UNIVERSITE PARIS XI FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD

Année 2008/2009

N° attribué par la bibliothèque

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE PARIS XI

Champ disciplinaire : Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire

École Doctorale de rattachement : « Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé » (0418)

Présentée et soutenue publiquement

par

Ophélie PHILIPOT

Le 21 Octobre 2009

Titre :

Coopération entre le facteur de transcription CBF (Runx1-CBFβ) et le facteur myogénique MyoD dans la régulation de l’équilibre prolifération-différenciation musculaire

Directeur de Thèse : AIT-SI-ALI Slimane

JURY Président : Pr AUCLAIR Christian Rapporteur : Dr VANDEL Laurence

Rapporteur : Dr DELVA Laurent Examinateur : Pr WEITZMAN Jonathan

Directeur de thèse : Dr AIT-SI-ALI Slimane

A Patrick e t Annie ,

Table des matières REMERCIEMENTS i

LISTE DES FIGURES iii

LISTE DES ABREVIATIONS iv

AVANT-PROPOS 1

CHAPITRE I 2

LE MUSCLE SQUELETTIQUE 2

I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE MUSCLE STRIE 2 I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié 2 I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées 2 I.1.2 Les cellules satellites 3 I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire 4 II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES 4 II.1 Mise en évidence des MRFs 4 II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au cours de la myogenèse embryonnaire 5 II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs 6 II.4 Relation structure/ fonction des MRFs 8 II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation avec les protéines E 8 II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité des MRFs 9 II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes 10 II.5.1 La sortie du cycle prolifératif 11 II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle 11 III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE MUSCLE 12 III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les myoblastes proliférants 12 III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire 12 III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs 14 III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression épigénétique de ses gènes cibles 15 III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale 18 III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21 et la cycline D3 18 III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à l’ADN 20 III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation musculaire 20 III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21

IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT DE SON INNERVATION 25 IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites 25 IV.2 Le muscle adulte est régulé par son innervation 26

CHAPITRE II 29

LE FACTEUR DE TRANSCRIPTION RUNX1/CBFβ 29

I. INTRODUCTION : DECOUVERTE DE LA FAMILLE DE PROTEINES A DOMAINE RUNT ET CBFβ 29 II. EXPRESSION ET FONCTION DE RUNX1 ET CBFβ 31 II.1 Fonctions biologiques de Runx1 et de la sous-unité CBFβ chez les mammifères 31 II.2 Organisation génomique de Runx1 et CBFβ 34 II.2.1 Les deux promoteurs de Runx1 et l’épissage alternatif de son ARNm sont à l’origine de ses nombreuses isoformes 34 II.2.2 La protéine CBFβ et ses isoformes 36 II.3 Relation Structure/ Fonction 37 II.3.1 La sous-unité protéique Runx1 37 II.3.2 La sous-unité protéique CBFβ 40 III. REGULATION DE L’ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION CBF 41 III.1 Régulation positive de l’activité de transactivation de Runx1 42 III.2.1 Phosphorylation, acétylation et méthylation de Runx1 42 III.2.2 Modulation de l’activité de Runx1 par la MAP kinase ERK 43 III.2 Régulation négative de l’activité de Runx1 44 III.2.1 Groucho/TLE 44 III.2.2 mSin3A et les HDACs 45 III.2.3 HMTs 46 III.3 Régulation de la formation du dimère fonctionnel CBF par la localisation subcellulaire des sous-unités Runx1 et CBFβ 46 IV. CBF DANS LE CONTROLE DE L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION 47 IV.1 Régulation croisée entre CBF et les régulateurs du cycle cellulaire 47 IV.1.1 CBF accélère la phase G1 et stimule l’entrée en phase S 47 IV.1.2 Régulations croisées entre les régulateurs du cycle cellulaire et Runx1 48 IV.2 CBF et l’équilibre prolifération-différenciation 50

PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE 53

CONTEXTE 53 PROBLEMATIQUE 54

ARTICLE DE RECHERCHE 55

DISCUSSION DES RESULTATS 77

Validation de la stratégie d’approche 77

Identification de Runx1-CBFβ au sein du complexe MyoD 77 MyoD interagit avec CBF via la sous-unité Runx1 78 MyoD et CBF interagissent ensemble dans les myoblastes murins, préférentiellement en prolifération 79 CBF est recruté sur les gènes cibles de MyoD préférentiellement dans les cellules musculaires en prolifération, et non en différenciation 79 Le facteur CBF régule négativement la différenciation musculaire, au profit de la prolifération cellulaire 80 Dans les myoblastes en prolifération, CBFβ est associé à des répresseurs et inhibe le remodelage de chromatine sur les gènes cibles de MyoD après induction de la différenciation 82 Conclusion et Modèle 83

DISCUSSION GENERALE & PERSPECTIVES 84

I. Régulation de la translocation de CBFβ dans le noyau des myoblastes 84 II. CBFβ dans le cytoplasme : un rôle de senseur ? 87 III. Runx1, CBFβ et MyoD : un rôle dans la différenciation ostéoblastique ! 87 IV. Les variants d’épissage de Runx1 pourraient être à l’origine d’une double fonction : le contrôle de la prolifération et de la différenciation musculaire 90

MODELISATION & CONCLUSION 93

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 95

ANNEXE 1 117

Article de revue 1 118

ANNEXE 2 130

Article 2 131

ANNEXE 3 141

Article 3 142

ANNEXE 4 151

Curriculum Vitae 152

i

Remerciements Je tiens vivement à remercier le Pr Christian Auclair d’avoir accepté d’être le président du Jury de

ma thèse. Également merci aux Drs Laurence Vandel et Laurent Delva d’avoir été rapporteurs de

ma thèse et de m’avoir aider à améliorer ce manuscrit. Enfin, un grand merci au Pr Jonathan

Weitzman, mon directeur d’unité, qui me fait l’honneur d’être examinateur de ma thèse.

Ma dernière année de thèse a été ponctuée par l’installation de mon équipe sur le campus de

l’université Paris-Diderot, au sein de l’unité « Epigénétique et Destin Cellulaire » dirigé par le Pr

Jonathan Weitzman. Jonathan, j’admire ta manière de créer cette cohésion et cette dynamique dans

notre unité. Malgré ton busy schedule, tu trouves toujours le temps d’écouter et de conseiller.

Un merci tout particulier à Pierre-Antoine Defossez, aka Mr Management. Merci pour tes livres, pour

ton temps précieux, tes conseils et tes astuces. Grâce à tout ça, je ne me suis fait que partiellement

ensevelir par la préparation de ma thèse. Ouf !

Ensuite, un grand merci à mon laboratoire d’accueil, littéralement ma deuxième maison pendant ma

thèse. Slimane, je tiens à te remercier pour tous nos échanges. Lancer ma thèse en même temps que

l’installation de ton labo était un pari risqué. Aujourd’hui c’est un pari gagné et je ne suis pas peu

fière d’avoir survécu à l’aventure ! Plus qu’un enseignement scientifique, c’est une leçon de vie que

j’ai apprise dans ton équipe. Alors, du fond du cœur : « Merci ! ». Mes manips ont largement profité

du savoir-faire de nos deux « experts » au laboratoire, Lolo et Phiphi ! Merci pour tous vos conseils

techniques et votre temps. Je tiens également à remercier Véronique, pourtant à peine arrivée dans

l’équipe. Sa bonne humeur contagieuse m’a permis de positiver jusqu’au bout de l’aventure. Et puis

il y a Aurélie avec qui ce n’était franchement pas gagné, mais qui finalement s’est révélée

indispensable pour ma santé mentale sur la dernière ligne droite. Merci un million de fois : parce

que tu sais râler avec classe, pour « l’escalator » , pour les fous rires, et pour ta playlist bien moisie.

Enfin, je n’oublie pas ma petite Céline, la meilleure stagiaire du monde entier : ma petite

padawanette, je sais que tu iras loin ! Tu as fait un boulot fantastique sur le projet. Merci pour ton

investissement, tes lumières, ton soutien, ta sagesse, tes sourires et ta bonne humeur quotidienne.

ii

Je n’oublie pas mon premier labo dirigé par le Dr Annick Harel-Bellan, où s’est déroulée la majeure

partie de ma thèse! Merci à tous ceux qui ont pris le temps de résoudre mes problèmes techniques

et qui m’ont wisely conseillé, je pense notamment à Jacques, Sylvain, Anna…

Un merci tout particulier aux « nénettes », Corinne et Cathy, pour les ragots, les imitations et les

fous rires ! Et à ma Nora, celle qui a suivi de très près mes péripéties au lab et qui a toujours été là

sans que je ne lui demande rien. Merci à mon rital préféré, Néri, toujours là prêt à sauter du Pont

Neuf avec moi quand la qPCR a foirée! Merci à Sélim, mon coach sportif et détente: entre la piscine

à l’aube les samedi mat’, les cours de salsa, les randos rollers et les après-midi bronzette, que de

bons souvenirs! Je sais que tu es entre de bonnes mains avec Anna et il me tarde d’assister à ta

soutenance de thèse !

Merci à ma nouvelle famille sur le campus de Paris-Diderot. Alors, à mes coacheuses shopping :

Sandra, Mélanie et Fabienne. Merci pour vos tips pour ne pas me perdre dans Manhattan et profiter

des bonnes affaires !! Après il y a mes fans, enfin, mon unique fan : merci Andrew de soutenir avec

autant d’enthousiasme ma carrière cinématographique. Tu peux prendre rendez-vous avec mon

attachée de presse A. Marchand pour une interview. Thank you Guillaume pour ton optimisme et tes

blagounettes ; si t’es sage, je te léguerai mon collier de Stone-Age. Ensuite, un petit mot gentil pour

Mika : n’oublie pas de m’inviter à ta crémaillère ! J’ai encore oublié de remercier Damien : merci de

me prévenir avant d’aller manger, c’est mieux qu’après ! Merci Florent pour la bonne ambiance et tes

communiqués de choc. Au fait, ya Heidi qui veut que je lui rende sa veste en poil de renard

synthétique, merci de m’avoir balancé ! Enfin, ma chère Ryma, je te remercie pour nos petites

discussions privées et aussi pour tes superbes compliments (je rigole encore pour le coup des

Oscars !). Et pour finir, je lance un énorme merci à tous ceux que je n’ai pas cités mais qui ont été là

à un moment ou à un autre et qui contribuent à la bonne ambiance de notre unité.

Je remercie aussi ceux qui n’ont rien à voir avec le lab, mais sans qui j’aurai pris le premier TGV

pour rentrer à la maison. Et bien ça y est, vous pouvez enfin me demander : alors cette thèse, tu la

finis quand ? Mais il te reste encore combien d’années ? C’est normal que ce soit si long ? Et bien,

« Guess what everybody ?! I did it!… and please, call me Doc’ ! »

Enfin, merci à « toi, toi, mon toi ». Merci pour cette patience dont je n’ai jamais entrevu les limites.

Tu as contribué à faire de cette année la meilleure des quatre… et de loin ! J’admire ton optimisme,

ton énergie, ta bonne humeur, tes beaux yeux bleus… et tout le reste!

iii

Liste des figures Figure 1 : Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique 3

Figure 2 : Structure du muscle strié (ou squelettique) 4

Figure 3 : Mise en place du muscle strié 5

Table 1 : Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés 6

Figure 4 : Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2 8

Figure 5 : Domaines fonctionnels de MyoD 9

Figure 6 : La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes 11

Figure 7 : Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire 13

Figure 8 : Modifications post-traductionnelles de MyoD 14

Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire 14

Figure 10 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 15

Figure 11 : Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie de

différenciation terminale 18

Figure 12 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21

Figure 13 : Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme 25

Figure 14 : Organisation des différents lignages hématopoïétiques 32

Figure 15 : Organisation du gène RUNX1 humain 34

Figure 16 : Structure génomique et variants d’épissage de CBFβ 36

Figure 17 : Structure du complexe formé du domaine runt de Runx1, CBFβ et l’ADN 37

Figure 18 : Domaines fonctionnels de la protéine Runx1 38

Figure 19 : Interaction particulière entre Runx1 (humain) et Ets-1 sur le site composite PBS

(PEBP2 binding site) et les site EBS (Ets binding site) 39

Figure 20 : Changement de conformation de Runx1 après dimérisation avec CBFβ 40

Figure 21 : Runx1 associé à ses coactivateurs et ses corépresseurs 42

Figure 22 : Cascade de phosphorylation initiée par Runx1/p300 43

Figure 23 : Modélisation des résultats 83

Figure 24 : Représentation des rôles possibles pour MyoD, Runx1 et CBFβ dans le muscle

présentés dans la discussion 93

Figure 25 : Diagramme du projet de recherche proposé par le Dr Slimane AIT-SI-ALI 94

iv

Liste des abréviation

ACh : acétylcholine

Ala : alanine

ALP : phosphatase alcaline

AML : acute myeloid leukemia

ARNi : ARN interférence

APC : anaphase promoting complex

Asp : asparagine

bHLH : basic helix loop helix

Bgb : Big brother

BMP : bone morphogenetic protein

BSP : bone sialo protein

Bro : Brother

CamK : Ca2+/calmodulin-dependent protein

kinase

CARM1 : coactivator-associated arginine

methyltransferase 1

CBF : core binding factor

CBP : creb binding protein

Cdk : cycline dependent kinase

ChIP : chromatin immunoprecipitation

CKI : cyclin-dependent kinase inhibitor

CREB : cAMP-responsive element binding

protein

EC : mouse embryonal carcinoma cells

EGF : epithelium growth factor

ERK : extracellular signal-regulated kinases

FAB : French-American-British classification

FGF : fibroblast growth factor

GRIP1 : glucocorticoid receptor interacting

protein 1

HA : Hemaglutinine

HAT : histone acétyltransférase

HDAC : histone désacétylase

HGH : hepatocyte growth factor

HIPK : homeodomain-interacting protein

kinase

HLH : helix loop helix

HMT : histone méthyltransférase

HP1 : heterochromatin protein 1

IGF1 : insulin-like growth factor 1

IL-3 : interleukine-3

IRES : internal ribosomal entry site

Jak : kinase Janus

MAPK : mitogen-activated protein kinase

MCK : muscle creatine kinase

Mef2 : myogenic enhancer factor 2

MHC : myosin heavy chain

MPC : muscle precursor cells

MRF : myogenic regulatory factor

NAD : Aldehyde dehydrogenase

NCAM : Neural Cell Adhesion Molecule

N-CoR : nuclear receptor corepressor

NLS : nuclear localisation signal

NMTS : nuclear matrix targeting sequence

v

NRDBn/c : negative regulatory region for

DNA binding N/C-terminal to the runt

domain

NRHn/c : negative regulatory region for

heterodimerisation N/C-terminal to the runt

domain

OCN : ostéocalcine

ORN : olfactory receptor neurons

Osx : osterix

PCAF : p300/CBP associated factor

PE : Py enhancer

PEBP2 : Py Enhancer Binding Protein 2

PRMT : protein-arginine N-methyltransferase

Py : polyomavirus

RD : runt domain

SMMHC : smooth muscle myosin heavy chain

SMRT : silencing mediator of retinoic acid and

thyroid hormone receptor

SRA : steroid receptor RNA activator

STAT : signal transducer and activator of

transcription

SWI/SNF : switch/sucrose non fermentable

TAD : transactivation domain

TCR : T-cell receptor

TGFβ : tumor growth factor beta

TLE1 : transducin-like enhancer of split

Thr : thréonine

1

Avant-propos Une cellule peut être dans divers états physiologiques comme la prolifération, la

différenciation, l’apoptose, la sénescence ou la quiescence. L’orientation d’une cellule vers

l’une ou l’autre de ces voies doit être minutieusement contrôlée. En particulier, l’équilibre

prolifération-différenciation de la cellule est fondamental pour maintenir l’intégrité des tissus.

Il existe d’ailleurs de nombreuses pathologies graves associées à une dérégulation de cet

équilibre. L’objectif principal de mon projet de thèse est de mieux comprendre comment

l’équilibre prolifération-différenciation est régulé dans la cellule et pour cela nous avons utilisé

comme modèle d’étude le muscle strié, où la différenciation terminale est bien caractérisée.

Dans le muscle strié, la prolifération et la différenciation sont mutuellement exclusives : l’arrêt

de la prolifération est requis pour permettre aux cellules de s’engager dans le processus de

différenciation terminale. Ainsi, les régulateurs positifs de la différenciation terminale sont

généralement des répresseurs de la prolifération.

Dans le premier chapitre de ce manuscrit, je présente les caractéristiques du muscle

squelettique. J’y décris sa structure, la manière dont il se met en place au cours du

développement embryonnaire, les facteurs de transcription majeurs impliqués, l’équilibre

prolifération-différenciation régulé par le facteur myogénique MyoD et, enfin, la régénération

du muscle adulte et sa régulation par innervation.

Dans un deuxième chapitre, je présente un facteur de transcription connu pour son rôle au

cours du développement : le facteur CBF (formé du dimère Runx1 et CBFβ). Comme il sera

décrit plus tard dans mes résultats, pour la première fois, je montre que ce facteur de

transcription, initialement non-apparenté au muscle strié, joue de fait un rôle clé dans la

régulation de l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique.

INTRODUCTION

2

Chapitre I Le Muscle Squelettique

I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE

MUSCLE STRIE

I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié Il existe trois types de cellules constituant le muscle strié (ou « muscle squelettique ») : les

cellules extra fusales, majoritaires et également appelées cellules musculaires striées, les cellules

satellites, et les cellules du fuseau neuromusculaire.

I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées

Le muscle squelettique fait partie des muscles à contraction volontaire, contrairement aux

muscles lisse et cardiaque, et il ne se contracte normalement qu’en présence de stimulation

nerveuse. Il y a deux types de cellules musculaires striées en proportion variable chez

l’Homme : les muscles de type I qui sont les muscles à contraction lente mais durable et les

muscles de type II qui sont les muscles à contraction rapide mais courte. La différenciation

du muscle en type I ou II dépend du motoneurone qui les innerve. Dans les gros muscles des

membres, les petites unités lentes sont les premières recrutées dans la plupart des

mouvements ; elles résistent bien à la fatigue et sont les plus fréquemment utilisées. Les

unités rapides se fatiguent plus vite et sont généralement sollicitées pour les mouvements plus

rigoureux.

Les myotubes qui constituent les cellules musculaires fonctionnelles, dérivent des cellules

progénitrices du muscle, également appelées MPCs (Muscle Progenitor Cells). Pour donner

naissance aux myotubes, ces MPCs subissent d’abord une étape de détermination qui les

convertit en myoblastes (figure 1). Contrairement aux myotubes, les myoblastes ont encore la

Figure 1. Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique.

Après l’induction de MyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices du muscle (MPCs) sontengagées dans le lignage musculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires(myogénine et MRF4) induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes, quiexpriment alors les protéines spécifiques du muscle et fusionnent en myotubes multinucléés.Les myotubes subissent finalement une dernière étape de maturation, avec notamment leurinnervation par les motoneurones, pour donner les myofibres striées.Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004.

Progéniteurmusculaire

(MPC)

Myofibremature

Myotubeprécoce

Myoblaste

Détermination MaturationDifférenciation

3

possibilité de se diviser, en revanche, ils ne sont plus multipotents, c’est-à-dire qu’ils sont

déterminés à se différencier en muscle. Sous l’influence de signaux extérieurs, les myoblastes

se différencient, c’est-à-dire qu’ils sortent du cycle prolifératif, expriment des protéines

spécifiques du muscle comme la créatine kinase musculaire (MCK) ou la chaîne lourde de la

myosine (MHC), et fusionnent entre eux, donnant ainsi naissance aux myotubes (figure 1).

Les myotubes subissent finalement une étape de maturation pour donner les fibres

musculaires striées.

Chaque fibre musculaire striée résulte donc de la fusion de plusieurs dizaines de cellules

musculaires appelées myoblastes. La cellule musculaire striée est une cellule très spécialisée,

très allongée (jusqu’à 50 cm de longueur) et de forme cyclindrique (10 à 50 µm de diamètre) :

c’est pourquoi on parle également de fibre musculaire. Chaque fibre individuelle qui forme le

muscle squelettique représente une unité de base du système musculaire. Elle possède une

centaine de noyaux situés en périphérie. La plus grande partie du cytoplasme de ces cellules

(appelé également sarcoplasme ou myoplasme) est constituée de milliers de myofibrilles

organisées en faisceaux. Une myofibrille est constituée de petits cylindres allongés dans le

sens de la cellule et qui donne son aspect strié à la cellule musculaire squelettique : ce sont les

sarcomères, véritables unités contractiles de la cellule musculaire striée (figure 2). Le

sarcomère est constitué de myofilaments fins d’actine et de myofilaments épais de myosine

orientés selon le grand axe de la myofibrille. Dans le cytoplasme restant, se trouvent

notamment du glycogène, des mitochondries, le réticulum endoplasmique lisse et l’appareil de

Golgi. La fibre musculaire est limitée par une membrane plasmique, appelée sarcolemme,

entourée par une membrane basale.

Afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la différenciation musculaire terminale sans être

gêné par des cellules non-musculaires dans l’interprétation des résultats, la lignée de

myoblastes murins C2C12 a été isolée et caractérisée (Blau et al, 1985; Yaffe & Saxel, 1977).

Les myoblastes C2C12 sont devenus un outil de prédilection pour l’étude de la différenciation

musculaire ex vivo et ont permis de mieux caractériser la différenciation musculaire et

d’étudier notamment l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique. Cette

lignée a la capacité à se différencier rapidement et à produire des myotubes contractiles

exprimant des protéines caractéristiques du muscle.

I.1.2 Les cellules satellites

Les cellules satellites sont une population de cellules mononucléées et indifférenciées. Elles

s’attachent à la surface de chaque fibre musculaire au niveau du sarcolemme, avant que la

Figure 2. Structure du muscle strié (ou squelettique).

Le muscle squelettique est formé de plusieurs faisceaux de fibres musculaires. Chaque faisceaucomprend plusieurs milliers de fibres musculaires. Une fibre musculaire résulte de la fusion deplusieurs centaines de cellules musculaires appelées myoblastes. En fusion, les myoblastesforment d’abord des myotubes qui sont des cellules multinucléées. Après une étape dematuration, les myotubes deviennent des myofibres. Les myofibres (ou fibres musculaires) sontcaractérisées par leur aspect strié. La striation est due à l’alternance des myofilaments d’actine etde myosine à l'intérieur de la fibre. La zone où les myofilaments fins d’actine d’un sarcomère sechevauchent avec les filaments d’actine du sarcomère suivant se trouvent les stries Z. Lesarcomère, véritable unité contractile de la fibre musculaire, est délimité par deux stries Z.Image adaptée de http://t.verson.free.fr/PHYSIOLOGIE/PHYSIOLOGIE_EXERCICE

Faisceaux de fibresmusculaires

Fibre musculaire(cellulemusculaire)composée demyofibrilles

VaisseauxsanguinsNoyau de

la cellulemusculaire

Myofibrillecomposée defilaments d’actine etde myosine

Filament d’actine

Filament de myosine

Stries Z

Stries Z

Sarcomère

4

lame basale n’entoure à la fois la cellule satellite et la fibre musculaire. Il y a environ une à

cinq cellules satellites pour cent noyaux d’une fibre musculaire. Dans le muscle adulte, les

cellules satellites interviennent durant l’hypertrophie musculaire liée à l’exercice et au cours de

la régénération suite à une blessure, une dénervation ou l’absence de fonctionnement. En

effet, bien que les cellules satellites soient mitotiquement quiescentes chez l’adulte, elles

peuvent retrouver leur capacité à proliférer lors d’un stress ou d’un traumatisme, permettant

la croissance et la régénération du muscle. L’équilibre entre la quiescence, l’activation des

cellules satellites et l’induction de leur différenciation pour former de novo une fibre musculaire

sera développé dans la dernière section de ce chapitre.

I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire

L’innervation du muscle est importante pour sa mise en place et son maintien dans le muscle

adulte. L’absence d’innervation du muscle conduit d’ailleurs à la destruction progressive de la

fibre musculaire. L’importance de l’innervation du muscle pour le maintien de son intégrité

sera présentée dans la dernière section de ce chapitre.

Les fuseaux neuromusculaires comportent des cellules intra fusales (cellules striées modifiées,

spécialisées), des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins. Ce sont des formations allongées

dans le même sens que les cellules musculaires striées et sont répartis à l’intérieur de la partie

charnue du muscle. Chacun est délimité par une capsule conjonctive. Les cellules musculaires

intra-fusales constituent des mécanorécepteurs qui renseignent sur le degré d’étirement ou de

contraction du muscle. Elles sont de deux types : cellules musculaires à sac (qui renseignent

sur la vitesse de variation de la longueur du muscle) et cellules musculaires à chaîne (qui

codent en plus pour la longueur instantanée du muscle). Dans les deux cas, la partie

contractile de ces fibres se situe à leurs deux extrémités et la partie centrale reçoit

l’innervation afférente. L’allongement de la partie centrale des fibres est à l’origine d’une

déformation mécanique des terminaisons sensorielles qui s’enroulent dans cette région. Cela

entraîne un potentiel de récepteur qui remonte vers la moelle épinière et le cortex pariétal.

II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES

II.1 Mise en évidence des MRFs Les “Myogenic Regulatory Factors”, ou MRFs, ont été mis en évidence pour la première fois

grâce à des expériences de traitement des fibroblastes par un agent déméthylant de l’ADN, la

5-azacytidine. En effet, le traitement à la 5-azacytidine des fibroblastes induisait

Figure 3. Mise en place du muscle strié.

Pendant le développement, les cellules souches mésodermiques s’engagent dans un desmultiples lignages cellulaires possibles, notamment dans le lignage musculaire. L’expression dePax3 dans les cellules progénitrices contribue à l’expansion myogénique. Après l’induction deMyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices mésodermiques sont engagées dans le lignagemusculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires (myogénine et MRF4)induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes en myocytes. Finalement, lafusion des myocytes donne naissance aux myotubes multinucléés qui subiront une dernièreétape de maturation avec notamment leur innervation par les motoneurone, pour donner lesmyofibres striées. Pendant la phase plus tardive de de la myogenèse embryonnaire, unepopulation cellulaire distincte des myoblastes et dérivée des cellules satellites du muscle,fusionne avec la fibre musculaire existante permettant ainsi à la fibre musculaire de s'accroitre.Certaiens cellules satellites restent associées aux myofibres, sous une forme quiescentes et dansun état indifférencié. L’origine embryonnaire des cellules satellites n’est pas bien connue à cejour. Cependant, l’expression de Pax7 est nécessaire pour la spécification et l’expansion de lapopulation de cellules satellites. FC : facteurs de croissance.Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004.

Progéniteurmésodermique

Myogénine,p21, Rb, Mef2

Cyline D1Rb-P

Myofibremature

Myotubeprécoce

Myoblaste

Déterminationmyogénique

Evénements plustardifs de la

différenciation(« innervation »)

Myogénine,MRF4

FC

Id, Pax3MyoDMyf5

MyocytesCellulesomitiquemésoder-

mique

Sortie du cycleprolifératif

Expression desgènes spécifiques

du muscle

BMP4

WntsShh

Noggin

5

spontanément leur conversion en myoblastes, qui pouvaient alors entrer en pseudo-

différenciation musculaire terminale en absence de signaux mitogènes. Un criblage

différentiel entre les fibroblastes traités ou non-traités à la 5-azacytidine a permis d’isoler le

gène MyoD (Davis et al, 1987). MyoD est un facteur de transcription myogénique puissant

qui, lorsqu’il est exprimé ectopiquement dans des cellules non-musculaires (neurones,

adipocytes, mélanocytes, chondrocytes), est capable de les convertir en myotubes (Choi et al,

1990; Weintraub et al, 1989) ; Davis et al, 1987). Sur la base de ces résultats, le gène MyoD a

été proposé comme un des acteurs principaux dans le développement musculaire. Cette

démarche a permis l’identification de trois autres gènes, myogénine (Edmondson & Olson,

1989; Wright et al, 1989), Myf5 (Braun et al, 1989) et MRF4 (Rhodes & Konieczny, 1989), qui

interviennent aussi dans le développement musculaire. La famille des MRFs est ainsi

composée de quatre membres : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Cette famille de facteurs de

transcription est exclusivement exprimée dans la lignée myogénique.

II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au cours de la myogenèse embryonnaire

Pendant le développement de l’embryon de souris, l’expression de Myf5 est induite dans les

somites dorsaux-médiants (qui donnent plus tard les muscles du tronc et intercostaux), elle

est suivie par l’expression de MyoD dans les somites dorso-latéraux (qui donnent naissance

par la suite aux muscles des membres et de l’enveloppe corporelle). Les voies Wnts, Sonic

hedgehog (Shh) et d’autres voies de signalisation contribuent à la détermination du muscle, en

induisant les expressions de Myf5 et MyoD (pour revue voir (Buckingham, 2001)) (figure 3).

L’expression de MyoD et Myf5 est une étape clé qui marque l’engagement des cellules

somitiques multipotentes dans le lignage myogénique. L’activation de MyoD est retardée dans

les embryons où le gène Myf5 est inactivé, montrant que l’expression de MyoD est initialement

sous le contrôle de Myf5 (Tajbakhsh et al, 1997). Cependant, par la suite MyoD est activé

indépendamment et la myogenèse se déroule normalement avec une localisation correcte des

cellules (Kassar-Duchossoy et al, 2004) (table 1). De même, en absence de MyoD, la

myogenèse se déroule apparemment normalement aussi, bien que les muscles des membres

se forment plus tardivement, certainement en raison du niveau initial insuffisant de Myf5

pour déclencher la différenciation (Rudnicki et al, 1992). Après induction de MyoD,

normalement le niveau de Myf5 diminue. Ainsi, chez les souris dont le gène MyoD est

inactivé, le niveau de Myf5 reste relativement élevé probablement pour pallier l’absence de

MyoD. Dans les doubles mutants Myf5:MyoD (Rudnicki et al, 1993), la myogenèse n’a pas lieu

Pas dedifférenciationterminale.Létalité.

Myogénine

Musculaturenormale

MRF4

Pas de musclesquelettique

MyoD:Myf5

Musculaturenormale

MyoD

Musculaturenormale

Myf5

Phénotypeobservé

Inactivationgénique

Table 1. Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés.

6

et les cellules myogéniques sont absentes (Braun & Arnold, 1996); Petrovick et al, 1998). Ces

expériences mettent en avant le rôle important de MyoD et Myf5 dans la myogenèse.

Le rôle joué par MRF4 pendant la myogenèse est plus compliqué. En effet, MRF4 est

exprimé de manière transitoire dans le myotome de souris au jour E9, en suivant de près

l’expression de Myf5. Son expression disparaît au jour E11,5 et est réinitiée au jour E16 dans

les fibres musculaires en différenciation. MRF4 a donc un rôle à la fois dans la spécification

des somites en progéniteurs myogéniques, mais également au cours de la différenciation

terminale (table 1).

Enfin, la myogénine joue un rôle critique au cours de la différenciation musculaire terminale.

En effet, chez les souris dont le gène myogénine a été inactivé, la deuxième phase d’expression

de MRF4 et la formation des fibres secondaires (Ontell & Kozeka, 1984a; Ontell & Kozeka,

1984b) sont sévèrement compromis (table 1). Chez ces souris, les myoblastes sont présents,

montrant que la myogénine n’est pas requise pour acquisition de l’identité de myoblastes,

cependant la différenciation terminale est fortement compromise (Venuti et al, 1995).

En résumé, ces études d’inactivation montrent que Myf5 et MyoD sont requis pour

l’engagement dans le lignage myogénique, alors que la myogénine joue un rôle critique dans

l’expression du phénotype musculaire final. Enfin, MRF4 participe à ces deux fonctions.

Ainsi, MyoD, Myf5, et dans une certaine mesure MRF4, sont considérés comme des facteurs

d’engagement ou de « détermination», alors que la myogénine est perçue comme un facteur

de « différenciation » uniquement (figure 3).

II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs Parallèlement aux MRFs, une autre famille de facteurs de transcription joue un rôle clé dans

la différenciation musculaire : les protéines de la famille des Myocyte Enhancer Factor 2 (Mef2).

Les protéines Mef2 appartiennent à la famille de facteurs de transcription à domaine MADS

(MCM1, agamous, deficiens, serum response factor) (Yu et al, 1992) et sont induites quand les

myoblastes entrent dans le programme de différenciation terminale (Gossett et al, 1989).

L’inactivation de l’unique gène Mef2 chez la drosophile entraîne une létalité embryonnaire,

ainsi qu’une perte complète de différenciation musculaire dans les trois lignages musculaires

(squelettique, lisse et cardiaque). Cependant, dans ce cas, les myoblastes sont présents et

correctement localisés, ce qui indique que c’est le processus de différenciation terminale et

non de détermination qui est affecté (Bour et al, 1995; Lilly et al, 1995).

7

Chez les mammifères, la famille Mef2 comprend quatre membres, Mef2 A à D, chacun codé

par un gène séparé. Alors que l’expression des MRFs est strictement cantonnée au muscle, les

gènes Mef2 sont exprimés dans une grande variété de tissus et de lignées cellulaires et sous la

forme de nombreux transcrits différents, en raison de leur épissage alternatif. Cependant, les

protéines elles-mêmes et leur activité de liaison à l’ADN semblent limitées aux cellules

musculaires différenciées et aux neurones. Les protéines Mef2 se fixent ainsi sur un site riche

en A/T retrouvé dans les promoteurs et les enhancers de nombreux gènes spécifiques du

muscle : CTA(A/T)4TAG (Gossett et al, 1989).

L’expression ectopique de Mef2 ne permet pas d’induire le programme de différenciation

myogénique in vitro. En revanche, plusieurs éléments permettent de dire que les protéines

Mef2 assistent les MRFs. Ainsi, MyoD et Mef2 interagissent directement in vitro et activent de

manière synergique des gènes rapporteurs contenant des boîtes E et des sites de liaison Mef2

(Molkentin et al, 1995). Les boîtes E sont situées dans la région régulatrice des gènes

spécifiques du muscle, tels que MCK (créatine kinase musculaire), Desmine, Troponine I, et sont

des sites de fixation reconnus par les MRFs. Dans les promoteurs et enhancers des gènes

spécifiques du muscle, les boîtes E sont souvent situées à proximité des sites Mef2, appuyant

encore une fois le rôle coopératif de Mef2 et MyoD pour activer la transcription (Wasserman

& Fickett, 1998). Par exemple, les protéines Mef2 se fixent sur l’enhancer du gène codant pour

MCK et leur présence est nécessaire pour l’activité maximale de cet enhancer (Gossett et al,

1989). Des sites de fixation fonctionnels pour les protéines Mef2 ont également été identifiés

dans les promoteurs de nombreux gènes structuraux des muscles cardiaques et squelettiques.

Certaines études in vitro ont montré que l’activation de certains promoteurs par MyoD

nécessite la présence de deux boîtes E sur lesquelles MyoD se fixe de manière coopérative

(Thomson et al, 1999). Sur les promoteurs cibles de MyoD ne possédant qu’une seule boîte

E, il est possible que la présence d’une boîte Mef2 compense fonctionnellement l’absence

d’une seconde boîte E, facilitant ainsi la fixation de MyoD.

De manière intéressante, Mef2 peut se fixer sur le promoteur de la myogénine et son site de

fixation est nécessaire pour l’activité complète du promoteur (Edmondson et al, 1992). La

capacité de la myogénine à induire l’expression de Mef2, qui en retour régule l’expression de la

myogénine, fournit un mécanisme par lequel ces facteurs s’amplifient et se maintiennent

mutuellement quand les myoblastes entrent en différenciation. Finalement, les protéines Mef2

sont capables de transactiver les gènes MyoD (Leibham et al, 1994; Wong et al, 1994),

myogénine (Cheng et al, 1993; Edmondson et al, 1992) et MRF4 (Black et al, 1995; Naidu et al,

1995). La surexpression de Mef2A peut en effet activer l’expression de MyoD et de la

Figure 4. Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2.

Au cours de la différenciation musculaire, MyoD déjà exprimé dans les myoblastes activel’expression de la myogénine, MRF4 et Mef2. En retour, la myogénine et Mef2 stimulentl’expression de MyoD. MRF4 stimule également l’expression de la myogénine et Mef2.Ensemble, ces boucles d’activation permettent l'amplification efficace des MRFs et des facteursMef2 au cours de la différenciation terminale.

SignauxExternes

Facteurs decroissance

MyoD

Myf5

Détermination Différenciation

Myog

Activation

Inhibition

Myf5MRF4

Mef2

Myog MRF4

8

myogénine, et réciproquement l’expression des MRFs dans des cellules non-musculaires induit

l’activité des protéines Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). Ceci tend à montrer que les membres

de la famille Mef2 interviennent dans le maintien et l’amplification de l’expression des MRFs

(figure 4). Il a été précédemment montré qu’une boucle d’autorégulation des MRFs existe et

qu’elle repose en partie sur les MRFs eux-mêmes. Notamment, l’expression ectopique de

MyoD active l’expression de la myogénine de manière directe (Hollenberg et al, 1993; Thayer et

al, 1989). MyoD est également capable de se fixer sur des séquences en 5’ de son propre gène

et de s’autoactiver (Hollenberg et al, 1993). Réciproquement, la myogénine est capable

d’activer MyoD, notamment lorsque les cellules entrent en différenciation. Mais il existe un

rétrocontrôle positif de MyoD indépendamment de la myogénine, ce qui suggère fortement

l’intervention d’autres facteurs tels que les facteurs Mef2 (Hollenberg et al, 1993; Thayer et al,

1989).

II.4 Relation structure/ fonction des MRFs Les quatre protéines MyoD, Myf5, myogénine, et MRF4 appartiennent à la famille des

facteurs de transcription de type bHLH (basic helix loop helix). Les MRFs présentent une

homologie de séquence à 80% sur un fragment de 70 acides aminés qui regroupe une région

basique et un domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). Ils contiennent également

des domaines de transactivation dans leur parties amino- et carboxy- terminales, qui sont

importants pour l’activation efficace de la transcription des gènes spécifiques du muscle

(figure 5) (Edmondson & Olson, 1993).

II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation avec les protéines E

Le motif bHLH définit une superfamille de protéines, dont font partie les bHLH

myogéniques : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Près du centre de ces protéines se trouve

une région basique (b), voisine du domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). La

région basique des bHLH myogéniques joue un double rôle dans le contrôle de la

transcription des gènes spécifiques du muscle en permettant la liaison à l’ADN des MRFs et

en conférant une spécificité de transcription. Les bHLH myogéniques diffèrent des autres

bHLH du fait qu’ils contiennent un motif de reconnaissance conservé au sein du domaine

basique. Ce « code myogénique » comprend les résidus conservés « Ala86, Thr87, Asp109,

Ala114 et Thr115 » et leur confère la capacité à activer les gènes spécifiques du muscle

(Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990; Huang et al, 1998a). La mutation de la région basique

empêche la liaison à l’ADN mais pas la dimérisation (Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990).

Figure 5. Domaines fonctionnels de MyoD.

Les différentes régions fonctionnelles de MyoD sont représentées par des rectangles : en bleupour le domaine d’activation, en gris clair pour le domaine C/H, en orange pour le domainebasique, en jaune pour le domaine HLH et en gris foncé pour le domaine C-terminal. Les chiffresindiquent la position des acides aminés aux bornes de chaque domaine.Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000 ».

1 53 108 125 137 146 166 319

Activité deremodelage dela chromatine

Activité deremodelage dela chromatine

DimérisationFixation surl’ADN

9

Des expériences de mutagenèse montrent que ce motif HLH sert d’interface à la

dimérisation, ce qui permet de former un domaine composite de liaison à l’ADN après

dimérisation de deux protéines bHLH (Davis et al, 1990; Voronova & Baltimore, 1990).

Le motif bHLH est également trouvé dans une classe de protéines ubiquitaires connues sous

le nom de protéines E, qui inclut HEB/HTF4, E2-2/ITF-2 et l’epissage alternatif du produit

du gène E2A : E12/E47. Ainsi, les bHLH myogéniques peuvent soit s’homodimériser, soit

s’hétérodimériser avec les facteurs de transcription bHLH de classe I, que sont les protéines

E.

Les dimères formés par dimérisation de protéines bHLH diffèrent par leur affinité de liaison

pour l’ADN. Par exemple, le dimère MyoD-E47 se forme efficacement et se fixe fortement

sur l’ADN, alors que l’homodimère MyoD se fixe à l’ADN faiblement (Murre et al, 1989).

Les hétérodimères MRF-protéine E se fixent sur la séquence consensus “CANNTG”,

appelée boîte E. Des préférences de liaison à l’ADN dépendantes des séquences adjacentes et

des séquences internes à la boîte E ont été identifiées pour les homodimères et les

hétérodimères MRF-protéine E in vitro (Blackwell & Weintraub, 1990). Les boîtes E sont

fréquemment représentées dans le génome et pas seulement dans les régions régulatrices des

gènes du muscle. Ainsi, des interactions intramoléculaires sont indispensables pour que

MyoD puisse activer spécifiquement la transcription des gènes du muscle. Par exemple, la

présence d’un site de liaison pour le facteur Mef2, augmente de manière coopérative la

transcription. Par ailleurs, Mef2C interagit directement avec le dimère MyoD-E12, mais pas

avec ces protéines individuellement (Molkentin et al, 1995; Molkentin & Olson, 1996; Olson

et al, 1995).

II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité des MRFs

En plus du domaine bHLH, des analyses de mutation et de délétion ont identifié trois

domaines de MyoD ayant des fonctions importantes dans la régulation des gènes spécifiques

du muscle : le domaine acide N-terminal, le domaine riche en histidine et cystéine (H/C) et

l’hélice III.

Le domaine N-terminal, qui comprend les résidus 1 à 53, est très acide et permet l’activation

d’un promoteur hétérologue (Weintraub et al, 1991). Le domaine acide N-terminal de MyoD

est requis pour l’activation d’un plasmide rapporteur dirigé par plusieurs boîtes E, suggérant

qu’il fonctionne comme un domaine de transactivation (TAD) et qu’il est nécessaire pour la

fixation de MyoD sur les boîtes E (Weintraub et al, 1990).

10

En plus du domaine de transactivation N-terminal, deux autres motifs conservés ont été

identifiés : du côté N-terminal du domaine bHLH, il y a le domaine riche en H/C et du côté

C-terminal, il y a une structure en hélice α, également appelée hélice III. Ces deux domaines

de MyoD sont nécessaires pour le remodelage de la chromatine, au niveau du promoteur de

la myogénine (Gerber et al, 1997), en coopérant avec Pbx et Meis. Les facteurs Pbx et Meis font

partie de la famille de facteurs de transcription à homéodomaine, initialement identifiés pour

leur rôle au cours de l’embryogenèse (Berkes et al, 2004). Les complexes Pbx-Meis

interagissent de manière coopérative avec les bHLH myogéniques in vitro sur un ADN

synthétique contenant les sites consensus de fixation de Pbx et Meis et une boîte E. Cette

liaison coopérative requiert la présence d’un résidu tryptophane conservé au sein du domaine

riche en H/C des bHLH (Knoepfler et al, 1999). Les mutants de MyoD pour la région riche

en H/C sont incapables d’initier le remodelage de la chromatine sur le locus de la myogénine

(Gerber et al, 1997), probablement car le mutant ne peut plus interagir avec le complexe

Pbx/Meis. L’hélice III a été montrée comme nécessaire pour initier l’activation de la

myogénine au niveau endogène (Bergstrom & Tapscott, 2001). Par ailleurs, un exemple qui

montre que chaque MRF a sa propre spécificité est le fait que MyoD et la myogénine

possèdent leur propre hélice III. Cette hélice permettrait à MyoD d’activer certains gènes

cibles spécifiquement, car si on remplace l’hélice III de la myogénine par celle de MyoD, la

protéine chimère devient à son tour capable d’activer certains gènes cibles de MyoD

(Bergstrom & Tapscott, 2001).

II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes

La différenciation des myoblastes en myotubes implique une cascade d’événements modifiant

profondément la cellule à la fois au niveau morphologique et moléculaire. Ceci implique une

reprogrammation importante du profil d’expression des gènes des cellules en question,

aboutissant à l’inhibition de certains gènes et à l’activation d’autres gènes. Lorsqu’il est

exprimé de manière ectopique dans certains types cellulaires, MyoD est capable d’induire la

conversion de ces cellules en cellules myoblastiques, ce qui montre que MyoD est capable

d’induire cette reprogrammation génique. De fait, l’ensemble des études effectuées à ce jour

sur MyoD montre que c’est un facteur de transcription capable de transactiver un nombre

important de gènes qui interviennent à toutes les étapes du processus de différenciation

musculaire. Notamment, MyoD est capable d’orchestrer les deux étapes discrètes de la

différenciation terminale : la sortie du cycle prolifératif et l’expression des gènes spécifiques

Myotubeprécoce

Myoblaste Myocytesalignés

Sortie du cycleprolifératif

Expression desgènes spécifiques

du muscle & fusion

Figure 6. La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes.

Les myoblastes exprimant MyoD prolifèrent sous l’influence des facteurs de croissance. Sousl’influence de stimuli extérieurs (ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués artificiellement),les myoblastes vont sortir définitivement du cycle cellulaire grâce à l’action concertée de MyoD,Rb hypophosphorylé, et p21. L’action de Mef2 entretient les boucles d’amplification des MRFs etva induire l’expression de myogénine de concert avec MyoD et MRF4. Les myocytes fusionnentenfin pour former les myotubes multinucléés et expriment les gènes spécifiques du muscle.

MyoD, Rb, p21 Myogénine, MyoD,Mef2, MRF4

11

de la différenciation musculaire. MyoD fonctionne ainsi comme un interrupteur moléculaire,

en « éteignant » la prolifération et en « allumant » la différenciation terminale, et permet ainsi

la séparation de ces deux processus (figure 6).

II.5.1 La sortie du cycle prolifératif

Pendant le processus de différenciation musculaire, les facteurs myogéniques ne sont pas

seulement impliqués dans l’induction des gènes spécifiques du muscle, mais également dans la

régulation de la transition entre l’état prolifératif (quand MyoD et Myf5 sont déjà exprimés) et

la sortie ordonnée du cycle de division cellulaire. L’arrêt du cycle prolifératif est un pré-requis

pour que la différenciation musculaire terminale puisse avoir lieu. Cette étape clé de la

différenciation musculaire squelettique implique la diminution des activateurs du cycle

cellulaire, tels que les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (Cdks), et

l’augmentation des inhibiteurs du cycle cellulaire, tels que Rb, p21, p27 et p57. Ainsi, MyoD

intervient tout d’abord au niveau de la sortie du cycle cellulaire en activant notamment les

gènes p21 (Halevy et al, 1995), la cycline D3 (Cenciarelli et al, 1999) , et Rb (Bergstrom et al,

2002). En particulier, Rb et p21 jouent un rôle très important dans l’arrêt de la croissance des

myoblastes. Leur niveau d’expression et leur activité, bien que régulés négativement par les

facteurs de croissance, sont régulés positivement par MyoD, qui joue un rôle coopératif dans

l’induction de l’arrêt du cycle cellulaire. D’ailleurs, MyoD peut bloquer la prolifération

indépendamment de son activité transcriptionnelle. En effet, exprimé ectopiquement dans

des cellules non musculaires, MyoD inhibe le cycle cellulaire avant la phase S,

indépendamment de son activité de liaison à l’ADN et de l’induction de la différenciation

myogénique (Crescenzi et al, 1990; Sorrentino et al, 1990).

II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle

Pour induire la différenciation terminale ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués

artificiellement en cultivant les cellules dans un milieu à faible teneur en sérum et en laissant

les cellules à confluence. Ce n’est qu’après l’arrêt permanent de la prolifération que les

myoblastes vont exprimer les protéines spécifiques du muscle et fusionner entre eux pour

former des cellules multinucléées appelées myotubes. Plusieurs études indépendantes ont

permis d’identifier certains gènes cibles de MyoD. En particulier, une étude utilisant comme

modèle la conversion myogénique de fibroblastes, a permis d’étudier le transcriptome de ces

cellules lorsque la différenciation musculaire est induite par MyoD (Bergstrom et al, 2002).

Simultanément à l’arrêt du cycle, MyoD active l’expression d’autres acteurs importants de la

différenciation comme la myogénine et Mef2 (Black & Olson, 1998; Cheng et al, 1993;

Edmondson et al, 1992). Comme il a été mentionné précédemment, la myogénine intervient

12

en aval de MyoD dans le processus de différenciation. Elle peut elle aussi assurer l’activation

des gènes de la famille Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). L’activation de la famille Mef2 et de la

myogénine permettrait de prendre le relais de MyoD et/ou de contribuer à la reprogrammation

transcriptionnelle des noyaux des myoblastes en cours de différenciation. Plus tard au cours

de la différenciation, MyoD participe à l’activation de gènes codant des protéines

fonctionnelles du muscle, comme la créatine kinase musculaire (MCK), la troponine I et la

chaîne lourde de la myosine (MHC), qui sont indispensables à la fois à la structure et au

fonctionnement des myotubes (Bergstrom et al, 2002; Lassar et al, 1989). MyoD semble

également intervenir dans l’expression de gènes codant des protéines d’adhérence, et de

certains intermédiaires des voies de transduction des signaux comme le gène codant le

récepteur à l’acétylcholine (Bergstrom et al, 2002; Gilmour et al, 1991).

III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE

MUSCLE

III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les myoblastes proliférants

MyoD est exprimé dans les myoblastes en prolifération, alors que les gènes cibles principaux

de MyoD ne sont pas activés. Cela implique une inhibition active de l’activité de MyoD. On

comprend donc aisément que les cellules assurent une régulation de l’activité de MyoD à

plusieurs niveaux. Comme cela va maintenant être décrit, l’activité de MyoD dépend

beaucoup des partenaires protéiques avec lesquels il interagit. Ainsi, ses partenaires influent

sur la fixation de MyoD à l’ADN, son intensité de transactivation, sa stabilité protéique, sa

spécificité sur ses promoteurs cibles, ainsi que le contexte chromatinien qui rend possible ou

non la transcription.

