pour mener à terme ces analyses ont reposé sur le couplage

de la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) et de la Spectrométrie de Masse à

Couplage Inductif du Plasma (ICP-MS). Ce montage a été utilisé avec la mise en oeuvre de la

Dilution Isotopique (DI) comme méthode de dosage. La DI, menée sous certaines conditions, est

reconnue comme une méthode primaire par le Bureau International des Poids et Mesures (BIPM),

et son application autorise la traçabilité des mesures au Système International.

Dans le cadre d’analyses de spéciation menées en DI, l’équilibre entre l’étalon marqué liquide et

l’analyte à mesurer dans l’échanitllon solide est impossible à obtenir avant le début de l’extraction.

Pour pallier à cette difficulté, les travaux ont donc été orientés vers le développement de

protocoles de traitements des échantillons qui permettent d’obtenir une extraction quantitative des

formes chimiques de l’élément depuis la matrice. Le postulat est que si l’extraction est quantitative,

l’analyte se retrouve en phase liquide avec l’étalon marqué et, ainsi, l’équilibre devient possible.

Pour l’analyse du sélénium, les travaux ont donc débuté par la mise en place de traitements

permettant d’extraire un maximum de formes de Se depuis les différents types d’échantillons.

Deux protocoles d’extractions séquentielles ont donc été mis au point pour améliorer la mise en

solution de l’ensemble des espèces de sélénium. Ces deux protocoles ont présenté des efficacités

différentes sur l’extraction du sélénium total, dépendantes des échantillons analysés. Cependant

ces deux protocoles se sont révélés tout aussi efficaces pour l’extraction de la sélénométhionine

sur tous les types d’échantillons. La quantification de SeMet s’est déroulée après l’application d’un

205

ou deux protocoles, en fonction des contraintes imposées par l’échantillon (faible teneur en Se).

Les extraits ont pu être analysés par deux techniques chromatographiques différentes pour

assurer une séparation efficace de la sélénométhionine et limiter ainsi les risques de co-élution. La

détection par ICP-MS a été optimisée pour éviter ou corriger les interférences lors de la mesure

des isotopes impliqués dans la DI.

L’approche visant à obtenir une extraction quantitative pour assurer la justesse du résultat a aussi

été considérée pour mener l’analyse du méthylmercure. Deux modes opératoires ont été mis en

place pour réaliser l’extraction, et lors des tests préliminaires, chacun s’est montré efficace pour

atteindre la totalité du méthylmercure présent dans les échantillons. Cependant, lors de

l’application de la DI en analyse de spéciation, les résultats pouvaient se révéler biaisés avec

l’utilisation de l’une des deux méthodes (l’extraction par incubation). Il a été démontré que ces

résultats étaient obtenus à cause d’une évolution de l’étalon marqué au cours de l’extraction de

l’analyte et donc avant son équilibre avec celui ci. Cet effet a ainsi démontré les limites de

l’hypothèse de travail pour les composés pouvant facilement se convertir en d’autres espèces.

Toutefois, le second protocole développé, reposant sur l’activation par champ micro-ondes pour

diminuer le temps d’extraction, a montré son efficacité sur la détermination du méthylmercure pour

les deux types d’échantillons étudiés. La séparation par HPLC et la détection par ICP-MS ont été

optimisées pour la mesure du méthylmercure. En particulier, l’utilisation de l’ICP-MS avec cellule

de collision/réaction activée a permis d’améliorer les limites de détection des techniques

analytiques. L’utilisation du couplage HPLC-ICP-MS pour l’analyse de spéciation du mercure est

également une alternative dans la mesure du méthylmercure. En effet, la plupart des méthodes

développées jusqu’à présent reposent sur l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse

pour la séparation des espèces après dérivation de celles-ci. La disponibilité de méthodes

complémentaires et basés sur principes des physico-chimiques différents pour réaliser une mesure

est indispensable pour l’évaluation de l’impact des techniques analytiques sur le résultat final.

Une fois les modes opératoires pour l’analyse des échantillons élaborés, les protocoles

métrologiques ont pu être appliqués. Un travail important pour l’obtention de la traçabilité au SI a

été la détermination des incertitudes de mesures. A partir de l’équation générale de la DI, un

modèle mathématique a été construit pour permettre de faire figurer les paramètres pris en compte

pour obtenir le résultat final mais également ceux n’apparaissant pas directement dans son

équation. A partir de cette expression mathématique, l’incertitude générale associée à la

quantification des espèces dans les différents échantillons a pu être établi. Outre le fait que le

calcul de l’incertitude est une étape importante et nécessaire pour la démonstration de la traçabilité

d’une analyse, il a également permis de pointer les facteurs les plus influents sur le résultat final ;

ainsi l’optimisation du processus de mesure a pu (et pourra) être envisagée en modifiant ces

206

paramètres. Sur l’ensemble des résultats, des incertitudes relatives comprises entre 3 et 10% en

fonction des échantillons ont pu être établies.

La validation des protocoles s’est déroulée par i) l’analyse de matériaux de références certifiés

(CRMs) ii) la participation à une intercomparaison et iii) le calcul des incertitudes de mesures. Ainsi

les méthodes développées ont pu démontrer leur justesse sur des gammes de teneurs allant de 10

à 2000 mg·kg-1 pour le sélénium et de 0.2 à 5 mg·kg-1 pour le mercure. La robustesse des

méthodes vis à vis des échantillons a également été étudiée par leur application sur différentes

matrices : des levures séléniées, brutes ou enrobées d’excipients pharmaceutiques, ou de la farine

de blé pour le sélénium et des échantillons de poissons frais ou lyophilisés pour le mercure.

