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THESE UNIQUE DE DOCTORAT

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE

FELIX HOUPHOUËT-BOIGNY EN SCIENCES DES

PROCEDES CHIMIQUES, ALIMENTAIRES ET

ENVIRONNEMENTAUX

Spécialité :

Chimie Organique et des Substances Naturelles

Présentée par :

KONE Kouwelton Patrick Franck Olivier Ingénieur en Génie Chimique

APPLICATION DES TECHNIQUES DE

CHROMATOGRAPHIE ET DE

SPECTROSCOPIE DANS L’IDENTIFICATION

DES METABOLITES SECONDAIRES DE TROIS

PLANTES ANTIDIABETIQUES ET

ANTIHYPERTENSIVES DE LA PHARMACOPEE

IVOIRIENNE

Soutenue le 10/07/2018 devant le jury composé de :

M. YAO Kouassi Benjamin (Professeur titulaire, INP-HB/ Yamoussoukro) Président

M. BEDI Sahouo Gustave (Professeur titulaire, ENS/ Abidjan) Rapporteur

M. TRAORE Karim Sory (Professeur titulaire, UNA/ Abidjan) Rapporteur

Mme KONE Mawa (Maître de Conférences, UFHB/ Abidjan) Examinatrice

M. SORO Yaya (Maître de Conférences, INP-HB/ Yamoussoukro) Directeur de thèse

A mon fils Ibrahim Abdallah

REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier les institutions et personnes suivantes sans qui cette thèse

n’aurait pas vu le jour :

- L’INP-HB avec à sa tête le Directeur Général M. KOFFI N’guessan pour la création de

l’Ecole Doctorale Polytechnique ;

- L’EDP avec à sa tête le Directeur, Professeur YAO Kouassi Benjamin pour avoir permis

mon inscription en thèse ;

- Le LAPISEN avec à sa tête le Directeur du laboratoire, Professeur YAO Kouassi Benjamin

pour avoir le cadre technologique mis à notre disposition ;

- La Direction des Orientations et des Bourses pour la bourse dont nous avons bénéficier pour

effectuer nos travaux ;

- Le Laboratoire de Chimie Agroalimentaire (LCA) de Toulouse avec sa direction composée

du Professeur Gerard VILAREM et du Professeur Carlos VACA-GARCIA pour leur

accueil au sein de leurs locaux ;

- Le Département de Formation et de Recherche Génie Chimique et Agro-Alimentaire avec à

sa tête le Professeur ADIMA Amissa Augustin et le personnel enseignant pour toute l’aide

scientifique et moral.

- Professeur BROU Casmir pour avoir présider le jury de thèse en remplacement du

Professeur YAO Kouassi Benjamin ;

- Professeur BEDI Gustave, Professeur Titulaire en Chimie Organique Biologique à l’Ecole

Normale Supérieure (ENS), Président de la SOACHIM Côte d’Ivoire, point focal de la

convention de Stockholm sur les polluants organiques et Professeur TRAORE Karim Sory,

Professeur Titulaire en Chimie et Environnement de l’Université Nangui Abrogoua (UNA)

pour avoir instruit cette thèse, ainsi que Professeur MEITE Ladji, Maitre de Conférence à

l’UNA, pour avoir suppléer le Professeur TRAORE ;

- Docteur KONE Mawa, Maitre de Conférences en Chimie Théorique et Analytique à

l’Université Félix Houphouët Boigny (UFHB) au Laboratoire de Chimie Organique et des

Substances Naturelles (LCOSN) pour avoir examiné cette thèse.

Nos plus sincères remerciements vont vers celui qui a initié cette thèse, le Docteur

SORO Yaya, Maitre de Conférences, ainsi que le Docteur Siaka SORHO, Maitre de

Conférences, qui n’ont cessé de nous soutenir sur tous les aspects de notre travail, ne montrant

aucune fatigue et aucun rechignement dans nos incessantes sollicitations à son égard.

Remerciement spécial au Dr KOUASSI Appiah Kouadio Esaïe et à M. SANOGO

Bazoumana pour leurs soutiens moral et scientifique de tous les moments.

Je remercie l’ensemble des doctorants de l’UMRI 58.

KONE KOUWELTON PATRICK i

Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de

trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne

TABLE DES MATIERES

LISTE DES SCHEMAS .............................................................................................. xi

LISTE DES TABLEAUX ......................................................................................... xiii

LISTE DES FIGURES ............................................................................................... xv

SIGLES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES ................................ xxi

INTRODUCTION ........................................................................................................ 1

QUESTIONS DE RECHERCHE ............................................................................... 3

HYPOTHESES ............................................................................................................. 3

ORIGINALITE............................................................................................................. 4

PARTIE 1 : BIBLIOGRAPHIE .................................................................................. 5

CHAPITRE I: METABOLITES SECONDAIRES .............................................. 6

I. COMPOSES POLYPHENOLIQUES .......................................................... 6

I.1. Flavonoïdes .................................................................................................. 6

I.1.1. Anthocyanes .......................................................................................... 7

I.1.2. Flavan-3-ols........................................................................................... 7

I.1.3. Flavonols ............................................................................................... 8

I.1.4. Flavones ................................................................................................ 8

I.1.5. Isoflavonoïdes ....................................................................................... 9

I.1.6. Flavonoïdes mineurs ............................................................................. 9

I.1.6.1. Chalcones et dihydrochalcones ...................................................... 9

I.1.6.2. Aurones ........................................................................................ 10

I.1.6.3. Flavanones .................................................................................... 10

I.1.6.4. Dihydroflavonols.......................................................................... 11

I.2. Autres composés phénoliques ou non-flavonoïdes .................................... 11

I.2.1. Phénols simples ................................................................................... 12

KONE KOUWELTON PATRICK ii



I.2.2. Phénols éthers ...................................................................................... 12

I.2.3. Phénylpropanoïdes .............................................................................. 13

I.2.4. Hydroxycinnamates............................................................................. 13

I.2.5. Tanins .................................................................................................. 14

I.2.6. Quinones ............................................................................................. 17

I.2.7. Stilbènes .............................................................................................. 17

II. LES TERPENES ET TERPENOÏDES ....................................................... 18

II.1. Hémiterpènes ............................................................................................ 19

II.2. Monoterpènes ............................................................................................ 19

II.3. Sesquiterpènes .......................................................................................... 20

II.4. Diterpènes ................................................................................................. 21

II.5. Sesterterpènes ........................................................................................... 22

II.6. Triterpènes ................................................................................................ 23

II.6.1. Stérols ................................................................................................ 24

II.6.2. Saponins ............................................................................................. 25

II.7. Tétraterpènes ............................................................................................. 26

III. ALCALOÏDES ........................................................................................... 27

Conclusion partielle .......................................................................................... 28

CHAPITRE II: PLANTES DE L’ETUDE ............................................................ 29

I. ALCHORNEA CORDIFOLIA ..................................................................... 29

Introduction ...................................................................................................... 29

I.1. Description ................................................................................................. 29

I.2. Origine géographique ................................................................................. 30

I.3. Propriétés pharmacologiques ..................................................................... 30

I.4. Etudes phytochimiques réalisées ................................................................ 31

I.4.1. Feuilles ................................................................................................ 31

KONE KOUWELTON PATRICK iii



I.4.2. Tige ..................................................................................................... 32

I.4.3. Racines ................................................................................................ 33

I.4.4. Graine .................................................................................................. 33

II. PHYLLANTHUS AMARUS ......................................................................... 35

Introduction ...................................................................................................... 35

II.1. Description botanique ............................................................................... 36

II.2. Origine géographique ............................................................................... 36

II.3. Propriétés pharmacologiques .................................................................... 37

II.4. Études phytochimiques ............................................................................. 40

III. TRIDAX PROCUMBENS ............................................................................ 41

Introduction ...................................................................................................... 41

III.1. Description botanique .............................................................................. 42

III.2. Biogéographie.......................................................................................... 42

III.3. Propriétés pharmacologiques ................................................................... 43

III.4. Etudes phytochimiques ............................................................................ 44


CHAPITRE III: OPTIMISATION ET ANALYSES CHIMIQUES.................... 46

I. PLAN D’EXPERIENCES ET OPTIMISATION ....................................... 46

Introduction ...................................................................................................... 46

I.1. Plan d’expériences ..................................................................................... 46

I.1.1. Définition ............................................................................................ 46

I.1.2 Processus de conception expérimental ................................................. 46

I.1.3. Types de plan d’expérience ................................................................. 47

I.1.3.1. Plan factoriel ................................................................................ 47

I.1.3.2. Plan de Plackett et Burman .......................................................... 48

I.2. Optimisation ............................................................................................... 49

KONE KOUWELTON PATRICK iv



I.2.1. Définition ............................................................................................ 49

I.2.2. Types d’optimisation ........................................................................... 49

I.2.2.1. Méthode de simplex ..................................................................... 49

I.2.2.2. Algorithme génétique ................................................................... 49

II. ANALYSES CHIMIQUES ........................................................................ 50

II.1. Techniques spectrométriques .................................................................... 50

II.1.1. Spectrométrie de masse ..................................................................... 50

II.1.1.1. Méthodes d'ionisation ................................................................. 51

II.1.1.2. Ions moléculaires et fragments par impact électronique ............ 51

II.1.1.3. Spectre de masse et pic de base .................................................. 51

II.1.1.4. Reconnaissance de l'ion moléculaire (parent), pic et détection des

isotopes ................................................................................................................. 51

II.1.1.5. Application de la spectroscopie de masse ................................... 52

II.1.1.6. Identification des métabolites secondaires par les ions parents issus

de la fragmentation par spectrométrie de masse .................................................. 52

II.1.2. Spectrométrie infrarouge ................................................................... 61

II.1.2.1. Théorie de la spectroscopie infrarouge ....................................... 61

II.1.2.2. Région d'empreinte digitale ........................................................ 61

II.1.2.3. Applications de la spectroscopie infrarouge ............................... 61

II.1.2.4. Interprétation des spectres infrarouges ....................................... 62

II.1.3. Spectroscopie ultraviolette ................................................................. 63

II.1.3.1. Théorie ........................................................................................ 63

II.1.3.2. Application.................................................................................. 63

II.2. Techniques chromatographiques .............................................................. 64

II.2.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) 64

II.2.2. Chromatographie en phase liquide à haute performance ................... 66

II.2.2.1. Théorie de la technique ............................................................... 66

KONE KOUWELTON PATRICK v



II.2.2.2. Application de la technique ........................................................ 66

II.2.3. Chromatographie en phase gazeuse ................................................... 66

II.2.3.1. Théorie de la méthode ................................................................. 66

II.2.3.2. Application de la CPG ................................................................ 66


PARTIE 2 : METHODOLOGIE .............................................................................. 68

CHAPITRE I: ANALYSES PHYTOCHIMIQUES ........................................... 69

I. BIBLIOMETRIE ........................................................................................ 69

II. RECOLTE DES ORGANES VEGETAUX ............................................... 69

III. EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT DES METABOLITES

SECONDAIRES .............................................................................................................. 70

III.1. Extraction des métabolites secondaires ................................................... 70

III.2. Fractionnement de l’extrait hydro-éthanolique ....................................... 70

IV. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE .............................................................. 71

IV.1. Test de détection des stérols et terpènes par la réaction de Lieberman et

Bürchard ....................................................................................................................... 72

IV.1.1. Sur le broyat ..................................................................................... 72

IV.1.2. Sur les extraits .................................................................................. 72

IV.2. Test de détection des polyphénols ........................................................... 72

IV.2.1. Sur le broyat ..................................................................................... 72


IV.3. Test de détection des flavonoïdes par la réaction à la cyanidine ............ 73

IV.3.1. Sur le broyat ..................................................................................... 73


IV.4. Test de détection des leucoanthocyanes .................................................. 73

IV.5. Test de détection des anthocyanes .......................................................... 73

IV.6. Tests de détection des tanins ................................................................... 73

KONE KOUWELTON PATRICK vi



IV.6.1. Tanins catéchiques ........................................................................... 73

IV.6.2. Tanins galliques................................................................................ 74

IV.7. Tests de détection des alcaloïdes ............................................................. 74

IV.7.1. Sur le broyat ..................................................................................... 74


IV.8. Test de détection des saponosides ........................................................... 74

IV.9. Test de détection des quinones et anthraquinones .................................. 75

IV.9.1. Sur les broyats .................................................................................. 75


IV.10. Test de détection des coumarines .......................................................... 75

IV.11. Test de détection des anthraquinones combinés ................................... 75

IV.11.1. Test de détection des O-hétérosides ............................................... 76

IV.11.2. Test de détection des C-hétérosides ............................................... 76

IV.12. Test de détection composés réducteurs ................................................. 76

IV. 13. Mucilages ............................................................................................. 76


CHAPITRE II: MODELISATION ET OPTIMISATION DU RENDEMENT

D’EXTRACTION……. ...................................................................................................... 78

I. MODELISATION ...................................................................................... 78

I.1. Enumération des facteurs ........................................................................... 78

I.2. Domaines de valeurs .................................................................................. 78

I.3. Matrice de Plackett-Burman ...................................................................... 79

I.4. Réalisation des tests ................................................................................... 79

II. OPTIMISATION DU MODELE ................................................................ 79


CHAPITRE III: IDENTIFICATION ET DETERMINATION STRUCTURALE ..... 81

KONE KOUWELTON PATRICK vii



I. IDENTIFICATION CHROMATOGRAPHIQUE ET

SPECTROSCOPIQUE ..................................................................................................... 81

I.1. Identification par chromatographie ............................................................ 81

I.1.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) .. 81

I.1.2. Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) ............................ 81

I.1.2.1. Conditions expérimentales pour Alchornea cordifolia ................ 81

I.1.2.2. Conditions expérimentales pour Phyllanthus amarus .................. 84

I.2. Identification par spectroscopie ................................................................. 86

I.2.1. Spectroscopie infrarouge ..................................................................... 86

I.2.2. Spectroscopie UV-visible .................................................................... 86

II. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN

PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE ....................... 86

II.1. Hydrolyse acide ........................................................................................ 86

II.2. Silylation des différents échantillons ........................................................ 87

II.3. Mode opératoire de la GC-MS .................................................................. 87


PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION ......................................................... 89

CHAPITRE I: BIBLIOMETRIE ......................................................................... 90

I. PHYLLANTHUS AMARUS ......................................................................... 90

II. ALCHORNEA CORDIFOLIA ..................................................................... 92

III. TRIDAX PROCUMBENS ............................................................................ 94

Discussion......................................................................................................... 96


CHAPITRE II: CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES ......................................... 98

I. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES BROYATS .............................. 98

I.1. Résultats ..................................................................................................... 98

I.2. Discussion ................................................................................................ 100

KONE KOUWELTON PATRICK viii



II. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES EXTRAITS DE TRIDAX

PROCUMBENS .............................................................................................................. 102

II.1. Criblages phytochimiques des extraits hydroalcooliques de Tridax

procumbens ................................................................................................................ 102

II.1.1. Résultats ........................................................................................... 102

II.1.2. Discussion ........................................................................................ 103

II.2. Criblage phytochimique des extraits dichlorométhane/éthanol des feuilles

suivi de la digestion et de la décoction ....................................................................... 104

II.2.1. Résultats ........................................................................................... 104

II.2.2. Discussion ........................................................................................ 104

III. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES FRACTIONS ISSUES DES

EXTRAITS HYDROALCOOLIQUES ......................................................................... 105

III.1. Résultats ................................................................................................ 105

III.2. Discussion .............................................................................................. 107

Conclusion partielle ........................................................................................ 109

CHAPITRE III: MODELISATION ET OPTIMISATION DES RENDEMENTS

D’EXTRACTION…… ..................................................................................................... 110

I. MODELISATION DES RENDEMENTS D’EXTRACTION DE A.

CORDIFOLIA ET DE T. PROCUMBENS ..................................................................... 110

I.1. Résultats ................................................................................................... 110

I.2. Discussion ................................................................................................ 111

I.2.1. Au niveau de Alchornea cordifolia ................................................... 111

I.2.2. Au niveau de Tridax procumbens ..................................................... 113

II. OPTIMISATION ...................................................................................... 115

III. VERIFICATION ET COMPARAISON DES DONNEES DES DEUX

MODELES…. ................................................................................................................ 115


KONE KOUWELTON PATRICK ix



CHAPITRE IV: IDENTIFICATIONS ET DETERMINATIONS

STRUCTURALES DES METABOLITES SECONDAIRES ...................................... 120

I. IDENTIFICATIONDES METABOLITES SECONDAIRES PAR

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE A HAUTE RESOLUTION

(HPTLC)…… ................................................................................................................. 120

I.1. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea

cordifolia .................................................................................................................... 120

I.1.1. Résultats ............................................................................................ 120

I.1.2. Discussion ......................................................................................... 126

I.2. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus

amarus ........................................................................................................................ 129

I.2.1. Résultats ............................................................................................ 129

I.2.2. Discussion ......................................................................................... 135

II. IDENTIFICATION PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE ............... 138

II.1. Spectres infrarouges des différentes fractions de Alchornea cordifolia . 138

II.1.1. Résultats ........................................................................................... 138

II.1.2. Discussion ........................................................................................ 142

II.2. Spectres infrarouges des différentes fractions de Phyllanthus amarus .. 143

II.2.1. Résultats ........................................................................................... 143

II2.2. Discussion ......................................................................................... 148

III. ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE

PERFORMANCE COUPLEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTES ........ 149

III.1. Chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la

spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia .......................... 150

III.1.1. Résultats ......................................................................................... 150

III.1.2. Discussion ....................................................................................... 156

KONE KOUWELTON PATRICK x



IV. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE

PERFORMANCE COMBINEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTE DES

FRACTIONS DE PHYLLANTHUS AMARUS ............................................................... 157

IV.1. Résultats ................................................................................................ 157

IV.2. Discussion ............................................................................................. 169

V. COMPARAISON DES METHODES ANALYTIQUES DE CRIBLAGE

DES METABOLITES SECONDAIRES ....................................................................... 170

V.1. Résultats .................................................................................................. 172

V.2. Discussion ............................................................................................... 174

VI. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN

PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE ..................... 178

VI.1. Analyse GC-MS des composés de la fraction à l’acétate d’éthyle issue de

l’extrait hydro alcoolique des fleurs de Tridax procumbens ...................................... 178

VI.2. Analyse GC-MS des composés de la fraction au dichlorométhane issue de

l’extrait hydro alcoolique des fleurs Tridax procumbens linn ................................... 206

VI.3. Discussion sur les composés identifiés ................................................. 236


CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................... 238

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................ I

ANNEXES ............................................................................................................. XVIII

KONE KOUWELTON PATRICK xi



LISTE DES SCHEMAS

Schéma 1: Fractionnement de l'extrait hydro-éthanolique ...................................................... 71

Schéma 2:Réaction de silylation du groupement hydroxyle en présence de MSTFA ............ 87

Schéma 3: Décomposition du pic 1 ....................................................................................... 179


Schéma 5: Décomposition du spectre du pic 3 ...................................................................... 182





Schéma 10: Décompostion du pic 8 ...................................................................................... 189

Schéma 11: Décomposition du pic 9 ..................................................................................... 191

Schéma 12:Décomposition du pic 9 ...................................................................................... 192

Schéma 13: Décomposition du pic 10 ................................................................................... 194








Schéma 21: Décomposition pic n°1 ....................................................................................... 208

Schéma 22: Décomposition du pic n°2 .................................................................................. 209

Schéma 23: décomposition du pic n°3 .................................................................................. 210








Schéma 31: Décomposition du pic n°10 ................................................................................ 218

KONE KOUWELTON PATRICK xii

















KONE KOUWELTON PATRICK xiii



LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Listes des molécules déjà isolées dans Alchornea cordifolia ............................... 34

Tableau 2: Expériences pour un plan factoriel 23 ................................................................... 47

Tableau 3: Exemple de matrice d'expérience pour 7 facteurs de Plackett et Burman ............ 48

Tableau 4: Facteurs recensés ................................................................................................... 78

Tableau 5: Matrice des expériences ........................................................................................ 79

Tableau 6: Conditions expérimentales de la HPLC ................................................................ 82

Tableau 7: Gradient de solvant ............................................................................................... 82

Tableau 8: Conditions expérimentales de la HPLC ................................................................ 82

Tableau 9: Gradient de solvant ............................................................................................... 83

Tableau 10: Conditions expérimentales de la HPLC .............................................................. 83

Tableau 11: Gradient de solvant ............................................................................................. 83







Tableau 18: Criblages phytochimiques des broyats de Tridax procumbens, Alchornea

cordifolia et Phyllanthus amarus ............................................................................................. 99

Tableau 19:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction hydro alcoolique de Tridax

procumbens ............................................................................................................................ 103

Tableau 20:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction dichlorométhane/éthanol des

feuilles suivie de la digestion et de la décoction .................................................................... 104

Tableau 21: Screening phytochimiques de trois familles de métabolites secondaires dans

Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus .......................................................................... 106

Tableau 22: Calcul de l'erreur expérimentale pour Alchornea cordifolia ............................. 111

Tableau 23: Détermination des facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia ................. 112

Tableau 24: Calcul de l'erreur expérimentale pour Tridax procumbens ............................... 113

Tableau 25: Détermination des facteurs significatifs Tridax procumbens ............................ 113

Tableau 26: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia ..................... 124

Tableau 27: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia (suite) .......... 125

KONE KOUWELTON PATRICK xiv



Tableau 28: Composition chimique des différentes fractions de Phyllanthus amarus .......... 132

Tableau 29: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite) .............. 133

Tableau 30: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite et fin) .... 134

Tableau 31: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de

Alchornea cordifolia .............................................................................................................. 155


Phyllanthus amarus ................................................................................................................ 167


Phyllanthus amarus (suite) ..................................................................................................... 168

KONE KOUWELTON PATRICK xv



LISTE DES FIGURES

Figure 1: Structure générale des flavonoïdes et leur numérotation ........................................... 6

Figure 2: Structure carbonée d'un anthocyane .......................................................................... 7

Figure 3: Structure d'un flavan-3-ol .......................................................................................... 8

Figure 4: Structure d'un flavonol ............................................................................................... 8

Figure 5: Structure d'un flavone ................................................................................................ 9

Figure 6: Structure d'un isoflavone ........................................................................................... 9

Figure 7: Numérotation de la structure des chalcones et dihydrochalcones ........................... 10

Figure 8: Numérotation des aurones ....................................................................................... 10

Figure 9: Structure de base d'une flavanone ............................................................................ 11

Figure 10: Configurations des quatre formes possibles de dihydroflavonols ......................... 11

Figure 11: Exemple de structures de quelques phénols simples ............................................. 12

Figure 12: Structures de quelques phénols éthers ................................................................... 12

Figure 13: Structures de quelques phénylpropanoïdes ............................................................ 13

Figure 14: Structures de quelques hydroxycinnamates ........................................................... 14

Figure 15: Structures de quelques tanins ................................................................................. 16

Figure 16: Structures de quelques quinones ............................................................................ 17

Figure 17: Structures de quelques stilbènes ............................................................................ 18

Figure 18: Structures de quelques hémiterpènes ..................................................................... 19

Figure 19: Structures de quelques monoterpènes .................................................................... 20

Figure 20: Structures de quelques sesquiterpènes ................................................................... 21

Figure 21: Structures de quelques diterpènes .......................................................................... 22

Figure 22: Structure d'un sesterterpène ................................................................................... 22

Figure 23: Structures de quelques triterpènes ......................................................................... 24

Figure 24: Schéma de base et numérotation des stérols .......................................................... 25

Figure 25: Structures de deux saponines ................................................................................. 26

Figure 26: Structures de quelques tétraterpènes ...................................................................... 27

Figure 27: Structures de quelques alcaloïdes .......................................................................... 28

Figure 28: Photographie de Alchornea cordifolia ................................................................... 29

Figure 29: Phyllanthus amarus ............................................................................................... 36

Figure 30: Tridax procumbens ................................................................................................ 42

KONE KOUWELTON PATRICK xvi



Figure 31: Voies de fragmentation de l'acacétine (1) et de la 4,5-dihydroxy-7-méthoxyflavone

(2) (Justesen, 2001). ................................................................................................................. 53

Figure 32: Voies de fragmentation de la diosmétine (3) (Justesen, 2001). ............................. 54

Figure 33: Voies de fragmentation de l'isorhamnétine (Justesen, 2001) ................................. 55

Figure 34: Proposition de dissociation induite par collision de la quercitrine déprotonée en

l'aglycone radicalaire et en ions du produit aglycone (Hvattum and Ekeberg, 2003). ............. 55

Figure 35: Spectre des ions filles produits par activation collisionnelle de l'ion (M - H) - de

l'acide palmitique-7,7,8,8-d4 (Jensen and Gross, 1987) .......................................................... 56

Figure 36: Résumé des potentiels coupures par spectrométrie de masse d'un flavonoïde

glycosylé (Domon and Costello, 1988) .................................................................................... 57

Figure 37: Mécanisme possible d’isomérisation entre le 2’-hydrochalcone en flavanone (Van

de Sande et al., 1972) ............................................................................................................... 57

Figure 38: Schéma de fragmentation du squelette chalcone par spectrométrie de masse proposé

par Van de Sande et al. (1972) ................................................................................................. 58

Figure 39: Schéma de fragmentation du squelette flavanone par spectrométrie de masse

proposé par Van de Sande et al. (1972) ................................................................................... 58

Figure 40: Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B (Nowakowska,

2004) ......................................................................................................................................... 59

Figure 41: Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes (flavanone) en

mode négatif (Portet et al., 2008) ............................................................................................. 59

Figure 42: Nomenclature simplifiée des voies de fragmentation des flavonoïdes en mode positif

(Wolfender et al., 2000) ........................................................................................................... 60

Figure 43: Exemple de spectre infrarouge de la N-méthylaniline (Cozzolino, 2009) ............ 63

Figure 44:Nombre de publications par année sur Phyllanthus amarus ................................... 90

Figure 45: Classement des auteurs en fonction du nombre de publications ........................... 91

Figure 46: Camembert représentant la part de chaque type de publication sur Phyllanthus

amarus ...................................................................................................................................... 92

Figure 47:Nombre de publications sur Alchornea cordifolia au fil des années ...................... 93

Figure 48: Trois premiers auteurs en nombre de publications sur Alchornea cordifolia ........ 93

Figure 49: Répartition des différents types de publication sur Alchornea cordifolia ............. 94

Figure 50: Nombre de publication sur Tridax procumbens par an .......................................... 95

Figure 51: Classement des auteurs les plus prolifiques sur les publications sur Tridax

procumbens .............................................................................................................................. 95

KONE KOUWELTON PATRICK xvii



Figure 52: Répartition des publications sur Tridax procumbens par type .............................. 96

Figure 53: Résultats des expériences sur Alchornea cordifolia ............................................ 110

Figure 54: Résultats des expériences sur Tridax procumbens .............................................. 111

Figure 55: Influences des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction de Alchornea

cordifolia ................................................................................................................................ 113

Figure 56: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction ....................... 114

Figure 57: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de


Figure 58: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia ......... 116

Figure 59: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Tridax

procumbens ............................................................................................................................ 117

Figure 60: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens ........... 117

Figure 61: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A. cordifolia

................................................................................................................................................ 118

Figure 62: Modélisation de Alchornea cordifolia avec le modèle de T. procumbens ........... 118

Figure 63: : Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia

................................................................................................................................................ 122

Figure 64: Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus

................................................................................................................................................ 131

Figure 65: Spectres Infrarouge des fractions de Alchornea cordifolia ................................. 140

Figure 66: Spectres Infrarouge des fractions de Phyllanthus amarus ................................... 146

Figure 67: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane des feuilles de


Figure 68: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle des

feuilles de Alchornea cordifolia ............................................................................................. 152

Figure 69: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction au butanol des feuilles de


Figure 70: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane de Phyllanthus

amarus .................................................................................................................................... 159

Figure 71: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle de


Figure 72: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’eau de Phyllanthus

amarus .................................................................................................................................... 166

KONE KOUWELTON PATRICK xviii



Figure 73: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour


Figure 74: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour


Figure 75: Résumé des pourcentages de détection de famille de métabolites secondaires ... 174

Figure 76: Pourcentage de détection des métabolites secondaires ........................................ 175

Figure 77: Résumé des pourcentages de détection des familles de métabolites secondaires de




Figure 79: Chromatogramme de la fraction à l’acétate d'éthyle de Tridax procumbens ...... 178

Figure 80: 2,3 Diméthylbutan-2-ol ........................................................................................ 179

Figure 81: Spectre de masse du pic 1 .................................................................................... 179

Figure 82: Octan-1-ol ............................................................................................................ 180

Figure 83: Spectre du pic 2 .................................................................................................... 180

Figure 84: 4-Hydroxy benzoate de méthyle .......................................................................... 181


Figure 86: Acide 4-hydroxybenzoïque .................................................................................. 183


Figure 88: Ester méthylique de l'acide procatéchine ............................................................. 185


Figure 90: Ester méthylique de l'acide coumarique .............................................................. 186


Figure 92: (3-methoxy-4-en-1-yl) Benzène .......................................................................... 187


Figure 94: Acide 3,4-dihydroxybenzoïque ............................................................................ 189


Figure 96:4-[(2E)-butan-2-ylidene amino]-3-ethlbutane-1,2,4-triol ..................................... 190


Figure 98: Malonate de diéthyle ............................................................................................ 191

Figure 99: Spectre du pic 10 .................................................................................................. 192

Figure 100: Acide (2E)-3-(4-hydroxyphényl) prop-2-énoïque ............................................. 193

Figure 101: Spectre du pic 11 ................................................................................................ 193

KONE KOUWELTON PATRICK xix



Figure 102: Acrylate de méthyle 3-(4-hydroxyphényle) ....................................................... 195


Figure 104: Acrylate de méthyl-3-(3,4-dihydroxyphényle) .................................................. 196


Figure 106: Acide férulique .................................................................................................. 198


Figure 108: Acide caféique ................................................................................................... 200


Figure 110: 2-(3,4-dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4h-chromèn-4-one ......................... 202


Figure 112: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one ......... 203


Figure 114: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one .............................. 205


Figure 116: Chromatogramme de la fraction dichlorométhane de Tridax procumbens ....... 207

Figure 117: (Méthylamino) méthanol ................................................................................... 207

Figure 118: Spectre de masse du pic 1 .................................................................................. 208

Figure 119: (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one ......................................................................... 209

Figure 120: Spectre de masse du pic n°2 .............................................................................. 209

Figure 121: spectre du pic n°3 ............................................................................................... 210




Figure 125: Spectre de masse du pic n° 7 ............................................................................. 214



Figure 128: Spectre de masse du pic n°10 ............................................................................ 217


Figure 130: Spectre de masse n°12 ....................................................................................... 219





KONE KOUWELTON PATRICK xx












KONE KOUWELTON PATRICK xxi



SIGLES ABREVIATIONS ET FORMULES

CHIMIQUES

°C Degré Celsius

°C/min Degré Celsius par minute

ACP Analyse en composante principale

ADN Acide désoxyribonucléique

Br Brome

CCM Chromatographie sur couche mince

CH2Cl2 Dichlorométhane

Cl Chlore

Cm Centimètre

CPG Chromatographie en phase gazeuse

D/GalN/LPS D-galactosamine Lipopolysaccharide

DPPH 2,2 Diphényl-1 picrylhydrazylhydrate

EDP Ecole Doctorale Polytechnique

eV Electron Volt

FeCl3 Trichlorure de fer

g Gramme

GC Gas Chromatography

GC-MS Gas Chromatography - Mass spectrometry

H Heure

HCl Acide chlorhydrique

HET-CAM Hen's Egg Test, Chorioallantoic membrane

HPLC High pressure Liquid chromatography

HPLC UV High pressure Liquids chromatograghy coupled with ultra violet spectroscopy

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography

IR Infra-Rouge

KBr Bromure de potassium

LAPISEN LAboratoire des Procédés Industriels de Synthèses, de l’environnement et des Energies Nouvelles

LC Liquid Chromatography

LDL Low Density Lipids (Lipides à faible densité)

M Mètre

m/z Masse par charge électrique

Mg Milligramme

MgSO4 Sulfate de magnésium

Min Minute

mL Millilitre

mL/g Millilitre par gramme

mL/min Millilitre par minute

mm Millimètre

MSTFA N méthyl N triméthylsilyltrifluoroacétanide

NH4OH Hydroxyde d'ammonium

nm Nanomètre

KONE KOUWELTON PATRICK xxii



OMS Organisation mondiale de la santé

RF Rapport frontale

RP Reverse phase

rpm Rotation par minute

scans/s Scans par seconde

TLC Thin Layer Chromatography (Chromatographie sur couche mince)

TMS Triméthylsilyle

uma/s Unité de masse atomique par seconde

UMRI Unité Mixte de Recherche et d’Innovation

UV Ultra-violet

v/v Volume par volume

Ycalc Réponse modélisées

Yexp Réponses expérimentales

ZnSe Séléniure de zinc

μ Micron

μL Microlitre

μm Micromètre

1

Applications des techniques de chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites

secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne

INTRODUCTION

La nature regroupe un nombre important de plantes qui jouent un rôle majeur dans la

vie des humains et des animaux en constituant une source alimentaire, cosmétique et de

médicaments (Cseke et al., 2016). Ces plantes contiennent des métabolites secondaires

responsables de leurs activités biologiques telles que les activités antioxydante, antidiabétique

(Croteau et al., 2000; Crozier et al., 2008; Smith, 2007; Verpoorte and Memelink, 2002) et

microbiologique (Bie et al., 2005; Biradar, 2016; Goly et al., 2015; Julien et al., 2015). L’étude

de la structure moléculaire de quelques substances naturelles a permis d’améliorer leurs

utilisations et de développer de nouvelles voies de leurs usages.

Les métabolites secondaires des plantes sont obtenus par plusieurs méthodes

d’extraction, parmi lesquelles la macération et la décoction (Jones and Kinghorn, 2006;

Stashenko et al., 2004). Ces méthodes d’extraction varient selon l’origine de la substance

naturelle (plante ou animal) et selon leurs utilisations (Starmans and Nijhuis, 1996).

L’extraction des métabolites secondaires des plantes médicinales permet de récupérer de faibles

quantités de substances actives dont la composition dépend du type de méthodes extractives.

Les méthodologies d’extraction méritent d’être explorées en vue d’améliorer le rendement

d’extraction et aussi de fournir une méthodologie simple et efficace à nos populations dans la

confection de médicaments traditionnels améliorés.

Après l’extraction des métabolites secondaires, l’une des étapes de l’étude

phytochimique de ces substances naturelles est la séparation des molécules suivie de

l’identification structurale. Cette identification passe généralement par des screening

phytochimiques qui utilisent une diversité de produits chimiques et réactifs dont l’accessibilité

pose un problème dans nos laboratoires. Il est donc nécessaire d’envisager de nouvelles

méthodes chromatographiques et spectroscopiques d’identification des métabolites

secondaires. C’est dans ce cadre que s’articule notre thèse qui s’intitule : « Application des

techniques de chromatographie et de spectrométrie dans l’identification des métabolites

secondaires de trois plantes antidiabétiques et antihypertensives ivoiriennes ».

L’objectif général de ce travail de thèse est d’appliquer les techniques de

chromatographie et de spectroscopie dans l’identification des métabolites secondaires de trois

plantes antidiabétiques et antihypertensives de la pharmacopée ivoirienne. Il se décline en

quatre objectifs spécifiques qui sont :

KONE KOUWELTON PATRICK 2



- la modélisation et l’optimisation de la méthode extractive des métabolites secondaires de

deux plantes de l’étude dans le but de maximiser leurs rendements d’extraction ;

- l’identification des trois grandes familles de métabolites secondaires à l’aide des techniques

de chromatographie et de spectroscopie ;

- la comparaison des méthodes chromatographiques et spectroscopiques dans l’identification

des trois grandes familles de métabolites secondaires ;

- la détermination structurale de quelques métabolites secondaires de Tridax procumbens

Linn.

Le document se présente comme suit : la première partie est consacrée à la bibliographie

sur les métabolites secondaires, les plantes soumises à l’étude (Alchornea cordifolia,

Phyllanthus amarus et Tridax procumbens), quelques méthodes chromatographiques et

spectroscopiques ainsi que sur la modélisation et l’optimisation. La seconde partie présente le

matériel et les méthodologies utilisées pour réaliser les screening phytochimiques, la

modélisation, l’optimisation, les analyses chromatographique et spectroscopique. La troisième

partie expose les résultats obtenus suivis de leur discussion. Une conclusion achèvera se

document suivi de recommandations et de perspectives.




QUESTIONS DE RECHERCHE

L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) mène un programme de promotion et de

développement des médicaments traditionnels car plus de 80% de la population du tiers-monde

utilisent des plantes pour un usage médicinal. Ce programme vise à établir des inventaires des

pratiques efficaces, à apporter la preuve de l’innocuité, de l’efficacité et de la qualité des

remèdes traditionnels et à entreprendre des recherches appropriées du moment, le marché

mondial des plantes médicinales est en plein essor et l’amélioration des rendements d’extraction

ainsi que l’identification des métabolites secondaires responsables des activités biologiques et

pharmacologiques des plantes demeure un enjeu important. Cette étude vient répondre à

plusieurs questions en adéquation avec la vision de l’OMS. Elles sont les suivantes :

- comment peut-on améliorer les rendements d’extraction des métabolites secondaires

des plantes ?