III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire

La décision cellulaire de progresser vers un nouveau cycle de division cellulaire a lieu à la

transition G1/S. Au niveau moléculaire, plusieurs régulateurs positifs et négatifs du cycle

cellulaire ont été identifiés. Parmi les régulateurs positifs du cycle se trouvent les complexes

cycline/Cdks (Nurse, 1994; Sherr, 1994). Les régulateurs négatifs du cycle, qui sont aussi des

coactivateurs de la différenciation musculaire, comprennent entre autres les inhibiteurs de

Cdks (CKIs) (Sherr & Roberts, 1995; Sherr & Roberts, 1999) et la famille des protéines à

Figure 7. Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire.

Durant le début la phase G1, la transcription des gènes de la phase S dépendante de E2F, estréprimée par la fixation de Rb à E2F. Au point de restriction R, des complexes cyclines/CDKsphosphorylent Rb, qui se décroche alors de E2F, permettant à celui-ci d’activer latranscription de ces gènes cible et le passage en S. La sortie du cycle précédant ladifférenciation cellulaire se fait au cours de la phase G1 lorsque l’inhibition de E2F par Rb esttoujours active.Figure extraite de Giacinti and Giordano, Oncogene 2006.

R

13

poche : la protéine Rb, le produit du gène de susceptibilité au rétinoblastome, et deux

protéines apparentées à Rb : p107 et p130 (Mulligan & Jacks, 1998).

III.1.1.1 Phosphorylation de Rb par les complexes cycline/cdk

Le passage de la phase G1 vers la phase S est contrôlé par les cyclines D (associées aux Cdk4

et Cdk6), la cycline E et la cycline A (associées à Cdk2). Une des cibles les plus étudiées pour

les cyclines A ou E/Cdk2 pendant la transition G1/S est la protéine Rb. Dans sa forme

hypophosphorylée, Rb régule négativement la progression du cycle cellulaire au niveau de la

progression de la phase G1 vers la phase S. Rb hypophosphorylé agit au niveau

transcriptionnel en interagissant et en modulant l’activité de nombreux facteurs de

transcription (Kouzarides, 1995; Taya, 1997), réprimant ainsi l’expression des gènes requis

pour l’entrée en phase S. Trois facteurs de transcription de la famille E2F (E2F1, E2F2 et

E2F3) régulent notamment les gènes associés à la prolifération. Les facteurs E2F sont les

cibles de Rb les plus étudiées pendant la phase G1 (Chellappan et al, 1991; Helin, 1998).

Dans sa forme active (hypophosphorylée), Rb interagit avec E2F et réprime ainsi son activité.

Au cours de la phase G1, la phosphorylation progressive et massive de Rb par les complexes

cycline/Cdk, induit sa dissociation de E2F et ce qui permet l’entrée des cellules en phase S

(Mittnacht, 1998). La protéine Rb reste ainsi hyperphosphorylée jusqu’à l’entrée en mitose, ce

qui conduit à sa dégradation. Ainsi, la progression du cycle cellulaire est largement sous le

contrôle de la régulation génique dépendante de Rb-E2F (figure 7).

L’expression de la cycline D1 est induite par les facteurs de croissance tels que le FGF

(fibroblast growth factor) et le TGF-β (tumor growth factor), et son niveau est maximal pendant la

phase G1 (Sherr, 1994). La surexpression de la cycline D1 accélère la progression G1/S

(Quelle et al, 1993) et inhibe la transactivation des gènes spécifiques du muscle en partie par

la voie Rb/E2F (Guo & Walsh, 1997; Rao et al, 1994; Skapek et al, 1995). Des expériences de

transdifférenciation musculaire de fibroblastes en culture cellulaire montrent que les cyclines

A et E bloquent la différenciation. La présence d’une protéine Rb mutante non-

phosphorylable abolit l’effet négatif des cyclines A et E sur la différenciation musculaire

(Skapek et al, 1996). En revanche, l’expression de la cycline D1 réussit quand même à inhiber

la différenciation musculaire même en présence de ce mutant de Rb. Ceci indique que

l’activité des cyclines/cdk bloque la différenciation musculaire à la fois par un mécanisme

dépendant de la phosphorylation de Rb, et par un second mécanisme indépendant de la

phosphorylation de Rb (Skapek et al, 1996).

Myoblastes (prolifération)

?

Myotubes (différenciation)

Figure 8. Modifications post-traductionelles de MyoD.

Les cercles rouges entourant un « P  » représentent un résidu phosphorylé, les cercles jaunesindiquant « Ub  » représente un acide aminé ubiquitinylé et un cercle bleu indiquant « Ac »représente un résidu acétylé. Les modifications post-traductionnelles retrouvées dans lesmyoblastes en prolifération sont placées au dessus et celles apparaissant en condition dedifférenciation sont illustrées en bas.Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000  ».

Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire.

Le niveau de MyoD augmente au cours de la phase G1 et atteint son niveau maximum enmilieu de phase G1 au niveau d’un point de restriction noté « R ». En présence de signauxmitogènes, Cdk2 phosphoryle alors MyoD sur la sérine 200 ce qui entraîne sa dégradation.Le niveau de MyoD augmente à nouveau durant la phase G2. La phosphorylation de MyoDpar CDK1 au niveau des sérines 5 et 200 entraîne sa dégradation avant l’entrée en mitose.

14

III.1.1.2 Modifications post-traductionnelles de MyoD conduisant à sa dégradation

La protéine MyoD comporte plusieurs sites de modifications post-traductionnelles (figure 8).

Ces modifications vont réguler l’activité de MyoD et/ou provoquer sa dégradation par le

protéasome (Breitschopf et al, 1998; Floyd et al, 2001). Ainsi, MyoD est phosphorylé dans les

myoblastes en prolifération et cette phosphorylation diminue lorsque les myoblastes se

différencient en myotubes (Kitzmann et al, 1999). MyoD est phosphorylé sur la sérine 200

dans les myoblastes en prolifération et cette phosphorylation est induite par cdk1 ou cdk2

(Tintignac et al, 2000). La phosphorylation de MyoD sur la sérine 200 est impliquée dans la

dégradation de MyoD, puisque les mutants de MyoD ayant une alanine 200 non-

phosphorylable ont une demie-vie augmentée trois à quatre fois par rapport à la protéine

sauvage (Song et al, 1998). La phosphorylation de MyoD par le complexe cycline E/cdk2 est

impliquée dans sa dégradation dépendante de l’ubiquitine pendant la phase G1-S (Tintignac

et al, 2000). Parce que la cycline D1 est essentielle pour l’induction de la cycline E (Nurse,

1994; Sherr, 1994), le rôle du complexe cycline E/cdk2 dans la phosphorylation de MyoD et

sa dégradation consécutive, fournit une explication supplémentaire pour le rôle inhibiteur de

la cycline D1 dans la myogenèse. En particulier, la surexpression de la cycline D1 induit

l’accumulation de Cdk4 dans le noyau, qui se lie alors à l’extrémité N-terminale de MyoD et

empêche sa liaison à l’ADN (Zhang et al, 1999a). Finalement, MyoD atteint son plus haut

niveau d’expression en début de phase G1, et si les stimuli extérieurs sont favorables, c’est

pendant cette fenêtre de temps que les myoblastes sortent du cycle cellulaire pour s’engager

dans le processus de différenciation terminale, sinon, MyoD est dégradé. Le point du cycle

matérialisant le moment auquel se fait le choix entre la sortie et la poursuite du cycle cellulaire

est nommé point de restriction. Après la phase S, le niveau de MyoD commence à augmenter

à nouveau (figure 9). Cependant, à l’enclenchement de la mitose, MyoD est à nouveau

phosphorylé sur les sérines 5 et 200 par les complexes cycline/cdk, puis ubiquitinylé et

dégradé (pour revue voir (Kitzmann & Fernandez, 2001)).

III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs

L’activité de MyoD et celle de ses co-facteurs, les protéines E et les facteurs MEF2, sont

hautement régulées par des interations protéine-protéine. Toutes les protéines à domaine

HLH ne possèdent pas de propriétés activatrices, au contraire, la plupart fonctionnent

comme des régulateurs négatifs de la transcription. Un cas bien illustré est celui des protéines

Id, qui possèdent un motif HLH mais pas de domaine basique. Id est donc capable de former

des hétérodimères avec les protéines bHLH, mais empêche leur liaison à l’ADN (Benezra et

al, 1990a; Benezra et al, 1990b). Id se lie à MyoD, et plus préférentiellement aux protéines E

Figure 10. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles.

Sur les gènes spécifiques du muscle, la chromatine et les protéines interagissant au niveau dela chromatine sont dans un état réprimé dans les myoblastes en prolifération. MyoD, Mef2 etYY1 recrutent des complexes co-répresseurs contenant des histones désacétylases (HDACs) etdes histones méthylases (par exemple Ezh2), qui empêchent l’hyperacétylation et induisent ladi- ou tri-méthylation de résidus lysine spécifiques (comme K27 et K9) pour donner uneconformation répressive à la chromatine au niveau des gènes spécifiques du muscle. La voieCaMK activée pendant la différenciation et les niveaux de Rb hypophosphorylé (suite à labaisse des signaux mitogènes) déplacent les HDACs de la chromatine et permettentl’hyperacétylation des histones par les acétyltransférases.Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005.

YY1

Ezh2Rb

HDACclasse I

RbHistoneméthyl-

transférases

Mef2 MyoD

HDACclasse 2

CaMK

PP

Pol II

Enhancer /Promoteur musculaire

HDACclasse I

cytoplasme

K27

Me Me Me

K9

Me Me

Boîte Mef2 Boîte E

15

(Benezra et al, 1990a), empêchant ainsi la formation d’un dimère actif MyoD-protéine E (Jen

et al, 1992). À l’enclenchement de la différenciation musculaire, la localisation de Id devient

cytoplasmique et il ne peut plus interagir avec MyoD. De plus, alors que son taux de

dégradation par le protéasome reste inchangé, les niveaux d’ARNm et protéique de Id sont

diminués lorsque les signaux mitogènes sont diminués et pendant la myogenèse (Norton et al,

1998; Sun et al, 2005; Trausch-Azar et al, 2004).

Une autre classe d’inhibiteurs à domaine HLH sont les protéines HES qui répriment l’activité

transcriptionnelle via leur liaison à une boîte N (apparentée aux boîtes E) sur l’ADN (Sasai et

al, 1992). De la même manière, la protéine bHLH Twist altère l’activité de MyoD en bloquant

sa liaison à l’ADN, à la fois en titrant les protéines E, mais aussi en interagissant directement

avec Mef2 (Hamamori et al, 1997; Spicer et al, 1996). D’autres protéines bHLH qui régulent

négativement l’activité de MyoD et bloquent la différenciation musculaire, sont les protéines

MyoR et Mist1. Ces facteurs contiennent des régions basiques et forment des dimères avec

les MRFs. MRF/MyoR et MRF/Mist1 sont des hétérodimères inactifs, capables de se fixer

sur les boîtes E, mais sans activer la transcription (Lemercier et al, 1998; Lu et al, 1999). La

protéine bHLH Mist1 peut aussi occuper les boîtes E en formant un homodimère Mist1-

Mist1 (Lemercier et al, 1998). Enfin, il a été démontré qu’une autre bHLH, Dermo-1, est

capable d’inhiber l’activité transactivatrice de MyoD d’une manière plus efficace que Id

(Gong & Li, 2002). Contrairement à l’inhibition liée à Id qui peut être levée par compétition

en co-transfectant la protéine E12, l’inhibition par Dermo-1 n’est apparemment pas ou peu

dépendante de E12. Dermo-1 induit la répression de la transcription des gènes cibles de

MyoD par son interaction directe avec la protéine Mef2C, mettant en jeu ses domaines N- et

C-terminaux (Gong & Li, 2002).

III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression épigénétique de ses gènes cibles

Si MyoD est titré hors de l’ADN et ses cofacteurs séquestrés ou dégradés, une fraction de

MyoD est malgré tout retrouvée sur la chromatine. Dans ce cas, MyoD est associé à la

répression de ses gènes cibles car il interagit avec différents facteurs de modification ou de

remodelage de la chromatine (figure 10), agissant ainsi au niveau épigénétique. En effet, de

nombreuses études ont permis d’établir une relation entre la structure chromatinienne et la

régulation de la transcription. L’induction de la transcription s’accompagne d’une altération

de la structure des nucléosomes positionnés sur les séquences régulatrices. La structure de la

chromatine est affectée par différents complexes de remodelage, dont les complexes

dépendants de l’ATP et les complexes d’acétylation ou de désacétylation des histones. Les

16

histones peuvent subir de multiples modifications post-traductionnelles comme la

phosphorylation, la méthylation, l’ubiquitinylation et l’acétylation. Ces modifications

interviennent essentiellement au niveau des queues N-terminales, qui sont à l’extérieur du

nucléosome. Elles constituent autant de signaux de reconnaissance pour des facteurs

impliqués dans les processus de transcription, de réparation, de condensation des

chromosomes, de dégradation. En 2000, Strahl et Allis font ainsi référence à « code des

histones », dans lequel chaque modification aurait son propre rôle dans l’activation de la

transcription, mais également un effet combinatoire avec les autres modifications (Strahl &

Allis, 2000).

III.1.4.1 Les histones désacétylases

Les histones désacétylases régulent négativement l’expression des gènes spécifiques du

muscle via leur interaction avec les protéines MyoD et Mef2. De ce fait, dans les myoblastes

en prolifération, MyoD est associé à la répression de ses propres gènes cibles. En effet, les

histones désacetylases (HDACs) de classes I et II sont exprimées dans les myoblastes,

fournissant un autre fragment d’explication pour l’incapacité de MyoD et Mef2 à activer leurs

gènes cibles avant leur entrée en différenciation. Dans les myoblastes en prolifération, MyoD

est en fait associé aux HDACs de classe I, via son domaine bHLH. Cette interaction réprime

l’activité transcriptionelle de MyoD à deux niveaux : (i) en désacétylant MyoD lui-même, (ii)

en désacétylant les histones sur ses promoteurs cibles. Par exemple, HDAC1 s’associe avec

MyoD et est capable de le désacétyler in vitro (Mal et al, 2001). De plus, MyoD est trouvé

complexé à HDAC1 dans les myoblastes en prolifération, mais pas dans les myotubes en

différenciation (Mal et al, 2001). Le recrutement de HDAC1 sur les gènes cibles de MyoD se

fait probablement par le co-répresseur N-CoR/SMRT, qui interagit directement avec MyoD

et qui est connu pour recruter HDAC1 sur l’ADN. L’histone désacétylase de classe II, Sir2,

une HDAC dépendante du NAD+, inhibe également la myogenèse en formant un complexe

avec l’histone acétyltransférase PCAF (p300/CBP associated factor) et MyoD, et lorsque Sir2 est

surexprimée, elle retarde la différenciation musculaire. Inversement, la diminution de Sir2

accélère la différenciation musculaire (Fulco et al, 2003).

L’activité de Mef2 est elle aussi réprimée par son association avec les HDACs de classe II

(telles que les HDACs 4 et 5), provoquant la désacétylation et la répression des gènes

contenant les sites de fixation de Mef2 (Lu et al, 2000). HDAC7 inhibe également

spécifiquement Mef2 (-A, -C, -D) et n’affecte pas MyoD et la myogénine (Dressel et al, 2001).

Les HDACs de classe II n’interagissent pas directement avec MyoD, mais répriment

17

l’expression de ses gènes cibles lorsqu’ils contiennent un site Mef2 en supplément de la boîte

E, en s’associant aux facteurs Mef2 (Lu et al, 2000).

III.1.4.2 Les histones méthyl-transférases

Il a été montré que le recrutement de complexes HDACs pour désacétyler les histones sur les

promoteurs du muscle avant la différenciation, contribue à la méthylation de l’histone H3 sur

sa lysine 9 (H3K9) par des histones méthyl-transférases (HMTs), sur ces mêmes promoteurs

(Zhang et al, 2002). À ce propos, Mal et Harter montrent que dans les myoblastes en

prolifération, MyoD est associé à HDAC1 sur le promoteur de la myogénine et que ce

promoteur présente alors une désacétylation ainsi qu’une méthylation de l’histone H3 sur la

lysine 9 (H3K9), ce qui correspond à des marques épigénétiques répressives (Mal & Harter,

2003). Par ailleurs, l’histone méthyltransférase Suv39h, qui méthyle H3K9, interagit avec

MyoD dans les cellules en prolifération et ce complexe est détecté sur le promoteur de la

myogénine qui est un gène cible de MyoD réprimé en prolifération. La présence de Suv39h1

sur ce promoteur est corrélée à la méthylation de H3K9 (Mal, 2006). La méthylation de

H3K9 est une marque épigénétique reconnue par la protéine de l’hétérochromatine HP1, qui

va contribuer à former une structure hétérochromatinienne compacte non-permissive à la

transcription. J’ai d’ailleurs participé à une étude montrant que la protéine HP1 est impliquée

dans la répression de la différenciation musculaire et qu’elle interagit directement avec MyoD

(Yahi et al, 2008) (Annexe 3).

D’autres méthyltransférases d’histones régulent négativement la différenciation musculaire.

Notamment Ezh2, une protéine polycomb avec une activité spécifique de méthylation de

H3K27, est recrutée spécifiquement sur les gènes spécifiques du muscle dans les myoblastes

en prolifération (Caretti et al, 2004). Ezh2 est retrouvée dans un complexe protéique

contenant HDAC1. Les promoteurs du muscle sont hyperméthylés sur H3K27 et donc

réprimés. L’enclenchement de la différenciation est couplé à la disparition de ce complexe sur

ces mêmes loci. H3K27 devient donc hypométhylé et MyoD et Mef2 sont recrutés,

permettant la transcription de leurs gènes cibles. La diminution de Ezh2 est corrélée avec une

activation de l’expression des gènes du muscle et sa surexpression inhibe la différenciation

musculaire (Caretti et al, 2004).

Figure 11. Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie dedifférenciation terminale.

MyoD et Myf5 sont exprimés dans les myoblastes en prolifération, où leur activité est inhibéepar les complexes Cdk4/Cycline D. Les complexes cycline/Cdk sont activés par les signauxmitogènes. En absence de facteurs de croissance, MyoD induit l’expression de p21 et de Rb cequi résulte en l’arrêt du cycle cellulaire. Notamment, p21 inhibe les complexes cycline/Cdk,qui ne peuvent alors plus phosphoryler Rb. En effet, en condition de prolifération cellulaire, Rbest normalement hyperphosphorylé par les complexes cycline/cdks, ce qui rend la protéine Rbinactive et l’empêche de s’associer avec le facteur E2F. E2F est donc libre d’aller transcrire lesgènes nécessaire à la prolifération cellulaire. En absence de signaux mitogènes, Rbhypophosphorylé séquestre E2F et contribue à l’arrêt du cycle cellulaire. La myogénine estactivée dans les myoblastes ayant arrêté de proliférer et c’est un élément intermédiaireimportant dans la différenciation terminale des myoblastes.Figure adaptée d’après Molkentin and Olson, Current Opinion in Genetics and Development,1996).

MyoD/Myf5 Myogénine p21 Arrêt de laprolifération

Différenciationmusculaire

Rb-E2F

cyclineD/Cdk4 E2F Prolifération

Rb- Pinactif

Facteurs decroissance

18

III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21 et la cycline D3

Un point de contrôle de l’entrée en différenciation a été mis en évidence (Puri et al, 2002). Ce

point de contrôle semble permettre aux myoblastes d’interrompre leur prolifération,

notamment lors d’un traitement des cellules par des agents génotoxiques. MyoD coopère

avec les régulateurs du cycle cellulaire, notamment les complexes cycline/cdk, les CKIs et Rb,

dans la voie de signalisation qui mène à l’arrêt du cycle en phase G1 et l’engagement dans la

voie de différenciation (Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Novitch et al, 1996; Parker et al,

1995; Schneider et al, 1994) et pour revue voir (De Falco et al, 2006) (figure 11).

III.2.1.1 Régulation des complexes cycline/cdk

Globalement, l’expression et l’activité des régulateurs positifs du cycle cellulaire sont

diminuées pendant la différenciation terminale. Si l’expression de cdk4 et cdk2 reste

inchangée pendant la différenciation musculaire squelettique, celle de cdk1, des cyclines D, E

et A décline. Cependant, une catégorie de cycline et Cdk échappe à cette règle, les cyclines T

et Cdk9 sont augmentées dans les myotubes en différenciation et aideraient même MyoD à

activer ses gènes cibles (Giacinti et al, 2006; Simone & Giordano, 2001; Simone et al, 2002b).

Dans les myoblastes, la protéine Rb interagirait également avec cycline T2/cdk9 (Simone et

al, 2002a). La cycline D3 est également une cycline dont l’expression est augmentée au cours

de la différenciation musculaire (Kiess et al, 1995; Rao & Kohtz, 1995). MyoD stimule lui-

même l’expression de la cycline D3, par un mécanisme qui requiert l’acétyltransférase p300

(Cenciarelli et al, 1999). La cycline D3 contribue à la sortie du cycle cellulaire et elle est

associée à cdk4 et Rb dans les myotubes différenciés (Cenciarelli et al, 1999).

III.2.1.2 Régulation des CKIs

L’expression des inhibiteurs de cdks (CKIs), en particulier p21 (Guo et al, 1995; Halevy et al,

1995; Parker et al, 1995; Skapek et al, 1995), mais également p27 (Zabludoff et al, 1998) et p18

(Franklin & Xiong, 1996), est renforcée pendant la myogenèse embryonnaire et pendant la

différenciation myogénique de myoblastes en culture. Dans les myoblastes, la majorité des

CKIs sont capables d’améliorer la capacité de transactivation de MyoD. L’augmentation des

CKIs à l’enclenchement du processus de différenciation terminale, explique la diminution

drastique de l’activité des complexes cycline/cdk au cours de la différenciation. Par exemple,

le complexe cdk2/ cycline E est inhibé par p57 (Reynaud et al, 2000). La sortie du cycle

cellulaire est essentiellement contrôlée par l’expression de deux inhibiteurs de cdk, p21 et p57

19

(Zhang et al, 1999b). MyoD induit directement l’expression de p21 au cours de la myogenèse

(Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Parker et al, 1995). L’importance du rôle joué par p21

dans la sortie du cycle prolifératif est illustrée par le fait que l’expression forcée de p21 dans

les myoblastes est suffisante pour enclencher le programme de différenciation terminale,

même en présence de facteurs de croissance (Guo et al, 1995). L’expression de p21 et p57 est

indispensable à la différenciation musculaire comme le montre la double inactivation génique

p57:p21, qui donne le même phénotype que les souris inactivées pour la myogénine (Zhang et al,

1999b).

III.2.1.3 Régulation de Rb

En plus de réguler l’expression de la cycline D3 et p21, MyoD active directement l’expression

de Rb. Le mécanisme par lequel MyoD active Rb est distinct de sa fonction myogénique

(Martelli et al, 1994). L’activation de l’expression de Rb passe par le recrutement du facteur de

transcription CREB (cAMP-responsive element binding protein) qui reconnaît un site CRE sur le

promoteur du gène codant pour Rb. De manière intéressante, les auteurs montrent que

MyoD s’associe à CREB dans un complexe comprenant également les protéines à activité

acétyl-transférase, p300 et PCAF. Cependant les auteurs montrent que l’acivité acétyl-

transférase de p300 n’est pas requise pour augmenter l’activité transcriptionnelle de MyoD,

en revanche celle de PCAF est indispensable. Les auteurs notent également que MyoD se fixe

sur le promoteur de Rb uniquement en présence de CREB (Magenta et al, 2003).

À l’enclenchement de la différenciation terminale, la baisse massive des régulateurs du cycle

permet à la protéine Rb de rester dans une forme hypophosphorylée. Rb hypophosphorylé

peut alors interagir directement avec le domaine d’activation des facteurs E2Fs, les

empêchant ainsi d’agir pour stimuler la progression vers la phase S. Par ailleurs, le facteur

E2F voit également son expression diminuer et les myocytes surexprimant E2F1 n’arrivent

pas à sortir du cycle cellulaire, même dans des conditions favorables à la différenciation

(Wang et al, 1995). De plus, l’interaction de la protéine Rb dans sa forme hypophosphorylée

avec MyoD et les autres bHLH myogéniques est nécessaire à la différenciation musculaire.

Rb coopère notamment avec MyoD pour stimuler l’activité transcriptionnelle de Mef2 dans

les myoblastes en différenciation (Novitch et al, 1999). Rb va subir des modifications post-

traductionnelles comme sa phosphorylation par la cycline T2/Cdk9, mais aussi une

acétylation par p300 et PCAF sur sa région N-terminale. Ces modifications sont

indispensables pour la sortie du cycle cellulaire et l’induction de la transcription des gènes

spécifiques du muscle (Chan et al, 2001; Nguyen et al, 2004). Notamment, Rb va stimuler

20

l’expression de gènes tardifs de la différenciation comme MCK et MHC, en augmentant

significativement l’activité transcriptionnelle de MyoD (Gu et al, 1993).

III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à l’ADN

La protéine musculaire LIM interagit avec le dimère E12-MRF, augmente son activité de

liaison à l’ADN et stimule la myogenèse (Arber et al, 1994). Des expériences ont montré que

son inhibition dans les myoblastes empêche leur différenciation terminale, alors que sa

surexpression favorise ce processus (Kong et al, 1997).

La protéine Pbx est une homéoprotéine exprimée de manière ubiquitaire et qui peut se fixer

de manière constitutive à certains promoteurs. En particulier, Pbx1 peut se fixer sur le

promoteur de la myogénine avant la fixation de MyoD, alors même que la structure de la

chromatine est défavorable à la transcription. Par ailleurs, MyoD forme un complexe avec

Pbx1 sur ce même promoteur, suggérant que Pbx1 pourrait aider à la fixation de MyoD sur

son gène cible (Berkes et al, 2004).

MyoD peut être phosphorylé par d’autres kinases que les Cdks et notamment par la kinase

Mos. L’inhibition de Mos dans les myoblastes diminue leur potentiel de différenciation alors

que sa surexpression augmente l’activité de MyoD. Ceci montre que Mos est un régulateur

positif de la différenciation musculaire. Mos phosphoryle MyoD directement sur la sérine 237

et favorise ainsi la dimérisation de MyoD avec la protéine E12 (Aurade et al, 1994;

Lenormand et al, 1997; Solhonne et al, 1999).

III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation musculaire

III.2.2.1 La voie Jak/STAT

La protéine STAT3 est un facteur de transcription activé par la kinase Janus (Jak) en réponse

à des stimuli extracellulaires tels que certains facteurs de croissance. Sa phosphorylation par

Jak2 permet l’homodimérisation et la relocalisation de STAT3 dans le noyau, où STAT3 se

fixe sur ses gènes cibles. Deux études montrent clairement que l’expression de STAT3 est

augmentée au cours de la différenciation musculaire et que la diminution de STAT3 par

ARN-interférence inhibe la différenciation. De plus, les auteurs montrent que MyoD et

STAT3 interagissent et proposent un rôle positif pour STAT3 au cours de la différenciation

musculaire (Wang et al, 2008; Yang et al, 2009a).

Figure 12. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles.

Les signaux induits par la différenciation aboutissant au déplacement de YY1 et desméthyltransférases, ainsi que la déméthylation des résidus lysine des histones ne sont pas bienconnus. Après, (ou au même moment) que le déplacement des complexes corépresseurs et desmarques épigénétiques de la chromatine, l’assemblage du transcriptosome myogénique induitle recrutement de plusieurs complexes dotés de différentes activités enzymatiques (comme lesacétyltransférases, les complexes de remodelage dépendants de l’ATP ou les arginineméthyltransférases). La kinases p38 activée pendant la différenciation régule plusieurs étapesde l’assemblement du transcriptosome, en ciblant et en phosphorylant les facteurs detranscriptions (Mef2), les partenaires d’hétérodimérisation des MRFs (E47) et les composantsdu complexe SWI/SNF (BAF60). p38 peut également réguler la stabilité de l’ARN naissant. Lerecrutement d’acétyltransférases sur les régions régulatrices des gènes du muscle n’estapparemment pas dépendant de la voie p38 et est probablement régulé par une cascadeparallèle activée pendant la différenciation. Chacun des composants recrutés dans letranscriptosome myogénique est essentiel pour conférer la capacité à activer la transcription.Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005.

Enhancer /Promoteur musculaire

R

MeR

Me

p300GRIP1

Mef2 MyoDE12/47

P PP/CAF

SWI/SNFBrg1

BrmP

CARM1

Acétylation

Remodelage dela chromatine

p38

ARNm

Pol II

Boîte Mef2 Boîte E

21

III.2.2.2 La voie p38 MAPK

La kinase p38 a un rôle particulièrement important dans l’expression des gènes spécifiques du

muscle, et le mécanisme par lequel p38 affecte les voies de régulation des gènes musculaires a

été abondamment décrit. L’activité de la kinase p38 augmente progressivement au fur et à

mesure du processus de différenciation et son activité est surtout nécessaire pour la

différenciation terminale (Wu et al, 2000). p38 est responsable de la phosphorylation du

domaine de transactivation de Mef2 (Cox et al, 2003; Zetser et al, 1999; Zhao et al, 1999).

L’inhibition de p38 atténue le potentiel d’activation de Mef2 et inversement l’expression d’un

mutant de p38 actif constitutivement promeut la différenciation musculaire (Puri et al, 2000;

Wu et al, 2000; Zhao et al, 1999). La kinase p38 jouerait également un rôle dans le

recrutement du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF sur les gènes cibles de

MyoD (Simone et al, 2004) et dans la phosphorylation des histones, comme cela a été montré

sur certains gènes précoces de la différenciation musculaire (Clayton et al, 2000; Thomson et

al, 1999). Notamment, la voie p38 MAPK, de concert avec deux autres voies de signalisation,

agirait pour stimuler la liaison de MyoD, Mef2 et des protéines Six sur le promoteur proximal

de la myogénine pour activer son expression (Xu et al, 2002).

III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles

Principalement deux classes de co-activateurs coopèrent avec les facteurs de transcription

pour permettre l’expression spécifique des gènes : les protéines modifiant les histones (telles

que les acétyltransférases ou les méthyltransférases) et les facteurs de remodelage de la

chromatine dépendants de l’ATP (tels que les protéines de la famille SWI/SNF) (figure 12).

III.2.3.1 Les histones acétyl-transférases

Les histone-acétyltransférases (HATs) fonctionnent en transférant des groupements acétyl de

l’acétyl-coA sur les résidus lysine des protéines histones, ainsi que des protéines non-histones.

L’acétylation des histones provoque le transfert des histones H2A/H2B de l’ADN vers des

protéines chaperonnes (Ito et al, 2000), augmentant ainsi l’accessibilité des facteurs de

transcription à l’ADN. Les HATs et les HDACs interagissent toutes deux avec MyoD et ont

des activités opposées qui sont critiques pour faire basculer MyoD d’un état répresseur à un

état activateur sur certains loci.

Par exemple, la protéine Rb peut déplacer HDAC1 de MyoD (Puri et al, 2001), laissant

MyoD libre d’activer la transcription. D’ailleurs, la libération de MyoD de HDAC1 est un

préalable à l’association de MyoD avec la HAT PCAF (Mal et al, 2001). Une régulation de la

transition des interactions HATs et HDACs est également contrôlée pour Mef2. Le complexe

22

Mef2/HDAC de classe II est sensible à la kinase CamK dépendante du calcium, qui médie

l’effet stimulant de IGF1 (insulin-like growth factor 1) sur la différenciation musculaire. CamK

phosphoryle HDAC5 sur deux résidus sérine, ce qui stimule sa liaison à la protéine

chaperonne 14-3-3. L’interaction de HDAC5 avec la protéine 14-3-3 provoque l’exposition

d’un signal d’export nucléaire de HDAC5 et sa sortie du noyau (McKinsey et al, 2000;

McKinsey et al, 2001).

Les coactivateurs transcriptionnels tels que p300, c-AMP response element-binding protein (CREB)-

binding protein (CBP) et p300/CBP-associated factor (PCAF) possèdent une activité acétyl-

transférase sur les lysines. L’activité acétyl-transférase (AT) générale augmente au cours de la

différenciation myogénique (Polesskaya et al, 2001b) et l’activité de MyoD est augmentée par

l’acétylation de ses résidus lysines par CBP, p300 et PCAF in vitro (Duquet et al, 2006;

Polesskaya et al, 2000; Polesskaya & Harel-Bellan, 2001; Sartorelli et al, 1999). Il y a une

association préférentielle entre MyoD acétylé (en comparaison avec MyoD non-acétylé ou

non-acétylable) et le bromodomaine de CBP et p300 (Polesskaya et al, 2001a). Dans la même

étude, les auteurs montrent avec un système rapporteur que l’acétylation de MyoD augmente

significativement sa capacité à activer la transcription. Une étude très récente montre que

l’acétylation de la lysine 99 de MyoD est indispensable pour son interaction avec le

bromodomaine de CBP et que la double acétylation des lysines 99 et 102 est requise pour

l’interaction de MyoD avec p300 (Wei et al, 2008). De nombreux groupes qui ont étudié le

rôle de CBP et p300 dans la différenciation musculaire n’ont pas toujours discriminé la

présence de CBP et p300 dans les complexes HATs où est retrouvé MyoD. Cependant,

puisque le motif de reconnaissance de CBP et p300 se situe au niveau de la lysine 99, ceci

génère certainement un encombrement stérique prévenant la formation d’un complexe

contenant à la fois CBP et p300. Il est donc fort à parier que les complexes HAT dans

lesquels MyoD est retrouvé pour activer le programme myogénique contiennent soit p300,

soit CBP selon les gènes cibles de MyoD à activer.

Bien que p300 ait été identifié comme un coactivateur de MyoD et accroisse l’activité

transcriptionnelle de ce dernier (Sartorelli et al, 1997; Yuan et al, 1996), l’activité AT de p300

est dispensable pour l’activation des gènes cibles précoces de MyoD (Polesskaya et al, 2001b;

Puri et al, 1997). La protéine p300 agirait comme un pont moléculaire et permettrait le

recrutement de PCAF. Dans les myotubes différenciés, MyoD est en effet complexé avec

p300 (ou CBP) et PCAF. Ce complexe trimérique est capable de se lier à une boîte E in vitro,

suggérant que MyoD recrute p300 (ou CBP) et PCAF sur les promoteurs spécifiques du

muscle (Puri et al, 1997). Le démantèlement de ce complexe en neutralisant PCAF inhibe la

23

différenciation musculaire, indiquant que le recrutement de PCAF par MyoD, via p300/CBP,

est indispensable pour l’activation du programme myogénique. D’après une étude utilisant un

système rapporteur, il est proposé que l’acétylation des histones soit effectué par p300 et que

l’acétylation de MyoD soit effectué par PCAF (Dilworth et al, 2004). La liaison de MyoD à

certains promoteurs spécifiques est concomitante avec l’acétylation des histones (Bergstrom

et al, 2002). Cette acétylation favoriserait le recrutement du complexe de remodelage

SWI/SNF sur ces gènes cibles (de la Serna et al, 2005).

III.2.3.2 Les histones méthyl-transférases

L’arginine méthyl-transférase CARM1 a été impliquée positivement dans la myogenèse.

CARM1 (également appelée PRMT4) est un membre de la famille des PRMT (protein-arginine

N-methyltransferase) et catalyse la méthylation des résidus arginine sur une large série de

substrats. Par exemple, CARM1 peut méthyler l’histone H3 in vitro et est impliquée dans la

différenciation de différents types cellulaires. CARM1 stimule la myogenèse en étant associée

directement avec GRIP1 (le coactivateur du récepteur aux stéroïdes) et Mef2C dans un

complexe (Chen et al, 2002). De plus, Mef2 et CARM1 sont recrutés sur le promoteur de

MCK en condition de différenciation et l’inhibition de CARM1 inhibe la différenciation

musculaire en abolissant l’expression de facteurs de transcription clés de la différenciation

terminale, tels que Mef2 et la myogénine (Chen et al, 2002). Paradoxalement, CARM1 a

également été montré comme modifiant les arginines des histones H3R17 et H3R26 de la

région promotrice de la cycline E1, stimulant l’expression de la cycline E1 et de ce fait stimulant

la prolifération dans ces cellules (El Messaoudi et al, 2006). Cette étude n’a pas été réalisée

dans des cellules musculaires et la stimulation de l’expression de la cycline E1 reste à montrer

dans les myoblastes. Par ailleurs, il n’est pas exclu que CARM1 ait un double rôle, mais que

son rôle prédominant dans les myoblastes soit de stimuler la différenciation terminale.

Une autre protéine de la même famille, PRMT5, a également été montrée comme stimulant la

myogenèse. En effet, l’arginine diméthylée en position 8 de l’histone H3 (H3R8) et PRMT5

sont retrouvées au cours de la différenciation sur un promoteur cible de MyoD activé

précocement : le promoteur de la myogénine (Dacwag et al, 2007). Les auteurs montrent que

PRMT5 est nécessaire pour la diméthylation de H3R8 et la diminution de PRMT5 prévient la

fixation de Brg1, la sous-unités ATPasique du complexe SWI/SNF et de MyoD lui-même.

III.2.3.3 Le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF

Les membres de la famille du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF jouent

des rôles critiques dans le contrôle de la transcription. Les protéines SWI/SNF sont les

24

composants d’un complexe multimérique qui modifie la structure de la chromatine en altérant

les contacts entre ADN et histones au sein d’un nucléosome, d’une manière dépendante de

l’ATP (pour revue voir (Martens & Winston, 2003) et (Racki & Narlikar, 2008)). La sous-

unité ATPasique, Brm ou Brg1, du complexe SWI/SNF possède un motif appelé

bromodomaine, qui est capable de lier les résidus lysine acétylés dans la queue N-terminale

des histones in vitro. Plusieurs travaux ont mis en évidence un rôle essentiel de SWI/SNF

dans la transactivation des promoteurs musculaires médiée par MyoD. Il a tout d’abord été

montré que la conversion myogénique de fibroblastes par MyoD est inhibée par la

surexpression d’un mutant dominant négatif de Brm ou de Brg1 et au plan moléculaire, cela

se traduit par l’inhibition de la transcription de certains gènes cibles de MyoD, comme par

exemple la myogénine et MHC (de la Serna et al, 2001a). Par ailleurs, une autre étude montre

que la fixation du complexe SWI/SNF sur le promoteur de la myogénine nécessite la présence

de MyoD (de la Serna et al, 2005). De manière intéressante, une étude complémentaire

montre que les gènes cibles de MyoD impliqués dans la sortie du cycle cellulaire (p21, Rb,

Cycline D3) ne sont pas affectés par les mutants de Brm ou de Brg1 ; SWI/SNF interviendrait

donc au niveau de l’étape de différenciation elle-même, mais pas dans la sortie du cycle

cellulaire (de la Serna et al, 2001b).

Les sous-unités ATPasiques, Brm et Brg1, sont nécessaires pour la myogenèse dans les

cellules exprimant MyoD (de la Serna et al, 2001a; Roy et al, 2002). MyoD et Mef2

recruteraient le complexe SWI/SNF sur les gènes spécifiques du muscle pour activer leur

transcription pendant la différenciation musculaire. MyoD co-précipite ainsi avec p300,

PCAF et Brg1 dans l’extrait nucléaire de myoblastes en différenciation (Simone et al, 2004) et

ces protéines sont retrouvées (de pair avec MyoD) sur les promoteurs de la myogénine et de

MCK.

Une étude intéressante par Giacinti et ses collègues montre une relation entre le complexe

cdk9/cyclin T2 qui, de concert avec p300 et PCAF et le complexe de remodelage SWI/SNF,

est recruté par MyoD sur les promoteurs et les enhancers des gènes spécifiques du muscle. Ce

recrutement aboutit au final à l’acétylation des queues N-terminales des histones, au

remodelage de la chromatine et à la phosphorylation de l’ARN polymérase II sur ces sites,

permettant l’activation de la transcription des gènes cibles de MyoD (Giacinti et al, 2006).

Récemment et pour la première fois, SRA (steroid receptor RNA activator), un ARN non-codant,

a été montré associé à MyoD et à deux protéines ARN hélicases, p68 et p72. Comme le

suggèrent leurs expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette association serait

retrouvée sur certains loci. De plus, in vitro les auteurs montrent que la présence concomitante

Figure 13. Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme.

En réponse à une lésion, les cellules satellites sont activées et prolifèrent (a). Une partie descellules satellites réapprovisionnent le stock de cellules satellites quiescentes présentes sur lamyofibre grâce à un processus d’auto-renouvellement. Les cellules satellites vont migrer auniveau de la région endommagée (b), et en fonction de la gravité de la lésion, vont fusionnerà la fibre existante (c) ou vont s’aligner et fusionner entre elles pour produire une nouvellefibre musculaire (d). Dans la myofibre régénérée, les noyaux des cellules qui viennent defusionner sont initialement centraux (e), mais migreront plus tard vers la périphérie de lamyofibre.Figure adaptée de Hawke and Garry, Journal of Applied Physiology, 2001.

a. Activation et prolifération descellules satellites

b. Attraction parchimiotactisme des cellules

satellites vers la fibreendommagée

c. Fusion avec la fibreendommagée (hypertrophie)

d. Alignement et fusion pour produire unenouvelle myofibrille (hyperplasie)

e. Myofibrille régénérée avec un noyaucentral

25

de p68, p72 et SRA augmente significativement l’activité de MyoD dans un système

rapporteur. Par ailleurs, la présence de p68 et p72 faciliterait le remodelage de la chromatine

initié par Brg1 sur certains gènes cibles de MyoD (Caretti et al, 2006).

IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT

DE SON INNERVATION

IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites Le muscle squelettique des mammifères est capable de réaliser une régénération massive et

rapide en cas de dommage sévère. La régénération musculaire est caractérisée par une phase

dégénérative et une phase régénérative (Lecker et al, 2004). Dans un premier temps, les sites

lésés sont envahis par les cellules inflammatoires, notamment les neutrophiles et les

macrophages. La dégénération est suivie par la régénération et la réparation du muscle. La

phase de régénération est caractérisée par la prolifération des cellules myogéniques appelées

cellules satellites, situées le long de chaque fibre musculaire. La prolifération de ces cellules

permet de former un réservoir suffisant de cellules musculaires qui pourront alors fusionner

et remplacer les fibres musculaires lésées. En absence de stimuli, les cellules satellites sont

quiescentes et transcriptionnellement moins actives que les noyaux des myofibres.

L’activation des cellules satellites n’est pas restreinte à la zone lésée. Un dommage causé à

l’extrémité de la fibre musculaire peut activer les cellules satellites situées tout le long de la

fibre, conduisant à une prolifération et à une migration des cellules satellites vers le site de

régénération (Schultz et al, 1985). La particularité des cellules satellites est leur division

asymétrique qui permet de restaurer la réserve de cellules satellites au tour de la fibre

musculaire néo-formée. Après l’activation de leur prolifération, une partie des cellules

satellites fusionne pour régénérer le muscle et une autre partie retourne à l’état de quiescence

pour reconstituer la réserve de cellules satellites (Kuang et al, 2008) (figure 13).

Les processus d’activation et de différenciation des cellules satellites pendant la régénération

sont similaires à ceux observés durant la mise en place de la musculature embryonnaire. Les

cellules satellites sont caractérisées par l’expression du facteur de transcription Pax7 (Kuang

et al, 2006; Seale et al, 2000), et dans plusieurs muscles également Pax3 (Buckingham, 2007).

D’ailleurs les souris dont le gène Pax7 est inactivé ne possèdent (pratiquement) pas de

cellules satellites (Seale et al, 2000). Outre la mise en place des cellules satellites avant la

naissance, Pax7 aurait lui-même un rôle au cours de la régénération musculaire. Les cellules

26

satellites au repos expriment un récepteur de surface codé par le proto-oncogène c-Met. Le

récepteur c-Met possède une forte affinité de liaison pour l’agent chimiotactique HGF

(hepatocyte growth factor). La fixation de HGF sur c-Met régule une cascade de signalisation

aboutissant à l’expression des MRFs Myf5 et MyoD spécifiques des myoblastes et la

prolifération des cellules satellites (pour revue voir (Buckingham, 2001) et (Charge &

Rudnicki, 2004)). Les précurseurs myogéniques dérivent des cellules satellites activées. L’arrêt

de la prolifération des précurseurs va être déterminé à la fois par l’augmentation de

l’expression de facteurs myogéniques régulateurs (MRFs) Myf5 et MyoD, et par la diminution

de la régulation de Pax7 (pour revue voir (Charge & Rudnicki, 2004)). Il est proposé que dans

la différenciation musculaire Myf5 ait plutôt un rôle favorisant la prolifération transitoire des

précurseurs myogéniques (Ishibashi et al, 2005; Ustanina et al, 2007), alors que MyoD

favoriserait plutôt l’entrée en différenciation des précurseurs myogéniques (Ishibashi et al,

2005; Megeney et al, 1996; Ustanina et al, 2007). Le processus de formation des nouvelles

fibres musculaires est caractérisé par : (i) MyoD et la myogénine qui sont exprimés dans les

cellules satellites activées avant et après la fusion des myoblastes (Paoni et al, 2002; Pownall et

al, 2002; Yablonka-Reuveni & Paterson, 2001), (ii) l’isoforme embryonnaire de la myosine qui

est exprimée dans les fibres musculaires naissantes (Paoni et al, 2002) et (iii) l’isoforme de la

molécule d’adhérence des cellules neurales (NCAM) qui est exprimée dans les cellules

satellites activées et dans les myotubes nouvellement formés (Crameri et al, 2004; Mesires &

Doumit, 2002).

IV.2 Le muscle adulte est régulé par son innervation Pour fonctionner, le muscle est en connexion avec les motoneurones qui, sous impulsion

électrique, vont stimuler sa contraction. La formation et le maintien du muscle sont donc en

partie régulés par son innervation (Magnusson et al, 2005). La destruction du nerf entraîne

l’atrophie du muscle et engendre un processus de régénération pour compenser l’atrophie de

la fibre. Certaines observations montrent que pendant plusieurs semaines, voire les premiers

mois suivant la dénervation, la régénération de nouvelles fibres musculaires est souvent

suffisante pour maintenir, et parfois même augmenter, le nombre de fibres musculaires

viables (Mussini et al, 1987; Schmalbruch & Lewis, 2000). Cependant, lorsque la dénervation

est maintenue sur des périodes très longues (au-delà de deux mois), le muscle squelettique

perd sa capacité à se restaurer dans un état complètement structuré et fonctionnel, même

après régénération du nerf dans le muscle (Carlson & Faulkner, 1988).

27

La réponse à la dénervation est biphasique. La réponse initiale a lieu dans les premiers jours

suivants la dénervation, avant la mort d’aucune fibre musculaire, et se traduit par la formation

de nouvelles fibres musculaires, le long des fibres musculaires en atrophie. La deuxième phase

de la réponse myogénique n’a pas lieu avant deux à quatre mois post-dénervation. Ici

spécifiquement, la myogenèse se déroule de concert avec la mort de la fibre et la perte de

myocytes. Les signaux nécessaires pour activer les deux phases ne sont pas connus. Il a été

montré que la première phase de la réponse myogénique à la dénervation ne nécessite pas la

mort cellulaire. Dans ce cas l’activation des cellules satellites est probablement due aux

changements physiologiques immédiat qui se passent dans les myocytes dénervés, tels que les

changements des récepteurs à l’acétylcholine et les facteurs de transcription classiques du

muscle (MyoD, myogénine, Myf5, MRF4). Trois jours après dénervation, MyoD est exprimé à

son niveau maximum dans les cellules satellites, mais également dans les noyaux de la

myofibre (Ishido et al, 2004). De manière intéressante, les deux gènes cibles de MyoD

régulant positivement la différenciation musculaire, p21 et Rb, sont exprimés dans les noyaux

des myofibres, mais pas dans les cellules satellites. Ces deux gènes sont activés dans les

noyaux des myofibres lorsqu’elles sont dénervées. En fait, p21 et Rb auraient dans la myofibre

un rôle anti-apoptotique pour limiter son atrophie (Ishido et al, 2004).

Des études montrent que les muscles dénervés au-delà d’une période de deux mois

présentent des altérations dans leur réserve de cellules satellites qui se traduisent par un

nombre diminué de cellules satellites dont les noyaux sont plus petits et plus compacts et

dont l’activation est diminuée (Kujawa et al, 2004; Kujawa et al, 2005). Il n’est toujours pas

clair si la dénervation affecte directement les cellules satellites ou si le phénotype observé sur

ces cellules est dû à la libération de facteurs par les fibres musculaires en atrophie. Le groupe

de B. Carlson qui a étudié l’effet de la dénervation à long terme sur les cellules satellites,

propose qu’après une trop longue période de dénervation, la réponse myogénique démesurée

pour régénérer la fibre, finit par épuiser les cellules satellites (Borisov et al, 2005). De manière

intéressante, Batt et ses collègues ont étudié l’expression des gènes du cycle cellulaire pour

suivre l’activation de la prolifération des cellules activées après dénervation. Effectivement,

l’expression de facteurs favorisant la croissance cellulaire comme la cycline D1 ou c-Jun sont

augmentés de manière significative le premier mois qui suit la dénervation, puis chutent

complètement à leur niveau basal après trois de dénervation du muscle. Réciproquement, des

facteurs inhibant la progression cellulaire, comme p107 (protéine apparentée à la protéine

Rb), sont inhibés suivant le premier mois de dénervation puis leur expression est augmentée

au niveau basal après trois mois (Batt et al, 2005). Batt et ses collègues proposent que ce

28

schéma d’expression des régulateurs du cycle cellulaire observé pendant le premier mois

suivant la dénervation du muscle pourrait résulter en l’activation et la prolifération des

cellules satellites musculaires. La perte de cette réponse proliférative après trois mois

empêcherait l’augmentation de la masse musculaire et limite la capacité de régénération à trois

mois (Batt et al, 2005).