L’application de ces protocoles sur les échantillons de plus faibles teneurs a montré également les

limites des techniques utilisées.

Finalement, il peut donc être retenu que les protocoles métrologiques mis en place pour l’analyse

de spéciation du sélénium et du mercure ont montré leur capacité de mesure dans les échantillons

étudiés. La traçabilité au SI est démontrée grâce à l’utilisation de la DI sous certaines conditions et

l’estimation des différentes sources d’incertitudes, ce qui permet de qualifier ces modes

opératoires de « procédures de mesure primaire ». Les protocoles développés sont donc

utilisables pour permettre le transfert de la traçabilité au SI vers les utilisateurs, via leur implication

dans la certification de matériaux de références ou lors de la participation à des essais d’aptitudes.

Les travaux réalisés au cours de cette thèse représentent une première étape pour le LNE dans le

domaine de la spéciation. La mesure de la sélénométhionine n’est seulement qu’un premier pas

dans l’évaluation de l’impact sur la santé humaine des types d’échantillons étudiés. En effet, cette

espèce ne représente que 65% du sélénium total. Des efforts doivent donc être réalisés pour

l’identification et la mesure des espèces contenues à plus plus faibles teneurs. Dans le cadre de

l’analyse du mercure, les protocoles mis en places ont montré leur limitation lors de l’analyse

d’échantillons frais de faibles concentrations. Des efforts devront être consacrés à l’amélioration de

la sensibilité des techniques utilisées pour permettre i) d’améliorer la capacité de mesures et ii)

diminuer les incertitudes associées sur de tels échantillons.

Le devenir des espèces mesurées dans le corps humain est aussi à étudier pour permettre de

corréler des teneurs d’exposition à des concentrations de présence au niveau de la personne.

Pour permettre cela, il est donc nécessaire de développer des méthodes capables de réaliser la

spéciation de ces éléments dans les fluides humains. Ainsi, des progrès pourront être réalisés

pour mieux appréhender la biochimie associée à chacun de ses éléments, ce qui permettra, in

fine, une meilleure évaluation des risques.

Des développements devront aussi être réalisés pour étendre l’utilisation des protocoles

métrologiques à d’autres espèces susceptibles d’affecter la santé humaine ou l’environnement. En

effet, plusieurs éléments soulèvent à l’heure actuelle des questions sur leur impact, que ce soit

207

d’un point de vue de la santé comme l’utilisation d’espèces platinées dans certaines formulations

médicamenteuses ou de leur conséquence environnementale comme les organoétains. Ainsi, des

applications de la spéciation pourront apporter des compléments d’informations que ce soit dans le

domaine de l’environnement ou du biomédical.

208

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233

Annexes

Annexe 1 : Revue bibliographique des séparations pa r

HPLC-ICP-MS avec appariements d’ions pour l’analyse

des espèces de sélénium

238

239

Type de séparation

Volume d’injection

(µL) Phase mobile

Dimension de la colonne

(mm)

Temps d’analyse

(min) Composés séparés

Type d’échantillon Référence

IP-RP

(appariement

d’ions)

10 0.1% acide trifluoro-acétique (TFA),

2% méthanol (MeOH) 150 x 4.6 25

SeMet, MeSeCys,

propyl-SeCys

Levures et

aulx

Bird

1997

IP-RP 100 0.1% acide acétique 150 x 4.6 20 Se-adénosyl-homo-cystéine Levure Casiot

1999b

IP-RP 25 0.1% TFA, 10% MeOH 250 x 4.6 22 Se inorganique, SeCys2,

SeMet, Se-éthionine (SeEt) Levure

B’Hymer

2000

0.1% TFA, 1% MeOH 20

0.1% acide pentafluoropropionique (PFPA), 1%

MeOH 40

IP-RP -

0.1% acide heptafluorobutyrique (HFBA), 1%

MeOH

150 x 3.9

75

Mélange de 23 étalons - Kotrebai

2000

IP-RP 100

2.5 mmol·L-1 1-butane sulfonate de sodium,

8 mmol·L-1 hydroxyde de tétraméthylammonium

(TMAH), 4 mmol·L-1 acide malonique,

0.05% MeOH, pH=4.5

250 x 4.6 20

SeIV, SeVI, SeCys2,

TMeSe+, SeET, SeMet,

sélénocystamine et

sélénouréa

Levure Zheng

2000

IP-RP 50

30 mmol·L-1 formate d’ammonium,

10 mmol·L-1 acétate de tétrabutylammonium,

5% MeOH, pH=3.0

250 x 4.0 12 SeEt, SeMet, SeVI, SeIV,

sélénocystamine et SeCys2 Urine

Marchante

2001

IP-RP 15 50% MeOH, pH=5.3 avec tampon acide

acétique/acétate de sodium 250 x 2.0 45 SeMet, SeEt Levure

Montes-Bayon

2001

IP-RP 20

5 mmol·L-1 acide citrique

5 mmol·L-1 acide hexanesulfonique,

5% MeOH, pH=4.5

150 x 4.6 7 SeMet Levure et

noix

Wrobel

2003

IP-RP 20 10 mmol·L-1 hydroxyde de tétraéthylammonium

(TEAH), 4.5 mmol·L-1 acide malonique, pH=6.8 250 x 4.6 20

SeIV, SeVI, SeCys2, SeET,

TMeSe+, SeMet, sélénouréa Levure

Zheng

2003

240

Type de séparation


(µL) Phase mobile

Dimension de la colonne

(mm)