- existe-t-il d’autres méthodes de criblages des métabolites secondaires des plantes

autres que les tests de coloration et de précipitation ?

- quelle est la composition chimique en familles de métabolites secondaires des

plantes ?

- quelle est la structure des molécules actives et/ou des nouvelles molécules ?

HYPOTHESES

La thématique de ce travail se base sur les hypothèses suivantes :

- Il est possible de trouver les paramètres qui influencent les rendements d’extraction

des métabolites secondaires des plantes ;

- Il est possible d’optimiser les rendements d’extraction des métabolites secondaires

des plantes ;

- les métabolites secondaires des plantes peuvent être identifiés par des méthodes

chromatographiques et spectroscopiques ;

- les structures des métabolites secondaires des plantes peuvent être établies

uniquement par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de

masse.




ORIGINALITE

Cette étude présente des résultats originaux quant à la détermination des paramètres qui

influencent les rendements d’extraction des métabolites secondaires de deux plantes et

l’optimisation de ces rendements. Les méthodes chromatographiques en phase liquide à haute

performance (HPLC) et sur couche mince à haute performance (HPTLC) ainsi que les méthodes

spectroscopiques Infrarouge (IR) et Ultra-Violette (UV) ont été employées avec succès dans

l’identification des famille de métabolites secondaires des plantes. Ces méthodes ont été

comparées entre elles et avec le criblage phytochimique par une analyse de données via des

tableaux croisés dynamiques.

5



PARTIE 1 : BIBLIOGRAPHIE




CHAPITRE I: METABOLITES SECONDAIRES

Les plantes produisent divers composés organiques, dont la grande majorité ne semble

pas participer directement à leurs croissance et développement. Ces substances,

traditionnellement appelées métabolites secondaires, sont souvent distribuées différemment

parmi des groupes taxonomiques limités dans le règne végétal (Hanson, 2003). Ils sont

responsable des activités biologiques des plantes médicinales (Croteau et al., 2000; Hanson,

2003). Sur la base de leurs origines biosynthétiques, les métabolites secondaires des plantes

peuvent être divisés en trois grands groupes : les composés polyphénoliques, les terpénoïdes et

les alcaloïdes (Crozier et al., 2008).

I. COMPOSES POLYPHENOLIQUES

Les composés phénoliques sont caractérisés par au moins un cycle aromatique substitué

par un ou plusieurs groupes hydroxyles. Plus de 8000 structures de composés phénoliques ont

été rapportées dans la littérature et elles sont largement dispersées dans les plantes (Strack et

al., 1992). Ils peuvent être classés en fonction du nombre et de l'agencement de leurs atomes de

carbone et sont communément substitués par des sucres et des acides organiques (Crozier et al.,

2008). Les composés phénoliques peuvent être classés en deux groupes : les flavonoïdes et les

non-flavonoïdes.

I.1. Flavonoïdes

Les flavonoïdes dérivent de la flavone. Les structures des flavonoïdes sont constituées

de deux anneaux de benzène séparés par une unité de propane. Ils sont généralement

hydrosolubles. On les trouve généralement dans les plantes sous forme glycosilées. Les

différentes classes dans le groupe se distinguent par des anneaux hétérocycliques contenant de

l'oxygène et des groupes hydroxyles. Il s'agit notamment des chalcones, des flavones, des

flavonols, des flavanones, des anthocyanines et des isoflavones (figure 1) (Williams and

Grayer, 2004).

Figure 1: Structure générale des flavonoïdes et leur numérotation




I.1.1. Anthocyanes

Les anthocyanes sont des hétérosides oxygénés dont l’aglycone est appelé

anthocyanidine. Les anthocyanes sont des sous classes des flavonoïdes au sens large dont la

structure de base est l’ion flavylium. Ils sont des pigments naturels des feuilles, fruits et pétales.

Ils sont impliqués dans la protection des plantes contre la lumière excessive par l'ombrage des

cellules de la mésophile foliaire et ont également un rôle important dans l’attraction des insectes

pollinisateurs (Crozier et al., 2008). Ils constituent un défi pour les biochimistes en raison de

leurs importantes variations structurales et de la complexité de leurs biosynthèse (Harborne,

2013; Harborne and Williams, 2000). Les anthocyanes sont connues pour leurs activités anti-

inflammatoire, antioxydant (Szymanowska et al., 2015) et cardioprotective (Zhang et al.,

2017). La figure 2 présente une structure d’un anthocyane.

Figure 2: Structure carbonée d'un anthocyane

I.1.2. Flavan-3-ols

Les flavan-3-ols sont une sous classe de flavonoïdes qui se caractérise par leurs

structures reconnaissables par la saturation des liaisons sur le cycle C et la présence d’un

groupement hydroxyle en position 3 de ce cycle (figure 3). Elles ont abordé leur relation avec

les tanins condensés et les aspects de leurs caractéristiques chimiques et spectroscopiques ainsi

que le métabolisme (Haslam, 1982, 1975). Ils sont hydrosolubles. Les flavan-3-ols sont connues

pour leurs propriétés antioxydantes (Li et al., 2016), cytotoxiques (Navarro et al., 2017) et

anticancéreuses (Zhu et al., 2017).




Figure 3: Structure d'un flavan-3-ol

I.1.3. Flavonols

Les flavonols sont des sous-groupes de flavonoïdes possédant un hydroxyle phénolique

en C3 et une fonction carbonyle en C4 (figure 4). Ils sont dispersés dans tout le règne végétal,

à l'exception des champignons et des algues. La répartition et les variations structurales des

flavonols sont très vastes (Fabre et al., 2001; Mollavali et al., 2016). Les flavonols tels que la

myricétine, la quercétine, l'isorhamnétine et le kaempférol sont le plus souvent sous forme de

O-glycosides (Strack et al., 1992). La liaison glycosidique se produit le plus souvent en position

3 du cycle C, mais des substitutions peuvent également se produire en positions 5, 7, 4’, 3’ et

5’ du cycle carbone. (Crozier et al., 1997).

Figure 4: Structure d'un flavonol

I.1.4. Flavones

Les flavones sont des sous familles des flavonoïdes dont la structure est bassée sur la

présence de la fonction carbonyle en C4. Ils ont une structure semblable à celle des flavonols

sans le groupement hydroxyle en C3 (figure 5). Les flavones ont des propriétés antitumorales

(Cabrera et al., 2007).




Figure 5: Structure d'un flavone

I.1.5. Isoflavonoïdes

Les isoflavonoïdes sont des isomères des flavonoïdes. Elles sont caractérisées par le fait

que le cycle B est attaché au cycle C en position 3 plutôt qu'en position C2 (Crozier et al., 2008).

Les isoflavonoïdes possèdent un squelette flavonoïde réarrangé (figure 6). Une variété de

modifications structurelles de ce squelette conduit à une grande classe de composés qui

comprend les isoflavones, les isoflavanones et la roténone. Les isoflavonoïdes sont des

composés spécifiques de la famille des Fabacées (Crout and Geissman, 1969). Ces composés

présentent des activités œstrogénique, insecticide et antifongique (Cornwell, 2004), en plus

d'une activité antifongique (Rivera-Vargas et al., 1993). Cependant certains isoflavonoïdes sont

des poisons puissants.

Figure 6: Structure d'un isoflavone

I.1.6. Flavonoïdes mineurs

Les flavonoïdes mineurs sont généralement constitués de chalcones, d’aurones, de

dihydrochalcones, de flavanones et de dihydroflavonols (Bohm, 1988).

I.1.6.1. Chalcones et dihydrochalcones

Les chalcones et les dihydrochalcones sont des composés C6-C3-C6 qui n'ont pas

d’hétérocyclique central. Les positions sur ces composés, sont identifiées à l'aide d'un système

de numérotation unique à ces groupes (figure 7) (Bohm, 1988). Les dihydrochalcones se




distinguent des chalcones par l’hydrogénation de la double liaison exocyclique en position α et

β (figure 7) (Portet et al., 2007).

Ces composés sont présents en abondance dans les fruits comestibles, les légumes, les

épices, le thé et ont également montré des effets pharmacologiques tels que des activités

anticancéreuses, anti-inflammatoire, antimicrobienne et antioxydante (Gutierrez et al.,

2015)(Chimenti et al., 2009).

Figure 7: Numérotation de la structure des chalcones et dihydrochalcones

I.1.6.2. Aurones

Les aurones sont une sous classes des flavonoïdes dit mineurs. Les aurones sont basées

sur la 2-benzylidenecoumaranone (figure 8). Les positions dans les aurones sont identifiées à

l'aide de nombres pour le cycle B et des nombres primés sur le cycle C ; Les aurones sont à cet

égard des flavonoïdes « normaux ». Des activités anticancéreuses, antiparasitaires, et

antimicrobiennes ont été révélées pour les aurones (Boumendjel, 2003).

Figure 8: Numérotation des aurones

I.1.6.3. Flavanones

Les flavanones sont une sous famille de flavonoïdes qui ont une structure similaire à

celle des flavones mais sans la double liaison entre les carbones 2 et 3 du cycle C (figure 9)

(Lee et al., 2004; Zhishen et al., 1999). C'est la classe qui a plus grand nombre de composés

dans la catégorie des « flavonoïdes mineurs ». Les flavanones sont très réactives et peuvent

subir des réactions d'hydroxylation, de glycosylation et d'O-méthylation. Les flavanones sont




des composants alimentaires présents dans les agrumes. La flavanone glycosylée la plus

courante est l'hespérétine-7-O-rutinoside (hespéridine) qui se trouve dans les écorces d'agrumes

(Crozier et al., 2008).

Figure 9: Structure de base d'une flavanone

I.1.6.4. Dihydroflavonols

Les dihydroflavonols sont une sous classe de flavonoïdes qui ont la même structure que

les flavonols à la différence que la liaison double entre les carbone 2 et 3 est hydrogénée. Les

dihydroflavonols ont deux centres d'asymétrie, en position C-2, C-3, et quatre configurations

(figure 10). La forme la plus commune est de loin (2R, 3R) (Crozier et al., 2008).

Figure 10: Configurations des quatre formes possibles de dihydroflavonols

I.2. Autres composés phénoliques ou non-flavonoïdes

Cette famille constitue une grande classe de composés dans lesquels un groupe

hydroxyle (groupe -OH) est lié à un cycle aromatique. Les non-flavonoïdes principaux sont les

acides phénoliques (C6-C1) (Brielmann et al., 2006; Crozier et al., 2008). La grande majorité

des produits naturels aromatiques de plantes sont des phénols (Brielmann et al., 2006). Nous

présenterons les grandes familles de ces composés phénoliques à savoir, les tanins, les quinones,

les phénols, les phénols éthers, les stilbènes, les phénylpropanoïdes et les phénols simples.




I.2.1. Phénols simples

Les pénols simples sont des composés phénoliques dont la structure est faite d’un phényl

et d’un ou plusieurs groupements hydroxyles (figure 11). Ils sont hydrosolubles. La plupart des

phénols simples sont des monomères des polyphénols et des acides qui composent certains

tissus végétaux, y compris la lignine et la mélanine. L'hydroquinone, le catéchol, l'orcinol et

d'autres phénols simples se trouvent à des concentrations relativement faibles (Buckingham et

al., 2010).

Figure 11: Exemple de structures de quelques phénols simples

I.2.2. Phénols éthers

Les phénols éthers se reconnaissent par leurs structures composées de phényl rattachés

à un ou plusieurs éthers alkyliques. Beaucoup de phénols existent également sous forme

d’éthers méthyliques (figure 12). Le trans-anéthole est principalement responsable du goût et

de l'odeur des graines d'Anis (Pimpinella anisum). L’Apiole, puissant diurétique, est un

constituant majeur de la graine de l'huile essentielle de persil (Petroselinum crispum) (Louli et

al., 2004).

Figure 12: Structures de quelques phénols éthers




I.2.3. Phénylpropanoïdes

Les phénylpropanoïdes contiennent une chaîne latérale à trois carbones attachés à un

phénol. Les exemples courants comprennent les hydroxycoumarines, les phénylpropènes et les

lignanes. Les différents types d'acides hydroxycinnamiques sont constitués des acides caféiques

et coumarique. La coumarine est fréquente pour de nombreuses plantes et est le composé volatil

qui à l'air doux, est libéré du foin nouvellement tondu. Les phénylpropènes sont des composants

importants de nombreuses huiles essentielles et comprennent l'eugénol, principal principe actif

de l'huile de clous de girofle (Eugenia caryophyllata ou Syzygium aromaticum) (Ntamila and

Hassanali, 1976). Les phénylpropènes comprennent également l'anéthole et la myristicine, les

principes actifs de la noix de muscade (Myristica fragrans) (Archer, 1988). Les acides caféïque

et de coumarique sont présents dans les grains de café vert et torréfié (Andrade et al., 1998).

L'umbelliférone et la scopolétine sont des phénylpropanoïdes de la classe des coumarines

connus depuis 1884 et isolés des racines de Scopolia japonica. Le phénylpropène eugénol a été

isolé de plusieurs sources végétales et a été utilisé comme analgésique dentaire (Samuelsson,

1991). La figure donne les structures de quelques phénylpropanoïdes.

Figure 13: Structures de quelques phénylpropanoïdes

I.2.4. Hydroxycinnamates

L'acide cinnamique est un composé C6-C3 qui est converti en une gamme

d'hydroxycinnamates qui, du fait qu'ils sont des produits de la voie phénylpropanoïde, sont

appelés collectivement les phénylpropanoïdes. Les hydroxycinnamates les plus courants sont

les acides p-coumarique, caféique et ferulique qui s'accumulent souvent comme leurs esters de

tartrate, de coutarique, de caftarique et de fertarique respectifs (figure 9). Les formes conjuguées

d'acide quinique, de l'acide caféique, tels que l'acide 3, 4 et 5-O-caféoylquinique, sont des




composés courants des fruits et des légumes. Cet acide est fréquemment appelé acide

chlorogénique, bien que ce terme soit réservé à un groupe entier de composés apparentés. Les

acides chlorogéniques sont présents à 10% des feuilles de grains de café maté vert (Ilex

paraguariensis) et de café robusta vert (graines transformées de Coffea canephora) (Crozier et

al., 2008).

Figure 14: Structures de quelques hydroxycinnamates

I.2.5. Tanins

Les tanins sont des oligomères hydrosolubles, riches en groupes phénoliques, capables

de se lier ou de précipiter des protéines solubles dans l'eau (Hagerman and Butler, 1989). Les

tanins, communs aux plantes vasculaires, existent principalement dans les tissus ligneux, mais




peuvent également être dans les feuilles, les fleurs ou les graines. Les tissus végétaux riches en

tanins ont un goût très amer et sont évités par la plupart des animaux. Les tanins peuvent être

divisés en deux groupes : qui sont les tanins condensés, et tanins hydrolysables. Les tanins

condensés sont formés biosynthétiquement par la condensation des flavanols pour former des

réseaux de polymères. Des exemples de tanins condensés (proanthocyanidines) sont présentés

à la figure 15. Les tanins hydrolysables sont, quant à eux, des esters d'un sucre (habituellement

le glucose) avec un ou plusieurs acides trihydroxybenzène-carboxyliques (acide gallique). Ces

composés donnent des précipités insolubles avec l'albumine, l'amidon ou la gélatine. La

réaction avec les protéines est utilisée industriellement pour convertir les peaux d'animaux en

cuir (bronzage). Des exemples de tanins hydrolysables (figure 15) comprennent la corilagine,

isolée des feuilles de sumac (Rhus spp.) et d'eucalyptus (Eucalyptus spp.) (Buckingham et al.,

2010) ainsi que la géraniine isolé de la géranium (Geranium spp.) et de Phyllanthus spp.

(Buckingham et al., 2010). La corilagine et la géraniine présente une activité anti-

immunodéficience humaine (VIH) en inhibant la transcriptase inverse (Notka et al., 2004).




Figure 15: Structures de quelques tanins




I.2.6. Quinones

Les quinones constituent une série de diènes plutôt que des composés aromatiques

comportant un noyau de benzène sur lequel deux atomes d'hydrogène sont remplacés par deux

atomes d'oxygène formant deux liaisons carbonyles (figure 16). Les quinones sont des

composés phénoliques qui forment généralement des pigments fortement colorés couvrant tout

le spectre visible. Ils se trouvent dans les régions internes de la plante. Elles jouent un rôle

important dans la respiration des plantes. Ils agissent comme des porteurs d'électrons qui

fonctionnent en convertissant les hydroquinones en quinones, agissant ainsi comme des couples

rédox. L'ubiquinone (coenzyme Q) sert spécifiquement de porte-électrons sur la membrane

mitochondriale interne en transférant des électrons afin de compléter une pompe à protons dans

la chaîne respiratoire. Les quinones jouent un rôle clé dans les membranes photosynthétiques.

Une double fonction est attribuée aux plastoquinones car elles agissent à la fois comme agents

d'extinction photochimiques et non photochimiques dans la photosynthèse.

Figure 16: Structures de quelques quinones

I.2.7. Stilbènes

Les stilbènes, de structure commune en C6-C2-C6, avec les deux carbones du milieu

possédant une double liaison. Ils sont des phytoaléxines, produites par les plantes en réponse à

une attaque par des agents pathogènes fongiques, bactériens ou viraux. Le resvératrol est le

stilbène le plus courant. Il se présente sur deux isomère cis et trans dans les tissus végétaux

principalement sous forme de trans-resvératrol-3-O-glucoside (figure 17), connu sous le nom

de piceide ou polydatine. Une famille de polymères de resvératrol (les viniférines) existe

également. Les principales sources de stilbènes sont les raisins, le vin, le soja et les produits de

l'arachide. Le trans-resvératrol et son glucoside se retrouvent dans des quantités

particulièrement élevées dans la plante d'Itadori (Polygonum cuspidatum), également connue

sous le nom de Knotweed japonais (Burns et al., 2002). En Asie, la racine d’Itadori est séchée




et infusée pour produire un thé. Elle est utilisée pendant des siècles au Japon et en Chine comme

remède traditionnel pour de nombreuses maladies, y compris les maladies cardiaques et les

accidents vasculaires cérébraux (Kimura et al., 1985). En effet, le trans-resveratrol peut inhiber

l'oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) au stade initial de la pathogenèse de

l'athérosclérose (Soleas et al., 1997).

Figure 17: Structures de quelques stilbènes

II. LES TERPENES ET TERPENOÏDES

Les terpènes, ou isoprénoïdes, sont l'une des classes les plus diverses de métabolites

secondaires. Leur squelette carboné est constitué d'unités isopréniques reliées, c'est ce que l'on

appelle la règle de l'isoprène. Ces squelettes peuvent être arrangés de façon linéaire ou bien

former des cycles. (Brielmann et al., 2006). Ils sont des arômes et des parfums, des

antibiotiques, des hormones végétales et animales, des lipides membranaires, des attracteurs

d'insectes, des anti alimentaires et des médiateurs des processus essentiels de transport

d'électrons (Crozier et al., 2008). Les terpènes ont été appréciés comme constituants des huiles

essentielles et leur utilisation comme parfums pendant plus de deux mille ans (Van Bergen et

al., 1997). Les terpènes simples trouvés dans les parfums présentent une grande diversité

structurelle. Les terpènes sont constitués des unités fondamentales d'isoprène à cinq atomes de

carbone (Bohlmann et al., 1998). Ainsi, les terpènes peuvent être classés en hémiterpènes (C5),




monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15), diterpènes (C20), sesterpènes (C25), triterpènes

(C30), tétraterpènes (C40).

II.1. Hémiterpènes

Les hémiterpènes (C5) sont constitués d'une unité à cinq atomes de carbone et sont les

plus simples de tous les terpènes. L'isoprène est produit par les feuilles de nombreuses plantes

et contribue à la brume naturelle dans certaines régions (Kang et al., 2001). On distingue de

nombreux composés à cinq atomes de carbone tels que l'alcool isoamylique, l'acide sénécioïque,

l'acide tiglique, l'acide angélique, les acides α et β-furoïques et l'isovaléraldehyde (figure 18).

Ces composés contribuent à la défense des plantes en repoussant les herbivores ou en attirant

des prédateurs et des parasites d'herbivores (Holopainen, 2004a).

Figure 18: Structures de quelques hémiterpènes

II.2. Monoterpènes

Les monoterpènes sont constitués de deux unités d’isoprène (figure 19). Une variété

étonnante d'arrangements de décane à base d'isoprène existe dans la nature (Liao et al., 2003).

Les monoterpènes (C10) sont le principal composant de nombreuses huiles essentielles. Ils ont

une importance économique en tant que saveurs et parfums. Les structures acycliques

comprennent le myrcène, le géraniol et le linalol. Les structures cycliques comprennent de

nombreux composés bien connus, tels que le menthol, le camphre, le pinène et le limonène. La

figure 19 donne les structures de quelques monoterpènes.




Figure 19: Structures de quelques monoterpènes

II.3. Sesquiterpènes

Dérivés de trois unités d'isoprène, les sesquiterpènes (C15) existent sous formes

aliphatiques, bicycliques et tricycliques (Fraga, 2003). Comme les monoterpènes, la plupart des

sesquiterpènes sont des composants des huiles essentielles de plantes. Un composé important

de cette série est le farnesol, qui présente une activité chimiopréventive du cancer (Crowell and

Gould, 2004). Certains des sesquiterpènes couramment rencontrés sont présentés à la figure 20.




Figure 20: Structures de quelques sesquiterpènes

II.4. Diterpènes

Les diterpènes, de structure en quatre (4) unité d’isoprène (C20) sont un groupe très

varié de composés (Hanson, 2004). En raison de leurs points d'ébullition plus élevés, ils ne sont

pas considérés comme constituants des huiles essentielles. Ainsi, ils sont classiquement

considérés comme des résines. Quelques diterpènes usuels sont présentés à la figure 21.




CH3

CH3

CH2 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H

CH3 H

O OH

CH3 OH

CH3 CH3 CH3 CH3

O

O

CH3

O

OH

CH3HH

CH3

p-Camphorène

Acide abiétique

Phytol

Marrubiine

Figure 21: Structures de quelques diterpènes

II.5. Sesterterpènes

Cette famille de terpènes est composée de cinq (5) unités d’isoprène. Ce sont des

composés minoritaires dans la famille des terpènes (Crews and Naylor, 1985; Walker et al.,

1980; Wei et al., 2004). La figure 22 donne un exemple de sesterterpènes.

Figure 22: Structure d'un sesterterpène




II.6. Triterpènes

Les terpènes de structure carbone en C30 sont basés sur six unités d'isoprène et sont

dérivés biosynthétiquement du squalène (Connolly and Hill, 2005). Ils sont souvent des

matières solides incolores à haut point de fusion et sont largement répartis entre les résines

végétales, le liège et les cutines. Il existe plusieurs groupes importants de triterpènes, parmi

lesquels les triterpènes simples, les stéroïdes, les saponines et les glycosides cardiaques. Parmi

ceux-ci se trouve l’azadirachtine (Schmutterer, 1988), issu des graines du neem (Azadirachta

indica). Il a été isolé pour la première fois en 1985 à partir de l'huile de neem. Seuls quelques-

uns des triterpènes communs sont largement répartis entre les plantes. Il s'agit notamment des

amyrines (Boar and Allen, 1973) et des acides uranique et oléanique (Liu, 1995), qui sont

communs dans les cires issues des feuilles et de la peau de certains fruits. D'autres triterpènes

comprennent les limonines et les cucurbitacines, considérés comme des antagonistes puissants

des hormones stéroïdes d'insectes (Miro, 1995). Quelques triterpènes sont présentés à la figure

23.




Figure 23: Structures de quelques triterpènes

II.6.1. Stérols

Un stérol est un lipide possédant un noyau de stérane dont le carbone 3 est porteur d'un

groupe hydroxyle (figure 24). Pratiquement tous les stéroïdes végétaux sont hydroxylés en C-3




et sont en fait des stérols. Dans le règne animal, les stéroïdes ont une importance profonde

comme hormones, coenzymes et provitamines. Cependant, le rôle des phytostérols est moins

bien compris. Il est prouvé que certains des phytostérols sont efficaces contre les maladies

cardiovasculaires (Kris-Etherton et al., 2002).

Figure 24: Schéma de base et numérotation des stérols

II.6.2. Saponins

Les saponines sont constituées de six unités d'isoprène et sont également dérivées du

squalène. Les saponines sont des glycosides triterpéniques de poids moléculaire élevé,

contenant un glycoside attaché à un stérol ou à d'autres triterpènes. Ils sont largement distribués

dans les plantes et se composent de deux parties : la glycone (sucre) et l'aglycone ou le génine

(triterpène) (Woitke et al., 1970). Typiquement, ils ont des propriétés détergentes, forment

facilement des mousses dans l'eau. Ils ont également un goût amer et sont piscicides (toxiques

pour les poissons). Beaucoup de plantes contenant des saponines ont été historiquement

utilisées comme savons. Il s'agit notamment des savons de racine de Chlorogalum

pomeridianum, d’écorce de Quillaja saponaria, de baie Sapindus saponaria et de noix de

Sapindus mukurossi (Hostettmann and Marston, 2005, 1995). Les aglycones peuvent être de la

classe des alcaloïdes triterpènes ou des stéroïdes. Les saponines peuvent être mono- ou

polydesmodiques, selon le nombre de fragments de sucre attachés. De nombreuses cyclases

enzymatiques impliqués dans leur biosynthèse ont été récemment déterminés (Haralampidis et

al., 2002). Deux saponines représentatives sont présentées à la figure 25.




Figure 25: Structures de deux saponines

II.7. Tétraterpènes

Les tétraterpènes les plus courants sont les caroténoïdes (Britton, 1995), un groupe

largement distribué de composés dont la chaine carbonée est en C40. Les caroténoïdes sont

généralement dérivés du lycopène. La cyclisation à une extrémité donne un γ-carotène et celle

aux deux extrémités fournit du β-carotène. Ce pigment a été isolé pour la première fois en 1831.

Il est pratiquement universel dans les feuilles des plantes supérieures. Comme le montre la

structure du polyène, de nombreux isomères sont possibles pour ces structures de base, qui

peuvent tous fournir des pigments aux couleurs vives. Dans les plantes, les caroténoïdes servent

de pigments nécessaires à la photosynthèse, où ils sont censés protéger les plantes contre la

suroxydation catalysée par d'autres pigments absorbant la lumière, comme les chlorophylles.




Ils sont également responsables des couleurs variant du jaune au rouge dans les fleurs et les

fruits. Cette coloration attire les pollinisateurs (fleurs) et sert de source d'aliments pour les

herbivores, aidant ainsi à la dispersion des graines. Les tétraterpènes sélectionnés sont présentés

à la figure 26.

Figure 26: Structures de quelques tétraterpènes

III. ALCALOÏDES

Les alcaloïdes sont un groupe diversifié de composés à faibles poids moléculaires,

contenant de l'azote dérivés principalement d'acides aminés et trouvés dans environ 20% des




espèces végétales (Roberts, 2013). Ce sont des bases contenant de l'azote qui forment des sels

avec des acides. Cette capacité à former des sels et à complexer des ions métalliques a aidé leur

séparation et leur détection à l'époque avant la chromatographie (Hanson, 2003). Les alcaloïdes

jouent un rôle défensif dans la plante contre les herbivores et les agents pathogènes. En raison

de leurs activités biologiques puissantes, bon nombre d’alcaloïdes connus ont été exploités

comme produits pharmaceutiques, stimulants, narcotiques et poisons (Wink, 1998). Les

alcaloïdes sont généralement regroupés sur la base du système cyclique présent. Plusieurs

systèmes cycliques communs, tels que les systèmes indolizidine, quinolozidine (Michael,

2003a, 2003b), quinoléine, quinazoline et acridones (Michael, 2004a, 2004b) ont été étudiées,

(Herbert, 2003). Beaucoup d'alcaloïdes dérivent directement des acides aminés aromatiques, de

la phénylalanine, de la tyrosine et du tryptophane. Un échantillonnage des classes d'alcaloïdes

est illustré à la figure 27.

Figure 27: Structures de quelques alcaloïdes

Conclusion partielle

Les métabolites secondaires peuvent être scindés en trois grands groupes : les alcaloïdes,

les terpènes et les composés phénoliques. Ils représentent une partie importante des substances

naturelles non seulement en nombre mais aussi par les activités biologiques et

pharmacologiques qu’ils confèrent aux plantes dans lesquelles ils se trouvent.




CHAPITRE II: PLANTES DE L’ETUDE

I. ALCHORNEA CORDIFOLIA

Introduction

La médecine traditionnelle africaine utilise de nombreuses plantes qui constituent une

source énorme de molécules bioactives capables de traiter plusieurs maladies. Ces plantes

médicinales sont donc un domaine qui mérite d'être exploré pour leur grande diversité de

molécules chimiques (Tra Bi et al., 2008). Ce paragraphe aborde quelques études antérieures

menées sur Alchornea cordifolia, en termes d'activités pharmacologiques et de compositions

chimiques.

Dans les lignes suivantes, il s’agira de décrire la plante, puis de donner son origine

géographique et ses propriétés pharmacologiques pour enfin faire un état des lieux de sa

composition chimique.

I.1. Description

Alchornea cordifolia est un Euphorbiacée, observée principalement en Afrique

subsaharienne. C'est un arbuste stérilisant, ramifié à la laisse, à feuilles persistantes ou petit

arbre jusqu'à 8 m de haut ; Les jeunes pousses se dressent, devenant plus tard horizontales,

creuses, glabres (Mavar-Manga et al., 2007).

Figure 28: Photographie de Alchornea cordifolia

Source (http://www.westafricanplants.senckenberg.de)

Photographe: Philippe Birnbaum; Date: 25-01-2005 10:05:00

http://www.westafricanplants.senckenberg.de/




I.2. Origine géographique

Alchornea cordifolia a été identifiée dans plusieurs pays, qui peuvent se résumer

essentiellement à la zone située entre les tropiques de l’Afrique. À partir de l'est du Sénégal au

Kenya (y compris la Côte d’Ivoire), on l'a également retrouvé en Tanzanie et en Afrique centrale

; Il est même cultivé au Congo pour ses vertus médicinales.

I.3. Propriétés pharmacologiques

De nombreuses propriétés pharmacologiques ont été démontrées sur des extraits

d’Alchornea cordifolia. Elles peuvent être différentes en fonction de l’organe de la plante et de

la nature de l’extrait ou de la fraction.

Les feuilles de A. cordifolia constituent l'organe le plus étudié de la plante. Elles

contiennent une grande variété de métabolites secondaires et possèdent de nombreuses

propriétés pharmacologiques en fonction du solvant d'extraction.

L’extrait à l’hexane possède des activités antibactériennes, antimicrobiennes et anti-

inflammatoires (Adeshina et al., 2012).

L'extrait au chloroforme présente des activités antiplasmodiques (Banzouzi et al., 2002),

antimicrobiennes (George et al., 2010; Owosini et al., 2015), antibactériennes (Noundou et al.,

2016), antifongiques et hépatoprotectives (Osadebe et al., 2012).

L'extrait à l'éther de pétrole a une activité antisplasmodique (Banzouzi et al., 2002) alors

que celui obtenu avec le butanol est antimicrobien (George et al., 2010).

L'extrait à l'éthanol a des effets anti-diarrhéiques (Agbor et al., 2004), antiplasmodiques

(Banzouzi et al., 2002), anti-diabétiques (Eliakim-Ikechukwu and Obri, 2009; Eliakim-

Ikechukwu and Riman, 2009), antimicrobiens, antibactériens (Okwu and Ukanwa, 2010),

hépatoprotecteurs (Olaleye et al., 2006), antioxydants, et anti-inflammatoires (Okoye et al.,

2011).

L’extrait méthanolique des feuilles possède des activités antimicrobiennes, anti-

bactérien et anti-inflammatoire in vivo. Ce extrait est utilisé comme un adjuvant

immunostimulant in vitro pour les vaccins (Ebi, 2001).

L'extrait aqueux d'Alchornea cordifolia est considéré comme un suppléments

nutritionnels pour les animaux (Alikwe, 2014); Il a également une activité anxiolytique

(Kamenan et al., 2013), immunomodulatrice (Kouakou et al., 2013), et anti-stress




anticonvulsivante (Umukoro and Aladeokin, 2010), Il a également des effets sur l'élastase et

l'anion superoxyde (Kouakou-Siransy et al., 2010).

Les propriétés anti-arthritiques (Adeneye et al., 2014), antihypertensives (Eliakim-

Ikechukwu and Riman, 2009), antibiotiques in vivo (Igbeneghu et al., 2007), et antidépresseur

(Ishola et al., 2014; Okeke et al., 1999) ont été mis en évidence dans l'extrait éthanolique.

L'extrait à l'acétate d'éthyle a des activités antimicrobiennes (George et al., 2010) et

antibactériennes (Noundou et al., 2016). Il a également un effet sur l'élimination des anions

superoxydes (Kouakou-Siransy et al., 2010) et possède des propriétés hépatoprotectives

(Osadebe et al., 2012).

L’écorce des plantes sont communément utilisé pour des besoins thérapeutiques.

Alchornea cordifolia n'échappe pas à cette règle. Les extraits à l’hexane, à l’acétone et à

l’acétate d’éthyle ont une activité antibactérienne (Ajali, 2000; Noundou et al., 2016) Les

extraits à l'éthanol et au méthanol sont antibactériens (Ajali, 2000) et antimicrobien (Ebi, 2001;

Mambe et al., 2016; Noundou et al., 2016; Owosini et al., 2015). L'extrait au chloroforme est

antibactérien, antimicrobien et antifongique (Noundou et al., 2016; Owosini et al., 2015).

Les études pharmacologiques des racines sont rares parce que la plupart du temps il faut

détruire l'arbuste. Toutefois, l’étude menée à ce jour, montre que l'extrait au méthanol est

antimicrobien et antibactérien (Ebi, 2001; Mambe et al., 2016).

L’extrait aqueux des graines a montré une activité antipaludique (Ayisi et al., 2011). La

pulpe de la graine est utilisée comme apport nutritionnel dans l'alimentation des poulets de chair

(Emenalom et al., 2012).

I.4. Etudes phytochimiques réalisées

Les différentes activités pharmacologiques observées sur Alchornea cordifolia sont dues

à des molécules bioactives qu'elle contient.

I.4.1. Feuilles

L'analyse phytochimique de l’extrait à l’hexane révèle la présence de tanins,

d'alcaloïdes, de flavonoïdes et de phénols. Les composés anti-inflammatoires isolés à partir de

cet extrait sont l'eugénol, le cadinol, la nanocosaine, les dérivés de stéroïdes, l'iso-allocholate

d'éthyle et le 3-acétoxy-7,8-époxylanostane-1-ol (Adeshina et al., 2012; George et al., 2010;

Okoye et al., 2011).




L’extrait à l’éthanol contient de nombreux métabolites secondaires. Le criblage

phytochimique révèle la présence d'alcaloïdes, de tanins, de saponines, de flavonoïdes, de

phénol, d'anthraquinone et de glycosides. Plusieurs composés tels que l’acide ellagique, la 5-

méthyl 4 '-propenoxy anthocyanidines 7-O-D - diglucopyranoside et des triterpénoïdes ont été

isolés dans cet extrait (Agbor et al., 2004; Banzouzi et al., 2002; Eliakim-Ikechukwu and

Riman, 2009; George et al., 2010; Noundou et al., 2016; Okwu and Ukanwa, 2010; Olaleye et

al., 2006; Osadebe et al., 2012; Owosini et al., 2015).

L'extrait au méthanol des feuilles contient des polyphénols, des tanins, des triterpènes,

des stérols, des alcaloïdes, des flavonoïdes et des saponines (Osadebe and Okoye, 2003). Les

composés isolés sont l’acide gallique, l’acide protocatéchique, la quécertine arabinose,

galactose-O-glycoside, la triosopentényl guanidine hyperoside, la quercitrine, le daucostérol,

l’acide acétylérolitolique, N1, N2-diisopentényl gaunidine, la N1, N2, N3-triisopentényl

guanidine, la β-sistérol et le phtalate de di-2-éthylhexyle (Ebi, 2001; Lamikanra et al., 1990;

Mambe et al., 2016; Manga et al., 2004; Mavar-Manga et al., 2008; Noundou et al., 2016;

Nworu et al., 2010; Osadebe et al., 2012; Osadebe and Okoye, 2003; Owosini et al., 2015).

Cinq composés ont été isolés de l’extrait à l’acétate d’éthyle, à savoir la quécèrtine, la

myricétine-3-glucopyranoside, la myricétine-3-rhamnopyranoside et la proanthocyanidine

(George et al., 2010; Kouakou-Siransy et al., 2010; Noundou et al., 2016; Osadebe et al., 2012).

I.4.2. Tige

Sept composés et responsables de l'activité antimicrobienne ont été isolé. Il s’agit de

stigmastérol, le stigmasta-4,22-dien-3-one; la friedeline; le friedelane-3-one-28-al; l’acide 3-O-

acétyl-aleuritolique; le 3-O-acétyl-érythrodiol et le méthyl-3,4,5-trihydroxybenzoate (gallate de

méthyle) (Noundou et al., 2016). En ce qui concerne la composition phytochimique de l'écorce

d'Alchornea cordifolia, il existe une présence d'alcaloïdes, de flavonoïdes, de saponines, de

glycosides stéréoïdes, de terpénoïdes et de tanins dans l'extrait à l'acétone (Ajali, 2000),

d'alcaloïdes, de flavonoïdes, de saponines, de glycosides stéréoïdiens, de terpénoïdes et de

tanins dans l'extrait éthanolique (Ajali, 2000; Owosini et al., 2015). Des polyphénols, des

tanins, des triterpènes et des stérols ont été identifiés dans l'extrait au méthanol (Ajali, 2000;

Ebi, 2001; Mambe et al., 2016; Noundou et al., 2016). Les flavonoïdes, des terpénoïdes et des




saponines ont été isolé également dans l'extrait à l’éther de pétrole (Ajali, 2000; Owosini et al.,

2015).