La fibre musculaire stimule la transcription d’un certain nombre de gènes après dénervation

pour maintenir sa fonction. De nombreuses études sur la régénération musculaire ont révélé

les gènes dépendants/sensibles à l’activité électrique dans le muscle. Ces gènes sont

susceptibles d’être des activateurs des cellules satellites. Parmi les gènes dont le niveau de

transcription est augmenté, plusieurs études ont notamment mis en évidence le gène Runx1

(Gonzalez de Aguilar et al, 2008; Zeman et al, 2009). De manière intéressante, l’expression de

Runx1 est fortement augmentée dans les muscles paralysés, pré-paralysés et dénervés

(Gonzalez de Aguilar et al, 2008). Cela est en accord avec les travaux du groupe de S. Burden

qui montrent pour la première fois que l’expression de Runx1 dans le muscle est régulée par

l’innervation (Zhu et al, 1994). En effet, dans le muscle squelettique de rat, l’expression de

Runx1 est augmentée de 50 à 100 fois cinq jours après la dénervation du muscle. Une

décennie plus tard, le même groupe de recherche montre que Runx1 participe positivement

au maintien de la fibre musculaire après dénervation. Dans cette étude, les auteurs montrent

que Runx1 est un facteur de transcription qui régule 29 gènes du muscle et la perte de Runx1

conduit à une accélération de l’atrophie liée à la dénervation (Wang et al, 2005).

29

Chapitre II Le Facteur de Transcription Runx1/CBFβ

I. INTRODUCTION : DECOUVERTE DE LA FAMILLE DE PROTEINES

A DOMAINE RUNT ET CBFβ

La famille de facteurs de transcription à domaine runt (appelée également protéines Runx) a

été étudiée et découverte par plusieurs groupes de recherche et dans des contextes très

différents. Pour comprendre d’où viennent les nombreuses dénominations des protéines à

domaine runt, et pour avoir un premier aperçu des rôles très variés de ces protéines, voici un

rapide historique de la découverte des protéines Runx et leur partenaire unique de

dimérisation, CBFβ.

PEBP2/PEA2/CBF lient les enhancers viraux murins

La découverte des facteurs de transcription de la famille Runx est due à des virologistes (pour

revue voir (Ito, 2008)). La découverte des enhancers de la transcription débute en 1981 avec

l’étude de l’enhancer du virus simien SV40 et du polyomavirus Py. De manière intéressante, Py

n’est capable d’infecter les cellules de carcinome embryonnaire (EC) que lorsqu’elles sont en

différenciation. Au début des années 80, la comparaison du Py sauvage aux Py mutants

capables d’infecter les EC non différenciées a révélé que ces mutations se trouvaient dans la

région enhancer du polyomavirus (Fujimura et al, 1981; Sekikawa & Levine, 1981; Vasseur et

al, 1980). L’analyse de cet enhancer a permis l’identification du facteur de transcription PEBP2

(Py Enhancer Binding Protein 2), exprimé dans les cellules EC en différenciation et se fixant à cet

30

enhancer. En 1985, quatre éléments de l’enhancer de Py sont identifiés et nommés PE-A à D

(Veldman et al, 1985) et en 1987, le groupe de M. Yaniv identifie deux facteurs liant l’élément

A, PEA1 et PEA2 (Piette & Yaniv, 1987). À nouveau, l’expression de ces deux facteurs n’est

retrouvée que dans les cellules EC différenciées (Furukawa et al, 1990; Piette & Yaniv, 1987).

Le facteur PEA2 est en fait identique à PEBP2 et sera reconnu plus tard comme une protéine

à domaine runt. Plus tard, le clonage de CBF (core binding factor) qui code pour une protéine

liant un site conservé sur l’enhancer du virus de la leucémie murine (MMLV), révèlera que CBF

est également identique à PEBP2/PEA2 (Wang et al, 1993).

Runt et Lozenge chez la drosophile

En 1990, le gène runt de la drosophile est découvert et classé comme un des gènes

appartenant à la classe des “pair-rule” et c’est le premier gène reporté dans la famille qui sera

plus tard appelée la famille RUNX ou la famille des facteurs de transcription à domaine runt

(Kania et al, 1990). Runt a d’abord été étudié comme un gène de segmentation, mais son rôle

s’est ensuite étendu à la détermination sexuelle et à la neurogenèse chez la drosophile. Les

travaux de recherche suggèrent que runt peut réguler la transcription, mais à cette époque-là,

runt n’avait pas de motif de liaison à l’ADN connu et sa fonction biochimique restait

relativement floue. En 1996, un second gène de la drosophile apparenté à runt a été découvert

et a été impliqué dans le développement des yeux et des cellules hematopoïétiques : il s’agit de

lozenge.

AML1 est impliqué dans les leucémies

En 1991, un membre de la famille de protéines à domaine runt a été découvert pour la

première fois chez l’Homme sous forme d’un gène de fusion : AML1/MTG8(ETO). Le gène

AML1 est situé sur le chromosome humain 21q2 et la translocation t(8;21) (q22; q22) est une

des anomalies les plus fréquentes du sous-type FAB-M2 (FAB = French-American-British

classification) de leucémie myéloïde aiguë (AML) (Miyoshi et al, 1991). Dans cette

translocation, le gène MTG8 (ou ETO) est fusionné du côté N-terminal au domaine Runt de

AML1 pour donner la protéine chimère AML1-MTG8. Le fait que AML1 soit impliqué dans

des translocations chromosomiques de manière récurrente lui a rapidement conféré son

activité oncogénique (Miyoshi et al, 1991). A ce moment-là, à part sa fonction clairement

oncogénique, la fonction biologique de AML1 n’était pas connue. En 1990 et 1991, le clonage

de Runt et AML1 révèle que ces séquences sont homologues et cette observation a

immédiatement suggéré que AML1 pouvait être impliqué dans le développement

31

embryonnaire des mammifères. Les expériences d’inactivation génique confirmeront des

années plus tard cette hypothèse.

En 1993, Ogawa et ses collègues mettent en évidence un lien clair entre PEBP2 dans les

cellules EC murines, Runt chez la drosophile et AML1 chez l’humain (Ogawa et al, 1993b).

Depuis 2004, une terminologie commune a été proposée pour harmoniser l’appellation de

PEPB2/PEA2/CBF/Runt/AML. L’ensemble de ces facteurs partage un domaine

d’homologie runt et en accord avec les recommandations de la Human Genome Organization, les

gènes codant ces facteurs ont été désignés « gènes apparentés à runt » (van Wijnen et al,

2004). Chez les mammifères la dénomination des protéines à domaine runt est Runx.

La protéine PEPB2β/CBFβ

La caractérisation de PEBP2 en 1990 par Kamachi et ses collègues a révélé en fait deux sous-

unités protéiques α et β (Kamachi et al, 1990). En 1993, Ogawa et ses collèges montrent que

PEBP2α et PEBP2β forment un hétérodimère qui a une activité de liaison à l’ADN (Ogawa

et al, 1993a). La découverte que la liaison de PEBP2α ou l’hétérodimère PEBP2α-β se trouve

exactement sur le même site sur l’ADN révèle une nouvelle classe de facteurs de

transcription. En effet, les facteurs de transcription dimériques connus jusqu’alors, tels que

AP-1 par exemple, reconnaissent la moitié du site de liaison. Pour être fonctionnel, Runx

(PEBP2α) se dimérise donc avec la protéine CBFβ (PEPB2β) pour former le facteur de

transcription dimérique CBF (Core Binding Factor) (Wang et al, 1996b). Le gène codant pour

CBFβ est également impliqué dans des translocations chromosomiques retrouvées dans les

leucémies myéloïdes aigues, notamment celle de type M4Eo (monocytaires avec éosinophilie)

(Hajra & Collins, 1995). Dans ces translocations, la partie du gène codant pour les 165

premiers acides aminés de CBFβ est associée au gène codant pour la chaîne lourde de la

myosine du muscle lisse (SMMHC ou gène MYH11) (Liu et al, 1993). La protéine chimère

CBFβ-SMMHC empêche la formation d’un facteur de transcription CBF fonctionnel (Hajra

et al, 1995).

II. EXPRESSION ET FONCTION DE RUNX1 ET CBFβ

II.1 Fonctions biologiques de Runx1 et de la sous-unité CBFβ chez les mammifères

Chez les mammifères, il existe trois gènes codant pour trois protéines Runx : Runx1, Runx2 et

Runx3 et un seul gène CBFb codant pour l’unique protéine CBFβ. Ces gènes sont des

Figure 14. Organisation des différents lignages hématopoïétiques.

Toutes les cellules circulant dans le sang périphérique sont dérivées des cellules soucheshématopoïétiques totipotentes (ou multipotentes). Cette cellule souche indéterminée peutdonner naissance à des cellules myéloïdes ou lymphoïdes en fonction des besoins du corps.L’hématopoïèse constitue l’ensemble des processus assurant le maintien d’un stock decellules souches hématopoïétiques, leur différenciation et leur maturation de manière àassurer le renouvellement à long terme de l’ensemble des cellules sanguines, myéloïdes etlymphoïdes, globules rouges et plaquettes.

Précurseur lymphoïdecommun

Précurseur myéloïde

ErythroblastesMégacaryoblastes

ErythrocytesPlaquettesMonocytes

Lymphocyte T Lymphocyte B

LeucocytesPolynucléaires

Précurseur érythroïde

PlasmocytesCellules Teffectrices

Cellule souche hématopoïétique

32

régulateurs clés de l’expression génique spécifique du lignage cellulaire dans des voies

majeures du développement. Ce sont d’ailleurs des gènes qui sont apparus très tôt au cours de

l’évolution et qui partagent une grande similitude de structure chez les mammifères (Levanon

et al, 2003; Rennert et al, 2003) et pour revue voir (Coffman, 2003)).

Les souris doublement inactivées pour Runx1 meurent au jour embryonnaire E12,5 et

présentent une hémorragie massive, principalement dans le système nerveux central,

suggérant que Runx1 est nécessaire pour la formation des vaisseaux sanguins. De plus,

l’hématopoïèse dans le foie fœtal est complètement bloquée. L’hématopoïèse normale se

déroule par une succession de vagues de différenciation. La première est appelée

hématopoïèse primitive et se déroule dans le sac vitellin où sont formés les érythrocytes

nucléés. La seconde vague de différenciation est l’hématopoïèse définitive et produit des

cellules d’une multitude de lignages, telles que les cellules lymphoïdes, myéloïdes et

érythroïdes (figure 14). Les expériences d’inactivations géniques (KO) ont révélé que Runx1

n’affecte pas l’hématopoïèse primitive, mais est indispensable pour l’hématopoïèse définitive

(Okuda et al, 1996; Wang et al, 1996a).

Des études complémentaires utilisant des souris transgéniques ont permis d’étudier davantage

le rôle de Runx1 au cours de l’hématopoïèse, en inactivant de manière conditionnelle le gène

Runx1 (par délétion d’exon) chez la souris adulte. Les phénotypes observés dans ces études

diffèrent légèrement en fonction des conditions d’inactivation du gène Runx1, mais tous

présentent une réduction du nombre de lymphocytes B et T matures ainsi que des

thrombocytes dans le sang périphérique. Plusieurs études ont tenté de caractériser l’étape de

maturation des lymphocytes bloquée par l’absence de la protéine Runx1 fonctionnelle.

Growney et ses collègues ont ainsi montré que le nombre de progéniteurs lymphocytaires

communs (PLC) est diminués de sept fois dans la moelle osseuse par rapport aux souris

« contrôle » (Growney et al, 2005). De plus, les pro- et pré-lymphocytes B sont pratiquement

indétectables et les lymphocytes B matures sont réduits de 20% en absence de la protéine

Runx1 fonctionnelle (Growney et al, 2005). Dans la rate également, le nombre de

lymphocytes B mature est diminué au bénéfice des formes immatures (Putz et al, 2005). Dans

le thymus, la population de lymphocytes T est retrouvée dans les mêmes proportion que dans

la rate : il y a une augmentation des formes très immatures de lymphocytes T (double négatifs

CD4-/CD8-) au détriment des formes matures ou en cours de maturation (Putz et al, 2005).

Les groupes de H. Hirai et de D. Gilliland ont montré que le blocage de la maturation des

lymphocytes T dans le thymus se fait à la transition DN2 (CD44+CD25+) - DN3 (CD44-

CD25+) (Growney et al, 2005; Ichikawa et al, 2004). Ces observations expliquent la

33

lymphocytopénie observée dans le sang périphérique (Growney et al, 2005; Ichikawa et al,

2004; Putz et al, 2005).

Par ailleurs, la perte de la protéine Runx1 fonctionnelle ne modifie pas le taux de globules

rouges (érythrocytes) dans le sang circulant ou dans la moelle osseuse, ni le taux de

granulocytes neutrophiles (Growney et al, 2005; Ichikawa et al, 2004; Putz et al, 2005). En

revanche dans le lignage myéloïde, Runx1 semble indispensable pour la maturation des

mégacaryocyte qui donneront plus tard les thrombocytes. En effet, après l’inactivation

fonctionnelle du gène Runx1, on observe une diminution dramatique des thrombocytes dans

le sang périphérique, concomitante avec une diminution des mégacaryocytes matures dans la

moelle osseuse (Growney et al, 2005; Ichikawa et al, 2004; Putz et al, 2005).

Au moins deux études ont corrélé la perte de la protéine Runx1 fonctionnelle à un phénotype

myéloprolifératif. Le groupe de F. Buchholz note qu’après deux mois d’inactivation

fonctionnelle du gène Runx1, la taille de la rate était augmentée de manière significative,

suggérant une splénomégalie liée à l’absence prolongée d’une protéine Runx1 fonctionnelle.

Les auteurs rapportent que le volume de la pulpe rouge (compartiment myéloïde) est

augmenté, au détriment de la pulpe blanche (compartiment lymphoïde) (Putz et al, 2005).

Dans la pulpe rouge, la quantité de granulocytes neutrophiles et de monocytes était très

augmentée, bien que leur taux reste normal dans le sang périphérique. La splénomégalie

observée (en absence de la protéine Runx1 fonctionnelle) serait donc liée à une population

plus importante de progéniteurs myéloïdes et non pas à un blocage de la différenciation. De

plus, le groupe de D. Gilliland a observé une légère hyperplasie myéloïde dans les tissus

hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris lorsque le gène Runx1 est fonctionnellement

inactivé. Il y a donc une augmentation significative des formes myeloides en maturation et

une hypercellularité dans la moelle osseuse (Growney et al, 2005) et dans la rate (Putz et al,

2005).

Le rôle de CBFβ dans le développement normal est très lié à celui de Runx1. En effet, la

délétion de CBFb chez les souris se traduit par la perte de l’hématopoïèse définitive à partir

des cellules précurseurs, comme chez les souris déficientes pour Runx1. CBFβ forme un

hétérodimère avec Runx1 pour augmenter son interaction avec l’ADN et la régulation de

l’expression de leur gènes cibles. Ceci suggère que l’un des mécanismes par lequel Runx1 est

capable de maintenir la différenciation normale implique CBFβ, permettant ainsis de former

un hétérodimère CBFβ/Runx1 actif (Sasaki et al, 1996; Wang et al, 1996b).

Figure 15. Organisation du gène RUNX1 humain.

A) Illustration de la région régulatrice et de la région codante du gène humain RUNX1. Lenuméro du chromosome humain où est situé le gène RUNX1 est indiqué à gauche. Lesgènes voisins CLIC6 et DSCR1 conservés pour les trois gènes RUNX sont indiqués en avaldu gène RUNX1. Les deux promoteurs P1 et P2 sont également représentés ainsi que lescodons d’initiation ATG leur correspondant. Les régions 5’UTR sont indiquées en jaune eten orange et le 3’UTR est symbolisé en bleu. B) Schéma de la structure du 5’UTRcorrespondant au promoteur distal P1. Il contient 4 exons dont les 2 du milieu sont épissésalternativement et désignés «  exon/intron  ». RR symbolise la position de deux sites defixation de la protéine Runx. C) Représentation du 5’UTR correspondant au promoteurproximal P2. Cet UTR recouvre un exon qui se termine par un site d’épissage dans l’exonindiqué «  AG  », précédé du signal de branchement intronique CTRAY. Le 5’UTR dupromoteur P2 contient un IRES et est entouré d’un ilôt CpG exceptionnellement largemarqué par un nuage gris clair.Figure extraite de Levanon and Groner, Oncogene, 2004.

A

B C

34

Satake et ses collègues ont étudié l’expression de CBFb et Runx1 dans plusieurs tissus de

souris âgées de quatre mois. Parmi les tissus observés, Runx1 est particulièrement abondant

dans le thymus et dans une moindre mesure dans les poumons. En revanche, la sous-unité

CBFβ apparaît exprimée de manière quasi ubiquitaire en montrant une bonne détection de

ses transcrits dans le cerveau, les poumons, le cœur, le thymus, le foie et les testicules, et dans

une moindre mesure dans la rate et les reins (Satake et al, 1995). Chez les souris adultes, le

transcrit de CBFb est également abondant dans le muscle squelettique (Chiba et al, 1997; Zhu

et al, 1994). Une autre étude sur les embryons de souris montre, par hybridation in situ, qu’au

cours du développement CBFb est présent dans le système nerveux central, la racine dorsale,

le nerf crânien, les yeux, les bourgeons des membres, les somites et les côtes (Adya et al,

2000; Wang et al, 1996b). Une autre étude sur des embryons de souris montre que Runx1 est

détecté dans l’épithélium des glandes salivaires, des bronches, des muqueuses olfactives et

respiratoires de la cavité nasale, du palais, des muqueuses de l’œsophage et de l’estomac

(Levanon et al, 2001a). Runx1 est également trouvé dans le mésenchyme, dans la région

vacuolaire du cœur, de la ligne médiane thoracique et abdominale, dans le stroma ovarien et

les parties génitrices extérieures (Levanon et al, 2001a).

II.2 Organisation génomique de Runx1 et CBFb Les gènes codant le domaine runt sont retrouvés en phylogénie dans divers organismes. Les

organismes inférieurs contiennent une seule copie du gène Runx et en remontant l’échelle

phylogénétique vers les arthropodes et les vertébrés, les gènes Runx se multiplient par

duplication du gène original (pour revues voir (Rennert et al, 2003; Robertson et al, 2009;

Sullivan et al, 2008)). Les trois protéines Runx1, Runx2 et Runx3 humaines et murines sont

codées respectivement sur les chromosomes humains 21q22.2, 6p21 et 1p36.1 ou sur les

chromosomes murins 16, 17 et 4 (Avraham et al, 1995; Bae et al, 1995; Calabi et al, 1995;

Levanon et al, 1994). L’unique gène codant pour CBFb chez les mammifères est porté sur le

chromosome 16q22 chez l’homme ou sur le chromosome 8 chez la souris (Adya et al, 2000).

II.2.1 Les deux promoteurs de Runx1 et l’épissage alternatif de son ARNm sont à l’origine de ses nombreuses isoformes

Les trois gènes Runx de mammifères ont une structure très conservée qui s’étend au-delà du

locus Runx lui-même pour inclure les gènes voisins paralogues CLIC et DSCR. Les éléments

similaires entre les trois gènes Runx incluent également les éléments de régulation de leur

expression, comme leurs deux promoteurs P1 (distal) et P2 (proximal). Le promoteur P2 est

situé dans un grand îlot CpG, contrairement au promoteur P1. En revanche, une autre région

35

CpG est rerouvée en 3’, au niveau du dernier exon des gènes Runx (Bangsow et al, 2001;

Levanon et al, 2001b), (figure 15). Ensemble ces deux régions CpG bordant les gènes Runx

pourraient être liées à l’expression spécifique de tissu des gènes Runx. Par exemple, le

promoteur P2 de Runx3 est hyperméthylé dans les lignées de cancers gastriques (Li et al,

2002).

Chaque promoteur (P1 et P2) contient plusieurs sites consensus pour la fixation des protéines

Runx, suggérant l’existence de régulations croisées et de boucles d’auto-amplification des

gènes Runx. Cependant, les expériences d’inactivation génique de chacun des gènes Runx

montrent que l’expression des autres gènes Runx n’est pas perturbée et donc l’hypothèse

d’une boucle d’auto-amplification est plus probable qu’une régulation croisée. De manière

intéressante, sur les gènes Runx humains et murins, deux sites de fixation de Runx sont

disposés de la même manière, au commencement du 5’ UTR du promoteur P1 sur une

séquence de 18 paires de bases parfaitement conservée (Bangsow et al, 2001).

La présence de deux promoteurs est à l’origine de deux isoformes protéiques majeures de

Runx1 qui diffèrent par leur extrémité N-terminale. Pour la protéine Runx1 humaine,

l’isoforme de type I produite à partir du promoteur P2, contient le pentapeptide MRIPV à

l’extrémité N-terminale et correspond à l’isoforme AML1b humaine (Runx1-P2). La partie

N-terminale de l’isoforme II, produite à partir du promoteur P1, est plus longue (entre 19 et

32 résidus) et, est initiée par la séquence MASN/DS et correspond à l’isoforme AML1c

humaine (Runx1-P1). En ce qui concerne le gène humain RUNX1, la région 5’ UTR de P1

fait 452 pb et la région 5’ UTR de P2 est particulièrement longue et compte 1631 pb.

L’isoforme produite à partir du promoteur proximal P2 est exprimée de manière dominante

par rapport à l’isoforme produite à partir du promoteur distal P1. D’ailleurs, lorsque l’on

regarde la conservation des gènes Runx entre espèces, on s’aperçoit que chez les invertébrés,

tous les gènes Runx connus commencent par une région 5’ UTR longue et une séquence

amino-terminale qui ressemble au pentapeptide produit à partir du promoteur P2 chez les

vertébrés. Ces données suggèrent que P2 est le promoteur ancestral du gène Runx (pour

revue voir (Rennert et al, 2003).

De manière intéressante, la transcription du gène Runx1 à partir du promoteur P1 ou P2 varie

au cours du développement. Par exemple, dans les cellules souches embryonnaires murines

en différenciation, Runx1-P1 a une expression plus tardive par rapport à Runx1-P2 (Fujita et

al, 2001). De même, les cellules souches embryonnaires humaines en culture expriment

Runx1-P2 mais pas Runx1-P1, alors qu’en cours de différenciation ces cellules expriment

Runx1-P1 (Zambidis et al, 2005).

Figure 16. Structure génomique et variants d’épissage de CBFβ.

Les nombreux produits d’épissage et la structure résultante de l’ADNc de CBFβ sontprésentés sous forme de diagramme en dessous de sa structure génomique et les acidesaminés bordant chaque exon sont inscrits au-dessus de la bordure de l’exon. Les deuxséquences d’acides aminés différentes, codées par l’exon 6 et générées par l’épissagealternatif d’un site donneur à la fin de l’exon 5, sont représentées par un motif différent surle dernier exon (damier ou stries). Le nombre d’acides aminés et le poids moléculaire (enkDa) sont indiqués à gauche de chaque variant d’épissage entre parenthèses.Figure extraite de Adya et al, Cell Developmental Biology, 2000.

Structure génomique de CBFβ

36

La traduction de l’ARN messager est dépendante de Cap pour le promoteur P1, alors qu’elle

est dirigée par un IRES pour le promoteur P2. La traduction passant par l’IRES peut avoir

lieu lorsque la traduction par Cap est physiologiquement bloquée, par exemple pendant la

mitose, la différenciation ou des conditions de stress (p.e. en présence de protéases virales).

Ainsi, les différentes conditions de traduction d’un ARNm codant Runx représentent un

niveau de régulation supplémentaire pour l’expression d’une isoforme par rapport à une

autre. En plus des deux extrémités N-terminales alternatives des gènes Runx, les ARN

messagers sont soumis à un épissage alternatif, générant ainsi de nombreuses isoformes pour

chacun des gènes Runx avec différentes fonctions biologiques ((Levanon et al, 2001b) et pour

revue voir (Levanon & Groner, 2004)). Par exemple, l’isoforme humaine AML1a, transcrite à

partir du promoteur P2, ne possède pas de domaine de transactivation (Miyoshi et al, 1995).

II.2.2 La protéine CBFβ et ses isoformes

Chez les vertébrés et les invertébrés, la protéine CBFβ est codée par un seul gène, excepté

chez la drosophile qui contient deux gènes homologues Brother (Bro) et Big brother (Bgb). Les

gènes humains et murins codant pour CBFβ contiennent 6 exons et sont soumis à un

épissage alternatif générant au final quatre isoformes (figure 16). Les isoformes longues de

182 et 187 résidus diffèrent par leur partie C-terminale (figure 16). Ces deux isoformes

conservent parfaitement les 135 acides aminés nécessaires pour la dimérisation et la

stimulation de la liaison à l’ADN de Runx1, bien que l’isoforme CBFβ(187) stimule plus

efficacement la transactivation de l’enhancer S3-3MLV (Zaiman et al, 1995). C’est d’ailleurs

l’isoforme murine CBFβ(187) que j’ai utilisée dans mes expériences de co-transfection et

pour établir la lignée cellulaire surexprimant stablement CBFβ (voir le chapitre « Article de

Recherche »). Les isoformes de 148 et 155 résidus sont générées par un épissage alternatif de

l’exon 3 et de l’exon 5 respectivement (figure 16). Ces deux dernières isoformes ne se

dimérisent pas stablement avec Runx1 (Ogawa et al, 1993a; Wang et al, 1993). La séquence

codante de CBFβ est très conservée entre l’Homme et la Souris (93% de conservation) et la

séquence en acides aminés également (99% de conservation) (Adya et al, 2000).

Chez la souris, le gène CBFb est transcrit à partir d’un promoteur distal qui s’étend des

nucléotides -1496 à -1061 et d’un promoteur proximal qui s’étend des nucléotides -1127 à -

251. Le promoteur distal contient trois sites de fixation TRE reconnus par AP-1 et le

promoteur proximal contient un site TRE et un site CRE (reconnu par CREB). L’expression

de CBFb via son promoteur proximal est entre autre activée par le facteur AP-1 formé de

l’homodimère JunB-JunB ou de l’hétérodimère JunB-ATF2. De manière intéressante, les

souris déficientes pour JunB meurent à un stade embryonnaire et les phénotypes obtenus

Figure 17. Structure du complexe formé du domaine runt de Runx1, CBFβ et l’ADN.

L’ADN est représenté en orange et en jaune. CBFβ est représenté en violet et le domainerunt de Runx1 est coloré en cyan. Les boucles du domaine runt en contact avec le grandsillon de l’ADN sont colorées en bleu (boucle C-terminale) et en rouge, alors que la boucleen contact avec le petit sillon de l’ADN est colorée en vert.Figure extraite de Zhang et al., Blood Celles, Molecules and Diseases, 2003.

37

pour les souris dont le gène JunB a été inactivé montre un phénotype étonnamment similaire

à celui des souris déficientes en CBFb. Par ailleurs, une étude du transcriptome dans les

cellules endothéliales de souris a révélé que CBFb était bien un gène cible de JunB. D’ailleurs

dans la moelle osseuse de souris déficientes en JunB, le niveau d’expression de CBFb est

diminué de 60% par rapport aux souris contrôles. Ceci montre que la régulation de

l’expression de CBFb est hautement dépendante de AP-1, en tout cas dans les cellules

endothéliales murines (Licht et al, 2006).

II.3 Relation Structure/ Fonction II.3.1 La sous-unité protéique Runx1

Plusieurs domaines de la protéine Runx1 ont été conservés à travers l’évolution. On peut

notamment citer le domaine runt, les domaines d’autoinhibition, le domaine VWRPY, les

domaines de transactivation et la séquence de localisation nucléaire.

II.3.1.1 Le domaine runt de Runx1 : hétérodimérisation avec CBFβ et liaison à l’ADN

La famille de protéines à domaine runt est une famille de facteurs de transcription très

conservés, incluant Runt et Lozenge exprimés chez la drosophile, SpRunt chez les oursins,

Cs-Runt chez l’araignée (Cupiennius salei), Xam1 chez le xénope, Runx1, Runx2 et Runx3

chez les mammifères, RNT-1 (Caenorhabditis elegans). Le domaine runt (RD) est la signature

de cette famille de protéines. C’est un motif conservé de 128 acides aminés, responsable à la

fois pour la liaison à l’ADN de manière spécifique de séquence et de la dimérisation avec

CBFβ (Kagoshima et al, 1993). Le domaine runt de Runx1 interagit avec une région de 135

acides aminés de la protéine CBFβ. La stœchiométrie du complexe [Runx-CBFβ-ADN]

prédite et vérifiée est de 1:1:1. (Bravo et al, 2001; Ogawa et al, 1993a; Tang et al, 2000a;

Zhang et al, 2003). Des études de fixation de la protéine Runx1 montrent qu’elle a une

affinité réduite à l’ADN, par rapport au domaine runt seul, suggérant l’existence de

domaine(s) inhibiteur(s) hors du domaine runt. Cette inhibition de fixation à l’ADN est levée

par la liaison de CBFβ à Runx1, stimulant ainsi sa fixation à l’ADN d’au moins quarante fois.

Au sein du domaine runt, les régions respectivement impliquées dans l’interaction avec CBFβ

et la fixation à l’ADN sont distinctes et ne se chevauchent pas (Nagata & Werner, 2001)

(figure 17).

Comme il sera mentionné dans la section « II.3.1.2 Les domaines d’autoinhibition (NRHn,

NRDBn et NRHc », la dimérisation de CBFβ avec Runx1 peut être induite et stimulée par

d’autres facteurs de transcription, tel que Ets-1. Cependant, Runx1/CBFβ a un rôle dans des

Figure 18. Domaines fonctionnels de la protéine Runx1.

Représentation schématique des domaines fonctionnels de la protéine Runx1.RD : domaine runt ;AD : domaine d’activation de la transcription ;ID : domaine d’inhibition de la transcription ;TE1, 2 et 3 : éléments d’activation de la transcription ;NLS : séquence de localisation nucléaire ;NRDBn et NRDBc : régions de régulation négative de la fixation à l’ADN, respectivementlocalisées en N-terminal et C-terminal;NRHn et NRHc : région de régulation négative de l’hétérodimérisation, respectivementlocalisées en N-terminal et en C-terminal;Association à la matrice nucléaire : région associée étroitement à la matrice nucléaire.Figure adaptée de Ito, Genes to Cells, 1999.

Association à la matrice nucléaire

59

70

173

Liaison à l’ADN

Hétérodimérisation

38

tissus où Ets-1 n’est pas exprimé, donc Ets-1 n’est clairement pas le seul facteur à stimuler la

formation du dimère Runx1/CBFβ et sa fixation à l’ADN. Il existe d’autres facteurs de

transcription connus pour coopérer avec Runx1, incluant par exemple Myb (Hernandez-

Munain & Krangel, 1995), C/EBPα (Zhang et al, 1996), MITF (Ogihara et al, 1999) et les

facteurs SMADs (Hanai et al, 1999), bien que pour ces facteurs aucune étude n’ait montré

leur rôle fonctionnel dans la stimulation de la liaison à l’ADN de Runx1/CBFβ.

La séquence consensus de liaison à l’ADN du dimère Runx1/CBFβ est PuT/ACCPuCA

(Kamachi et al, 1990). Pour davantage de précisions sur les propriétés de liaison à l’ADN de

Runx/CBFβ, voir les travaux des groupes de John Bushweller et Nancy Speck (Crute et al,

1996; Huang et al, 1998b; Huang et al, 1999; Tang et al, 2000a; Tang et al, 2000b), Peter

Gergen (Kagoshima et al, 1993) et Yoshiaki Ito (Ogawa et al, 1993b).

II.3.1.2 Les domaines d’autoinhibition (NRHn, NRDBn et NRHc)

Les protéines Runx contiennent des domaines d’auto-inhibition qui masquent le domaine

runt de liaison à l’ADN. En effet, les hétérodimères Runx/CBFβ (CBF) formés à partir des

sous-unités sauvages ont une liaison faible pour l’ADN. Cependant, si les régions amino- et

carboxy- terminales au domaine runt sont enlevées, le domaine runt « nu » lie l’ADN

correctement, suggérant que ces régions adjacentes masquent la surface de liaison à l’ADN du

domaine runt. Il a été suggéré que l’hétérodimérisation des sous-unités Runx1 et CBFβ

pourrait donc être bloquée aussi par ces régions. La régulation de la dimérisation de ses sous-

unités fait partie des mécanismes qui régulent l’activité du facteur de transcription CBF.

Sachant que la dimérisation des deux sous-unités est nécessaire pour former un facteur de

transcription CBF actif, il est proposé que Runx1 soit synthétisé dans une forme native inerte,

au sein de laquelle la régulation négative intramoléculaire de Runx empêche son interaction

avec l’ADN ainsi que sa liaison à CBFβ.

En se référant à la protéine Runx1 humaine, la région comprenant les acides aminés 1 à 49

représente à la fois le domaine d’inhibition de liaison à l’ADN (NRDBn) et de dimérisation

avec CBFβ (NRHn) (figure 18). En effet, si cette région est enlevée, la dimérisation

Runx1/CBFβ et la fixation du dimère sur l’ADN augmentent de manière significative. De la

même manière, du côté C-terminal, une autre région a été montrée comme inhibant la

formation de l’hétérodimère Runx1/CBFβ et s’étend des résidus 372 à 451 (NRHc), bien que

le domaine exact d’inhibition n’est pas été précisément délimité (figure 18). D’autres mutants

de délétion ont montré que la protéine Runx1 humaine tronquée après le 291ème résidu (1-

291), s’hétérodimérise bien avec CBFβ mais lie faiblement l’ADN, alors que le mutant

Figure 19. Interaction particulière entre Runx1 (humain) et Ets-1 sur le site composite PBS(PEBP2 binding site) et les site EBS (Ets binding site).

Représentation de la conformation de Runx1 (A), de Ets (B) et du dimère Runx-Ets sur l’ADN(C). Runt : domaine runt; ETS: domaine Ets; Ex;VII : région codée par l’exon 7; N et C: lesextrémités N- et C-terminale de la protéine; EI et EII : les région qui intéragissent avec lesrégions PI et PII de Ets-1; PBS : site de fixation de CBF sur l’ADN; EBS : site de fixation de Etssur l’ADN; NRDB et NRH : voir figure 17 pour la légende.(Figure extraite de Ito,Genes to Cells, 1999)

39

tronqué après le 177ème résidus (1-177) s’hétérodimérise avec CBFβ et se lie à l’ADN. Il existe

donc une autre région d’inhibition de la fixation à l’ADN comprenant les acides aminés 178 à

291, appelée NRDBc (figure 18).

De manière intéressante, Ets-1, une autre protéine qui se fixe sur l’enhancer du polyomavirus

Py, possède également un domaine d’auto-inhibition qui limite la liaison à l’ADN du facteur

sur son site consensus (Kim et al, 1999). Les sites consensus de Runx1 et Ets-1

(respectivement nommés PBS et EBS) sont retrouvés à proximité dans les régions

régulatrices de nombreux gènes, notamment les gènes spécifiques des cellules T, tels que ceux

codant les récepteurs α et β (TCRα et TCRβ). La présence de Runx1 et Ets-1 seuls (en

absence de CBFβ) suffit pour stimuler leur fixation à l’ADN (figure 19). Dans le cas présent,

il est même suggéré que CBFβ ne se lie à Runx1 qu’après la fixation à l’ADN de Runx1 et

Ets-1, conférant ainsi à Ets-1 le rôle potentiel de médiateur de l’interaction entre Runx1 et

CBFβ. En fait, l’interaction de Runx1 et Ets-1 via leur domaine d’auto-inhibition, permet

l’exposition de leur domaine de liaison à l’ADN et l’activation consécutive de TCRα et TCRβ

(Kim et al, 1999). Il n’est pas clair si CBFβ lie le complexe Runx1/Ets-1 avant ou après que le

complexe soit en contact avec l’ADN.

II.3.1.3 Le motif VWRPY

Un domaine également conservé dans la famille à domaine runt est un motif de cinq acides

aminés dans la partie carboxy-terminale: VWRPY (figure 18). Ce motif est parfaitement

conservé chez l’homme, la souris, la drosophile, excepté pour C. elegans qui possède le motif

VWRPF. La fonction de ce motif est complètement indépendante de l’activité de

dimérisation ou de liaison à l’ADN de Runx/CBFβ. Le motif WVRPY est reconnu et lié par

la protéine de drosophile Groucho ou son homologue chez les mammifères, TLE (Aronson

et al, 1997; Nishimura et al, 2004). Groucho/TLE sont impliqués dans la répression de la

transcription, comme il est décrit dans la section « III- Régulation de l’Activité du Facteur de

Transcription CBF ».

II.3.1.4 Le domaine d’activation de Runx1

En utilisant un système rapporteur dans la lignée cellulaire Jurkat, des mutants de délétion de

Runx1 ont permis d’identifier un domaine d’activation de la transcription en C-terminal par

rapport au domaine runt (Kanno et al, 1998). Il existe ainsi un domaine majeur d’activation

dans la région 291 à 371 (positions des résidus dans la protéine Runx1-P2 murine). L’activité

de transactivation de ce domaine est inhibée par le domaine adjacent allant des résidus 371 à

411, qui est donc un domaine inhibiteur. Une région minimale de transactivation a été

Figure 20. Changement de conformation de Runx1 après dimérisation avec CBFβ.

La dimérisation de CBFβ avec Runx1 permet un changement de conformation de Runx1 etl’exposition du domaine de liaison à l’ADN. Runt: le domaine runt; β: la sous-unité CBFβ;NRDB: domaine de régulation négative de liaison à l’ADN; PBS: site de fixation de CBF surl’ADN. Pour simplifier cette figure, les domaines d’activation et d'inhibition de latranscription n’ont pas été représentés.(Figure extraite de Ito,Genes to Cells, 1999)

40

identifiée en testant d’autres mutants de délétion de Runx1-P2. L’élément de transactivation

(TE) minimal s’étend ainsi des résidus 291 à 331 (TE1) et la région adjacente à TE1 qui

comprend les résidus 332 à 371 (appelée TE2) augmente significativement la transactivation

du mutant de Runx1-P2 (figure 18). Enfin, un autre TE a été identifié car le mutant de

délétion TE3 (résidus 243-191) possède, lui aussi une activité de transactivation (Kanno et al,

1998) (figure 18).

Il existe également une région d’activation dans la partie amino-terminale de Runx1 mettant

en jeu la partie adjacente au domaine runt et l’hélice α du runt domaine lui-même. C’est une

région acide de 26 résidus très conservée entre les trois protéines Runx de mammifères (Liu

et al, 2006) (figure 18).

II.3.1.5 Le signal de localisation nucléaire

Les protéines Runx contiennent un signal de localisation nucléaire (NLS) conservé dans la

partie C-terminale au domaine runt qui permet la localisation des protéines Runx dans le

noyau de la cellule. De plus, les protéines Runx possèdent également une séquence ciblant la

matrice nucléaire (NMTS) comprenant les résidus 324-353 chez Runx1-P2 murin (Kanno et

al, 1998) ou 351-381 chez son homologue Runx1-P2 humain (Zeng et al, 1997). L’association

du facteur CBF à la matrice nucléaire serait un pré-requis pour la transactivation par Runx1-

P2 (Zeng et al, 1998), d’ailleurs, la séquence NMTS de Runx1 comprend le domaine

d’activation (TE1 et TE2) (Kanno et al, 1998) (figure 18).

II.3.2 La sous-unité protéique CBFβ

La protéine CBFβ est une petite protéine de 22 kDa environ. Elle ne possède pas de

domaines particuliers : pas de NLS, pas de NES, pas de site de liaison à l’ADN. Le rôle le

plus important pour CBFβ est de lier le domaine runt et induire un changement de

conformation de Runx qui expose ainsi le domaine de liaison à l’ADN (figure 20).

La comparaison des constantes de dissociation [Runx-ADN] et [Runx-CBFβ-ADN] montre

que CBFβ augmente l’affinité de liaison à l’ADN de Runx. Le mécanisme de stabilisation de

la fixation de Runx à l’ADN par CBFβ n’est pas encore clairement défini, en revanche la

structure du dimère a été élucidée par le groupe de Bushweller (Huang et al, 1999; Tang et al,

2000a; Zhang et al, 2003). Ce groupe a également montré que les 141 premiers acides aminés

(1-141) suffisaient à CBFβ pour se lier au domaine runt avec la même efficacité que la

protéine complète (182 ou 187 résidus) (Zhang et al, 2003). Ce fragment N-terminal de 141

résidus est également capable de restaurer l’hématopoïèse terminale dans les cellules souches

embryonnaires déficientes en CBFb (Miller et al, 2001). Il est possible que ce domaine soit le

41

seul requis pour la fonction de CBFβ in vivo. Finalement, la région minimale pour la

dimérisation de CBFβ avec le domaine Runt est située au niveau des 135 premiers acides

aminés, et les 117 premiers acides aminés sont nécessaires pour stimuler la liaison à l’ADN de

Runx (Kagoshima et al, 1996).

Bien que CBFβ ait été décrit à de nombreuses reprises comme un partenaire indispensable à

la fonction des protéines Runx, une étude sur l’embryon d’oursin montre que pour

l’activation de certains gènes cibles de Runx, SpCBFβ (homologue de CBFβ chez l’oursin)

n’est pas indispensable. Selon cette étude, SpCBFβ jouerait un rôle fondentamental avec

Runx préférentiellement pour une catégorie de gènes impliqués dans les voies de

différenciation cellulaire (Robertson et al, 2006).

La dimérisation de Runx avec CBFβ ne fait pas qu’augmenter l’affinité de Runx pour l’ADN.

En effet, CBFβ a récemment été montré comme protégeant Runx de sa dégradation par le

protéasome (Huang et al, 2001). En effet, Runx1 est soumis à une dégradation protéolytique

par la voie ubiquitine/protéasome. Ici encore CBFβ joue un rôle important en protégeant

Runx1 de sa dégradation car en se dimérisant avec Runx1, CBFβ stabilise la protéine. Les

données sur les souris déficientes pour CBFb soutiennent ces conclusions, puisque le niveau

protéique de Runx1 dans ces souris est plus faible que dans les souris sauvages.

III. REGULATION DE L’ACTIVITE DU FACTEUR DE

TRANSCRIPTION CBF

Plusieurs gènes cibles des facteurs de transcription Runx ont été identifiés dans les tissus

hématopoïétiques, squelettiques et tumoraux. Depuis les premières publications sur les

facteurs de transcription Runx, le nombre de gènes régulés positivement ou négativement par

ces facteurs est en constante augmentation. Certains de ces gènes ont des fonctions dans la

tumorigenèse, la progression cellulaire ou l’angiogenèse. Bien que la majorité des gènes cibles

étudiés de Runx soient activés, la répression transcriptionnelle de certains gènes cibles

suggère que les facteurs Runx puissent jouer à la fois le rôle d’activateurs et de répresseurs en

fonction du contexte dans lequel ils se fixent à l’ADN. Ce contexte est déterminé par le type

cellulaire et la combinaison de différents facteurs de transcription se fixant aux sites au sein

d’une région de régulation d’un gène cible (Canon & Banerjee, 2003). La capacité des

protéines Runx à agir comme une protéine de charpente dans des complexes activateurs ou

répresseurs, leur permet d’agir comme des intégrateurs des différents signaux des diverses

Figure 21. Runx1 associé à ses coactivateurs et ses corépresseurs.

Dans l'activation transcriptionnelle, Runx1/CBFβ (CBF) fonctionne comme une protéinecharpente qui interagit avec beaucoup de facteurs de transcription spécifiques de tissu, telsque Ets et Myb. De plus, CBF peut recruter des activateurs tels que p300 et P/CAF. Cesprotéines possèdent une activité acétyltransférase. CBF interagit également avec descorépresseurs tels que Groucho/TLE-1 (grâce à son motif VWRPY en C-terminal) qui peut seretrouver complexé à des histones désacétylases (HDACs) et mSin3 qui est capable derecruter des HDACs et l’histones méthyltransférase Suv39h1.

Runx1Ets/myb

P/CAF

Gènes cibles

p300CBFβ

Gènes ciblesRunx1

CBFβ

Groucho/TLE

HDAC

Gènes ciblesRunx1

CBFβSuv39h

Sin3AHDACs

ACTIVATION REPRESSION

42

voies de signalisation, rendant les facteurs Runx comme des interrupteurs réglables pour les

processus clés du développement, de la prolifération et la différenciation cellulaire. C’est

finalement le code de combinaison de facteurs liés à des promoteurs particuliers qui

détermine le profil d’expression d’un gène. À ce jour, les mécanismes d’action des protéines

Runx sont très variés et sont focalisés sur certains gènes cibles spécifiques, dont la nature

reflète l’intérêt d’un groupe de recherche en particulier. Ceci rend particulièrement difficile de

tirer des conclusions générales sur les différents mécanismes reportés. Ici, je ne vais pas

présenter les gènes positivement ou négativement régulés par Runx1, car un même gène va

être réprimé ou activé par Runx1 selon le contexte cellulaire dans lequel il est étudié (c’est par

exemple le cas du gène p21WAF1/CIP1). En lieu, je présente ici quelques interacteurs connus de

Runx1 ou de protéines modifiant directement Runx1 pour moduler son activité (figure 21).

III.1 Régulation positive de l’activité de transactivation de Runx1 III.2.1 Phosphorylation, acétylation et méthylation de Runx1

Les mécanismes par lesquels les facteurs de transcription Runx activent l’expression génique

impliquent le recrutement de protéines coactivatrices telles que les HATs p300, MOZ, la

kinase HIPK ou encore l’arginine méthyltransférase PRMT1.

Un des premiers co-activateurs de Runx1 identifié est la protéine HAT p300. Dans les

cellules myéloïdes L-G, au niveau endogène p300, CBP et Runx1 sont immunoprécipités

ensemble (Kitabayashi et al, 1998). De plus, une autre étude précise que p300 acétyle deux

résidus lysine très conservés, en positions 24 et 43 de Runx1 (forme humaine) situés dans la

partie N-terminale adjacente au domaine runt (Yamaguchi et al, 2004). L’acétylation de

Runx1 augmente sa fixation sur sa séquence d’ADN spécifique et stimule l’activation de la

transcription. Les auteurs proposent que l’acétylation des deux lysines 24 et 43 situées dans le

NRDBn (Negative Regulatory region for DNA Binding N-terminal to the runt domain) pouvait induire

un changement de conformation du NRCBn qui dévoilerait le domaine de liaison à l’ADN du

domaine runt. Alternativement, cette acétylation pourrait avoir un effet sur les interactions

protéine-protéine, permettant à Runx1 de recruter d’autres coactivateurs (Yamaguchi et al,

2004). Une autre acétyltransférase, la protéine MOZ, interagit aussi avec Runx1 et stimule son

activité. De manière surprenante, le domaine acétyltransférase de MOZ n’est pas

indispensable pour l’interaction avec Runx1 et l’acétylation de Runx1 par MOZ a seulement

été observée in vitro (Kitabayashi et al, 2001).

La kinase HIPK2 a été identifiée comme un composant du complexe Runx1 (forme

humaine) (Kitabayashi et al, 2001). Les protéines HIPKs (homeodomain-interacting protein kinases)

Figure 22. Cascade de phosphorylation initiée par Runx1/p300.

Initiation de la cascade de phosphorylation après la dimérisation de Runx1 avec CBFβ sur unsite de liaison fonctionnel sur l’ADN. Cette cascade conduit à l’activation des gènes cibles deCBF.Figure adaptée de WEE et al., Blood, 2008.

5. Recrutement de p300

1. Hétérodimérisation de Runx1/CBFβ

6. Phosphorylation de p300

7. Activation des gènes cibles

3. Recrutement de HIPK2

4. Phosphorylation de Runx1

2. Reconnaissance et fixation sur l’ADN

43

sont des kinases serine/thréonine dont trois membres ont été identifés (HIPK1, HIPK2,

HIPK3). La phosphorylation de Runx1 sur les résidus Ser249 et Ser276 par HIPK2 rend la

protéine Runx1 active, car dans un système rapporteur, les mutants Runx1 non-

phosphorylables ne sont plus capables d’activer la transcription correctement (Aikawa et al,

2006). Les auteurs montrent également que les souris inactivées pour les gènes HIPK1 et

HIPK2 n’expriment plus la forme protéique hyperphosphorylée de p300, suggérant que la

phosphorylation de p300 est dépendante de HIPK1 et/ou HIPK2. Effectivement, grâce à

des expériences de co-transfection, les auteurs montrent que la phosphorylation et

l’association de Runx1 avec HIPK1/2 est en fait un pré-requis pour la phosphorylation

consécutive de p300. Les modifications post-traductionnelles de p300 et Runx1 sont

nécessaires pour activer la transcription (Aikawa et al, 2006). De manière intéressante, MOZ

est également phosphorylée par HIPK2 et le trimère Runx1-HIPK2-MOZ semble être

indispensable pour la phosphorylation de MOZ (Aikawa et al, 2006). Il est donc proposé que

Runx1 agisse comme protéine de structure pour l’interaction physique entre HIPK2 et

p300/MOZ, et pourrait constituer une unité de régulation pour contrôler la phosphorylation

de p300 (Yoshida & Kitabayashi, 2008). Une étude récente a mis en valeur le rôle de CBFβ,

en montrant que l’hétérodimérisation de Runx1 avec CBFβ était nécessaire pour sa

phosphorylation par HIPK2 (Wee et al, 2008). La figure ci-contre récapitule les étapes

d’activation de Runx1 pour être dans un forme active (figure 22).