Temps d’analyse



IP-RP 100 100 mmol·L-1 acétate d’ammonium,

2% MeOH, pH=4.5 250 x 4.6 10 SeMet Poisson

Diaz Huerta

2004

A : 0.1% TFA dans l’eau IP-RP 30 Gradient

B : 0.1% TFA dans MeOH 250 x 4.1 35 Chaînes polypeptidiques Levure

Polatajko

2004

IP-RP 20 0.1% HFBA, 5% MeOH, pH=2.5 150 x 4.6 20 Se inorganiques, SeCys2,

MeSeCys et SeMet Oignions

Shah

2004

0.1% acide formique, 2% MeOH IP-RP 50

0.1% TFA, 2% MeOH 250 x 4.6 12 SeIV, SeMet, MeSeCys Levure

Goenaga

2005

IP-RP 20 0.2% HFBA, 10% MeOH, pH=2.5 250 x 2.0 22 SeMet, MeSeCys

Ail et

moutarde

indienne

Montes-Bayon

2006

IP-RP 20 0.05% TFA, 0.1% HFBA, 2 % MeOH 150 x 2.0 25 Se inorganiques, SeCys2,

MeSeCys et SeMet Yahourt

Alzate

2007

IP-RP - 5 mmol·L-1 hydroxyde de tétrabutylammonium

(TBAH), 5% MeOH, pH=7.5 150 x 4.6 25 Composés seleno-arséniés -

Kanaki

2007

A : TBAH, 2.5 mmol·L-1 phosphate

d’ammonium, pH=6.0 IP-RP 100 Gradient

B : 10 mmol·L-1 sulfate d’ammonium

250 x 4.6 8 SeIV, SeVI, SeMet et

SeCys2

Eaux,

plantes et

urines

Afton

2008

A : 0.1% HFBA dans l’eau IP-RP Gradient

B : 0.1% HFBA dans MeOH

150 x 4.6 12 SeMet, SeCys Tissus

biologiques

Bierla

2008

A : 0.1% HFBA, 0.3% MeOH IP-RP 50 Gradient

B : 0.1% HFBA, 2% MeOH 150 x 3.9 14 - Riz

Zhang

2008


HPLC-ICP-MS avec échange d’ions pour l’analyse des

espèces de sélénium

244

245

Type de séparation


(µL) Phase mobile

Dimension de la colonne (mm)

Temps d’analyse



AX

(échange

d’anions)

2 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium 10 x 1.6 12 SeIV et SeVI - Shum

1993

AX 30 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,

pH=4.8 150 x 4.6 14

SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,

MeSeCys, Se-allyl-SeCys Ail

Bird

1997

CX

(échange

de cations)

100 20 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH de 2 à 5.7 250 x 4.6 7 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,

SeEt, Seleno-homo-cystine -

Goessler

1997

AX 100 12.5 mmol·L-1 phosphate d’ammonium, 3%

MeOH, pH=8.5 250 x 4.1 16 SeIV et SeVI -

Guerin

1997

AX 100 6 mmol·L-1 salicylate de Tris, 3% MeOH, pH=8.5 120 x 4.6

CX 50 2 mmol·L-1 formiate de pyridine, 3% MeOH,

pH=2.9 100 x 3

9 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2 Trèfle Pedersen

1997

AX 10 5 mmol·L-1 malonate d’ammonium - 4 SeIV et SeVI Eau

souterraine

Woller

1998

A : 6.25 mmol·L-1 phosphate

d’ammonium, pH=5.5 AX 100 Gradient

B : 25 mmol·L-1 phosphate

dammonium, pH=11

250 x 4.1 14 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,

SeEt Levure

Casiot

1999a

AX 100 5.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium 25 x 4 7 SeIV, SeVI, SeMet, TMeSe+ - Li

1999

AX 20 25 mmol·L-1 hydroxyde de sodium, 2% MeOH 250 x 2 10 SeIV, SeVI, SeMet Urine Gammelgaard

2000

10 mmol·L-1 acide oxalique, 20 mmol·L-1 sulfate

de potassium, 2% MeOH, pH=3 9 SeIV, SeVI, SeMet, TMeSe+

CX 20 30 mmol·L-1 formiate d’ammonium, 2% MeOH,

pH=3

250 x 2

12 SeIV, SeMet, TMeSe+

Urine Gammelgaard

2001

246

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



AX 4 mmol·L-1 salicylate de sodium, 3% MeOH, pH=8 125 x 4.6 16

A : 0.75 mmol·L-1 formiate de

pyridine, 3% MeOH, pH=3 CX

50 - 200 Gradient

B : 8 mmol·L-1 formiate de pyridine,

3% MeOH, pH=3.2

100 x 3 52

SeIV, SeVI, 12 espèces de

sélénium organiques

Levure,

algue

Larsen

2001

A : 20 mmol·L-1 nitrate d’ammonium,

pH=8.7 AX 100 Gradient

B : 60 mmol·L-1 nitrate d’ammonium,

pH=8.7

250 x 4.1 9 SeIV et SeVI Eau de

surface

Martinez

2001

A : 30 mmol·L-1 Tris-HCl, 30 mmol·L-1

HEPES, pH=7.3 Gradient

B : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, 20 mmol·L-1

sulphate d’ammonium, pH=8.2

- 12

A : 0.8 mmol·L-1 hydroxyde de

sodium

AX 100

Gradient B : 0.5% hydroxyde de tétraméthyl-

ammonium

- 12


SeEt, selenurea Bactérie

Michalke

2001

CX 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.9 250 x 4.1 30

3 mmol·L-1 salicylate de Tris, pH=6

5.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, pH=4.8 AX

100

15 mmol·L-1 tartrate d’ammonium, pH=2.9

250 x 4.1 8


TMSe+ Huîtres

Moreno

2001

AX 50 100 mmol·L-1 hydroxyde de sodium 250 x 4 10 SeIV et SeVI Eau

souterraine

Vassileva

2001

247

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



A : 5 mmol·L-1 phosphate

d’ammonium, pH=8 AX 10 Gradient


dammonium, pH=8

250 x 2 25 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2 Levure Chassaigne