I.4.3. Racines

Le criblage phytochimique des racines a montré la présence de polyphénol, de tanin, de

triterpènes et de stérols (Ebi, 2001; Mambe et al., 2016).

I.4.4. Graine

L'acide alchornoique a été isolé et identifié de l’extrait à l'éther de pétrole des graines

(Kleiman et al., 1977).

Le tableau 1 énumère quelques molécules isolées de cette plante ainsi que les activités

biologiques qui leur sont assignées.




Tableau 1: Listes des molécules déjà isolées dans Alchornea cordifolia

Nom commun Organe Activité biologique Bibliographie

La quercétine Plante

entière,

feuille

Relaxation musculaire

lisse, activité

antibactérienne

Ogungbamila et al

1990, Lamikanra et al

1990

Di (2-éthylhexyle) phtalate Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2008

Acide anthranilique Les

racines

Non déterminé Correia et al 1962

5-Methyl 4'-propenoxy

anthocyannidines 7-O-β-D-

diglucopyranoside

Feuille Activité

antibactérienne

Okwu et al 2010

(E) -bicyclo [10.8.0]

eicosane

Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011

Acide gallique Plante

entière,

feuille


lisse, activité

antibactérienne

Ogungbamila et al

1990, Lamikanra et al

1990

Stigmasta-4,22-dién-3-one Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

Guaijavérine Plante

entière


lisse

Ogungbamila et al

1990

N1, N2-diisopentényl

guanidine

Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire et

cytotoxique

Mavar-manga et al

2008

N1, N2, N3-triisopentényl

guanidine

Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire, activité

cytotoxique

Mavar-manga et al

2008

Triisopentyl gaunidine Feuille Activité

antibactérienne

Lamikanra et al 1990

Acide 3-O-acétyl-

aleuritolique

Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

Acide acétyl-érolitolique Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2008

Acétate de 11-tétradécyn-1-

ol

Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011

Daucostérol Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2008

L'acide ellagique Plante

entière


lisse

Ogungbamila et al

1990

Hypérine Plante

entière


lisse

Ogungbamila et al

1990

Hypéroside Feuille Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2004




Acide génique les racines Non déterminé Correia et al 1962

Quercitrine Feuille Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2004

Friedeline Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

(+) Acide cis-14,15-époxy-

cis-11-eicosénoïque

(alchornoic)

Graine Non déterminé Kleiman et al 1977

3-O-acétyl-érythrodiol Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

Hexadécyl-oxirane Feuille Activité de balayage Onocha et al 2011

β-sitostérol Feuilles et

racines

Activité anti-

inflammatoire

Mavar-manga et al

2008

Stigmastolaire Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

Galate de méthyle Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

Acide protocatéchique Feuille Activité

antibactérienne

Lamikanra et al 1990

Friedélane-3-one-28-al Tige Activité

antibactérienne

Noundou et al 2016

II. PHYLLANTHUS AMARUS

Introduction

Les plantes appartenant au genre Phyllanthus (Euphorbiaceae) sont largement

distribuées dans la plupart des pays tropicaux et subtropicaux. Linnaeus a décrit ce genre pour

la première fois en 1737. Il s'agit d'un très grand genre d'environ 550 à 750 espèces qui est

subdivisé en 11 sous-genres, qui sont Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Conani,

Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus , Ericocus et Phyllanthus (Calixto

et al., 1998). Les études sur Phyllanthus amarus ont été publié dans la majorité des revues

phytochimiques, pharmacologiques ou ethno-botaniques avec différents noms tel que

Phyllanthus niruri (Patel et al., 2011).

Dans ce paragraphe, il s’agira donc de faire une description de la plante, ensuite de

donner son origine géographique, puis enfin d’énumérer ses propriétés pharmacologiques et les

études phytochimiques déjà réalisées.




Figure 29: Phyllanthus amarus

II.1. Description botanique

Phyllanthus amarus est une herbe annuelle érigées de 10 à 60 cm de hauteur. Sa tige

principale est simple ou ramifiée. Les feuilles ont une dimension de 3-11 × 1.5-6 mm et une

forme ovales elliptiques, oblongues. Les fleurs possèdent 2 à 3 axes proximaux avec des

cymbales unisexuelles, chacune comprenant 1 mâle et 1 femelle ou 2 à 3 mâles et femelle ou 1

fleur masculine et 2 femelle ou une combinaison de celles-ci (Mitra and Jain, 1985). Les

capsules de graines sur les tiges ont une longueur de 1 à 2 mm, et sont rondes, lisses,et large de

2 mm, avec en moyenne six graines à l’intérieur. Lorsque les fruits éclatent, les graines sont

lancées. Les graines sont triangulaires, de couleur marron clair, de longueur moyenne 1 mm et

avec 5 à 6 côtes à l'arrière (Morton and others, 1981; Wessels Boer et al., 1976).

II.2. Origine géographique

Le genre Phyllanthus se compose d'environ 750 espèces dans 300 genres, (Webster,

1994). De nombreuses espèces de cette famille sont originaires de l'Amérique (Unander et al.,

1995). Le nom « Phyllanthus » signifie « feuille et fleur » parce que la fleur se confond aux

fruit et aux feuilles (Cabieses, 1993). La révision taxonomique sur ce genre par Webster

comprenait des genres étroitement liés à Phyllanthus amarus, sous la sous-section Swartiziani

de la section Phyllanthus. La nomenclature, la spécificité taxonomique et les proches parents




de Phyllanthus amarus ont été abordés en détail en fonction de la morphologie et de la

répartition géographique (Chaudhary and Rao, 2002). Elle est liée à Phyllanthus abnormis, qui

est endémique des zones sablonneuses du Texas et de la Floride au sud des États-Unis. Il est

donc très probable que Phyllanthus Amarus soit originaire de la région des Caraïbes comme

une espèce indirecte de Phyllanthus abnormis du sud des États-Unis et s'est répandue dans les

régions tropicales (Webster, 1957).

II.3. Propriétés pharmacologiques

L'activité antiamnésique de l'extrait aqueux de feuilles et de tiges de Phyllanthus amarus

a été évalué sur les fonctions cognitives et l'activité de souris mâles albinos suisses. Phyllanthus

amarus (50, 100 et 200 mg.kg-1) a produit une amélioration dose-dépendante dans les scores de

mémoire de souris jeunes et plus âgés. Elle a également inversé avec succès l'amnésie induite

par la scopolamine (0,4 mg.kg-1, i.p.) et le diazépame (1 mg.kg-1, i.p.) et l'activité du

cholinestérase cérébrale a également été réduite. Le piracétame 400 mg.kg-1, i.p. a été utilisé

comme contrôle positif (Joshi and Parle, 2007). Le 6-gingérol et la phyllanthine isolés de

Phyllanthus amarus ont montré une activité nootropique (augmentation de la mémoire). Ces

deux composés ont augmenté de manière significative les latences retardées chez les souris

âgées, et ont considérablement diminué l'activité de l'acétyle cholinestérase dans le cerveau

entier (Joshi and Parle, 2006).

Des extraits à l'hexane, au méthanol et à l'eau de parties aériennes de Phyllanthus

amarus ont été criblés pour des activités antimicrobiennes contre Bacillus subtilis, Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus et Candida albicans

en utilisant le protocole de diffusion d'agarcup. Les extraits aqueux et méthanoliques de

Phyllanthus amarus ont été actifs contre tous les microorganismes testés. L'extrait

méthanolique de Phyllanthus amarus a également montré un large spectre d'activité avec une

concentration inhibitrice minimale de 1,56 mg.mL-1 contre tous les microorganismes d'essai

(Alli et al., 2011). Les extraits méthanoliques à 80% obtenus à partir de sept genres de

Phyllanthus ont été évalués pour une activité antibactérienne en utilisant le dosage de

microdilution au bouillon. La meilleure activité antibactérienne a été obtenue pour Phyllanthus

amarus contre Staphylococcus aureus (gram-positif) avec une valeur de MIC de 17,7 g.mL-1

(Eldeen et al., 2011). L'activité antibactérienne des extraits éthanoliques des racines des feuilles

de Phyllanthus amarus a été évaluée contre Escherichia coli isolée à partir des échantillons de




selles de patients séropositifs au VIH avec ou sans diarrhée à l'aide de la méthode de diffusion

de disque Bauer. Les souches isolées des deux patients séropositifs contre le VIH étaient

sensibles à diverses concentrations des extraits (5, 10, 20, 40 et 80 mg.mL-1). Les zones

moyennes d'inhibition des extraits de racine variaient de 8,0 ± 0,33 à 25,0 ± 1,50 mm contre E.

coli tandis que les zones moyennes d'inhibition des extraits de feuilles variaient de 8,0 ± 0,50 à

26,0 ± 1,00 mm contre E. coli.

La cytotoxicité des extraits bruts (aqueux et au méthanol) Phyllanthus amarus ont été

criblées en utilisant le MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-

sulfophényl)-2H-tétrazolium). Il a été démontré que ces extraits et fractions inhibaient la

croissance des cellules MCF-7 (carcinome mammaire) et A549 (carcinome pulmonaire) avec

des valeurs de IC50 allant de 56 à 126 g.ml-1 et 150 à 240 g.ml-1 pour des extraits au méthanol

et aqueux respectivement. En comparaison, ils ont une toxicité plus faible sur les cellules

normales avec une viabilité cellulaire de 50% lorsqu'ils sont traités jusqu'à 1000 g.ml-1 pour les

extraits aqueux et au méthanol. Après avoir déterminé la dose efficace non toxique, plusieurs

tests d'antimétastase ont été réalisés et les extraits de Phyllanthus amarus ont permis de réduire

efficacement l'invasion, la migration et l'adhésion des cellules MCF-7 et A549. Ceci a été suivi

d'une évaluation des modes possibles de mort cellulaire qui ont eu lieu avec l'activité

antimétastatique. La capacité de Phyllanthus amarus à exercer des activités antimétastatiques

est principalement associée à la présence de composés polyphénoliques dans ses extraits (Lee

et al., 2011). L'extrait au méthanol de racines capillaires de Phyllanthus amarus a révélé une

activité antiproliférative puissante dans les cellules MCF-7 par induction de l'apoptose médiée

par l'augmentation des espèces d'oxygène réactif intracellulaire (ROS) associée à une

diminution du potentiel de la membrane mitochondriale (Abhyankar et al., 2010).

L'administration orale d'éthanol absolu (1 mL par 200 g de poids corporel) a permis

d'étudier des bandes rouges, allongées et rougeâtres d'érosions hémorragiques dans la muqueuse

gastrique du rat. Le groupe de contrôle de l'éthanol avait l'indice d'ulcère le plus élevé de 45,20

± 2,39. L'extrait aqueux de feuilles Phyllanthus amarus laisse et la cimétidine inhibent de

manière significative (p <0,001) l'ulcération de 59,3 et 41,2% respectivement. L'extrait à

l'acétone a donné un pourcentage d’inhibition de l'ulcère dépendant de la dose. Le plus faible

dosage de l'extrait aqueux a eu une inhibition plus élevée de l'ulcère (Shokunbi and Odetola,

2008). Les extraits au méthanol de feuilles et tiges de Phyllanthus amarus aux doses de 50, 200

et 1000 mg.kg-1 de poids corporel po, chez les rats Wistar mâles adultes inhibent de manière




significative les lésions gastriques induite par l'administration intragastrique d'éthanol absolu

(8 mL.kg-1 de corps poids). La mortalité, l'augmentation du poids de l'estomac, l'indice d'ulcère

et les saignements intraluminaux ont été significativement diminués par les extraits au méthanol

des feuilles et tige de Phyllanthus amarus. L'analyse biochimique a indiqué que la réduction de

la GSH de la muqueuse gastrique produite par l'administration de l'éthanol était

significativement élevée par un traitement avec à l’extrait au méthanol des feuilles et tige de

Phyllanthus amarus (Raphael and Kuttan, 2003). Les doses graduées de l'extrait aqueux des

feuilles et tige Phyllanthus amarus (100-800 mg.kg-1) ont été administrées par voie orale et ont

induit l’inhibition du transit intestinal le plus élevé de 31,65% avec 400 mg/kg chez des souris.

Dans la diarrhée induite par l'huile de ricin chez la souris, l'extrait aqueux de feuilles et

tige Phyllanthus amarus (400 mg.kg-1) a retardé l'apparition de la diarrhée et réduit la fréquence

de défécation. En outre, les activités de certaines enzymes de la muqueuse intestinale (maltase,

sucrase, lactase et phosphatase alcaline) chez les souris prétraitées avec de cet extrait avant la

prise de l'huile de ricin n'ont pas été aussi fortement affectées que celles chez les souris traitées

à l'huile de ricin (témoin) (Odetola and Akojenu, 2000).

L'effet de la nor-sécurinine, un alcaloïde isolé de Phyllanthus amarus, a été étudié contre

la germination des spores de certains champignons (Alternaria brassicae, Alternaria solani,

Curvularia pennisetti, Curvularia sp., Erysiphe pisi, Helminthosporium frumentacei) ainsi que

l'oïdium du pois (E. pisi) dans des conditions de serre. La sensibilité des champignons à la nor-

sécurinine variait considérablement et cette molécule était efficace contre la plupart des

champignons. H. frumentacei était la plus sensible même à la plus faible concentration (1000

g.mL-1). Les conidies d'E. pisi ont également été inhibées dans la formation partielle ou totale

d'appressorium. La pré-inoculation a montré une plus grande efficacité que la post-inoculation

dans l'inhibition du développement de la moisissure en poule dans une serre. Une inhibition

maximale s'est produite à 2000 g.mL-1 (Sahni et al., 2005). L'essai biologique antifongique en

termes de réduction de poids, de diamètre de colonie et de sporulation de la colonie fongique

ciblée a été effectué à l'aide de la méthode de dilution du bouillon. La fraction au chloroforme

de la partie aérienne de la Phyllanthus amarus a montré un effet inhibiteur important contre les

champignons dermatophytiques M. gypseum (Agrawal et al., 2004).

L'extrait aqueux de feuilles de Phyllanthus amarus a été étudié pour ses activités

analgésiques et anti-inflammatoires utilisant à la fois des modèles thermiques et chimiques

d'évaluation de la douleur chez les rats. Cet extrait (200 mg.kg-1) a provoqué une importante




inhibition de 70,20% de l'œdème de la patte, induite par la carraghénine chez les rats, plus

élevée que celle du médicament de référence (acide acétylsalicylique). Cet extrait a également

produit une activité analgésique marquée en inhibant à la fois les phases rapides et tardives du

stimulus de la douleur des pattes induites par la formol chez les rats Licking et aussi une

augmentation significative et associée à la dose dans l'inhibition de la durée moyenne

d'immersion de la queue à une température variable du bain d'eau (50, 55 et 60°C) (Iranloye et

al., 2011).

Les effets de l'extrait au méthanol à 75% de la plante entière de Phyllanthus amarus sur

différentes phases de l'inflammation ont été réalisés sur un œdème de patte induite par des

agents phlogistiques différents, une inflammation de la poche d'air induite par la carraghénine

et un granulome de granulés de coton chez des rats Wistar mâles. L’extrait au méthanol à une

dose de 250 mg.kg-1 de poids corporel inhibe de manière significative l'œdème de la patte

induite par la carraghénine, la bradicine, la sérotonine et la prostaglandine E1, mais n'a pas

réussi à inhiber l'œdème de la patte induite par l'histamine (Mahat and Patil, 2007).

L'activité antioxydante de l'extrait aqueux de la plante entière de Phyllanthus amarus à

la dose de 200 mg.kg-1 de poids corporel/jour a été évaluée chez les rats Wistar albinos induits

par la streptozotocine (Karuna et al., 2011). Cet extrait a montré un potentiel significatif (p

<0,05) dans le balayage des radicaux libres et dans l'inhibition de la peroxydation lipidique. En

outre, cet extrait s'est avéré contenir une teneur élevée en composés phénoliques qui ont eu des

corrélations positives fortes et significatives (p <0,05) avec le potentiel de balayage des

radicaux libres, la capacité d'inhibition de la peroxydation des lipides et l'efficacité cyto-

protectrice contre les dommages cellulaires oxydatifs induits par le chrome VI (Guha et al.,

2010).

II.4. Études phytochimiques

Les métabolites secondaires présents chez Phyllanthus amarus sont les alcaloïdes, les

flavonoïdes, les tanins hydrolysables (Ellagitanins), les lignanes majeurs, les polyphénols, les

triterpènes, les stérols et les composés volatiles de l’huile. Les lignanes isolés de la plante

entière sont la phyllanthine, l’hypophyllanthine, la nirurine, la niranthine, la phyltétraline, la

nirtétraline (A. M. Maciel et al., 2007; Chevallier, 2000; Huang et al., 2003; Kassuya et al.,

2006; Morton and al, 1981; Singh et al., 2009; Srivastava et al., 2008). Les flavonoïdes isolés




de la plante entière sont la quercétine, la quercétrine, la rutine, la gallocatéchine, la

phyllanthusiine, le kaempférol (Foo, 1993; Foo and Wong, 1992; Londhe et al., 2008; Morton

and others, 1981). Les Ellagitanins, la géraniine, l’amariine, la furosine, l’acide gélaniinique,

l’acide amariinique, l’amandine, l’acide répandusinique, la corilagine, l’isocorilagine,

l’élaéocarpusine, la phyllanthine D, l’acide gallique, l’acide répandusinique A ont également

été isolés de la plante entière (Foo, 1995, 1993; Foo and Wong, 1992). Les triterpènes isolés de

la plante entière sont le phyllanthénol, la phyllanthénone, le phytllanthéol (A. M. Maciel et al.,

2007; Foo and Wong, 1992). Les alcaloïdes isolés de la plante entière sont la sécurinine, la

dihydrosécurinine, la tétrahydrosécurinine, la sécurinol, la phyllanthine, l’allosécurine, la nor-

sécurinine, l’épibubbialine, l’isobubbialine, la 4-méthoxy dihydrosécurinine, la 4-

méthoxytétrahydrosécurinine et la 4-hydrosécurinine (Foo and Wong, 1992; Houghton et al.,

1996; Kassuya et al., 2006). Les stérols tels que l’amarostérol-A, l’amarostérol-B ont également

été isolés de la plante entière (Ahmad and Alam, 2003). L’huile essentielle de la partie aérienne

de la plante contient du linalool, et un phytol (Moronkola et al., 2009).

III. TRIDAX PROCUMBENS

Introduction

Tridax procumbens Linn appartient à la famille des Compositae communément appelée

«Ghamra» en raison de l'apparence de fleurs (Bhagwat et al., 2008). Elle est connue comme

mauvaise herbe, et a été l’objet de plusieurs études. Elle est utilisée dans la médecine

traditionnelle ivoirienne pour ses propriétés antihypertensives et antidiabétiques (Tra Bi et al.,

2008).

Tridax procumbens est la troisième plante de notre étude. Le paragraphe suivant revèlera

sa description botanique, sa biogéographie, ses études phytochimiques et quelques activités

pharmacologiques.




Figure 30: Tridax procumbens

III.1. Description botanique

Tridax procumbens porte des marguerites comme des fleurs blanches ou jaunes centrées

sur le jaune avec des fleurs de rayons à trois dents. Les feuilles sont dentées et généralement en

forme de flèche. Son fruit est un aquarium acharné recouvert de poils rigides et d'une plume,

d’un panache comme une aigrette blanche à une extrémité. Le cristallin est représenté par des

écailles ou réduit à aigrette. La plante est envahissante en partie parce qu'elle produit jusqu'à

1500 aquènes par plante, et chaque aquène peut, de par son aigrette, être porté à distance par le

vent. Cette herbe peut être trouvée dans les champs, les prairies, les terres cultivées, les zones

perturbées, les pelouses et les zones de la route comme pour les climats tropicaux (Kumar,

2012).

III.2. Biogéographie

Tridax procumbens est originaire d'Amérique tropicale et naturalisée en Afrique

tropicale, en Asie, en Australie et en Inde. C'est une plante sauvage répartie dans toute l'Inde

(Kumar, 2012).




III.3. Propriétés pharmacologiques

L'activité hépatoprotective des parties aériennes de Tridax procumbens est montrée une

protection significative pour atténuer la lésion hépatocellulaire induite par la D-

Galactosamine/Lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) (Mundada et al., 2010). En effet la D-

GalN/LPS est hépatotoxique en raison de sa capacité à détruire les cellules du foie. La nécrose

multifocale produite par D-GalN et la lésion de l'hépatite virale chez l'homme sont similaires.

On sait que cet amino-sucre bloque sélectivement la transcription et la synthèse indirecte de

protéines hépatiques. Elle provoque une hépatite fulminante dans les 8 heures après son

administration (Mundada et al., 2010).

L’extrait à l’éthanol des feuilles de Tridax procumbens ont un effet immunomodulateur

sur des rats Albino (Oladunmoye, 2006). De même, la fraction insoluble dans l'éthanol d'un

extrait aqueux de Tridax procumbens provoque une augmentation significative de l'indice

phagocytaire, du nombre de leucocytes et des cellules sécrétrices d'anticorps spleéniques. La

stimulation de la réponse immunitaire humorale a également été observée avec l'élévation du

titre d'anticorps anti-hémagglutination. La partie aérienne de la plante a un effet à la fois sur le

système immunitaire humoral et cellulaire (Tiwari et al., 2004).

La guérison des plaies implique une interaction complexe entre les cellules

épidermiques et dermiques, la matrice extracellulaire, l'angiogenèse contrôlée et les protéines

dérivées du plasma, toutes coordonnées par une gamme de cytokines et de facteurs de

croissance (Bhat et al., 2007). Tridax procumbens a antagonisé l'antiépithélisation et l'effet

déprimant de la dexaméthasone résistant à la traction (un agent inhibiteur de cicatrisation

connu) sans affecter l'anticontraction et l'action antigranulation de la dexaméthasone. L'extrait

aqueux a également été efficace par augmentation de la lysyl oxydase mais à un degré moindre

que l'extrait de plante entière. L'extrait des feuilles de cette plante favorise également la

cicatrisation des plaies chez les rats normaux et immunodéprimés (stéroïdes) dans un modèle

de cicatrisation des plaies mortes. La plante augmente non seulement la lysyl oxydase, mais

aussi la teneur en protéines et en acides nucléiques dans le tissu de granulation, probablement

en raison de l'augmentation de la teneur en glycosamino glycane (Nia et al., 2003).

Diverses herbes ont été utilisées sous forme de jus pour abaisser le taux de glycémie.

L'extrait hydro alcoolique de feuilles de Tridax procumbens a montré une diminution

significative du taux de glycémie dans le modèle de diabète induit par l'alloxane chez le rat

(Bhagwat et al., 2008).




L’extrait aqueux de la plante entière de Tridax procumbens possède des activités

antibactériennes sur diverses espèces de bactéries parmi lesquelles Pseudomonas aeruginosa.

La méthode de diffusion du disque a été utilisée pour tester l'activité antibactérienne. Le jus

frais de plante est appliqué deux fois par jour pendant 3 à 4 jours pour guérir les plaies (Mahato

and Chaudhary, 2005).

L’extrait aqueux des feuilles de Tridax procumbens a un effet hypotenseur. En effet, les

études réalisées sur le rat Sprague-Dawley anesthésié ont montré que cet extrait entraîne des

diminutions significatives de la pression artérielle. Une dose plus élevée de cet extrait a entraîné

une réduction significative de la fréquence cardiaque. (Salahdeen et al., 2004). Les huiles

essentielles des feuilles Tridax procumbens ont été évaluées pour leurs effets de répulsion

topique contre le vecteur paludique Anopheles stephensi (An. Stephensi) dans les cages à

moustiques. Toutes les huiles essentielles ont été testées à trois concentrations différentes (2, 4

et 6%). Parmi celles-ci, les huiles essentielles de Tridax procumbens ont présenté un effet de

répulsion relativement élevé (> 300 minutes à une concentration de 6%) (Rajkumar et al.,

2007). Tridax procumbens a également montré une activité anti-inflammatoire et anti-oxydante

lorsque le dosage de DPPH (2,2-dipényl-1-picrylhydrazylhydrate) et HET-CAM (membrane de

chorioallanthhoïque d'œufs de poule) a été effectué (Nia et al., 2003). Les feuilles de Tridax

procumbens ont été signalée pour leur effet préventif sur la chute des cheveux (Rathi et al.,

2008; Saxena and Albert, 2005).

III.4. Etudes phytochimiques

Le criblage phytochimique de Tridax procumbens a révélé la présence d'alcaloïdes, de

caroténoïdes, de flavonoïdes (catéchines et flavones), de tanins et de saponines. La plante est

riche en sodium, potassium et calcium. La feuille de Tridax procumbens contient

principalement 26% de protéines, 17% de fibre brute, 39% de glucides solubles, 5% d'oxyde de

calcium (Jhample et al., 2015). La lutéoline, la glucolutéoline, la quercétine et l'isoquercétine

ont été isolés dans les fleurs alors que l'acide fumarique, l’acide oléanolique, le β-sitostérol et

un tanin ont également été isolé dans la plante (Christudas et al., 2012). L'acide oléanolique

s'est révélé être un agent antidiabétique potentiel lorsqu'il a été testé contre l’α-glucosidase

(Nisha, 2015).





Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus et Tridax procumbens contiennent des

métabolites secondaires qui leur confèrent des propriétés biologiques et pharmacologiques. Les

études antérieures réalisées sur ces plantes ont montré qu’elles sont largement utilisées en

médecine traditionnelle. Elles ont également permis d’identifier quelques composés issus de

ces plantes.




CHAPITRE III: OPTIMISATION ET ANALYSES CHIMIQUES

I. PLAN D’EXPERIENCES ET OPTIMISATION

Introduction

En recherche, l’un des buts ultimes est la compréhension des phénomènes naturels. Si

ce n’est le phénomène le but, sa compréhension aide beaucoup tant dans la reproduction de

celui-ci pour des buts utiles de la vie de tous les jours, pour résoudre des problèmes spécifiques

ou juste pour une meilleure compréhension de la nature. Le plan d’expérience est un outil qui

répond parfaitement à ces questions.

Il s’agira donc dans de définir le plan d’expérience et l’optimisation et d’étayer leurs

différents types.

I.1. Plan d’expériences

I.1.1. Définition

Le plan d'expérience et l'optimisation sont des outils utilisés pour examiner

systématiquement différents types de problèmes qui se posent dans la recherche, le

développement et la production. Il est évident que si les expériences sont effectuées au hasard,

sans planification, le résultat obtenu sera également aléatoire (Lundstedt et al., 1998).

I.1.2 Processus de conception expérimental

Le processus de conception expérimental peut être divisé en trois étapes :

- la planification de l'expérience qui implique la conception statistique des

expériences ;

- la mise en œuvre de l'expérience qui implique un schéma de randomisation et un

blocage possible ;

- et l'analyse et l'interprétation des données recueillies qui utilisent l'analyse

statistique des données (Smith, 2005).

Il est indispensable dans un processus de conception expérimentale de choisir les

conditions à modifier et les réponses à mesurer (Lundstedt et al., 1998).

Il existe plusieurs types de plan d’expérience. Nous attarderons sur les plans

d’expérience matriciels (plans factoriels et plan de plackett et burmann) du fait de leurs

simplicités d’utilisation.




I.1.3. Types de plan d’expérience

I.1.3.1. Plan factoriel

Un plan factoriel complet 2k nécessite toutes les combinaisons de deux versions de

chacune des k variables. Pour une variable continue, les deux versions deviennent le niveau

haut et bas de cette variable. Cependant pour une variable qualitative, les deux versions

correspondent par exemple, parfois à la présence et à l'absence de la variable. Les essais

comprenant la conception expérimentale sont commodément présentés dans l'une ou l'autre de

deux notations comme illustré dans le tableau 2 pour les huit essais comprenant un plan factoriel

23 (Box and Hunter, 1961).

Tableau 2: Expériences pour un plan factoriel 23

Numéro d’expériences Notation 1

Variables ABC

Notation 2

Variables 123

1 1 - - -

2 a + - -

3 b - + -

4 c - - +

5 ab + + -

6 ac + - +

7 bc - + +

8 abc + + +

Dans la notation 1, les variables sont identifiées par des lettres majuscules, et leurs deux

versions par la présence ou l'absence de la lettre minuscule correspondante. Lorsque toutes les

variables sont à leur niveau "bas" ou version, un "1" est utilisé. Dans la notation 2, les variables

sont identifiées par des nombres et les deux versions de chaque variable par un signe moins et

plus, ou par moins et plus un. La conception expérimentale peut ensuite être visualisée

géométriquement. Une exécution est représentée par un point dont les coordonnées sont les

versions -1 pour cette exécution. Par exemple, le plan factoriel 23 fournira les huit sommets

d'un cube dans un système de coordonnées tridimensionnel. La liste des exécutions




expérimentales est appelée la matrice de conception et est généralement notée D. Pour un

factoriel 2k, la matrice de conception contient k colonnes et N = 2k lignes. Il y a une colonne

pour chacune des variables k, et chaque ligne donne la combinaison de versions pour chaque

cycle (Box and Hunter, 1961).

I.1.3.2. Plan de Plackett et Burman

Les plans d’expérience de Plackett-Burman ont été élaborés en 1946 en vue de trouver

des modèles expérimentaux pour étudier la dépendance de certaines quantités

d’approvisionnements mesurées sur un certain nombre de variables indépendantes (facteurs).

Chaque valeur prend L niveaux, de manière à minimiser la variance des estimations des

dépendances en utilisant un nombre limité d’expériences (Plackett and Burman, 1946). Les

interactions entre les facteurs ont été considérées comme négligeables. Le modèle expérimental

implique que chaque combinaison de niveaux pour n'importe quelle paire de facteurs apparaît

le même nombre de fois, pendant toutes les expériences (Tableau 3). Une conception factorielle

complète satisferait ce critère, mais l'idée était de trouver des conceptions plus petites

(Anderson and Whitcomb, 2000).

Tableau 3: Exemple de matrice d'expérience pour 7 facteurs de Plackett et Burman

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7

1 + - + - + + -

2 - + - + - + +

3 + - + - + - +

4 + + - + - + -

5 - + + - + - +

6 + - + + - + -

7 - + - + + - +

8 - - - - - - -

Nous utiliserons dans la méthodologie le plan de Plackett et Burman pour les raisons

suivantes :

- la capacité de modélisation du modèle ;

- la détection des paramètres significatifs ;




- l’efficience : nombre de tests relativement petit malgré le grand nombre de

paramètres ;

- l’obtention d’un modèle linéaire facile à manipuler.

I.2. Optimisation

I.2.1. Définition

L'optimisation vise à modéliser, à analyser et à résoudre analytiquement ou

numériquement les problèmes consistant à minimiser ou maximiser une fonction sur un

ensemble (Vera Candioti et al., 2014).

Il existe de nombreuses méthodes d’optimisation de modèle, cependant nous décrirons

deux d’entre elles qui sont parmi les plus simples et les plus utilisées dans les modèles linéaires.

I.2.2. Types d’optimisation

Parmi les nombreuses méthodes d’optimisation qui sont liées à la fonction à optimiser,

la méthode de simplex et l’algorithme génétique seront présentées du fait de la récurrence de

leurs utilisations et de leur relative simplicité.

I.2.2.1. Méthode de simplex

La méthode de simplex est un algorithme très utilisée pour la programmation linéaire.

Le nom de l'algorithme est dérivé du concept d'un simplex et a été suggéré par T.S. Motzkin

(Murty, 1983). Les simplex ne sont pas réellement utilisés dans la méthode, mais une

interprétation de celle-ci est qu'elle fonctionne sur des cônes simplex, et ceux-ci deviennent un

simplex avec une contrainte additionnelle (Stone and Tovey, 1991; Strang, 1987). Ces cônes

sont les coins d'un objet géométrique appelé polytope dont la forme est définie par les

contraintes appliquées à la fonction objectif (Ficken, 2015).

I.2.2.2. Algorithme génétique

Un algorithme génétique est une métaheuristique inspirée par le processus de sélection

naturelle qui appartient à la plus grande classe des algorithmes évolutionnaires. Ces algorithmes

sont utilisés pour générer des solutions de haute qualité aux problèmes d'optimisation et de

recherche en s'appuyant sur des opérateurs bio-inspirés tels que la mutation, le croisement et la

sélection (Melanie, 1999).




Dans un algorithme génétique, une population de solutions candidates (appelées

individus, créatures ou phénotypes) à un problème d'optimisation évolue vers de meilleures

solutions. Chaque solution candidate a un ensemble de propriétés (ses chromosomes ou son

génotype) qui peuvent être mutés et modifiés. Ainsi les solutions sont représentées en binaire

comme des chaînes de 0 et 1, mais d'autres codages sont également possibles (Whitley, 1994).

Dans la méthodologie nous utiliserons la méthode des simplex pour deux raisons : sa

facile accessibilité (car elle peut être réalisée avec Microsoft office Excel) et son adéquation à

l’optimisation des modèles linéaires

II. ANALYSES CHIMIQUES

Dans le but de séparer, d’identifier et de déterminer les structures des molécules,

plusieurs techniques d’analyse sont utilisées. Il s’agira dans cette partie de décrire les théories

qui accompagne des techniques spectrométriques et chromatographiques mises en œuvre dans

cette étude.

II.1. Techniques spectrométriques

II.1.1. Spectrométrie de masse

L'application extensive de la spectroscopie de masse dans la résolution des problèmes

de structures des molécules organiques n'a commencé qu'en 1960. Cette technique est basée sur

le seul principe de la détermination de la masse d'un ion en phase vapeur. Ainsi, un spectromètre

de masse ionise l'échantillon dans un faisceau d'électrons en phase vapeur. Les ions sont séparés

selon leurs rapports masse sur charge (valeurs m/e ou m/z) et leurs spectres de masse sont

enregistrés sous la forme de raies avec leurs abondances relatives (Yadav, 2013).

En réalité, le m/e est obtenu à partir d'un spectre de masse, mais pour des raisons

pratiques, il est égal à la masse m de l'ion, car les ions multichargés sont beaucoup moins

abondants que ceux avec une seule charge (e ou z = 1). La spectroscopie de masse est utile en

analyses chimiques car elle peut :

- donner les masses moléculaires exactes ;

- montrer la présence de certaines unités structurales et leurs points d'attachement

dans la molécule ;

- donner une idée de la structure de la molécule (Yadav, 2013).




II.1.1.1. Méthodes d'ionisation

Les méthodes d'ionisation les plus importantes sont :

- l'impact électronique dans laquelle l'échantillon est bombardé en phase vapeur avec

un faisceau d'électrons à haute énergie (70 eV) ;

- l'ionisation chimique dans laquelle l'échantillon est introduit dans la chambre

d'ionisation à la pression atmosphérique avec un excès d'une substance intermédiaire

(méthane, isobutane ou ammoniac) également appelé gaz porteur.

II.1.1.2. Ions moléculaires et fragments par impact électronique

Le bombardement avec un faisceau d'électrons à haute énergie (70 eV) arrache l'électron

ayant le plus petit potentiel d'ionisation dans la molécule pour donner l'ion moléculaire ou ion

parent M+ en phase vapeur. L'ion moléculaire donne la masse moléculaire de l'échantillon car

la masse de l'électron perdue de la molécule est négligeable.

L'ordre de l'énergie nécessaire pour éliminer un électron d'une molécule pour donner

l'ion moléculaire est : Paire d’électrons < liaison π conjugué < liaison π non conjugué < liaison

σ (Jensen and Gross, 1987; Thompson, 2018).

Dans les alcanes, l'élimination d'un électron à partir de liaisons C-C est plus simple que

celle des liaisons C-H. L'énergie requise pour éliminer un électron à partir de molécules

organiques neutres est d'environ 10-12 eV. En pratique, on utilise une énergie beaucoup plus

élevée (70 eV) qui provoque une fragmentation supplémentaire de l'ion moléculaire résultant

en un fragment d'autres ions filles (Jensen and Gross, 1987).

II.1.1.3. Spectre de masse et pic de base

Le spectre de masse d'un composé est représenté graphiquement en traçant les valeurs

m/e des divers ions (ions moléculaires et ions fragments) par rapport à leurs abondances

relatives. Parfois, le pic de l'ion moléculaire lui-même peut être le pic de base. Généralement,

les spectres de masse sont représentés sous la forme d'un graphique à barres (Loudon and

Maccoll, 1970).

II.1.1.4. Reconnaissance de l'ion moléculaire (parent), pic et détection des isotopes

La reconnaissance du pic de l'ion moléculaire M+ (pic parent) dans le spectre de masse

d'un composé organique est très importante car elle donne la masse moléculaire du composé.