III.2.2 Modulation de l’activité de Runx1 par la MAP kinase ERK

Les cytokines et les facteurs de croissance régulent l’activité transcriptionnelle de Runx1 en

contrôlant la phosphorylation de Runx1 par les MAPK (mitogen activated protein kinase). La

protéine Runx1 contient 14 sérines (ou thréonines) suivies d’une proline, ce qui constitue la

séquence minimale reconnue par les MAPK. Trois de ces sites de phosphorylation sont situés

dans la partie amino-terminale de Runx1, les onze autres sites sont distribués dans le domaine

de transactivation carboxy-terminal. Le groupe de H. Hirai a montré que le EGF (epithelium

growth factor) et l’IL-3 (interleukine-3) stimulent l’activité transcriptionnelle de Runx1 via la

phosphorylation de ses sérines Ser-249 et -266 par ERK (Tanaka et al, 1996). La

phosphorylation de Ser-249 et -266 module l’activité de Runx1 en induisant la dissociation de

Runx1 et mSin3A qui est un corépresseur transcriptionnel (Imai et al, 2004). Inversement, les

mutants de Runx1 présentant une délétion des résidus 248 à 287, où sont normalement situés

les sites de phosphorylation de ERK, ont une interaction plus forte avec le corépresseur

mSin3A (Lutterbach et al, 2000). De plus, d’autres sites de phosphorylation de ERK décrits

pour quatre sérines et thréonines rapprochées (Ser-249, -266, -276 et Thr-273), ont également

44

un rôle dans la régulation de l’activité de Runx1. En effet, si ces sites sont remplacés par des

alanines, l’activité transcriptionnelle est considérablement réduite, alors que s’ils sont

remplacés par des acides aspartiques l’activité de Runx1 est augmentée (Zhang et al, 2004).

Ces données montrent que la phosphorylation de Runx1 par ERK est nécessaire pour

l’activité de Runx1. Cependant, il n’est pas clair si la phosphorylation de Runx1 est nécessaire

pour sa dimérisation avec CBFβ.

De manière intéressante, ERK ne serait pas seulement impliquée dans la modulation de

l’activité de Runx1, mais pourrait également jouer un rôle dans sa dégradation. En effet,

Runx1 est dégradé par la voie ubiquitine-protéasome (Huang et al, 2001), et la

phosphorylation de Runx1 par ERK pourrait déstabiliser Runx1 (Imai et al, 2004). Ceci

pourrait être un moyen d’induire un renouvellement rapide de la protéine une fois qu’elle est

phosphorylée et active. La transactivation de Runx1 après avoir été phosphorylé par ERK

apparaît ainsi comme transitoire.

III.2 Régulation négative de l’activité de Runx1 La répression des gènes dépendante de Runx passe par le recrutement et l’interaction directe

avec des protéines co-répresseurs telles que le facteur TLE1/Groucho, mSin3A, les histones

désacétylases (HDACs) et les méthyltransférases d’histone (HMTs), grâce à des motifs

conservés sur certains domaines spécifiques de la protéine Runx (figure 21).

III.2.1 Groucho/TLE

La protéine de drosophile Gro et ses homologues humains TLE1-4 sont exprimés de manière

ubiquitaire. Ce sont des protéines nucléaires qui ne se fixent pas à l’ADN et comprennent des

motifs répétés WD impliqués dans les interactions protéine-protéine. Le mécanisme d’action

de Groucho/TLE n’est pas très clair. Par exemple, en ce qui concerne l’homologue de

Groucho/TLE chez la levure (Tup1p) le mécanisme d’action rapporté est : (i) le blocage du

domaine d’activation des facteurs de transcription, (ii) l’interaction avec la machinerie de

transcription et (iii) l’induction d’une structure chromatinienne non-permissive à la

transcription avec des interactions directes avec les queues N-terminales des histones H3 et

H4 (pour revue voir (Parkhurst, 1998)). TLE est un des premiers co-répresseurs à avoir été

décrit comme interagissant avec Runx1. Groucho/TLE induit la répression des gènes cibles

de Runx1 en reconnaissant et en interagissant avec le motif VWRPY de Runx1. La répression

de l’activation de deux gènes cibles de Runx1 par TLE1, a été montrée au niveau des enhancers

de TCRα et TCRβ (Levanon et al, 1998). Une autre étude a montré que TLE1 et TLE2 sont

associés à la matrice nucléaire comme Runx1 et par microscopie confocale TLE1 et TLE2

45

colocalisent avec Runx1 dans les mêmes foci (Javed et al, 2000). De manière intéressante,

Groucho, l’homologue de TLE chez la drosophile, s’associe avec l’histone H3 et l’histone

désacétylase Rdp3 (Chen et al, 1999; Palaparti et al, 1997), ajoutant ainsi un degré

supplémentaire de répression ou une explication sur le mécanisme répresseur de Groucho.

III.2.2 mSin3A et les HDACs

La répression des gènes cibles de Runx1 n’est pas toujours dépendante de Groucho/TLE.

C’est notamment le cas du gène p21WAF1/CIP1 qui est réprimé par Runx1 indépendamment de

sa liaison au corépresseur Groucho. Runx1 interagit en fait avec d’autres répresseurs. En

particulier, pour la répression de p21WAF1/CIP1 Runx1 interagit directement avec mSin3A. Des

mutants de délétion de Runx1 ont permis d’identifier le domaine d’interaction avec mSin3A

près de l’extrémité carboxy-terminale, mais sur un site distinct du site de fixation de Groucho.

Le site d’interaction de mSin3A avec RUNX1 est situé sur la région C-terminale

immédiatement adjacente au domaine runt, puisque le mutant Runx1 humain dont les résidus

208 à 237 ont été délétés n’est plus capable d’interagir avec mSin3A (Lutterbach et al, 2000).

La protéine mSin3A est un membre de la famille des corépresseurs mSin3 qui agit souvent en

coopération avec les co-répresseurs N-CoR (Nuclear receptor CoRepressor) et SMRT (Silencing

Mediator of Retinoic acid and Thyroid hormone receptor) et les histones désacétylases (Torchia et al,

1998). D’ailleurs dans leur étude, les auteurs montrent qu’en traitant les cellules avec un

inhibiteur de HDAC, la répression du promoteur de p21WAF1/CIP1 par Runx1 est en partie levée

(Lutterbach et al, 2000). Un argument supplémentaire qui met en avant le rôle des HDACs

dans la répression médiée par Runx1 est apporté par Imai et ses collègues. Les auteurs ont

montré dans une étude antérieure que la transcription de TCRβ induite par Runx1 dépendait

de l’état de phosphorylation de Runx1. Notamment, comme je l’ai mentionné avant, un

mutant de Runx1 non phosphorylable a une activité réduite pour activer TCRβ. Ici les

auteurs montrent que ce mutant retrouve en partie son activité transcriptionnelle en présence

d’un inhibiteur des HDACs. Ceci suggère que mSin3A, qui s’associe préférentiellement à

Runx1 non-phosphorylé (ou non-phosphorylable), agit en faisant un pont entre Runx1 et les

HDACs (Imai et al, 2004). De manière intéressante, dans la même étude les auteurs montrent

que mSin3A guide Runx1 dans la matrice nucléaire, car le mutant mimant la phosphorylation

constitutive de Runx1 n’interagit plus avec mSin3A et n’est plus localisé dans la matrice

nucléaire. Le NMTS et le domaine d’interaction avec mSin3A semblent donc nécessaires

pour la localisation de Runx1 dans la matrice nucléaire, en tout cas dans les cellules Cos7 et

lorsque les différents partenaires sont surexprimés (Imai et al, 2004).

46

Enfin, dans une étude réalisée par Durst et ses collègues, le lien entre les HDACs et Runx1 a

été clairement défini. Grâce à des expériences de co-transfection des HDACs et de Runx1

dans les cellules Cos7, des interactions directes et fortes ont été montrées entre Runx1 et les

HDACs 1, 3 et 9 et des interactions plus faibles ont été observées pour les HDACs 2, 5 et 6

(Durst et al, 2003). Ces données suggèrent que les HDACs pourraient interagir avec Runx1

indépendamment de mSin3.

III.2.3 HMTs

L’interaction de Runx1 avec les HMTs a été découverte après les co-répresseurs

précédemment énoncés. En particulier, l’histone méthyltransférase Suv39H1 est associée à la

répression épigénétique des gènes cibles de Runx1. Dans leur étude, les auteurs montrent

pour la première fois que Runx1 interagit directement avec Suv39h1 in vitro et in vivo, grâce à

son domaine runt (Chakraborty et al, 2003). Logiquement, les auteurs remarquent que cette

interaction diminue l’affinité de Runx1 pour l’ADN. Une autre étude confirme ces résultats

en montrant en plus que Suv39H1, HDAC1 et HDAC3 interagissent avec Runx1 au niveau

des mêmes motifs de Runx1 (Reed-Inderbitzin et al, 2006).

III.3 Régulation de la formation du dimère fonctionnel CBF par la localisation subcellulaire des sous-unités Runx1 et CBFβ

De manière intéressante, bien que fonctionnant ensemble, Runx et CBFβ ne se situent pas

dans le même compartiment subcellulaire. En effet, Runx est nucléaire alors que CBFβ est

majoritairement cytoplasmique. Les localisations distinctes de CBFβ et Runx constituent un

moyen de régulation de la formation de l’hétérodimère CBF actif, et donc un contrôle

supplémentaire pour l’activité de CBF.

Lu et ses collègues ont testé la localisation de CBFβ en fonction des mutants de Runx2

surexprimés dans les cellules NIH 3T3 (Lu et al, 1995). Lorsque CBFβ et Runx2 sont co-

tranfectés, leur localisation est respectivement cytoplasmique et nucléaire. En revanche, un

mutant de Runx2 tronqué dans sa partie amino-terminale (94-513), co-transfecté avec CBFβ,

entraîne une localisation nucléaire de CBFβ. Ceci suggère que la partie N-terminale de Runx2

empêche la libre association de CBFβ et Runx2, certainement via le NRHn comme il est

décrit dans la section précédente, et implique également que l’association passive de CBFβ

avec Runx2 suffirait à sa translocation dans le noyau. Un autre mutant de Runx2, tronqué

dans sa partie C-terminale, Runx2 (1-224), induit la même colocalisation (Lu et al, 1995). In

vivo, la régulation de l’association de la sous-unité Runx avec CBFβ est certainement un

47

mécanisme de contrôle de l’activité de transcription du dimère Runx-CBFβ, puisque la

protéine Runx seule ne lie que faiblement l’ADN.

Une autre étude apporte des précisions sur la localisation cytoplasmique de CBFβ. Dans le

muscle squelettique, CBFβ colocalise avec l’α-actinine sur les lignes Z des les myotubes du

muscle squelettique montrant ainsi une affinité de CBFβ avec les structures du cytoplasme

(Chiba et al, 1997). À partir de cette étude, le groupe de M. Satake a approfondi la localisation

de CBFβ dans le cytoplasme. Leur étude montre que CBFβ colocalise avec l’actine-F sur les

fibres de stress qui s’étendent dans l’axe le plus long de la cellule et qui logent leurs extrémités

dans la membrane cellulaire (Tanaka et al, 1997). Dans le cytoplasme, Yoshida et ses

collègues ont montré que CBFβ interagissait avec la filamine A (Yoshida et al, 2005), qui est

une protéine qui réticule l’actine corticale. Le domaine de CBFβ responsable de sa

localisation cytoplasmique est donc a priori celui qui est responsable de son interaction avec

les filamines. Ce domaine est localisé au niveau des résidus 68 à 93 (numérotation sur la

protéine CBFβ murine). De plus, dans les cellules déficientes en filamine A, CBFβ est localisé

au noyau. Les auteurs montrent de manière très intéressante que lorsqu’on force la

localisation de CBFβ dans le noyau (en absence de filamine A), le niveau protéique de Runx1

est nettement augmenté. De fait, la stabilisation du niveau protéique de Runx1 dans la cellule

n’est pas dépendante du niveau protéique de CBFβ dans la cellule, mais est strictement

dépendante de la quantité de CBFβ transloqué dans le noyau. Ceci met en évidence

l’importance de la localisation des deux sous-unités dans la régulation de l’activité du facteur

hétérodimérique CBF (Yoshida et al, 2005).

IV. CBF DANS LE CONTROLE DE L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION

IV.1 Régulation croisée entre CBF et les régulateurs du cycle cellulaire IV.1.1 CBF accélère la phase G1 et stimule l’entrée en phase S

Il y a de plus en plus de données montrant que Runx1 régule la prolifération cellulaire

directement. Sa capacité à promouvoir la prolifération cellulaire dans différents systèmes est

cohérente avec son activité oncogénique. Par exemple, la surexpression de Runx1-P2

(AML1b) dans les fibroblastes 3T3 permet la transformation des cellules in vitro et la

formation de tumeur chez les souris nude (Kurokawa et al, 1996).

48

Plusieurs données suggèrent que Runx1 régule la transition G1/S du cycle cellulaire. Une des

premières études à ce sujet concerne l’étude de la protéine chimère CBFβ-SMMHC

composée des 165 acides aminés C-terminaux de la protéine CBFβ (soit pratiquement

l’intégralité de la protéine native) fusionnée à la partie C-terminale de la chaîne lourde la

myosine du muscle lisse (SMMHC). Cette protéine de fusion CBFβ-SMMHC est une

oncoprotéine retrouvée dans les leucémies myeloïdes capable de séquestrer Runx1 par

multimérisation grâce au domaine SMMHC, et a une fonction inhibitrice sur le cycle cellulaire

(Kummalue et al, 2002; Liu et al, 1993). De plus, lorsque l’on génère des souris knock-in où le

gène CBFb est remplacé par CBFβ-SMMHC, on obtient un phénotype similaire à celui des

souris CBFb-/-, montrant que la protéine de fusion CBFβ-SMMHC est un dominant négatif.

Ceci suggère que la protéine native CBFβ pourrait au contraire avoir une fonction positive

dans la régulation du cycle cellulaire (Cao et al, 1997). Une seconde étude est allée plus loin en

montrant que dans les cellules myéloïdes ou lymphoïdes, l’augmentation de CBFβ-SMMHC

inhibe la transition G1/S et la quantité de Rb hypophosphorylé (actif) est augmentée (Xia et

al, 2007). De manière intéressante, la surexpression de la protéine Runx1 contrecarre l’effet

inhibiteur de CBFβ-SMMHC sur le cycle cellulaire et cet effet n’est pas dépendant du

domaine d’interaction de Runx1 avec TLE. En revanche, les mutants de Runx1, dans lesquels

un ou les deux domaines de transactivation ont été délétés, ne compensent pas l’effet

inhibiteur de CBFβ-SMMHC, au contraire, ils renforcent l’inhibition de l’entrée en phase S

en synergie avec CBFβ-SMMHC (Lou et al, 2000).

La sous-unité Runx1 est donc impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. Lorsque

Runx1-P2 (AML1b) humain est exprimé dans les cellules 32D.3 (cellules de moelle osseuse

de souris) l’entrée en phase S est accélérée. Il avait déjà été montré que Runx1-P2 est

transformant lorsqu’il est exprimé dans les fibroblastes grâce à son domaine de régulation de

la transcription en C-terminal (Strom et al, 2000). Le phénotype observé est similaire à celui

obtenu lorsqu’on surexprime les cyclines -D (Quelle et al, 1993) ou -E dans ces mêmes

cellules. Runx1-P2 est finalement le premier facteur de transcription à qui l’on prête un rôle

dans le cycle cellulaire (Strom et al, 2000). À noter que contrairement à E2F qui stimule

l’entrée en phase S sans l’aide de signaux coopératifs, comme l’expression de cytokines

comme l’interleukine 3 (IL-3), Runx1-P2 nécessite la présence de l’IL-3 pour accélérer la

phase G1 du cycle cellulaire.

IV.1.2 Régulations croisées entre les régulateurs du cycle cellulaire et Runx1

Trois sites consensus (S/T)PX(R/K) reconnus pour la phosphorylation par les complexes

cyclines/Cdks ont été identifiés sur Runx1 : S48, S303 et S424. Les Cdk 1 et 6 phosphorylent

49

les résidus de Runx1 dans les cellules hématopoïétiques et la mutation de ces résidus sérines

en acides aspartiques (mimant des résidus constitutivement phosphorylés) augmente l’activité

de Runx1 (Zhang et al, 2008). Dans les cellules Ba/F3, le triple mutant de Runx1 où les trois

sérines Ser48, Ser303 et Ser424 sont remplacées par des acides aspartiques contrecarre l’effet

inhibiteur sur la prolifération de CBFβ/SMMHC exprimé dans ces cellules (Zhang et al,

2008). Etonnament, la mutation de ces sérines en alanines augmente également l’affinité pour

l’ADN, suggérant que la phosphorylation de Runx1 par les Cdks n’est pas déterminante pour

l’activité de liaison à l’ADN de Runx1 (Zhang et al, 2008). Un rôle possible de cette

phosphorylation serait plutôt de réguler le taux de Runx1 dans la cellule. En effet, la

phosphorylation de S303 induit la dégradation de Runx1 pendant la phase G2/M par le APC

(anaphase promoting complex) (Biggs et al, 2006; Biggs et al, 2005; Wang et al, 2007).

De manière intéressante, le niveau protéique de Runx1 est régulé au cours du cycle cellulaire,

mais le niveau de son ARN messager reste constant. Notamment, la protéine Runx1 est

augmentée de 2 à 4 fois en phase S et en G2/M par rapport à la phase G1 et le niveau de

liaison à l’ADN du facteur CBF est augmenté lui aussi en même temps que le niveau

protéique de Runx1 (Bernardin-Fried et al, 2004). Pour vérifier si cette stabilisation est induite

par CBFβ, il serait intéressant de regarder si la localisation de CBFβ (qui est majoritairement

cytoplasmique) augmente dans le noyau pendant les phases S et G2/M, au moment où la

protéine Runx1 est stabilisée. Inversement, le traitement des cellules par un agent bloquant en

phase G1, entraîne en même temps une diminution du niveau protéique de Runx1. La

variation de Runx1 endogène au cours du cycle cellulaire correspond en fait à la variation de

la stabilisation de Runx1 (Bernardin-Fried et al, 2004).

La surexpression de Runx1-P2 dans les cellules myéloïdes accélère l’entrée en phase S en

induisant l’expression de Cdk2, Cdk4 et également des cyclines D1 et D2. En fait, des sites de

fixation de Runx1 ont été retrouvés sur le promoteur murin de la cycline D2, suggérant un

mécanisme direct d’activation de l’expression de cette cycline (Strom et al, 2000). Ce

promoteur est également activé par Runx1-P2 dans les cellules Cos7 de singe. Inversement,

l’expression de CBFβ-SMMHC ou KRAB-Runx1, deux oncoprotéines chimères formées à

partir de CBFβ ou Runx1 et agissant comme des dominants négatifs, et bloquent le passage

G1/S en induisant une réduction du transcrit de Cdk4 dans les cellules Ba/F3 (Lou et al,

2000).

De manière intéressante, Runx1 possède également un site de fixation sur le promoteur

murin de la cycline D3 et active son expression dans la lignée de lymphocytes B murins Ba/F3

50

(Peterson et al, 2005). Une étude montre que lorsqu’elle est exprimée dans les cellules 293T,

la protéine cycline D3 est capable d’entrer en compétition avec CBFβ pour interagir avec

Runx1 via son domaine runt et le domaine comprenant les résidus de 213 à 395. Cette

interaction diminuerait l’interaction de CBF avec l’ADN. La cycline D3 exercerait ainsi un

rétrocontrôle négatif de l’activité de Runx1 sur la prolifération. Un des mécanismes décrit

pour expliquer cette observation est la capacité de la cycline D3 à déplacer l’interaction

Runx1-CBFβ pour former le dimère Runx1-cycline D3. Cette observation est également vraie

pour les cyclines -D1 et -D2, capables elles-aussi d’interagir directement avec Runx1 et

déplaçant ainsi l’interaction entre Runx1 et CBFβ (Peterson et al, 2005). L’ensemble des

cyclines D interviennent donc pour moduler négativement l’activité de Runx1 dans les

cellules en prolifération.

La régulation des CKIs par Runx1 peut être négative ou positive selon le type cellulaire. Par

exemple le promoteur du gène p21WAF1/CIP1 contient de multiples sites de fixation de Runx1 et

dans les fibroblastes murins NIH3T3, Runx1-P2 réprime dix fois le promoteur de p21WAF1/CIP1

(Lutterbach et al, 2000). Ensemble, le fait que Runx1 puisse activer la transcription de Cdk4

et de la cycline D3 et par ailleurs puisse réprimer la transcription de p21WAF1/CIP1, contribue à la

stimulation de la prolifération (Bernardin-Fried et al, 2004; Lutterbach et al, 2000; Petrovick

et al, 1998).

IV.2 CBF et l’équilibre prolifération-différenciation Runx1 régule le cycle cellulaire, mais en même temps est nécessaire à la différenciation des

tissus dans lesquels la protéine est exprimée, comme par exemple la différenciation

hématopoïétique définitive. De ce fait, il est probable qu’en plus de leur rôle comme

inducteur de la différenciation, les protéines Runx de mammifères soient nécessaires pour

stimuler et/ou maintenir la prolifération des cellules précurseurs dans lesquelles elles sont

exprimées. Allant de pair avec ce rôle, les protéines Runx interagissent avec les effecteurs

nucléaires SMADs de la voie de signalisation TGFβ/BMP (Hanai et al, 1999; Ito &

Miyazono, 2003; Zaidi et al, 2002), qui contrôlent à la fois la prolifération et la différenciation

dans une grande variété de systèmes au cours du développement (Angerer et al, 2000;

Ferguson & Anderson, 1992; Xie & Spradling, 1998). De plus, le facteur de transcription

TCF/LEF-1 qui est une cible très en aval de la voie de signalisation Wnt, est connu pour être

un partenaire d’interaction important de Runx1 (Robertson et al, 2008), notamment pour

activer certains gènes cibles tels que TCRβ et IFNβ dans les lymphocytes T (Carey, 1998;

Giese et al, 1995). La voie de signalisation Wnt est une autre voie commune impliquée dans

51

diverses réponses biologiques comme la prolifération et la différenciation, plaçant encore une

fois Runx1 en lien avec des grandes voies de signalisation impliquées dans le développement

et au cœur du destin cellulaire.

Initialement, Runx1 et CBFβ étaient connus pour leur implication dans les leucémies, où ils

sont sujets à des translocations multiples et génèrent des protéines Runx1 et CBFβ tronquées

et fusionnées à d’autres protéines (Michaud et al, 2003). Le rôle du facteur CBF a été

également très étudié dans l’hématopoïèse puisque les expériences d’inactivations géniques de

Runx1 et CBFβ compromettent l’hématopoïèse définitive chez la souris (Niki et al, 1997;

Okada et al, 1998; Wang et al, 1996a). Cependant, aujourd’hui Runx1/CBFβ s’imposent

comme des régulateurs clés du destin cellulaire, et notamment à l’interface de la prolifération

et de la différenciation dans de nombreux systèmes cellulaires.

Par exemple, dans le système nerveux des mammifères, Runx1 est nécessaire pour maintenir

la prolifération des précurseurs des neurones portant les récepteurs olfactifs (ORN).

L’absence de Runx1 dans ces cellules induit une sortie du cycle et elles se différencient

prématurément. Le fait que les progéniteurs neuronaux se différencient prématurément en

absence de Runx1 pourrait signifier que Runx1 agit pour prévenir la différenciation cellulaire

en plus de, ou à la place de, son rôle dans la stimulation de la prolifération. Cependant,

l’expression exogène de Runx1 dans des cultures primaires de cellules progénitrices neurales

corticales augmente le nombre de cellules en prolifération, sans pour autant bloquer leur

capacité à se différencier, produisant ainsi un grand réservoir de cellules progénitrices

(Theriault et al, 2005). Vu que la différenciation se déroule normalement quand Runx1 est

surexprimé dans ces cellules, il semblerait que la différenciation prématurée de Runx1 dans

les précurseurs ORN soit due à un effet indirect résultant de l’échec de ces cellules à

proliférer. De manière intéressante, p21WAF1/CIP1 est réprimé dans les cellules progénitrices

neurales corticales surexprimant Runx1 (Theriault et al, 2005), montrant que Runx1

favoriserait la progression cellulaire en réprimant p21WAF1/CIP1.

D’autres études mettent en évidence le rôle de Runx1 et CBFβ dans la stimulation de la

prolifération chez C. elegans. Les auteurs montrent que des mutations de Rnt-1 (l’homologue

de Runx1) interfère avec la division des cellules « souches » de C. elegans et résulte en un

nombre réduit de cellules aux stades larvaires (Nam et al, 2002; Nimmo et al, 2005). Au

contraire, la surexpression de rnt-1 stimule fortement la prolifération et donne des cycles de

division supplémentaires (Nimmo et al, 2005), indiquant clairement la fonction de Rnt-1 dans

la prolifération cellulaire pendant le développement larvaire de C. elegans. De manière

52

intéressante, Xia et ses collègues montrent que CBFβ est également impliqué dans la

prolifération cellulaire chez C. elegans, mais aussi dans la spécification de ces cellules souches

(Xia et al, 2007).

Un dernier exemple du rôle de Runx1 à l’interface entre prolifération et différenciation

concerne la structure du cheveu et du follicule pileux. Dans ce travail, les auteurs examinent

la fonction de Runx1 dans le follicule pileux et montrent que Runx1 est important pour la

prolifération du cheveu dans la peau adulte. Les souris qui expriment une protéine Runx1

non-fonctionnelle dans les cellules épithéliales de la peau, présentent un déficit de la

prolifération des kératinocytes in vitro et l’expression de facteurs régulant la quiescence du

cycle du cheveu sont dérégulés (Osorio et al, 2008).

53

Présentation du Projet de Recherche

Contexte

En 2005, le Dr Slimane AIT-SI-ALI m’a proposé un projet de recherche qui avait pour but

d’étudier l’équilibre prolifération-différenciation. Pour étudier cet équilibre, il s’appuie sur un

modèle de choix très bien décrit dans la littérature et dont le laboratoire est expert : le muscle

squelettique. Dans ce système cellulaire, la prolifération et la différenciation sont

mutuellement exclusives et la différenciation terminale est orchestrée par le facteur

myogénique MyoD. MyoD est décrit comme le « Master Switch » de la différenciation

musculaire car il orchestre à la fois la sortie du cycle prolifératif et l’activation des gènes

spécifiques du muscle. Pour approfondir et mieux comprendre comment MyoD régule

l’équilibre prolifération-différenciation dans les myoblastes, le laboratoire a choisi une

stratégie pragmatique qui mettait en jeu des approches différentes mais complémentaires : (i)

identification exhaustive des partenaires de MyoD par spectrométrie de masse, (ii) validation

fonctionnelle de ces partenaires avec une banque de petits ARN interférants, (iii) étude de la

force transactivatrice de MyoD dans des lignées non-musculaires, (iv) identification des gènes

cibles de MyoD et enfin (v) caractérisation des modifications épigénétiques associées à

l’activation des gènes cibles de MyoD.

En mai 2006, j’ai amorcé mon projet de thèse en purifiant MyoD doublement étiquetté Flag

et HA dans une lignée HeLa où il était exprimé ectopiquement. Après une purification

biochimique par double affinité en tandem de MyoD, les partenaires protéiques ont été

analysés par spectrométrie de masse. De cette manière, j’ai identifié pour la première fois les

protéines CBFβ et Runx1 au sein du complexe MyoD.

Ces dernières années, dans la période même où je conduisais ce projet, de nombreuses

nouvelles études ont accordé à Runx1 et CBFβ un rôle beaucoup plus étendu que celui

majoritairement étudié jusqu’à maintenant. Au départ essentiellement étudiés pour leur

54

implication dans les leucémies myéloïdes aiguës et l’hématopoïese définitive, Runx1 et CBFβ

s’imposent aujourd’hui par des fonctions variées au cours du développement, dans lesquelles

leurs rôles se trouvent souvent à l’interface de la prolifération et de la différenciation. Runx1

et CBFβ sont ainsi des candidats particulièrement intéressants pour leur rôle potentiel, de

concert avec MyoD, pour réguler l’équilibre prolifération-différenciation dans les myoblastes.

Problématique

J’ai ainsi posé mon hypothèse principale de travail:

« Caractériser la fonction de Runx1/CBFβ , en coopération avec MyoD, dans

l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique »

Cet objectif était doublement intéressant car MyoD et Runx1 sont tous deux décrits au coeur

de l’équilibre prolifération-différenciation dans leurs systèmes cellulaires respectifs, avec

apparemment pour chacun d’eux un effet dose de la protéine dans la cellule. Ce rôle pivot

entre différenciation et prolifération permet d’imaginer ces deux protéines « travaillant »

ensemble pour contrôler le destin cellulaire- a fortiori de la cellule musculaire dans cette étude.

En étudiant Runx1, et MyoD, tous deux décrits dans des systèmes de différenciation et

régulant en partie certaines protéines de cycle cellulaire, le but était d’étudier les deux étapes

discrètes de la différenciation musculaire, c’est-à-dire le contrôle de la sortie du cycle

prolifératif et l’engagement de la cellule dans la voie de différenciation musculaire terminale.

RÉSULTATS

55

Article de Recherche

The Core Binding Factor CBF Negatively Regulates Skeletal Muscle Terminal Differentiation

PHILIPOT Ophelie and AIT-SI-ALI Slimane*

UMR 7216 “Epigénétique et Destin Cellulaire”, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université Paris-Diderot, 35 rue Hélène Brion, F-75013 Paris, France.

*: Corresponding author email: slimane.aitsiali@univ-paris-diderot.fr phone: (33)-1-5727-8919 fax: (33)-1-1-5727-8910

56

Dans cet article, je présente mes travaux de recherche sur le rôle de Runx1 et CBFβ au cours

de la différenciation musculaire terminale, de concert avec MyoD. La stratégie d’étude choisie

pour étudier la fonction potentielle de Runx1/CBFβ dans le muscle s’est articulée autour de

deux axes.

Tout d’abord, j’ai caractérisé l’interaction de Runx1/CBFβ avec MyoD :

• Au niveau endogène dans des myoblastes immortalisés, puis dans des myoblastes primaires.

• En regardant si cette interaction était directe ou non par GST pull-down et par une combinatoire de transfection transitoire.

• En regardant si cette interaction était dépendante de la chromatine.

Puis j’ai validé fonctionnellement la relevance biologique de cette interaction dans les

myoblastes :

• Par gain-de-fonction, en surexprimant CBFβ dans les myoblastes C2C12 ;

• Par perte-de-fonction, en utilisant l’ARN interférence (ARNi) contre Runx1 et CBFβ dans les myoblastes C2C12 et les myoblastes primaires.

Cette étude montre que l’interaction de MyoD avec Runx1 est directe in vitro et CBFβ n’est

co-précipité avec MyoD qu’en présence de Runx1. De plus, Runx1 et CBFβ s’associent à

MyoD et à ses gènes cibles, uniquement dans des conditions de prolifération, c’est-à-dire

lorsque MyoD est considéré comme inactif.

La cinétique de différenciation terminale des myoblastes C2C12 est dépendante du taux

d’expression de CBFβ et Runx1 comme le montrent les expériences de perte et gain de

fonction. En effet, lorsque CBFβ est surexprimé, la cinétique de différenciation est inhibée.

Inversement lorsque Runx1 ou CBFβ sont diminués par ARNi, la cinétique de différenciation

est considérablement favorisée.

De manière intéressante, Runx1/CBFβ semble agir à l’interface prolifération-différenciation.

En effet, la forte expression des marqueurs de différenciation musculaire dans les expériences

de perte-de-fonction de Runx1 ou CBFβ, est corrélée à une sortie du cycle cellulaire précoce

et une diminution des régulateurs du cycle.

Finalement, cette étude propose un nouveau rôle pour Runx1/CBFβ en l’impliquant comme

régulateur négatif de la différenciation musculaire terminale.

The Core Binding Factor CBF Negatively Regulates Skeletal Muscle Terminal Differentiation

PHILIPOT Ophelie and AIT-SI-ALI Slimane*

UMR7216 Epigénétique et Destin Cellulaire, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université Paris-Diderot, 35 rue Hélène Brion, 75013 Paris, France. Previous address: Institut André Lwoff, CNRS, FRE2944, 7 rue Guy Moquet, 94800 Villejuif; Université Paris-Sud, France

Tel: (33)-1-5727-8919, Fax: (33)-1-1-5727-8910

*: Corresponding author, email: slimane.aitsiali@univ-paris-diderot.fr,

Running title: CBF in muscle diffeentiation

ABSTRACT

Core Binding Factor or CBF is a transcription factor composed of two subunits, Runx1/AML-1 and CBF beta or CBFβ. CBF was originally described as a regulator of hematopoiesis. Here we show that CBF is involved in the control of skeletal muscle terminal differentiation. Indeed, downregulation of either Runx1 or CBFβ protein level accelerates cell cycle exit and muscle terminal differentiation. Conversely, overexpression of CBFβ in myoblasts slows terminal differentiation. CBF interacts directly with the master myogenic transcription factor MyoD in proliferating but not in differentiating myoblasts. The MyoD/CBF complex contains several chromatin modifying enzymes that inhibits MyoD activity, such as HDACs. When overexpressed, CBFβ induced an inhibition of histone H3 acetylation at MyoD target promoters. Finally, we show a preferential recruitment of Runx1 protein on MyoD target genes in proliferating myoblasts. Taken together, our data show a new role for Runx1 and CBFβ in the control of the proliferation/differentiation in skeletal myoblasts.

Keywords: Differentiation, proliferation, muscle, MyoD, Runx1/CBFβ

INTRODUCTION

Runx1 (for Runt-related factor, also known as AML1 for Acute Myeloid Leukemia 1, CBFA2 or PEPB2aB) belongs to a family of highly homologous heterodimeric transcription factors named Core Binding Factors or CBF (reviewed in: [1]). To be fully functional as a transcription regulator, DNA binding subunit

Runx1 must dimerize with its cofactor CBF-beta (CBFb , a non-DNA-binding subunit that is expressed in a ubiquitous manner [2] Runx1 was originally identified at a breakpoint on human chromosome 21 in the t(8;21) translocation, known as the most common target of chromosomal translocations in human leukemia [3,4]. Genetic studies showed that Runx1 is essential in the developing murine embryo for definitive hematopoiesis of all lineages [5,6].

There is now strong evidence that Runx proteins are also important for differentiation of multiple cell types, including osteoblasts [7], neurons [8,9], hematopoietic cells of all lineages [5,6,10] and skin epidermis and hair follicle stem cells [11,12]. Runx1 is also involved in promoting senescence in primary mouse fibroblasts [13], and in cell cycle regulation [14-16].

Runx proteins have the potential to either activate or repress transcription in a context dependent manner. Runx1 seems to promote proliferation in progenitor cells, whereas in differentiating cells it cooperates with tissue-specific transcription factors to regulate tissue-specific gene expression. For example, Runx1 cooperates with C/EBPα and C/EBPβ to regulate hematopoiesis and osteogenesis, respectively [17,18]. The dual role of Runx1 in regulating proliferation and differentiation could depend on differential interactions with protein partners, specific for each stage of cell development. The molecular mechanisms underlying such a switch in Runx1 function remain however to be deciphered.

Runx1 and CBFβ have also been linked to skeletal muscle differentiation [19-21], and prevention of muscle wasting [20]. In skeletal muscle, proliferation and differentiation are

mutually exclusive. Indeed, skeletal muscle terminal differentiation begins with an irreversible withdrawal from the cell cycle, followed by muscle-specific marker expression [22]. Irreversible cell cycle exit involves a definitive silencing of proliferation-associated genes (reviewed in [23] and references therein). Terminal muscle differentiation is orchestrated by myogenic bHLH transcription factors, such as MyoD and Myf5, two master myogenic determination factors. MyoD is expressed in proliferating myoblasts, but is unable to activate its target genes even when bound to their promoters [24,25]. MyoD therefore has a repressive role at its target genes prior to initiating chromatin remodeling in differentiating cells [24,26,27]. In proliferating myoblasts, MyoD is associated with histone deacetylases (HDACs), the histone methyltransferase Suv39h1 and heterochromatin protein HP1, and might actively inhibit expression of its target genes by inducing a local repressive chromatin structure [24,28,29].

Here we show that CBF associates with MyoD only in proliferating myoblasts, and knockdown of Runx1 or CBFβ accelerates cell cycle exit and terminal differentiation. Conversely, overexpression of CBF slows cell cycle exit and delays muscle differentiation. In proliferating myoblasts, the MyoD/CBF complex contains several chromatin modifying enzymes such as HDACs. In agreement with this, when overexpressed, CBFβ maintains histone H3 deacetylated on MyoD target promoters even in differentiation conditions. Finally, Runx1 is recruited to MyoD target genes only in proliferating myoblasts, when these genes are repressed. Altogether, our data suggest that CBF transcription factor plays a pivotal role as a negative regulator of skeletal muscle terminal differentiation.

RESULTS

CBF subunits, Runx1 and CBFβ, interact with MyoD in proliferating myoblasts

In an attempt to charaterize MyoD protein partners, we carried out double-affinity purification of HA-Flag MyoD stably expressed in HeLa cells (see purification scheme on Supplementary Figure 1). MyoD protein complex composition was then analyzed by mass spectrometry (MS) and

western blot (WB). MS analysis of the purified protein complex revealed some already known partners of MyoD (Supplementary Figure 2), such as Id, Pbx1, PC4 and E12/E47, and new partners that had never been described to interact with MyoD. Indeed, MS analysis unveiled CBFβ protein within MyoD complex with a high number of peptides, covering almost 20% of its protein mass and amino acids content (Figure 1A). WB analyses confirmed that result and showed that Runx1 also copurified with MyoD (Figure 1B).

We then performed a complementary experiment by transfecting HA-tagged MyoD and/or HA-tagged Runx1 into HeLa cells stably expressing Flag-HA-CBFβ (ectopic, eCBFβ). We showed that, indeed, MyoD co-precipitated with eCBFβ (Figure 1C). Moreover, the simultaneous co-transfection of HA-tagged Runx1 resulted in its co-precipitation with CBFβ and, more importantly, increased the MyoD-CBFβ co-precipitation (Figure 1C).

To further investigate the CBF/MyoD interaction, we turned to myogenic cells: the murine myolastic cell line C2C12. Both CBFβ and Runx1 are expressed in the C2C12 myoblasts and their protein level do not vary significantly during differentiation (Supplementary Figure 3). We found that MyoD and CBFβ co-precipitated preferentially in proliferating compared to differentiating C2C12 myoblasts (Figure 1D).

To assay whether MyoD has the ability to interact directly with CBF, we performed GST pull-down experiments, which showed that GST-MyoD strongly interacts with Runx1 (Figure 1E, lane 4), but not with CBFβ (Figure 1E, lane 5). The interaction of MyoD with Runx1 was specific; we did not detect any Runx1 signal in the presence of GST protein alone (Figure 1E, lane 8) nor any luciferase signal with GST-MyoD (Figure 1E, lane 7). Interestingly, GST-MyoD interacts with CBFβ only in the presence of Runx1 (Figure 1E, compare lanes 5 and 6), in agreement with our previous findings (Figure 1C). These results show that MyoD interacts directly with heterodimeric transcription factor CBF, via the Runx1 subunit.

CBF negatively regulates cell cycle exit and terminal differentiation in skeletal myoblasts

We used siRNAs to decrease Runx1 level in order to investigate its role in differentiating myoblasts (Figure 2A, see Runx1 quantification). Downregulation of Runx1 resulted in a more efficient differentiation (Figure 2A); both the expression of muscle markers and the proportion of multinucleated cells were higher in Runx1-depleted cells (Figure 2A and Supplementary Figure 4A). In particular, myogenin and MCK (Muscle Creatine Kinase) were expressed at higher levels, and 24 hours earlier, in Runx1-depleted cells (Figure 2A). Interestingly, cyclin D1 level decreased more rapidly when Runx1 is downregulated (Figure 2A). Similarly, CBFβ downregulation induced a more rapid decrease in cyclin D1 and an accelerated differentiation (Figure 2B). Indeed, we could detect MCK expression in CBFβ-depleted myoblasts as soon as 24 h after the induction of differentiation (Figure 2B). These cells moreover exhibited larger myotubes (Supplementary Figure 4B). We confirmed these results in primary myoblasts (Figure 2C).

In agreement with our previous results, we have found that Runx1 or CBFβ downregulation led to a significant decrease of S-phase cells proportion concomitant with an increase in G1-phase cells (Figure 2D). This suggests that CBF positively regulates myoblasts proliferation.

To complete our analysis, we studied the effect of CBFβ overexpression on terminal differentiation. Overexpression of CBFβ in C2C12 myoblasts (C2C12-CBFβ) was well tolerated and did not lead to morphological abnormality. However, in differentiation conditions, C2C12-CBFβ cells showed a delay in cell cycle exit, as measured by cyclin D1 level that decreased with a 24 to 48 h delay compared to control cells (Figure 2E). This delayed cell cycle exit correlated with delayed expression of muscle markers such as myogenin (48 h delay), MCK (24 h delay), and MHC (Myosin Heavy Chain, not detected at 120 h) (Figure 2E). In contrast to control cells, C2C12-CBFβ cells exhibited smaller and mainly mononucleated myotubes (Supplementary Figure 5) with low expression of MCK and MHC (Figure 2F) in

differentiation conditions. This suggests that differentiation kinetics was not completely impaired but greatly delayed when CBFβ was overexpressed.

Altogether, these results suggest that CBF plays a dual role during skeletal muscle differentiation by regulating cell cycle withdrawal and expression of muscle markers.

CBF transcription factor is located to MyoD early target genes and regulates negatively their expression

The fact that CBF is a transcription factor, and that CBF interacts with MyoD preferentialy in proliferation conditions, led us to investigate whether it would be targeted to MyoD target genes to repress their transcription. Using an in silico approach, we first found that on early target gene promoters of MyoD, Runx1- and MyoD- binding sites were adjacent (Supplementary Figure 6A). In order to test the effective recruitment of Runx1 onto MyoD target promoters, we performed ChIP experiments. Our results showed a preferential enrichment in Runx1 on myogenin, p21 and cycD3 promoters in proliferating compared to differentiating myoblasts (Figure 3A). These MyoD target genes are expressed early in differentiating but not in proliferating myoblasts (Supplementary Figure 6B).

Our ChIP assays showed that Runx1 was not located on late target genes of MyoD, such as Desmin, MHC and MCK (data not shown), while it was on early muscle differentition genes myogenin, p21 and cyD3. In addition, we did not find Runx1 binding sites adjacent to E-boxes on late MyoD target genes’ promoters. These findings suggest that Runx1 would essentially regulate early events of skeletal muscle termianl differentiation. Taken together, our results strongly suggest that Runx could be recruited onto MyoD early target genes to regulate negatively their expression in proliferating myoblasts.

To gain insights into the mechanism of action of CBF on MyoD target genes, we purified CBFβ protein complex from proliferating C2C12-CBFβ cells via its Flag tag. As expected, CBFβ copurified with the the myogenic factor MyoD and with its dimerization partner Runx1 (Figure 3B). The other partners that copurified specifically with CBFβ are proteins known to be involved in

transcriptional repression: the histone 3 lysine 9 (H3K9) methyltransferase Suv39h1, the heterochromatin protein HP1β, and the histone deacetylases HDACs 1, 2 and 3 (Figure 3B). These proteins are already known partners of Runx1 on the one hand [30], and repressors of MyoD activity on the other hand [31-33].

Given the association of CBFβ with chromatin-modifying enzymes, we studied the chromatin status of three target gene promoters of MyoD in differentiating C2C12-CBFβ using chromatin immunoprecipitation (ChIP). Our results showed that, in contrast to control cells in which histone H3 acetylation (a mark associated with transcription activation) on myogenin, cyclin D3 and p21 promoters increased in differentiation compared with proliferation conditions, histone H3 acetylation levels at these promoters did not vary in C2C12-CBFβ cells (Figure 3C). This result is an agreement with our previous findings showing that CBF associates with chromatin modifying enzymes, such as HDACs, Suv39h1 and HP1β, which are known to repress MyoD activity in proliferating myoblasts. Thus, CBF has an effect on the chromatin structure of three early target genes of MyoD and contibutes to maintain a repressive chromatin state.

DISCUSSION

Here we show that CBF transcription factor is expressed in proliferating myoblasts where it interacts with MyoD. We found that modulating the expression levels of either of the CBF subunits, Runx1 or CBFβ, impaired cell cycle exit and terminal myogenic differentiation.

Runx1 or CBFβ downregulation in myoblasts induced an accelerated cell cycle exit (cyclin D1 protein disappears 24 hours earlier) in differentiation conditions. In addition, Runx1 or CBFβ downregulation led to a an increase in G1-phase cells, suggesting that CBF positively regulates myoblasts proliferation. Conversely, CBFβ overexpression delayed cyclin D1 disappearance even in differentiation conditions (cyclin D1 is still detectable 72 hours after the induction of differentiation), demonstrating a delayed cell cycle exit. Consequently, entry into terminal differentiation was delayed. In agreement with

this, our ChIP results showed that in proliferating myoblasts, Runx1 is recruited to repressd p21 and cyclin D3, which encode cell cycle regulators. Together, these results suggest that CBF regulates positively proliferation, and negatively terminal differentiation, of skeletal myoblasts. Thus, CBF impacts on the proliferation/differentiation switch in myoblasts (see model on Figure 4).

Our results revealed that such a role for CBF is likely to be partly mediated through interaction with MyoD. Indeed, we provide evidence that CBF is recruited to early MyoD target genes in proliferating myoblasts, where MyoD is mainly associated with transcriptional repressors [24]. This suggests that CBF may serve for assembly of a transcription repression complex at early MyoD target genes such as p21 and cyclin D3. As for example, such a mechanism could be involved in the repression of the skeletal muscle acetylcholine receptor gene, which contains a repressive E-box that mediates its repression in proliferating myoblasts [34]. In agreement with this, we found that in proliferating myoblasts, CBF associates with many chromatin modifying enzymes, such as HDACs (1, 2 and 3), Suv39h1, and HP1β, which are known to repress MyoD activity in proliferating myoblasts [24,31,35,36]; and already known to interact with Runx1 [30,37,38]. We did not succeed to show the concomitant presence of Runx1 and MyoD on MyoD target genes, given that it has reviously been demonstrated that in proliferating conditions, a small fraction of MyoD contributes to the repressive remodeling of its target genes, prior differentiation. Alternatively, Runx1 could prevent the proper binding of MyoD and the recruitment of the transcriptional machinery. Notably, the displacement of Runx1 in differentiating conditions is concomitant with a strong binding of MyoD to its target promoters (data not shown).

Our results showed that Runx1 was not located on late target genes of MyoD, while it is recruited into early muscle differentiation genes. This suggests that Runx1 essentially regulates cell cycle exit and early events of skeletal muscle terminal differentiation.

Taken together, our results strongly suggest that CBF could be recruited onto early MyoD

target genes to repress them in proliferating myoblasts.

Interestingly, although MyoD is expressed both in proliferating and differentiating cells, we found that the interaction between MyoD and CBF was lost in differentiating cells. In proliferating myoblasts, a fraction of MyoD could be recruited to its target genes where it acts as a transcriptional repressor, until differentiation starts [24]. We showed that overexpression of CBFβ in myoblasts led to stabilization of Runx1 that could more efficiently repress MyoD transactivating activity, which induces a delay in terminal differentiation. In agreement with this, in myoblasts overexpressing CBFβ, histone H3 acetylation (a mark of active transcription) on MyoD target genes is delayed in differentiation conditions.

In summary, we propose that CBF transcription factor might participate in recruiting chromatin modifying enzymes to repress MyoD early target genes by locally inducing a repressive chromatin structure. Our data reveal a new critical role of CBF in the regulation of the balance between proliferation and differentiation in skeletal muscle cells. They also demonstrate a new mechanism of repression of differentiation genes in proliferating myoblasts.

MATERIALS AND METHODS Cell culture

C2C12 (CRL-1772, ATCC, USA) and HeLa S3 cells (CCL-2.2TM, ATCC, USA) were cultured under standard conditions. C2C12 cells and mouse primary myoblasts (described in: [39]), were cultured and differentiated as described in: [39].

Stable cell lines establishment and plasmid construction

A HeLa cell line stably expressing MyoD was established with a transgene encoding for full-length MyoD; and HeLa and C2C12 cell lines expressing CBFβ were established with a transgene encoding for full-length CBFβ. The transgenes were tagged with double-HA (Haemagglutinin) and double-FLAG epitopes at the N-terminus as described in [40].

Control cell lines transduced with the empty vector were also established. Murine CBFβ cDNA (a kind gift from Dr Nancy A. Speck) was amplified by PCR with specific primers with protruding restriction sites (fw-Pspx1:

CCGCTCGAGCCGCGCGTCGTCCCGGG, rev-Not1: ATTCTATATGCGGCCGCTAACGAAGTTTGAGATCATCG, and subcloned into the XhoI-NotI sites in the pREV retroviral vector after Pspx1 and Not1 digestion (Pspx1 is compatible with Xho cloning site in the pRev vector) [40,41].

Protein complex purification

Flag-HA-MyoD complex purification from HeLa-MyoD cells was performed as described in: [31]. 3 grams of C2C12-CBFβ cell pellet were used to purify tagged CBFβ using a simple-affinity purification method using Flag resin.

Preparation of nuclear extracts

Cells were scraped in a minimal volume of PBS and centrifuged 2 min at 400 g. The pellet was resuspended in: 20 mM Hepes pH 7, 0.15 mM EDTA, 0.15 mM EGTA, 10 mM KCl, then lysed by addition of NP-40 up to 4.5%. Nuclei were immediately neutralized with addition sucrose buffer (50 mM HEPES pH 7, 0.25 mM EDTA, 10 M KCl, 70% (m/v) sucrose). After centrifugation (5 min, 2000 g), nuclei were suspended in glycerol buffer (10 mM HEPES pH 8, 0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 25% glycerol) to remove any trace of cytosolic components and centrifuged again. The nuclei were then resuspended in sucrose buffer n°2 (20 mM Tris pH 7.65; 60 mM NaCl; 15 mM KCl; 0.34 M Sucrose) then lysed in a final concentration of 250 mM NaCl using High Salt Buffer (20 mM Tris pH 7.65; 0.2 mM EDTA; 25 % glycerol; 900 mM NaCl; 1.5 mM MgCl2). The lysates were sonicated 3 times for 15s with the BioRuptor (Diagenode, Liège, Belgium) on “High”, then centrifuged 10 min at 13000 rpm to harvest the total nuclear extracts (supernatants). Protein concentration for each sample was estimated with BCA kit (Perbio, Brebières, France).