2002

CX 20 mmol·L-1 formiate de pyridium, pH=3 20

A : 20 mmol·L-1 acide acétique, 10

mmol·L-1 triéthyl-amine, pH=4.7 AX

100

Gradient B : 200 mmol·L-1 acide acétique, 100

mmol·L-1 triéthyl-amine, pH=4.7

-

50


SeEt Levure

McSheehy

2002

5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 3% MeOH, pH=5 250 x 4.1 22 Levure

A : 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,

3% MeOH, pH=3.65 AX 100 Gradient

B : 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,

3% MeOH, pH=8

250 x 4.1 12


MeSeCys Blé

Diaz Huerta

2003

A : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4

AX 100 Gradient B : 50 mmol·L-1 Tris-HCl, 0.5 mol·L-1

acétate d’ammonium, pH=7.4

50 x 5 30 Glutathion peroxidase,

protéine P

Sérum

humain

Hinojosa

2003


pyridine, 3% MeOH, pH=3

B : 2 mmol·L-1 formiate de pyridine,

3% MeOH, pH=3 CX 10 - 100 Gradient

C : 8 mmol·L-1 formiate de pyridine,

3% MeOH, pH=3.2

100 x 3 70 10 espèces de sélénium

organiques Levure

Larsen

2003

CX 100 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, 3% MeOH,

pH=4.5 ou 2.8 250 x 4.1 20


TMSe+ Poisson

Cabanero

2004

248

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



AX 100 5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH

pH=5.9 250 x 4.1 13


MeSeCys

Levure et

complément

s

alimentaires

Goenaga

2004


d’ammonium, 2% MeOH, pH=7 AX 100 Gradient


d’ammonium, 2% MeOH, pH=7

250 x 4.1 15 SeMet Levure Hinojosa

2004

CX 100 4 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.8 ou 4.7 250 x 4.1 24 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,

TMSe+

Tissus

biologiques

Moreno

2004

A : 10 mmol·L-1 hydroxyde de

sodium AX 1000 Gradient

B : 100 mmol·L-1 hydroxyde de

sodium

- 30 SeIV, SeVI, seleno-cyanate Eaux de

surfaces

Wallschlager

2004


pyridine, 3% MeOH, pH=3 CX 50 Gradient

B : 8 mmol·L-1 formiate de

pyridine, 3% MeOH, pH=3.2

125 x 4 45 SeMet, SeCys2, MeSeCys,

MeSeMet

Moutarde

indienne

Ketavarapu

2005

AX 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, pH=4.8 100 x 4.1 8

CX 20 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.1 150 x 4.6

CX

20

10 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=1.6 250 x 4.1 14

SeIV, SeVI, SeMet,

sélénosucres Urine

Kuehnelt

2005

A : 20 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=4.7

AX 100 B : 200 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=4.7

250 x 4.6 40


seleno-adeno-homo-

cystéine

Levure McSheehy

2005

249

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



A : 10 mmol·L-1 acide acétique AX 100 Gradient

B : 100 mmol·L-1 acide acétique 250 x 4 40 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2

Levure et

farine de blé

Polec-Pawlak

2005

A : 5 mmol·L-1 acide para-

hydroxyde benzoïque (PHBA),

pH=9

24 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2

AX 25 Gradient

B : 20 mmol·L-1 PHBA, pH=9

250 x 4.1

35 SeIV, SeVI, SeMet, SeCys2,

MeSeCys

Levure et

complément

s

alimentaires

Ayouni

2006

CX 2 mmol·L-1 formiate de pyridine, pH=2.8 150 x 4.6 11 SeIV, SeMet, SeCys2,

MeSeCys


d’ammonium, 1% MeOH, pH=5.0 AX

100

Gradient B : 50 mmol·L-1 phosphate

d’ammonium, 1% MeOH, pH=5.0

250 x 4.1 20 SeIV, SeMet, SeCys2, SeVI

Oignons Kapolna

2006

SEC-AX

(exclusion

stérique

combinée à

l’échange

d’anions)

20 10 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.5 300 x 7.6 24 SeMet, MeSeCys

Ail,

moutarde

indienne

Montes-Bayon

2006

AX 100 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,

pH=5 250 x 4.1 14


MeSeCys Yahourt

Alzate

2007

AX 100 12.5 mmol·L-1 phosphate d’ammonium, 3%

MeOH, pH=8.5 250 x 4.1 20 SeIV et SeVI Eau de pluie

Darrouzes

2007

AX 10 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,

pH=5 - 12

SEC-AX

100 - 200

25 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.7 - 25


MeSeCys, γ-glutamyl-Se-

méthyl-sélénocystéine

Lentille Pedrero

2007a

250

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



5 mmol·L-1 citrate d’ammonium, 2% MeOH,

pH=5.9 10

SeMet, SeIV, SeVI,

MeSeCys et SeCys2

5 mmol·L-1 actétate d’ammonium, pH=4.8, 5.7 ou

7.7 - -

A : 20 mmol·L-1 acide acétique, 10

mmol·L-1 trethylamine, pH=4.7

AX 100

Gradient B : 200 mmol·L-1 acide acétique, 100

mmol·L-1 trethylamine, pH=4.7

250 x 4.1

35 SeMet, SeIV, SeVI,

MeSeCys et SeCys2

Farine et

pain

Warburton

2007

A : 0.5 mmol·L-1 citrate d’ammonium,

2% MeOH, pH=3.7 AX 200 Gradient

B : 20 mmol·L-1 citrate d’ammonium,

2% MeOH, pH=8.0

250 x 4.1 12 SeIV, SeVI, SeMet,

MeSeCys Urine

Kuo

2008

251

252


HPLC-ICP-MS pour l’analyse des espèces de mercure

254

Type de séparation


(µL) Phase mobile

Dimensions de la colonne (mm)