Le pic d'ion moléculaire est le pic du nombre de masse le plus élevé à l'exception des pics




isotopiques aux nombres de masse M+1, M+2 etc. (M = masse de l'ion moléculaire). Les pics

isotopiques (satellites) apparaissent en raison de la présence d'un certain nombre de molécules

contenant des isotopes plus lourds que les isotopes communs. Puisque l'abondance naturelle

des isotopes plus lourds est généralement beaucoup plus faible que celle de l'isotope le plus

léger, les intensités des pics isotopiques sont très faibles par rapport au pic parent. Cependant,

pour les composés contenant du chlore, du brome ou du soufre, les pics isotopiques sont

importants. Le pic isotopique M+2 dû à la présence d'un atome de chlore ou d'un atome de brome

est respectivement de 33% et 50% du pic de l'ion moléculaire. Ainsi, dans un composé chloré

ou bromé, le rapport d'intensité des pics M+ et M+2 sera respectivement de 3 : 1 ou 1 : 1. Cela

est dû à l'abondance naturelle de 37,6% de l’isotope 37Cl par rapport à 75,4% de l’isotope 35Cl

et à une abondance presque égale des isotopes 79Br et 81Br (Thompson, 2018).

II.1.1.5. Application de la spectroscopie de masse

La spectroscopie de masse est devenue au fil du temps un outil incontournable dans la

chimie organique des substances naturelles. Elle est d’une grande utilité dans la détermination

des structures moléculaires. Elle est très souvent couplée à une technique de chromatographie.

Comme exemple le couplage entre la chromatographie capillaire en phase liquide et la

spectroscopie de masse a permis de dresser le profil de métabolites secondaire d’Arabidopsis

(Von Roepenack-Lahaye et al., 2004) ; la spectrométrie de masse a été utilisée aussi dans

l’identification des flavonoïdes glycosilés (Stobiecki, 2000) ; elle a aussi été utilisé dans la mise

en place d’une base de données de métabolome de la tomate en couplage avec la

chromatographie liquide (Moco et al., 2006).

II.1.1.6. Identification des métabolites secondaires par les ions parents issus de la

fragmentation par spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse, très souvent couplée à la chromatographie en phase gazeuse,

est utilisée pour identifier les molécules. Plusieurs travaux ont permis de donner des approches

de coupures de molécules comme des flavonoïdes (Hvattum and Ekeberg, 2003; Justesen, 2001;

Stobiecki, 2000), les alcaloïdes (Takáts et al., 2004) et les terpènes et terpénoides (Bursey et

al., 1973; Dass and Stout, 1993; Jensen and Gross, 1987; Korfmacher, 2013; Loudon and

Maccoll, 1970; Sastia and Eiichiro, 2015).

Les figures 29 à 33 résument des exemples de coupures des plus souvent rencontrées

dans les différentes familles de métabolites secondaires.




Figure 31: Voies de fragmentation de l'acacétine (1) et de la 4,5-dihydroxy-7-

méthoxyflavone (2) (Justesen, 2001).




Figure 32: Voies de fragmentation de la diosmétine (3) (Justesen, 2001).




Figure 33: Voies de fragmentation de l'isorhamnétine (Justesen, 2001)

Figure 34: Proposition de dissociation induite par collision de la quercitrine déprotonée

en l'aglycone radicalaire et en ions du produit aglycone (Hvattum and Ekeberg, 2003).




Figure 35: Spectre des ions filles produits par activation collisionnelle de l'ion (M - H)

- de l'acide palmitique-7,7,8,8-d4 (Jensen and Gross, 1987)

Le modèle de base de décomposition, décrit dans les figures 29 à 33, a été énoncé par

Domon et Constello en 1988. La figure 34 résume les différentes voies de coupure d’un

flavonoïde glycosylé (Domon and Costello, 1988).




Figure 36: Résumé des potentiels coupures par spectrométrie de masse d'un flavonoïde

glycosylé (Domon and Costello, 1988)

Parmi les flavonoïdes, la fragmentation des chalcones et hydrochalcones par

spectrométrie de masse a été beaucoup étudié. Les travaux de Van de Sande vont dans ce sens.

Les figures 35 et 36 montrent d’abord une isomérisation possible des chalcones en flavanone

par ionisation de spectromètre de masse, puis un essai de mécanisme des différentes voies de

fragmentation de chalcones (Van de Sande et al., 1972).

Figure 37: Mécanisme possible d’isomérisation entre le 2’-hydrochalcone en flavanone

(Van de Sande et al., 1972)




Figure 38: Schéma de fragmentation du squelette chalcone par spectrométrie de masse

proposé par Van de Sande et al. (1972)

Ces auteurs ont aussi donné un essai de mécanisme de fragmentation des flavanones,

donnant ainsi les liaisons les plus susceptibles de se rompre et les fragments susceptibles de se

former. La figure 37 montre un essai de mécanisme de fragmentation du noyau des flavanones.

Figure 39: Schéma de fragmentation du squelette flavanone par spectrométrie de masse

proposé par Van de Sande et al. (1972)




Nowakowska (2004) a donné une autre voie de décomposition des chalcones substitués

sur le cycle B. Ceci est détaillé dans la figure 38.

Figure 40: Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B

(Nowakowska, 2004)

La fragmentation des molécules en spectrométrie de masse dépend aussi du type

d’ionisation du spectromètre. Les figures suivantes résument les différentes fragmentations

possibles pour le noyau d’un flavonoïde en fonction du mode ionisation (positif ou négatif).

Les figures 39 (ionisation en mode négatif, chromatographie liquide) et 40 (ionisation en mode

positif, chromatographie liquide) décrivent ces fragmentations pour une meilleure

compréhension. La nomenclature adoptée est celle de Ma et Dougherty (Ma and Dougherty,

1997). Les notations i,jA- et i,jB- sont utilisées pour désigner les ions produits contenant les

cycles, respectivement A et B et les notations i j concernent les liaisons qui ont été scindées.

Figure 41: Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes

(flavanone) en mode négatif (Portet et al., 2008)




Figure 42: Nomenclature simplifiée des voies de fragmentation des flavonoïdes en

mode positif (Wolfender et al., 2000)




II.1.2. Spectrométrie infrarouge

II.1.2.1. Théorie de la spectroscopie infrarouge

La spectroscopie infrarouge traite de l'enregistrement de l'absorption des rayonnements

dans la région infrarouge du spectre électromagnétique. La position d'une absorption infrarouge

donnée est exprimée en termes de longueur d'onde (en micron µ) ou plus communément en

termes de nombre d'onde ν en cm-1 puisqu'il est directement proportionnel à l'énergie. La région

infrarouge ordinaire 2,5 -15 µ (4000-667 cm-1) est la plus pratique pour les organiciens. La

région 0,8 -2,5 µ (12500 - 4000 cm-1) s'appelle proche infrarouge et la région 15-200 µ (667-

50 cm-1) s’appelle l'infrarouge lointain. L'absorption du rayonnement infrarouge par une

molécule se produit en raison des changements d'énergie vibratoires et rotatifs quantifiés

lorsqu'ils sont soumis à une irradiation infrarouge. Ainsi, les spectres IR sont souvent appelés

spectres de rotation vibratoire. Les différentes bandes observées dans un spectre IR

correspondent à divers groupes fonctionnels et des liaisons présentes dans la molécule. Ainsi,

la spectroscopie infrarouge est largement utilisée pour la détection de groupes fonctionnels et

l'identification de composés organiques (Yadav, 2013).

II.1.2.2. Région d'empreinte digitale

Il n'est pas possible pour deux composés différents (excepté les énantiomères) d'avoir

exactement le même spectre IR. Par conséquent, le spectre infrarouge d'un composé est appelé

son empreinte digitale. La région située au-dessous de 1500 cm-1 est appelée région d'empreinte

digitale car chaque composé possède un motif d'absorption unique dans cette région. Cette

région contient de nombreuses bandes d'absorption causées par des vibrations de flexion telles

que les bandes d'absorption causées par les liaisons carbone-carbone, carbone-oxygène (C-C,

C-0) comme dans les alcools, les éthers, les esters, et la liaison carbone-azote (C-N) comme

dans les amines, les acides aminés, les amides (Yadav, 2013).

II.1.2.3. Applications de la spectroscopie infrarouge

La spectroscopie IR est une méthode utilisée pour la détermination de la structure des

composés organiques. En effet, les vibrations moléculaires dépendent des distances

interatomiques, des angles de liaison et des forces de liaison plutôt que des propriétés en vrac

du composé. Ainsi, la spectroscopie infrarouge est utilisée en chimie organique pour la




détection des groupes fonctionnels, la confirmation de l’identité des composés et le suivi des

réactions.

a. Détection des groupes fonctionnels

Tous les groupes fonctionnels absorbent dans une région de fréquence définie. Ainsi, la

présence ou l'absence d'une bande dans une région de fréquence définie montre la présence ou

l'absence d'un groupe fonctionnel particulier dans le composé.

b. Confirmation de l'identité des composés

L'identité d'un composé est souvent établie en comparant son spectre IR à celui d'un

échantillon authentique. Si les spectres IR, enregistrés dans les mêmes conditions, sont

superposables, ils représentent le même composé. Le nombre de bandes, surtout dans la région

de l'empreinte digitale, est très utile pour l'identification. Les spectres infrarouges d'échantillons

impurs sont habituellement flous et ont de nombreuses bandes qui ne peuvent pas être

interprétées alors qu'un composé pur donne un spectre IR clair.

c. Suivi des réactions

La progression d'une réaction organique peut être suivie à l’aide d’une spectroscopie IR.

Ceci se fait en examinant les spectres IR des portions du mélange réactionnel prélevés à certains

intervalles de temps.

II.1.2.4. Interprétation des spectres infrarouges

Il n'y a pas de règles définies pour interpréter les spectres IR. Les chimistes organiciens

interprètent généralement les spectres IR en inspectant et en comparant la position, l'intensité

et la forme des bandes avec des données de référence disponibles dans les tableaux des

fréquences de groupes caractéristiques. La figure 41 présente un modèle de spectre infrarouge

du N-méthylaniline (Cozzolino, 2009).




Figure 43: Exemple de spectre infrarouge de la N-méthylaniline (Cozzolino, 2009)

II.1.3. Spectroscopie ultraviolette

II.1.3.1. Théorie

La spectroscopie UV (ultraviolet) visible est une technique de caractérisation de

molécules. En effet, elle est basée sur la capacité des composés à absorber un faisceau lumineux

(Yadav, 2013).

A chaque fonction organique correspond une plage d’absorption de rayonnement

lumineux dans le spectre UV-visible. L’intensité de l’absorption est aussi fonction de la nature

de liaisons chimiques (liaison σ ou π …) dans les molécules (Stem and Timmons, 1970).

II.1.3.2. Application

La spectroscopie UV-visible permet également de déterminer la concentration d’une

famille de molécules dans un extrait tels que le dosage des anthocyanes, polyphénol totaux,

flavonoïdes totaux (Giusti and Wrolstad, 2001).




II.2. Techniques chromatographiques

La chromatographie englobe une série de techniques qui ont en commun la séparation

des composants d'un mélange. L’échantillon à séparer est entrainé par un courant de phase

mobile (gaz ou liquide) le long d’une phase stationnaire (papier ou silice…). La

chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d’un

mélange. La chromatographie préparative est utilisée pour séparer ou purifier les composantes

d’un mélange (Giddings, 2002).

Le mélange à séparer et analyser peut être un gaz, un liquide ou un solide. Le résultat

de cette interaction est la distribution différente des composants de l'échantillon entre les deux

phases, entraînant la séparation du composant de l'échantillon en zones ou bandes. Le principe

qui régit la séparation chromatographique constitue le fondement de la plupart des méthodes

physiques de séparation, par exemple la distillation et l'extraction liquide-liquide (Grob, 2004;

Waksmundzka-Hajnos et al., 2008).

La séparation des composants de l'échantillon peut être réalisée par les techniques

suivantes : Chromatographie sur Couche Mince (CCM), chromatographie sur couche mince

haute précision (HPTLC), chromatographie liquide haute pression (HPLC) et chromatographie

en phase gazeuse (GC). Dans cette partie, nous aborderons la CCM, la HPTLC, la GC et la

HPLC.

II.2.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC)

Une nouvelle approche de détermination analytique de substances naturelles a été mise

au point avec la HPTLC (Nicoletti et al., 2012). La chromatographie sur couche mince à haute

performance (HPTLC) est très utilisée dans les analyses qualitatives (Stahl, 1956). Avec le

développement de couches pré-revêtues modernes et l'introduction d'équipements partiellement

ou totalement automatisés des analyses quantitatives très précises sont maintenant possibles

(Hahn-Deinstrop, 2007).

La HPTLC est largement utilisée pour l'analyse qualitative de composés organiques,

l'isolement des composés purs à partir de mélanges à plusieurs composants. De nombreux types

de plaques pré-revêtues de CCM et de HPTLC sont commercialisés, par exemple celles avec

des couches d'adsorbant inorganiques (silice ou gel de silice et alumine) et organiques

(polyamide, cellulose), polaires liées de manière covalente, (diol, cyanopropyle et




aminopropyle) et non polaires (RP2, RP8, RP18). Les adsorbants appliqués en HPTLC ont des

caractéristiques de surface différentes et, par conséquent, des propriétés physicochimiques

différentes. De plus, il existe un large choix de phases mobiles qui peuvent être utilisées pour

séparer les composants du mélange. Celles-ci ont des propriétés différentes en tant que donneurs

de protons, accepteurs de protons et dipôles. En HPTLC, l'absorption ultraviolette (UV) des

solvants de la phase mobile n’influence pas la détection et la quantification des analytes, car la

phase mobile est évaporée avant la détection. La viscosité élevée d'un solvant peut être

considérée comme une propriété unique limitant son choix en tant qu’éluant. La multitude de

types des phases mobiles et fixes donne une abondance de combinaison possible rendant la

technique personnalisable aux mélanges complexes d’extraits de plantes.

La HPTLC est également une technique simple pour effectuer des séparations

bidimensionnelles. Un seul échantillon est appliqué dans le coin d'une plaque, et la couche est

développée dans la première direction avec la phase mobile 1. La phase mobile est séchée par

évaporation, et la plaque est ensuite développée avec la phase mobile 2 à un angle droit

(perpendiculaire ou direction orthogonale) ; la phase mobile 2 a des caractéristiques de

sélectivité différentes par rapport à la phase mobile 1. De cette manière, une séparation

complète peut être obtenue de mélanges très complexes tels que les extraits végétaux sur toute

la surface de la couche (Waksmundzka-Hajnos et al., 2008).

L’une des caractéristiques très utile dans l’interprétation d’un chromatogramme HPTLC

est la référence frontale. La référence frontale est le rapport entre le front de solvant, (distance

parcourue par l’éluant de la ligne de dépôt jusqu’à la ligne d’arrêt de l’élution), et le front de la

tâche (distance entre la tâche du composé et la ligne de dépôt). De part cette définition, la

référence frontale est comprise entre 0 et 1. Elle dépend des conditions expérimentales (nature

de la phase fixe et de la phase mobile). Lorsque les conditions expérimentales sont conservées,

la référence frontale est une caractéristique du composé et peut être utilisée pour identifier un

composé en fonction d’un standard (Litvinova, 2006).

La HPTLC est utilisé pour réaliser l’identification de métabolites secondaires. En effet,

elle est souvent couplée avec la spectrométrie de masse et UV dans l’identification de

métabolites secondaires des éponges marines (Klöppel et al., 2008). L’identification et la

quantification de composés dans des poches de perfusion pour de la chimiothérapie a été réalisé

en utilisant une HPTLC (Paci et al., 2003). Elle sert aussi à réaliser les études phytochimiques

sur les terpénoïdes des plantes médicinales (Yamunadevi et al., 2011).




II.2.2. Chromatographie en phase liquide à haute performance

II.2.2.1. Théorie de la technique

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est la plus puissante de toutes

les techniques chromatographiques.

La chromatographie en phase liquide à haute performance est une technique qui découle

de l'application à la chromatographie liquide (LC) des théories et de l'instrumentation

développées à l'origine pour la chromatographie en phase gazeuse (GC) (Sandy, 1991). La

chromatographie en phase liquide à haute performance base sa technique sur la pression de la

phase mobile (l’éluant). Elle se différencie de la chromatographie sur colonne du fait que

l’élution se fait par une pompe qui confère une forte pression agisssant sur la séparation des

composés (Snyder et al., 2011).

II.2.2.2. Application de la technique

La HPLC est une méthode qui a beaucoup d’application surtout au niveau de la chimie

des substances naturelles. En effet, elle est utilisée dans la séparation ou l’identification de

composés. Elle est souvent couplée avec la spectrométrie de masse ou la spectrométrie UV-

visible.

La HPLC est également utilisée pour l’identification, la séparation et la quantification

de certaines familles de molécules dans les extraits de plantes (Bobzin et al., 2000; Chandra et

al., 2001).

II.2.3. Chromatographie en phase gazeuse

II.2.3.1. Théorie de la méthode

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique de séparation de

molécules, basée sur une phase mobile gazeuse. La substance à analyser doit être vaporisable

pour être entrainée par le gaz vecteur (Grob, 2004).

II.2.3.2. Application de la CPG

La CPG est utilisée dans la plupart des cas en couplage avec la spectroscopie de masse

dans l’identification des composés organiques. Elle reste une technique de choix dans

l’identification car elle ne nécessite pas une séparation préalable de l’extrait. Cependant, les




extraits polaires nécessitent un prétraitement, à savoir des dérivations (méthylation ou

silylation) (Christie, 1998).

Un exemple courant est la détermination des structures des acides gras (lipides) par des

méthodes utilisant un couplage chromatographie en phase gazeuse et la spectroscopie de masse

(Christie, 1998). Ce couplage est aussi utilisé pour le suivi des réactions, et pour l’oxydation de

l’Acide Désoxyribo Nucléique (Dizdaroglu, 1994). La CPG peut aussi être couplée avec un

détecteur UV dans le but d’analyser une famille de métabolites bien précise comme l’analyse

de terpènes (Qiu et al., 2017).


. Les techniques analytiques permettent de connaitre la nature et les propriétés des

substances chimiques. Elles sont utilisées pour l’identification, la séparation et la quantification

de certaines familles de molécules dans les extraits de plantes. Les plans d’expériences sont des

outils puissants de modélisation et d’optimisation qui permettent de cerner la relation entre des

phénomènes.

68



PARTIE 2 : METHODOLOGIE




CHAPITRE I: ANALYSES PHYTOCHIMIQUES

I. BIBLIOMETRIE

La bibliométrie peut être définie comme « l’application des mathématiques et des

méthodes statistiques aux livres, articles et autres moyens de communication » (Pritchard,

1969). Elle est utilisée pour constater de l’état d’avancement de la recherche dans une

thématique bien définie. Dans notre cas, en substances naturelles, les thématiques concernent

soit des familles de molécules ou des substances bien définies, soit une plante source de

métabolites secondaires. Nos travaux s’orientent dans le deuxième cas de figure à savoir une

bibliométrie s’accentuant sur les différentes plantes soumises à notre étude.

La bibliométrie sur une thématique donnée (dans notre cas les il s’agit des trois plantes

soumises à notre étude) a été effectuée avec la plate-forme internet SCIFINDER qui répertorie

toutes les formes de publication traitant de la thématique à traiter. Sur ce site, les données

correspondant aux nombres de publications par années, le nombre de publications par auteur,

et le nombre de publication par type de publication ont été exporté vers la suite Excel du logiciel

Microsoft Office. Un traitement statistique des données est effectué et consiste dans la

réalisation de graphes en bâtons. Les graphes sont utilisés pour observés l’évolution dans le

temps de l’intérêt scientifique ainsi que le type de publication produit indiquant sur l’utilisation

technique des résultats (brevet).

II. RECOLTE DES ORGANES VEGETAUX

La récolte des différents organes des trois plantes a été effectuée dans une forêt claire

au sein de l’Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT BOIGNY de Yamoussoukro

(INP-HB) de coordonnées 6°53’04.7’’Nord et 5°13’54.9’’ Ouest. Les organes ont été identifiés

par M. Amani N’Guessan, botaniste à l’INP-HB.

Pour Alchornea cordifolia il s’agit des feuilles, pour Tridax procumbens, les fleurs et

les feuilles ont été récoltées, pour Phyllanthus amarus, la plante entière a été utilisée. Les

différents organes ont été choisi en fonction de leurs utilisations (Tra Bi et al., 2008).




III. EXTRACTION ET FRACTIONNEMENT DES METABOLITES

SECONDAIRES

III.1. Extraction des métabolites secondaires

L’extraction des métabolites secondaire se fait par macération dans l’objectif de réduire

la dégradation des molécules présentes dans nos plantes. Le solvant utilisé est composé de 30%

d’eau distillée et de 70% d’éthanol absolu. Pour chaque, plante le broyat est macéré dans le

solvant hydro-éthanolique avec un ratio masse/volume de solvant (1/10). La durée de

macération est de 24 heures et la vitesse d’agitation est de 600 rpm. Une fois la macération

terminée, le mélange est filtré sur papier Wattman et concentrée avec un évaporateur rotatif.

L’extrait obtenu après élimination du solvant constituera la matière première pour les

fractionnements.

III.2. Fractionnement de l’extrait hydro-éthanolique

L’extrait hydro-éthanolique obtenu a subi un fractionnement par une succession de

séparation liquide-liquide. Les solvants ont été choisis en fonction de leurs polarités : l’hexane,

le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle et le butanol. Les séparations se font de façon successive

comme le montre le schéma 1 : l’extrait est dissout dans de l’eau et une séparation liquide-

liquide est effectuée avec chaque solvant. On obtient à la fin de l’opération cinq fractions : la

fraction à l’hexane, la fraction au dichlorométhane, la fraction à l’acétate d’éthyle, la fraction

au butanol et la fraction résidu aqueux.




Schéma 1: Fractionnement de l'extrait hydro-éthanolique

IV. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

Le criblage a été réalisé suivant les différents tests tirés des travaux de Houghton sur le

criblage phytochimique des familles de métabolites secondaires (Houghton, 1995). Tous les

réactifs de pureté analytique ont été achetés chez across, Lancaster ou Merck et ont été utlisés

sans autre purification. Les solvants ont été acheté chez Polychimie et ACI. Ceux de pureté ont

été directement utilisés alors que les autres ont été purifiés par distillation avant leur utilisation.

Le choix de ces familles criblées se justifie par le fait que la majorité des propriétés

biologiques des plantes leur sont attribuées. Par exemple, les alcaloïdes ont des propriétés

d’anesthésie locale, les tanins sont des cicatrisant, antibactérien, antiseptique, les flavonoïdes

présentent des propriétés anti inflammatoire et antibactérienne. Les saponosides possèdent des

propriétés anti inflammatoire, anti œdémateuse et analgésique, les terpènes et stéroïdes sont

analgésique, anti inflammatoire et les dérivés quinoniques sont antibactériens (Bruneton, 1999).

La majorité des études réalisées sur Tridax procumbens concernent les activités

biologiques. L’extrait hydroalcoolique est celui qui donne généralement les meilleurs résultats

(Dhanabalan, 2008; Salahdeen et al., 2004). C’est pour ces raisons qu’il nous paraissait

important de voir le profil chimique de cet extrait. Les extraits hydroalcooliques des organes de

Extrait hydro-éthanolique

Extrait à l'Hexane Marc 1

Extrait au dichlorométhane

Marc 2

Extrait à l'acétate d'éthyle

Marc 3

Extrait au butanol Marc 4

Fraction résidu aqueux

Marc 5




Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus ayant fait l’objet de criblages phytochimiques

dans plusieurs études de la littérature, il nous est apparu inutile de reprendre ces criblages.

IV.1. Test de détection des stérols et terpènes par la réaction de Lieberman et

Bürchard

IV.1.1. Sur le broyat

Une masse de 1g de broyat de l’organe végétal est macéré dans 20 mL d’hexane pendant

24h. L’extrait est filtré trois fois sur du coton puis une fois sur du papier Wattman. L’extrait à

l’hexane obtenu est complété à 20 mL.

Dans une capsule, 10mL d’extrait hexanique sont évaporés à sec et repris dans un tube

avec un mélange de 1 mL d’anhydride acétique et 1 mL de chloroforme. Un volume de 1 à 2

mL d’acide sulfurique est ajouté avec précaution dans le tube contenant l’extrait. En cas de

réaction positive, il se forme un anneau rouge-brunâtre ou violet à la zone de contact des deux

liquides.

IV.1.2. Sur les extraits

Un volume de 5 mL de la solution à analyser est évaporé à sec dans une capsule sur un

bain de sable. Le résidu obtenu est dissout à chaud dans 1 mL d’anhydride acétique puis

transvasé dans un tube à essais auquel est ajouté 0,5 mL d’acide sulfurique concentré avec

précaaution. La réaction est positive, s’il y a apparition d’un anneau pourpre ou violet virant au

bleu puis au vert.

IV.2. Test de détection des polyphénols


Dans un tube à essais contenant 5 mL d’infusé à 5% (5g de broyat dans 100 mL d’eau

bouillante), est ajouté 1 mL d’une solution aqueuse diluée de trichlorure de fer (FeCl3) à 1%.

En présence de composés polyphénoliques, il se développe une coloration verdâtre ou bleu

noirâtre.


Une goutte de solution alcoolique de chlorure ferrique 2% est ajoutée à 2 mL d’extrait.

L’apparition d’une coloration bleue noirâtre ou verte plus ou moins foncée traduit la présence

de composés phénoliques.




IV.3. Test de détection des flavonoïdes par la réaction à la cyanidine


Dans un tube à essais contenant 5 mL d’infusé à 5% sont ajoutés 5 mL d’alcool

chlorhydrique (mélange de même volume de l’alcool à 95°, de l’eau distillée et de l’acide

chlorhydrique concentré), 1 mL d’alcool isoamylique puis quelques copeaux de magnésium.

L’apparition d’une coloration rose-orangée (flavones) ou rose-violacée (flavanones) ou rouge

(flavonones, flavanonols) rassemblée dans la couche surnageante d’alcool isoamylique indique

la présence d’un flavonoïde libre (génine). Les colorations sont moins intenses avec les

hétérosides flavoniques.


Deux (2) mL d’extrait sont évaporés. Après refroidissement, le résidu est repris par 5

mL d’alcool chlorhydrique dilué deux fois dans un tube à essais. On y ajoute 2 à 3 copeaux de

magnésium. L’addition de 3 gouttes d’alcool isoamylique intensifiant une coloration orange ou

violacée, indique la présence de flavonoïdes.

IV.4. Test de détection des leucoanthocyanes

Les leucoanthocyanes sont caractérisées par la réaction à la cyanidine sans ajout de

copeaux de magnésium avec un chauffage pendant 15 min au bain-marie. En présence de

leucoanthocyanes, il se développe une coloration rouge-cerise ou violacée. Quant aux catéchols,

elles donnent une teinte brun-rouge.

IV.5. Test de détection des anthocyanes

A 5 mL d’infusé à 5% présentant une coloration plus ou moins foncée, sont ajoutés 5

mL d’acide sulfurique puis 5 mL d’hydroxyde d’ammonium. Si la coloration s’accentue par

acidification puis vire au bleu-violacée en milieu basique, on peut conclure la présence

d’anthocyanes.

IV.6. Tests de détection des tanins

IV.6.1. Tanins catéchiques

Un (1) millilitre de solution d’alcool chlorhydrique (mélange de 5 mL d’alcool, 5 mL

d’eau distillée, 5 mL d’acide chlorhydrique concentré) est ajouté à 5 mL d’infusé. La solution

obtenue est ensuite portée à ébullition pendant 15 minutes. La formation de précipité rouge

soluble dans l’alcool amylique indique la présence de tanins catéchiques.




IV.6.2. Tanins galliques

Quinze (15) millilitres de réactif de Stiany (mélange de 10 mL de formaldéhyde à 40%

et 15 mL d’acide chlorhydrique concentré) sont ajoutés à 30 mL d’infusé. La solution obtenue

est portée à ébullition pendant 15 min au bain marie. La formation d’un précipité révèle la

présence de tanins galliques. La solution est filtrée et le filtrat est saturé par l’acétate de sodium,

puis quelques gouttes d’une solution de chlorure ferrique à 1% y sont ajoutées. Il apparaît une

coloration bleu-noire qui indique la présence de tanins galliques non précipités par le réactif de

Stiany.

IV.7. Tests de détection des alcaloïdes


Dix (10) grammes de poudre végétale sont ajoutés à 50 mL d’une solution d’acide

sulfurique diluée au 1/10. Le mélange est agité et macéré pendant 24 heures à la température

ambiante du laboratoire puis filtré sur papier Whatmann. Dans 2 tubes à essais contenant chacun

1 mL de filtrat sont respectivement ajoutées 5 gouttes de réactifs de Mayer et de Dragendorff.

La présence d’alcaloïdes est révélée par l’apparition de précipité.


Le résidu obtenu à partir de 6 mL d’extrait évaporé est repris dans 6 mL d’alcool à 60°

(degré alcoolique). La solution alcoolique ainsi obtenue est repartie dans 2 tubes à essais. Dans

le premier tube, sont ajoutées 2 gouttes de réactifs de Dragendorff. L’apparition d’un précipité

ou d’une coloration orange indique la présence d’alcaloïdes. Dans le deuxième tube, sont

ajoutées 2 gouttes de réactif de Mayer. L’apparition de coloration brune-rougeâtre indique une

présence d’alcaloïdes.

IV.8. Test de détection des saponosides

Une masse de 1 g de poudre végétale est introduite dans un erlenmeyer de 250 mL. Un

volume de 100 mL d’eau distillée est ajouté et le mélange est légèrement chauffé. Après

filtration et refroidissement, le mélange est complété à 100 mL avec de l’eau distillée qui

constitue le filtrat. Dans un tube à essais, 20 mL du filtrat sont introduits et agités

vigoureusement pendant 15 secondes, et le tube est placé verticalement pendant 15 minutes. Au

bout de cette période, si la mousse persiste alors la drogue végétale contient des saponines.




IV.9. Test de détection des quinones et anthraquinones

IV.9.1. Sur les broyats

Un (1) gramme de broyat est placé dans un tube avec 15 à 30 mL d’éther de pétrole.

Après 10 minutes d’agitation et un repos de 24 h, l’extrait est filtré et concentré à l’étuve. La

présence de quinones libres est confirmée quand la phase aqueuse vire au jaune, rouge ou violet,

lorsque l’on ajoute à l’extrait quelques gouttes de soude à 1/10 sur les extraits.

À 5 mL au l’extrait chloroforme des broyats, sont ajoutés 5 mL d’une solution aqueuse

d’hydroxyde de potassium à 10 % (v/v). Après agitation, la présence des anthraquinones est

confirmée par un virage de la phase aqueuse au rouge.


Le réactif de Borntraeger (Ammonique dilué 2 fois), est utilisé pour mettre en évidence

des substances quinoniques.

Un volume de 2 mL d’extrait est évaporé à sec. Le résidu est repris avec 5 mL d’une

solution d’acide chlorhydrique dilué au 1/5, puis chauffé jusqu’à l’ébullition pendant 30

minutes au Bain-Marie dans un tube à essais. Après refroidissement sous courant d’eau froide,

l’hydrolysat est extrait avec 20 mL de chloroforme dans un tube à essais. A la phase organique

recueillie, est ajouté 0,5 mL d’ammoniaque dilué 2 fois. Le virage de la coloration au rouge ou

violet, indique la présence de composés quinoniques.

IV.10. Test de détection des coumarines

Un volume de 5 mL d’extrait à l’éther obtenu après une macération de 24 heures est

évaporé à l’air libre, puis repris avec 2 mL d’eau distillée chaude. La solution est partagée entre

deux tubes à essai. La présence de coumarines est testée après ajout dans l’un des tubes de 0,5

mL de solution d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) à 25% et observation de la fluorescence

sous une lampe UV à 366 nm. Une fluorescence bleue intense dans le tube où l’ammoniaque a

été ajoutée indique la présence de coumarines.

IV.11. Test de détection des anthraquinones combinés

Les anthraquinones combinées sont mises en évidence selon leur nature.




IV.11.1. Test de détection des O-hétérosides

Un hydrolysat est préparé à partir du résidu du broyat épuisé par le chloroforme. Des

volumes de 10 mL d’eau et de 1 mL d’acide chlorhydrique concentré y sont ajoutés et le tube

à essai est maintenu au bain-marie bouillant pendant 15 minutes. Un volume de 5 mL de

l’hydrolysat est agité avec 5 mL de chloroforme. A la phase organique, est ajoutée 1 mL de la

solution d’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) diluée. Une coloration rouge plus ou moins

intense indique la présence de génines d’O-hétérosides.

IV.11.2. Test de détection des C-hétérosides

La solution à analyser est la phase aqueuse obtenue avec la solution à analyser des O-

hétérosides. A cette solution sont ajoutés 10 mL d’eau distillée et 1 mL de solution de FeCl3 à

1%. La solution est chauffée au bain-marie pendant 30 minutes. Elle est refroidie sous un

courant d’eau puis agitée avec 5 mL de chloroforme. La phase au chloroforme est soutirée et 1

mL de solution de NH4OH diluée est ajouté. L’apparition d’une coloration rouge plus ou moins

intense indique la présence de génines de C-hétérosides.

IV.12. Test de détection composés réducteurs

Un volume de 5 mL de décocté aqueux à 10 % est évaporé au bain-marie jusqu’à sec.

Après ajout de 1 mL de réactif de Fehling au résidu, l’obtention d’un précipité rouge-brique

indique la présence de composés réducteurs.

IV. 13. Mucilages

Les mucilages sont des substances végétales, constituées de polysaccharides, qui

gonflent au contact de l'eau en prenant une consistance visqueuse, parfois collante, semblable

à la gélatine.

A 1 mL de décocté à 10 % sont ajoutés 5 mL d’éthanol absolu. L’obtention d’un

précipité floconneux, par mélange, indique la présence de mucilages.


Le screening phytochimique, basé sur des tests de coloration et de précipitation, permet

d’identifier des familles de métabolites secondaires des plantes. Plusieurs méthodes de

détection des alcaloïdes, des flavonoïdes, des stérols et terpènes, des tanins, des coumarines,




des composés réducteurs, des O- et C- hétérosides, des mucilages, des anthocyanes, des

leucoanthocyanes, des saponosides et des anthraquinones ont été décrites.




CHAPITRE II: MODELISATION ET OPTIMISATION DU

RENDEMENT D’EXTRACTION

Dans cette partie, il s’agira de présenter le procédé employé pour modéliser et optimiser

l’extraction des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus.

I. MODELISATION

I.1. Enumération des facteurs

Nous avons choisi six facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites

secondaires qui sont la durée de séchage du matériel végétal, la granulométrie du broyat, le

pourcentage d’alcool dans le solvant, le ratio volume de solvant sur masse de broyat, la durée

de macération et la vitesse d’agitation (Chemat et al., 2015; Raaman, 2006; Walton and Brown,

1999). Notons que le solvant hydro-éthanolique est largement utilisé pour l’extraction des

métabolites secondaires des plantes (Chemat et al., 2015; Raaman, 2006; Walton and Brown,

1999) et il est proche de l’eau généralement utilisée en médecine traditionnelle.

I.2. Domaines de valeurs

Les domaines de valeurs des facteurs ont été fixés en fonction du matériel disponible au

laboratoire. Au niveau de la granulométrie et de la vitesse d’agitation, le choix a été fait par

rapport aux tamis et aux agitateurs magnétiques disponibles dans notre laboratoire. Quant aux

autres facteurs, le choix a été fait en tenant compte des conditions de macération trouvées dans

la littérature (Ćujić et al., 2016; Feknous et al., 2015; Huie, 2002). Le tableau 4 résume le choix

des valeurs des facteurs énumérés.

Tableau 4: Facteurs recensés

Codage Facteurs Valeur (-1) Valeur (+1)

X1 Durée de séchage 14 jours 28 jours

X2 Granulométrie <= 0,4 mm <=2 mm

X3 Pourcentage d’alcool du solvant 50% 90%

X4 Ratio (volume sur masse de broyat) 5 mL/g 10 mL/g

X5 Durée de macération 12h 24h

X6 Vitesse d'agitation 500 rpm 1600 rpm




I.3. Matrice de Plackett-Burman

Pour l’établissement de la matrice de Plackett-Burman (Plackett and Burman, 1946;

Wallis, 1972), un facteur fictif (x7) a été ajouté pour que le nombre de facteurs k (fictifs et réels)

soit du type (k + 1), multiple de 4 et corresponde au nombre d’expériences. Le tableau 5 présente

la matrice des expériences.

Tableau 5: Matrice des expériences

Test x1

(semaines) x2 (mm) x3 (%)

x4

(g/mL) x5 (h) x6 (rpm)

1 4 0,4 50 10 12 1600

2 4 2 50 5 24 500

3 4 2 90 5 12 1600

4 2 2 90 10 12 500

5 4 0,4 90 10 24 500

6 2 2 50 10 24 1600

7 2 0,4 90 5 24 1600

8 2 0,4 50 5 12 500

I.4. Réalisation des tests

Le matériel végétal est séché pendant une durée x1 dans une salle à température

ambiante (entre 28 et 30°C) ; puis broyé et tamisé pour donner une poudre de granulométrie x2.

Une masse de 10 g du broyat est introduite dans un volume x3 d’un solvant hydro-éthanolique

de composition x4 et macéré pendant une durée x5 avec une vitesse de rotation x6. Après

filtration du mélange, le solvant évaporé et l’extrait obtenu est pesé.

Les tests 1 à 8 sont réalisés en prenant les valeurs des facteurs du tableau 5.

II. OPTIMISATION DU MODELE

L’optimisation du modèle obtenu après le traitement des résultats est réalisée en utilisant

la suite Excel du logiciel Microsoft Office avec le complément solveur qui permet de faire une

optimisation par la méthode des Simplex (Han et al., 2017; Ribeiro-Santos et al., 2017) . Cette

méthode est utilisée pour les modèles linéaires et elle permet de trouver une solution optimum.