Transient plasmid transfection and Flag-affinity precipitation of Flag-HA-CBFβ

For plasmid transfection, 25 µg of pRcCMV-HA-AML1 (kind gift of Dr I. Kitabayashi, Japan), pCMV-HA-MyoD or pRC-CMV backbone were transfected into HeLa-CBFβ cells, using calcium phosphate pH 7.12, and Flag IPs was performed 24 h post-transfection (results presented on Figure 1C). Each IP was performed with 1.5 mg of total nuclear extracts and with 25 µL stock of ssDNA and BSA-pre-blocked Agarose Flag M2 resin from Sigma. IP was performed on wheel overnight at 4 °C. Resin was then washed 5 times with TEGN buffer (20 mM Tris pH 7.65; 0.1 mM EDTA; 10 % glycerol; 150 mM NaCl; 0.5 % NP-40) and eluted by competition with high-purity Flag peptide at a final concentration of 0.2 mg/ml. The resin-free eluate was retrieved using Clean-up Post reaction columns (Sigma).

siRNA transfection

siRNAs were purchased from Sigma (Saint-Quentin Fallavier, France) and were transfected using Hi-Perfect reagent (Qiagen, Courtaboeuf, France) according to the manufacturer recommendations. We usually transfect 0.2 µmol of siRNA per 100 mm cell culture dish. CBFβ targeting siRNA sequences used are: C1: CCGGGAAUAUGUCGACUUA, and C2: UAACUUAGGUGGCGGUGAU; Runx1 siRNA: CUGUGAAUGCUUCUGAUUU; and the scrambled siRNA: ACUUAACCGGCAUACCGGCTT.

Immunoprecipitation of endogenous proteins

For IP, we usually use 2 µg of antibodies, 10 µL protein A/G Sepharose beads from Perbio and 1.2 mg of nuclear extracts from C2C12 cells, or 0.5 mg from primary myoblasts. Elution was performed with 40 µl of 0.1 M glycine pH 2.5, 15 min at 25 °C, the eluate was recovered using Spin cleaning-up post-reaction column (Sigma). Acidity was neutralized with Tris pH 8.0 before adding loading buffer.

Western blotting

For western blotting, protein samples were resolved on pre-cast NuPage 4-12% bis-Tris acrylamide gradient SDS-PAGE gel (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Proteins were then transferred onto nitrocellulose membrane during 1 h at 400 mA in transfer buffer (25 mM Tris, 150 mM Glycine, 0.1 % SDS and 20 % methanol). Membranes are blocked 1 hour in PBS-0.2 % Tween, 10 % skimmed milk and incubated overnight at 4°C with primary antibodies. Membranes were incubated with the appropriate secondary antibodies coupled to HRP and revealed using West Dura from Pierce (Perbio, Brebières, France) and ChemiSmart 5000 system (Vilber Lourmat, Marne-La-Vallée, France).

Plasmids, GST fusions and GST pull-down

GST and GST-MyoD plasmid constructs were expressed in Escherichia coli strain BL21 and purified using glutathione-sepharose beads according to the manufacturer (Sigma, Saint Quentin-Fallavier, France). Purified proteins were quantified by coomassie staining after SDS–PAGE separation. In vitro transcription and translation (TNT) of pcDNA3-AML1b, pcDNA3-CBFβ and luciferase were performed with Riboprobe in vitro transcription systems (Promega, Charbonnières, France) in the presence of 35S-labelled methionine.

Agarose beads coated with equal amounts of GST or GST-MyoD (1 mg) were incubated with 10 µL of radioactive TNT reaction in reaction buffer (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Triton) during 2 h at 4°C. Beads were washed 5 times with wash buffer (50 mM Tris pH 7.6, 300 mM NaCl, 0.5 % Triton 100), resuspended and proteins

resolved by SDS-PAGE gel and revealed by autoradiography.

Immunofluorescence

Cells were cultured in Labtecks permanox (Falcon) and fixed briefly with 4% formaldehyde in PBS. Residual formaldehyde was neutralized with 0.1 M Glycine pH 8.0, and washed with PBS. Cells were permeabilized and blocked using 1 % BSA, 1 % goat serum, 0.3 % Triton-X100 in PBS. Primary and secondary antibodies were diluted in the permeabilizing/blocking solution and were washed with 0.3% Triton-X100 in PBS. Nuclei are stained with DAPI and the glass lid is fixed using an anti-fading polymerizing media from DakoCytomation (Dako, Trappes, France).

Antibodies

The C-20 anti-MyoD, M-225 anti-myogenin, C-20 anti-Myf5, FL-182 anti-CBFβ normal rabbit IgG antibodies were purchased from Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA). Rabbit polyclonal anti-Suv39h1 antibody (ref. 07-550), and rabbit anti-acetyl histone H3 (ref. 06-599) were obtained from Upstate Biotech (Lake Placid, NY, USA). Anti-HP1β (1MOD1A9AS) was from Euromedex (Souffelweyersheim, France). Rabbit polyclonal anti-MCK antibody was developed by Dr H. Ito [42]. Anti-Flag and anti-α-tubulin antibodies were purchased from Sigma (Saint-Quentin Fallavier, France). Rat anti-HA antibody was purchased from Roche (Meylan, France). Mouse anti-AML1 antibody (MAB10062) was purchased from Millipore (Saint Quentin en Yvelines, France) and mouse anti-HDAC3 antibody (611125) from BD Biosciences (Le Pont de Claix, France). Goat anti-rat IgG Alexa-488-conjugated, anti-rabbit IgG Alexa-488 were from Invitrogen (Cergy-Pontoise, France) and anti-mouse IgG TRITC (T7657) were from Sigma (Saint-Quentin Fallavier, France).

FACS analysis

C2C12 were transfected with the siRNAs as indicated in the Material and Method section. 48 hours post-transfection, cells were washed with PBS, then scraped in 500 µL of PBS. Cells were kept on ice while 4,5 mL of ethanol 70% were added. Then cells are kept at least overnight at -20°C. Propidium iodide (PI) staining proceeds as follows: cells are centrifuged and the pellet is washed with PBS. Cells are then centrifuged and resuspended in 2mL PI solution (PI, RNase, Triton 0,1%) 30 minutes and kept in the dark. Cells are homogeneized by vortexing before analysis. We worked on a Beckman and Coulter FACS apparatus and we counted at least 3000 events for each condition.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

ChIP protocol and primers have been described in: [39]. The yet unpublished primers used are: Myogenin fw: GAATCACATGTAATCCACGGA, rev: ACGCCAACTGCTGGGTGCCA. Cyclin D3 fw: CTGCTTGCCTCTGTCTTCA; rev: GACCCATGTCAGATGACTC. 36B4 fw: ATGTGCAGCTGATAAAGACTGG; rev: CTGTGATGTCGAGCACTTCAG.

ACKNOWLEGEMENTS

We thank P. Robin, C. Pellentz, L. Fritsch, A. Polesskaya, and A. Marchand for technical help and critical reading of the manuscript. We thank F. Ferri and C. Guillemin for technical help. We thank C. Francastel, J. Weitzman, F. Hubé, C. Rougeulle, V. Mezger and P-A. Defossez for critical reading of the manuscript. The authors warmly thank Drs N. Speck, G. Mouchiroud, I. Kitabayashi, H. Ito, and L. Delva for sharing reagents. This work was supported by the Association Française contre les Myopathies (AFM); the Fondation Bettencourt-Schueller; the Ligue Nationale contre le Cancer; the Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), the CNRS; and the Université Paris-Sud. PO was recipient of fellowships from the Ministère de la Recherche and the ARC.

CONFLICT OF INTEREST None of the authors has any commercial affiliations, consultancies, or equity interests, nor patent-licensing arrangements that could be considered to pose a conflict of interest regarding the submitted manuscript.

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FIGURE LEGENDS

Figure 1: Runx1 and CBFβ interact with MyoD in vitro and in proliferating myoblasts

A. Peptide sequences identified by mass spectrometry in the MyoD complex corresponding to CBFβ protein. B. Western blot analysis of double-purified Flag-HA-MyoD (MyoD), or eluate from HeLa control cells (Mock) with the indicated antibodies (Ab). S: soluble; C: chromatin associated. C. HeLa cells stably expressing Flag-HA-CBFβ (CBFβ) or HeLa control cells stably transfected with the empty vector (Ctr) were transiently transfected with expressing vectors for HA-tagged MyoD and/or HA-tagged Runx1. 24 hours post-transfection, cells were harvested and lysates were used for immunoprecipitation (IP) using Flag resin to precipitate Flag-HA-CBFβ. Precipitates were then subjected to western blot using HA Ab (ib α-HA) to simultaneously detect HA-Runx1, HA-MyoD, and Flag-HA-CBFβ (discriminated on the gel by their molecular weight). D. Nuclear extracts from proliferating (prolif.) or differentiating myoblasts (Diff.) were used for IP with antibodies raised against MyoD (lanes 4 and 9) and Myf5 (lanes 2 and 7), with control beads (lanes 3 and 8) or with normal rabbit IgG (lanes 5 and 10) as negative controls. The resulting precipitates were then subjected to western blot analysis for the presence of MyoD, Myf5 and CBFβ. Nuclear extracts (input) were loaded to show endogenous protein levels (lanes 1 and 6). E. Runx1, CBFβ, or luciferase (Luc) were in vitro translated in the presence of 35S-Methionine (inputs on lanes 1-3, respectively) and incubated with equivalent amounts of GST-MyoD beads (lanes 4-7) or GST beads (lanes 8-11). GST pull-down was then conducted as described in the Material and Methods section, and the radiolabeled proteins were detected by autoradiography. *: CBFβ.

Figure 2: Modulation of CBF subunits expression deregulates cell cycle exit and muscle terminal differentiation entry

A. C2C12 myoblasts were transfected with scrambled (Scr) or anti-Runx1 siRNAs. 48 h post-transfection (0 h, lanes 1-2), cells were placed in differentiation medium for 24 h (lanes 3-4) or 48 h (lanes 5-6). Cells were then analyzed by western blot with the indicated antibodies (Ab). The differentiation times are indicated in hours (h). Runx1 downregulation has been quantified (indicated as “Runx1 quantif.”) using Bio1D application (Vilber Lourmat). α-tubulin is used as a loading control. B. As in A, except that we used anti-CBFb siRNAs. C. As in A and B, except that we used proliferating primary myoblasts, and combined Runx1 and CBFb siRNAs (lane 4). Note that all the kinetic studies of differentiation were carried out in the same 10 cm diameter cell culture dish for each sample. D. FACS analysis of the cell cycle distribution of C2C12 myoblasts transfected with the indicated siRNAs. Cells were analyzed 48h post-transfection. Scr: scrambled siRNA. E-F. C2C12 cells stably overexpressing Flag-HA-CBFb (C2C12-CBFb) or control cells (C2C12-Ctr) were differentiated at the indicated times (E, in hours), and analyzed by western blotting with the indicated Ab (E) or by immunofluorescence (IF) (10X magnification) (F). The kinetic studies were carried out

in the same 10 cm diameter cell culture dish (E). IF experiments using anti-MCK or anti-MHC Ab were performed 48 h and 72 h respectively after induction of differentiation. Cells were DAPI-stained prior to fluorescent microscopy analysis (63X magnification).

Figure 3: CBF acts at the chromatin level to regulate MyoD target genes

A. ChIP using anti-Runx1 Ab were performed from either proliferating (grey bars) or differentiating myoblasts (black bars). We quantified copy numbers of the myogenin, p21 and cyclin D3 promoter regions harboring the MyoD and Runx1 target sequences, compared to 36B4 gene, which was used as a reference gene. Results are the mean of 3 independent experiments. B. Western blot analysis of Flag-purified Flag-HA-CBFβ stably expressed in C2C12 cells (CBFβ), or from C2C12 control cells (Ctr). Both inputs are probed in lanes 1-2 and eluates are shown in lanes 3-4. C. Chromatin immunoprecipitation experiments using anti-acetyl H3 antibody were performed from either proliferating (grey bars) or differentiating (black bars) C2C12 control (left) and C2C12-CBFβ (right) cells. We quantified copy numbers of the myogenin (myog.), cyclin D3 and p21 promoter regions harboring the MyoD target sequences. Results are the mean of three measurements.

Figure 4: Model of skeletal muscle terminal differentiation regulation by CBF and MyoD.

CBF negatively regulates cell cycle exit and early muscle differentiation genes. Upon differentiation, MyoD activates these genes.

Figure 1, Philipot et al.

A

B

HA-CBF

HA-MyoD

HA-Runx1

1 2 3 4 5 6 7 8Input Flag IP

pHA-MyoDpHA-Runx1

CtrCBF CtrCBF

+ + + + + + + +

+ - + - + - + -

HeLa-:

CBF

Flag

C CS

Mock MyoD

2851

MW(kDa)

Runx1

S

51

1 2 3 4

ib

-HA

-

C

-

-

MW(kDa)

34

39

51

64

D

MyoD

CBF

Myf-5

Inp

ut

Inp

ut

Prolif. Diff.

IP Ab

Myf

-5

bea

ds

Myo

D

IgG

IP Ab

Myf

-5

bea

ds

Myo

D

IgG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E

Run

x1

CB

F

Luc

GST-MyoD GST

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Runx1

Runx1

CBFCBF

Runx1+CBF

LucRunx1+CBF

Luc

11

Inputs

22

39

28

51

19

MW(kDa)

28

39

MW(kDa)

**

F

Figure 2, Philipot et al.

A

CBF

MCK

Myog.

-tub.

CycD1

Runx1

0 4824Diff. (h)

siRNA Scr

Run

x1

Scr

Scr

Run

x1

Run

x1

1 2 3 4 5 6

B

Myog.

MHC

CBF

C

MCK

-tub.

Scr

siRNA CB

F

Run

x1

Run

x1+

CB

F

MW(kDa)

MW(kDa)

39

51

2839

51

51

19

39

19

51

39

51

28

28

19128

1 2 3 4

100 58 100 36 100 1Runx1 quantif.

Myog.

CBF

MCK

cyc D1

Prolif. Diff.

Scr

siRNA CB

F

Scr

CB

F

MW

39

28

39

51

19

28

3928

1 2 3 4

Flag

MCK-tub.

MHC

Myog.

C2C12-Ctr C2C12-CBF

120960 724824Diff. (h) 120960 724824

MyoD

Runx1

E

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

cycD1

MW(kDa)

39

51

39

51

51

191

2839

2839

3928

64

FMCK MHC

C2

C1

2-C

trC

2C

12

-CB

F

60

7176

16.511 10

2317

12

10

20

30

40

50

60

70

80

Scr siRNA Runx1 siRNA

G1 S G2/M

CBF siRNA

cells

in c

ell c

ycle

ph

ases

(%)

D

CB

F

Ctr

Figure 3, Philipot et al.

Flag (CBF )

MyoD

HP1

Suv39h1

Runx1

input eluate

C2C12-

Myf5

HDACs

CB

F

Ctr

2 3 4

123

B

MW(kDa)

3939

3951

51

19

2839

28

64

3928

6439

50

100

150

200

250

5

10

15

20

25

CChIP Acetyl H3

pro

mo

ter

enri

chm

ent

C2C12-Ctr C2C12-CBF

p21myog. cycD3

Proliferation Differentiation

p21myog. cycD3promoter

1

p21

pro

m. r

ela

tive

en

rich

men

t

myogenin cycD3

ChIP anti-Runx1

A

Proliferation

Differentiation

1

2

3

4

5

6

7

Figure 4, Philipot et al.

CBF

D3 p21 Myogenin

MYOD

Purification on Flag resin

Purification on HA resin

SDS-PAGE resolution, mass spec analysis/western blot

Elution against Flag peptide

Elution against HA peptide

Nuclear soluble or chromatin extractsfrom HeLa cells expressing Flag-HA-MyoD

Supplementary Figure 1, Philipot et al.

Schematic representation of the purification protocol used to purify the MyoD complex from HeLa cells.

Supplementary Figure 2, Philipot et al.

MyoD known partners identified by mass spectrometry in the MyoD complex

Protein name ReferencePbx1 (Berkes et al, 2004)PC4 (Micheli et al, 2005)

Id (Benezra et al, 1990)E12/E47 (Lassar et al, 1991)

BRG1 (de la Serna et al, 2001)Prohibitin (Sun et al, 2004)

HP1 (Yahi et al, 2008)PRMT5 (Dacwag et al, 2007)

REFERENCES

Benezra R, Davis RL, Lockshon D, Turner DL, Weintraub H (1990) The protein Id: a negative regulator of Helix-Loop-Helix DNA binding proteins. Cell 61: 49-59

Berkes CA, Bergstrom DA, Penn BH, Seaver KJ, Knoepfler PS, Tapscott SJ (2004) Pbx marks genes for activation by MyoD indicating a role for a homeodomain protein in establishing myogenic potential. Mol Cell 14(4): 465-477

Dacwag CS, Ohkawa Y, Pal S, Sif S, Imbalzano AN (2007) The protein arginine methyltransferase Prmt5 is required for myogenesis because it facilitates ATP-dependent chromatin remodeling. Mol Cell Biol 27(1): 384-394

de la Serna IL, Carlson KA, Imbalzano AN (2001) Mammalian SWI/SNF complexes promote MyoD-mediated muscle differentiation. Nat Genet 27(2): 187-190

Lassar AB, Davis RL, Wright WE, Kadesch T, Murre C, Voronova A, Baltimore D, Weintraub H (1991) Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell 66(2): 305-315

Micheli L, Leonardi L, Conti F, Buanne P, Canu N, Caruso M, Tirone F (2005) PC4 coactivates MyoD by relieving the histone deacetylase 4-mediated inhibition of myocyte enhancer factor 2C. Mol Cell Biol25(6): 2242-2259

Sun L, Liu L, Yang XJ, Wu Z (2004) Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci 117(Pt 14): 3021-3029

Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S (2008) Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem 283(35): 23692-23700.

Supplementary Figure 3, Philipot et al.

MyoDRunx1CBF

MCKMyog.

0 72

-tub.

0 724824Diff. (h)

1 2 3 4 5 651

39

5119

28

3951

MW(kDa)

3951

Expression of Runx1 and CBF proteins during muscle terminal differentiation.

Cellular extracts from proliferating or differentiating C2C12 myoblasts (left panel) or from mouse primary myoblasts (right panel) were subjected to western blot analyses for the expression of CBF Runx1, MyoD, myogenin (Myog.) and Muscle Creatine Kinase (MCK).

-tubulin is detected as a loading control. Differentiation times are indicated in hours on the top of each panel.

Supplementary Figure 4, Philipot et al.

A

Scr

Runx1

Proliferation DifferentiationsiRNA

B

CBF

Proliferation Differentiation

Scr

siRNA

A. C2C12 myoblasts were transfected with control siRNA (Scrambled, Scr) or with Runx1 siRNA as indicated. 48 hours post-transfection (Proliferation) cells were placed in differentiation medium (Differentiation) for 86 hours. Cells were then analyzed by microscopy (10X magnification).

B. As in A, except that we used CBF siRNA.

ib C

BF

ex.

end.

0 24 48 72 96 120

0 24 48 72 96 120

C2C12 Ctr C2C12 CBF

Supplementary Figure 5, Philipot et al.

Differentiation (h)

C2C12-CBF cells characterization

A. Expression level of CBF in C2C12 control (ctr) and in C2C12-CBF in proliferating myoblasts (0 h) or at the indicate differentiation times (in hours), as measured by western blot using anti-CBF antibody. ex.: exogenous; end: endogenous. B.C2C12 cells stably overexpressing Flag-HA-CBF? (C2C12-CBF ) or control cells (C2C12-Ctr) were differentiated for 72 hours and analyzed by light microscopy (10X magnification).

19

39

28

MW(kDa)

C2

C1

2-C

trC

2C

12

-eC

BF

Proliferation Differentiation

light microscopy

BA

Supplementary Figure 6, Philipot et al.

p21

myogenin

cycD3

B

Proliferatio

n

Differentiatio

n

(24 h)

1 2

-tub.

MW(kDa)

51

19

2839

28

28

39

+1-642 -532 -378

MyoDCATTTG

Runx1TGTGGT

MyoDCAGCTG myogenin promoter

+1+187 +209

MyoDCACCTG

Runx1TGTGGT

p21 promoter

A

A. Runx1 binding sites found in silico on MyoD target genes myogenin and p21.

B. Western blot analysis (with the indicated antibodies) of cell extracts used for the ChIP experiment presented on Fig 1G. -tubulin ( -tub.) is used a loading control.

-8

MyoDCAGTTG

DISCUSSION DES RÉSULTATS

77

Discussion des Résultats Validation de la stratégie d’approche

L’idée originale de notre stratégie était d’opter pour une approche globale dans un système

cellulaire artificiel puisque nous avons identifié les partenaires protéiques du facteur

myogénique MyoD dans une lignée non-musculaire, la lignée humaine tumorale HeLa. Ce

choix était motivé par des raisons pratiques à plusieurs niveaux. Tout d’abord, les cellules

HeLa sont des cellules cancéreuses qui supportent relativement bien l’expression constitutive

du facteur MyoD, alors que normalement MyoD exprimé ectopiquement est capable

d’induire la transdifférenciation des cellules hôtes. Ainsi, ces cellules se transdifférencient au

détriment de la prolifération, rendant difficile l’isolement de clones cellulaires surexprimant

MyoD tout en continuant à proliférer. Le deuxième avantage d’utiliser les cellules HeLa pour

surexprimer MyoD est leur capacité à proliférer en suspension. Ce paramètre non-négligeable

nous a permis d’obtenir rapidement de grandes quantités de cellules en cultivant les HeLa

dans de grands contenants pouvant contenir jusqu’à trois litres de culture cellulaire. Grâce

aux deux étiquettes Flag et Hemaglutinine (HA) portées par MyoD, j’ai pu purifier de

manière très stringente le complexe MyoD avec un protocole de double affinité. L’analyse du

complexe MyoD purifié par spectrométrie de masse a été réalisée en doublon au laboratoire

et dans un laboratoire américain situé à Boston. Le panorama de l’ensemble des partenaires

de MyoD a été réalisé après trois purifications et trois analyses par spectrométrie de masse du

complexe, nous permettant ainsi de recouper les protéines communes aux trois analyses

effectuées. Alors que je partais avec un biais dans ma stratégie en utilisant les cellules HeLa

comme système d’expression, un grand nombre de partenaires historiques de MyoD ont été

révélés dans le complexe MyoD. Entre autres, les protéines E12, Id1, Brg1, Pbx, prohibitine

ont été identifiés au sein de complexe MyoD, validant ainsi notre approche.

Identification de Runx1-CBFβ au sein du complexe MyoD

Beaucoup de nouveaux partenaires potentiels de MyoD ont été révélés et notamment la

protéine CBFβ est apparue avec un grand nombre de peptide. La protéine CBFβ se dimérise

avec la protéine Runx1 pour former le facteur de transcription CBF (Core Binding Factor).

78

De manière intéressante, bien que Runx1 n’ait pas été révélé par l’analyse de spectrométrie de

masse du complexe MyoD, j’ai pu le détecter, ainsi que CBFβ, en réalisant un western blot

sur le complexe MyoD purifié.

Le choix d’étudier plus en détail le facteur CBF (Runx1-CBFβ) comme partenaire de MyoD

n’était pas basé uniquement sur le nombre de peptides abondants trouvé pour CBFβ après

l’analyse par spectrométrie de masse. Dans la littérature scientifique, plusieurs publications

reliaient Runx1 et CBFβ avec le muscle squelettique. Une des premières études mettant le

facteur CBF en lien avec le muscle concerne l’expression de CBFβ in vivo dans le muscle

squelettique (Chiba et al, 1997). De plus, dans une étude visant à étudier de façon exhaustive

les gènes cibles de MyoD, Runx1 avait déjà été montré comme un gène cible de MyoD

(Bergstrom et al, 2002). La région promotrice de Runx1 contient en fait plusieurs boîtes E

reconnues pour la fixation des MRFs. Il a ainsi été montré dans cette étude que dans les

myoblastes primaires, MyoD et Myf5 activent l’expression des gènes liés à la croissance

cellulaire et activent notamment l’expression de Runx1 (Ishibashi et al, 2005). Parmi les

publications décrivant Runx1 et CBFβ au niveau du système musculaire, toutes restent très

descriptives et à ma connaissance, aucun mécanisme ou rôle n’a été décrit pour la fonction de

Runx1 et CBFβ au cours de la différenciation musculaire.

MyoD interagit avec CBF via la sous-unité Runx1

J’ai donc investigué davantage sur l’interaction protéique entre MyoD et CBF. Nos résultats

montrent que l’interaction entre MyoD et CBF passe par l’interaction directe entre MyoD et

la sous-unité Runx1. De manière intéressante, une autre protéine à domaine HLH, la protéine

MITF, a été montrée comme interagissant directement avec Runx1 via le domaine de

transactivation de Runx1 situé dans la partie C-terminale du domaine runt (Ogihara et al,

1999). Bien que le domaine d’interaction entre ces deux protéines n’ait pas été défini pour

MITF, il se peut que ce soit au sein de la région hydrophobe HLH qui est retrouvée

également chez la protéine MyoD. Une autre protéine à domaine HLH a également été

montrée comme interagissant avec Runx1, il s’agit de la protéine HES (McLarren et al, 2000).

Cette fois encore, le domaine d’interaction entre HES et Runx1 n’a pas été mis en évidence et

ne permet pas de voir si le domaine d’interaction de HES avec Runx1 est partagé par le

facteur MyoD. Je devrais donc affiner mon résultat en étudiant les domaines d’interaction de

Runx1 et MyoD. D’ailleurs, j’ai déjà réuni le matériel nécessaire pour la réalisation de ces

expériences.

79

MyoD et CBF interagissent dans les myoblastes murins, essentiellement durant leur prolifération

Afin d’avoir une relevance biologique de cette interaction étudiée jusqu’à présent de manière

artificielle, j’ai testé l’interaction MyoD-CBF dans des myoblastes murins en utilisant la lignée

C2C12. Si cette lignée immortalisée reste un outil fiable et pratique plus de trente ans après

son isolement, elle connaît des dérives en culture par rapport à des myoblastes fraîchement

isolés. J’ai également donc travaillé sur des myoblastes primaires isolés au laboratoire à partir

de cellules satellites murines pour confirmer tous les résultats des expériences obtenus avec la

lignée de myoblastes immortalisés C2C12. De manière endogène cette fois, j’ai donc détecté

dans des myoblastes murins (C2C12 et primaires) les sous-unités Runx1 et CBFβ en

immunoprécipitant MyoD. De manière intéressante, l’interaction entre MyoD et Runx1-

CBFβ est très forte dans les myoblastes en prolifération, mais n’est presque plus détectable

après induction de la différenciation. MyoD est le chef d’orchestre de la différenciation

terminale et il est connu pour être associé à des inhibiteurs et des co-répresseurs dans les

myoblastes en prolifération. L’interaction préférentielle entre MyoD et CBF dans les

myoblastes en prolifération a immédiatement soulevé la possibilité que CBF soit un

régulateur négatif de l’activité de MyoD. De plus, une étude extérieure à la nôtre montre qu’à

l’instar des régulateurs négatifs de la différenciation musculaire, le transcrit de Runx1 est

fortement diminué dans les myoblastes après induction de la différenciation (Delgado et al,

2003). Par ailleurs, étant donné que MyoD et Runx1 sont soumis à des modifications post-

traductionnelles, il est tout à fait envisageable que la variation du statut de

phosphorylation/acétylation/méthylation de ces deux protéines soit responsable de la

variation de leur force d’interaction entre les myoblastes proliférants et les cellules en

différenciation. L’utilisation de mutants de MyoD ou Runx1, non

phosphorylables/méthylables/acétylables nous permettra de tester in vitro cette éventualité.

CBF est recruté sur les gènes cibles de MyoD, préférentiellement dans les cellules musculaires en cours de prolifération, et non en différenciation

J’ai affiné le contexte d’interaction de MyoD et CBF en regardant s’il était dépendant de la

chromatine. Runx1 est la sous-unité responsable de la fixation de CBF sur l’ADN et

reconnaît la séquence consensus TGTGGT (sur le brin complémentaire : ACCACA). De

manière intéressante, sur trois promoteurs cibles précoces de MyoD, j’ai localisé la séquence

consensus de Runx1, adjacente à la boîte E (CANNTG) reconnue par MyoD. Les résultats

obtenus après immunoprécipitation de Runx1 et l’analyse des promoteurs de p21, de la cycline

D3 et de la myogénine par PCR quantitative, montrent que Runx1 est effectivement recruté sur

ces promoteurs cibles de MyoD. MyoD et CBF interagiraient donc dans un contexte

80

dépendant de la chromatine. L’occupation physique de ces promoteurs par Runx1 semble liée

à une répression des gènes en question, puisque le produit de ces gènes n’est alors pas détecté

par western blot. Par ailleurs, de manière très intéressante, la protéine Runx1 est recrutée

préférentiellement sur ces promoteurs dans les cellules musculaires en prolifération et non en

différenciation, renforçant ainsi le rôle potentiellement négatif de Runx1/CBFβ sur la

différenciation musculaire. De manière intéressante, je n’ai pas détecté de recrutement de

Runx1 sur le promoteur de la desmine et l’enhancer de MCK (résultats non présentés), des gènes

cibles plus tardifs de MyoD. Le facteur CBF aurait ainsi peut-être un rôle important dans le

contrôle de l’induction de la différenciation musculaire et un rôle nul ou partiel dans la

régulation des gènes musculaires plus tardifs.

Le facteur CBF régule négativement la différenciation musculaire, au profit de la prolifération cellulaire

La diminution de l’expression de la sous-unité Runx1 ou CBFβ dans les myoblastes

C2C12 ou les myoblastes primaires accélère la différenciation terminale

Dans le but de valider le rôle potentiellement négatif de CBF sur la différenciation

musculaire, j’ai diminué le niveau protéique de chacune des sous-unités CBFβ et Runx1 par

ARN interférence (ARNi) dans les myoblastes C2C12 et dans des myoblastes primaires.

L’effet de la diminution des protéines Runx1 et CBFβ a été contrôlée au cours d’une

cinétique de différenciation. De manière intéressante, dans les deux cas, l’expression de

marqueurs musculaires tels que la myogénine et MCK (créatine kinase musculaire) est

beaucoup plus intense et plus rapide pour les cellules déplétées en Runx1 ou CBFβ. Ce

résultat confirme nos suspicions sur le rôle de CBF au cours de la différenciation musculaire

et lui prête un rôle de régulateur négatif de la différenciation terminale, puisqu’en diminuant

le taux protéique de Runx1 ou CBFβ, la différenciation est accélérée. Sachant que la

différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes, à savoir la sortie du cycle

prolifératif suivie de l’expression des marqueurs de la différenciation musculaire, la question

qui se pose alors est la suivante : « l’expression forte et précoce des marqueurs musculaires en

absence de Runx1 ou CBFβ, est-elle due à une levée de l’inhibition sur les gènes

correspondants ou est-elle une conséquence d’une sortie du cycle cellulaire plus rapide et plus

efficace ? »

Pour répondre à cette question, j’ai testé l’expression de la cycline D1 qui est un marqueur

des cellules en prolifération et dont l’expression inhibe la différenciation musculaire terminale

(Rao et al, 1994; Rao & Kohtz, 1995; Skapek et al, 1995). Effectivement, la protéine cycline

D1 est diminuée précocement et efficacement dans les myoblastes en absence de Runx1 ou

81

CBFβ. La diminution de Runx1 ou CBFβ dans les myoblastes conduirait donc à une sortie

du cycle cellulaire plus efficace et consécutivement à l’expression rapide des marqueurs de la

différenciation musculaire terminale. Ce résultat n’est pas surprenant du fait que dans d’autres

systèmes cellulaires, Runx1 a été montré comme un régulateur de l’expression des cyclines D

(Peterson et al, 2005; Strom et al, 2000) et que la diminution de Runx1 est liée à la sortie du

cycle cellulaire dans plusieurs systèmes cellulaires (Osorio et al, 2008; Theriault et al, 2005).

En absence de Runx1 dans les myoblastes, il est donc raisonnable de constater une

diminution de la protéine cycline D1. J’ai également regardé l’effet de la diminution de Runx1

et CBFβ sur le cycle cellulaire des myoblastes C2C12 par FACS (résultats non présentés).

Effectivement, par rapport aux C2C12-contrôle, le pourcentage de C2C12 dans la phase G1

(correspondant à un arrêt du cycle) est plus élevé lorsque CBFβ est diminué.

La surexpression de la sous-unité CBFβ dans les myoblastes C2C12 ralentit la

différenciation terminale

Afin de valider le rôle négatif de CBF sur la différenciation terminale, j’ai établi une lignée de

myoblastes C2C12 surexprimant CBFβ et j’ai contrôlé l’effet de la surexpression sur une

cinétique de différenciation. Comme attendu, la surexpression de CBFβ induit une

stabilisation de la protéine Runx1. Ce résultat est en accord avec la littérature puisqu’il a été

décrit que CBFβ protège Runx1 de la dégradation par la voie ubiquitine-protéasome (Huang

et al, 2001). L’effet général de la surexpression de CBFβ est le ralentissement de la

différenciation musculaire qui se traduit par la faible expression de MCK et la quasi-

inexistance de myogénine et de la chaîne lourde de la myosine (MHC). Dans ces mêmes

cellules, les expériences d’immunofluorescence montrent que les myotubes formés après 48h

et 72h de différenciation sont courts et pour la plupart mono-, ou di-nucléés, suggérant un

problème de fusion lorsque CBFβ est surexprimé. Ceci peut être en partie expliqué par la très

faible expression de myogénine dans les myoblastes qui surexpriment CBFβ. En effet, la

myogénine est un facteur de transcription qui, de concert avec MRF4, active l’expression de

gènes plus tardifs de la différenciation terminale et participe à la fusion des myoblastes

(Dedieu et al, 2002; Rawls et al, 1998; Vivian et al, 2000).

Le retard de différenciation dans ces mêmes cellules est concomitant avec l’expression forte

et soutenue de cycline D1, favorisant très certainement la prolifération des myoblastes au

détriment de la différenciation. En réalisant l’étude du cycle cellulaire par FACS des C2C12

surexprimant CBFβ, j’ai pu constater un léger enrichissement des cellules dans la phase S par

rapport aux C2C12-contrôle (résultats non présentés). Pour établir que la surexpression de

82

CBFβ n’inhibe pas la différenciation musculaire uniquement par la stimulation antagoniste du

cycle prolifératif, il serait intéressant de diminuer l’expression de la cycline D1 par ARNi dans

ces cellules et de voir si l’expression des marqueurs musculaires est toujours autant

compromise dans ce cas-là.

L’étude de l’effet de la surexpression et la diminution de Runx1 et CBFβ dans les myoblastes,

montre une corrélation inverse entre le niveau d’expression de ces deux protéines et

l’efficacité de la différenciation musculaire. Encore une fois, Runx1 se retrouve au centre d’un

système où son dosage dans la cellule semble en déterminer la destinée. Par exemple, dans le

follicule pileux ou les neurones, l’augmentation du niveau de Runx1 favorise la prolifération

au détriment de la différenciation. Ces résultats et les nôtres confèrent au facteur Runx1-

CBFβ un rôle général dans l’équilibre prolifération-différenciation pour différents systèmes

cellulaires.

Dans les myoblastes en prolifération, CBFβ est associé à des répresseurs et inhibe le remodelage de chromatine sur les gènes cibles de MyoD après induction de la différenciation

Pour essayer d’approcher le mécanisme d’action de CBF, j’ai utilisé la lignée C2C12

surexprimant CBFβ pour étudier les partenaires protéiques de CBFβ dans les myoblastes en

prolifération. En purifiant CBFβ, j’ai détecté par western blot la présence concomitante des

histones désacétylases HDACs 1, 2 et 3, la présence de l’histone méthyl-transférase Suv39h1

et la protéine de l’hétérochromatine HP1β. Ces partenaires protéiques de CBFβ sont connus

pour conférer à la chromatine un état non-permissif à la transcription. Ces protéines sont

également des partenaires connus de MyoD et Runx1. Ce résultat suggère que CBF peut

réprimer au niveau épigénétique l’expression des gènes cibles de MyoD. J’ai donc analysé

l’état d’acétylation (qui est une marque épigénétique d’activation de la transcription) des gènes

cibles de MyoD sur lesquels j’ai montré que Runx1 est recruté préférentiellement au cours de

la prolifération : p21, myogénine et cycline D3. Pour la lignée C2C12-contrôle, le niveau

d’acétylation de ces trois promoteurs augmente très significativement après induction de la

différenciation. En revanche, pour les C2C12 surexprimant CBFβ, le taux d’acétylation reste

faible et constant. Ceci montre que le retard de différenciation observé précédemment pour

ces cellules est lié (au moins en partie) à l’absence ou l’inhibition du remodelage épigénétique

de ces trois gènes cibles de MyoD.

Au final, les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIPs) ont montré que

Runx1 se trouvait sur le promoteur de la myogénine en prolifération, mais pas en

différenciation, pouvant potentiellement réguler négativement l’expression de la myogénine. De

Figure 23. Modélisation des résultats.

A) L’association de CBF avec MyoD se fait préférentiellement au cours de la prolifération. Surcertains gènes cibles précoces de MyoD, CBF possède des sites de liaison et peut recruter desprotéines de remodelage de la chromatine, conférant aux gènes cibles de MyoD un état non-permissif à la transcription dans les myoblastes en prolifération. Au cours de ladifférenciation, l’interaction CBF-MyoD serait levée et CBF ne serait plus présent sur lachromatine, permettant à MyoD de recruter des coactivateurs. B) Double rôle de CBF aucours de la différenciation musculaire terminale : inhibition de la sortie du cycle prolifératif etinhibition de l'expression des gènes spécifiques du muscle.

Gènes spécifiquesdu muscle

Machinerie basale de transcription

E12 MYODMEF2

HATs

CARM1

p300PCAF

Runx1CBFβ

HDACs

MYOD

Suv39h1

CBFβ

HP1Runx1 Gènes spécifiques

du muscle

B

A

Myotubeprécoce

Myoblastes enprolifération

Myocytes alignés

Sortie du cycleprolifératif

Expression desgènes spécifiques

du muscle & fusion

PROLIFERATION DIFFERENCIATION

83

plus, d’après nos données, le promoteur de la myogénine n’est pas acétylé après 24h de

différenciation dans les myoblastes surexprimant CBFβ alors que c’est le cas pour les C2C12

contrôle. Nous observons des résultats similaires pour les promoteurs de la cycline D3 et le

promoteur de p21, tous des gènes cibles précoces de MyoD. La surexpression de CBFβ

semble donc toucher les étapes précoces de la différenciation musculaire. Il serait intéressant

de réaliser des ChIPs anti-Runx1 sur la lignée C2C12 qui surexprime CBFβ pour voir si

l’absence d’acétylation est corrélée à une présence continue de Runx1 sur ces trois

promoteurs-là après induction de la différenciation, retardant ainsi la différenciation

musculaire terminale.

Conclusion et modèle

Ces résultats nous incitent à penser que le facteur CBF agirait à deux niveaux pour réguler la

différenciation musculaire : à la fois sur la sortie du cycle prolifératif, mais aussi sur

l’expression des marqueurs de la différenciation musculaire et la fusion des cellules. De plus,

du fait de son interaction avec MyoD et sur les gènes cibles de MyoD, préférentiellement au

cours de la prolifération cellulaire, il semblerait que le rôle du facteur CBF soit au moins en

partie dépendant de MyoD. MyoD est capable d’induire la transdifférenciation de cellules

non-musculaires avec une efficace relative et certaines lignées non-musculaire comme la

lignée HeLa sont réfractaires à la transdifférenciation induite par MyoD (Choi et al, 1990;

Davis et al, 1987; Weintraub et al, 1989). Cette résistance est expliquée en partie par

l’expression d’inhibiteurs de la différenciation musculaire, tels que Id et la musculine (Yang et

al, 2009b). De même, le facteur Runx1 pourrait inhiber cette conversion dépendante de

MyoD. Cependant, à la vue son action connue sur le cycle cellulaire, Runx1/CBFβ pourrait

inhiber la différenciation musculaire rien que par sa fonction antagoniste à MyoD, en

stimulant la prolifération des myoblastes. Le modèle que je propose pour le rôle du facteur

CBF au cours de la différenciation terminale est le suivant (figure 23) : (i) son association

avec MyoD se fait préférentiellement au cours de la prolifération. Sur certains gènes cibles

précoces de MyoD, Runx1 possède des sites de liaison (ii) et peut recruter des protéines du

remodelage de la chromatine conférant aux gènes cibles de MyoD un état non-permissif à la

transcription (iii) dans les myoblastes en prolifération (iv). Au cours de la différenciation,

l’interaction CBF-MyoD serait levée (v) et CBF ne serait plus présent sur la chromatine (vi),

permettant à MyoD de recruter des coactivateurs.

DISCUSSION GÉNÉRALE

84

Discussion Générale & Perspectives I. Régulation de la translocation de CBFβ dans le noyau des myoblastes

Avant la nôtre, une seule étude s’était penchée sur le rôle de CBFβ dans le muscle

squelettique, celle de Chiba et ses collègues. Cette étude renseigne sur la localisation

cytoplasmique et nucléaire de CBFβ au cours du développement du muscle squelettique

(Chiba et al, 1997). Dans cette étude, les auteurs suivent l’expression et la localisation de la

protéine CBFβ dans les myocytes alignés et prêts à fusionner, dans les myotubes néo-formés

et dans les myofibres matures caractérisées par l’alignement des myofibrilles et l’apparition

des stries Z. Dans les myocytes intercostaux (jour embryonnaire E13,5 chez la souris),

l’expression cytoplasmique de CBFβ est faible, et à un stade antérieur où les myocytes sont

encore désorganisés, la protéine CBFβ n’est carrément pas détectable. Au jour E16,5, les

cellules myogéniques de souris de la région intercostale correspondent à des myotubes avant

maturation. Dans ces myotubes, la protéine CBFβ est détectée en abondance dans tout le

cytoplasme et de manière intéressante, les auteurs détectent la protéine CBFβ également dans

les noyaux. Enfin, l’expression de la protéine CBFβ a été réalisée sur des coupes de myofibres

matures dont l’architecture présente des stries Z et l’alignement des myofibrilles d’actine. Le

marquage protéique de CBFβ est localisé sur les stries Z dans des coupes de muscle. Plus

précisément, les auteurs montrent par microscopie confocale que le marquage de CBFβ se

superpose à celui de l’α-actinine, une protéine de structure où sont ancrées les myofibrilles

d’actine. En résumé, l’expression de CBFβ augmente donc dans le cytoplasme des cellules

musculaires au cours du développement, et n’est détectable dans le noyau qu’au stade

myotube, mais plus après la maturation de la fibre musculaire (Chiba et al, 1997). Ceci

implique que le facteur de transcription CBF peut se former et aurait un rôle prédominant

dans les myotubes.

Le mécanisme de translocation de la protéine CBFβ dans le noyau est important à étudier car

il permet la formation du facteur de transcription dimérique CBF actif dans le noyau et la

85

stabilisation protéique de Runx1. Une étude relativement récente a montré l’importance des

filamines dans la localisation cytoplasmique de CBFβ et sa relocalisation dans le noyau

(Yoshida et al, 2005). Les filamines sont des protéines réticulant les filaments d’actine

corticale de manière orthogonale et ancrent les protéines transmembranaires au cytosquelette

d’actine. Dans mes expériences d’immunofluorescence, j’ai constaté qu’effectivement, le

marquage de CBFβ était cytoplasmique et dessinait parfaitement les moindres étirements de

la membrane cellulaire. Par ailleurs, lorsque j’ai surexprimé CBFβ dans les myoblastes C2C12,

j’ai observé une intensification de ce marquage cytoplasmique, avec un recouvrement complet

de la cellule comme si la protéine CBFβ tapissait parfaitement toute la membrane cellulaire.

Dans une étude utilisant comme modèle une lignée cellulaire n’exprimant que la filamine A

(les autres isoformes étant indétectables), la diminution artificielle de la filamine A entraîne la

relocalisation spontanée de la protéine CBFβ dans le noyau de ces cellules. Or, dans les fibres

musculaires, les trois types de filamines sont exprimées (A, B et C), dont certaines formes de

filamines sont d’ailleurs exclusivement retrouvées dans le muscle, soulignant l’importance de

ces protéines dans le muscle (Chiang et al, 2000). Les trois types de filamines (A, B et C) ont

été montrés comme interagissant avec CBFβ (Yoshida et al, 2005). In vivo, il existe deux

mécanismes pouvant reproduire la dissociation des filamines de l’actine : la fusion ou la

division cellulaire. Par exemple, au moment de la fusion de deux myoblastes (ou entre un

myoblaste compétent et le myotube en formation), l’actine forme localement des pré-

vésicules de fusion et devient localement fasciculée au lieu d’être réticulée (Kim et al, 2007),

cela implique que les filamines doivent se détacher des fibres d’actine. Si les filamines

réticulant l’actine corticale se dissocient de l’actine pour lui laisser adopter une structure en

faisceau, cela pourrait être un mécanisme pour la libération potentielle de la protéine CBFβ et

sa relocalisation au noyau. Si cette hypothèse est vraie, cela explique en partie pourquoi dans

les myotubes en formation, mais pas dans les myoblastes, ni dans les myofibres matures,

CBFβ est détecté dans le noyau dans l’étude du groupe de Satake (Chiba et al, 1997). Dans les

myotubes en cours de formation, le rôle de CBFβ transloqué au noyau reste en revanche

inexpliqué.

Dans les myoblastes en prolifération, la division cellulaire pourrait également contribuer à la

relocalisation nucléaire de CBFβ et réapprovisionner ainsi le niveau basal de CBFβ dans le

noyau des myoblastes en prolifération. Si par immmunofluorescence je n’ai pas mis en

évidence la présence de CBFβ dans le noyau des myoblastes en prolifération, j’ai pu détecter

la protéine CBFβ dans l’extrait nucléaire de myoblastes proliférants par western blot. Dans

86

mon étude, j’ai d’ailleurs immunoprécipité CBFβ avec le facteur myogénique MyoD

préférentiellement dans les myoblastes en prolifération.

Par ailleurs, la présence de Runx1 influe également sur la relocalisation de CBFβ dans le

noyau (Lu et al, 1995). De manière intéressante, une étude montre que le transcrit de Runx1

est exprimé dans les myoblastes et dans les myotubes, mais que sa détection dans les

myofibres n’est plus possible, à moins que la fibre soit dénervée (Zhu et al, 1994). En

reprenant l’ensemble des résultats apportés par cette étude (Zhu et al, 1994) et ceux de Chiba

et ses collègues (Chiba et al, 1997), il est possible d’envisager le modèle suivant : (i) au cours

du développement l’expression de CBFβ est au début faible et exclusivement cytoplasmique,

(ii) puis la protéine CBFβ est ensuite détectée dans les noyaux des myotubes au moment où

Runx1 est également exprimé, et (iii) après maturation et innervation de la myofibre, quand

Runx1 n’est plus détecté, la protéine CBFβ est à nouveau exclusivement cytoplasmique.

Après dénervation de la fibre musculaire, il serait intéressant d’étudier la localisation de CBFβ

pour vérifier si la protéine est alors à nouveau présente dans le noyau pour y retrouver son

partenaire de dimérisation Runx1 qui s’y trouve réexprimé (Zhu et al, 1994). Ce modèle

appuie à la fois la présence de CBFβ dans le noyau en présence de Runx1, mais aussi

consécutivement aux fusions permettant la croissance du myotube en formation. Il y aurait

donc au moins deux mécanismes stimulant le transfert de CBFβ dans le noyau et ces deux

mécanismes restent à valider dans les cellules musculaires.

Il y a de toute évidence un contrôle très strict de la transclocation de CBFβ dans le noyau car

malgré la surexpression très forte de la protéine dans les myoblastes C2C12, ou la lignée

cancéreuse HeLa (résultats non présentés), je n’ai pas observé d’expression plus abondante de

de CBFβ dans le noyau. Cependant, la réalité devait être autre car dans les myoblastes C2C12

surexprimant CBFβ, j’ai observé une stabilisation de la protéine Runx1 nucléaire et j’ai

obtenu un effet franc sur la différenciation des myoblastes en myotubes. Ceci montre que la

moindre variation dans la quantité de CBFβ transloqué au noyau (aussi indétectable soit-elle)

suffirait pour stabiliser Runx1 et former un dimère CBF actif capable de bouleverser

radicalement la différenciation musculaire. Pour amplifier l’effet du facteur de transcription

CBF dans le noyau et évaluer son impact sur la différenciation des myoblastes, il serait

judicieux d’établir une lignée de myoblastes surexprimant la sous-unité Runx1. Dans ce cas, je

m’attends à une relocalisation plus importante de CBFβ endogène dans le noyau des

myoblastes et à un phénotype encore plus marqué sur la différenciation musculaire.