Temps d’analyse



pH=6.8 16 Hg2+; MeHg+; EtHg+ CRM de thon Phase Inverse

(RP) 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;

3% acétonitrile ; 0.005% 2-mercaptoéthanol

pH=5.3

-

18 Hg2+; Thimerosal Solutions pour

lentilles de contact

Bushee 1988

150 x 1.6 8 Appariement d’Ions

(IP-RP) 2 5 mmol·L-1 pentanesulfonate d’ammonium

50 x 1.6 6

Hg2+; MeHg+; EtHg+; PhHg+ Urine

Shum 1992

RP 200 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 3% methanol ; 1.5% acétonitrile ;

0.005% 2-mercaptoéthanol 250 x 4.6 16 Hg2+; MeHg+; EtHg+

CRM de thon ; solutions pour

lentilles de contacts et eau

usée

Huang 1993

RP 100 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;

1% acétonitrile ; 0.005% 2-mercaptoéthanol

150 x 3.2 10 Hg2+; MeHg+; EtHg+ CRM de homard

Bloxham 1996

RP 1 000

à 10 000 65% acétonitrile ; pH=5.5 80 x 4.6 10 Hg2+; MeHg+; EtHg+;

PhHg+ ; acide mersalyl

CRMs de poissons ; sédiments

Falter 1997

250 x 4.6 IP-RP 100

60% méthanol ou 45% acétonitrile ; 0.01% 2-mercaptoéthanol ;

10 mmol·L-1 bromure de tétrabutylammonium 100 x 3.0 6 Hg2+; MeHg+

Solution d’étalons

Harrington 1997

RP 100 0.5% L-Cystéine 150 x 4.6 7 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Eau de robinet ;

eau de mer Wan 1997

RP 10 000 0.5 mmol·L-1 acétate d’ammonium pH=4.5; 65%

acétonitrile ; 0.5 mmol·L-1 pyrrolidinedithiocarbamate de sodium

80 x 4.6 6 Hg2+; MeHg+ Sédiments Wilken 1998

IP-RP 10 20% acétonitrile ;

7.5 mmol·L-1 pentanesulfonate de sodium ; pH=3.0

50 x 1.0 6 MeHg+; EtHg+; PhHg+ Solution d’étalons

Acon 2001

RP 100 0.05% 2-mercaptoéthanol ; 0.05% L-Cystéine ; pH=6.6 250 x 2.1 7 Hg2+; MeHg+; EtHg+

Poissons (CRM et naturel)

Chiou 2001

256

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse


Type d’échantillon

Référence


5 % méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=6.8

150 x 3.9 11 Hg2+; MeHg+ Cheveux humains

Morton 2002

RP 50 0.02% L-Cystéine ;

10.4 mmol·L-1 acétate d’ammonium 150 x 3.0 5 Hg2+; MeHg+

Poisons (CRM et naturel) ;

CRM de homard ; huître

Qvarnström 2002

RP - 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ;

5% méthanol ; 0.1% L-Cystéine ; pH=6.8

- 2.5 Hg2+; MeHg+ Poissons (CRMs et naturel)

Rai 2002

RP 100 50% méthanol ;

0.01% 2-mercaptoéthanol 250 x 4.6 6 MeHg+

CRMS de poissons

Clough 2003c

RP 50 200 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 30%

methanol ; 0.001% 2-mercaptoéthanol

- 11 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Sols et

sédiments Han 2003


30% methanol ; 0.005% 2-mercaptoéthanol

- 6 Hg2+; MeHg+ Solutions d’étalons

Rahman 2003

A : 10 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4 Echangeuse d’Anions

(AX) - Gradient

B : 200 mmol·L-1 Tris-HCl, pH=7.4

750 x 7.5 14 Hg lié à des protéines Mammifères et oiseaux marins,

CRMs

Ikemoto 2004

RP 0.1 mol·L-1 Tris-HNO3 (pH=7.4) ; 0.2 mmol·L-1

CHAPS 250 x 4.6 7

Exclusion Stérique (SEC)

100 0.1 mol·L-1 Tris-HNO3 (pH=7.4) 1-300 kDa 45

Hg lié à des protéines Œufs de saumon

Hasegawa 2005

SEC - 25 mmol·L-1 Tris ; 12.5 mmol·L-1 HCl ;

20 mmol·L-1 KCl - 15 Hg lié à des protéines

Cerveaux de souris

Kameo 2005

A : 5 mmol·L-1 acétate d’ammonium, pH=6.0

RP 20 Gradient B : 5 mmol·L-1 acétate

d’ammonium, 50% méthanol pH=6.0

250 x 2.1 45 Hg lié à des protéines Rats Shen 2005

257

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse



RP 50 0.1% L-Cystéine ;

0.1% L-Cystéine, HCl, H2O 150 x 4.6 9 Hg2+; MeHg+; EtHg+

Poissons frais, en boîte ; CRM de poissons,

d’eau et de sols

Hight 2006

A : 10 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 1% méthanol ; 0.05% L-Cystéine ; pH=3.0

150 x 1.0

RP 20 Gradient

B : 100 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 10% méthanol ;