Les plans d’expériences planifient des expériences pour avoir des résultats à traiter en

vue de modéliser le phénomène et d’en tirer les conditions optimales de travail. Le plan de

Plackett et Burmann sera utilisé pour déterminer les paramètres significatifs qui influencent les




rendements des extractions. La méthode de simplex est proposée pour optimiser le rendement

d’extraction.




CHAPITRE III: IDENTIFICATION ET DETERMINATION

STRUCTURALE

I. IDENTIFICATION CHROMATOGRAPHIQUE ET SPECTROSCOPIQUE

I.1. Identification par chromatographie

I.1.1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC)

L’analyse chromatographique sur couche mince a été réalisée sur une plaque en verre

de 20 cm sur 20 cm, sur laquelle est recouvert un gel de silice. Chaque extrait de plante a sa

plaque sur laquelle ont été déposées les différentes fractions à faire éluer. Les points de dépôts

ont été espacés de 26,6 mm en commençant à 20 mm du bord gauche. Le dépôt des fractions

sur la plaque a été fait automatiquement par l’appareil CAMAG Automatic TLC Sampler III

(ATS3). Les fractions ont été déposées à 30 mm de la plaque et le front de solvant à la fin de

l’élution a été noté à 185 mm. La lampe de détection a été calibrée pour balayer les longueurs

d’ondes suivantes : 250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm. Le solvant d’élution est un mélange

binaire hexane-acétate d’éthyle (1/3) (v/v). Les chromatogrammes sont générés en fichier PDF

sur l’ordinateur de l’appareil.

Les longueurs d’onde utilisées pour révéler les tâches en HPTLC permettent de repérer

les différents groupes chromophores et auxophores afin de corréler les spectres infra rouges et

les chromatogrammes HPTLC pour identifier les familles de métabolites secondaires.

I.1.2. Chromatographie liquide à haute pression (HPLC)

La chromatographie liquide à haute pression a été réalisée avec un chromatographe

HPLC de type Dionex RF 2000 équipée d’une pompe socratique P 680. Les échantillons ont

été préparés dans un solvant de même nature que l’éluant de départ à savoir un mélange eau-

acétonitrile (1:1), dilués au 1/10. Les conditions expérimentales de l’analyse sont données dans

les tableaux suivants selon la fraction analysée. Le détecteur utilisé est un détecteur UV-visible

à diode, et la longueur d’onde choisie dépend de la nature de l’extrait ou fraction analysé.

I.1.2.1. Conditions expérimentales pour Alchornea cordifolia

a. Fraction à l’acétate d’éthyle

Les tableaux 6 et 7 donnent les conditions de fonctionnement de la colonne ainsi que le

gradient de solvant appliqué.




Tableau 6: Conditions expérimentales de la HPLC

Paramètres Valeurs

Type de colonne Kromasil 100 SIL (5 µm 250 x 4 mm)

Quantité injectée 1,0 µL

Solvant d’élution Eau/Acétonitrile (en mode gradient)

Débit 1 mL/min

Détecteur à diode UV λ = 220 nm

Durée d’analyse 260 min

Tableau 7: Gradient de solvant

Paliers Temps (minutes) Eau (%) Acétonitrile (%)

1 0 93 7

5 93 7

2 125 70 30

3 140 0 100

170 0 100

4 195 100 0

260 100 0

b. Fraction à l’hexane

Les tableaux 8 et 9 déroulent les conditions de fonctionnement de la colonne et le

gradient de solvant.


Paramètres Valeurs




Débit 1 mL/min








1 0 100 0

20 100 0

2 60 0 100

65 0 100

3 70 50 50

75 75 25

4 80 100 0

90 100 0

c. Fraction au butanol

Les tableaux 10 et 11 nous donnent les conditions expérimentales de la réalisation de

la manipulation.


Paramètres Valeurs




Débit 1 mL/min





1 0 93 7

30 95 15

2 45 0 100

60 0 100

3 75 100 0

90 100 0




I.1.2.2. Conditions expérimentales pour Phyllanthus amarus

a. Fraction à l’hexane


Paramètres Valeurs




Débit 1 mL/min





1 0 100 0

20 100 0

2 60 50 50

80 50 50

3 120 0 100

140 0 100

4 160 100 0

180 100 0

b. Fraction à l’acétate d’éthyle


Paramètres Valeurs




Débit 1 mL/min








1 0 93 7

5 93 7

2 125 70 30

3 136 50 50

147 50 50

4 158 0 100

169 0 100

5 180 100 0

190 100 0

c. Fraction au résidu aqueux


Paramètres Valeurs




Débit 1 mL/min





1 0 90 3

30 85 15

2 45 0 100

60 0 100

3 75 100 0

90 100 0




I.2. Identification par spectroscopie

I.2.1. Spectroscopie infrarouge

Les différentes fractions (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et résidu

aqueux) ont été analysées en spectroscopie infrarouge. Cette analyse se déroule en deux étapes :

la préparation de la pastille à analyser et l’analyse proprement dite. Une masse de 5 à 10 mg de

l’échantillon à analyser est pesée, puis la masse est complétée à 300 mg avec du bromure de

potassium (KBr). L’ensemble est mélangé puis broyé manuellement en une fine poudre qui est

ensuite pressée à l’aide d’une presse manuelle jusqu’à 200 bars pendant 30 secondes. Une

pastille est obtenue par cristallisation de la poudre. Cette pastille est introduite dans la chambre

optique du spectroscope pour analyse. Une pastille neutre (ne contenant que du KBr) est utilisée

pour la mise à niveau de l’appareil. Un ordinateur couplé à l’appareil permet de recueillir le

spectre de l’échantillon. Dans le cas d’un échantillon liquide, des pastilles en ZnSe sont

utilisées. Elles sont préalablement rincées avec du chloroforme, puis une goutte de l’échantillon

est déposée entre deux pastilles de ZnSe. Elles sont ensuite introduites dans la chambre optique

pour analyse.

I.2.2. Spectroscopie UV-visible

Les spectres UV des échantillons ont été mesurés lors des analyses HPLC couplée à la

spectroscopie UV-visible grâce au détecteur à barrette diode.

II. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN

PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS)

permet l’identification de quelques composés. Pour les extraits de plante, cette analyse nécessite

une hydrolyse acide suivie de la silylation des différents échantillons.

II.1. Hydrolyse acide

A 10 g de poudre préalablement extrait par l’hexane jusqu’à épuisement des lipides,

sont additionnés 50 mL d’une solution d’acide chlorhydrique (HCl, 2N). L’ensemble est porté

à reflux pendant 2 heures. Après refroidissement, l’hydrolysat est traité par l’acétate d’éthyle

(3 × 50 mL) pour extraire les aglycones. Les fractions organiques sont regroupées et séchées




sur sulfate de magnésium anhydre (MgSO4). Après filtration, le filtrat est concentré sous vide

et conservé sous azote.

II.2. Silylation des différents échantillons

La silylation est utilisée en GC-MS pour transformer les composés contenus dans les

extraits dérivés du triméthylsilyle (TMS) plus volatils, moins polaires et plus thermos tolérants.

Dans le cadre de notre étude, nous avons utilisé comme agent de silylation le N-méthyl-N-

triméthylsilyl trifluoroacétamide (MSTFA). La réaction de silylation du groupement hydroxyle

en présence de MSTFA est donnée dans le schéma 2. A 3 mg de chaque échantillon sont

additionnés 0,5 mL de dichlorométhane (CH2Cl2) distillé et 0,2 mL de MSTFA. L’ensemble est

chauffé à 37°C pendant 30 minutes.

R OH +

O

N

F

F

FCH3

Si

CH3

CH3

R O Si

CH3

CH3

CH3

CH3

Schéma 2:Réaction de silylation du groupement hydroxyle en présence de MSTFA

II.3. Mode opératoire de la GC-MS

L’analyse a été effectuée sur un chromatographe en phase gazeuse couplé à un

spectrophotomètre de masse de marque SHIMADZU, modèle QP2010SE avec une colonne

Zébron ZB-5ms de 20 m de long, d’un diamètre intérieur de 0,18 mm et d'une épaisseur de film

de la phase stationnaire de 0,18 µm. L'hélium a été employé comme gaz porteur, avec une

vitesse linéaire de 0,9 mL/s. La température (70 à 270°C) du four a été programmée à 4°C/min

et maintenue à 270°C pendant 20 minutes. Les températures de l'injecteur et du détecteur ont

été fixées respectivement à 280°C et 290°C. L’injection a été réalisée en mode splitless. Les

paramètres du spectromètre de masse pour le mode d’impact électronique sont : la température

de la source d’ionisation 230°C, l’énergie de 70 eV, la vitesse de scan 50 scans/s et la vitesse

d’acquisition 10 000 uma/s. L'identification des composés silylés a été possible, en comparant

les temps de rétention avec ceux des standards et les données spectrales obtenues à partir des

bibliothèques Wiley et NIST. Chaque détermination a été effectuée en trois exemplaires.





Les méthodes spectroscopique et chromatographique seront utilisées pour la séparation,

l’identification et la détermination structurale des métabolites secondaires des plantes. Leurs

principes sont basés sur la détection des fonctions chimiques caractéristiques des différentes

familles de molécules.

89



PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION




CHAPITRE I: BIBLIOMETRIE

Il a s’agit de faire un état des lieux des travaux effectués sur chacune des plantes

étudiées. Dans les prochaines lignes, nous étayerons les résultats de cette bibliométrie par

plante.

I. PHYLLANTHUS AMARUS

La première publication a été enregistrée en 1985. La période de notre bibliométrie

s’étant donc de 1985 au mois de mars de l’année 2016. 557 publications ont été enregistrées

dans cet intervalle de temps ; 433 publications (77,74% du total) parmi celles-ci ont été

enregistrées dans les dix dernières années (2006-2016) avec 60,05% dans les cinq dernières

années (2011-2016). Le pic de publications a été observé en 2011 avec 67 publications. Ces

chiffres montrent un engouement sur le sujet. C’est en moyenne sur toute la période d’étude,

17,41 publications par an sur Phyllanthus amarus avec 43,33 publications par an sur les cinq

dernières années, soit une augmentation de 149% sur la moyenne globale. Phyllanthus amarus

est donc une plante qui suscite l’intérêt scientifique. La figure 42 illustre le nombre de

publications par année sur la période d’étude (1985-2016).

Figure 44:Nombre de publications par année sur Phyllanthus amarus

Au niveau des auteurs, un peu plus de 950 ont publié sur le sujet. L’auteur qui a le plus

publié sur la thématique est Kuttan Ramasadan avec 16 publications. La figure 43 montre le

premier, deuxième et troisième meilleur auteur (en nombre de publications).

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Année




Figure 45: Classement des auteurs en fonction du nombre de publications

Concernant le type de publication, les journaux et articles de journaux viennent en tête

avec 40% des publications. Il faut noter aussi la pertinence en termes de découverte et utilité

scientifique de la plante qui s’observe avec un taux élevé de brevet (4,54% des publications).

Le journal désigne un ensemble d’article qui paraissent dans un même volume ; l’article de

journal est un chapitre du journal et un article est une publication qui parait seul de façon

individuelle sans être dans un ensemble d’autre article d’un journal. La figure 44 résume la part

de chaque type de publications dans le total.

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2

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Kuttan Ramadasan Thyagarajan S P Foo L Yeap Krithika Rajesh

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Auteurs




Figure 46: Camembert représentant la part de chaque type de publication sur

Phyllanthus amarus

II. ALCHORNEA CORDIFOLIA

La première publication sur Alchornea cordifolia a été écrite en 1921 ; mais la recherche

sur cette plante a démarré réellement dans les années 90. Les publications traitant de cette plante

sont au nombre de 110 sur une période entre 1921 et 2016. 75 d’entre elles ont été publier entre

2006 et 2016 et 53,33% de ces 75 dans les cinq dernières années (2011-2016). Le pic de

publication a été observé en 2010 avec 13 publications. La moyenne globale est de 1,2

publications par an, contre une moyenne de 6,8 publications entre 2006 et 2016, soit une hausse

de 489% sur la tendance globale, et une moyenne de 6,7 publications entre 2011 et 2016, soit

une baisse de 2,22% par rapport à la moyenne des dix dernières années. Si l’intérêt scientifique

sur Alchornea cordifolia ne cesse de croitre sur ces dix dernières années, il faut constater cette

croissance est en ralentissement sur les cinq dernières années. La figure 45 résume l’évolution

du nombre de publications au fil des années.

40%

14%

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Journal

Article

Article de journal

Fichier en ligne

Support à la recherche

Brevet

Review

Essai clinique

Essai clinique controllé

Etude comparative




Figure 47:Nombre de publications sur Alchornea cordifolia au fil des années

Au niveau des auteurs, c’est Pieters Luc qui vent en tête avec le plus grand nombre de

publication sur Alchornea cordifolia avec 8 publications. La figure 46 donne les trois auteurs

les plus prolifiques sur cette plante.

Figure 48: Trois premiers auteurs en nombre de publications sur Alchornea cordifolia

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8

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Pieters L Vlietinck A J Apers S

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Auteurs




Les publications sur Alchornea cordifolia sont à 42% des articles de journaux. Il est à

souligner la présence de deux brevets et aucune revue bibliographique (jusqu’à la date de mars

2016).

Figure 49: Répartition des différents types de publication sur Alchornea cordifolia

III. TRIDAX PROCUMBENS

La première publication sur Tridax procumbens a été enregistré en 1930 ; mais l’intérêt

scientifique sur cette plante a pris son envol dans les années 1970. On compte 354 publications

sur la période entre 1930 et 2016 soit une moyenne de 4,07 publications par an. Cependant,

l’étude bibliométrique nous montre que nous sommes en plein dans les investigations sur Tridax

procumbens, avec 275 sur 354 publications entre 2006 et 2016. 75% (205) de ces publications

ont été enregistrées dans les cinq dernières années (2011-2016) avec le pic de publications en

2015 (51). Cela montre que les travaux scientifiques sur cette plante sont d’actualité. La figure

47 résume les observations du nombre de publications sur Tridax procumbens par an.

42%

17%

17% 13%

6% 2%

2%

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Journal

Article

Article de Journal

Fichier en ligne

Support de recherchegouvernementalConférence

Etude comparative

Brevet




Figure 50: Nombre de publication sur Tridax procumbens par an

L’auteur le plus prolifique dans les publications sur Tridax procumbens est Yuan Ke

avec 9 publications. Les deuxièmes et troisièmes places sont données dans la figure 49.

Figure 51: Classement des auteurs les plus prolifiques sur les publications sur Tridax

procumbens

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Auteurs




Le type de publication le plus répandu dans les publications sur Tridax procumbens est

le journal avec 51% des publications. Cette plante a de nombreuses potentialités à la vue du

nombre de brevets déposés (33) représentant 5% des publications. Une seule revue

bibliographique a été faite sur Tridax procumbens. La figure 50 illustre la répartition des

publications par type.

Figure 52: Répartition des publications sur Tridax procumbens par type

Discussion

Les trois études bibliométriques sur les plantes de notre travail ont toutes montrées une

évolution conséquente de l’intérêt scientifique porté sur elles. Cela est d’abord dû à

l’accroissement de l’activité scientifique de façon globale mais aussi de façon spécifique aux

domaines des substances naturelles dans le souci de trouver des alternatives aux composés de

synthèses tant dans l’industrie pharmaceutique que chimique. L’essor donc de nouvelles

méthodes d’analyses telles que la chromatographie en phase liquide à haute pression et la

chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse a impulsé

l’investigation de nouvelles molécules. L’utilisation de nouvelles techniques d’identification et

de séparation pourrait donc augmenter cet engouement scientifique autour de ces plantes. En

51%

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11%

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Journal

Fichier en ligne

Article

Ariticle de journal

Brevet

Support de recherchegouvernementale

Conférence

Etude d'évaluation

Review




effet des études bibliométrique effectuées sur les substances naturelles actives contre le cancer

ont montré un hausse substantielle des publications sur le sujet (Tang and Du, 2014). Une autre

étude sur l’économie botanique a montré aussi l’intérêt grandissant de la science sur les plantes

(Biswas et al., 2007).


Les résultats de la bibliométrie nous indiquent que les plantes de l’étude ont des intérêts

scientifiques réels vu le nombre de plus en plus croissant de publications. Cette nouvelle

approche scientifique est de plus en plus utilisée et conseillée avant d’entreprendre des études

sur une thématique donnée.




CHAPITRE II: CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES

I. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES BROYATS

I.1. Résultats

Les tests phytochimiques effectués ont permis de mettre en évidence la présence ou non

de différentes familles de composés recherchés dans les organes des plantes étudiées.

Les criblages phytochimiques du broyat des organes des différentes plantes ont porté

sur les familles de métabolites secondaires présents dans le tableau 18.




Tableau 18: Criblages phytochimiques des broyats de Tridax procumbens, Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus

FAMILLES DE

METABOLITES

SECONDAIRES

Tridax procumbens Alchornea cordifolia Phyllanthus amarus

Racines Tiges Fleurs Feuilles Feuilles Plante entière

Alcaloïdes + - + + + +

Tanins catéchiques + + - - + +

Tanins galliques + + + + + +

Anthocyanes + - + - + +

Flavonoïdes + + + + + +

Leucoanthocyanes + + + + + -

Coumarines + + + + - -

Anthraquinones libres - - - - - -

O-hétérosides + - - - +

C-hétérosides + - - - +

Stérols et terpènes + + + + + +

Composés réducteurs + + + + - +

Mucilages + + + + - +

Saponines - - - - + +

+ : Présence ; - : Absence




I.2. Discussion

L’analyse des résultats du tableau 18 montre que les racines de Tridax procumbens sont

les plus riches en métabolites secondaires avec la présence de douze (12) familles sur les

quatorze (14) recherchées soit 85,71% des métabolites secondaires recherchés. En effet, une

grande partie de ces métabolites secondaires sont des molécules de défense qui éloignent les

prédateurs ou inhibent la croissance de plantes concurrentes. Ces molécules sont concentrées

dans les racines, partie du végétal la plus exposée aux agressions de l'environnement. Les fleurs

de Tridax procumbens contiennent neuf (9) familles de métabolites secondaires sur les (14)

recherchées soit 64,29%. Enfin, les tiges et les feuilles de Tridax procumbens contiennent tous

les deux huit (8) familles sur les quatorze (14) recherchées soit 57,14% des métabolites

secondaires. Les résultats du criblage phytochimique révèlent l’absence d’anthraquinones libres

et de saponines dans l’ensemble des organes de Tridax procumbens. Les O-hétérosides et C-

hétérosides sont uniquement présents dans les racines. Les alcaloïdes sont présents dans les

fleurs, les racines et les feuilles mais absents dans les tiges. Les tanins galliques, les

leucoanthocyanes, les coumarines, les stérols et terpènes, les composés réducteurs et les

mucilages sont présents dans tous les organes de Tridax procumbens. Les tanins catéchiques

sont concentrés dans les racines et la tige et ils sont totalement absents dans les feuilles et les

fleurs. Les anthocyanes sont absents dans la tige alors que les autres flavonoïdes (en particulier

les flavones et / ou flavanones) sont présents dans tous les organes de la plante.

Il existe très peu d’études chimiques sur Tridax procumbens et la plupart de celles qui

existent concernent les feuilles. Les études antérieures réalisées sur les feuilles de l’espèce de

l’Inde ont révélé la présence d’alcaloïdes, de flavonoïdes (catéchine et flavone) ainsi que de

tanins (Christudas et al., 2012; Mundada et al., 2010) et celles réalisées au Nigeria ont révélé

la présence de saponines (Jude et al., 2009) alors que l’espèce ivoirienne de l’étude n’en

contient pas. Les travaux de la littérature auxquels nous avons eu accès n’ont pas rapporté la

présence de flavanones, de leucoanthocyanes, de coumarines, de composés réducteurs ni de

mucilages dans les feuilles. Cela pourrait être dû au fait que ces métabolites sont absents ou

n’ont pas été recherchés. Une étude sur les fleurs de l’espèce de l’Inde a révélé la présence de

saponines (Saxena and Albert, 2005) alors que l’espèce ivoirienne n’en contient pas. La

comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature montre que nous sommes en

présence d’un nouveau chémotype.




Les feuilles de Alchornea cordifolia contiennent neuf (9) familles de métabolites

secondaires sur les (14) recherchées soit 64,29%. On note la présence d’alcaloïdes, de tanins

catéchiques et galliques, d’anthocyanes, de flavonoïdes, de leucoanthocyanes, de terpènes et

stérols ainsi que de saponines. Les mucilages, composés réducteurs et les O- et C- hétérosides

sont absents des feuilles de Alchornea cordifolia. Les résultats obtenus sont presque similaires

à ceux réalisés sur les feuilles de la plante récoltée au sud de la Côte d’Ivoire sauf que l’espèce

du sud ne contient pas d’alcaloïdes (N’guessan et al., 2011). Toutefois, les travaux réalisés sur

l’espèce malienne ont montré la présence d’alcaloïdes à un taux de 0,1 % dans les rameaux

feuillés de la plante (Togola, 2002). Nos résultats montrent la présence d’anthocyanes et de

saponines alors que ces deux familles de métabolites secondaires sont absentes dans l’espèce

malienne. Cependant, les coumarines, absentes des feuilles de notre étude, sont présentes dans

celles de N’guessan (2011) et de Togola Adiaratou (2002). Les mucilages et les composés

réducteurs, absents des deux espèces de la Côte d’Ivoire sont présents dans celle du Mali.

La plante entière de Phyllanthus amarus contient douze (12) familles sur les quatorze

(14) recherchées soit 85,71% des métabolites secondaires recherchés. Les leucoanthocyanes,

les coumarines et les anthraquinones libres sont absents de la plante entière. La présence de ces

douze familles de composés renforce les activités biologiques et pharmacologiques de la plante.

Les résultats obtenus sont proches de ceux de N’Guessan et de ses collaborateurs (N’Guessan

et al., 2009) qui notent cependant l’absence de tanins galliques et de saponines dans l’espèce

récoltée à Agboville dans le sud de la Côte d’Ivoire. L’espèce nigériane de cette plante contient

tous les métabolites secondaires présents dans la plante de notre étude (Umoh et al., 2013) alors

que les stérols et terpènes ainsi que les mucilages sont absents dans l’espèce étudiée au

Cameroun (Joseph et al., 2015).

Au total, la présence des familles de métabolites secondaires pourrait être à la base des

activités pharmaceutiques de Tridax procumbens, de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus

amarus. En effet, l’activité antibiotique pourrait être due aux alcaloïdes des plantes (Kahlouche-

Riachi, 2014). Les activités antioxydantes, anti-inflammatoires et antivirales pourraient

provenir des composés polyphénoliques (Ecra et al., 2001). Les activités anti diarrhéiques et

antiseptiques pourraient provenir des tanins galliques (Becker et al., 2005). Par ailleurs, les tests

phytochimiques ont mis en évidence la présence de coumarines dans tous les organes de T.

procumbens linn qui pourraient justifier les activités antihypertensives et anti-inflammatoires

attribuées à cette plante (Becker et al., 2005). Les terpènes et stérols contenus dans ces plantes




pourraient leur conférer plusieurs propriétés biologiques. En effet, les stérols, de structures

proches de celle du cholestérol, limitent le passage de celui-ci dans le sang en détournant

l’organisme, entrainant ainsi l’élimination de la grande partie de ce dernier. De plus, les stérols

ne sont pas fabriqués par le corps humain et ils doivent donc être apportés par l’alimentation.

Quant aux terpènes, ils sont cytotoxiques sur diverses lignées cellulaires tumorales (Oberlies et

al., 2002; Sai Prakash et al., 2002; Shen, 2004), ils présentent des propriétés

immunomodulatrices, des activités trypanocides (Espindola et al., 2004; Hunter et al., 1997),

antileishmaniales et antiplasmodiales (Jullian et al., 2005) et une activité modérée contre

Mycobacterium tuberculosis (Kanokmedhakul et al., 2005).

II. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES EXTRAITS DE TRIDAX

PROCUMBENS

II.1. Criblages phytochimiques des extraits hydroalcooliques de Tridax

procumbens

II.1.1. Résultats

Les résultats du criblage phytochimique sur la poudre brute des différents organes de la

plante avaient révélé l’absence d’anthraquinones libres et de saponines. Ces résultats ont été

confirmés dans l’extrait hydro alcoolique (Tableau 19).




Tableau 19:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction hydro alcoolique de

Tridax procumbens

FAMILLE DE

METABOLITES

SECONDAIRES

ORGANES DE LA PLANTE

Racines Tiges Fleurs Feuilles

Alcaloïdes + - + +

Tanins catéchiques + + - -

Tanins galliques + + + +

Anthocyanes - - - -

Flavones + - + -

Flavanones - + - +

Leucoanthocyanes + - + +

Coumarines + + + +

O-hétérosides - - - -

C-hétérosides - - - -

Stérols et terpènes + + + +

Composés réducteurs - - + +

Mucilages - - - +

+ : Présence ; - : Absence

II.1.2. Discussion

Les résultats du criblage phytochimique des extraits hydro alcooliques des différents

organes de la plante révèlent l’absence d’anthocyanes ainsi que de O- et C-hétérosides dans

l’ensemble des organes de la plante. Cela pourrait expliquer leur extraction par les solvants

polaires tels que le mélange butanol/eau. Les alcaloïdes sont présents dans l’extrait hydro

alcoolique des racines, des feuilles, et des fleurs mais absents dans les tiges, ce qui confirme les

résultats précédents. Les tanins galliques, les coumarines, les stérols et terpènes sont également

présents dans les extraits hydro alcooliques de tous les organes de la plante. Les tanins

catéchiques sont concentrés dans les tiges et les racines et sont absents dans les feuilles et les

fleurs. Les flavones sont uniquement présentes dans les racines et les fleurs alors que les

flavanones sont uniquement présentes dans la tige et les feuilles. Les leucoanthocyanes sont




absents dans la tige alors que les composés réducteurs sont concentrés dans les fleurs et les

feuilles. Les mucilages sont présents dans les feuilles.

II.2. Criblage phytochimique des extraits dichlorométhane/éthanol des feuilles suivi de la

digestion et de la décoction

II.2.1. Résultats

Les résultats du criblage phytochimique sur le broyat des feuilles ont révélé l’absence

de tanins catéchiques, d’anthocyanes, de flavones, d’anthraquinones libres, de O- et C-

hétérosides et de saponines. Ces résultats ont été confirmés dans l’extrait

dichlorométhane/éthanol (Tableau 20).

Tableau 20:Résultats du criblage phytochimique de l’extraction

dichlorométhane/éthanol des feuilles suivie de la digestion et de la décoction

FAMILLE DE

METABOLITES

SECONDAIRES

Tridax procumbens FEUILLES DE LA PLANTE

CH2Cl2/EtOH Digesté aqueux

(50°C)

Décocté aqueux

(100°C)

Alcaloïdes + - +

Tanins galliques - + +

Flavanones - + +

Leucoanthocyanes - + +

Coumarines + + +

Stérols et terpènes - - -

Composés réducteurs - + +

Mucilages - + +

+ : Présent ; - : Absence

II.2.2. Discussion

Les résultats du tableau 20 montrent que le mélange dichlorométhane/éthanol a extrait

les alcaloïdes et les coumarines. L’eau (à 50°C) a extrait la plupart des métabolites secondaires

à l’exception des alcaloïdes, des stérols et des terpènes. L’eau (à 100°C) a également extrait la

plupart des métabolites secondaires à l’exception des stérols et terpènes.




III. CRIBLAGES PHYTOCHIMIQUES DES FRACTIONS ISSUES DES

EXTRAITS HYDROALCOOLIQUES

III.1. Résultats

Le screening phytochimique des fractions de Tridax procumbens, de Alchornea

cordifolia et de Phyllanthus amarus se sont déroulés sur les trois familles de métabolites

secondaires les plus importantes à savoir les flavonoïdes, les alcaloïdes ainsi que les terpènes

et stérols. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 21.




Tableau 21: Screening phytochimiques de trois familles de métabolites secondaires dans Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus

Fractions

Familles de métabolites secondaires

recherchées dans A. cordifolia


recherchées dans P. amarus


recherchées dans T. procumbens

Terpènes

et stérols Alcaloïdes Flavonoïdes

Terpènes


Terpènes


Hexane - + + + + + + - -

Dichlorométhane + - + - + + + - -

Acétate d’éthyle - - + + + + - - -

Butanol + + + - + + - + +

Eau - - + + + + + + +

+ : Présent ; - : Absence




III.2. Discussion

La fraction à l’hexane des feuilles de Alchornea cordifolia a révélé la présence de

flavonoïdes et d’alcaloïdes. Cela est confirmé par les travaux de Adeshina en 2012 sur la même

plante en provenance du Nigéria (Adeshina et al., 2012). Bien que les travaux récents réalisés

sur les feuilles de Alchornea cordifolia récoltées dans le sud de la Côte d’Ivoire indiquent la

présence de flavonoïdes dans la fraction à l’hexane, les auteurs n’ont pas détecté d’alcaloïdes

dans cette fraction (N’guessan et al., 2011). Cela confirme encore que nous sommes en présence

d’un nouveau chémotype de cette plante. Les terpènes et les flavonoïdes sont présents dans la

fraction au dichlorométhane alors que les alcaloïdes sont absents de cette fraction. Ces résultats

corroborent ceux de N’guessan en 2011 (N’guessan et al., 2011) qui ont plutôt utilisé le

chloroforme qui est aujourd’hui remplacé par le dichlorométhane à cause de sa plus grande

toxicité. Quant à la fraction à l’acétate d’éthyle elle ne contient que des flavonoïdes. Ces

résultats corroborent les travaux de la littérature (Adeshina et al., 2010; N’guessan et al., 2011).

La fraction au butanol contient tous les métabolites secondaires recherchés (alcaloïdes, terpènes

et flavonoïdes). Ces familles ont également été obtenues dans l’espèce nigériane (Mohammed

et al., 2013; Adeshina et al., 2010; N’guessan et al., 2011) mais seuls les flavonoïdes, recherchés

dans les travaux réalisés sur l’espèce du sud de la Côte d’Ivoire, ont été présents. La fraction

aqueuse ne contient que des flavonoïdes, ce qui est confirmé par les travaux de Nga en 2017

(Nga et al., 2017).

Le criblage phytochimique de la fraction à l’hexane de la plante entière de Phyllanthus

amarus a révélé la présence de toutes les familles de métabolites secondaires recherchées

(Alcaloïdes, terpènes et flavonoïdes). Des résultats similaires ont été obtenus par Zubair et ses

collaborateurs en 2017 (Zubair et al., 2017) lors de l’étude sur la même plante en provenance

du Nigéria. La fraction au dichlorométhane contient des flavonoïdes et des alcaloïdes mais ne

contient pas de terpènes et stérols. Ces résultats sont conformes à ceux de Khatoon en 2006

(Khatoon et al., 2006) mais en contradiction avec ceux de Okolo et ses collaborateurs en 2012

qui ont trouvé les trois familles de notre étude dans une espèce du Nigéria. La fraction à l’acétate

d’éthyle contient toutes les familles de métabolites recherchée (Alcaloïdes, terpènes et

flavonoïdes) comme précédemment confirmé par Karuna et ses collaborateurs en 2009 (Karuna

et al., 2009). La fraction au butanol contient des alcaloïdes et des flavonoïdes mais pas de

terpènes et stérols, alors que les trois familles de l’étude ont été retrouvées dans cette même




fraction au Nigéria (Okolo et al., 2012). Quant à la fraction aqueuse, elle contient toutes les

trois familles, comme l’ont montré des études antérieures (N’Guessan et al., 2009; Okolo et al.,

2012). Toutefois, les travaux réalisés par (Khatoon et al., 2006) ont mentionné uniquement la

présence de composés phénoliques dans cette fraction. Cela peut être dû au fait que la fraction

aqueuse analysée par Khatoon résulte d’une séparation successive par Soxhlet. L’absence des

deux autres familles serai donc dû au passage préliminaire des solvants apolaires.

Le criblage phytochimique des fractions à l’hexane et au dichlorométhane des feuilles

de Tridax procumbens a révélé uniquement la présence terpènes et stérols. La fraction à

l’acétate d’éthyle ne contient aucune des trois familles de métabolites recherchée (Alcaloïdes,

flavonoïdes, terpènes et stérols) alors que toutes ces familles sont présentes dans la fraction

aqueuse. Nous n’avons pas trouvé dans la littérature d’études sur les fractions issues d’un extrait

hydroalcoolique pour les comparer à nos résultats. Toutes les études de la littérature concernent

des extraits et non des fractions. Les extraits à l’éther de pétrole (qui est souvent utilisé en lieu

et place de l’hexane) des feuilles de la plante d’origine indienne ont également révélé la

présence de terpènes et stérols en plus des alcaloïdes qui ne sont pas détectés dans notre fraction

à l’hexane (Chistudas et al., 2012). Les études réalisées sur l’extrait au chloroforme (qui est

souvent remplacé par le dichlorométhane) des feuilles de la plante d’origine indienne sont en

accord avec nos résultats quant à la présence de terpènes et stérols. Toutefois, ces études

montrent en plus, la présence d’alcaloïdes (Chistudas et al., 2012) ou encore la présence

d’alcaloïdes et de flavonoïdes (Sawant et al., 2013). Notre fraction au butanol ne contient pas

de terpènes et stérols alors que l’extrait à l’éthanol de la plante d’origine indienne contient cette

famille (Chistudas et al., 2012). Nos résultats sur la fraction aqueuse qui contient tous les trois

métabolites secondaires recherchés sont conformes à ceux de Sawant et ses collaborateurs pour

un extrait Acétone /eau (Sawant et al., 2013).

Les différences observées au niveau des résultats pourraient s’expliquer par plusieurs

facteurs tels que la zone de récolte, la période de récolte, le mode de préparation des fractions

(extraction successive ou directe) ou encore par une différence entre espèce du même genre

(Ayerdi Gotor, 2008). A titre d’exemple, les différences observées entre nos travaux et ceux de

N’guessan Koffi et ses collaborateurs pourraient être liées au choix des organes de plantes. En

effet, les études de ces auteurs ont porté sur les feuilles de Phyllanthus amarus alors que nos

études ont concerné la plante entière.





Le criblage phytochimique a révélé une diversité de métabolites secondaires dans les

broyats et extraits des différentes plantes soumises à notre étude. Il a montré que les métabolites

secondaires présents dans les broyats se trouvent repartis dans les extraits en fonction de leur

polarité et leur affinité avec les différents solvants ou mélanges de solvants d’extraction.




CHAPITRE III: MODELISATION ET OPTIMISATION DES

RENDEMENTS D’EXTRACTION

I. MODELISATION DES RENDEMENTS D’EXTRACTION DE A.

CORDIFOLIA ET DE T. PROCUMBENS

I.1. Résultats

Les résultats obtenus après la réalisation des expériences nous donnent, pour les deux

plantes, des rendements compris entre 0,04 et 0,24. Les rendements les plus élevés ont été

obtenus avec les feuilles de Alchornea cordifolia, qui sont compris entre 0,02 et 0,24. Quant à

la plante entière de Tridax procumbens, les rendements sont compris entre 0,004 et 0,11. Les

rendements sont plus élevés lorsque le ratio volume/masse du broyat est à sa borne +1, quel que

soit la plante. Les figures 51 et 52 résument les différents rendements obtenus en fonction des

facteurs mis en jeu.

Figure 53: Résultats des expériences sur Alchornea cordifolia

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,5 0,9 0,5 0,9

100 ML 50 ML

0,021

0,136

0,188

0,239

0,179

0,11

0,069

0,015

Re

nd

em

en

t

Facteurs

Alchornea cordifolia

0,4 mm - 2 SEMAINES - 12h - 500 rpm

0,4 mm - 2 SEMAINES - 24h - 1600rpm

0,4 mm - 4 semaines - 12h - 1600 rpm

0,4 mm - 4 semaines - 24h - 500 rpm

2 mm - 2 SEMAINES - 12h - 500 rpm

2 mm - 2 SEMAINES - 24h - 1600 rpm

2 mm - 4 semaines - 12h - 1600 rpm

2 mm - 4 semaines - 24h - 500 rpm




Figure 54: Résultats des expériences sur Tridax procumbens

I.2. Discussion

Les résultats obtenus ont été traité en régression linéaire multiple à l’aide de la suite

Excel de Microsoft Office.

I.2.1. Au niveau de Alchornea cordifolia

Le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées et la détermination

des facteurs significatifs sont respectivement présentés dans les tableaux 22 et 23.