87

II. CBFβ dans le cytoplasme : un rôle de senseur ?

La question qui vient naturellement en voyant l’abondance de la protéine CBFβ dans le

cytoplasme est « A quoi sert une telle abondance cytoplasmique de cette protéine si

uniquement une faible partie est transloquée au noyau? ». Le rôle potentiel de CBFβ dans le

cytoplasme, indépendamment de sa fonction avec Runx, a été soulevé plusieurs fois (Chiba et

al, 1997; Lu et al, 1995; Tanaka et al, 1997). D’autant que dans la fibre mature, le niveau de

CBFβ dans le cytoplasme reste élevé en comparaison avec celui de Runx1 qui est

indétectable. En effet, suite à la dénervation de la fibre musculaire, le transcrit de Runx1 est

augmenté de façon importante mais celui de CBFβ, qui était déjà abondant, augmente peu

(Zhu et al, 1994). Dans la fibre musculaire striée notamment, l’importance des protéines de

structure et la présence de CBFβ sur ces protéines de structures (stries Z, filamines) dans le

cytoplasme pourrait être en lien. Je propose notamment que CBFβ puisse jouer le rôle de

senseur au moment des fusions. Au niveau du point de fusion, le relarguage des filamines

et/ou la translocation de CBFβ dans le noyau pourrait constituer un signal pour éviter les

fusions multiples simultanées des cellules. A noter que dans la lignée de myoblastes C2C12

dans laquelle j’ai surexprimé artificiellement CBFβ, j’ai observé un nombre important de

myotubes exceptionnellement courts et souvent seulement dinucléés, soutenant l’hypothèse

que CBFβ pourrait avoir un rôle dans la régulation négative de la fusion des myoblastes. À

l’inverse, en diminuant le niveau d’expression de CBFβ par ARNi, les myotubes formés

étaient particulièrement gros et longs. La comparaison entre les myoblastes surexprimant

Runx1 et les myoblastes surexprimant CBFβ permettra de dire si c’est la formation du facteur

nucléaire CBF qui est importante dans la différenciation musculaire terminale, ou si c’est la

position de CBFβ dans le cytoplasme et son rôle potentiel de senseur qui a un rôle dominant

dans le ralentissement de la différenciation musculaire. Ou peut-être une combinaison des

deux !

III. Runx1, CBFβ et MyoD : un rôle dans la différenciation ostéoblastique !

Une question que je me suis posée au cours de mon étude est la possible reconversion des

myoblastes en cellules de type osseux sous l’influence de Runx1. La protéine Runx1 qui est

exprimée dans une grande variété de tissus et qui est impliquée dans différentes voies de

différenciation, pourrait-elle induire dans les myoblastes un phénotype autre que musculaire?

À l’origine de cette question, il y a plusieurs observations. Premièrement, la protéine Runx1

est impliquée dans le développement squelettique et est nécessaire à la différenciation

ostéogénique (Lian et al, 2003). Deuxièmement, MyoD lui-même a été montré comme étant

indispensable à la différenciation ostéogénique (Komaki et al, 2004). Enfin, une myriade de

88

publications documente la transdifférenciation des myoblastes en os. Un des facteurs de

transcription majeurs de la différenciation ostéogénique n’est autre que Runx2, un autre

membre de la famille Runx. Runx2 est un régulateur essentiel de la différenciation

ostéogénique (Ducy et al, 1997). La nécessité de Runx2 pour la formation de l’os est mise en

évidence dans les modèles de souris mutantes ou inactivées pour Runx2, qui ne développent

plus de squelette minéralisé (Choi et al, 2001; Komori et al, 1997; Otto et al, 1997). Runx2 est

une des cibles de la voie de signalisation TGFβ/BMP (Lee et al, 2000) et interagit

directement avec les médiateurs de cette voie, les facteurs SMADs (Zaidi et al, 2002).

Une des premières études mettant Runx1 en lien avec la formation du squelette, est une étude

conduite par Simeone et ses collègues (Simeone et al, 1995), dans laquelle ils montrent que

Runx1 est exprimé dans le cartilage. Dans une étude plus récente, l’expression de Runx1 a été

étudiée au cours de la formation du squelette et dans des cellules de l’os. Runx1 est détecté

dans des cellules ostéoblastiques matures qui expriment les marqueurs osseux Runx2 et

l’ostéocalcine (OCN) (Lian et al, 2003). De plus, par immunofluorescence, la protéine Runx1

a été détectée dans une lignée primaire d’ostéoblastes de rat, dans une lignée humaine

d’ostéoblastes et dans une lignée d’ostéoprogéniteurs murins (Lian et al, 2003). Par RT-PCR,

l’expression de Runx1 a été mesurée au cours d’une cinétique de différenciation dans une

lignée de progéniteurs mésenchymateux, montrant une augmentation du transcrit de Runx1

du stade de prolifération, jusqu’à la confluence, au moment où la phosphatase alcaline (ALP,

un marqueur précoce de la différenciation ostéogénique) est activée (Lian et al, 2003). De

manière très intéressante, au cours du développement, Runx1 présente un schéma

d’expression spatial et temporel durant la formation de l’os qui est différent de celui de

Runx2. Runx1 n’est pas exprimé dans les stades tardifs de la différenciation ostéogénique,

dans les ostéocytes, alors que l’expression de Runx2 est augmentée durant la formation de

l’os et la différenciation des ostéoblastes (Banerjee et al, 2001). Ainsi, l’expression de Runx1

précède celle de Runx2 dans le tissu squelettique (Lian et al, 2003).

De manière intéressante, de nombreuses expériences ont démontré la plasticité des

myoblastes, qui sous l’influence de certains facteurs peuvent adopter un autre destin

cellulaire. Certaines études ont notamment mis en avant la capacité du facteur BMP-2 (bone

morphogenetic protein-2) à inhiber la formation de myotubes ainsi que l’expression de

troponine T et de la chaîne lourde de la myosine dans les cellules musculaires. Au contraire,

BMP-2 stimule l’expression de la protéine inhibitrice de la différenciation musculaire Id-1 et

l’expression de marqueurs ostéogéniques, comme OCN et ALP (Katagiri et al, 1994). La

protéine BMP-2 fait partie de la superfamille du TGFβ et agit en amont de Runx2. Une

89

expérience montre qu’en culture cellulaire les myoblastes C2C12 stimulés avec BMP-2 se

mettent à exprimer Runx2 qui, en interaction avec les facteurs SMAD 1 et 5 eux aussi activés

par BMP-2, va induire leur transdifférenciation ostéogénique (Nishimura et al, 2002). Une

autre étude a évalué l’effet direct de Runx2 sur la transdifférenciation ostéogénique des

myoblastes. Il a ainsi été montré que Runx2 inhibe la myogenèse de myoblastes primaires, en

inhibant l’expression de MyoD et de la myogénine dans les myoblastes, et en stimulant

l’expression des marqueurs de la différenciation ostéogénique, tels que OCN, ALP, BSP (bone

sialo protein), Osx et Dlx5 (Gersbach et al, 2004). De manière intéressante, une autre étude

montre que l’expression de MyoD est induite transitoirement après les traitements des

myoblastes C2C12 par BMP-2 (Komaki et al, 2004). Dans cette étude, les auteurs suggèrent

même que Runx2 pourrait être une cible de MyoD, puisqu’en présence de BMP-2 les

myoblastes expriment les marqueurs osseux osterix (Osx) et Runx2. Les auteurs montrent

notamment qu’en utilisant des cellules musculaires de souris inactivées pour le gène MyoD, il

n’est pas possible d’induire la différenciation ostéogénique, à moins de réintroduire MyoD

dans ces cellules (Komaki et al, 2004). Ces expériences soulignent l’importance et le rôle de

MyoD dans la conversion des myoblastes en ostéoblastes, au moins in vitro.

Très récemment, les propriétés à la fois ostéogénique et myogénique des cellules satellites et

des cellules progénitrices musculaires (MPCs) ont été caractérisées. L’étude révèle que les

MPCs coexpriment ALP, Runx2 et MyoD sans stimulations extérieures et sont capables

d’accomplir la différenciation ostéogénique terminale (Hashimoto et al, 2008). Les auteurs

montrent ainsi que les MPCs (qui correspondent à des cellules satellites activées) possèdent

simultanément des propriétés myogéniques et ostéogéniques (Hashimoto et al, 2008). Par

ailleurs, dans les expériences de dénervation de fibre musculaire in vivo, une étude a montré

que Runx1 et MyoD étaient fortement induits dès le troisième jour après la dénervation de la

fibre, mais également, l’expression de la protéine Runx2, non exprimée dans la fibre

musculaire en conditions normales, était induite dans la fibre dénervée et en régénération

(Zhu et al, 1994).

Dans mes expériences, je montre que la surexpression de CBFβ entraîne une stabilisation de

Runx1 et un ralentissement/blocage de la différenciation musculaire terminale. Il serait

intéressant de tester si en situation de crise (blocage de la différenciation musculaire

terminale), les myoblastes sont capables de s’orienter vers une autre voie de différenciation,

en l’occurrence la différenciation ostéogénique. À noter que dans plusieurs cas de maladie du

muscle squelettique, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, l’activité de

la phosphatase alcaline a été détectée spontanément dans le muscle en régénération. Ceci

90

montre l’expression in vivo et sans stimulation extérieure d’un marqueur osseux dans la fibre

musculaire en régénération.

En connaissance de ses informations-là, il serait intéressant de tester si dans les myoblastes

surexprimant CBFβ, l’augmentation de l’activité du dimère Runx1/CBFβ concomitante avec

l’expression de MyoD, pourrait induire l’expression de la protéine Runx2. Si tel est le cas, cela

pourrait suffire à induire la différenciation ostéogénique (Gersbach et al, 2004), au détriment

de la différenciation musculaire.

IV. Les variants d’épissage de Runx1 pourraient être à l’origine d’une double fonction : le contrôle de la prolifération et de la différenciation musculaire

Une des caractéristiques des gènes Runx de mammifères et de l’oursin est la génération de

variants d’épissages. À une ou deux exceptions près, l’ensemble des transcrits qui codent les

protéines Runx gardent le domaine runt intact et diffèrent principalement par leur extrémité

C-terminale. Dans l’hématopoïèse, un processus au cours duquel la fonction de Runx1 a bien

été caractérisée, un certain nombre de variants ont été caractérisés. Ces variants d’épissage

sont co-exprimés différemment en fonction du lignage cellulaire, cependant leur spécificité

n’est pas encore bien comprise. Néanmoins, certaines fonctions ont été attribuées à certains

variants de Runx1 grâce à des expériences en culture cellulaire où une isoforme peut être

surexprimée par rapport à une autre (Tanaka et al, 1995). Par exemple, une étude suggère que

l’isoforme humaine la plus courte, Runx1-P2 de 26 kDa (appelée également AML1a) et dont

l’extrémité C-terminale est presque intégralement manquante, favorise la prolifération au

détriment de la différenciation dans la lignée murine de cellules myéloïdes. De manière

intéressante, l’isoforme plus longue Runx1-P2 de 49 kDa (appelée également AML1b) a un

effet opposé en stimulant la différenciation et en bloquant la prolifération (Tanaka et al,

1995). Une autre étude plus récente s’est intéressée au rôle différentiel de AML1a et AML1b

dans les cellules de moelle osseuse. L’expression forcée de AML1 dans ces cellules augmente

leur potentiel de greffe puisque le nombre de cellules surexprimant AML1a s’amplifie

rapidement chez les receveurs. Inversement, la surexpression d’AML1b abolit complètement

la capacité de greffe de ces cellules. De plus, AML1b stimule la différenciation alors que

AML1a stimule la prolifération des progéniteurs capables de greffe lymphomyéloïde (Tsuzuki

et al, 2007). Ensemble, ces études et d’autres (Tanaka et al, 1995) suggèrent que les

différentes isoformes de Runx1 peuvent avoir des rôles opposés dans la prolifération et la

différenciation. Le niveau d’expression relatif des différentes isoformes de Runx1 pourrait

ainsi affecter le choix de la cellule dans sa décision de proliférer ou de se différencier.

91

Dans mon étude, je n’ai pas mis l’accent sur les rôles respectifs des différentes isoformes de

Runx1 au cours de la différenciation musculaire. Chez la souris, j’ai recensé quatre isoformes :

deux « longues » isoformes se situant environ à 56-58 kDa (poids moléculaire apparent sur le

gel) transcrites alternativement à partir du promoteur distal et du promoteur proximal et deux

isoformes « courtes » de 46-48 kDa, dont 64 acides aminés immédiatement positionnés en C-

terminal du domaine runt subissent un épissage alternatif. De manière intéressante, les deux

couples d’isoformes protéiques, longues et courtes, sont retrouvés avec la même intensité

d’expression dans les myoblastes en prolifération et en différenciation (résultats non

présentés). Dans mon étude, je n’ai pas étudié l’importance relative de ces isoformes sur la

différenciation musculaire en surexprimant l’une ou l’autre dans les myoblastes C2C12. En

revanche, dans mes expériences d’ARN interférence, j’ai testé un oligonucléotide ciblant

uniquement les deux isoformes longues de Runx1, mais pas les deux courtes. De manière

surprenante, alors que les ARNi visant l’ensemble des quatre isoformes donne un phénotype

stimulant la différenciation musculaire, les ARNi ciblant uniquement les isoformes longues ne

stimulent pas la différenciation. Le phénotype de ces myoblastes est un blocage de la

prolifération observé en culture cellulaire. D’ailleurs, il est fort probable que l’absence de

différenciation soit notamment dû au fait que les myoblastes n’arrivent jamais à confluence

pour entrer efficacement dans le programme de différenciation terminale et fusionner entre

eux. L’analyse du cycle cellulaire de ces mêmes myoblastes par FACS, révèle en effet que la

diminution des deux isoformes longues se traduit par une accumulation significative des

cellules en phase G1, montrant que la transition G1/S est bloquée dans ces cellules (résultats

non présentés). De ce fait, dans les myoblastes murins C2C12, les isoformes longues

stimuleraient particulièrement la prolifération cellulaire et la diminution de l’ensemble des

isoformes permettrait malgré tout aux myoblastes de continuer à proliférer jusqu’à atteindre

la confluence. Il n’est pas exclu qu’en plus de stimuler la prolifération des myoblastes, le

couple d’isoformes longues puisse également intervenir pour inhiber l’expression des

marqueurs musculaires. Pour valider cela, il serait judicieux de diminuer les deux isoformes

longues par ARNi lorsque les myoblastes sont déjà subconfluents et pratiquement sortis du

cycle cellulaire pour contrôler l’effet de la diminution de ces isoformes longues de Runx1 sur

l’expression des marqueurs musculaires. De plus, il serait intéressant d’établir des lignées de

myoblastes exprimant soit l’isoforme longue, soit l’isoforme courte de Runx1 et définir

indépendamment leur rôle sur la prolifération des myoblastes et sur leur différenciation

terminale. De même, il serait intéressant d’étudier le recrutement plus ou moins efficace de la

protéine CBFβ en fonction d’une isoforme ou d’une autre pour la formation d’un facteur de

92

transcription CBF actif. La purification et l’identification des partenaires protéiques de CBF

constitué de l’une ou l’autre des isoformes de Runx1 apporterait des informations

indispensables pour comprendre le rôle différentiel d’une isoforme par rapport à une autre.

Enfin, dans mon étude j’ai montré l’interaction de MyoD et Runx1 et il serait intéressant de

voir si une isoforme interagit préférentiellement avec MyoD et sur les gènes cibles de MyoD

dans les myoblastes en prolifération. L’objectif ici serait de discriminer le rôle de CBF

clairement associé à la prolifération des myoblastes et son rôle clairement associé à la

différenciation musculaire, s’il y a lieu.

Figure 24. Représentation des rôles possibles pour MyoD, Runx1 et CBFβ dans le muscleprésentés dans la discussion.

A) MyoD et CBF pourraient stimuler ensemble la transdifférenciation des myoblastes enostéoblastes. B) MyoD et CBF auraient une fonction antagoniste sur la proliférationcellulaire et enfin, C) CBF inhiberait l’activation des gènes spécifiques du muscle au coursde la différenciation terminale.

ostéoblaste

Myotubeprécoce

Myoblastes enprolifération

Myocytes alignés

Sortie du cycleprolifératif

Expression desgènes spécifiques

du muscle & fusion

Runx1CBFβ

MYOD

Tran

sdiff

éren

ciat

ion

osté

ogén

ique

A

B C

93

Modélisation & Conclusion

L’ensemble des résultats de mon étude confrontés à la littérature, me permet d’envisager

plusieurs rôles pour le facteur dimérique CBF. Tout d’abord, il pourrait y avoir une fonction

antagoniste entre Runx1 et MyoD au cours du cycle cellulaire. Le premier favorisant la

prolifération cellulaire, l’autre stimulant la différenciation des myoblastes. Au cours de la

différenciation musculaire terminale, Runx1 aurait également un rôle répresseur pour

l’activation des gènes cibles de MyoD, bloquant ainsi la différenciation musculaire à deux

niveau : au moment de la sortie du cycle cellulaire et pour l’expression des gènes spécifiques

du muscle. Pour affiner ce double rôle, il serait intéressant d’étudier l’expression des

différentes isoformes de Runx1 et voir si certaines isoformes régulent préférentiellement une

étape ou une autre de la différenciation musculaire terminale. Par ailleurs, Runx1 et MyoD

étant impliqués dans la différenciation ostéogénique, il serait intéressant de voir si lorsque la

différenciation musculaire est bloquée par la surexpression de la sous-unité CBFβ, Runx2

pourrait être exprimé en stimulant ainsi la différenciation ostéogénique. Ce modèle est

présenté dans la figure 24. Ce modèle fait de Runx1/CBFβ un régulateur puissant de

l’équilibre prolifération-différenciation dans le muscle et du destin cellulaire en général. Pour

tester ce modèle, les expériences proposées dans les parties « Discussion des Résultats » et

« Discussion Générale & Perspectives » devront être réalisées.

L’élucidation du rôle du facteur CBF reste un petit pas dans l’avancée des recherches qui

permettront de décrypter comment l’équilibre prolifération-différenciation est régulé dans le

muscle. En effet, les partenaires protéiques de MyoD, directs ou indirects, restent nombreux

à caractériser. Il est donc important de replacer mon projet de thèse dans le cadre d’un projet

plus général à l’initiative du Dr Slimane Ait-Si-Ali au laboratoire. Ce projet beaucoup plus

ambitieux vise à proposer un système intégré reprenant les différents éléments de la

différenciation musculaire squelettique, en incorporant les différents partenaires de MyoD et

en analysant leurs fonctions sur l’activation de l’ensemble des gènes cibles de MyoD (figure

25).

Figure 25. Diagramme du projet de recherche proposé par le Dr Slimane AIT-SI-ALI en 2005.

Résine anti-HA

Élution par compétitionavec le peptide Flag

Flag epitope HA epitope

MyoD

Analyse des partenairesprotéiques de MyoD parspectrométrie de masse

Purification TAP-TAG du complexe MyoD

Analyse des gènescibles de MyoD par

TA-cloning

Validation fonctionnelle parARN interférence dans les

myoblastes C2C12

Résine anti-Flag

Élution par compétitionavec le peptide HA

Cartographie épigénétique desgènes cibles de MyoD au cours de

la différenciation musculaire

Caractérisation du rôledes protéines

candidates dans lesmyoblastes C2C12

Validation descandidats dans la

transdifférenciationde cellules non-

musculaires

Cartographie épigénétique desgènes cibles de MyoD au cours

de la transdifférenciation decellules non-musculaires

Identification desprotéines indispensables

au remodelageépigénétique des gènes

cibles de MyoD

94

En revenant à notre objectif de départ sur l’identification et la compréhension du rôle des

partenaires de MyoD au cours de la différenciation musculaire, la poursuite de cette étude

passe par l’investigation des autres partenaires potentiels de MyoD identifiés par

spectrométrie de masse. Une autre étude de notre groupe a d’ailleurs été publiée, suite à

l’identification des trois isoformes la protéine HP1 (Heterochromatin Protein 1) du sein du

complexe MyoD et la validation de leurs rôles respectifs au cours de la différenciation

musculaire (Yahi et al, 2008). D’ailleurs, pour un certain nombre de partenaires potentiels de

MyoD, nous avons constitué une banque de ARN interférents, pour valider (ou invalider)

leur rôle dans le système musculaire.

Au cours de mes années de thèse, j’ai ainsi notamment amorcé et préparé un projet de

recherche sur l’étude du rôle du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF au

cours de la différenciation musculaire. La prochaine étape de ce projet mettra l'accent sur la

sous-unité SNF5 (en parallèle des autres sous-unités du complexe SWI/SNF), car j’ai obtenu

des résultats préliminaires intéressants au cours de la différenciation et la transdifférenciation

musculaire (ce travail sera terminé par une autre personne après mon départ du laboratoire).

Un autre volet de recherche que j’ai amorcé lors de ma thèse est la cartographie épigénétique

des gènes cibles de MyoD au cours de la différenciation et de la transdifférenciation

musculaire. Le but ici est de comprendre au niveau épigénétique la « force » de transactivation

de MyoD dans différents contextes cellulaires. Pour cela, j’ai constitué un panel de lignées

cellulaires exprimant MyoD de manière inductible. En collaboration avec le laboratoire du Dr

El-Osta (Australie), j’ai commencé à établir une cartographie épigénétique de la

transdifférenciation musculaire. À plus long terme, l’objectif est de voir si les partenaires de

MyoD validés dans le système musculaire sont également indispensables lors de la

transdifférenciation de cellules non-musculaires.

Ensemble, ces axes de recherche apportent des informations différentes mais

complémentaires qui doivent être analysées dans leur ensemble pour permettre de proposer

un système intégré reprenant l’ensemble des coactivateurs et corépresseurs de MyoD pour

réguler la transition prolifération-différenciation dans le muscle squelettique.

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ANNEXES

Annexe 1 Article de revue 1

Philipot, O*, Yahi, H*, Guasconi, V, Fritsch, L, Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle

differentiation. Expert Opin Ther Targets 2006, 10(6) : 923-34. Review. (*equal contribution)

Author Proof

Review

10.1517/14728222.10.6.xxx © 2006 Informa UK Ltd ISSN 1472-8222 1

General

Chromatin modification and muscle differentiationHakima Yahi*, Ophélie Philipot*, Valentina Guasconi, Lauriane Fritsch & Slimane Ait-Si-Ali††Institut André Lwoff, Laboratoire ‘Epigénétique et Cancer’, FRE 2944, CNRS, 7 rue Guy Moquet, 94800 Villejuif, France. *These authors contibuted equally to this manuscript.

Skeletal muscle differentiation is a multistep process, which begins with thecommitment of multi-potent mesodermal precursor cells to the muscle fate.These committed cells, the myoblasts, then differentiate and fuse into multi-nucleated myotubes. The final step of muscle differentiation is the maturationof differentiated myotubes into myofibres. Skeletal muscle developmentrequires the coordinated expression of various transcription factors like themembers of the myocyte enhancer binding-factor 2 family and the muscleregulatory factors. These transcription factors, in collaboration withchromatin-remodelling complexes, act in specific combinations and withincomplex transcriptional regulatory networks to achieve skeletal myogenesis.Additional factors involved in the epigenetic regulation of this process con-tinue to be discovered. In this review, the authors discuss the recent discoveriesin the epigenetic regulation of myogenesis. They also summarise the role ofchromatin-modifying enzymes regulating muscle gene expression. These dif-ferent factors are often involved in multiple steps of muscle differentiation andhave redundant activities. Altogether, the recent findings have allowed abetter understanding of myogenesis and have raised new hopes for thepharmacological development of new therapies aimed at muscle degenerationdiseases, such as myotonic dystrophy or Duchenne muscular dystrophy.

Keywords: chromatin remodelling, differentiation, skeletal muscle

Expert Opin. Ther. Targets (2006) 10(6):xxx-xxx

1. Introduction

Skeletal muscles derive from muscle precursor cells (MPCs) that engage in amultistep differentiation programme in which mesoderm progenitors become com-mitted to a skeletal muscle fate, then proliferate and migrate to specific locations,and finally differentiate into multinucleated myotubes to form myofibres [1].Among the different factors expressed in the embryo structures, members ofthe Wnts family and Sonic Hedgehog (Shh) factor are positive regulators of myo-genesis [2-7]. These factors induce the production of Myf5 and MyoD, the determi-nation factors of myogenesis. Many other regulatory factors involved in thesedifferent steps have been identified, including the early markers Pax3, c-Met, themembers of the MEF2 family and the muscle regulatory factors (MRFs): MyoD,myogenin, Myf5, and MRF4 (Table 1). The MEF2 and MRFs transcription factorsare the key regulators of the latest steps of myogenesis. The ectopic expression of anindividual MRF in a variety of non-muscle cells results in the activation of the skel-etal muscle differentiation programme [8,9]. These transcription factors, in collabo-ration with chromatin remodelling complexes, act in specific combinations andwithin complex transcriptional regulatory networks to achieve skeletal myogenesis.

1. Introduction

2. The specification factors of

embryonic myogenesis

3. Transcriptional regulation of

muscle differentiation

4. Chromatin remodelling

enzymes in proliferating

myoblasts

5. Chromatin remodelling

enzymes in differentiating

myotubes

6. Insights from muscle

regeneration studies

7. Pharmacological triggering of

the transcription regulators of

skeletal muscle differentiation

8. Conclusion

9. Expert opinion

Author Proof

Chromatin modification and muscle differentiation

2 Expert Opin. Ther. Targets (2006) 10(6)

2. The specification factors of embryonic myogenesis

In the embryo, a number of factors are implicated in the sur-vival, delamination and migration of the MPCs from thedermomyotome to sites of muscle formation in the body andlimbs (Figure 1). Several homeodomain transcription factors areinvolved. Thus, Pax3 and Pax7 mark cells in the dermomyo-tome and in newly forming muscle masses, such as the myo-tome in the mature somite. Pax3 is essential for the formationand migration of the MPCs. Pax3 gene acts upstream of themyogenic programme and is necessary for MyoD activation inthe absence of Myf-5 [10,11]. Most of the functions of Pax3 canbe replaced by its paralogue Pax7 [12]. Msx1 is a homeodo-main protein that can inhibit myogenesis, with an antagonisteffect of Pax3 and the MRFs. The Six family (homeobox pro-teins) are transcription factors with notably Six1 and Six4 thatare expressed in MPCs and can bind the MEF-3 elementlocated in myogenin promoter. Lbx1 is also a homeobox pro-tein necessary for a correct migration of the MPCs [13].Finally, the proto-oncogene c-met is a marker of the MPCsdelaminating and migrating from the lateral dermomyotome.The c-met gene encodes a tyrosine kinase receptor and its lig-and is the hepatocyte growth factor, also called scatter factorbecause it delineates the migratory route of MPCs. Duringmigration, the MPCs express all these specification factors,but do not yet express the determination factors, such asMyoD and Myf-5 (Figure 1).

3. Transcriptional regulation of muscle differentiation

The development of skeletal muscle is an ordered multistepprocess requiring the sequential activation of essentially twogroups of myogenic transcription factors (Figures 1 and 2,Table 1). The first group is composed of thebasic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors family. Thesecond group includes the MEF2 family of transcription factors.

3.1 The myogenic bHLH transcription factors familyThe myogenic bHLH family comprises MyoD, Myf5, myo-genin and MRF4, which belong to the Class II of the tis-sue-specific bHLH transcription factors family. Targeted genedisruption of any of the four bHLH family members, MyoD,Myf5, myogenin and Mrf4, in mice has shown that they playcentral roles in myogenesis [14-16]. Progenitor cells remainmulti-potent in the absence of these factors, they do notlocate correctly to sites of myogenesis and adopt other cellfates [17,18]. Moreover, in the absence of MyoD and Myf5,myogenin and MRF4 are not observed [19-21]. On the con-trary, it has been shown that mice lacking myogenin or MRF4still develop skeletal muscle, although double knockout micetotally lack skeletal muscle fibres and myoblasts [19-21]

(for review see [16]).Further experiments have pointed out the compensatory

roles of Myf5 and MyoD. Inactivation of Myf5 gene resultsin delayed myotome formation and aberrant migration of

Figure 1. Sequential expression of major markers of skeletal muscle differentiation and illustration of the different stages ofmyogenesis, from the somitic cells to mature myofibres. The committed cells in the somite are characterised by the expression ofPax3, which will further lead to the migration of the MPCs, along with c-Met. The expression of MyoD and Myf5 in the MPCs leads totheir determination into proliferating myoblasts. The concomitant expression of MyoD, Myf5, Mfr4 and the MEF2 factors, will inducethese myoblasts to exit from the cell cycle and to enter terminal differentiation. Late-stage markers of differentiation, such as MCK andMHC, are expressed in the multinucleated myotubes. The latter finally fuse to form mature and functional myofibres.MCK: Muscle creatine kinase; MEF: Myocyte enhancer factor; MHC: Myosin heavy chain; MPC: Muscle precursor cell; MRF: Muscle regulator factory; MyoD: Myogenicdetermination.

Maturation

Committed myoblasts at the site of muscle formation

Myotubes, at site of muscle formation. Permanent cell cycle exit

Mature myofibers

Uncommittedcells of the

somite

DifferentiationDetermination

Terminally differentiatedProliferative

Specification

Muscle cell precursors

Pax3, Pax7Wnt, ShhSix1, Six4c-met, lbx1, msx1

Myf5, MyoD, MRF4MEF2

MyoD, MRF4,Myogenin

MCK, MHCTroponin1AchRMEF2

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muscle precursors into the adjacent tissues, dermis andsclerotome, where they acquire non-muscle fates [22]. Thisearly defect in myogenesis is, however, compensated by thelater expression of MyoD, leading to essentially normalmuscles at birth. Similarly, disruption of the MyoD gene,which is normally expressed two days after Myf5, does notalter muscle formation. Indeed, homozygous MyoD-/- miceare normal, fertile and do not show abnormal skeletal mus-cles [23]. To understand this compensatory role, analysis ofthe mRNA of newborn mice shows an increased level ofMyf5 expression, both in homozygous and heterozygousMyoD+/- mice. This suggests that Myf5 replaces MyoD inthese mice and, thus, there is functional overlap betweenthese two genes.

MyoD positively auto-regulates its own expression, andactivates that of myogenin (Figure 2). Myogenin is expressedin nonproliferating myoblasts as they enter the differentiationpathway. Myogenin seems to be implicated in later steps ofmuscle cell differentiation and triggers differentiation with

activation of muscle specific genes, such as muscle creatinekinase (MCK) and myosin heavy chain (MHC).

Both MyoD and myogenin are expressed during skeletalmuscle differentiation and it is likely that, together, they reg-ulate the late expression of MRF4, which contributes tofibres’ maturation and to the maintenance of their differen-tiated state (Figure 2). But Mrf4 is not only playing a role inthe late stages of muscle differentiation. Indeed, it wasrecently shown that Mrf4 is expressed in MPCs, such asMyoD and Myf5 [11,24,25]. Actually, Myf5 and MRF4 actupstream of MyoD to direct embryonic multi-potent cellsinto the myogenic lineage. Moreover, Myf5/MyoD doublenull mice are able to form skeletal muscles if Mrf4 expres-sion is not compromised [11]. Thus, MRF4 has roles in bothmuscle determination and differentiation.

3.2 Molecular mechanismsThe bHLH transcription factors have a basic region and ahelix-loop-helix domain. These muscle-specific transcriptionfactors can either homodimerise, or heterodimerise with class IbHLH transcription factors, which are quasi-ubiquitous Eproteins (such as HEB/HTF4, E2-2/ITF-2 and E12/E47). TheMRFs act on muscle-specific promoters where they can interactwith each other and with other transcription factors, such asMEF2. In addition, they interact with chromatin-modifyingproteins, such as histone deacetylases (HDACs), histone acetyl-transferases (HATs) and members of the SWI/SNFATP-dependent chromatin remodelling complex (Figure 3).

Each of the MRF members has been shown to heterodimer-ise in vitro, and in vivo with quasi-ubiquitous E proteins thatare the alternatively spliced products of the E2A gene: E12 andE47 [26-28]. Basically, dimers formed from bHLH proteins dif-fer in their abilities to bind to DNA. For example, MyoD-E47heterodimer forms efficiently and binds strongly to DNA,whereas MyoD homodimers only poorly bind DNA. These

Table 1. The different maturation stages and genes/proteins potentially involved at each stage of skeletal muscle formation.

Myogenic stage Associated genetic factors

Delamination Pax3, c-Met

Migration c-Met/HGF, Lbx1, Msx1

Proliferation Pax, c-Met, Mox3, Six, (Myf5, MyoD)

Determination MRFs: Myf5, MyoD, MRF4

Differentiation MRFs (MyoD, myogenin, MRF4)MEF2 (MEF2 A, B, C, D)

HGF: Hepatocyte growth factor; MEF: Myocyte enhancer factor; MRF: Muscle regulatory factor; Myf: Myogenic factor; MyoD: Myogenic determination.

Figure 2. The MRFs functional network during muscle differentiation. MyoD, Myf5 and MRF4 are necessary for the commitmentof the somitic cells to the myogenic lineage. They are also called the myogenic determination factors. Myf5 is a positive regulator ofMyoD expression and has a direct or indirect role in myogenin gene activation. Myogenin, in turn, stimulates MyoD expression, and bothMyoD and myogenin are necessary for the late expression of MRF4 in terminal differentiation. Finally, MRF4, MyoD and myogeninpromote the expression of late stage markers such as muscle creatine kinase and myosin heavy chain.MCK: Muscle creatine kinase; MEF: Myocyte enhancer factor; MHC: Myosin heavy chain; MRF: Muscle regulatory factor; MyoD: Myogenic determination.

Externalsignals

MRF4

Growth factors

MyoD

Myf5

Determination Differentiation

MRF4MyogeninMuscle-specific

genes (MCK, MHC…)

Maturation

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Figure 3. Role of chromatin remodelling proteins at muscle specific loci in proliferating and in differentiating myoblasts.A. In proliferating myoblasts HDAC1 interacts with, and deacetylates, MyoD. MEF2 binds HDAC5 and this interaction leads to thedeacetylated state of histones H3 and H4. HDACs at muscle-specific loci lead to the recruitment of the HMTs and the subsequentmethylation of H3K9 is recognised by heterochromatin protein 1 to silence efficiently muscle-specific genes in proliferating myoblasts.B. Rb competes with MyoD for HDAC1 to silence proliferation genes, which liberates MyoD from HDAC1. The calcium-dependant kinasephosphorylates HDAC5 on two serine residues, which leads to its exclusion to the cytoplasm by the protein chaperone 14-3-3.C. The HATs then bind to MEF2 and MyoD on the promoter of muscle-specific genes, and acetylate histone H3, H4 and MyoD itself.CARM1 methylates histones on arginine residues and contributes to the transcriptionally active state of muscle specific genes indifferentiating myoblasts.CamK: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase; CARM: Coactivator-associated arginine methyltransferase; HAT: Histone acetyltransferase; HDAC: Histone deacetylase; HMT: Histone methyltranferase; HP; Heterochromatin protein; MEF: Myocyte enhancer factor; MyoD: Myogenic determination; PCAF: p300/CBP-associated factor; Rb: Retinoblastoma protein.

A. Chromatin structure non-permissive to transcription

MyoD

HMTs HDAC1

MeH3K9

MeH3K27

HP1

HP1

Mef2

HDAC5

HP1MeH3K9

MyoD

HMTsHDAC1

MeH3K9

MeH3K27

HP1

HP1

Mef2

HDAC5

HP1MeH3K9

Rb

HATs

CamK

P-Ser

P-Ser

C. Chromatin structure permissive to transcription

CARM1

Bas altransc riptional

mac hineryMyoD

Ac H3 Ac H4

p300 /PCAF

Ac-LysAc-Lys

Ac-Lys

E47Mef2

SWI /SNF

Me-Arg

Chromatin remodellingAcetylation of MyoD and histones

B. Intermediate state of chromatin remodelling

MyoD

HMTs HDAC1

HP1

HP1

MEF2

HDAC5

HP1

MyoD

HMTsHDAC1

HP1

HP1

MEF2

HDAC5

HP1

Rb

HATs

CamK

CARM1

Basaltranscriptional

machineryMyoD

p300 /PCAF

E47MEF2

SWI /SNF

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heterodimers bind to the consensus sequence CANNTG, theso-called E-boxes (reviewed in [29,30]). The E-boxes are locatedin the regulatory regions of muscle-specific genes, such asMCK, Desmin and Tropinin I [31,32]. E-boxes occur frequentlyon the genome and not only in the regulatory region of musclegenes. Thus, intermolecular interactions appear to be necessaryfor MyoD to activate muscle gene transcription. Binding sitesfor factors such as MEF2 can functionally substitute for thesecond E-box, indicating that the cooperative interactionswith adjacent factors are crucial for establishing a stable andfunctional transcriptional complex [33].

3.3 MyoD, the major playerMyoD is considered as the major player in triggering muscleterminal differentiation, even if Myf5 has a redundant rolein muscle development and adult myogenesis [34]. The abil-ity of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal musclestrongly indicates that it might have a central role in myo-genesis [35,36]. These findings provided the first direct evi-dence that a single gene can initiate a complex programmeof differentiation, acting as a ‘master switch’ as named byS Tapscott [37]. The role of MyoD in the cell-cycle arrest andin triggering muscle differentiation will be discussed below,as well as the repressive complexes that inhibit MyoD activ-ity. Indeed, the myogenic activity of the bHLHs and MEF2factors is both positively and negatively regulated by differ-ent chromatin remodelling enzymes [38] and ATP-dependentchromatin remodelling complexes, which play a pivotal rolein transcriptional regulation. For example, both families ofproteins associate with HATs and HDACs, which act in anopposing manner to control the acetylation state onnucleosomal histones (and of the proteins themselves), inproliferating and differentiating myoblasts.

3.4 The myocyte enhancer binding factor 2 familyThe MEF-2 family is part of the MADS-box-containing pro-teins (MCM1, agamous, deficiens, serum response factor). Invertebrates, the four genes of the MEF-2 family are Mef2: A, B,C and D [39], and their alternative splicing gives rise to theMEF2 proteins. These transcription factors bind to A/T-richsequences found at a number of muscle-specific promoters [39].

MEF2 proteins contain the highly conserved MADS, andthe adjacent MEF2 domains, involved in DNA binding anddimerisation [40]. MEF2 factors can directly interact with, andhelp, MyoD to bind to E boxes (recognised by the bHLH fac-tors). Indeed, in many muscle-specific genes, the MEF2 bind-ing sites and E boxes are juxtaposed [41]. Moreover, activationof muscle gene expression by myogenic bHLH proteinsdepends on their association with members of the MEF2family [15], as documented by experiments of loss-of-functionon Mef2 that inhibited differentiation [42,43].

The four Mef2 genes’ expression profile corresponds to thatof myogenin, suggesting that MEF2 proteins are implicated inthe final steps of muscle differentiation [44]. The Mef2c gene isthe first member of the MEF2 factors to be expressed at the

onset of differentiation of skeletal muscle lineage in vivo,followed by the expression of the other Mef2 genes, and itsexpression is maintained throughout skeletal muscle develop-ment. It has been shown that Mef2c is a direct transcriptionaltarget for MEF2 and myogenic bHLH proteins [45].

4. Chromatin remodelling enzymes in proliferating myoblasts

It is interesting to take a glance at MyoD expression through-out the cell cycle, because MyoD is expressed in proliferatingmyoblasts without triggering muscle differentiation. MyoDlevels increase during G1 phase until a restriction point whereMyoD becomes phosphorylated on serine 200 and is thenubiquitinylated to be finally degraded. After the S phase,MyoD levels start increasing again, but at the onset of mitosisMyoD is phosphorylated on serines 5 and 200 bycyclin/CDK1 complexes and is further ubiquitinylated thendegraded [46-49]. In proliferating myoblasts, MyoD actuallyrepresses its target genes. Indeed, class I and II HDACs areexpressed in proliferating myoblasts, providing a potentialexplanation for the inability of MyoD, and MEF2, to activatetheir target genes prior to differentiation. There would be atleast 17 HDACs, which are organised in three classes: I, IIand III. Class I HDACs are expressed ubiquitously, whereasclass II HDACs are highly enriched in heart, skeletal muscleand brain. Thus, in proliferating myoblasts, MyoD is associ-ated with class I HDACs through its bHLH region [38,50,51]

(Figure 3A). This interaction represses the transcriptional activ-ity of MyoD, in part, by deacetylating MyoD itself [51], and bydeacetylating histones on its target gene promoters [50-52]. Thedimerisation of MyoD with its co-activators E12 and E47 isalso prevented as they are heterodimerised with antimyogenicId protein [53]. Furthermore, the activity of MEF2 proteins isrepressed by association with class II HDACs (HDAC4 andHDAC5), resulting in histone deacetylation on, andtranscriptional repression of, muscle genes [54].

Finally, the class III histone deacetylase Sir2, aNAD+-dependent deacetylase, inhibits myogenesis by form-ing a complex with the HAT p300/CBP-associated factor(PCAF) and MyoD and, when overexpressed, retards muscledifferentiation. Conversely, cells with decreased Sir2 differ-entiate prematurely [52].

Moreover, the recruitment of the HDAC complexes todeacetylate histones on the muscle promoters before differen-tiation contributes to H3K9 methylation by histone methyl-transferases (HMTs) on these same promoters. H3K9surrounding a MEF2 binding site in the inactive myogeninpromoter is, indeed, highly methylated in proliferating myob-lasts, but becomes acetylated during muscle differentiation,when the myogenin gene is activated [55]. Methylated H3K9 isa repressive epigenetic mark, which is recognised by hetero-chromatin protein HP1, and thus contributes to form aheterochromatic structure that represses transcription in astable way (Figure 3A). The authors’ results demonstrate that

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MyoD protein interacts also with HP1 in myoblasts(unpublished observation).

Other repressive HMTs negatively regulate muscle differen-tiation. Notably, Ezh2, which is a polycomb protein with aHMT activity specific for histone H3K27, is recruited specifi-cally on muscle specific genes in proliferating myoblasts [56].Ezh2 is found in a protein complex containing HDAC1(Figure 3A). Indeed, muscle gene promoters were found to behypermethylated on H3K27 and thus silenced. Triggering ofdifferentiation and muscle gene activation is coupled with theloss of this repressor complex from these loci. H3K27becomes hypomethylated and the transcriptional activatorsMyoD and MEF2 are recruited, allowing the transcription oftheir target genes. Downregulation of Ezh2 coincided withactivation of muscle gene expression and its hyperexpressioninhibited muscle differentiation. These findings suggest theexistence of a two-step activation mechanism, wherebyremoval of Ezh2-mediated H3K27 methylation, followed bythe recruitment of positive transcriptional regulators at dis-crete genomic loci, are required to promote muscle geneexpression and cell differentiation. The Ezh2 complex mightnot regulate the expression of every muscle-specific gene.Indeed, myogenin expression is not influenced by Ezh2 [56].

5. Chromatin remodelling enzymes in differentiating myotubes

During the early process of skeletal muscle differentiation,myogenic factors regulate the transition from the proliferativeto a differentiating stage. Myoblasts must irreversibly exit thecell cycle prior to the activation of muscle-specific gene.Studies have revealed that MyoD contributes to both of theseevents (reviewed in [57]). These two functions of MyoD arecontrolled by distinct mechanisms: indeed, MyoD basic regionmutants are unable to activate differentiation, but can stillinduce cell-cycle arrest [58]. The key step to growth arrestinvolves the downregulation of cell cycle activators such as cyc-lins (except cyclin D3) and cyclin-dependent kinases (CDKs),and upregulation of cell-cycle inhibitors such as retinoblastomaprotein Rb, p21, p27 and p57. Cyclin D3, together with Rband the CDK inhibitor protein p21, are critical cell-cycle regu-lators for MyoD-mediated growth arrest [59,60]. These genesshare the properties of being non-muscle-specific genes alreadyexpressed in proliferating myoblasts, but have their expressionlevel raised by MyoD at the onset of differentiation [60]. In dif-ferentiating myoblasts, MyoD associates to CREB (c-AMPresponsive element binding protein) and activates the Rb pro-moter in cooperation with the HATs p300 and PCAF [61].Hypophosphorylated Rb promotes cell cycle arrest and theexpression of late-stage muscle-specific genes, and also preventsapoptosis during myoblast differentiation [62,63]. On the otherhand, a functional link between MyoD, HDAC1 and Rb pro-tein, has been provided by Puri et al. [64] (Figure 3B). Indeed,Rb has been shown to positively regulate muscle differentiationby competing with MyoD for binding to HDAC1. During

muscle differentiation, HDAC1 is released from MyoD andassociates with hypophosphorylated (active) Rb. Rb-HDAC1complex appear to stimulate differentiation by repressing E2Ftarget genes, which are responsible of the G1/S transition [65].Moreover, H3K9 methylation mediated by Suv39h is neces-sary for the silencing of E2F target genes. This H3K9 methyla-tion of the E2F target genes is a prerequisite for the inductionof terminal muscle differentiation [66]. Suv39h is indeedrequired for the silencing of proliferation genes and for theactivation of the programme of muscle differentiation, andthus it plays a major role in the control of the balance betweenproliferation and differentiation.

Skeletal muscle terminal differentiation is initiated byMyoD, which binds directly to the regulatory regions of genesexpressed during skeletal muscle differentiation and initiateschromatin remodelling at specific promoters, such as myogenin,MCK and the MyoD gene itself. To this end, MyoD interactswith an adjacent protein complex containing the homeodo-main protein Pbx1, which appears to be constitutively bound atthe muscle gene promoters [67]. Pbx1 binds constitutively to thepromoter in a SWI/SNF-independent manner, suggesting atwo-step mechanism in which MyoD initially interacts indi-rectly with the myogenin promoter and attracts chroma-tin-remodelling enzymes [68], which then facilitate directbinding by MyoD and other regulatory proteins such as HATs.The HATs/MyoD complex has two distinct HAT activities,p300/CBP and PCAF [38,69-72], which are necessary for thefull transcriptional activity of MyoD on chromatin-associatedtemplates [70,73]. First, MyoD would recruit p300/CBP to thepromoter, allowing p300/CBP to acetylate histones H3and H4. p300/CBP would then recruit PCAF (thep300/CBP-associated factor), which acetylates three lysine resi-dues within MyoD, thereby facilitating the transactivationprocess of muscle differentiation (Figure 3B and C) [73,74].

The authors also previously showed how class II HDACs (4,5, 6 and 7) negatively regulate muscle differentiation throughassociation with members of the MEF2 family [38,75]. To initi-ate muscle differentiation, CamK, a calcium-dependant kinaseunder the control of the insulin growth factor (IGF-1), triggersthe phosphorylation of two serine residues on HDAC5,resulting in its dissociation from MEF2 Figure 3B. Then, phos-phorylated HDAC5 associates with the 14-3-3 chaperone,which activates a nuclear export sequence in HDAC5 andleads to its exportation from the nucleus. The followingrecruitment of p300/PCAF and other co-activators with HATactivity to MEF2 allows muscle-specific transcription andmyotube formation [72,76].

In addition to the HATs, the SWI/SNF ATP-dependentchromatin remodelling complex and the histone argininemethyltransferase, co-activator-associated arginine methyltrans-ferase 1 (CARM1), have emerged as positive key regulators ofskeletal myogenesis [55,77]. MyoD recruits the SWI/SNFATP-dependent chromatin-remodelling complex through aninteraction that can be regulated by the p38MAPK Figure 3C [77,78]. At myogenic loci, the p38 kinase

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phosphorylates the SWI/SNF subunit BAF60 [78]. Moreover,the forced activation of the p38 pathway promotes SWI/SNFrecruitment, facilitates MyoD and MEF2 binding, leads to therecruitment of RNA polymerase II and anticipates expression oflate muscle markers at early stages of differentiation [79]. Inhibi-tion of SWI/SNF activity, as well as inhibition of HAT activity,prevents the ability of MyoD to initiate transcription andchromatin remodelling at specific loci [69,77,80]. Recent resultssuggest that functional SWI/SNF complexes are required forMyoD to activate muscle-specific gene transcription, but not toactivate negative cell-cycle regulators [77].

Recent reports showed that histone arginine methylationalso plays an important role in the positive regulation of mus-cle gene expression. CARM1, which methylates arginines, is apositive regulator of skeletal myogenesis via direct interactionswith MEF2C Figure 3B [77]. Indeed, CARM1, which is amember of the protein arginine–N-methyltransferase family(PRMT) has been shown to interact with MEF2 on theendogenous MCK promoter in a differentiation-dependentmanner. Furthermore, the inhibition of CARM1 expressioninhibits differentiation and abrogates key transcription factorsof the differentiation cascade (myogenin and MEF2). Therecruitment of CARM1 during MEF2-dependent activationof MCK expression and its function as a MEF2 co-factor sug-gest that histone arginine methylation (such as that of histoneH3), and non-histone targets, potentiates the process ofterminal muscle differentiation.

6. Insights from muscle regeneration studies

Studies of muscle regeneration from satellite cells havebrought more information on the different partners involvedin muscle differentiation. In response to injury, quiescent sat-ellite cells, located between the basal lamina and the maturedifferentiated muscle fibres, are activated and start proliferat-ing to form myoblasts [81]. These myoblasts divide a limitednumber of times before terminally differentiating and fusingto form multinucleated myotubes [82,83]. The myogenic line-age progression of satellite cells and their myoblastic progenyis regulated by various transcription factors, including thepaired-box transcription factors Pax3 and Pax7 and theMRFs Myf5, MyoD and myogenin [84]. Satellite cells activa-tion from quiescence is initially characterised by upregulationof MyoD and Myf5 expression, which precedes mitotic activ-ity and is maintained in proliferating satellite cell-derivedmyoblasts. Myogenin is also upregulated following the sameprogression as in embryonic myogenesis [85]. Most of the acti-vated cells commit to differentiation; however, a minoritydownregulates MyoD, while keeping a robust expression ofPax7, and stops DNA synthesis, thus adopting a phenotypethat resembles that of quiescent satellite cells again. Thismaintenance of satellite-cell populations seems to be a uni-versal mechanism [84]. Finally, it has been shown that MyoDacetylation is important during muscle regeneration in vivo andin embryonic stem cells [86]. Thus, one could speculate that a

defect in HAT enzymes responsible for MyoD acetylationcould have dramatic effects on muscle regeneration.

7. Pharmacological triggering of the transcription regulators of skeletal muscle differentiation

The detailed understanding of the intermolecular interactionsand the gene programmes the myogenic factors control isessential to the rational design of therapeutics. Indeed, aber-rant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation,could be associated with muscle disorders such as congenitalmyasthenias, myotonic dystrophy (DM), rhabdomyosarcomaand defects in muscle regeneration. As such, these proteinscould provide an enormous pool of target molecules where onemight intervene in muscle disorders, both with regard tomechanisms that cause disease and regenerative mechanismsthat can ameliorate disease processes. Because transcriptionfactors often interact with each other as a means of both posi-tive and negative regulation of effector genes, such interven-tion comes with particular peril, as the results ofpharmacological manipulation are likely to be highly pleio-tropic. Nevertheless, the manipulation of transcriptional sig-nals holds the promise of treating muscle diseases by exploitingthe ability of muscle cells to regenerate after injury, and thesefactors provide keys to unlock the incredible developmentalpotential of muscle cells to repair their own damage [87].