0.5% L-Cystéine ; pH=3.0 100 x 1.0

15 Hg2+; MeHg+; EtHg+;

PhHg+

Eaux de nappe phréatique, de mer et usée

Castillo 2006

RP 20 50 % méthanol ;

0.01% 2-mercaptoéthanol 150 x 3.2 4 Hg2+; MeHg+

CRMs de poissons

Vidler 2006

RP 5

12 % méthanol ; 0.2% 2-mercaptoéthanol ;

1 mmol·L-1 pentanesulfonate de sodium 3.4 10-3 mmol·L-1 EDTA ; pH=2.8

150 x 1.0 15 Hg2+; MeHg+; EtHg+ Poissons (CRM

et naturel) Chang 2007

SEC 100 30 mmol·L-1 Tris-HCl ;

0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=7.5 300 x 10 45 Hg lié à des protéines

RP 50 60 mmol·L-1 acétate d’ammonium ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=3.0

250 x 4.6 20 Hg2+

Plants de soja Ketavarapu

2007


3 % methanol ; 0.1 % 2-mercaptoéthanol

150 x 3.9 25 Hg2+; MeHg+ Urine humaine Li

2007

300 x 8.0 (10-300 kDa)

40 SEC 50 -

300 x 8.0 (500-60 kDa)

20

Hg lié à des protéines

Rats Shi

2007

Echangeuse de Cations

(CX) 20

50 mmol·L-1 Pyridine ; 5% méthanol ;

0.5% L-Cystéine ; pH=2 250 x 4.1 8 Hg2+; MeHg+

CRMs de poissons

Vallant 2007

258

Type de séparation


(µL) Phase mobile


Temps d’analyse




5% méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol

150 x 3.9 X Hg2+; MeHg+

CRM de produits de la mer, cheveux,

et boeuf

Wang 2007

0.5% L-Cystéine

RP 100 0.5% L-Cystéine ; 0.05% 2-mercaptoéthanol

100 x 2.1 5 Hg2+; MeHg+

Phases dissoutes et particulaires d’eaux de surfaces

Cairns 2008


3% méthanol ; 0.1% 2-mercaptoéthanol ; pH=6.8

50 x 2.1 11 Hg+; Hg2+; MeHg+; EtHg+ Sédiments (CRM et naturel)

Cattani 2008

A : 0.1% acide formique dans l’eau

RP 50 Gradient B : 0.25% acide formique dans le

méthanol

150 x 4.6 12 Hg2+; MeHg+ complexés

avec cystéine et glutathion Riz

Krupp 2008

RP 200 5% méthanol ;

0.5% 2-mercaptoéthanol ; pH=4.7 30 x 3 6 Hg2+; MeHg+; EtHg+

Faine de blé et de riz (CRMs et

naturelles), CRM de poisson

Lin 2008

RP 100 50 mmol·L-1 Pyridine ; 0.5% L-Cystéine ; 5%

méthanol 150 x 4.6 5 Hg2+; MeHg+ CRM de thon

Reyes 2008

SEC 100 100 mmol·L-1 Tris 300 x 7.8 25 Hg lié à des protéines Cerveaux de

rats Wang 2008

RP 20 40% acétonitrile ; 35% méthanol ; 25% eau contenant 0.1 mmol·L-1 diéthyldithiocarbamate de sodium

150 x 4.6 15 Hg+; Hg2+; MeHg+; EtHg+;

PhHg+

Eaux de surfaces, poissons, cheveux humains

Chen 2009

Annexe 4 : Exemple d’un calcul d’incertitude obtenu

avec Wincert

Les images suivantes représentent les feuilles de résultats obtenus après l’utilisation du logiciel

Wincert pour la détermination de l’incertitude de mesure. L’exemple pris en considération est la

détermination de la fraction de masse pour la sélénométhionine contenue dans l’échantillon de

SELM-1 après l’application du protocole A pour extraire SeMet.

Page 1 : Paramètres pris en considération pour l'in certitude de mesure accompagné de leur

incertitude-type

264

Page 2 : Suite des paramètres pris en considération , détails des fonctions utilisées comme modèles

mathématiques accompagnées de leur résultat et de l eur incertitude, et début des poids des

paramètres sur les différents résultats

265

Page 3 : Suite des détails des paramètres important s sur les différents résultats

266


267


268


269

Annexe 5 : Equations de la déconvolution des profil s

isotopiques

273

Les calculs présentés dans cette annexe sont repris de l’article publié par Meija et al. (2006) et

appliqué à notre cas de figure : DI menée avec l’ajout d’un étalon marqué en méthylmercure sur la

masse 200, l’ajout d’un étalon marqué en mercure inorganique sur la masse 202 et utilisation de la

masse 201 comme isotope de référence pour l’échantillon.

Deux conversions sont étudiées : la déméthylation (nommée α) et la méthylation (nommée β)

telles que :

++

←→ 2HgMeHg

β

α

En considérant :

- ki

jm , la masse associée à l’isotope i pour le composé j pouvant provenir de l’étalon en MeHg+,

celui en Hg2+, de l’échantillon (éch) ou du mélange (m) en fin de DI et pour l’espèce k, exprimée

en masse de mercure (et non pas en masse de l’espèce)

- ijA l’abondance associée à l’isotope i pour le composé j et exprimée en fraction de masse (et

non pas en fraction de mole)

- ki

mI , l’intensité mesurée à l’ICP-MS pour le mélange (m) et associée à l’isotope i et à l’espèce

k

- s le coefficient de sensibilité de l’ICP-MS qui relie les intensités mesurées aux abondances

isotopiques du mélange.