Tableau 22: Calcul de l'erreur expérimentale pour Alchornea cordifolia

Variables Coefficients Coeff*2 Facteur de

Student

Erreur

expérimentale

Constante 0,119625 0,23925 3,07768 0,06078

x7 0,009875 0,01975

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

12h 24h 24h 12h 12h 24h 24h 12h

0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm 0,4 mm 2 mm

0,5 0,9 0,5 0,9

10 ml/g 5 ml/g

0,088

0,004

0,102

0,04

0,106

0,02

0,092

0,022

Ren

de

men

ts

Facteurs

Tridax procumbens

4 semaines - 500 rpm







Tableau 23: Détermination des facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia

Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence

Constante 0,119625 0,119625 0,23925 OUI

x1 0,008125 0,008125 0,01625 NON

x2 -0,026375 0,026375 0,05275 NON

x3 0,036125 0,036125 0,07225 OUI

x4 0,059375 0,059375 0,11875 OUI

x5 0,005375 0,005375 0,01075 NON

x6 0,006125 0,006125 0,01225 NON

Il ressort donc de ces analyses qu’il y a deux facteurs significatifs à savoir le pourcentage

d’alcool (x3) et le ratio volume sur la masse de broyat (x4). Le modèle obtenu est donc le

suivant (relation 1) :

𝑅𝑑𝑡 = 0,036125 × 𝑃 + 0,059375 × 𝑅 + 0,119625 (1)

Avec :

- Rdt, le rendement en métabolites secondaires ;

- P, le pourcentage en éthanol dans le mélange eau-éthanol (entre 50 et 90%) ;

- R, le ratio volume de solvant (en mL) sur la masse de broyat en g (entre 5 et 10

mL/g).

La figure 53 illustre la dépendance du rendement à ces deux facteurs. En effet, le

rendement est maximum pour un ratio de 10 mL/g et un pourcentage de 90% en éthanol dans

le solvant.




Figure 55: Influences des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction de


I.2.2. Au niveau de Tridax procumbens

Le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées à la détermination

des facteurs significatifs sont respectivement consignés dans les tableaux 24 et 25.

Tableau 24: Calcul de l'erreur expérimentale pour Tridax procumbens

Variables Coefficients Coeff*2 Facteur de

Student

Erreur

expérimentale

Constante 0,05925 0,1185 3,077683537 0,004616525

x7 0,00075 0,0015

Tableau 25: Détermination des facteurs significatifs Tridax procumbens

Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence

Constante 0,05925 0,05925 0,1185 OUI

x1 -0,00125 0,00125 0,0025 NON

x2 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI

x3 0,03775 0,03775 0,0755 OUI

x4 -0,00775 0,00775 0,0155 OUI

x5 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI

x6 -0,00075 0,00075 0,0015 NON

0,298

0,418

0,036

0,205

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5 0,9

Re

nd

em

en

t

pourcentage en éthanol

10 ml/g

5 ml/g




Il ressort de ces analyses qu’il y a quatre (4) facteurs significatifs à savoir la

granulométrie du broyat (x2), le ratio volume sur la masse de broyat (x3), le pourcentage en

éthanol dans le solvant (x4) et la durée de macération (x5). Le modèle obtenu est donc le

suivant (relation 2) :

𝑅𝑑𝑡 = −0,00475 × 𝐺 − 0,00775 × 𝑃 + 0,03775 × 𝑅 − 0,00475 × 𝐷𝑚 + 0,05925 (2)

Avec :

- Rdt, le rendement en métabolites secondaires ;

- G, la granulométrie du broyat (entre 0 et 4 mm) ;

- P, le pourcentage en éthanol dans le mélange eau-éthanol (entre 50 et 90%) ;

- R, le ratio volume de solvant (en mL) sur la masse de broyat (en g) (entre 5 et 10

mL/g) ;

- Dm, la durée de macération (entre 12 et 24h).

La figure 54 montre que le ratio volume de solvant sur masse de broyat est plus influent

que les autres facteurs significatifs car tous les rendements les plus hauts sont obtenus lorsqu’il

est à son niveau +1. Il y a une séparation visible en deux groupes du fait des deux bornes de ce

facteur.

Figure 56: Influence des facteurs significatifs sur le rendement d'extraction

0,106

0,04

0,092

0,004

0,102

0,02

0,088

0,022

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,5 0,9 0,5 0,9

10 ml/g 5 ml/g

Re

nd

em

en

ts

Ratio Volume sur masse et pourcentage en éthanol

0,4 mm - 12h

0,4 mm - 24h

2 mm - 12h

2 mm - 24h




II. OPTIMISATION

Les conditions optimales pour le modèle réalisé avec Alchornea cordifolia sont les

suivantes : une durée de séchage de 28 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm,

un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 90%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une

durée de macération de 24 heures et une vitesse d’agitation de 1600 rpm.

Pour le modèle réalisé avec Tridax procumbens, les conditions optimales sont les

suivantes : une durée de séchage de 14 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm,

un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 50%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une

durée de macération de 12 heures et une vitesse d’agitation de 500 rpm.

La granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm et le ratio volume sur masse de 10 mL/g

sont les deux conditions identiques pour les modèles et pourraient être maintenues pour

l’extraction des métabolites secondaires des plantes.

III. VERIFICATION ET COMPARAISON DES DONNEES DES DEUX

MODELES

Des comparaisons entre les données obtenues avec les modèles et les données

expérimentales ont été effectuées en calculant les coefficients de détermination linéaire (Cohen

et al., 2013; Faul et al., 2009; Lin, 1992). Les différents résultats obtenus sont présentés dans

les figures 55 et 56 pour Alchornea cordifolia avec un coefficient de corrélation de 0,9915 et

dans les figures 57 et 58 pour Tridax procumbens avec un coefficient de corrélation de 0,9933.




Figure 57: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle

de Alchornea cordifolia

Figure 58: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia

18,80%

1,50%

6,90%

17,90%

23,90%

11,00%

13,60%

2,10%

17,81%

0,51%

7,89%

16,91%

24,89%

11,99% 12,61%

3,09%

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

1 2 3 4 5 6 7 8

Ren

dem

ent

Test

Y exp Y calc

y = 0,9831x + 0,002R² = 0,9831

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00%

Do

nn

ées

exp

érim

enta

les

Données modélisées

Y Mac

Linéaire (Y Mac)




Figure 59: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle

de Tridax procumbens

Figure 60: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens

Quant à la comparaison entre le modèle développé sur A. cordifolia et celui développé

sur T. procumbens, chaque modèle a été testé sur les données de l’autre plante. Il est ressorti de

ce test que le modèle de A. cordifolia modélise mieux les données de T. procumbens que le

modèle de ce dernier pour les données de la première. En effet, comme le montre les figures 59

et 60, le coefficient de corrélation de A. cordifolia (R²=0,6920²=0,4789) est plus grand que celui

de T. procumbens (R²=0,3329²=0,1108). Cela montre que le type de plante influe sur le

10,60%

2,20% 2,00%

10,20%

9,20% 8,80%

0,40%

4,00%

10,87%

1,67% 2,12%

10,07%

8,52%9,32%

1,08%

3,73%

0,00%

2,00%

4,00%

6,00%

8,00%

10,00%

12,00%

1 2 3 4 5 6 7 8

Ren

dem

ent

Test

Y exp Y calc

y = 0,9863x + 0,0008R² = 0,9866

0,00%

2,00%

4,00%

6,00%

8,00%

10,00%

12,00%

0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00%

Do

nn

ées

exp

érim

enta

les


Y Mtp

Linéaire (Y Mtp)




rendement d’extraction, cependant le coefficient du modèle de A. cordifolia nous rassure quant

à une relation permettant de faire passer le modèle d’une plante à une autre.

Figure 61: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A.

cordifolia

Figure 62: Modélisation de Alchornea cordifolia avec le modèle de T. procumbens


Un plan de Plackett-Burmann a permis de déterminer les paramètres influençant le

rendement d’extraction de métabolites secondaires. Ce sont le ratio volume de solvant sur masse

y = 0,3602x + 0,0162R² = 0,4789

0,00%

2,00%

4,00%

6,00%

8,00%

10,00%

12,00%

0,00% 5,00% 10,00% 15,00% 20,00% 25,00% 30,00%

Do

nn

ées

exp

érim

enta

les

de

T.

pro

cum

ben

s

Données modélisées avec A. cordifolia

modèle de T. procumbens par A.cordifolia

Linéaire (modèle de T.procumbens par A. cordifolia)

y = 0,6451x + 0,0814R² = 0,1108

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

0,00% 2,00% 4,00% 6,00% 8,00% 10,00% 12,00%

Do

nn

ées

exp

érim

enta

les

A. c

ord

ifo

lia

Données modélisées par T. procumbens

modèle de A. cordifolia avecTridax

Linéaire (modèle de A. cordifoliaavec Tridax)




de broyat et le pourcentage d’éthanol dans le solvant hydroalcoolique pour Alchornea cordifolia

et le ratio volume de solvant sur masse de broyat et le pourcentage d’éthanol dans le solvant

hydroalcoolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération pour Tridax procumbens.

Les modèles obtenus ont été optimisés par la méthode des simplex et des conditions

expérimentales optimales ont été établies. Chaque modèle est proche de l’expérimentation avec

des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. Il ressort de cette étude que le modèle de

Alchornea cordifolia modélise mieux les données de Tridax procumbens que celui de cette

dernière pour la première.




CHAPITRE IV: IDENTIFICATIONS ET DETERMINATIONS

STRUCTURALES DES METABOLITES

SECONDAIRES

L’identification des métabolites secondaires a concerné Alchornea cordifolia et

Phyllanthus amarus. En effet, ces deux plantes ayant fait l’objet de plusieurs études, nous

disposons d’assez de données pour comparer les différentes méthodes analytiques. La

détermination structurale a quant à elle été réalisée sur Tridax procumbens car il existe très peu

d’études dans ce sens concernant cette plante.

I. IDENTIFICATION DES METABOLITES SECONDAIRES PAR

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE A HAUTE RESOLUTION

(HPTLC)

I.1. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea

cordifolia

I.1.1. Résultats

Les chromatogrammes HPTLC ont été obtenus pour les fractions à l’hexane (FHA), au

dichlorométhane (FDA), à l’acétate d’éthyle (FAA), au butanol (FBA) et à l’eau (FEA) issues des

extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia (annexe 01). Les spectres ont été mesurés à

six (6) longueurs d'onde (250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm) en fonction des familles de

métabolites secondaires recherchés (Senior et al., 2012). Les résultats des analyses ont été

traités dans la figure 61.




a. Analyse de la fraction à l’hexane

b.Analyse de la fraction au dichlorométhane

c. Analyse de la fraction à l 'acétate d'éthyle

d. Analyse de la fraction au butanol

0,01 0,050,1 0,14

0,23

0,43 0,44 0,46 0,47 0,48

0,9

00,10,20,30,40,50,60,70,80,91

0

10

20

30

40

50

60

tach

e 0

1

tach

e 0

2

tach

e 0

3

tach

e 0

4

tach

e 0

5

tach

e 0

6

tach

e 0

7

tach

e 0

8

tach

e 0

9

tach

e 1

0

tach

e 1

1

Rap

po

rt f

ron

tal

% A

bso

rpti

on

Titre de l'axe

250 280 310 340 370 400 RF

0,010,05 0,06

0,1

0,9 0,91

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

tache 01 tache 02 tache 03 tache 04 tache 05 tache 06

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF

0,01

0,89 0,9

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0

20

40

60

80

100

Tache 01 Tache 02 Tache 03

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF

0,01

0,36

0,89

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0

20

40

60

80

100

Tache 01 Tache 02 Tache 03

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF




e. Analyse de la fraction à l 'eau

Figure 63: : Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia

0,01

0,89 0,9

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

tache 1 tache 2 tache 3

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF




Les chromatogrammes HPTLC ont été interprétés en se basant sur les bandes

d’absorption UV des familles de métabolites secondaires et nous ont permis de classer les

métabolites secondaires des fractions en trois grandes familles. En effet, les zones d’absorption

des différentes taches nous renseignent sur les métabolites qui y sont présents. La révélation

s’est faite sur six (6) longueurs d’onde à savoir 250, 280, 310, 340, 370 et 400 nm. L’attribution

des familles de métabolites secondaires s’est faite sur la base du pourcentage d’absorption

maximale sur l’ensemble des longueurs d’ondes pour chaque tache en se basant sur les

longueurs d’onde de la littérature à savoir 250 et 280 nm pour les terpènes et stérols (Traina et

al., 1990), 310 nm pour les alcaloïdes (Sangster and Stuart, 1965) et 340, 370 et 400 nm pour

les flavonoïdes (Marinova et al., 2005; Menziani et al., 1990). Les valeurs maximales du

rapport frontal (Rf) des composés séparés en utilisant un système d’éluant (Hexane/acétate

d’éthyle : 1/3 (V /V)) et les pourcentages des composés dans le mélange ont été obtenues. Le

choix du solvant est un paramètre important pour obtenir la meilleure séparation (Pothier and

Galand, 2005) et le solvant ne doit pas absorber dans la région de l’UV concernée pour éviter

des interférences. L’ensemble des résultats est consigné dans le tableau 26.




Tableau 26: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia

Fractions Taches

% d’Absorption à différentes longueurs d’ondes

(nm) Rf

max

Proportion de

la tache (en

%)

Familles de métabolites secondaires recherchés

250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et stérols

FHA

1HA 38,32 33,88 40,52 43,23 36,20 24,13 0,01 35,64 + - -

2HA 0,00 0,00 0,00 6,92 7,35 11,00 0,05 3,45 + - -

3HA 0,00 0,00 0,00 9,18 13,14 17,88 0,10 5,49 + - -

4HA 0,00 0,00 0,00 7,70 7,65 10,53 0,14 3,49 + - -

5HA 0,00 0,00 0,00 0,00 13,53 18,92 0,23 4,62 + - -

6HA 18,38 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,43 3,93 - - +

7HA 0,00 6,38 16,25 14,74 0,00 0,00 0,44 5,84 - + -

8HA 0,00 0,00 3,33 4,53 4,33 4,00 0,46 2,21 + - -

9HA 1,59 0,00 0,00 0,00 4,11 3,63 0,47 1,39 + - -

10HA 7,86 7,15 11,12 13,70 13,69 9,90 0,48 9,89 + - -

11HA 33,85 52,59 28,79 0,00 0,00 0,00 0,90 24,04 - - +

FDA

1DA 82,02 67,30 79,58 85,12 79,24 72,31 0,01 76,99 + - -

2DA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 11,10 0,05 1,30 + - -

3DA 0,00 0,00 5,57 8,26 9,18 0,00 0,06 3,50 + - -

4DA 0,00 0,00 0,00 9,18 11,58 16,59 0,10 4,39 + - -

5DA 0,00 0,00 12,53 0,00 0,00 0,00 0,90 13,36 - + -

6DA 0,00 0,00 2,32 0,00 0,00 0,00 0,91 0,46 - + -




Tableau 27: Composition chimique des différentes fractions de A. cordifolia (suite)

Fractions Taches

% d’Absorption à différentes longueurs d’ondes

(nm) Rf max

Proportion de

la tache en %

Famille de métabolites secondaires

recherchées

250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et

stérols

FAA

1AA 88,57 41,86 50,83 100,00 100,00 100,00 0,01 91,14 + - -

2AA 6,15 0,00 7,72 0,00 0,00 0,00 0,89 2,79 - + -

3AA 0,00 20,10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,9 6,07 - - +

FBA

1BA 75,30 50,76 77,19 100,00 100,00 100,00 0,01 76,57 + - -

2BA 0,00 6,85 0,00 0,00 0,00 0,00 0,36 2,03 - - +

3BA 14,72 42,39 22,81 0,00 0,00 0,00 0,89 21,39 - - +

FEA

1EA 69,84 48,46 73,63 100,00 100,00 100,00 0,01 73,11 + - -

2EA 0,00 51,54 26,37 0,00 0,00 0,00 0,89 21,51 - - +

3EA 30,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,9 5,38 - - +




I.1.2. Discussion

La figure 61 montre des différences dans les empreintes chromatographiques des taches

dans les différentes fractions qui n’ont pas le même nombre de taches pour un même extrait.

En effet, les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau

issues des extraits hydroalcooliques de Alchornea cordifolia ont respectivement 11, 6, 3, 3 et 3

taches traduisant ainsi une plus grande richesse en famille de métabolites secondaires des deux

premières fractions. Lors d’une extraction liquide/liquide par polarité croissante de solvant, les

premiers solvants utilisés récupèrent le maximum de produits par épuisement de l’extrait. Ces

derniers sont donc faiblement épuisés par le solvant suivant entrainant ainsi son

appauvrissement. Les taches n’absorbent pas toutes aux six (6) longueurs d’ondes de l’étude et

cela est lié à la nature de leurs groupes chromophores. En effet, les caractéristiques d’absorption

des molécules organiques dans la région de l’Ultra-Violet (UV) dépendent des transitions

électroniques qui peuvent se produire et de l’effet de l’environnement atomique sur la transition

(Silverstein, 2005). Les résultats obtenus montrent que la quantité de métabolites détectée est

liée à la longueur d’ondes utilisée et à la nature de la fraction. A titre d’exemple, la tache 1HA

de la fraction à l’hexane de A. cordifolia est détectée aux six longueurs d’onde alors que dans

cette même fraction, la tache 6HA n’est détectée qu’à 250 nm (figure 61, a).

Le chromatogramme de la fraction à l’hexane de Alchornea cordifolia présente onze

(11) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,9. L’analyse du tableau 26

montre que les taches 1HA (Rf = 0,01), 11HA (Rf = 0,9) sont les plus abondantes dans cette

fraction avec respectivement des proportions de 35,64 % et 24,04 % en fonction des composés

révélés aux différentes longueurs d’ondes suivies des taches 10HA (Rf = 0,48) (9,89 %) et 7HA

(Rf = 0,44) (5,84 %) Les taches 8HA et 9HA sont les moins abondantes dans cette fraction avec

des proportions respectives 2,21 % et 1,39 %. La tache 1HA présente un pourcentage

d’absorption maximale (43,23) à 340 nm qui indique qu’elle est composée de métabolites

secondaires de la famille des flavonoïdes alors que la tache 11HA présente un pourcentage

d’absorption maximale (52,59) à 280 nm et contient ainsi des terpènes et stérols (probablement

des terpènes à cause de la polarité de cette fraction). La tache 7HA présente un pourcentage

d’absorption maximale (16,25) à 310 nm et est constituée d’alcaloïdes. L’analyse de l’ensemble

des taches montre que les taches 1HA, 2HA, 3HA, 4HA, 5HA, 8HA, 9HA et 10HA sont

constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 66,18 %. Les taches 6HA et

11HA sont constituées de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité




de cette fraction) et représentent une proportion totale de 27,97 %. La tache 7HA est constituée

d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 5,84 %. Au total, la fraction à l’hexane

contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour

les flavonoïdes suivie des terpènes et stérols et une faible proportion d’alcaloïdes.

Le chromatogramme de la fraction au dichlorométhane de Alchornea cordifolia présente

six (6) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,91. La tache 1DA, la plus

abondante (76,99 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (85,12) à 340 nm qui

indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis de la tache 5DA (Rf = 0,90) (13,36 %) qui

présente un pourcentage d’absorption maximale (12,53) à 310 nm indiquant qu’elle contient

des alcaloïdes (figure 61 b, tableau 26). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les

taches 1DA, 2DA, 3DA et 4DA sont constituées de flavonoïdes et représentent une proportion

totale de 86,18 %. Les taches 5DA et 6DA sont constituées d’alcaloïdes et représentent une

proportion totale de 13,82 %. Au total, la fraction au dichlorométhane contient deux familles

de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les flavonoïdes suivis des

alcaloïdes. Cette fraction ne contient pas de terpènes et stérols détectables par cette méthode.

Le chromatogramme de la fraction à l’acétate d’éthyle de Alchornea cordifolia présente

trois (3) taches dont les rapports frontaux sont de 0,01 ; 0,9 et 0,91. La tache 1AA, la plus

abondante (91,14 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et

400 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivie de la tache 3AA (Rf = 0,90)

(6,07 %) présentant un pourcentage d’absorption maximale (20,10) à 280 nm et contenant

uniquement des terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette

fraction) (figure 61 c, tableau 26). La tache 2AA (Rf = 0,89) (2,79 %), la moins abondante

présente un pourcentage d’absorption maximale (7,72) à 310 nm qui indique qu’elle est

composée d’alcaloïdes. Au total, la fraction à l’acétate d’éthyle contient les trois familles de

métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les flavonoïdes suivis des

terpènes et stérols ainsi qu’une faible proportion d’alcaloïdes.

Le chromatogramme de la fraction au butanol de Alchornea cordifolia présente trois (3)

taches dont les rapports frontaux sont 0,01 ; 0,36 et 0,89. La tache 1, la plus abondante (76,57

%) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm qui indique

qu’elle est composée de flavonoïdes suivie des taches 3BA (Rf = 0,89) (21,39 %) et 2BA (Rf

= 0,36) (2,03 %) qui présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs de (42,39)

et (6,85) à 280 nm et qui indiquent qu’elles sont composées de terpènes et stérols (probablement




des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure 61 d, tableau 26). Au total, la fraction

au butanol contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée

pour flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Les alcaloïdes ne sont pas détectables par cette

méthode dans cette fraction.

Le chromatogramme de la fraction à l’eau de Alchornea cordifolia présente trois (3)

taches dont les rapports frontaux sont 0,01 ; 0,89 et 0,90. La tache 1EA, la plus abondante

(73,11 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm qui

indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivie des taches 2EA (Rf = 0,89) (21,51 %) et

3EA (Rf = 0,90) (5,38 %) qui présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs de

(51,54) à 280 et (30,16) à 250 nm et qui indiquent qu’elles sont composées de terpènes et stérols

(probablement des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure 61 d, tableau 26). Au

total, la fraction à l’eau contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance

plus prononcée pour flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Les alcaloïdes ne sont pas

détectables par cette méthode dans cette fraction.

Nous n’avons pas trouvé dans la littérature des données similaires afin de les comparer

à nos résultats. Toutefois, l'étude de l'extrait éthanolique de E. alsinoides par HPTLC a révélé

la présence de stéroïdes, de terpénoïdes et de glycosides dans cet extrait (Gomathi et al., 2012).

La HPTLC a été utilisée pour la détermination comme un outil utile pour validation

analytique des nouvelles formes de produits naturels et a permis de déterminer une quantité du

composé adultérant légèrement supérieure à celle contenue dans un comprimé de Viagra

(Nicoletti, 2011). Cette technique analytique a été appliquée avec succès à l'identification et à

la quantification de la sibutramine ajoutée illégalement dans certains produits amaigrissants

commercialisés sur les marchés (Ariburnu et al., 2012). Elle a été appliquée pour les estimations

simultanées du Telmisartan et du Ramipril sous forme de doses combinées (Patel et al., 2010)

ou encore de la β-Sitostérol-D-glucoside et de la Withaférine A (Jirge et al., 2011). Cette

technique a été utilisée en préparative pour la séparation et l’isolation de flavonoïdes de

Launaea procumbens (Mishra et al., 2012).




I.2. Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus

amarus

I.2.1. Résultats

Les chromatogrammes HPTLC ont été obtenus pour les fractions à l’hexane (FHP), au

dichlorométhane (FDP), à l’acétate d’éthyle (FAP), au butanol (FBP) et à l’eau (FEP) issues de

l’extrait hydroalcoolique de P. amarus issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus

amarus (annexe 02). Les spectres ont été mesurés à 6 longueurs d'onde (250, 280, 310, 340,

370 et 400 nm) en fonction des familles de métabolites secondaires recherchés (Senior et al.,

2012). Les résultats des analyses ont été traités dans les figures 61.




a: Analyse de la fraction à l 'hexane

b: Analyse de la fraction au dichlorométhane

c: Analyse de la fraction à l’acétate d'éthyle

d: Analyse de la fraction au butanol

0,01

0,09

0,49

0,61

0,71 0,720,78 0,79

0,94

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

tache01

tache02

tache03

tache04

tache05

tache06

tache07

tache08

tache09

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF

0,01 0,030,07 0,08

0,13

0,25

0,61

0,68 0,7 0,71

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0

10

20

30

40

50

60

70

Tache01

Tache02

Tache03

Tache04

Tache05

Tache06

Tache07

Tache08

Tache09

Tache10

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF

0,01 0,03 0,04 0,07 0,08 0,09

0,270,32 0,34

0,6 0,620,7 0,73 0,74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

tach

e 0

1

tach

e 0

2

tach

e 0

3

tach

e 0

4

tach

e 0

5

tach

e 0

6

tach

e 0

7

tach

e 0

8

tach

e 0

9

tach

e 1

0

tach

e 1

1

tach

e 1

2

tach

e 1

3

tach

e 1

4

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF

0,010,04

0,08

0,690,74

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

tache 01 tache 02 tache 03 tache 04 tache 05

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF




e: Analyse de la fraction à l 'eau

Figure 64: Analyses des fractions issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus

Les chromatogrammes HPTLC ont été interprétés comme précédemment. L’ensemble des résultats est consigné dans le tableau XX.

0,01

0,71 0,730,77

0,94 0,95

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tache 01 Tache 02 Tache 03 Tache 04 Tache 05 Tache 06

Rap

po

rt f

ron

tal

Ab

sorp

tio

n %

250 280 310 340 370 400 RF




Tableau 28: Composition chimique des différentes fractions de Phyllanthus amarus

Fractions Taches

% d’Absorption à différentes longueurs

d’ondes (nm) Rf

max

Proportion

de la tache

(en %)


recherchés

250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes et

stérols

FHP

1HP 7,65 7,71 20,65 31,27 24,62 14,17 0,01 11,71 + - -

2HP 0,00 0,00 1,99 10,11 13,75 15,54 0,09 2,68 + - -

3HP 4,21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,49 1,51 - - +

4HP 2,99 6,82 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 3,48 - - +

5HP 79,62 78,73 0,00 0,00 0,00 0,00 0,71 56,30 - - +

6HP 0,00 0,00 52,85 58,62 61,63 58,00 0,72 16,44 + - -

7HP 0,00 0,00 12,35 0,00 0,00 0,00 0,78 1,30 - + -

8HP 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,29 0,79 0,96 + - -

9HP 5,53 6,74 12,16 0,00 0,00 0,00 0,94 5,64 - + -

FDP

1DP 37,10 38,65 48,25 41,06 35,19 29,54 0,01 38,09 - + -

2DP 0,00 0,00 7,14 8,12 9,01 10,00 0,03 5,20 + - -

3DP 2,55 4,31 9,31 10,78 9,78 9,65 0,07 7,35 + - -

4DP 3,10 4,04 9,37 15,12 19,24 19,83 0,08 11,11 + - -

5DP 0,00 0,00 0,00 4,32 5,85 6,83 0,13 2,63 + - -

6DP 0,00 0,00 5,57 3,62 0,00 0,00 0,25 1,34 - + -

7DP 0,00 4,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 0,89 - - +

8DP 0,00 0,00 13,15 8,58 7,11 0,00 0,68 4,21 - + -

9DP 57,25 48,80 0,00 0,00 13,83 0,00 0,70 22,90 - - +

10DP 0,00 0,00 7,21 8,41 0,00 24,14 0,71 6,27 + - -




Tableau 29: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite)

Fractions Taches

% d’Absorption à différentes longueurs

d’ondes (nm) Rf

max

Proportion

de la tache

(en %)


recherchés

250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes

et stérols

FAP

1AP 68,47 63,63 73,72 77,21 75,02 67,12 0,01 70,56 + - -

2AP 2,31 4,91 0,00 7,54 6,31 7,79 0,03 4,50 + - -

3AP 0,00 0,00 10,81 0,00 0,00 0,00 0,04 2,12 - + -

4AP 0,00 1,81 0,00 3,40 0,00 0,00 0,07 0,96 + - -

5AP 0,00 2,46 0,00 0,00 11,74 0,00 0,08 1,92 + - -

6AP 0,00 2,46 4,40 6,25 0,00 15,00 0,09 4,27 + - -

7AP 0,00 1,86 2,97 0,00 0,00 0,00 0,27 1,00 - + -

8AP 1,53 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,32 0,24 - - +

9AP 3,55 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,34 0,57 - - +

10AP 0,00 2,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,60 0,45 - - +

11AP 0,00 0,00 3,27 0,00 0,00 0,00 0,62 0,64 - + -

12AP 22,13 13,53 0,00 5,60 6,93 10,09 0,70 9,64 - - +

13AP 0,00 0,00 4,83 0,00 0,00 0,00 0,73 0,95 - + -

14AP 0,00 9,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,74 2,19 - - +




Tableau 30: Composition des différentes fractions de Phyllanthus amarus (suite et fin)

Fractions Taches

% d’absorption aux différentes longueurs d’ondes

(nm) Rf

max

Proportion

de la tache

(en %)

Famille de métabolites secondaires

recherchés

250 280 310 340 370 400 Flavonoïdes Alcaloïdes Terpènes

et stérols

FBP

1BP 40,09 48,24 83,70 100,00 100,00 93,17 0,01 66,46 + - -

2BP 1,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,47 - - +

3BP 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,83 0,08 0,54 + - -

4BP 42,87 26,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,69 18,47 - - +

5BP 15,10 25,43 16,30 0,00 0,00 0,00 0,74 14,06 - - +

FEP

1EP 20,99 13,99 33,14 100,00 100,00 100,00 0,01 31,65 + - -

2EP 0,00 21,44 32,58 0,00 0,00 0,00 0,71 15,22 - + -

3EP 36,48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,73 8,85 - - +

4EP 28,33 49,34 22,95 0,00 0,00 0,00 0,77 32,22 - - +

5EP 14,21 15,22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,94 9,95 - - +

6EP 0,00 0,00 11,33 0,00 0,00 0,00 0,95 2,11 - + -




I.2.2. Discussion

La figure 62 montre des différences dans les empreintes chromatographiques des taches

dans les différentes fractions qui n’ont pas le même nombre de taches pour un même extrait.

En effet, les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau

issues des extraits hydroalcooliques de Phyllanthus amarus ont respectivement 9, 10, 14, 5 et

6 taches traduisant ainsi une plus grande richesse en famille de métabolites des trois premières

fractions. Les taches n’absorbent pas toutes aux six (6) longueurs d’ondes de l’étude et cela est

lié à la nature de leurs groupes chromophores. En effet, les caractéristiques d’absorption des

molécules organiques dans la région de l’UV dépendent des transitions électroniques qui

peuvent se produire et de l’effet de l’environnement atomique sur la transition (Silverstein,

2005). Les résultats obtenus montrent que la quantité de métabolites détectée est liée à la

longueur d’ondes utilisé et à la nature de la fraction. A titre d’exemple, la tache 1HP de la

fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus est détectée aux six longueurs d’onde alors que dans

cette même fraction, les lots de taches (8HP et 9HP) et 10HP et 11HP ne sont respectivement

détectés qu’à 250, 280 et 310 nm (figure 62, a).

Le chromatogramme de la fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus présente neuf (9)

taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,94. La tache 5HP (Rf

= 0,71), la plus abondante de cette fraction (56,30 %) présente un pourcentage d’absorption

maximale (79,62) à 250 nm qui indique qu’elle est composée de métabolites secondaires de la

famille des terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité de cette fraction)

suivie de la tache 6HP (Rf = 0,72) (16,44 %) qui présente un pourcentage d’absorption

maximale (61,63) à 370 nm et contient ainsi des flavonoïdes. Les taches 7HP (Rf = 0,78) (1,30

%) et 9HP (Rf = 0,94) (5,64 %) présentent des pourcentages d’absorption maximale respectifs

de (12,35) et (12,16) à 310 nm indiquant qu’elles sont composées d’alcaloïdes (figure 62 a,

tableau 28). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches 1HP, 2HP, 6HP, et 8HP

sont constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 31,79 %. Les taches

3HP, 4HP et 5HP sont constituées de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de

la polarité de cette fraction) et représentent une proportion totale de 61,28 %. Les taches 7HP

et 9HP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 6,94 %. Au total,

la fraction à l’hexane contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance

plus prononcée pour les terpènes et stérols suivis des flavonoïdes et une faible proportion

d’alcaloïdes.




Le chromatogramme de la fraction au dichlorométhane de Phyllanthus amarus présente

dix (10) taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,71. La tache

1DP (Rf = 0,01), la plus abondante (38,09 %) présente un pourcentage d’absorption maximale

(48,25) à 310 nm qui indique qu’elle est composée d’alcaloïdes suivie de la tache 9DP (Rf =

0,70) (22,90 %) qui présente un pourcentage d’absorption maximale (57,25) à 250 nm

indiquant qu’elle est composée de terpènes et stérols (probablement des terpènes à cause de la

polarité de cette fraction) (figure 62 b, tableau 28). L’analyse de l’ensemble des taches montre

que les taches 1DP, 6DP et 8DP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion

totale de 43,64 %. Les taches 2DP, 3DP, 4DP, 5DP et 10DP sont constituées de flavonoïdes et

représentent une proportion totale de 32,56 %. Les taches 7DP et 9DP sont constituées terpènes

et stérols (probablement des terpènes à cause de la polarité de cette fraction) et représentent une

proportion totale de 23,79 % (figure 62 b, tableau 28). Au total, la fraction au dichlorométhane

contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour

les alcaloïdes suivis des flavonoïdes et des terpènes et stérols.

Le chromatogramme de la fraction à l’acétate d’éthyle de Phyllanthus amarus présente

quatorze (14) taches dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,74. La tache 1AP

(Rf = 0,01), la plus abondante (70,56 %) présente un pourcentage d’absorption maximale

(75,02) à 370 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis de la tache 12AP (Rf

= 0,70) (9,64 %) qui présente un pourcentage d’absorption maximale (22,13) à 250 nm

indiquant qu’elle est composée de terpènes et stérols (figure 62 c, tableau 29). L’analyse de

l’ensemble des taches montre que les taches 1AP, 2AP, 4AP, 5AP et 6AP sont constituées de

flavonoïdes et représentent une proportion totale de 82,21 %. Les taches 3AP, 7AP, 11AP et

13AP sont constituées d’alcaloïdes et représentent une proportion totale de 4,71 %. Les taches

8AP, 9AP, 10AP, 12AP et 14AP sont constituées terpènes et stérols et représentent une

proportion totale de 13,09 % (figure 62 c, tableau 29). Au total, la fraction à l’acétate d’éthyle

contient les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée des

flavonoïdes suivis des terpènes et stérols ainsi qu’une faible proportion d’alcaloïdes.

Le chromatogramme de la fraction au butanol de Phyllanthus amarus présente cinq (5)

taches dont les rapports frontaux maximums sont compris entre 0,01 et 0,74. La tache 1BP (Rf

= 0,01), la plus abondante (66,46 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (100,00)

à 340 et 370 nm qui indique qu’elle est composée de flavonoïdes suivis des taches 4BP (Rf =

0,69) (18,47 %) et 5BP (Rf = 0,74) (14,06 %) qui présentent des pourcentages respectifs




d’absorption maximale (42,87) à 250 nm et (25,43) à 280 nm indiquant qu’elles sont composées

de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette fraction) (figure

62 d, tableau 30). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches 1BP, et 3BP sont

constituées de flavonoïdes et représentent une proportion totale de 67,00 %. Les taches 2BP,

4BP et 5BP sont constituées terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité

de cette fraction) et représentent une proportion totale de 33,00 %. Au total, la fraction au

butanol contient deux familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée

des flavonoïdes suivis des terpènes et stérols. Cette fraction ne contient pas d’alcaloïdes.

Le chromatogramme de la fraction à l’eau de Phyllanthus amarus présente six (6) taches

dont les rapports frontaux sont compris entre 0,01 et 0,95. La tache 4EP (Rf = 0,77), la plus

abondante (32,22 %) présente un pourcentage d’absorption maximale (49,34) à 280 nm qui

indique qu’elle est composée de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la

polarité de cette fraction) suivis de la tache 1EP (Rf = 0,01) (31,65 %) qui présente un

pourcentage d’absorption maximale (100,00) à 340, 370 et 400 nm indiquant qu’elle est

composée flavonoïdes (figure 62 e, tableau 30). La tache 2EP (Rf = 0,71) (15,22 %) présente

un pourcentage d’absorption maximale (32,58) à 310 nm indiquant qu’elle est composée

d’alcaloïdes (figure 62 e, tableau 30). L’analyse de l’ensemble des taches montre que les taches

1EP est constituée de flavonoïdes et représente une proportion totale de 31,65 %. Les taches

2EP et 6EP sont constituées d’alcaloïdes et représentent 17,33 %. Les taches 3EP, 4EP et 5EP

sont constituées de terpènes et stérols (probablement des stérols à cause de la polarité de cette

fraction) et représentent une proportion totale de 51,02 %. Au total, la fraction à l’eau contient

les trois familles de métabolites recherchées avec une tendance plus prononcée pour les terpènes

et stérols suivis des flavonoïdes puis des alcaloïdes. La présence d’alcaloïdes dans cette fraction

alors qu’ils sont absents de la fraction précédente pourrait s’expliquer par la présence d’un sucre

ou de plusieurs sucres liés à un aglycone alcaloïde dont l’ensemble est très soluble dans l’eau.

Nous n’avons pas trouvé dans la littérature des données similaires afin de les comparer

à nos résultats. Toutefois, L'étude de l'extrait éthanolique de E alsinoides par HPTLC a révélé

la présence de stéroïdes, de terpénoïdes et de glycosides dans cet extrait (Gomathi et al., 2012).

La HPTLC a été utilisée pour la détermination comme un outil utile pour validation

analytique des nouvelles formes de produits naturels et a permis de déterminer une quantité du

composé adultérant légèrement supérieure à celle contenue dans un comprimé de Viagra

(Nicoletti, 2011). Cette technique analytique a été appliquée avec succès à l'identification et à




la quantification de la sibutramine ajoutée illégalement dans certains produits amaigrissants

commercialisés sur les marchés (Ariburnu et al., 2012). Elle a été appliquée pour les estimations

simultanées du Telmisartan et du Ramipril sous forme de doses combinées (Patel et al., 2010)

ou encore de la β-Sitostérol-D-glucoside et de la Withaférine A (Jirge et al., 2011). Cette

technique a été utilisée en préparative pour la séparation et l’isolation de flavonoïdes de

Launaea procumbens (Mishra et al., 2012).