The essential role of the MRFs in muscle development hasbeen proven by gene disruption experiments in mice. Micelacking MyoD, although overtly normal, also have defects inmuscle regeneration [88,89]. The stimulation of regeneration isa function of MyoD that is likely to be important inneuromuscular diseases. For example, the mdx mouse modelof Duchenne muscular dystrophy has more severe pathologyin the absence of MyoD [88].

MyoD has also been implicated in myotonic dystrophy [90].DM is caused by two similar, non-coding, repeat expansionmutations (DM1 and DM2). These are thought to producepathogenic RNA molecules that accumulate in nuclear foci.DM1 is a CTG expansion in the 3′UTR (untranslated regionof dystrophia myotonica protein kinase [DMPK] RNA).Introduction of a mutant DMPK 3′UTR into culturedmuscle cells disrupts muscle differentiation by lowering theexpression of MyoD [90,91], although the mechanism for thiseffect is unclear.

Chromatin-remodelling factors also influence muscle differ-entiation, hypertrophy and fibre-type determination, signallingmechanisms that impinge on these transcriptional complexes,and how these multicomponent regulatory cascades may beexploited in the development of novel therapies to more effec-tively treat myopathies in humans. Indeed, as mentioned previ-ously, several HDACs have been shown to regulate MEF2- andMyoD-activated transcription. HDACs 4, 5 and 7, all of whichare class II HDACs, can associate with each of the fourvertebrate MEF2 proteins and affect their function [38].

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Chromatin modification and muscle differentiation

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The ability of HATs and HDACs to physically interactwith MRFs and MEFs confounds the design of pharmaco-logical agents aimed at these molecules, as perturbation ofHATs and HDACs could affect loci beyond those involved ingene regulation in muscle. However, the fact that there aredrugs that inhibit HDAC activity might well provide novelopportunities to stimulate myogenic gene programs. In arecent and exciting demonstration of this idea, exposure ofmouse embryos in utero to non-teratogenic doses of HDACinhibitors (trichostatin A or valproic acid) increased thenumber of somites in mice [92].

Chromatin remodelling was also implicated in the controlof cardiac hypertrophy (reviewed in [93]), which is often asso-ciated with increased risk of mortality, and the molecularmechanisms of cardiomyocyte hypertrophy could have a sig-nificant impact on human health. Thus, it seems likely thatp300/CBP positively regulate cardiac hypertrophy. Thishypothesis should be easily testable with specific inhibitors ofp300/CBP, such as Lys-CoA and dominant-negative mutantsof the HAT, as shown by Gusterson et al. [94].

On another hand, Olson’s group results suggest key rolesfor class II HDACs as negative regulators of cardiac hypertro-phy [55], found that diverse hypertropic signals stimulate theactivity of a cardiac HDAC kinase(s) that phosphorylates the14-3-3 binding sites in HDAC4, -5, -7 and -9, and thatsignal-resistant mutants of these HDACs containing alaninesin place of the target serine residues are potent repressors ofhypertrophy. These results strongly suggest that class IIHDACs function as signal-responsive repressors of cardiachypertrophy and heart failure, presumably through theircapacity to inhibit MEF2 target genes.

8. Conclusion

More is now understood about how chromatin remodellingenzymes regulate myogenesis at the molecular level. However,much remains to be done to fully evaluate the involvement ofthese enzymes in muscle disease initiation and progression. Itwill be of great interest to determine their target genes in thecontext of muscular homeostasis. On the basis of this infor-mation, it should be possible to develop novel drugs andspecific treatment strategies having fewer side effects than iscurrently the case.

9. Expert opinion

All of the myogenic transcription factors represent potentialtargets where pharmacological intervention could have adramatic impact on disease processes. Agents affectingcalcium signalling, protein phosphorylation and proteinmethylation could also be exploited and are another class oftarget molecules for the design of therapies.

Chromatin-modifying enzymes play critical roles in thecontrol of muscle gene regulatory programs. A major chal-lenge for the future is to understand how these enzymes arecoopted by signalling cascades to allow for rapid and precisechanges in gene expression in response to physiological andpathological cues. Elucidation of these molecular mechanismswill undoubtedly reveal novel targets that are amenable topharmacological manipulation in the treatment ofmuscle-related diseases in humans.

In addition to traditional pharmacological approaches,techniques such as gene therapy and RNA interference [95] areimportant for manipulating this biologically important classof molecules in muscle cells. Indeed, small interfering RNAs(siRNA) could be inoculated into humans, in order to knockdown the expression of a harmful gene. RNA interferencegene-silencing mechanism is induced by smalldouble-stranded RNA and is highly sequence specific. It is anextremely powerful tool for silencing gene expression in vitro,and might be used as therapy in human muscle pathologies tospecifically target a pathological version of a given RNA. Itcould for example suitable for use to knock down the patho-genic DMPK RNA in myotonic dystrophy. Indeed, the use oflentivirus-delivered short hairpin RNAs (shRNAs) seem todownregulate the endogenous nuclear retained mutantDMPK mRNAs in cultured cells [96].

The emerging role of small non-coding RNAs in many cellprocesses, including muscle differentiation, will be of greattherapeutical interest. Some of these microRNAs, such asmiR181, are directly involved in muscle differentiation [97]. Itwas, for example, recently demonstrated that a mutation inthe 3′UTR of myostatin RNA creates a binding site for twomicroRNAs expressed in muscle cells causing a translationinhibition of the myostatin gene and then contributing tomuscle hypertrophy [98]. Non-coding RNAs are linked tochromatin remodelling and gene silencing, at least in someorganisms such as plants and fission yeast [99]. It will be ofgreat interest to further investigate the link between thenon-coding RNAs and chromatin remodelling in mammals.Deciphering such a link might help in a better understandingof chromatin remodelling in muscle physiopathology and thedesign of new therapies targeting non-coding RNAs.

Acknowledgements

The authors’ laboratory is supported by the AssociationFrançaise contre les Myopathies (AFM), the LigueNationale contre le Cancer (LNCC), the Association pourla Recherche sur le Cancer (ARC), the FondationBettencourt-Schueller, and the European grantLSHG-CT-2004-502950. H Yahi and V Guasconi wererecipients of fellowships from the Ligue Nationale contre leCancer, and OP from Ministère de la Recherche.

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Yahi, Philipot, Guasconi, Fritsch & Ait-Si-Ali

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AffiliationHakima Yahi, Ophélie Philipot, Valentina Guasconi, Lauriane Fritsch & Slimane Ait-Si-Ali††Author for correspondenceInstitut André Lwoff, Laboratoire ‘Epigénétique et Cancer’, FRE 2944, CNRS, 7 rue Guy Moquet, 94800 Villejuif, FranceTel: +33 1 4958 3384; Fax: +33 1 4958 3307;E-mail: aitsiali@vjf.cnrs.fr

Annexe 2 Article 2

Robin P, Fritsch L, Philipot O, Svinarchuk F, Ait-Si-Ali S. Post-translational modifications

of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.

Genome Biology 2007, 8(12):R270.

Genome Biology 2007, 8:R270

Open Access!""#Robinet al./olume 2, Issue 6!, 7rticle R!#"MethodPost-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a:hilippe Robin=, Lauriane Fritsch=, @phélie :hilipot=, Fedor SvinarchuEF and Slimane 7it-Si-7li=

7ddresses: =Centre National de la Recherche ScientifiLue (CNRS) FRE !PQQ, Institut 7ndré LRoff, rue GuT UoLuet, /illejuif F-PQ2"6, FranceW Xniversité :aris-Sud, /illejuif F-PQ2"6, France. FCentre National de la Recherche ScientifiLue (CNRS) FRE Y"62, GENET[@N, bis rue de l'Internationale, EvrT F-P6""!, FranceW Xniversité d'EvrT, EvrT F-P6""!, France.

Correspondence: Slimane 7it-Si-7li. Email: aitsiali]vjf.cnrs.fr

© 2008 Robin et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.[istone modifications associated Rith [UTs^p_Uass spectrometrT analTsis of the post-transcriptional modifications of histones [Y and [Q that Rere co-purified Rith histone meth-Tltransferases SuvYPh6 and GPa shoRs that, in [eLa cells, histone methTltransferases can be phTsicallT associated Rith acetTlated histones, Rhich normallT marE transcriptionallT active chromatin.^`p_

Abstract

Specific combinations of post-translational modifications of histones alter chromatin structure,facilitating gene transcription or silencing. Here we have investigated the 'histone code' associatedwith the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a by combining double immunopurification andmass spectrometry. Our results confirm the previously reported histone modifications associatedwith Suv39h1 and G9a. Moreover, this method allowed us to demonstrate for the first time anassociation of acetylated histones with the repressor proteins Suv39h1 and G9a.

BackgroundThe amino-terminal tails of nucleosomal histones protrudefrom the aN7 and are subject to covalent modifications.These modifications include lTsine acetTlation, lTsine andarginine methTlation, serine and threonine phosphorTlation,7a:-ribosTlation, and ubiLuitination c6d. [istone lTsinemethTlation can have different effects depending on the resi-due that is modified: methTlation of histone [Y at LTsQ([YeQ) is associated Rith gene activation, Rhereas methTla-tion of [YeP, [Ye!#, and [Qe!" generallT correlates Rithtranscriptional repression c!-Qd. The roles of [YeYf and[Ye#P methTlation remain elusiveW indeed, these modifica-tions are associated Rith both transcriptional activation andrepression cg,fd.

LTsine residues can be mono-, di-, or trimethTlated, inducingdifferent biological responses cY,#,2d. Thus, for example,highlT condensed heterochromatic regions shoR a highdegree of trimethTlated [YeP ([YePmeY), Rhereas euchro-

matic regions are preferentiallT enriched in mono- anddimethTlated [YeP c!,Yd. [istone lTsine methTlation ismediated bT histone methTltransferases ([UTs), manT ofRhich contain a conserved SET cSu(var)Y-P, Enhancer-of-zeste, Trithoraxd domain, such as SuvYPh6 (Suppressor ofvariegation YPh6) and GPa c6,!,Pd. SuvYPh6 belongs to a fam-ilT of peri-centromeric proteins and is responsible for [YePtrimethTlation c6"-6Yd. GPa (Eu[UTase-!) is the majormethTlase responsible for mono- and dimethTlation of [YePin euchromatic regions c6Q,6gd, but it maT also be present inheterochomatic regions c6fd.

Covalent modifications of histones can regulate gene expres-sion directlT or through recruitment of non-histone effectorproteins c!,6#d. These effector proteins bind modified chro-matin using a varietT of chromatin-binding domains. Forexample, bromodomains recognize acetTlated lTsines,Rhereas chromo, UBT, Tudor, kQ" domains and :[a fin-gers, recognize methTlated lTsines c6#,62d. Repressive

Published: 20 December 2007

Biology 2007, 8:R270 (doi:10.1186/gb-2007-8-12-r270)

Received: 2 October 2007Revised: 6 December 2007Accepted: 20 December 2007

The electronic version of this article is the complete one and can be found online at http://genomebiology.com/2007/8/12/R270

Biology 2007, 8:R270

http://genomebiology.com/2007/8/12/R270 Biology 2007, Volume 8, Issue 12, Article R270 Robin et al. R270.2

methTl-lTsine modifications are recognized bT chromodo-main-containing proteins such as [:6 and :olTcomb (:cG),Rhich bind methTlated [YeP and [Ye!#, respectivelT, andcontribute to creation of heterochromatin-liEe structuresc6Pd. Thus, [YeP methTlation has been linEed to both aN7methTlation c!",!6d and l-chromosome inactivation c!!d.

aifferent modifications of histone amino-terminal tails con-stitute the so-called 'histone code' c!Yd. Indeed, specific com-binations of histone modifications can alter chromatinstructure to alloR transcription or to repress it, either revers-iblT or stablT c6d. Chromatin modifications confer a uniLueidentitT on the nucleosomes involved. The composite patternof modifications regulates the binding and activities of otherchromatin-associated components. Indeed, modifications ofhistones at a specific nucleosome verT liEelT influence subse-Luent modifications, regulated bT both !"# and %&'(# mecha-nisms. Characterizing such modifications could provideinsight into the roles of chromatin-binding proteins

In this studT, Re Rere interested in the 'histone code' associ-ated Rith the [UTs SuvYPh6 and GPa, as these tRo [UTsgenerallT localize to tRo distinct regions in the nucleus. Stud-Ting modifications of the histones associated Rith these[UTs could help in understanding the "( )")* state of consti-tutive heterochromatin associated Rith SuvYPh6, and that ofthe silent euchromatin and facultative heterochromatin asso-ciated Rith GPa.

@ur approach Ras to identifT post-translational modifica-tions on histones co-purified Rith tagged SuvYPh6 and GPa[UTs. ke performed a double immunopurification of theseproteins from chromatin preparations enriched in mono-nucleosomes. ke then studied histone modifications bT apropionTlation-based modification method, folloRed bT massspectrometrT analTsis c!Q-!#d.

ke used four cell sTstems in this studT: normal liver cells,[eLa cells, [eLa cells expressing a tagged form of SuvYPh6,and [eLa cells expressing a tagged form of GPa. ke began bTcomparing the global epigenetic modifications of crude nucle-osomal histones isolated from these cell lines. ke observed adecrease of the three repressive trimethTlation marEs ([YeP,[Ye!# and [Qe!") in cancerous [eLa cells compared Rithnormal liver cells. [eLa cells expressing tagged SuvYPh6 havea higher [YePmeY content than the parent [eLa cells,Rhereas [eLa cells expressing tagged GPa shoR a higher levelof [YePme and non-modified [YeP. ke also identified aneR epigenetic modification, the monomethTlation of LTs#Pon histone [Q. @ur results help define the histone code asso-ciated Rith SuvYPh6 and GPa. [istone [Y associated RithSuvYPh6 is heavilT trimethTlated at LTsP, Rhereas [Ye!# and[Qe!" are mainlT dimethTlated. In addition, SuvYPh6 isassociated Rith methTlation at [Ye62, [Ye#P and [Qe#P.[istone [Y associated Rith GPa is mainlT mono- or dimeth-Tlated at LTsP, as expected. InterestinglT, Re find SuvYPh6

and GPa to be associated Rith substantial acetTlation of[Qe6f, [Ye62 and [Ye!Y.

TaEen together, our results confirm some histone modifica-tions previouslT found to be associated Rith SuvYPh6 andGPa, and shoR, for the first time, an unexpected associationbetReen these repressor proteins and histone acetTlation,Rhich normallT activates transcription.

ResultsDetermination of global histone modificationske first compared the basal modifications present on thecrude nucleosomal histones in the different cell lines used:the cancerous [eLa cell line, and the [eLa cell lines stablTexpressing the [YeP-specific trimethTlase SuvYPh6 ([eLa-SuvYPh6) or dimethTlase GPa ([eLa-GPa).

[eLa-SuvYPh6 and [eLa-GPa cell lines give a different bacE-ground pattern of [YeP, [Ye!" and [Ye!# methTlationstates. Indeed, our results shoR an approximatelT Q"mincrease in [YePmeY in [eLa-SuvYPh6 cells compared to[eLa cells (Figure 6b), Rhereas levels of this modification aresimilar in [eLa and [eLa-GPa cells (Figure 6b). In [eLa-SuvYPh6 cells, [Qe!"meY and [Ye!#meY are present atsimilar levels to those found in [eLa cells (Figure 6b). khenRe compare [eLa-SuvYPh6 to [eLa cells, the increase in[Ye!#me! is similar to the decrease in [Ye!#me, bT approx-imatelT 6"-6gm (Figure 6b), Rhereas [Ye!#meY increasesslightlT in [eLa-GPa cells (Figure 6b). SurprisinglT, in [eLacells expressing the [YeP dimethTlase GPa, the [YePme andnon-modified [YeP ([YePnm) forms increase significantlT,Rhereas [YePme! decreases bT !6m relative to [eLa cells(Figure 6b). GenerallT, methTlation at [Ye!# and [Qe!"occurs to the same extent in [eLa and in [eLa-GPa cells (Fig-ure 6b). UethTlation on [YeYf occurs at comparable levels in[eLa cells and in [eLa-SuvYPh6 cells, Rhereas [eLa-GPacells shoR a slight increase (6gm) in non-modified [YeYf(Figure 6b). In [eLa-GPa cells, [YeYfme! decreases bTroughlT 62m compared Rith [eLa cells (Figure 6b).

For the amino-terminal histone [Q peptide Q-GegGGe2GLGe6!GG7e6fR-6# ('peptide Q-6#'), the predomi-nant form detected in the three cell lines Ras a non-modifiedone corresponding to an ion of 6,gg" m`z (Figure 6c). Themost abundant single modification of this peptide isacetTlated [Qe6f ([Qe6fac), detected as an ion of 6,gYf m`z, Rhich appears at a level of 6Qm in [eLa cells, 6gm in [eLa-SuvYPh6, and fm in [eLa-GPa cells (Figure 6c). [Qe6fac isfound mostlT alone, but can be found in combination Rith[Qe2ac or Rith [Qe6!ac (data not shoRn). 7 triacetTlatedform of this peptide Ras also found, representing less than 6mof the total (data not shoRn). The second most abundantmodification of peptide Q-6# is [Qe6!ac, Rhich is foundeither as a single modification or in combination Rith[Qe2ac or [Qe6fac (Figure 6c, panacetTl). Considering the

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2007, 8:R270

Comparison of histone H3 and H4 modifications in different cell typesFigure 1Comparison of histone H3 and H4 modifications in different cell types. (a) Purification of crude nucleosomal histones. Nucleosomal histones were separated on a 4-12% gradient NuPAGE gel and run in MES buffer (Invitrogen), fixed, and stained with Seeblue (Invitrogen). Lane 1, SeeBlue pre-stained molecular weight markers (Invitrogen); lane 2, nucleosomal histones from normal mouse liver; lane 3, nucleosomal histones from HeLa cells, purified on a POROS HQ column. (b) Methylation states of H3K9, H3K27, H3K36, and H4K20. nm, non-modified; me, monomethyl; me2, dimethyl; me3, trimethyl. Shown are the means of four independent experiments. (c) Basal amino-terminal modifications of histone 4 in the indicated cell types. 'H4 4-17nm': unmodified H4 peptide containing amino acids 4-17. Shown are the means of four independent experiments (± standard deviation). Pan-ac: panacetylated.

(a)

1 2

Macro-H2A1.1

H1, H5

HP1

H3, H2BH2A

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

(c)

HeLaLiver

H4

3MW

(KDa)

39

28

1914

Histone H4

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

nm me me2 me3

H3K36 H4K20

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

H3K9

Perc

ent r

elat

ive

abun

danc

e H3K27

(b)

10

20

30

40

50

60

70

10

20

30

40

50

60

70

80

90

nm me me2 me3

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

10

20

30

40

50

60

70

80

nm me me2 me3

10

20

30

40

50

60

70

80

90

nm me me2 me3

HeLa-G9a

H4K16ac H4K12ac H4 4-17pan-ac

H4 4-17nm

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Liver HeLa Hela-Suv39h1

HeLa-G9aLiver HeLa Hela-Suv39h1

2007, 8:R270

http://genomebiology.com/2007/8/12/R270 2007, Volume 8, Issue 12, Article R270 Robin R270.4

total monoacetTlated plus panacetTlated peptide, [Qe6!acoccurs in gm of the peptide Q-6# in [eLa cells, 6"m in [ela-SuvYPh6, and less than 6m in [eLa-GPa cells. ke cannotexplain the much loRer level observed in [eLa-GPa cells.

FinallT, Re found a neR modification on histone [Q: [Qe#PmonomethTlation (see 7dditional data file !). Indeed,approximatelT !"m of [Qe#P is methTlated in [eLa, [eLa-SuvYPh6, [eLa-GPa, and normal liver cells. ke confirmedthis methTlation bT analTzing trTpsin-digested histone [QRithout anT additional treatment. Xsing this method, this iongives a poor signal, and it is detected at a level of !m of thepartiallT digested e#P-RP! peptide. This ten-fold decrease ismostlT due to the poor signal, but this ion gives a robust andcomplete T-series and a poor b-series in the collision frag-mentation result. This modification has never been describedin mammals but Ras suggested in +,-#'&./ c!2d. ke alsodetected an acetTlated form of this amino acid at a level of fmin the bacEground cell lines.

To further validate our method, Re compared the global his-tone modifications in normal liver cells and in the cancerous[eLa cells. This approach has been validated in previousstudies of histone modifications in cancer cells c!Pd. @urresults shoR a dramatic difference in the usage of the histone[Y variant [Y.Y, Rhich, surprisinglT, is present in f"m of thenucleosomes of normal mouse liver and in onlT !-Ym ofnucleosomes in [eLa cell lines (data not shoRn). Theamounts of the histone [!7 variant macro-[!7 seem com-parable in normal liver cells and [eLa cells (Figure 6a).

ke then extensivelT studied the three lTsine methTlationmodifications associated Rith heterochromatin - [YePme,[Qe!"me and [Ye!#me - as Rell as the [YeYfme modifica-tion. ke observed a decrease of 6"-!"m for the repressive tri-methTlation of [YeP, [Ye!# and [Qe!" in [eLa cellscompared to normal liver cells (Figure 6b). 7 similar resulthas alreadT been reported for [Qe!" c!Pd. ConverselT, the di-and trimethTlated lTsine [YeYf, Rhich are mainlT associatedRith transcriptional activation, shoR an increase in [eLacells (Figure 6b), Rhereas the non-modified [YeYf decreasessignificantlT in [eLa cells compared to normal liver cells(Figure 6b).

For the amino-terminal histone [Q peptide Q-6#, Re alsodetected three different ions. The non-modified form is thepredominant species in both normal liver and in [eLa cells(Figure 6c). 7 single acetTlation at [Qe6f ([Qe6fac)accounts for !Ym of the peptide Q-6# in liver and 6Qm in [eLacells (Figure 6c). This [Qe6fac modification can be found incombination Rith [Qe2ac or Rith [Qe6!ac in another #m ofthe peptide Q-6# species in mouse liver cells (data not shoRn).Considering the total monoacetTlated plus panacetTlatedpeptides, [Qe6!ac occurs 6"m of the time in normal liver butonlT gm in [eLa cells (Figure 6c and data not shoRn).

In summarT, the protocol Re used to studT modifications ofcrude histone preparations, especiallT those of histones [Yand [Q, gave satisfactorT and informative results. Conse-LuentlT, Re used this protocol to studT the histone code asso-ciated Rith the [UTs SuvYPh6 and GPa.

Determination of the epigenetic modifications on histones H3 and H4 associated with HMTs Suv39h1 and G9a in HeLa cellsThe main goal of our studT Ras to identifT the histone modi-fications associated Rith the [YeP-specific [UTs SuvYPh6and GPa, especiallT on histones [Y and [Q. To this end, Reperformed double-affinitT purification of [7-Flag-SuvYPh6and [7-Flag-GPa complexes from chromatin enriched inmononucleosomes (Figure !a and 7dditional data file 6). TheSuvYPh6-associated complex is visualized in Figure !b, lane !.ke observe good stoichiometrT of the SuvYPh6-associatedproteins stronglT bound to chromatin, such as members ofthe [:6 protein familT, histones [6-[g, and macro-[!7(Figure !b). The double immunopurification has been per-formed on chromatin extracts from the [eLa control cell linetransduced bT the emptT vector to measure the bacEgroundsignal. The results do not give anT Luantifiable signal, espe-ciallT at the histone molecular Reight (data not shoRn).

[YePmeY and [Qe!"me! associate Rith SuvYPh6 at levels of26m and f2m, respectivelT (Figure !c). These percentages areapproximatelT Q"m loRer in [eLa-SuvYPh6 cells (compareFigures 6b and !b, or see 7dditional data file Y). :osition[Ye!# is dimethTlated ([Ye!#me!) 2"m of the time inSuvYPh6 complexes versus fgm in [eLa-SuvYPh6 cells (com-pare Figures 6b and !b, or see 7dditional data file Y). FinallT,SuvYPh6 is mainlT associated Rith non-modified and dimeth-Tlated forms of [YeYf (Figure !c).

In the protein complex associated Rith the [UT GPa,[YePme and [YePme! both occur Q"m of the time (Figure6b), compared Rith !6m and g!m in [eLa-GPa cells, respec-tivelT (Figure !c). Thus, there is a significant enrichment of[YePnm and [YePme in the GPa complex. ke did not suc-ceed in detecting [YePmeY on GPa-associated histone [Y,Rhereas this modification is detected approximatelT 6Ym ofthe time in [eLa-GPa cells (Figures 6b and !b and see 7ddi-tional data file Y). GPa protein is associated Rith the mono-methTlated form of [Qe!", Rith 66m enrichment comparedto the [eLa-GPa cell line. Indeed, GPa is found to be associ-ated Rith [Qe!"me and [Qe!"me! Y#m of the time (Figure!c). For [Ye!# and [YeYf, the GPa complex gives the samedistribution as its bacEground cell line. Indeed, GPa is associ-ated Rith [Ye!#me !"m of the time and Rith [Ye!#me!fQm of the time. 7t position [YeYf, GPa is found Rith theunmodified, mono-, or dimethTlated forms (Figure !c).

In conclusion, a comparison of histone modifications associ-ated Rith SuvYPh6 or GPa shoRs that SuvYPh6 is associatedRith [YePmeY, Rhereas GPa is associated Rith [YePme and

http://genomebiology.com/2007/8/12/R270 2007, Volume 8, Issue 12, Article R270 Robin R270.5

2007, 8:R270

[YePme!. This result is expected: SuvYPh6 is a EnoRn tri-methTlase, and GPa a EnoRn dimethTlase, of position [YeP.SurprisinglT, SuvYPh6 is not associated Rith [Qe!"meY.

ke have also studied [Y modifications at the folloRing posi-tions: [Ye62, Rhich can be either acetTlated or monomethTl-ated, though Re have also occasionallT detected adimethTlated form (7dditional data file Q)W [Ye!Y, Rhich canonlT be acetTlatedW and [Ye#P, Rhich can be monomethTl-ated. SurprisinglT, Re found [Ye62ac associated Rith bothSuvYPh6 and GPa complexes Pm of the time (7dditional datafile g). ke also detected the monomethTlated form of [Ye62in SuvYPh6 complexes 2m of the time, constituting an 2menrichment, as this modification is barelT detectable in [eLa-SuvYPh6 cells. The monomethTlated form of [Ye62 has beendescribed previouslT c!#d. 7cetTlation of [Ye!Y is present gmof the time in SuvYPh6 and 2m in GPa complexes (7dditionaldata file g). UethTlation of [Ye#P has also been studied andRas detected in association Rith SuvYPh6 about 6gm of thetime, but is not detected Rith GPa.

Concerning histone [Q, Re did not find the panacetTlatedform of the [Q peptide Q-6# in either SuvYPh6 or GPa com-plexes. [oRever, Re found [Qe6fac associated Rith SuvYPh6complexes 6#m of the time and Rith GPa complexes !!m ofthe time (Figure !d). 7n acetTl group and a trimethTl grouphave comparable masses, so to confirm the [Qe6fac modifi-cation, Re performed a U7LaI-T@F analTsis on the samesample that Re used for ion trapping, Rith internal scalingusing histone peptides of non-ambiguous mass (7dditionaldata file f). ke found the m`z ratio for the ion to be6,gYf.f6f". This is in agreement Rith the theoretical mass ofan acetTl group and four propionTl groups on peptide Q-6#.Thus, the signal detected on [Qe6f corresponds most proba-blT to an acetTl group.

DiscussionUanT reports to date have analTzed histone modifications bTdifferent approaches. 7lthough these studies have improvedour understanding of the role of histone modifications inbiological pathRaTs, to our EnoRledge feR studies have

Figure 2

(b)

MW

(K

Da)

Suv

39h1

com

plex

1 2

Macro-H2A1.1H1, H5

HP1H3, H2BH2A

taggedSuv39h1

64

51

39

28

1914

H4

Histone H4

(d)

H4K16ac H4 4-17pan-ac

H4 4-17nm

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

Suv39h1 complex G9a complex

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

Per

cent

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ativ

e ab

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nce

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

Per

cent

rel

ativ

e ab

unda

nce

H3K36 H4K20

H3K9 H3K27

nm me me2 me3

102030405060708090

100

102030405060708090

100

102030405060708090

100

102030405060708090

100

nm me me2 me3

nm me me2 me3 nm me me2 me3

Suv39h1 complex G9a complex

HMTHMT

T

Chromatin extracts preparation (MNase)

HMTTHMT

Crude histones preparation:HMT-histones complex purifcation:

Purification on Flag resin

Purification on HA resin

SDS-PAGE resolution,mass spec analysis of histone modifcations

POROS anion exchangecolumn

Elution with a salt gradient

(a)

20

40

60

80

100

HMTTHMT HMTT

HMTTHMT

Elution against Flag peptide

Elution against HA peptide

Chromatin

(c)

Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the chromatin-binding proteins Suv39h1 and G9aFigure 2Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the chromatin-binding proteins Suv39h1 and G9a. (a) Schematic representation of the purification protocols used to purify the HMT-histone complexes and crude histones. (b) Doubly immunopurified Suv39h1 complexes from chromatin extracts of 20 g of HeLa-Suv39h1 cells were resolved on a 4-12% gradient NuPAGE gel, run in MES buffer (Invitrogen), fixed, and stained with Colloidal blue. Lane 1, SeeBlue pre-stained molecular weight markers (Invitrogen); lane 2, Suv39h1 complex from chromatin fractions. (c) Amino-terminal lysine methylation of histones H3 and H4 associated with Suv39h1 or G9a proteins. (d) Post-translational modifications of histone H4 associated with Suv39h1 or G9a. Shown are the means of three independent experiments (± standard deviation).

2007, 8:R270

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sought to provide a sTstematic analTsis of the histone modifi-cations associated Rith a given chromatin-binding proteincY"d. In this studT, Re attempted to investigate modificationsof the histones [Y and [Q associated Rith the [YeP-specific[UTs SuvYPh6 and GPa.

Basal modifications of histones H3 and H4 in normal versus cancer cellsTo validate our method, Re first studied the basal histonemodifications in the different cell lines used in this studT.[eLa cells stablT expressing tagged [YeP tri-methTlaseSuvYPh6 shoR an increase in [YePmeY compared to [eLacells, Rhereas [YePme and [YePme! decrease significantlT.This result is in agreement Rith a previous RorE using#.)01,-`- cells in Rhich the level of [YePmeY Ras found todecrease, [YePme! Ras unaffected and [YePme increasedc!Qd. Furthermore, a studT in 2&*#*3,"4' shoRed that a5.)01,6 hTperactive mutant displaTed an increase in [YePdi- and trimethTlation cY6d. In [eLa cells expressing taggedGPa, Rhich is preferentiallT a dimethTlase of [YeP, [YePmeand [YePnm increase significantlT compared to [eLa cells,Rhereas [YePme! decreases. This last result Ras totallTunexpected, but as GPa cooperates Rith the other Eu[UTase,GL: (Eu[UTase 6), it maT be necessarT to co-express the tRoproteins to see an increase in [YePme!. TaEen together,these results suggest that SuvYPh6, Rhen over-expressed, canconvert a mono- or a dimethTlated [YeP to a trimethTlatedstate, Rhereas GPa can monomethTlate [YeP.

[Qe!"meY and [Ye!#meY do not seem to change in [eLa-SuvYPh6 compared to [eLa cells. 7nd, generallT, [Ye!# and[Qe!" methTl modifications are present to the same extentin [eLa and in [eLa-GPa cells.

ke found that three of the repressive methTlation modifica-tions ([YePme, [Ye!#me, and [Qe!"me) Rere underrepre-sented in [eLa cells and derivative lines compared to normalliver cells, Rhereas the activating modification [YeYfme Rasoverrepresented compared to normal liver cells. The decreasein repressive methTlation is reminiscent of general aN7methTlation in tumor cells cY!d. Tumor suppressor gene pro-moters are found to be heavilT methTlated in tumors cYY,YQd,and indeed there is cross-talE betReen [YeP methTlation andaN7 methTlation in manT species c!6,Yg,Yfd. In the case oftumor suppressor genes, it has been shoRn that theT are alsosilenced bT methTlation on [YeP, [Ye!# and [Qe!"cYY,Y#d, Rith or Rithout concomitant aN7 methTlation of thepromoter. ConverselT, one might thinE that oncogenes intumor cells could be methTlated on [YeYf and hTpo-methTl-ated on [YeP and [Ye!#. It Rill be interesting to testRhether the methTlation pattern of aN7 and the methTlationof [YeP and [Ye!# overlap 'geographicallT' in tumor cells.

FinallT, Re report here a neR modification of histone [Q, themonomethTlation of [Qe#P, Rhich is found at a level of !"min normal liver cells, as Rell as in [ela cells.

Post-translational modifications of Suv39h1- and G9a-associated histones H3 and H4ke have studied post-translational modifications of chroma-tin-bound histones associated Rith the [UTs SuvYPh6 andGPa, Rhich overlap onlT partiallT in their nuclear distribu-tion. Indeed, SuvYPh6 is mainlT located in the pericentric andconstitutive heterochromatin, Rhereas GPa Ras firstdescribed as a euchromatic protein, and later Ras shoRn tohave a broader distribution in the nucleus c6fd. The distribu-tion of both proteins is associated Rith specific methTlationstates of LTsP on histone [Y. khen associated Rith SuvYPh6in constitutive heterochromatin, [YeP is mainlT trimethTl-ated but also dimethTlatedW Rhen associated Rith GPa ineuchromatin and facultative heterochromatin, it is eithernon-modified, mono-, or dimethTlated. ke found SuvYPh6 tobe associated mainlT Rith dimethTlation at [Qe!", but GPaRas associated eLuallT freLuentlT Rith mono- or dimethTla-tion at this position. Both SuvYPh6 and GPa are associatedmainlT Rith the dimethTlated form of [Ye!#.

Thus, SuvYPh6 is mainlT associated Rith [YePmeY,[Ye!#me!, and [Qe!"me!. These three modifications areEnoRn to act in concert to create a heterochromatin structure.7t least in embrTonic stem cells, SuvYPh6 has been suggestedto maintain [YeP trimethTlation, [Ye!# monomethTlationand [Qe!" trimethTlation at pericentromeric heterochroma-tin c!Q,Y2d. The apparent discrepancT betReen those resultsand ours could be explained bT differences betReen embrT-onic stem cells and [eLa cells. @ur RorEing model suggeststhat there is a direct or indirect interaction betReen SuvYPh6and the [UTs responsible for [Qe!" and [Ye!# methTla-tion, namelT SuvQ-!"h and the :olTcomb protein Ezh!,respectivelT. Indeed, a phTsical association betReen SuvYPh6and :cG proteins has been reported cYPd.

It has been suggested that [YeP trimethTlation constitutesthe first event leading toRard [Qe!" trimethTlation cY2d.[:6 proteins, Rhich recognize [YePmeY created bT SuvYPh6,recruit SuvQ-!"h, the enzTme that normallT establishes[Qe!"meY. @ur results suggest that SuvYPh6 is preferen-tiallT associated Rith [Qe!"me!, but not [Qe!"meY. Thisassociation might correspond to an intermediate state of[Qe!" methTlation. 7nother possibilitT is that heterochro-matin modification is not homogenousW for example, someSuvYPh6-bound nucleosomes maT be dimethTlated on[Qe!", Rhile adjacent nucleosomes are trimethTlated on[Qe!".

ke have found a significant enrichment of [Ye62ac and[Ye!Yac in SuvYPh6-chromatin complexes. [Ye!Y islocated Rithin the epitope of histone [Y that is recognized bTthe chromodomain of :olTcomb proteins c6Pd. Therefore,[Ye!Y acetTlation could regulate this recognition bT prevent-ing the formation of the :olTcomb complex. Indeed, distinctlocalizations betReen [YePmeY, Rhich is associated Rith

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SuvYPh6, and [Ye!#meY, Rhich is recognized bT :olTcombcomplex, have been deduced from ChI:-chip analTsis cQ"d.

In addition, Re have observed an acetTlated form of LTs6f ofhistone [Q associated Rith both SuvYPh6 and GPa. It is Luitesurprising to have [Qe6fac associated Rith the transcriptionrepressors SuvYPh6 and GPa, since this modification ismainlT associated Rith transcriptional activation. Even so, itis unclear Rhether [Qe6fac alRaTs causes activation, since itis associated Rith constitutive heterochromatin in manT spe-cies cQ6,Q!d, and another acetTlation marE, [Qe6!ac, isinvolved in the establishment of heterochromatin in 2&*7#*3,"4' cQYd. Furthermore, it is EnoRn that GPa can be a coac-tivator cQQd.

It maT be that acetTlation at [Qe6f is involved in recruitingSuvYPh6 and GPa, but also other proteins, to the histone tails.For example, the chromatin remodeling complex kIN7C hasbeen described to bind [Ye6Qac via kSTF to induce repres-sion of a target gene cQgd, and [Qe6f could plaT a similar rolein the nucleosomal context. In addition, binding of the NoRCcomplex to [Qe6fac is reLuired for the subseLuent deacetTla-tion of [Qeg, [Qe2, and [Qe6! during the NoRC-dependentestablishment of heterochromatin cQfd. FinallT, [Qe6facetTlation varies in a cell cTcle-dependent manner and isassociated Rith replication cQ#-QPd. SuvYPh6 and GPa are alsolinEed to aN7 replication cg"d. 7s [Qe6f is the first lTsine tobe acetTlated after replication cQPd, SuvYPh6 and GPa couldassociate Rith this form in a replication-dependent manner.

ke have found a neR histone [Q modification: monomethTl-ation of [Qe#P. [Qe#Pme is detected in SuvYPh6 and GPacomplexes. This modification has never been described inmammals but Ras suggested in +,-#'&./ c!2d. Uutation of[Qe#P in 5'!!,'&*/-!8# !8&8)"#"'8 affects both telomericand raN7 silencing cg6d. In fact, [Qe#P is part of the Lrs(Loss of ribosomal silencing) nucleosomal domain cg!d, sug-gesting that [Qe#P methTlation is associated Rith genesilencing. Indeed, [Qe#P is located close to [Ye#P in thenucleosome structure and contacts the aN7 surface cg6,gYd,suggesting that its charge is important for silencing raN7genes cg6,gYd. FinallT, Re found [Ye#Pme associated RithSuvYPh6, but not Rith GPa. This modification preferentiallTlabels constitutive heterochromatin and perhaps more specif-icallT telomeres.

ConclusionIn conclusion, Re can combine double immunopurificationand mass spectrometrT to uncover novel associations of his-tone modifications Rith specific chromatin-binding proteins.This method alloRed us to demonstrate for the first time anassociation of acetTlated histones Rith the repressor proteinsSuvYPh6 and GPa. It Rould be interesting to studT the signif-icance of such an association.

Materials and methodsPurification of Suv39h1 and G9a complexes[eLa cell lines stablT expressing SuvYPh6 and GPa Rereestablished Rith human transgenes coding for full-lengthproteins SuvYPh6 (amino acids 6-Q6!) and GPa (amino acids6-6,!66) tagged Rith double-[7 (haemagglutinin) and dou-ble-FL7G epitopes at the amino terminus. 7 [eLa control cellline transduced Rith the emptT vector has been establishedand used to control the complex purification protocols. Thesecell lines shoRed about the same proliferation rate as the par-ent [eLa cell line.

To purifT nucleosomes, Re used !" g of drT cell pellet perexperiment, Rhich corresponds roughlT to 6" billion cells.Cells Rere resuspended in a hTpotonic buffer, lTsed and dis-rupted using !" stroEes of a tight-fitting aounce homoge-nizer, and centrifuged to pellet the nuclei cgQd. SuvYPh6 andGPa complexes Rere purified as described in cggd. BrieflT,nuclei Rere resuspended and digested Rith micrococcalnuclease (Sigma, Saint-nuentin Fallavier, France) until theTconsisted primarilT of mononucleosomes (7dditional datafile 6). The complexes associated Rith nucleosomes Rere thenpurified bT immunoprecipitation using anti-FL7G antibodTimmobilized on agarose beads (Sigma). 7fter elution Rith theFL7G peptide (sTnthesized bT 7nsTnth, Roosendal, TheNetherlands), the bound complexes containing nucleosomesRere further affinitT-purified on anti-[7 antibodT-conju-gated agarose (Sigma) and eluted Rith the [7 peptide (sTn-thesized bT 7nsTnth, Roosendal, The Netherlands). Theeluted protein complexes Rere then resolved on precastNu:7GE Q-6!m bis-Tris acrTlamide gradient gel in UESbuffer (Invitrogen, CergT :ontoise, France) and stained RithColloidal blue (Invitrogen, CergT :ontoise, France). 7t thisstep, bands corresponding to histones Rere cut from the geland subjected to a propionTlation-based modificationmethod (see beloR). The other bands Rere also cut from thegel, trTpsin-digested using ".Q mg of seLuencing-gradetrTpsin (:romega, Charbonnières, France), and identified bTmass spectrometrT.

Crude histone purificationNuclei from mouse liver Rere prepared as described in cgfd.Nuclei from liver cells and nuclei obtained from different[eLa cell lines Rere Rashed, digested Rith micrococcalnuclease (Sigma) at g" units per !" g of initial tissue or cellpellet, and sonicated for Q minutes. Crude nucleosomes Rerefurther purified on a :@R@S [n!" anion exchange columnpacEed in a Q.f mm p 6"" mm :@R@S column (7pplied Bio-sTstems, Courtaboeuf, France), loaded at ".Qg U NaCl, andeluted Rith a salt gradient extending to 6.g U NaCl in g" mUTris (p[ f.g).

Nucleosomal histone preparation for mass spectrometry analysisNucleosomal histones associated Rith SuvYPh6 or GPa, andcrude histones purified from [eLa cells or from normal

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mouse liver, Rere run on a precast Nu:7GE Q-6!m bis-TrisacrTlamide gradient gel Rith UES buffer (Invitrogen, CergT:ontoise, France) and stained Rith Colloidal blue (Invitro-gen). Gel bands corresponding to each histone Rere cut anddestained overnight in g"m acetonitrile, g" mU N[Q[C@Y.[istones Rere then subjected to a propionTlation-based mod-ification method c!Q-!#d. :ropionic anhTdride maEes cova-lent bonds Rith non-modified or monomethTlated lTsinesand Rith the amino termini of proteins. Gel slices Reretreated for 6 h at Y#qC Rith 6"" !l of Y"m propionic anhTdridein methanol and Q" !l of g" mU N[Q[C@Y c!Q-!fd, folloRedbT tRo ten-minute Rashes in 6"" mU N[Q[C@Y, one Rash ing"m acetonitrile, 6"" mU N[Q[C@Y, and one Rash in ace-tonitrile. The slices Rere then dried and digested at Y#qC over-night using ".Q !g of seLuencing-grade trTpsin (:romega).The digests Rere acidified in ".gm trifluoroacetic acid, lTophi-lized, resuspended in Q" !l of g" mU N[Q[C@Y, andpropionTlated again in 6"" !l of Y"m propionic anhTdride inmethanol for 6 h at Y#qC, lTophilized and resuspended in !"!l of ".6m of formic acid. The second propionTlation modifiedthe neRlT created amino-terminal ends after trTpsin diges-tion. These conditions gave complete lTsine and amino-termi-nal propionTlation, but also chemical methTlations that canbe detected using deuterated methanol (methanol-dQ) for thepropionic anhTdride dilution (not shoRn).

Determination of histone modifications by mass spectrometryThe peptide mixtures obtained as described above Rere runon a Nano C62 :epUap 6"" pre-column (g mm, 6"" r, Y""!m I.a. p 6 mm), coupled Rith a column of #g !m I.a. p 6g cmRith the same resin (LC :acEings, aionex, /oisins le Breton-neux, France). The Nano-floR-[igh :ressure LiLuid Chroma-tographT LC (LC :acEings) is directlT coupled to anelectrospraT ionization sTstem on an ion-trap mass spectrom-eter (ESI`US-USW ThermoFinnigan LCn aeca l:). The fivemost intense ions of the mass spectrometrT scan Rere sub-jected to fragmentation (US-US) Rithout anT data-depend-ent scan. The interpretation of the mass spectrometrT dataRas performed Rith the BiokorEs softRare version Y.!(Thermo Scientific, Courtaboeuf, France), Rith the folloRingspecifications: a banE of peptides from the histones cut atarginine residues Ras indexed Rith permanent add mass forthe amino terminus and lTsine of gf."!g aa, and three poten-tial modifications - e minus 6Q."6g for acetTlation or trimeth-Tlation, es6Q."6g aa for a monomethTlation and e minus!#.PPg aa for a dimethTlation. This set-up alloRed us to auto-mate analTsis of the mass spectrometrT raR data. Each raRdataset Ras analTzed to checE for combinations of modifica-tions that might have been missed bT the automated method.ke also tooE advantage of the fact that each modificationshoRs a specific retention time on reverse phase [:LC. Ionsdi- and trimethTlated on lTsine elute before acetTlated ones,propionTlated ones elute later, and propionTlated plus mono-methTlated elute last. Just one ion did not folloR this rule,namelT, the highlT hTdrophobic peptide that bears the [Qe#P

amino acid, for Rhich the propionTlated and methTlated formelutes before the propionTlated one. Retention times Rereused to confirm that the data analTsis reconstituted the frag-mentation correctlT. [istone modifications Rere LuantifiedbT the number of ions detected bT US`US analTsis: for eachpost-translational modification, results are presented as thenumber of ions detected that bear the modification,expressed as a percentage of the total number of peptides(modified or not) recognized in the US`US analTsis. 7llmasses are expressed in centroid m`z values.

Abbreviationsac, acetTlatedW [7, haemagglutininW [eLa-GPa, [eLa cellsstablT expressing human [7-FL7G-tagged GPa proteinW[eLa-SuvYPh6, [eLa cells stablT expressing human [7-FL7G-tagged SuvYPh6 proteinW [UT, histone methTtrans-feraseW me, monomethTlatedW me!, dimethTlatedW meY, tri-methTlatedW nm, non-modifiedW SuvYPh6, suppressor ofvariegation YPh6.

Authors' contributionsR: and 7S initiated and designed this studT. R: performedcrude histone and complex purifications and did all the in-house mass spectrometrT analTsis on an ion-trap mass spec-trometer. FL performed SuvYPh6 and GPa complex purifica-tion. :@ performed cell culture and helped in complexpurification. 7S established the cell lines expressing taggedproteins and set up the complex purification protocols, Rrotethe paper, got the supporting grants and directed the researchproject. SF performed the U7LaI-T@F analTsis to confirmthe [Qe6fac modification and helped in the analTsis of USdata. 7ll the authors have participated in discussing theresults and reading the manuscript. 7ll the authors have readand approved the final manuscript.

Additional data filesThe folloRing additional data are available Rith the onlineversion of this paper. 7dditional data file 6 shoRs the size ofthe aN7 extracted from the nucleosomal preparation used topurifT the SuvYPh6 complex. 7dditional data file ! shoRs thefragmentation of the ion [Qe#Pme. 7dditional data file YshoRs selected amino-terminal lTsine methTlations of the his-tones [Y and [Q associated Rith SuvYPh6 and GPa proteinscompared to their bacEground cell lines. 7dditional data fileQ is about the fragmentation of the 6,"!# m`z ion Rith a pro-pionTl group at the amino terminus, tRo methTl groups onlTsine [Ye62, and a propionTl group on [Ye!Y. 7dditionaldata g shoRs selected histone [Y modifications in differentcell bacEgrounds and in SuvYPh6 and GPa complexes. 7ddi-tional data f shoRs the [Qe6fac fragmentation on a U7LaI-T@F.7dditional data file 6The size of the aN7 extracted from the nucleosomal preparation used to purifT the SuvYPh6 complexThe size of the aN7 extracted from the nucleosomal preparation used to purifT the SuvYPh6 complex.ClicE here for file7dditional data file !Fragmentation of the ion [Qe#PmeFragmentation of the ion [Qe#Pme.ClicE here for file7dditional data file YSelected amino-terminal lTsine methTlations of the histones [Y and [Q associated Rith SuvYPh6 and GPa proteins compared to their bacEground cell linesSelected amino-terminal lTsine methTlations of the histones [Y and [Q associated Rith SuvYPh6 and GPa proteins compared to their bacEground cell lines.ClicE here for file7dditional data file QFragmentation of the 6,"!# m`z ion Rith a propionTl group at the amino terminus, tRo methTl groups on lTsine [Ye62, and a propi-onTl group on [Ye!YFragmentation of the 6,"!# m`z ion Rith a propionTl group at the amino terminus, tRo methTl groups on lTsine [Ye62, and a propi-onTl group on [Ye!Y.ClicE here for file7dditional data file gSelected histone [Y modifications in different cell bacEgrounds and in SuvYPh6 and GPa complexesSelected histone [Y modifications in different cell bacEgrounds and in SuvYPh6 and GPa complexes.ClicE here for file7dditional data file f[Qe6fac fragmentation on a U7LaI-T@F[Qe6fac fragmentation on a U7LaI-T@F.ClicE here for file

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AcknowledgementsWe thank Drs Thomas Jenuwein, Yoichi Shinkai, Irina Stancheva, DidierTrouche, Annick Harel-Bellan, Ali Hamiche and Marie Körner for providingcrucial reagents. We thank Dr Anna Polesskaya, Mouloud Souidi, Dr KhalidOuararhni and Maxime Marouteau for sharing material and technical help.We thank Drs Linda L Pritchard, Anna Polesskaya, Valentina Guasconi andMaya Ameyar-Zazoua for critical reading of the manuscript and scientificdiscussions. This work was supported by the Association Française contreles Myopathies (AFM); the Fondation Bettencourt-Schueller; the LigueNationale contre le Cancer (LNCC); the Association pour la Recherche surle Cancer (ARC); the Ministère de la Recherche (ACI-Jeunes chercheurs,décision N° 04 3 75), the CNRS; and the Université Paris-Sud Orsay. OPwas recipient of fellowship from the Ministère de la Recherche.