Alors, dans le mélange de la DI, la masse de mercure présente sous la forme de méthylmercure

est égale à la somme des masses issues : de la présence de l’étalon marqué en MeHg+ après sa

déméthylation, de l’étalon marqué en Hg2+ après sa méthylation et de l’évolution des espèces de

l’échantillon, telle que :

+++

+

+

+ =++ MeHgm

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHgmmmm 2 (1)

Si le raisonnement se fait sur chaque isotope, alors l’équation 1 devient :

=

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

MeHgm

MeHgm

MeHgm

MeHgéch

MeHgéch

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

Hg

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHg

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

,202

,201

,200

,202

,201

,200

,202

,201

,200

,202

,201

,200

2

2

2

(2)

274

En exprimant l’équation 2 avec les abondances isotopiques :

=

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

202

201

200

202

201

200

202

201

200

202

201

200

2

2

2

2

m

m

m

MeHgm

éch

éch

éch

MeHgéch

Hg

Hg

HgMeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHgMeHg

MeHg

A

A

A

m

A

A

A

m

A

A

A

m

A

A

A

m (3)

En introduisant dans l’équation 3 les intensités mesurés au sein du mélange pour le

méthylmercure ainsi que le coefficient de sensibilité de l’ICP-MS ainsi que l’équation 1 :

++=

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

MeHgm

MeHgm

MeHgm

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

éch

éch

éch

MeHgéch

Hg

Hg

HgMeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHgMeHg

MeHg

I

I

I

smmm

A

A

A

m

A

A

A

m

A

A

A

m,202

,201

,200

202

201

200

202

201

200

202

201

200

)( 2

2

2

2

2 (4)

L’équation 4 peut se transformer telle que :

(5)

En posant les coefficients représentatifs de la participation de chaque composé tels que :

smmm

ma

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHg

)( 2

1 ++

+

+

+

+

+

++= (6)

smmm

mb

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

Hg

)( 2

2

1 ++

+

+

+

+

+

++= (7)

smmm

mc

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHgéch

)( 2

1 ++

+

+

+

+

++= (8)

Alors l’équation 5 devient :

=

+++

+++

++ +

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

MeHgm

MeHgm

MeHgm

éch

éch

éch

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHgéch

Hg

Hg

Hg

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHgéch

MeHg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

MeHg

I

I

I

A

A

A

smmm

m

A

A

A

smmm

m

A

A

A

smmm

m

,202

,201

,200

202

201

200

202

201

200

202

201

200

)()()( 2

2

2

2

2

2

2

275

=

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

MeHgm

MeHgm

MeHgm

éch

éch

éch

Hg

Hg

Hg

MeHg

MeHg

MeHg

I

I

I

A

A

A

c

A

A

A

b

A

A

A

a,202

,201

,200

202

201

200

1

202

201

200

1

202

201

200

1

2

2

2

(9)

En posant l’équation 9 sous forme matricielle :

=

++

++

++

+

+

+

1

1

1

202202202

201201201

200200200

,202

,201

,200

2

2

2

c

b

a

AAA

AAA

AAA

I

I

I

échHgMeHg

échHgMeHg

échHgMeHg

MeHgm

MeHgm

MeHgm

(10)

La résolution de l’équation 10 s’effectue grâce à une régression linéaire multiple par la méthode

des moindres carrés, effectuée par la fonction « Droitereg » sur une feuille de calcul

Excel (Microsoft®) en fixant le passage des droites par l’origine des axes.

Si ce raisonnement est appliqué aux intensités délivrées par l’ICP-MS pour le mercure

inorganique, le même système d’équations est obtenu, où les coefficients représentatifs de la

participation de chaque composé sont notés

2

2

2

c

b

a

.

La connaissances des facteurs

1

1

1

c

b

a

et

2

2

2

c

b

a

permet de remonter aux taux de déméthylation (α) et

de méthylation (β) ainsi qu’aux valeurs initiales de MeHg+ et Hg2+ présentes dans l’échantillon

avant leur conversion.

Avec :

+

+

+

+

=MeHg

Hg

MeHg

MeHg

m

m

b

a

21

1 (11)

+

+

+

+

= 2

2

2

2

2

Hg

Hg

Hg

MeHg

m

m

b

a (12)

276

Or, ces masses sont reliées aux quantités initialement introduites au cours de la DI telles que :

)1( α−= +

+

+ MeHg

MeHg

MeHgmm (13)

β+

+

+ = 22 Hg

MeHg

Hgmm (14)

α+

+

+ =MeHg

Hg

MeHgmm

2

(15)

)1(2

2

2 β−= +

+

+ Hg

Hg

Hgmm (16)

En introduisant les équations 13 et 14 dans l’équation 11, et en opérant de même pour 15 et 16

dans 12 :

βα

+

+ −=

2

)1(

1

1

Hg

MeHg

m

m

b

a (17)

)1(22

2

βα

−=

+

+

Hg

MeHg

m

m

b

a (18)

Ce système consiste à résoudre deux inconnus avec deux équations. Les coefficients de

conversions des espèces (α et β) sont ainsi déterminés.