II. IDENTIFICATION PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE

Les spectres Infrarouge (IR) sont utilisés pour identifier les groupes fonctionnels de

métabolites secondaires sur la base de la valeur des pics dans la région de 4000 à 500 cm-1. Un

spectre Infra Rouge permet d’obtenir des informations sur le groupe caractéristique dans la

molécule étudiée. Chaque bande d’absorption est associée à un type de liaison ce qui permet de

retrouver le groupe caractéristique. Les symboles suivants et leurs significations ont été

utilisés : ν (Elongation), β (Flexion dans le plan), γ (Flexion hors du plan), ω (Hochement ou

Déformation angulaire hors du plan), ρ (Balancement ou Déformation angulaire dans le plan),

τ (Torsion), δ (Cisaillement), a (asymétrique), s (symétrique). La liaison chimique concernée

par la fréquence de vibration est en gras. Les longueurs d’ondes sont exprimées en cm-1. Les

attributions ont été faites selon Silverstein et al. (2005), Rolere et al. (2015), Xu et al. (2012),

Vijayalakshmi et Ravindhran (2012), Belboukhari et al. (2013) et Bulama et al.

(2015)(Belboukhari et al., 2013; Bulama et al., 2015; Rolere et al., 2015; Silverstein, 2005;

Vijayalakshmi and and Ravindhran, 2012). Cette étude a été réalisée sur les différentes fractions

de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus.

II.1. Spectres infrarouges des différentes fractions de Alchornea cordifolia

II.1.1. Résultats

Les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau de

Alchornea cordifolia sont respectivement notées FHA, FDA, FAA, FBA et FEA. L’ensemble

des spectres est donné dans la figure 63.




a. Spectre IR de la fraction à l’hexane de A. cordifolia

b. Spectre IR de la fraction au dichlorométhane de A. cordifolia

c. Spectre IR de la fraction à l’acétate d'éthyle de A. cordifolia

d. Spectre IR de la fraction au butanol de A. cordifolia

3412

3012

2925,5

2853,5

1736

1620

1464,5

1377,5

1171,5

1036,5

719,5

50

55

60

65

70

75

80

85

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%

LONGUEUR D'ONDE EN cm-1

FHA

3421,5 2921,5

2850,5 1715

1617

1513,5

1463,51318 1200

1038,5

50

60

70

80

90

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FDA

3405,5

2978

2930,5

1701,5

1618

1536

15141449,5

1339,5

1199

1112,5;

1036971

923

882,5

770

10

20

30

40

50

60

70

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FAA

3411

2969

2931,5

1711,5

1616,5

1511 1449,5

1331,5

1208,51089,5

1041

967

909,5

872

762

15

25

35

45

55

65

75

85

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FBA




e . Spectre IR de la fraction à l’eau de A. cordifolia

Figure 65: Spectres Infrarouge des fractions de Alchornea cordifolia

3414,52920

1715

1616,5

1446,5 1344,51212 1045,5

864,5

766

669,5

609,5

15

25

35

45

55

65

75

5001000150020002500300035004000TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FEA




Le spectre de FHA (figure 63 a) montre la présence de bandes à 3412 cm-1 (ν N-H) ; 3012

(ν –C=C-H), 2925,5 (νa -CH3), 2853,5 (νa -CH2-), 1736 (ν –(C=O)-OR), 1620 (ν –(C=C)-) ,

1464,5 (δ -C-H), 1377,5 (δ -CH3), 1171,5 (ω -CH2-), 1036,5 (ν C-N), 719,5 (ρ -CH2-).

L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupement amine, de chaines aliphatiques

saturées et insaturées, de groupements carbonyles (ester). La différence entre la bande de

l’amine et celle de l’alcool réside dans la taille de la bande. En effet, la bande correspondant à

OH est large alors que celle de NH est moyenne (Silverstein, 2005).

Le spectre de FDA (figure 63 b) montre la présence de bandes à 3421,5 cm-1 (υ N-H et υ

O-H) , 2921,5 (νa -CH2-), 2850,5 (νa -CH2-), 1715 (ν –(C=O)-OR), 1617 (ν –(C=C)-) , 1513,5

(ν Ar), 1463,5 (δ -C-H), 1318 (δs -CH3), 1200 (νa -O-C=C-), 1038,5 (ν C-N). L’ensemble de

ces résultats montre la présence de groupements amine et hydroxyle, de chaines aliphatiques,

de structures carbonées avec des liaisons multiples et de groupements carbonyles (ester).

Le spectre de FAA (figure 63c) montre la présence de bandes à 3405,5 cm-1 (υ O-H),

2978 (νa -CH3), 2930,5 (νa -CH2-), 1701,5 (ν –(C=O)-OH), 1618 (ν –(C=C)-), 1536 (νa CO2-

), 1514 (ν Ar), 1449,5 (δ -CH2-), 1339,5 (δa -CH3), 1199 (νa -O-C=C-), 1112,5 (ν C-C + ω -

CH2-), 1036 (ρ -CH3), 971 (τ C=C, Ar), 923 (ν C-C), 882,5 (ω -CH3), 770 (ω -C-H, Ar).

L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements alcools (acides carboxyliques),

de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples, de groupements

carbonyles (acide) et de cycles aromatiques.

Le spectre de FBA (figure 63 d) montre la présence de bandes à 3411 cm-1 (υ O-H), 2969

(νa -CH3), 2931,5 (νa -CH2-), 1711,5 (ν –(C=O)-OH), 1616,5 (ν –(C=C)-), 1511 (ν Ar), 1449,5

(δ -CH2-), 1331,5 (δa -CH3), 1208,5 (νa -O-C=C-), 1089,5 (τ -CH2-), 1041 (ρ -CH3), 967 (τ

C=C, Ar), 909,5 (ν C-C), 872 (ω -CH3), 762 (ω -C-H, Ar).

L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements alcools (acides

carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples, de

groupements carbonyles (acide) et de cycles aromatiques.

Le spectre de FEA (figure 63 e) montre la présence de bandes à 3414,5 cm-1 (υ O-H),

2920 (νa -CH2-), 1715 (ν –(C=O)-OH), 1616,5 (ν –(C=C)-), 1446,5 (δ -CH2-), 1344,5 (δa -

CH3), 1212 (νa -O-C=C-), 1045,5 (ρ -CH3), 766 (ω -C-H, Ar), 669,5 (ω C=C, Phénol), 609,5

(ω O-H, Phénol).




L’ensemble des résultats obtenus montre la présence de groupements alcools (acides

carboxyliques, phénols), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons

multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques (phénols).

II.1.2. Discussion

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’hexane montre la présence de la

fonction amine traduite par deux bandes à 3412 (ν N-H) et 1036,5 (ν C-N) indiquant la présence

d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les autres bandes notamment celles à 1377,5 (δ -CH3)

et 1620 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;

Holopainen, 2004b). L’absence de bandes correspondant à des groupements aromatique et

hydroxyle traduit l’absence de flavonoïdes. On peut noter que le spectre ne présente pas de

bandes à 815, 824, 872 ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols

(Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où l’absence de cette famille dans la fraction à l’hexane.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au dichorométhane montre la présence

de la fonction amine traduite par deux bandes à 3421,5 (ν N-H) et 1038,5 (ν C-N) indiquant la

présence d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les bandes à 1377,5 (δ -CH3) et 1620 (ν –

(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). La

présence de la large bande à 3421,5 (υ O-H) ainsi que des bandes à 1200 (νa -O-C=C-) et à

1513,5 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes dans cette fraction. La présence simultanée

des groupements hydroxyle et amine à 3421,5 cm-1 donne une superposition de leurs bandes

d’absorption habituelle. On peut noter que le spectre ne présente pas de bandes à 815, 824, 872

ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et

al., 1976) d’où l’absence de cette famille dans cette fraction.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’acétate d’éthyle montre la présence

de la fonction hydroxyle traduite par la bande à 3405,5 (υ O-H). La présence de cette bande

ainsi que de celle des bandes à 1199 (νa -O-C=C-) et à 1514 (ν Ar) indique la présence de

flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par les

bandes à 971 (τ C=C, Ar), 770 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par les bandes à

1701,5 (ν –(C=O)-OH) et 1536 (νa CO2-) indiquent la présence de composés phénoliques

(Williams and Grayer, 2004). Les bandes à 1339,5 (δa -CH3) et 1618 (ν –(C=C)-) indiquent la

présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre




présente une bande à 882,5 (ω -CH3) qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols

(Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où la présence de cette famille dans la fraction à

l’acétate d’éthyle. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au butanol montre la présence de la

fonction hydroxyle traduite par la bande à 3411 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi que

de celle des bandes à 1208,5 (νa -O-C=C-) et à 1511 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes

dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par les bandes à 967

(τ C=C, Ar), 762 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par les bandes à 1711,5 (ν –

(C=O)-OH) indiquent la présence de composés phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les

bandes à 1331,5 (δa -CH3) et 1616,5 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et

al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une bande à 872 (ω -CH3)

qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976)

d’où la présence de stérols dans cette fraction. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’eau montre la présence de la

fonction hydroxyle traduite par la bande à 3414,5 (υ O-H). La présence de cette bande ainsi

que de celle des bandes à 1212 (νa -O-C=C-), 766 (ω -C-H, Ar), 669,5 (ω C=C, Phénol) et

609,5 (ω O-H, Phénol) indique la présence de flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la

présence de la fonction acide traduite par les bandes à 1715 (ν –(C=O)-OH) indiquent la

présence d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les autres bandes à 1344,5 (δa -

CH3) et 1616,5 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;

Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre ne présente pas une bande à 872 (ω -CH3)

qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976)

d’où l’absence de cette famille dans la fraction aqueuse. Les alcaloïdes sont également absents

de cette fraction.

II.2. Spectres infrarouges des différentes fractions de Phyllanthus amarus

II.2.1. Résultats

Les fractions à l’hexane, au dichlorométhane, à l’acétate d’éthyle, au butanol et à l’eau

de Phyllanthus amarus sont respectivement notées FHP, FDP, FAP, FBP et FEP. L’ensemble des

spectres est donné dans la figure 64.




a. Spectre IR de la fraction à l’hexane de P. amarus

2982

2930,5

2852

1728,5

1601

1581

1516

1446,5

1391

1367,5

1286

1173,5

1124,5 1074

1040,5

1018,5

745,5

30

40

50

60

70

80

90

100

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FHP




b. Spectre IR de la fraction au dichlorométhane de P. amarus

c. Spectre IR de la fraction à l’acétate d'éthyle de P. amarus

3401,5

2923,5 2853,51731

1602

1515,5

1447,5

1446,5

1366,5

1285,51174,5

1123,5

1074,5

1039

862,5

745,5

706

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FDP

3413,52926

2854

1717,5

1613

1515,5

1449

1304 1206,5

1076,5

1036,5

872,5

744,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FAP




d. Spectre IR de la fraction au butanol de P. amarus

e. Spectre IR de la fraction à l’eau de P. amarus

Figure 66: Spectres Infrarouge des fractions de Phyllanthus amarus

33932926,5

2854,51725,5

1615,5

1516,5

1448

1368

1285,5 1206 1074

1039

744

20

30

40

50

60

70

80

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FBP

3428 2928

1619,5

1384,5

10791046

877,5

820,5

77420

25

30

35

40

45

50

55

60

5001000150020002500300035004000

TRA

NSM

ITTA

NC

E EN

%


FEP




Le spectre de FHP (figure 64 a) montre la présence de bandes à 2982 (ν –C-H), 2930,5

(νa -CH3), 2852 (νa -CH2-), 1728,5 (ν –(C=O)-OR), 1601 (ν –(C=C)-), 1516 (ν Ar), 1446,5 (δ

-C-H), 1367,5 (δ -CH3), 1286 (ν -C-O), 1173,5 (ω -CH2-), 1124,5 (ν C-C + ω -CH2-), 1074 (τ

-CH2-), 1040,5 (ρ -CH3), 745,5 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence

de chaines aliphatiques saturées et insaturées, de groupements carbonyles (ester) et de cycles

aromatiques.

Le spectre de FDP (figure 64 b) montre la présence de bandes à 3401,5 cm-1 (υ N-H et υ

O-H ), 2923,5 (νa -CH2-), 2853,5 (νa -CH2-), 1731 (ν –(C=O)-OR), 1602 (ν –(C=C)-), 1515

(ν Ar), 1446,5 (δ -C-H), 1366,5 (δs -CH3), 1285,5 (ν -C-O), 1174,5 (νa -O-C=C-), 1123,5 (ν

C-C + ω -CH2-), 1074 (τ -CH2-), 1039 (ν C-N), 862,5 (ω -CH3), 745,5 (ω -C-H, Ar).

L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements amines et éthers, de chaines

aliphatiques, de structures carbonées avec des liaisons multiples et de groupements carbonyles

(esters).

Le spectre de FAP (figure 64 c) montre la présence de bandes à 3413,5 cm-1 (υ O-H),

2926 (νa -CH2-), 2854 (νa -CH2-), 1717,5 (ν –(C=O)-OH), 1613 (ν –(C=C)-), 1515 (ν Ar),

1449 (δ -CH2-), 1304 (δa -CH3), 1206,5 (νa -O-C=C-), 1076,5 (τ -CH2-), 1036,5 (ρ -CH3),

872,5 (ω -CH3), 744,5 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de

groupements alcools (acides carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées

avec des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques.

Le spectre de FBP (figure 64 d) montre la présence de bandes à 3393 cm-1 (υ O-H),

2926,5 (νa -CH2-), 2854 (νa -CH2-), 1725,5 (ν –(C=O)-OH), 1615,5 (ν –(C=C)-), 1516,5 (ν

Ar), 1448 (δ -CH2-), 1368 (δs -CH3), 1285,5 (ν -C-O), 1206 (νa -O-C=C-), 1074 (τ -CH2-),

1039 (ρ -CH3), 744 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de

groupements alcools (acides carboxyliques), de chaines aliphatiques, de structures carbonées

avec des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques.

Le spectre de FEP (figure 64 e) montre la présence de bandes à 3428 cm-1 (υ O-H), 2928

(νa -CH2-), 1619,5 (ν –(C=C)-), 1384,5 (δa -CH3), 1079 (τ -CH2-), 1046 (ρ -CH3), 877,5 (ω -

CH3), 744 (ω -C-H, Ar). L’ensemble de ces résultats montre la présence de groupements

alcools (acides carboxyliques, phénols), de chaines aliphatiques, de structures carbonées avec

des liaisons multiples, de groupements carbonyles (acides) et de cycles aromatiques (phénols).




II2.2. Discussion

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’hexane montre la présence de

bandes à 1367,5 (δ -CH3) et 1601 (ν –(C=C)-) qui indiquent la présence de terpènes (Dosseh

et al., 1980; Holopainen, 2004b). La présence de bandes à 1728,5 (ν –(C=O)-OR), 1516 (ν Ar)

et 1286 (ν -C-O) confirme la présence d’esters aromatiques. Ces composés pourraient aussi être

des flavonoïdes ou des acides phénoliques dont les fonctions hydroxyles et acides ont été

éthérifiées ou estérifiés, ce qui confirmerait la présence de ces deux familles dans la fraction.

L’absence de bandes correspondant à la fonction amine qui traduit l’absence d’alcaloïdes. En

outre, le spectre ne présente pas de bandes à 815, 824, 872 ou 882 cm-1 qu'on attribue au groupe

méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où l’absence de stérols

dans cette fraction.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au dichlorométhane montre la

présence de la fonction amine traduite par deux bandes à 3401,5 (ν N-H) et 1039 (ν C-N)

indiquant la présence d’alcaloïdes (Hocquemiller et al., 1984). Les bandes à 1366,5 (δ -CH3) et

1602 (ν –(C=C)) indiquent également la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen,

2004b). La présence de la large bande à 3401,5 (υ O-H) ainsi que des bandes à 1174,5 (νa -O-

C=C-), à 1515 (ν Ar) et à 745,5 (ω -C-H, Ar) traduit la présence de flavonoïdes dans cette

fraction. La présence simultanée des groupements hydroxyle et amine donne une superposition

de leurs bandes d’absorption habituelle. Le spectre présente une bande à 862,5 (ω -CH3) qu'on

attribue au groupe méthyle terminal des stérols et traduit la présence de cette famille dans la

fraction au dichlorométhane (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976).

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’acétate d’éthyle montre la présence

de la fonction hydroxyle traduite par la bande à 3413,5 (υ O-H). La présence de cette bande

ainsi que de celle des bandes à 1206,5 (νa -O-C=C-) et à 1515 (ν Ar) indique la présence de

flavonoïdes dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par la

bande à 770 (ω -C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par la bande à 1717,5 (ν –(C=O)-

OH) indiquent la présence de d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les bandes à

1304 (δa -CH3) et 1613 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980;

Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une bande à 872,5 (ω -CH3) qu'on

attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Bulama et al., 2015; Itoh et al., 1976) d’où la

présence de stérols dans cette fraction. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.




L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction au butanol montre la présence de la


de celle des bandes à 1206 (νa -O-C=C-) et à 1516,5 (ν Ar) indique la présence de flavonoïdes

dans cette fraction. En plus, la présence d’aromatique traduite également par la bande à 744 (ω

-C-H, Ar) et de la fonction acide traduite par la bande à 1725,5 (ν –(C=O)-OH) indique la

présence d’acides phénoliques (Williams and Grayer, 2004). Les bandes à 1368 (δa -CH3) et

1615,5 (ν –(C=C)-) indiquent la présence de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b).

Les stérols et alcaloïdes sont absents de cette fraction.

L’ensemble des résultats obtenus pour la fraction à l’eau montre la présence de la


de celle de la bande à 744 (ω -C-H, Ar) confirme la présence de flavonoïdes dans cette fraction.

Les autres bandes à 1384,5 (δa -CH3) et 1619,5 (ν –(C=C)-) indiquent également la présence

de terpènes (Dosseh et al., 1980; Holopainen, 2004b). On peut noter que le spectre présente une

bande à 877,5 (ω -CH3) qu'on attribue au groupe méthyle terminal des stérols (Itou et al., 1976 ;

Bulama et al., 2015) d’où la présence de cette famille dans la fraction. Les alcaloïdes sont

absents de cette fraction.

III. ANALYSE EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE

PERFORMANCE COUPLEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-

VIOLETTES

La chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la spectroscopie

Ultra-Violette (HPLC-UV) est adaptée à la séparation des constituants d'un mélange même très

complexe tel que la matrice végétale. L'identification des produits élués se fait à l'aide d’un

détecteur UV/visible. Cette technique a été utilisée pour analyser les fractions issues des extraits

hydroalcooliques de Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus. L’identification des

terpènes et stérols s’est basée sur les travaux de Bulama et de ses collaborateurs (Bulama et al.,

2015), de Makin et Gower (2010) et de Brahim Harkati (2011) (Harkati, 2011; Makin and

Gower, 2010). Ces métabolites secondaires sont dotés de doubles liaisons conjuguées qui

absorbent fortement le rayonnement UV dans la plage de longueur d'onde comprise entre

environ 220 et 350 nm. L’identification des flavonoïdes s’est basée sur les maximum




d’absorption autour de 270 nm relatif à la bande II et autour de 350 nm relatif à la bande I (Bae

et al., 2015; Kassi, 2013; Mabry et al., 1970; Michel, 2011). Les alcaloïdes ont été identifiés

par les absorptions maximales autour de 228, 275 et 292 nm (Bruneton et al., 1974; Roblot et

al., 1978).

III.1. Chromatographie en phase liquide à haute performance combinée à la

spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia

III.1.1. Résultats

Dans cette partie, seules trois (3) fractions issues de l’extrait hydroalcoolique des

feuilles de Alchornea cordifolia ont été étudiées. Les chromatogrammes HPLC des fractions à

l’hexane (FHA), à l’acétate d’éthyle (FAA) et au butanol (FBA) de Alchornea cordifolia donnent

respectivement quatre (4) pics, sept (7) pics et huit (8) pics (annexe 03). Les spectres en

spectroscopie Ultra-Violette des précédentes fractions sont donnés dans les figures 65, 66 et 67.




a. Spectre UV du composé AH1

b. Spectre UV du composé AH2

c. Spectre UV du composé AH3

d. Spectre UV du composé AH4

Figure 67: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane des feuilles de Alchornea cordifolia




a. Spectre UV du composé AA2

b. Spectre UV du composé AA3

c. Spectre UV du composé AA4

d. Spectre UV du composé AA6

Figure 68: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle des feuilles de Alchornea cordifolia




a. Spectre UV du composé AB1

b. Spectre UV du composé AB2

c. Spectre UV du composé AB3

d. Spectre UV du composé AB4




e. Spectre UV du composé AB5

f. Spectre UV du composé AB6

g. Spectre UV du composé AB7

h. Spectre UV du composé AB8

Figure 69: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction au butanol des feuilles de Alchornea cordifolia

L’analyse des données spectrales a permis d’identifier les métabolites secondaires présents dans ces fractions (Tableau 31).




Tableau 31: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Alchornea cordifolia

Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax Familles de métabolites

Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et terpènes

Hexane

AH1 0,84 15,56 270 / 326 + - -

AH2 33,33 64,01 207 / 222 / 238 - - +

AH3 46,29 2,75 206 - - -

AH4 69,14 17,68 222 / 278 - + -

Acétate

d’éthyle

AA1 1,33 17,77 - - -

AA2 3,15 16,18 213 / 262 - - +

AA3 4,05 5,57 213 / 260 - - +

AA4 32,50 50,03 217 / 272 - + -

AA5 56,28 3,36 - - -

AA6 139,93 2,49 225 / 277 - + -

AA7 174,47 4,60 - - -

Butanol

AB1 1,47 2,53 267,1 / 386,9 + - -

AB2 2,00 6,13 218,5 / 272,8 / 395,9 + - -

AB3 3,33 9,14 213 / 267,1 / 342,2 + - -

AB4 4,05 39,03 218 / 274,1 / 341,9 + - -

AB5 6,75 3,55 208 / 218,1 / 262,2 - - +

AB6 35,54 32,82 215,1 / 270,7 / 337,6 + - -

AB7 36,00 1,50 203 / 255,2 / 357,4 + - -

AB8 64,18 5,31 254,4 / 360,2 + - -




III.1.2. Discussion

L’analyse des spectres UV de la fraction à l’hexane montre que tous les composés

séparés absorbent à la longueur d’onde de 220 nm. Les mesures réalisées aux bases et au

maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour les

composés AH1, AH3 et AH4, ce qui entraine une superposition des différents spectres pour

chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour le composé AH2 où les spectres ne sont

pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales

pratiquement identiques. Ce composé se présente alors sous forme de conformères dont les

intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Cette

fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées. Les stérols et

terpènes sont majoritaires avec 64,01 % suivis des alcaloïdes (17,68 %) et des flavonoïdes

(15,56 %). Cette fraction contient également 2,75 % du composé AH3 identifié comme étant

un ester ou un acide aliphatique (Silverstein, 2005).

L’analyse des spectres UV de la fraction à l’acétate d’éthyle montre que les composés

AA1, AA5 et AA7 n’absorbent pas en UV à 220 nm, ce qui traduit l’absence de groupes

chromophores absorbant à la longueur d’onde de l’étude dans ces molécules. Par conséquent,

leurs familles de métabolites secondaires n’ont pu être déterminées alors qu’ils représentent

25,74 %. Les mesures réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une

allure gaussienne sont identiques pour les composés AA2, AA4 et AA6 entrainant ainsi une

superposition des différents spectres pour chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour

le composé AA3 où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des

valeurs d’absorptions maximales pratiquement identiques. Le composé AA3 se présente alors

sous forme de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc

similaires (Gros, 2013). Cette fraction contient deux familles de métabolites secondaires

recherchées. Les alcaloïdes (composés AA4 et AA6) sont majoritaires avec 52,52 % suivis des

stérols et terpènes (composés AA2 et AA3) qui représentent 21,75 %. Les flavonoïdes sont

absents de cette fraction.

L’analyse des spectres UV de la fraction au butanol montre que tous les composés

absorbent en UV à 220 nm. Les mesures réalisées aux bases et au maximum des pics

chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour le composé AB4 entrainant

ainsi une superposition des différents spectres pour ce composé ce qui n’est pas le cas pour les

composés AB1, AB3, AB5, AB6, AB7 et AB8 où les spectres ne sont pas superposables mais




ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces

derniers se présentent alors sous forme de conformères dont les intensités des spectres UV sont

relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Les spectres de AB2 ne sont pas

superposables et n’ont pas la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales

pratiquement différents. Cette fraction contient deux familles de métabolites secondaires

recherchées. Les flavonoïdes (composés AB1, AB2, AB3, AB4, AB6, AB7 et AB8) sont

majoritaires avec 96,46 % suivis des stérols et terpènes (composé AB5) qui représentent 3,55

%. Les alcaloïdes sont absents de cette fraction.

Nous n’avons pas trouvé d’études similaires dans la littérature pour les comparer à notre

étude. Toutefois, l’analyse UV des macromolécules biologiques telles que les protéines et les

acides nucléiques a permis d’utiliser les valeurs de leurs absorbances pour mesurer leurs

concentrations, pour détecter des changements conformationnels et pour suivre les réactions

enzymatiques (Schmid, 2001). Cette technique a également été utilisée pour caractériser le β-

sitostérol de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l'écorce de racine de Terminalia glaucescens

(Bulama et al., 2015) ou encore pour la détermination simultanée de quinze (15) composés

phénoliques et de la caféine dans les thés et les matés (Bae et al., 2015). Plusieurs flavonoïdes

ont été identifiés en utilisant la spectroscopie Ultra-Violette (Kassi, 2013; Mabry et al., 1970).

IV. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

COMBINEE A LA SPECTROSCOPIE ULTRA-VIOLETTE DES FRACTIONS

DE PHYLLANTHUS AMARUS

IV.1. Résultats

Dans cette partie, seules trois (3) fractions issues de l’extrait hydroalcoolique de la

plante entière de Phyllanthus amarus ont été étudiées. Les chromatogrammes HPLC des

fractions à l’hexane (FHP), à l’acétate d’éthyle (FAP) et à l’eau (FEP) de Phyllanthus amarus

montrent que ces fractions donnent respectivement neuf (9) pics, dix-sept (17) pics et huit (8)

pics (annexe 04). Les spectres en spectroscopie Ultra-Violette des précédentes fractions sont

donnés dans les figures 68, 69 et 70.




a. Spectre UV du composé PH1

b. Spectre UV du composé PH3

c. Spectre UV du composé PH4

d. Spectre UV du composé PH5




e. Spectre UV du composé PH7

f. Spectre UV du composé PH8

g. Spectre UV du composé PH9

Figure 70: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’hexane de Phyllanthus amarus




a. Spectre UV du composé PA1

b. Spectre UV du composé PA3

c. Spectre UV du composé PA4

d. Spectre UV du composé PA5




e. Spectre UV du composé PA6

f. Spectre UV du composé PA7

g. Spectre UV du composé PA8

h. Spectre UV du composé PA9




i . Spectre UV du composé PA10

j . Spectre UV du composé PA11

k. Spectre UV du composé PA12

l . Spectre UV du composé PA13




m. Spectre UV du composé PA14

n. Spectre UV du composé PA15

o. Spectre UV du composé PA16

p. Spectre UV du composé PA17

Figure 71: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’acétate d’éthyle de Phyllanthus amarus




a. Spectre UV du composé PAQ1

b. Spectre UV du composé PAQ2




c. Spectre UV du composé PAQ3

d. Spectre UV du composé PAQ4

e. Spectre UV du composé PAQ5

f. Spectre UV du composé PAQ6




g. Spectre UV du composé PAQ7

Figure 72: Spectres en spectroscopie Ultra-Violette de la fraction à l’eau de Phyllanthus amarus

L’analyse des données spectrales a permis d’identifier les métabolites secondaires présents dans ces fractions (Tableau 32).




Tableau 32: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Phyllanthus amarus

Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax Familles de métabolites

Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et terpènes

Hexane

PH1 0,84 1,22

PH2 60,98 80,40 209,7 / 238 / 274,9 - + -

PH3 63,57 0,40 232,7 / 283,3 - + -

PH4 67,66 2,73 203,3 / 282,2 - - +

PH5 70,94 5,60 201,5 / 229,9 / 279,9 - + -

PH6 71,37 0,55

PH7 75,22 4,49 204,4 / 281,4 - - +

PH8 77,32 4,21 202,6 / 279,4 - - +

PH9 144,43 0,40 255,2 - - -

Acétate

d’éthyle

PA1 0,91 2,53 212,7 / 261,2 - - +

PA2 3,12 7,65

PA3 4,04 0,81 213 / 260,7 / 326,3 + - -

PA4 4,13 3,03 228,3 / 284,3 - + -

PA5 21,89 13,96 221,5 / 282,9 - + -

PA6 27,23 11,34 218 / 277,6 - - +

PA7 31,12 3,64 218,3 / 270,7 - - +

PA8 32,59 2,42 216,3 / 271,8 - - +




Tableau 33: Analyse des données spectrales de la spectroscopie Ultra-Violette des fractions de Phyllanthus amarus (suite)

Fractions Composés Tr (mn) Pourcentage (%) λmax


Flavonoïdes Alcaloïdes Stérols et

terpènes

Acétate

d’éthyle

PA9 38,01 8,28 220,4 / 277,8 - + -

PA10 130,67 21,18 226,7 / 275,2 - + -

PA11 143,73 2,87 203,2 / 282,3 - - +

PA12 147,22 6,11 201,4 / 229,9 / 279,9 - + -

PA13 151,29 4,64 204,5 / 281,4 - - +

PA14 152,40 4,21 202,8 / 279,8 - - +

PA15 156,68 2,68 224,8 / 276,9 - + -

PA16 172,99 1,75 204,6 / 248,8 - - -

PA17 173,23 2,89 255,8 - - -

Eau

PAQ1 1,91 1,08 208,5 - - -

PAQ2 2,29 0,85 217,5 / 272,1 - - +

PAQ3 2,62 35,70 216,7 / 323,9 + - -

PAQ4 3,37 22,85 214,4 / 296,9 - - +

PAQ5 4,05 9,15 216,3 / 272,1 - - +

PAQ6 4,31 27,75 218,9 / 279,1 - + -

PAQ7 7,33 2,18 221,5 / 275,4 / 343,9 + - -

PAQ8 64,18 0,44 -




IV.2. Discussion

L’analyse des spectres UV de la fraction à l’hexane montre que les composés PH1 et

PH6 n’absorbent pas en UV à 220 nm traduisant l’absence de groupes chromophores absorbant

à la longueur d’onde de l’étude dans ces molécules. Les mesures réalisées aux bases et au

maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont identiques pour les

composés PH4, PH7, PH8 et PH9 entrainant ainsi une superposition des différents spectres

pour chacun de ces composés ce qui n’est pas le cas pour les composés PH2, PH3, PH5 et PH6

où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs

d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme

de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires

(Gros, 2013). Cette fraction contient deux des trois familles de métabolites secondaires

recherchées. Les alcaloïdes sont majoritaires avec 86,40 % suivis des stérols et terpènes (11,43

%) alors que les flavonoïdes sont absents. Cette fraction contient également 0,40 % du composé

PH9 identifié comme étant un acide 3,4-hydroxybenzoïque (composé phénolique) (Amiot et

al., 1989; Michel, 2011).

L’analyse des spectres UV de la fraction à l’acétate d’éthyle montre que le composé

PA2 n’absorbe pas en UV à 220 nm traduisant l’absence de groupes chromophores absorbant

à la longueur d’onde de l’étude dans cette molécule. Par conséquent, ses familles de métabolites

secondaires n’ont pu être déterminées alors qu’il a une proportion de 7,65 %. Les mesures

réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont

identiques pour les composés PA3, PA6, PA7, PA9, PA10, PA11, PA13, PA14, PA15, PA16

et PA17 entrainant ainsi la superposition des différents spectres pour chacun de ces composés

ce qui n’est pas le cas pour les composés PA1, PA4, PA5, PA8 et PA12 où les spectres ne sont

pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs d’absorptions maximales

pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme de conformères dont les

intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires (Gros, 2013). Cette

fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées. Les alcaloïdes

(composés PA4, PA5, PA9, PA10, PA12 et PA15) sont majoritaires avec 55,24 % suivis des

stérols et terpènes (composés PA1, PA6, PA7, PA8, PA11, PA13 et PA14) qui représentent

31,65 %. Les flavonoïdes sont minoritaires dans cette fraction avec une proportion de 0,81 %.

Le composé PA16 n’a pu être identifié alors que le composé PA17 a été identifié comme étant

un acide p-hydroxybenzoïque (composé phénolique) (Amiot et al., 1989; Michel, 2011).




L’analyse des spectres UV de la fraction aqueuse montre que le composé PAQ8

n’absorbe pas en UV à 220 nm traduisant ainsi l’absence de groupes chromophores absorbant

à la longueur d’onde de l’étude dans cette molécule. Par conséquent, ses familles de métabolites

secondaires n’ont pu être déterminées même s’il ne représente que 0,44 %. Les mesures

réalisées aux bases et au maximum des pics chromatographiques à une allure gaussienne sont

identiques pour le composé PAQ5 entrainant ainsi une superposition des différents spectres

pour ce composé ce qui n’est pas le cas pour les composés PAQ1, PAQ2, PAQ3, PAQ4, PAQ6

et PAQ7 où les spectres ne sont pas superposables mais ont la même allure avec des valeurs

d’absorptions maximales pratiquement identiques. Ces derniers se présentent alors sous forme

de conformères dont les intensités des spectres UV sont relativement stables et donc similaires

(Gros, 2013). Cette fraction contient les trois familles de métabolites secondaires recherchées.

Les flavonoïdes (composés PAQ3 et PAQ7) sont majoritaires avec 37,88 % suivis des stérols

et terpènes (composés PAQ2, PAQ4 et PAQ5) et des alcaloïdes (composé PAQ6) qui

représentent respectivement 32,85 % et 27,75 %. Le composé PAQ1 (1,08 %) a été identifié

comme étant un acide aliphatique (Silverstein, 2005).

Nous n’avons pas trouvé d’études similaires dans la littérature pour les comparer à notre

étude. Toutefois, l’analyse UV des macromolécules biologiques telles que les protéines et les

acides nucléiques a permis d’utiliser les valeurs de leurs absorbances pour mesurer leurs

concentrations, pour détecter des changements conformationnels et pour suivre les réactions

enzymatiques (Schmid, 2001). Cette technique a également été utilisée pour caractériser le β-

sitostérol de l’extrait à l’acétate d’éthyle de l'écorce de racine de Terminalia glaucescens

(Bulama et al., 2015) ou encore pour la détermination simultanée de quinze (15) composés

phénoliques et de la caféine dans les thés et les matés (Bae et al., 2015). Plusieurs flavonoïdes

ont été identifiés en utilisant la spectroscopie Ultra-Violette (Kassi, 2013; Mabry et al., 1970).

V. COMPARAISON DES METHODES ANALYTIQUES DE CRIBLAGE DES

METABOLITES SECONDAIRES

Afin de comparer les méthodes analytiques de criblages des métabolites secondaires de

Alchornea cordifolia et de Phyllanthus amarus, un traitement statistique des données s’avèrent

nécessaire. Il existe plusieurs méthodes statistiques telle que l’analyse en composante principale

(ACP), la classification ascendante hiérarchique et le tableau croisé dynamique. C’est cette

dernière méthode que nous avons utilisée car c’est une méthode simple qui permet de générer




une synthèse d'une table de données brutes, d’en effectuer une analyse interactive et de proposer

une représentation synthétique des résultats (Altom, 2011; Chen, 2007; Montondon and Marsh,

2006). La présence d’une famille de métabolites secondaires initialement matérialisée par un

signe (+) sera matérialisée par le chiffre un (1) et l’absence par le chiffre zéro (0). Le tableau

résultant est donné en annexe 05 et son illustration est donnée dans les figures 71 et 72

respectivement pour Alchornea cordifolia et Phyllanthus amarus.




V.1. Résultats

Figure 73: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour Alchornea cordifolia

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

HP

LC U

V

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

Scre

enin

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HP

TLC IR

HP

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V

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

HP

LC U

V

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

Fraction à l'hexane Fraction audichlorométhane

Fraction à l'acétate d'éthyle Fraction au butanol Fraction résiduelle


Métabolites secondaires Alcaloïdes Métabolites secondaires Flavonoïdes Métabolites secondaires Tepènes et stérols




Figure 74: Comparaison de trois méthodes de criblage avec le screening chimique pour Phyllanthus amarus

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

HP

LC U

V

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

Scre

enin

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HP

TLC IR

HP

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V

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

Scre

enin

g ch

imiq

ue

HP

TLC IR

HP

LC U

V

Fraction à l'hexane Fraction audichlorométhane

Fraction à l'acétate d'éthyle Fraction au butanol Fraction résiduelle

Phyllanthus amarus

Métabolites secondaires Alcaloïdes Métabolites secondaires Flavonoïdes Métabolites secondaires Tepènes et stérols




La méthode des tableaux croisés dynamiques est utilisée pour analyser les résultats de

détection (1) ou non (0) des familles de métabolites secondaires. Les données sont notées dans

un tableau et elles sont croisées entre elles (ligne et colonne) par le logiciel Excel, ce qui permet

de calculer le pourcentage de détection d’une méthode donnée dans la détection d’une famille

de métabolites secondaires choisie. Les différents résultats de cette méthode sont illustrés dans

la figure 73.