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Annexe 3 Article 3

Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R,

Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and

MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 2008 Aug 29;283(35):23692-700.

Differential Cooperation between Heterochromatin ProteinHP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts*□S

Received for publication, April 4, 2008, and in revised form, June 25, 2008 Published, JBC Papers in Press, July 2, 2008, DOI 10.1074/jbc.M802647200

Hakima Yahi‡1,2, Lauriane Fritsch‡1, Ophelie Philipot‡3, Valentina Guasconi‡, Mouloud Souidi‡, Philippe Robin‡,Anna Polesskaya‡, Regine Losson§, Annick Harel-Bellan‡, and Slimane Ait-Si-Ali‡4

From the ‡Institut Andre Lwoff, CNRS, FRE 2944, 7 rue Guy Moquet, 94800 Villejuif, Universite Paris-Sud, Villejuif F-94801, Franceand the §Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, CNRS UMR 7104 and INSERM U 596,Universite Louis Pasteur, College de France, F-67404 Illkirch, France

Mechanisms of transcriptional repression are important duringcell differentiation. Mammalian heterochromatin protein 1 iso-formsHP1�, HP1�, andHP1� play important roles in the regula-tion of chromatin structure and function. We explored the possi-bility of different roles for the threeHP1 isoforms in an integratedsystem,skeletalmuscle terminaldifferentiation. In this system, ter-minal differentiation is initiated by the transcription factorMyoD,whose target genes remain mainly silent until myoblasts areinduced to differentiate. Here we show that HP1� and HP1� iso-forms, but notHP1�, interactwithMyoD inmyoblasts. This inter-action is direct, as shown using recombinant proteins in vitro. Agene reporter assay revealed that HP1� andHP1�, but not HP1�,inhibitMyoD transcriptional activity, suggesting amodel inwhichMyoD could serve as a bridge between nucleosomes and chroma-tin-binding proteins such as HDACs and HP1. Chromatin immu-noprecipitationassays showapreferential recruitmentofHP1pro-teins on MyoD target genes in proliferating myoblasts. Finally,modulationofHP1protein level impairsMyoDtarget geneexpres-sion andmuscle terminal differentiation. Together, our data showa nonconventional interaction between HP1 and a tissue-specifictranscription factor,MyoD. In addition, they strongly suggest thatHP1 isoforms play important roles during muscle terminal differ-entiation in an isoform-dependentmanner.

Mammalian heterochromatin protein 1 (HP1)5 isoformsare closely related non-histone proteins that are involved in

transcriptional regulation and chromatin organization. Inmammals, HP1 exists in three isoforms: �, �, and � (Ref. 1and references therein). Each is composed of a conserved chro-modomain that is important for heterochromatin binding and achromoshadow domain (CSD), whose structure is similar tothat of the chromodomain that is involved in dimerization andinteraction with proteins containing the consensus sequencePXVXL (2). The chromodomain and the CSD are separated bya less conserved region called the hinge region. HP1 isoformsexhibit different subnuclear localizations in interphasic nuclei:HP1� is mainly centromeric; HP1� is also centromeric but to alesser extent; and HP1� is located in both euchromatic andheterochromatic compartments (3). HP1 proteins are known tobind methylated histone H3 lysine 9 (H3K9) and heterodimer-ize, contributing to the formation and maintenance of hetero-chromatic structures (4, 5). HP1 isoforms interact with a widevariety of proteins,mainly chromatin-associated proteins (Refs.1 and 6 and references therein).HP1 proteins have been implicated in many differentiation

pathways (7–10), although their individual roles are not alwayswell understood. During terminal differentiation of cells, chro-matin undergoes dramaticmorphological changes (reviewed inRefs. 11–13), for example during muscle differentiation (14).These changes involve reorganization of constitutive hetero-chromatin (15) and selective silencing and activation of specificgroups of genes (Refs. 7, 16, and 17; reviewed in Ref. 13 andreferences therein) and implicate both differential interactionsof various proteins with chromatin and changes in the chroma-tin structure itself.Skeletal muscle terminal differentiation begins with an irre-

versible withdrawal from the cell cycle, followed by muscle-specific marker expression with fusion of myoblasts intomultinucleated myotubes (18). Cell cycle withdrawal corre-sponds to a definitive silencing of proliferation associatedgenes, such as E2F targets (Ref. 16; reviewed in Ref. 19 andreferences therein). Terminal muscle differentiation is orches-trated by the myogenic basic helix loop helix transcription fac-tors, such as MyoD, which is the master myogenic determina-tion factor. In proliferatingmyoblasts,MyoD is expressed but isunable to activate its target genes even when it binds to theirpromoters (20, 21). Therefore, the requirement forMyoD to becontinuously expressed in undifferentiated myoblasts is enig-matic. MyoD might have a repressive role at its target genesprior to initiating chromatin remodeling in differentiating cells(20, 22, 23). In proliferatingmyoblasts,MyoD is associatedwith

* This work was supported by the Association Francaise contre les Myopa-thies, the Fondation Bettencourt-Schueller, the Ligue Nationale contre leCancer, the Association pour la Recherche sur le Cancer, Ministere de laRecherche ACI-Jeunes Chercheurs Decision 04375, the CNRS, Grant LSHG-CT-2004-502950 from the European Union 6th Framework program (toA. H.-B.), and the Universite Paris-Sud Orsay. The costs of publication of thisarticle were defrayed in part by the payment of page charges. This articlemust therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

□S The on-line version of this article (available at http://www.jbc.org) containsfour supplemental figures.

We dedicate this work to the memory of Helene Richard-Foy.1 These authors contributed equally to this work.2 Recipient of a fellowship from the Ligue Nationale contre le Cancer.3 Recipient of a fellowship from the Ministere de la Recherche.4 To whom correspondence should be addressed. Tel.: 33-1-4958-3384; Fax:

33-1-4958-3307; E-mail: aitsiali@vjf.cnrs.fr.5 The abbreviations used are: HP1, heterochromatin protein 1; CSD, chro-

moshadow domain; H3K9, histone H3 lysine 9; HDAC, histone deacetylase;MCK, muscle creatine kinase; HA, hemagglutinin; GST, glutathione S-trans-ferasel; ChIP, chromatin immunoprecipitation; IP, immunoprecipitation.

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 35, pp. 23692–23700, August 29, 2008© 2008 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.

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http://www.jbc.org/cgi/content/full/M802647200/DC1Supplemental Material can be found at:

histone deacetylases (HDACs) and might actively suppressexpression of its targets by inducing a locally repressive chro-matin structure (20, 24, 25). It is known that histone deacetyla-tion contributes toH3K9methylation on these same promoters(22). It has been shown that some MyoD target promoters,including p21 and myogenin, are methylated at H3K9 specifi-cally in proliferating myoblasts (20, 22), a modification knownto be bound by HP1 proteins.Here we show that HP1 proteins associate directly with

MyoD in an isoform-dependent manner and inhibit its tran-scriptional activity. Indeed, MyoD interacts preferentially withthe isoforms HP1� and HP1�, but not HP1�. In addition, HP1proteins are recruited toMyoD target promoters preferentiallyin proliferating myoblasts. Finally, overexpression of HP1 iso-forms interferes with muscle terminal differentiation in anisoform-dependent manner. Taken together, these datastrongly suggest that, in addition to its role as an activator ofdifferentiation-specific genes,MyoD can also act as a transcrip-tional repressor in proliferating myoblasts in cooperation withspecific isoforms of HP1 protein.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Cell Culture and Transfection—C2C12, HEK 293, andHeLa cells were maintained using standard conditions.C2C12 cells were differentiated as described in Ref. 16. Thebiotin-streptavidin interaction studies were performed asdescribed in Ref. 26.Stable Cell Lines Establishment—A HeLa cell line stably

expressing MyoD was established with a transgene encodingfor full-lengthMyoD, and C2C12 cell lines expressing HP1 iso-formswere establishedwith transgenes encoding for full-lengthHP1�, HP1�, and HP1� as described in Ref. 27. The transgeneswere taggedwith double hemagglutinin (HA) and double FLAGepitopes at the N terminus as described in Ref. 27. HeLa andC2C12 control cell lines transducedwith the empty vectorwerealso established.Protein Complex Purification—MyoD complex characteriza-

tion was performed as described in Ref. 27.Protein Extraction, Coimmunoprecipitations, and Western

Blotting—The biotin-streptavidin interaction studies were per-formed as described in Ref. 26. Expression vectors for biotiny-latable proteins are kind gifts from Dr. V. Ogryzko (26).For the study of the endogenous protein interactions, nuclear

extracts were used for immunoprecipitation overnight, afterwhich the immunoprecipitates were incubated with Ultralinkimmobilized protein A/G (Pierce) for 2 h at room temperatureand washed with the dilution buffer 4–10 times.Plasmids, GST Fusions, andGST Pulldown—Expression vec-

tors derived from pGEX for GST fusions of wild type HP1�, �,�, and HP1� deletion mutants GST-HP1�(1–119), GST-HP1�(1–66), and GST-HP1�(67–119) were described in Ref.28. All of the plasmid constructs were expressed in Escherichiacoli strain BL21 and purified using glutathione-Sepharosebeads according to themanufacturer (Sigma). Purified proteinswere quantified by Coomassie staining after SDS-PAGE sepa-ration and by the Bradford protein assay. BL21 cells were alsoused for bacterial expression of untaggedMyoD as described inRef. 29.

Beads coated with equal amounts of GST fusion proteins (1�g) were incubated with 100 ng of recombinant MyoD inNTEN buffer (100 mM NaCl, 20 Mm Tris-HCl, pH 8, 0.5 mMEDTA, 0.1% Nonidet P-40) completed with protease inhibitors(Roche Applied Science) for 4 h at 30 °C. The beads were thenwashed four times with washing buffer (150 mM NaCl, 10 mMTris-HCl, pH 7.5, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsul-fonyl fluoride) and resuspended, and the proteinswere resolvedby SDS-PAGE gel for Western blot analysis.For this GST pulldown assays usingMyoD deletionmutants,

HEK 293 cells were transfected with 10 �g of expression plas-mids of taggedMyoD (wild typeMyoD) or its deletion mutants(Cter, Nter, �Cter, and �Nter), using Lipofectamine (Qiagen).48 h post-transfection, the cells were lysed in lysis buffer (300mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0,4% Nonidet P-40, 10 mMMgCl2) to extractMyoDor its deletionmutants. GST pulldownassays were then performed as described above.GeneReporterAssays—HEK293 cells at 60% confluencewere

cotransfected by calcium phosphate coprecipitation. 24 h post-transfection, the cells were lysed in a reporter lysis buffer (Pro-mega, Charbonnieres, France). Luciferase activity (Promega lucif-erase assay system)was determined and normalized to the level of�-galactosidase (Promega �-galactosidase enzyme assay system)and to the total protein amount. The plasmids used in the assaywere pEMSV-MyoD, pEMSV, pcDNA3-HP1�, pcDNA3-HP1�,pcDNA3-HP1�, pcDNA3, pMCK-Luciferase reporter gene, andpCMV-�-galactosidase.Antibodies—The C-20 anti-MyoD, M-225 anti-myogenin,

normal rabbit IgG, and normalmouse IgG antibodies were pur-chased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-HP1 antibodies (2HP2G9, 1MOD1A9AS, and 2MOD1GC)were obtained from Euromedex (Souffelweyersheim, France).Rabbit polyclonal anti-Suv39h1 (suppressor of variegation39h1) antibody (catalog number 07-550) was obtained fromUpstate Biotechnology, Inc.. Rabbit polyclonal anti-MCK anti-body was developed by Dr. H. Ito (30). The horseradish perox-idase-streptavidin conjugate (Sigma; catalog number S 2438),anti-FLAG and anti-�-tubulin antibodies were purchased fromSigma. Rat anti-HA antibody was purchased from RocheApplied Science.Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)—ChIP protocol

and primers have been described in Ref. 26.

RESULTS

HP1 Proteins Interact with MyoD—To exhaustively charac-terize MyoD protein partners, we first purified MyoD complexfrom a HeLa cell line ectopically expressing a double taggedform of MyoD. To this end, we performed double affinity puri-fication of the HA-FLAG-MyoD complex (Fig. 1A) from chro-matin enriched in mononucleosomes (as described in Ref. 27).Mass spectrometry analysis ofMyoD complex confirmed some“historical” partners of MyoD such as Id, E12/E47, and MEIS1,and other partners that have never been described to interactwithMyoD, among themHP1 proteins, as confirmed byWest-ern blotting (Fig. 1B). Thus, MyoD can coexist with HP1 pro-teins in the same complex, at least in an artificial cell system.To further characterize these interactions, we used HEK 293

human cells to express biotinylatable forms of either MyoD or

HP1 and Terminal Differentiation

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HP1 proteins �, �, or � (as described in Ref. 26). The system isbased on the coexpression of the target protein fused to a shortbiotin acceptor domain together with the biotinylating enzymeBirA from E. coli. The strength of the biotin-streptavidin inter-action allows a robust characterization of protein-proteininteractions, even in stringent conditions. Using biotinylatedHP1 proteins, detected with streptavidin-horseradish peroxi-dase (Fig. 1C, bottom panel), we could precipitate MyoD withHP1� and HP1� but not with HP1� (Fig. 1C, lanes 1–3). Thesignal is specific for HP1� and�; we did not detectMyoD in theHP1� precipitate, nor in the control cells, which do not expressany biotinylatable protein (Fig. 1C, lanes 1 and 4, respectively),nor in the cells that express biotinylated HP1 proteins but notMyoD (Fig. 1C, lanes 5–7). The level of ectopic MyoD was nor-malized byWestern blotting, and that of biotinylated HP1 pro-teins was normalized by streptavidin-horseradish peroxidase(Fig. 1C, bottom panel). The reverse experiment using biotiny-latedMyoDandFLAG-taggedHP1proteins (Fig. 1D, top panel)led to the same conclusion: a preferential interaction of MyoDwith HP1� and HP1�, but not with HP1�. The precipitation ofbiotinylated MyoD by streptavidin beads coprecipitated HP1�and HP1� but never HP1� (Fig. 1D, lanes 4–6). The coprecipi-tation of HP1� andHP1� with biotinylatedMyoDwas specific,because there was no signal in cells not transfected with the bio-tinylated MyoD expressing vector (Fig. 1D, lanes 1–3). Theabsence of an interaction betweenMyoDandHP1� is not due to alowexpressionof this isoform, because this is shown in thebottompanel of Fig. 1D (normalization of the inputs). Taken together,these results confirm, in cells, the specific interaction of MyoDwith HP1� and HP1�, but not HP1�.MyoD Interacts with HP1� and HP1�, but Not with HP1�, in

Proliferating Myoblasts—To confirm the interaction betweenMyoD and HP1 proteins in a more physiological context, weused C2C12 myoblasts. In this system, MyoD is expressed at alow level in proliferatingmyoblasts, and its expression increasesupon initiation of terminal differentiation. Immunoprecipita-tion (IP) experiments were performed using isoform-specificanti-HP1 or anti-MyoD antibodies or an anti-Suv39h1 anti-body as a positive control, because this H3K9 methylase isknown to interact with HP1. Indeed, Suv39h1 coprecipitatedthe three isoforms of HP1 as expected (Fig. 2A). EndogenousMyoD specifically coprecipitated endogenousHP1� andHP1�,but not HP1� (Fig. 2A), and the IgG control did not show anyHP1 signal (Fig. 2A). The results of the reciprocal IP confirmedthese conclusions: IP of HP1� or HP1�, but not HP1�, copre-cipitated MyoD (Fig. 2B), and the control IP did not give anydetectable signal (Fig. 2B). The absence of the interactionbetween MyoD and HP1� is not due to a low expression of thelatter, because this isoform is highly detected byWestern blot-ting. Taken together, these results show that MyoD interactspreferentially with the � and � isoforms of HP1, but not withthe � isoform, in myoblasts.

MyoD + ++ - - -

IP: bHP1IB: α-MyoD

ΙΒ: MyoD

Str-HPO

A

HP1

α

HP1

β

HP1

α

HP1

β

HP1

γ

MyoD + ++- - -

HP1

α

HP1

β

HP1

γ

HP1

α

HP1

β

HP1

γ

+

+

*

*

bMyoD

IP: bMyoDIB: Flag

ΙΒ: Flag

-

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

-HP1

γC

Flag

HP1α

Myo

D

Mo

ck

HP1β

HP1γ

MW

(KD

a)

Myo

D C

om

.

14

21

3136

55

66

97116

B

D

MyoD

FIGURE 1. Ectopically expressed MyoD interacts with endogenous HP1proteins. A, silver staining the double affinity-purified MyoD complex iso-lated from chromatin fractions in a HeLa cell line stably expressing FLAG-HAtagged MyoD. MW, protein molecular weight marker. The molecular massesof the markers are indicated. B, Western blot analysis of double purified FLAG-HA-MyoD (MyoD) or eluate from HeLa control cells (Mock). C, top panel, West-ern blotting with anti-MyoD on streptavidin-bead precipitates from HEK 293cell extracts transfected with a MyoD expression vector (lanes 1– 4) or with anempty vector (lanes 5–7), along with expression vectors for the biotinylatedforms of HP1� (bHP1�) (lanes 3 and 7), HP1� (lanes 2 and 6), HP1� (lanes 1 and5), or the empty vector (lane 4). Middle and bottom panels, quantity control ofMyoD detected with an anti-MyoD antibody (middle panel) and biotinylatedHP1 detected using streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (bottompanel) in the inputs. D, top panel, Western blotting of anti-FLAG-HP1 ofstreptavidin bead precipitates from HEK 293 cell extracts transfected with theexpression vector for FLAG-HP1� (lanes 1 and 4), FLAG-HP1� (lanes 2 and 5),HP1� (lanes 3 and 6), or with the empty vector (lane 7), along with expressionvectors for the biotinylated form of MyoD (lanes 4 –7) or the empty vector(lanes 1–3). Middle and bottom panels, quantity control of biotinylated MyoD

(bMyoD) detected using streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (mid-dle panel) and that of FLAG-HP1 protein in the inputs as detected with ananti-FLAG antibody (bottom panel). *, endogenous biotinylated proteins. IB,immunoblot.

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MyoD Interacts Directly with HP1� and HP1� in Vitro—Westudied the possible direct interaction betweenMyoD andHP1proteins. GST-HP1 fusion proteins produced in bacteria wereimmobilized on agarose-glutathione beads, and an untaggedrecombinant form ofMyoD (purification protocol described inRef. 29) was detected by Western blotting using an anti-MyoDantibody.GSTpulldown experiments showed thatMyoD inter-acts with HP1� and HP1� but not with HP1� (Fig. 3A, lanes1–3). The interaction of MyoD with HP1� and HP1� was spe-cific; we did not detect anyMyoD signal in the presence of GSTprotein alone (Fig. 3A, lane 4). The quantity of each GST-HP1protein was checked by Western blotting using an anti-GSTantibody (Fig. 3A, lower panel). The interaction ofHP1 proteinswith MyoD was specific and was not seen with myogenin,another myogenic basic helix loop helix factor (Fig. 3B). Theseresults show that, very interestingly, MyoD, but not myogenin,interacts specifically and directly with the isoforms � and � ofHP1.The Chromoshadow Domain of HP1� and the C-terminal

Domain of MyoD Are Required for Their Interaction—In anattempt to delimit the domain of HP1 responsible for interac-tion with MyoD, we used deletion mutants of HP1� fused toGST. AGST pulldown experiment was performed using bacte-rially produced MyoD as described above. GST pulldownrevealed an interaction of MyoD with the wild type HP1� asexpected (Fig. 3C, lane 1) and with a HP1� 119–189 mutant,which retains the CSD (Fig. 3C, lane 2). MyoD failed to interact

with truncated HP1� versions lacking the CSD, i.e. mutants1–119, 67–119, and 1–67 (Fig. 3C, lanes 3–5). The amounts ofthe different GST-HP1� mutants were checked by Westernblotting (Fig. 3C, bottom panel). These experiments clearlyshow that the CSD of HP1� is required for interaction withMyoD.The same experimentswere performedusing tagged deletion

mutants of MyoD ectopically expressed in HEK 293 cells. Theresults show that the C-terminal domain of MyoD is requiredfor the interaction with HP1 (Fig. 3, D and E).HP1 Represses MyoD Transcriptional Activity—To inves-

tigate the effects of HP1 proteins on MyoD transcriptionalactivity, we used a Luciferase reporter gene under the con-trol of the muscle creatine kinase (MCK) promoter, which isa direct target promoter of MyoD. Cotransfection experi-ments were performed in different nonmuscle cells lines thatdo not express MyoD endogenously. We observed that thecotransfection of either HP1�- or HP1�-expressing plasmidtogether with MyoD expression vector resulted in the inhi-bition of MCK promoter activity in a dose-dependent man-ner (Fig. 4, A and B, black bars). Interestingly, cotransfectionof a HP1� expression vector had no effect on the activity ofMyoD (Fig. 4C, black bars). The expression of transfectedMyoD was not influenced by cotransfection with HP1expression vectors as determined by Western blotting (datanot shown). The inhibitory effect of HP1� and HP1� is spe-cific and is MyoD-dependent. Indeed, it was not seen with�-galactosidase expression under a cytomegalovirus pro-moter (used as a normalization control for transfection effi-ciency) nor with a pMCK-luciferase vector in the absence ofMyoD (Fig. 4, gray bars). Thus, HP1� and HP1�, but notHP1�, directly inhibit MyoD activity.HP1 Protein Isoforms Are Preferentially Recruited toMyoD

Target Genes in ProliferatingMyoblasts—To test the recruit-ment of HP1 isoforms into MyoD target promoters, we per-formed ChIP experiments using specific antibodies to eachHP1 isoform. Our results show a preferential enrichment inall the three HP1 isoforms on both p21 andMCK promoters,which are MyoD targets activated early and late in differen-tiating cells, respectively, in proliferating myoblasts com-pared with differentiating myotubes (Fig. 5). Thus, evenHP1�, which does not interact directly with MyoD, isrecruited on MyoD target promoters, suggesting that HP1�may regulate myogenesis independently of any interactionwith MyoD (see below). These results suggest that all thethree HP1 isoforms regulate MyoD target genes in prolifer-ating myoblasts using different mechanisms. Note that HP1proteins are not found on coding regions of MyoD targetgenes (data not shown).HP1 Levels Are Crucial for Muscle Terminal Differentiation—

To test more generally the role of HP1 proteins in muscleterminal differentiation, we employed gain-of-functionstrategy. To ectopically express HP1 protein isoforms, weused a retrovirus expressing HA and FLAG-tagged isoformsof HP1 or an empty vector as a negative control to transduceC2C12 cells (see “Experimental Procedures”). Immunofluo-rescence studies using anti-HA antibody showed that theexogenous HP1 isoforms had normal subnuclear localization

IgG

Myo

D

Suv3

9h1

MyoD

IB:

Suv39h1

HP1α

IP antibody

HP1γ

HP1β

A

B

IB: MyoD

lnp

ut

IgG

IgG

IP antibodyIg

G

HP1

γ

HP1

β

HP1

α

IB: HP1γ IB: HP1β IB: HP1α1 32 4 5 6 7

GM

FIGURE 2. HP1� and HP1�, but not HP1�, coprecipitate with MyoD inmyoblasts. Nuclear extracts from growing myoblasts were used for immu-noprecipitation with antibodies raised against MyoD, Suv39h1, or controlbeads (A) or against HP1�, HP1�, HP1�, or normal mouse IgG as a negativecontrol (B). The resulting precipitates were then subjected to Western blot-ting (immunoblot, IB) analysis for the presence of Suv39h1, MyoD, HP1�,HP1�, and HP1� as indicated in A and B. Total input lysate was loaded in B toshow that HP1� is present in the inputs, even if it is not present in the IP. Lowerpanel of B, the faint signal obtained with anti-HP1 Western blotting in thecontrol IgG IP corresponds to IgG light chain (noise).

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(Fig. 6A). Overexpression of any of the HP1 isoforms, �, �, or�, resulted generally in the inhibition of differentiation com-pared with the control cell line. HP1-overexpressing cells didnot express the differentiation markers myogenin and MCK(Fig. 6B) and did not fuse into myotubes (data not shown).The faint expression of MCK and myogenin in HP1�-ex-pressing cells cultured in differentiation medium was due tothe fact that this cell line was not pure for the expression of

tagged HP1�, �90%; during cul-ture, some cells lost tagged HP1�expression. We presume thatthese cells differentiated normallyand expressed myogenin andMCK.Overexpression of HP1 proteins

could have broad effects (31). Thus,differentiation inhibition we haveseen in cells overexpressing HP1proteins could be a result of thesebroad effects. To check the specific-ity of the effects seen when we over-express HP1 isoforms (Fig. 6, A andB), we performedChIP experimentsusing anti-FLAG resin to testwhether the tagged HP1 isoformsare recruited to MyoD target genes.Our results show that the exoge-nousHP1 isoforms are indeed phys-ically recruited into MyoD targetgenes (Fig. 6C), but unlike theendogenous HP1 (Fig. 5), theseexogenous isoforms remain onMyoD target promoters even inmyoblasts cultured in differentia-tion conditions (Fig. 6C). This resultsuggests that the differentiationdefect seen in HP1-overexpressingmyoblasts could be due, at least inpart, to a lack of de-repression ofMyoD target genes. Taken together,these results suggest that overex-pression of HP1 proteins impairsMyoD target genes expression andthus muscle terminal differentia-tion, regardless of the HP1 isoform.

DISCUSSION

Repression of MyoD target genesin proliferating myoblasts involvesH3K9methylation (20, 22), which isnormally recognized by HP1 pro-teins (4, 5). This suggests the forma-tion of local facultative heterochro-matin on MyoD target promoters,insuring their stable repressionuntil the cells undergo terminal dif-ferentiation. We tested the hypoth-esis that HP1 proteins are involved

in the repression of MyoD target genes and explored their rolein muscle terminal differentiation in general.Physical and Functional MyoD/HP1 Interaction—Immuno-

precipitation assays showed that MyoD interacts with HP1�andHP1�, but notwithHP1� inmyoblasts. In vitro assays dem-onstrated that MyoD interacts directly with HP1� and HP1�via their chromoshadow domains and the MyoD transactivat-ing domain. A reporter gene assay indicated that this interac-

A

IB: MyoD

IB: GST

GST

-HP1

α

GST

-HP1

β

GST

-HP1

γG

ST

1 32 4

WT

119-

189

1-11

967

-119

1-67

C

IB: MyoD

IB: GST

CD CSD1 67 119 189

HP1α

1 32 4 5

GST-HP1α:

Myo

D W

T

Myo

D W

T

Cte

r aa

173-

318

Nte

r aa

1-11

4∆C

ter a

a 1-

241

∆Nte

r aa

83-3

18

GST-HP1βGST

Emp

ty v

ecto

r

α-Flag

α-G

ST

GST-HP1β

GST

α-HA

D

1 31899 167CterNter bHLH

TADDimerizationDNA binding TAD

MyoD

GST

GST

-HP1

α

GST

-HP1

β

GST

-HP1

γ

GST

GST

-HP1

α

GST

-HP1

γin

pu

t

inp

ut

GST

-HP1

α

GST

-HP1

γ

GST

-HP1

βG

ST-H

P1α

GST

-HP1

γ

+ --- --+ + + +++

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

MyoDMyogenin

MyoDMyogenin

B

Myo

D W

T

Cte

r aa

173-

318

Nte

r aa

1-11

4

∆Cte

r aa

1-24

1

∆Nte

r aa

83-3

18

Emp

ty v

ecto

rE

*

**

* *

35,1

47,4

24,9

24,9

35,147,4

35,1

47,4

60,4

24,9

MWKDa

MW KDa

MW KDa

y

MW KDa

35,1

*

**

**

47,4

35,1

24,9

47,460,4

24,9

35,1

47,4

24,9

47,4

60,4

FIGURE 3. HP1� and HP1�, but not HP1�, interact directly with MyoD in vitro via their chro-moshadow domain and MyoD transactivating domain. A, HP1� and HP1� interact directly with MyoDin a GST pulldown assay. Equivalent amounts of bacterially produced untagged MyoD were incubatedwith GST beads (lane 4) or GST-HP1 beads (lanes 1–3). MyoD was detected by Western blotting using ananti-MyoD antibody (upper panel), and GST fusions using an anti-GST antibody (lower panel). IB, immuno-blot. B, unlike MyoD, myogenin does not interact with HP1 proteins. Myogenin and MyoD were in vitrotranslated in the presence of radioactive [35S] methionine (inputs on lanes 1 and 14, respectively). MyoD ormyogenin were incubated with equivalent amounts of either GST or GST-HP1 proteins, as indicated. GSTpulldown was then conducted as described under “Experimental Procedures,” except that at the end ofthe experiment, the radiolabeled proteins were detected by autoradiography. Lanes 1– 8, GST pulldownexperiment with [35S]myogenin; lanes 9 –14, with [35S]MyoD. C, the chromoshadow domain of HP1� isrequired for interaction with MyoD. Equivalent amounts of bacterially produced MyoD were incubatedwith GST-HP1� deletion mutants on beads (lanes 2–5) or GST-HP1� wild type (lane 1). MyoD was detectedby Western blotting using an anti-MyoD antibody (upper panel) and GST fusions using an anti-GST anti-body (lower panel). D, HP1� interacts with MyoD wild type and with MyoD deletion mutants containingthe C-terminal domain. Top panel, schematic diagram of MyoD functional domains . TAD, transactivationdomain. Lower panels, wild type MyoD was detected using anti-FLAG antibody, and its deletion mutantswere detected using anti-HA antibody (upper panels). GST and GST-HP1� were detected using anti-GSTantibody (lower panel). E, Western blotting using anti-FLAG and anti-HA to verify the expression level ofMyoD and its deletion mutants in HeLa cells used in D*, specific bands.

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tion contributes toMyoD-mediated transcriptional repression.Our results provide evidence for a physical interaction betweenMyoD and HP1�/� and suggest a direct role for these two HP1isoforms in regulating the repressive function of MyoD. A sim-ilar result has been described for HP1� and muscle enhancerfactor 2C, which belongs to themuscle enhancer factor 2 familyof myogenic transcription factors (22). HP1� has also beenshown to interact and cooperate with two critical hematopoi-etic transcription factors, PU.1/GATA-1 (32) and the differen-tiation factor C/EBP� (33). In the case of MyoD, it has beenshown to bind target promoters in proliferating myoblasts,where it acts as a repressor (20). This repression involvesHDACs, among other factors (25). MyoD binds HDAC1 via itshelix-loop-helix domain (25) and HP1 via its C-terminaldomain, which contains a pseudo-PXVXL motif (PALLL) atposition 266, found in many HP1-interacting proteins (34).Such a motif is not found in myogenin, which does not interactwith any of theHP1 isoforms. Thus,MyoDcould form a ternarycomplex with HDAC1 and HP1. MyoD could thus serve as abridge between nucleosomes and chromatin-binding proteins.The first enzymes to be recruited by MyoD could be HDACsthat deacetylate H3K9 to allow its subsequent methylation by ahistone methyltransferase (20, 22). Methylated H3K9 couldthen be recognized and stabilized by HP1 proteins. Thus, therewould be a complex composed ofMyoD-HDAC-histonemeth-yltransferase-HP1, which ensures the stable silencing of MyoDtarget genes by preventing H3K9 acetylation before the initia-tion of differentiation, as previously suggested in: (22). In con-clusion, the equilibrium between H3K9 acetylation and meth-

A

B

C

Rela

tive

luci

fera

se/β

gal

act

ivit

yRe

lati

ve lu

cife

rase

/βg

al a

ctiv

ity

10

20

30

40

50

60

70

80

90

HP1α

10

20

30

40

50

60

70

80

90

HP1β

HP1γ

Rela

tive

luci

fera

se/β

gal

act

ivit

y

10

20

30

40

50

60

pEMSV-MyoD pEMSV

FIGURE 4. HP1� and HP1�, but not HP1�, repress MyoD-mediated tran-scription. Cotransfection into HEK 293 cells of an MCK promoter-driven lucif-erase reporter plasmid with a fixed amount of MyoD expression vector (800ng), and increasing amounts of pcDNA3 vector expressing HP1� (A), HP1� (B),or HP1� (C). The quantities of different pcDNA3-HP1 expression vectors used

were: 0, 100, 200, 300, and 500 ng. The total amount of pcDNA3 was normal-ized when necessary to 500 ng. Expression of MyoD and different HP1s wasanalyzed by Western blotting (data not shown). The inhibitory effect of HP1�and HP1� was specific and MyoD-dependent (compare black bars to graybars). Indeed, it was not seen with �-galactosidase expression under a cyto-megalovirus promoter (used as a normalization control for the transfection),nor with the MCK-luciferase vector in the absence of MyoD (gray bars). Blackbars correspond to transfections with pEMSV-MyoD vector, and gray barscorrespond to the empty vector control pEMSV.

MCK promoter

Proliferation Differentiation

HP1α HP1β HP1γChIP Ab

Rel

ativ

e as

soci

atio

n

0,2

0,4

0,6

0,8

1

p21 promoter

Rel

ativ

e as

soci

atio

n

HP1α HP1β HP1γChIP Ab

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Proliferation Differentiation

FIGURE 5. Preferential recruitment of HP1 on MyoD target promoters inproliferating myoblasts. Chromatin fractions from either proliferatingC2C12 myoblasts (black bars) or cultured 48 h in differentiating medium (graybars) were immunoprecipitated using anti-HP1 antibodies (HP1) and ana-lyzed by quantitative PCR. We quantified copy numbers of the p21 and MCKpromoters regions harboring the MyoD-binding site. gapdh and 36B4 geneswere used as negative controls to normalize our ChIP results. The results arethe means of two independent experiments and six PCR measurements.

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ylation at MyoD target promoters may represent a switch thatdetermines the timing of differentiation.Specificity of the Interaction of MyoD with HP1� and HP1�—

We report differential associations of HP1�/� with MyoD,whereas HP1� does not associate with MyoD, at least in ourhands. The only system inwhichHP1�was found in associationwith MyoD was in HeLa cells. Because this interaction was notfound inmyoblasts, it could be due to the large amount of HeLacells we used to purify MyoD complex. We concluded thatMyoD does not directly interact with HP1�.

HP1 proteins share extensivestructural identity and several char-acteristics (35–40). Despite thesestructural and biochemical similari-ties, HP1 proteins differ in someproperties. For example, they differin their subnuclear distribution (28,41, 42). In addition, HP1� is the onlyisoform that has been linked to tran-scription activation (43). Finally,among the HP1 binding proteins,several have been reported to inter-act with all HP1 isoforms, such asSP100; in contrast, TAFII130 bindstoHP1� andHP1�, but not toHP1�(41), and BRG1 binds only to HP1�(28). Thus, the absence of interac-tion betweenMyoD andHP1� couldbe due to structural and sub-nuclear localization differencescompared with the two other HP1isoforms. Together, these resultsstrongly support the notion thatHP1 proteins form distinct com-plexes in cells (28, 44) and suggestsboth shared and distinctive rolesfor these proteins in muscledevelopment.HP1 Level Is Crucial for Skeletal

MyoD Target Genes Expression andMuscle Terminal Differentiation—Itwas shown that HP1 isoformexpression levels donot change dur-ing muscle differentiation (45), andour results show that HP1 isoformlevels do not significantly change inregenerating muscle, with only aslight increase in HP1� and HP1�levels (not shown).As observedwithoverexpression of Suv39h1 (Refs. 42and 46) and unpublished results),overexpression of any of the threeHP1 isoforms resulted in the loss ofdifferentiation capacity. Our re-sults show that exogenous HP1isoforms remain on MyoD targetpromoters even in differentiationconditions. Thus, overexpression

of HP1 or Suv39h1 could preclude de-repression of MyoD tar-get genes, thus inhibiting terminal differentiation.However, down-regulation ofHP1 isoformswith small inter-

fering RNAs resulted in a generally poor differentiation effi-ciency (supplemental data). This result was unexpected,because we have shown that HP1� and HP1� are involved inthe regulation of MyoD activity. This apparent contradictioncould be explained several ways. First of all, down-regulation ofonly one HP1 isoformmight not be sufficient to activateMyoDtarget genes. One can also hypothesize that H3K9 remains

A

HP1α

HP1β

HP1γ

α-Tubulin

end.ex.

end.ex.

end.ex.

Proliferation Differentiation

ib:

Myogenin3928

MW

28

28

28

51

C2C12:

*

HP1

α

HP1

βH

P1γ

ctrl

MCK51

DAPI HA

HP1α

HP1β

HP1γ

ctrl

HP1

α

HP1

βH

P1γ

ctrl

B

ItgA7

5

10

15

20

25

30

35

40

HP1α HP1β HP1γ

HP1α HP1β HP1γ

Rel

ati

ve e

nri

chm

ent

p21

ChIP Flag:

10

20

30

40

50

60

70

80

ctrl

ctrl

MCK

Rel

ati

ve e

nri

chm

ent

HP1α HP1β HP1γChIP Flag: ctrl

Rel

ati

ve e

nri

chm

ent

Proliferation Differentiation

C

2

4

6

8

10

ChIP Flag:

FIGURE 6. Modulating the levels of HP1 isoforms affects muscle terminal differentiation. A and B, C2C12cells stably expressing HA-FLAG tagged HP1 isoforms as indicated or control cells (ctrl) were cultured underproliferation conditions or in differentiation medium. Proliferating cells were tested by immunofluorescenceusing anti-HA antibody (Roche Applied Science) and 4�,6�-diamino-2-phenylindole (DAPI) to stain DNA (A) oranalyzed by Western blotting with isoform-specific anti-HP1, anti-myogenin, anti-MCK, and anti-�-tubulin as aloading control (B). Note that the kinetic studies were carried out in the same 10-cm-diameter cell culture dishfor each sample. C, FLAG-HA tagged HP1 isoforms are recruited to MyoD target promoters regardless ofdifferentiation. ChIP experiments using anti-FLAG resin were performed from myoblasts stably expressing thetagged HP1 isoforms (or from the control cell line, ctrl) either proliferating (black bars) or cultured in differen-tiation conditions (gray bars). We quantified copy numbers of the MCK, ItgA7, and p21 promoter regionsharboring the MyoD target sequence. The 36B4 gene was used as a negative control. The results are the meansof three independent experiments.

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methylated in the absence of one HP1 isoform and could besufficient per se to silence transcription as described by others(47). In addition, other repressor proteins, like the histone H3lysine 27 methylase EZH2 (48) and HDAC1 (25), are recruitedto silent MyoD target genes in myoblasts, and this could besufficient to inhibit gene expression per se in the absence ofHP1. Secondly, down-regulation of one HP1 isoform may besufficient to interfere with (or inhibit) general chromatin reor-ganization, which occurs in differentiating myoblasts (11, 12,14), thereby inhibiting terminal differentiation. More likely,HP1 proteins are required to silence proliferation-associatedgenes in differentiating cells, a step that is obligatory to initiateterminal differentiation (see supplemental data). Indeed, wepreviously found comparable results with Suv39h1, aH3K9his-tone methyltransferase, which is involved in muscle terminaldifferentiation by silencing proliferation genes, i.e. E2F targetgenes (16). It has also been shown that HP1 proteins associatewith proliferation genes only in differentiated cells, where thesegenes are irreversibly silenced (Ref. 7) and unpublished results)and upon triggering irreversible cell cycle exit in senescent cells(17). Thus, when we down-regulate HP1 protein expression inmyoblasts and try to induce differentiation, E2F target genes arenot correctly silenced in the absence of HP1, cells do notundergo irreversible cell cycle exit, and differentiation cannotstart (supplemental data). We have observed a similar pheno-type when we down-regulate the Suv39h1 expression in myo-blasts (Ref. 16 and unpublished results).ConcerningHP1�, ChIP experiments showed its preferential

enrichment on MyoD target genes in proliferating myoblasts.Although we observed that HP1� does not interact directlywith MyoD, its overexpression interferes with muscle terminaldifferentiation. Thus, HP1� might regulate myogenesis inde-pendently of any direct interaction with MyoD. Because it isknown that HP1 proteins heterodimerize, HP1� could berecruited by HP1�/�. In addition, HP1� might be necessary forthe general nuclear reorganization occurring in differentiatingmyoblasts. Indeed, mutation in the Su(var)205 gene, whichencodes HP1, in Drosophila melanogaster causes lethality atlarval stages (49), suggesting a general role of HP1 as a non-histone chromatin protein. However, to our knowledge, noHP1 knock-out mice have been described to date.In conclusion, our results provide additional evidence that

members of the HP1 protein family are functionally distinctand point to a novel role for MyoD in the organization of het-erochromatin-like local structures on its targets in proliferatingmyoblasts. These data strongly suggest that, in addition to therole ofMyoD as an activator of differentiation-specific genes, itcan also act as an active transcriptional repressor in proliferat-ing myoblasts, in cooperation with specific isoforms of HP1proteins.

Acknowledgments—Wewarmly thank Dr. S. A. Leibovitch for provid-ing MyoD expressing vectors, Dr. H. Ito for the kind gift of anti-MCKantibody, Drs. D. Trouche and A. Hamiche for providing crucialreagents, and Drs. V. Ogryzko and A. Viens for sharing plasmids andtechnical help. We thank Dr. L. L. Pritchard and A. Marchand forcritical reading of the manuscript.

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36. Minc, E., Allory, Y.,Worman, H. J., Courvalin, J. C., and Buendia, B. (1999)Chromosoma 108, 220–234

37. Minc, E., Courvalin, J. C., and Buendia, B. (2000)Cytogenet. Cell Genet. 90,279–284

38. Nielsen, A. L., Ortiz, J. A., You, J., Oulad-Abdelghani,M., Khechumian, R.,Gansmuller, A., Chambon, P., and Losson, R. (1999) EMBO J. 18,6385–6395

39. Nielsen, A. L., Oulad-Abdelghani,M., Ortiz, J. A., Remboutsika, E., Cham-bon, P., and Losson, R. (2001)Mol. Cell 7, 729–739

40. Nielsen, S. J., Schneider, R., Bauer, U. M., Bannister, A. J., Morrison, A.,O’Carroll, D., Firestein, R., Cleary, M., Jenuwein, T., Herrera, R. E., andKouzarides, T. (2001) Nature 412, 561–565

41. Vassallo, M. F., and Tanese, N. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,5919–5924

42. Czvitkovich, S., Sauer, S., Peters, A. H., Deiner, E., Wolf, A., Laible, G.,Opravil, S., Beug, H., and Jenuwein, T. (2001)Mech. Dev. 107, 141–153

43. Vakoc, C. R.,Mandat, S. A., Olenchock, B. A., and Blobel, G. A. (2005)Mol.Cell 19, 381–391

44. Aagaard, L., Laible, G., Selenko, P., Schmid, M., Dorn, R., Schotta, G.,Kuhfittig, S., Wolf, A., Lebersorger, A., Singh, P. B., Reuter, G., and Jenu-wein, T. (1999) EMBO J. 18, 1923–1938

45. Agarwal, N., Hardt, T., Brero, A., Nowak, D., Rothbauer, U., Becker, A.,Leonhardt, H., and Cardoso, M. C. (2007) Nucleic Acids Res. 35,5402–5408

46. Mal, A. K. (2006) EMBO J. 25, 3323–333447. Stewart, M. D., Li, J., and Wong, J. (2005)Mol. Cell Biol. 25, 2525–253848. Caretti, G., Di Padova, M., Micales, B., Lyons, G. E., and Sartorelli, V.

(2004) Genes Dev. 18, 2627–263849. Eissenberg, J. C., James, T. C., Foster-Hartnett, D. M., Hartnett, T., Ngan,

V., and Elgin, S. C. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9923–9927

HP1 and Terminal Differentiation

23700 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOLUME 283 • NUMBER 35 • AUGUST 29, 2008

at CN

RS

on March 26, 2009

ww

w.jbc.org

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Annexe 4 Curriculum Vitae

Ophélie PHILIPOT Ingénieur-Docteur – ophelie.philipot@gmail.com- Page 1 de 2

Ophélie PHILIPOT 7 rue René THIBERT, 94800 Villejuif Tél : (+33) 6 7007 8747 ophelie.philipot@gmail.com 26 ans (05/03/83), nationalité Française

INGENIEUR EN BIOTECHNOLOGIES - DOCTEUR EN BIOLOGIE (EN FINALISATION)

EXPÉRIENCES PROFESSIONNELLES

CHERCHEUR ÉTUDIANT UNITE DE RECHERCHE EN EPIGENETIQUE & DESTIN CELLULAIRE 2005 – 2009 Université de Paris-Diderot, France

Réalisations/Productions • Rédaction d’articles scientifiques et soumission pour publication de mon projet de recherche de doctorat • Participation à la publication de quatre autres articles scientifiques • Mise en place de trois collaborations : au Japon, en Australie et en France • Présentation de mes travaux lors de congrès, notamment à un congrès international à New-York • Encadrement et formation d’étudiants (niveaux Licence 3, Master 1 et Ingénieur) • Enseignement (vacations 20h, niveau Bac+3)

INGENIEUR ÉTUDIANT PIERRE FABRE- ONCOLOGIE 2005 (6 mois) Industrie pharmaceutique, Toulouse, France

Réalisations/Productions • Mise en place de la technologie FACS au laboratoire. • Optimisation d’un protocole de routine pour l’analyse du cycle cellulaire par FACS • Incrémentation de la banque de lignée cellulaire du laboratoire avec la caractérisation de nouveaux modèles tumoraux (mélanomes)

FORMATION

2009 Doctorat en biologie moléculaire et cellulaire (prévu pour octobre 2009) (Université de Paris Diderot, France) Lauréate d’une bourse de recherche en oncologie (ARC)

2005 Ingénieur en Biotechnologies (ESIL, Marseille, France)

2002 BTS biotechnologies (Institut La Raque, Castelnaudary, France) (major de promotion, mention TB)

LANGUES ET COMPÉTENCES INFORMATIQUES

INFORMATIQUE • Travail en environnement Mac et PC (microsoft office).

LANGUES • Anglais (courant), Espagnol (très bon niveau écrit, lu et parlé) ARTICLES ET COMMUNICATIONS

PLOS ONE Philipot O. and Ait-Si-Ali S Article en révision Core Binding Factor CBF negatively regulates muscle terminal differentiation

Ophélie PHILIPOT Ingénieur-Docteur – ophelie.philipot@gmail.com- Page 2 de 2

EXPERT OPIN. THER. TARG. Philipot O*, Yahi, H*, Guasconi, V, Fritsch, L, Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. 2006, 10(6) : 923-34. (*contribution égale)

GENOME BIOLOGY Robin P, Fritsch L, Philipot O, Svinarchuk F, Ait-Si-Ali S. Post-translational

modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. 2007. 8(12) :R270

J BIOL CHEM Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson

R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. 2008. 29;283(35):23692-700

CRIT REV ONCOL HEMATOL Raynaud CM, Sabatier L, Philipot O, Olaussen KA, Soria JC. Telomere length,

telomeric proteins and genomic instability during the multistep carcinogenic process. 2008. 66(2):99-117

COLLABORATIONS • avec les Drs El-Osta et Baker (Melbourne, Australie). Cartographie épigénétique des

gènes cibles de MyoD

• avec le Dr Ozasa (Kumamoto, Japan). Etalissement des modèles cellulaires exprimant ectopiquement MyoD

CONFERENCES •Young Researchers Meeting (Institut Curie,Institut Jacques Monod, Paris-Diderot),

mai 2009. Présentation orale. •Making Muscle in the embryo and the adult (University of Columbia, New-York City, NY, USA), juin 2009. Présentation poster.

Résumé/Abstract Coopération entre le facteur myogénique MyoD et le facteur CBF pour la régulation de

l’équilibre prolifération-différenciation dans le muscle

Le facteur de transcription CBF est composé de deux sous-unités, Runx1 et CBFβ. Core Binding

Factor ou CBF était à l’origine étudié pour son rôle dans l’hématopoïèse, mais des études récentes

l’on impliqué dans d’autres types cellulaires. Dans notre étude, nous montrons pour la première

fois que Runx1 et CBFβ jouent un rôle clé dans la différenciation terminale du muscle squelettique.

La différenciation musculaire terminale est sous le contrôle d’un facteur myogénique majeur,

MyoD. Ce facteur est capable d’orchestrer la sortie du cycle cellulaire des myoblastes et d’activer

l’expression des gènes spécifiques du muscle. Cette étude suggère que Runx1 et CBFβ inhibent la

sortie cellulaire et interagissent avec MyoD pour réprimer l’expression des gènes cibles de MyoD.

Ensemble, ces données suggèrent que le facteur CBF régule négativement l’équilibre prolifération-

différenciation musculaire.

Mots clés : différenciation, prolifération, muscle, MyoD, Runx1, CBFβ, destin cellulaire

Cooperation between the muscle transcription factor MyoD and Core Binding Factor in the proliferation-differentiation balance in skeletal muscle

Core Binding Factor or CBF transcription factor is composed of two subunits, Runx1/AML1 and

CBFβ. CBF was originally described as a regulator of hematopoiesis, but recent studies

demonstrated its participation in many other differentiation pathways. In this study, we show that

Runx1 and CBFβ play a key role in skeletal muscle terminal differentiation. Muscle terminal

differentiation is orchestrated by MyoD, a major transcription factor in skeletal muscle. MyoD is

capable of triggering the irreversible cell cycle exit of myoblasts and induces the expression of

muscle markers. Here, we show that Runx1 and CBFβ have a growth promoting role and that

Runx1 and CBFβ interact with MyoD and repress the activation of MyoD target genes. Together,

our data suggest that CBF negatively regulates muscle terminal differentiation.

Key words : differentiation, proliferation, muscle, MyoD, Runx1, CBFβ, cell fate