En opérant avec le même raisonnement sur les facteurs associés à l’échantillon :

+

+

+

=MeHgéch

MeHg

MeHg

m

m

c

a

1

1 (19)

+

+

+

= 2

2

2

2

2Hgéch

Hg

Hg

m

m

c

b (20)

277

Or les masses associées à l’échantillon sont corrélées avec celles initialement présentes avant la

conversion des espèces telles que :

βα initHgéch

initMeHgéch

MeHgéch mmm ,, 2

)1(+++

+−= (21)

αβ initMeHgéch

initHgéch

Hgéch mmm ,, )1(

22 +++

+−= (22)

En introduisant les équations 13 et 21 dans l’équation 19, et 16 et 22 dans 20 :

βα

αinitHg

échinitMeHg

éch

MeHg

mm

m

c

a,,

1

12

)1(

)1(++

+

+−

−= (22)

αβ

βinitMeHg

échinitHg

éch

Hg

mm

m

c

b,,

2

2

)1(

)1(2

2

++

+

+−

−= (23)

De nouveau, il est obtenu un système de deux équations avec deux inconnus permettant de

déterminer les masses de chaque espèce initialement présentes au sein de l’échantillon. Les

connaissances de la quantité d’échantillon utilisée pour la DI et de son taux d’humidité permettent

la détermination de la fraction de masse associée à chacune des espèces dans l’échantillon et

corrigée des conversions.

278

Annexe 6 : Publications et communications sur ces

travaux de thèse

281

Articles publiés ou à paraître :

- Développement de l’analyse de spéciation du sélénium dans des compléments alimentaires

S. Sannac, F. Pannier, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier

Accepté et à paraître dans La Revue Française de Métrologie

- Development of a reference procedure for the determination of methylmercury in fish products

S. Sannac, P. Fisicaro, F. Pannier, G. Labarraque, M. Potin-Gautier

Accreditation and Quality Assurance, 2009, 14, 263-267

- Validation of a reference measurement procedure for the assessment of selenomethionine in

nutritional supplements

S. Sannac, F. Pannier, C. Oster, G. Labarraque, P. Fisicaro, M. Potin-Gautier,

Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2009, 24, 237-241

Actes de congrès :


P. Fisicaro, S. Sannac, G. Labarraque, F. Pannier, M. Potin-Gautier

International Conference on Metrology of Environmental, Food and Nutritional Measurements,

Budapest (Hongrie), septembre 2008

- Importance de la préparation de l’échantillon pour une analyse de spéciation du sélénium par

HPLC-ID-ICP-MS.

Détermination d’incertitudes du rendement d’extraction au résultat sur la sélénométhionine

S. Sannac, C. Oster, G. Labarraque, G. Hervouët, F. Pannier, M. Potin-Gautier

13ème Congrès International de Métrologie, Lille (France), juin 2008

Communications orales :


P. Fisicaro, S. Sannac, G. Labarraque, F. Pannier, M. Potin-Gautier

International Conference on Metrology of Environmental, Food and Nutritional Measurements,

Budapest (Hongrie), septembre 2008

282

- Development of a reference method for the analysis of selenomethionine in selenized yeasts


4th International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutritional and

Environmental Sciences, Munich (Allemagne), mai 2008

- Importance de la préparation de l’échantillon pour une analyse de spéciation du sélénium par

HPLC-ID-ICP-MS.

Détermination d’incertitudes du rendement d’extraction au résultat sur la sélénométhionine


13ème Congrès International de Métrologie, Lille (France), juin 2007

- Evaluer les incertitudes lors d’analyses de spéciation par HPLC-ID-ICP-MS, application au

sélénium présent dans des levures


Spectr’Atom, Pau (France), mai 2007

Communication par affiche :

- Development of a reference method for speciation analysis of methylmercury in fish by HPLC-

ICP-MS and specie specific isotope dilution


European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry, Graz (Autriche), février 2009

283

285

Titre : Développement d’un protocole métrologique pour l’analyse de spéciation du sélénium et du

mercure dans des matrices environnementales et agroalimentaires par HPLC-ID-ICP-MS.

Mots clés : spéciation, sélénium, mercure, métrologie, traçabilité, HPLC, ICP-MS, dilution

isotopique.

Résumé : Les éléments pouvant se rencontrer sous différentes formes chimiques, la pleine

évaluation de leur impact passe par la quantification de leurs diverses espèces, en d’autres termes

par la réalisation de leur analyse de spéciation. Au niveau de la législation, cette notion commence

à être prise en compte ce qui entraîne des besoins dans la qualité et la fiabilité de ces analyses.

En association avec l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, le Laboratoire National de

Métrologie et d’Essais a donc développé des méthodes qui assurent la relation des mesures au

Système International des unités, c’est à dire leur traçabilité métrologique.

Ce mémoire de thèse présente la mise en place d’un protocole métrologique pour la réalisation

d’une analyse de spéciation. Son application a été réalisée à la mesure de la sélénométhionine

dans des échantillons représentatifs de l’apport en sélénium et pour la détermination du

méthylmercure dans des produits de la mer, caractéristiques de l’exposition au mercure. La

traçabilité des analyses est assurée par i) l’utilisation de la double dilution isotopique comme

méthode de dosage, et ii) le calcul des incertitudes de mesures.

Title : Development of a metrological procedure for the speciation analysis of selenium and

mercury in environmental and food samples by HPLC-ID-ICP-MS.

Abstract: Speciation analysis, i.e. the identification, quantification and characterisation of the

chemical forms of a given element, is one of the key challenges of modern analytical chemistry.

With the legislation evolution, the needs for the achievement of reliable results are required. In

collaboration with the University of Pau, LNE, the French Metrology Institute, has developed

procedures that enable the link of results to the SI units, i.e. metrological traceability.

The work presented in this memory is centred on the development of a metrological procedure for

the realisation of speciation analysis. Appliances are made for the evaluation of selenomethionine

content in samples representative of the selenium intake and for the assessment of methylmercury

in sea products, emblematic of the mercury exposure. Traceability is reached by i) the involvement

of double isotope dilution as the quantification method and ii) the calculation of measurement

uncertainties.

Documents

Thèse : Développement d un protocole métrologique … · Remerciements Le travail que j’ai le plaisir de vous présenter au travers ce manuscrit est le fruit de nombreuses contributions