Figure 75: Résumé des pourcentages de détection de famille de métabolites

secondaires

V.2. Discussion

La figure 73 compare la détection globale des méthodes de criblage. La méthode qui a

un pourcentage de détection similaire dans toutes les familles de métabolites est la méthode de

criblage par HPTLC. Elle a un minimum de 30% de détection globale dans toutes les familles

de métabolites. La méthode de criblage par screening phytochimique est celle qui a les résultats

les plus satisfaisants avec deux pourcentages au-dessus de 30%. Il n’y a qu’au niveau des

terpènes et stérols que la détection est en dessous de 20%. La méthode de criblage par IR est

très satisfaisante pour les terpènes et stérols. La méthode par HPLC UV est celle qui donne les

moins bons résultats. La figure 74 résume le pourcentage de détection de chacune des méthodes

dans une famille de métabolites secondaires

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

35,00%

HPLC UV HPTLC IR Screeningchimique

Somme de Alcaloïdes

Somme de Flavonoïdes

Somme de Tepènes et stérols




a. Pourcentage de détection dans les Alcaloïdes

b. Pourcentage de détection dans les Flavonoïdes

c. Pourcentage de détection des Terpènes et stérols

Figure 76: Pourcentage de détection des métabolites secondaires

22,73%

31,82%13,64%

31,82%

HPLC UV

HPTLC

IR

Screeningchimique

12,12%

30,30%

27,27%

30,30%

HPLC UV

HPTLC

IR

Screeningchimique

20,00%

30,00%33,33%

16,67%HPLC UV

HPTLC

IR

Screeningchimique




Les alcaloïdes sont mieux détectés la HPTLC (31,82%) et le screening chimique (31,82

%) suivis de la HPLC-UV. La méthode de criblage par Infrarouge est la moins sensible

(13,64%). Cela pourrait être dû à la superposition des bandes des amines et des alcools

(Silverstein, 2005).

Les flavonoïdes sont mieux détectés la HPTLC (30,30%) et le screening chimique

(30,30%) suivis de l’Infrarouge (27,27 %). La méthode HPLC-UV est la moins sensible (12,12

%). Cela pourrait être dû à la grande influence de l’environnement moléculaire, des conditions

d’analyses dans cette méthode et surtout au choix de la longueur d’onde du détecteur qui

pourrait empêcher l’absorption des groupes chromophores de certains flavonoïdes.

Les Terpènes et stérols sont mieux détectés l’IR (33,33%) suivis de la HPTLC (30,00

%) puis de la méthode HPLC-UV (20,00 %). La méthode la moins sensible est le screening

chimique (16,67 %).

Il ressort de tous ces résultats que la méthode de criblage par HPTLC est la plus

satisfaisante. En effet, quel que soit la famille de métabolites à détecter, elle a des pourcentages

de détection supérieurs à 30%. Cela est dû au fait que cette méthode, en plus de balayer un large

spectre détection en longueurs d’onde UV, sépare d’abord les composants en taches ce qui

annulent les encombrements et évitent qu’une famille majoritaire rende difficile la détection

d’une autre qui existe belle et bien dans la fraction.

Des analyses similaires ont été réalisées en séparant les résultats par plante afin de vérifier

une potentielle influence du matériel végétal lors des criblages. Les résultats des figures 75 et

76 confirme l’efficacité de la méthode HPTLC avec 33,33%, 31,25% et 28,57% de détection

respective des alcaloïdes, flavonoïdes et terpènes et stérols dans les fractions de Alchornea

cordifolia et également avec 30,77%, 29,41% et 31,25% de détection respective des alcaloïdes,

flavonoïdes et terpènes et stérols dans les fractions de Phyllanthus amarus.







Phyllanthus amarus

22,22%

33,33%

22,22%

22,22%

12,50%

31,25%

25,00%

31,25%

21,43%

28,57%

35,71%

14,29%

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

35,00%

40,00%

HPLC UV HPTLC IR Screening chimique

Somme de Alcaloïdes Somme de Flavonoïdes Somme de Tepènes et stérols

23,08%

30,77%

7,69%

38,46%

11,76%

29,41%29,41%

29,41%

18,75%

31,25%

31,25%

18,75%

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

35,00%

40,00%

HPLC UV HPTLC IR Screening chimique

Somme de Alcaloïdes Somme de Flavonoïdes Somme de Tepènes et stérols




VI. DETERMINATION STRUCTURALE PAR CHROMATOGRAPHIE EN

PHASE GAZEUSE COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE

L'identification des composés a été possible, en comparant les temps de rétention avec

ceux des standards et les données spectrales obtenues à partir des bibliothèques Wiley et NIST.

Les fractions analysées sont les fractions au dichlorométhane et à l’acétate d’éthyle issues de

l’extrait hydro alcoolique des fleurs.

VI.1. Analyse GC-MS des composés de la fraction à l’acétate d’éthyle issue de

l’extrait hydro alcoolique des fleurs de Tridax procumbens

Le chromatogramme CG-MS, présenté en figure 77, montre la présence de plusieurs

pics correspondant à plusieurs composés silylés avec des temps de rétention compris entre 4,243

et 17,126 minutes.

Figure 79: Chromatogramme de la fraction à l’acétate d'éthyle de Tridax procumbens

Le pic 1 (temps rétention 4,243 minutes) est le 2,3 diméthylbutan-2-ol représenté sur la

figure (78). Son spectre de masse (celui de son dérivé silylé) (figure (79)) montre que trois

fragments se distinguent avec le fragment de masse 73 m/z (C2H7OSi) qui est le plus abondant.

Il dérive de la coupure la liaison silice carbone (schéma 3). Ce composé peut être classé parmi

les terpènes et stérols.




Figure 80: 2,3 Diméthylbutan-2-ol

Figure 81: Spectre de masse du pic 1

Schéma 3: Décomposition du pic 1




Le pic n°2 (temps de rétention de 6,340 minutes) est l’octan-1-ol (figure 80). Son spectre

de masse (figure 81) révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 187 m/z ce qui

correspondrait au départ de groupement méthyle en fin de chaine de la molécule. Les fragments

de masse 129 m/z et 73 m/z proviendraient de la rupture de la liaison entre l’oxygène et le

silicium. Le fragment de masse 89 m/z correspondrait au groupement C3H9OSi résultant de la

rupture entre l’oxygène et le carbone (schéma 4). Ce composé peut être classé dans la famille

des terpènes et stérols.

Figure 82: Octan-1-ol

Figure 83: Spectre du pic 2





Le pic n°3 (temps de rétention 8,310 minutes) est le 4-hydroxy benzoate de méthyle

(figure 82). La masse de son dérivé sylilé est de 224 m/z ; le fragment le plus abondant a une

masse de 209 m/z et serai du soit au départ du groupement méthyle de l’oxygène du groupement

ester, soit d’un méthyle relié au silicium (figure 83). Le fragment de masse 224 m/z

correspondrait à la molécule elle-même. Le fragment de masse 135 m/z serait le fragment

C8H7O2 résultat de la rupture entre l’oxygène et du cycle aromatique. Les fragments de masse

149 m/z et 73 m/z proviendraient du départ du groupement triméthylsilyl (schéma 5). Ce

composé peut être classé parmi les composés phénoliques.

Figure 84: 4-Hydroxy benzoate de méthyle





Schéma 5: Décomposition du spectre du pic 3

Le pic n°4 (temps de rétention 9,04 minutes) est l’acide 4-hydroxybenzoïque (figure

84). Son spectre de masse révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 267 m/z qui




résulte du départ d’un groupement méthyle lié à l’un des siliciums présents dans le dérivé silylé

(figure 85). Les fragments de masse 193 m/z et 89 m/z (91 m/z sur le spectre, une différence

qui peut être due à des isotopes) proviendraient de la scission de la liaison entre un carbone et

un oxygène lié au silicium. Les fragments de masse 73 m/z et 209 m/z (251 sur le spectre)

viennent du départ du groupement triméthylsilyl (schéma 6). Ce composé peut être classé parmi

les composés phénoliques.

Figure 86: Acide 4-hydroxybenzoïque






Le pic n°5 (temps de rétention 9,527) est 3,4 dihydroxy benzoate de méthyle (figure 86).

Le fragment le plus abondant du spectre de masse de son dérivé silylé a une masse de 193 m/z

(figure 87). Le fragment pourrait provenir de la rupture d’un des groupements silyles et le départ

de l’oxygène et du groupement methoxyle du carbone du groupement carbonyle. Les fragments

de masse 166 m/z (165 sur le spectre) et 73 m/z proviendraient du départ d’un groupement

triméthylsilyl (schéma 7). Ce composé peut être classé parmi les composés phénoliques.




Figure 88: Ester méthylique de l'acide procatéchine






Le pic n°6 (temps de rétention 9,910) est l’ester méthylique de l’acide coumarique

(figure 88) ; son spectre de masse montre que le fragment le plus abondant est l’ion formé par

la molécule entière avec pour masse 250 m/z suivi par le fragment de masse 235 m/z qui découle

du départ d’un groupement méthyle (figure 89). Le fragment de masse 219 m/z provient du

départ d’un oxygène du fragment de masse 235 m/z ; la perte d’un autre oxygène conduit au

fragment de masse 203 m/z. Le fragment de masse 73 m/z résulte du départ du groupement

triméthylsilyl (schéma 8). Ce composé peut être classé parmi les composés phénoliques.

Figure 90: Ester méthylique de l'acide coumarique






Le pic n°7 (temps de rétention 9,977 minutes) est le 3-metoxypent-4-1-yl benzène

(figure 90). Le spectre de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse

de 73 m/z qui correspond au départ du groupement triméthylsilyle (figure 91). L’autre fragment

qui vient juste après en abondance a une masse de 233 m/z et résulte du départ d’un groupement

méthyle (schéma 9). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.

Figure 92: (3-methoxy-4-en-1-yl) Benzène






Le pic n°8 (temps de rétention 10,013) est l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque (figure 92).

Le spectre de masse de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse

de 193 m/z (figure 93) ; ce fragment résulterait du départ de deux groupements triméthylsilyles

(fragment de masse 73 m/z) sur trois et la fragmentation du groupement carbonyle avec départ

des oxygènes sur le carbone du carbonyle. Les fragments de masse 355 m/z et 310 m/z (311 sur

le spectre) résultent respectivement du départ d’un (1) groupement méthyle et de quatre (4)

groupements méthyles (schéma 10). Ce composé est dans la famille des composés phénoliques.




Figure 94: Acide 3,4-dihydroxybenzoïque






Le pic n°9 (temps de rétention 10,340 minutes) (figure 94) a un spectre de masse qui est

dominé par le fragment de masse 73 m/z (figure 95). Ce fragment est le triméthylsilyle qui se

détache de la molécule (schéma 11). Ce composé est de la famille des alcaloïdes.

Figure 96:4-[(2E)-butan-2-ylidene amino]-3-ethlbutane-1,2,4-triol






Le pic n°10 est un diester : le malonat de diéthyle (figure 96). Le fragment le plus

abondant dans le spectre de masse à une masse de 73 m/z (figure 97). Il correspond à l’ion issu

de la rupture entre le silicium et le carbone, ce qui donne le départ de l’ion triméthylsilyle

(schéma 12). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.

Figure 98: Malonate de diéthyle





Schéma 12:Décomposition du pic 10

Le pic n°11 (temps de rétention 10,620 minutes) est l’acide 4-hydroxyphénylpropan-2-

enoïque (figure 98) ; le spectre de masse du dérivé silylé montre que le fragment le plus

abondant a une masse de 73 m/z (figure 99). Ce fragment correspond au groupement




triméthylsilyle. Le fragment de masse 235 m/z résulte du départ du groupement triméthylsilyl.

Les fragments de masse 293 m/z et 248 m/z (249 sur le spectre) résultent respectivement du

départ d’un (1) et de quatre (4) groupements méthyles. Les fragments de masse 219 m/z et 89

m/z (88 sur le spectre) résulte de la scission de la liaison entre l’oxygène et un carbone

appartenant au cycle aromatique (schéma 13). Ce composé est de la famille des composés

phénoliques.

Figure 100: Acide (2E)-3-(4-hydroxyphényl) prop-2-énoïque









Le pic n°12 (temps de rétention 10,673 minutes) est l’acrylate de méthyl 3-(4-

hydroxyphényle) (figure 100). Son dérivé donne un spectre de masse dont le fragment le plus

abondant a une masse de 250 m/z (figure 101). Il se forme par le départ de deux groupements

méthyles. Les fragments de masse 221 m/z (219 sur le spectre) et 59 m/z résultent de la rupture

de la liaison carbone carbone entre le carbone du groupement carbonyle et celui de la liaison

multiple. Le fragment de masse 73 m/z correspond au groupement triméthylsilyl (schéma 14).

Ce composé est de la famille des composés phénoliques.

Figure 102: Acrylate de méthyle 3-(4-hydroxyphényle)






Le pic n°13 (temps de rétention 10,933 minutes) est l’acrylate de méthyl-3-(3,4-

dihydroxyphényle) (figure 102) ; son spectre de masse révèle que le fragment le plus abondant

a une masse de 220 m/z (219 sur le spectre) (figure 103). Il provient du départ du groupement

triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) et un groupement méthyle. Les fragments de masse

265 m/z et 192 m/z résultent du départ de respectivement un (1) et deux (2) groupements

triméthylsilyls (schéma 15). Ce composé fait partie des composés phénoliques.

Figure 104: Acrylate de méthyl-3-(3,4-dihydroxyphényle)






Le pic n°14 (temps de rétention 11,297 minutes) est l’acide férulique (figure 104). Le

spectre de masse de son dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse de




73 m/z et provient de du départ des groupements triméthylsilyls (figure 105). Les fragments de

masse 249 m/z et 89 m/z résultent de la rupture de la liaison entre l’oxygène et le cycle

aromatique. Le fragment de masse 308 m/z résulte du départ de deux groupements méthyls

(schéma 16). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.

Figure 106: Acide férulique






Le pic n°15 (temps de rétention 11,483 minutes) est l’acide caféique (figure 106). Le

fragment le plus abondant su spectre de masse de son dérivé silylé a une masse de 219 m/z (issu

de la rupture de la liaison carbone-carbone au niveau du carbone du groupement carbonyle)

suivi du fragment de masse 73 m/z (issu du départ de quatre (4) groupements méthyles et du

fragment de masse 117 m/z (115 sur le spectre)) (figure 107). Le fragment de masse 381 m/z

résulte du départ d’un (1) groupement méthyl (schéma 17). Ce composé est de la famille des

composés phénoliques.




Figure 108: Acide caféique






Le pic n°16 (temps de rétention 16,193 minutes) est un flavonoïde (2-3,4-

dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromèn-4-one (figure 108). Le spectre de masse

montre un fragment abondant de masse 647 m/z qui découle du départ d’un groupement

méthyle (figure 109). Le fragment de masse 559 m/z résulte du départ de deux (2) groupements

méthyls et un groupement triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) (schéma 18).




Figure 110: 2-(3,4-dihydroxyphényl)-3,5,7-trihydroxy-4h-chromèn-4-one



Le pic n°17 (temps de rétention 16,813 minutes) est aussi un flavonoïde (2-3,4-

dihydrophenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one) (figure 110). Le fragment le

plus abondant du spectre de masse du dérivé silylé a une masse de 589 m/z (figure 111). Ce




fragment découle du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 485 m/z provient

du départ de huit (8) groupements méthyls. Les fragments de masse 531 m/z et 73 m/z résultent

du départ d’un groupement triméthylsilyl (schéma 19).

Figure 112: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5-dihydroxy-7-methoxy-4H-chromen-4-one






Le pic 18 (temps de rétention 17,127 minutes) est aussi un flavonoïde, le 3,5,7-

trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one (figure 112). Le spectre de son dérivé

silylé nous révèle que le fragment majoritaire est issu du départ d’un groupement méthyle et a

une masse de 559 m/z (figure 113). Le fragment de masse 471 m/z résulte du départ d’un

groupement méthyl et d’un groupement triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z) (schéma 20).




Figure 114: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one






Les composés identifiés sont connus mais la littérature ne mentionne pas la présence de

beaucoup d’entre eux dans les extraits des fleurs de Tridax procumbens linn. En effet, cet

organe de la plante n’a pratiquement pas fait l’objet d’étude chimique dans l’objectif de

déterminer les structures des composés présents.

VI.2. Analyse GC-MS des composés de la fraction au dichlorométhane issue de

l’extrait hydro alcoolique des fleurs Tridax procumbens linn

Le chromatogramme CG-MS, présenté sur la figure 114, montre la présence de plusieurs

pics correspondant à plusieurs composés silylés avec des temps de rétention compris entre 3,862

et 13,337 minutes. Les composés identifiés sont obtenus à partir des composés silylés

correspondants et ils appartiennent à plusieurs familles. Ils peuvent constituer trois groupes :




les dérivés des acides hydroxycinnamiques, des acides hydroxybenzoïques ainsi que des acides

organiques non aromatiques.

Figure 116: Chromatogramme de la fraction dichlorométhane de Tridax procumbens

L’identification des composés a été réalisée avec les spectres de masse.

Le pic n°1 (temps de rétention 3,853 minutes) est le méthylamino méthanol (figure 115).

Son spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une masse de 160 m/z

(figure 116). Il est obtenu avec le départ de trois groupements méthyles. Les fragments de masse

60 m/z (59 sur le spectre) et de masse 87 m/z résultent respectivement du départ des deux (2)

groupements triméthylsilyles (fragment de masse 73 m/z) et de trois groupements méthyles et

un (1) groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 175 m/z résulte du départ de deux (2)

groupements méthyles (schéma 21). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.

Figure 117: (Méthylamino) méthanol




Figure 118: Spectre de masse du pic 1

Schéma 21: Décomposition pic n°1

Le pic n°2 (temps de rétention 4,003 minutes) est le (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one

(figure 117). Son spectre nous montre que les fragments les plus abondants sont ceux avec une

masse de 73 m/z et de 157 m/z (figure 118). Le fragment de masse 73 m/z est obtenu par la

rupture de la liaison oxygène silicium, tandis que le fragment de masse 157 m/z est obtenu par

le départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 115 m/z résulte du départ de quatre

(4) groupements méthyles (schéma 22). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.




Figure 119: (3E)-4-hydroxypent-3-en-2-one

Figure 120: Spectre de masse du pic n°2

Schéma 22: Décomposition du pic n°2




Le pic n°3 (temps de rétention 4,453 minutes) est le phénol. Son spectre de masse

montre que le fragment majoritaire a une masse de 151 m/z (figure 119). Il se forme par le

départ d’un groupent méthyle (schéma 23). Ce composé est de la famille des composés

phénoliques.

Figure 121: spectre du pic n°3

Schéma 23: décomposition du pic n°3

Le pic n°4 (temps de rétention 5,433 minutes) est l’acide hydroxyacétique. Le spectre

de masse de son dérivé silylé (figure 120) montre qu’il y a deux fragments abondants, l’un de

masse 73 m/z et l’autre de masse 147 m/z qui résulte tous de deux de la rupture de la liaison

oxygène-silicium (schéma 24). Le fragment de masse 205 m/z résulte du départ d’un




groupement méthyl. Le fragment de masse 177 m/z résulte du départ de trois (3) groupements

méthyles. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.



Le pic n°5 (temps de rétention 5,907 minutes) est l’acide 3-ethoxy-3-oxopropanoïque.

Son spectre de masse (figure 121) révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 75

m/z. Il peut se former par soit le départ d’un groupement triméthylsilyl soit de la rupture entre

l’oxygène et le carbone du carbonyle (schéma 25). Le fragment de masse 131 m/z résulte du

départ d’un groupement triméthylsilyl. Le fragment de masse 159 m/z résulte du départ du




groupement éther d’éthyle rattaché au carbone du crabonyle. Ce composé fait parte des terpènes

et stérols.



Le pic n°6 (temps de rétention 6,060 minutes) est le phénylméthanol. Le spectre de

masse (figure 122) de son dérivé silylé montre deux fragments abondants : l’un de masse 91

m/z dû à la rupture de la liaison carbone oxygène, l’autre de masse 165 m/z dû au départ d’un

groupement méthyle (schéma 26). Le fragment de masse 135 m/z résulte du départ de trois

groupements méthyles. Ce composé est de la famille des composés phénoliques.






Le pic n°7 (temps de rétention 6,307 minutes) est le 3-hydroxy-4,4-

diméthyldihydrofuran-2(3H)-one. Son dérivé silylé a un spectre de masse (figure 123) qui

révèle que le fragment le plus abondant a une masse de 75 m/z. Il se formerai par départ du

groupement triméthylsilyle (schéma 27). Le fragment de masse 187 m/z résulte du départ d’un

groupement méthyle, alors que le fragment de masse 142 m/z lui résulte du départ de quatre (4)

groupements méthyles. Ce composé est de la famille des composés phénoliques.




Figure 125: Spectre de masse du pic n° 7


Le pic n°8 est l’acide 3-méthylheptanedioïque. Le spectre de masse du dérivé silylé de

cet acide révèle que le fragment majoritaire a une masse de 156 m/z (figure 124). Ce fragment

serait dû à une rupture la liaison entre deux carbones les plus éloignés des carbonyles dont l’un

est trisubstitué (schéma 28). Le fragment de masse 245 m/z résulte du départ du groupement

triméthylsilyl (fragment de masse 73 m/z). Les fragments de masse 73 m/z, 128 m/z et 117 m/z

résultent de la scission des liaisons carbone-carbone et oxygène-silicium. Les fragments de

masse 89 m/z et 56 m/z résultent de la rupture des liaisons oxygène-silicium et la liaison

carbone-carbone. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.






Le pic n°9 (temps de rétention 6,710 minutes) est l’acide 4-ethoxy-4-oxobutanoïque. Le

spectre de masse du dérivé silylé montre que le fragment le plus abondant a une masse de 91

m/z (figure 125). Il résulterait de la rupture entre l’oxygène lié au silicium et le carbone du

carbonyle ; cette rupture est aussi à l’origine du fragment de masse 129 m/z (schéma 29). Le

fragment de masse 73 m/z est le groupement triméthylsilyl qui se détache de la molécule en

formant un autre fragment de masse 145 m/z. le fragment de masse 158 m/z résulte du départ

de quatre (4) groupements méthyles. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.






Le pic n°10 (temps de rétention 7,223 minutes) est l’acide 2,3-dihydroxypropanoïque.

Le spectre de masse de son dérivé silylé montre un fragment majoritaire de masse 73 m/z (figure

126) correspondant au départ du groupement triméthylsilyle (schéma 30). Le fragment de masse

103 m/z résulte du départ de trois groupements triméthylsilyls. Les fragments de masse 142 m/z

et 43 m/z résultent de la rupture d’une liaison oxygène carbone et du départ de neuf (9)

groupements méthyles. Les fragments de masse 186 m/z, 292 m/z et 307 m/z résultent

respectivement du départ de neuf (9), deux (2) et un (1) groupements méthyles. Ce composé

fait partie des terpènes et stérols.






Le pic n°11 (temps de rétention 7,410 minutes) est l’acide 2-hydroxybutanedioïque. Le

spectre de masse du dérivé silylé nous renseigne sur le fragment majoritaire qui a une masse de

73 m/z (figure 127), résultant du départ du groupement triméthylsilyle générant dans le même

temps le fragment de masse 130 m/z (schéma31). Le fragment de masse 172 m/z résulte de la




rupture de deux liaisons oxygène-carbone du groupement carbonyle, ce qui provoque le départ

du groupe C3H9OSi qui est le fragment de masse 89 m/z. le fragment de masse 117 m/z résulte

de la rupture d’une liaison carbone-carbone du carbonyle avec génération du fragment de masse

233 m/z. Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.



Le pic n°12 (temps de rétention 7,733 minutes) est la 3,4-dihydroxydihydrofuran-2(3H)-

one. Le spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une masse de 73 m/z

(figure 128). Il se forme par le départ du groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 100

m/z résulte du départ de deux groupements triméthylsilyls et d’un atome d’oxygène. Le




fragment de masse 143 m/z résulte du départ de trois (3) groupements méthyles et un

groupement triméthylsilyl. Le fragment de masse 189 m/z résulte du départ du groupement

triméthylsylil. Le fragment de masse 233 m/z résulte du départ de deux groupements méthyles


Figure 130: Spectre de masse n°12





Le pic n°13 (temps de rétention 8,193 minutes) est la 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-

4H-pyran-4-one. Le spectre de masse du dérivé silylé révèle plusieurs fragments dont le plus

abondant à une masse de 271 m/z (figure 129) ; celui-ci est formé par le départ d’un groupement

méthyle. Le fragment de masse 197 m/z résulte de la rupture de la liaison entre l’oxygène lié

au silicium et le carbone lié au cycle aromatique. Le fragment de masse de 213 m/z résulte du

départ du groupement triméthylsilyle (fragment de masse 73 m/z) (schéma 33). Ce composé est

de la famille des composés phénoliques.






Le pic n°14 (temps de rétention 8,370 minutes) est l’acide 3-hydroxy-3-(4-

hydroxyphenyl)propanoïque. Le fragment majoritaire a une masse de 73 m/z comme l’indique

le spectre de masse de son dérivé silylé (figure 130). Ce fragment est issu du départ du

groupement triméthylsilyle et le fragment de masse 135 m/z se forme également ainsi que du

CO2. Le fragment de masse 267 m/z est formé en par la rupture de la liaison entre le carbone

lié au cycle aromatique et le carbone lié au carbone du groupement carbonyle (schéma 34). Ce

composé est de la famille des composés phénoliques.






Le pic n°15 (temps de rétention 8,433 minutes) est l’acide hex-2-énoïque. Son spectre

de masse nous montre que le fragment majoritaire a une masse de 156 m/z (figure 131). Il

résulte du départ d’un groupement éthyle issu de la rupture de la chaine principale. Les

fragments de masse 113 m/z et de masse 73 m/z résultent de la scission de la liaison entre

l’oxygène et le silicium (schéma 35). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.






Le pic n°16 (temps de rétention 9,043 minutes) est l’acide 4-hydroxybenzoïque. Le

fragment le plus abondant, d’après le spectre de masse de son dérivé silylé, a une masse de 267

m/z (figure 132). Il résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 222 m/z

résulte du départ de quatre (4) groupements méthyles. Les fragments de masse 136 m/z et 73

m/z proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium (schéma 36). Ce composé est de la

famille des composés phénoliques.






Le pic n°17 (Temps de rétention 9,133 minutes) est l’acide benzène-1,2-dicarboxylique.

Le fragment de masse 73 m/z est le plus abondant selon le spectre de masse du dérivé silylé

(figure 133). Le départ du groupement triméthylsilyle en serait la cause. Le fragment de masse




221 m/z résulte de la rupture d’une liaison entre l’oxygène lié au silicium et un carbone du

groupement carbonyle. Le fragment de masse 250 m/z est le résultat du départ de quatre (4)

groupements méthyles (schéma 37). Ce composé est de la famille des composés phénoliques.



Le pic n°18 (temps de rétention 9,477 minutes) est le décane-1,10-diol. Le fragment

majoritaire a pour masse 73 m/z et serait dû au départ du groupement triméthylsilyle (figures

134). Les fragments de masse 145 m/z et 173 m/z résultent de la rupture de la liaison carbone-




carbone au sein de la chaine aliphatique. Le fragment de masse 303 m/z résulte du départ d’un

groupement méthyle (schéma 38). Ce composé fait partie des terpènes et stérols.






Le pic n°19 (temps de rétention 9,750 minutes) est l’acide 3-hydroxy-4-

methoxybenzoïque. Son spectre de masse nous montre que le fragment le plus abondant a une

masse de 297 m/z (figure 135) ; il résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de

masse 267 m/z résulte du départ de trois (3) groupements méthyles. Les fragments de masse

166 m/z et 73 m/z proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium (schéma 39). Ce







Le pic n°20 (temps de rétention 9,907 minutes) est l’acide nonanedioïque. Le spectre de

masse de son dérivé silylé révèle que le fragment majoritaire a une masse de 73 m/z (figure

136). Il dérive du départ du groupement triméthylsilyle. Le fragment de masse 317 m/z résulte

du départ d’un groupement méthyle. Les fragments de masse 201 m/z et 131 m/z proviennent

de la scission de la liaison entre le carbone lié au carbone du groupement carbonyle et son

carbone adjacent (schéma 40). Ce composé est de la famille des terpènes et stérols.






Le pic n°21 (temps de rétention 10,010 minutes) est l’acide dihydroxybenzoïque. Le

fragment ayant pour masse 193 m/z est le plus abondant, étant donné le spectre de masse de

son dérivé silylé (figure 137). Ce fragment provient du départ de deux (2) groupements

méthyles et deux (2) groupements triméthylsilyles. Les fragments de masse 151 m/z et 73 m/z

proviennent de la rupture des liaisons oxygène-silicium. Le fragment de masse 355 m/z résulte

du départ d’un groupement méthyle (schéma 41). Ce composé est de la famille des composés

phénoliques.






Le pic n°22 (temps de rétention 10,390 minutes) est l’acide 4-hydroxy- 3,5-

dimethoxybenzoïque. Le spectre de masse du dérivé silylé indique que le fragment majoritaire

a une masse de 73 m/z (figure 138) ce qui correspond au départ du groupement triméthylsilyle.

Le fragment de masse 327 m/z résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de




masse 209 m/z résulte de la rupture d’une liaison entre un oxygène lié au silicium et un carbone

et au départ de trois (3) groupements méthyles (schéma 42). Ce composé est de la famille des

composés phénoliques.






Le pic n°23 (temps de rétention 10,620 minutes) est l’acide 3-(4-hydroxyphenyl)prop-

2-énoïque. Le spectre de masse ce son dérivé silylé montre que le fragment majoritaire a une

masse de 73 m/z ce qui correspond au groupement triméthylsilyle (figures 139). Le fragment

293 m/z résulte du départ d’un groupement méthyle. Le fragment de masse 219 m/z provient

de la rupture d’une liaison entre un oxygène lié au silicium et un carbone (schéma 43). Ce







Le pic n°24 (temps de rétention 11,293 minutes) est l’acide 3-(4-hydroxy-3-

methoxyphényl)prop-2-énoïque. Le spectre de masse du dérivé silylé nous montre que le




fragment le plus abondant a une masse 338 m/z (figure 218). Cela doit être dû au départ d’un

électron du dérivé silylé (figure 140). Les fragments de masse 308 m/z, 293 m/z et 249 m/z

résultent respectivement du départ de deux (2), trois (3) et six (6) groupements méthyles. Les

fragments de masse 192 m/z et 73 m/z se forment par la rupture des liaisons oxygène-silicium







Le pic n°25 (temps de rétention 13,337 minutes) est l’inositol. Le fragment 73 m/z est

le plus abondant comme l’indique le spectre de masse du dérivé silylé (figure 141). Il

correspond au départ du groupement silylé. Le fragment 317 m/z est issue du départ de quinze

(15) groupements méthyles (schéma 45). Ce composé fait partie des composés phénoliques.






Les composés identifiés sont connus mais la littérature ne mentionne pas la présence de

beaucoup d’entre eux dans les extraits des fleurs de Tridax procumbens. En effet, cet organe de

la plante n’a pratiquement pas fait l’objet d’étude chimique.

VI.3. Discussion sur les composés identifiés

Les composés identifiés au niveau de Tridax procumbens sont pour la plupart des

composés phénoliques. Ces composés sont connues pour leur activités antioxydantes

(Djeridane et al., 2006; Rice-Evans et al., 1997). Ces résultats attestent des propriétés

médicinales conférées à cette plante. Ce sont des molécules qui ont déjà été isolées dans d’autres




plantes mais pas encore dans les fleurs de Tridax procumbens car elle n’a pas encore été l’objet

d’étude phytochimique approfondie.


Les différentes méthodes chromatographiques et spectroscopiques ont permis

d’identifier la composition en familles de métabolites secondaires des plantes étudiées. La

comparaison entre ces méthodes a montré que la chromatographie sur couche mince à haute

performance est la plus efficace alors que la chromatographie Liquide à haute performance

couplée à la spectroscopie Ultra-Violette a été la moins efficace. Les structures de quelques

métabolites secondaires de Tridax procumbens ont été élucidées par la chromatographie en

phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.




CONCLUSION ET PERSPECTIVES

L’objectif de notre travail était l’identification des familles de métabolites secondaires

de trois plantes médicinales ivoiriennes par l’application de techniques chromatographiques et

spectrométriques. Pour atteindre les objectifs, une bibliographie sur le thème ainsi qu’une

méthodologie de travail ont été réalisées et ont permis d’avoir des résultats intéressants.

La bibliométrie des trois plantes a été réalisée pour évaluer l’engouement scientifique

que suscite leurs études. Ainsi, ces plantes sont largement étudiées avec des moyennes de

publications sur les cinq dernières années de 43 publications pour Phyllanthus amarus, de 7

pour Alchornea cordifolia et de 41 publications pour Tridax procumbens.

L’optimisation du rendement d’extraction des métabolites secondaires a débuté par la

détermination des paramètres influençant cette extraction, puis le rendement a été modélisé par

un plan de Plackett et Burmann. Le modèle a ensuite été optimisé par la méthode des simplex

pour trouver les conditions optimales d’extraction des métabolites secondaires des plantes.

Ainsi, la modélisation et l’optimisation sur Alchornea cordifolia et Tridax procumbens ont

montré que le rendement d’extraction est très sensible à la nature de la plante et que les

paramètres les plus significatifs sont le ratio volume du solvant sur masse du broyat et la

proportion en éthanol du solvant hydro-alcoolique. Il serait intéressant d’approfondir ce travail

en agrandissant le domaine de valeurs choisi et aussi en variant les plantes utilisées.

Les extraits hydro-alcooliques des métabolites secondaires ont été fractionnés par des

solvants de polarité croissante à savoir l’hexane, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle, le

butanol et l’eau. Chaque fraction obtenue a été analysée en Chromatographie sur couche mince

à haute performance (HPTLC), en Chromatographie liquide à haute performance couplée à la

spectroscopie Ultra-Violette (HPLC-UV) et en spectroscopie Infrarouge (IR). De toutes ces

méthodes, la HPTLC a été la plus efficace dans l’identification des familles de métabolites

secondaires des plantes de l’étude. Une Chromatographie en phase gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse (GC-MS) a permis de déterminer la structure de quelques molécules de

Tridax procumbens.

Les perspectives de ce travail sont nombreuses. Ainsi, les résultats de l’optimisation

devront être approfondies en validant le modèle avec une plus grande base de données et un

domaine de confiance plus large. Il serait intéressant de voir l’influence des paramètres




d’extraction sur la sélectivité des familles de métabolites secondaires. L’optimisation des

conditions d’extraction pourrait aussi contribuer à améliorer les conditions d’élaboration des

médicaments traditionnels améliorés et pourrait être entreprise en vue d’améliorer le rendement

en familles de métabolites biologiquement actifs.

L’utilisation des méthodes chromatographiques et spectroscopiques dans

l’identification des familles de métabolites secondaires dans des extraits de plantes devra être

poursuivie afin de normaliser ces méthodes qui pourraient constituer une alternative

intéressante à la méthode de criblage phytochimique très utilisée actuellement.

I



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KONE KOUWELTON PATRICK XVII



XVIII



ANNEXES

Annexe 01 : Chromatogrammes HPTLC de Alchornea cordifolia

Annexe a: Fraction à l'hexane

Annexe b: Fraction au dichlorométhane

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

250 280 310 340 370 400

RA

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ON

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LONGUEUR D'ONDE (NM)

250 280 310 370 400 340

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60,0%

80,0%

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RA

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OR

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ON

TAL

(%)


250

280

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340

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KONE KOUWELTON PATRICK XIX



Annexe c: Fraction à l'acétate d'éthyle

Annexe d: Fraction au butanol

Annexe e: Fraction résiduelle aqueuse

0,0%

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20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

250 280 310 340 370 400

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OR

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ON

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(%)


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280

310

340

370

400

0

0,1

0,2

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0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

250 280 310 340 370 400

RA

PP

OR

T FR

ON

TAL


250 nm

280 nm

310 nm

340 nm

370 nm

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1

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RA

PP

OR

T FR

ON

TAL


250 nm

280 nm

310 nm

340 nm

370 nm

400 nm

KONE KOUWELTON PATRICK XX



Annexe 02 : Chromatogramme HPTLC de Phyllanthus amarus

Annexe f: Fraction à l'hexane

Annexe g: Fraction au dichlorométhane

0

0,1

0,2

0,3

0,4

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0,9

1

250 280 310 340 370 400

RA

PP

OR

T FR

ON

TAL


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280 nm

310 nm

340 nm

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RA

PP

OR

T FR

ON

TAL

(%)


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Annexe h: Fraction à l'acétate d'éthyle

Annexe i: Fraction au butanol

Annexe j: Fraction résiduelle aqueuse

0

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0,5

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RA

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OR

T FR

ON

TAL


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370 nm

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1

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RA

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OR

T FR

ON

TAL


250 nm

280 nm

310 nm

340 nm

370 nm

400 nm

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

250 280 310 340 370 400

RA

PP

OR

T FR

ON

TAL


250 nm

280 nm

310 nm

340 nm

370 nm

400 nm

XXII



Annexe 03 : Chromatogramme HPLC de Alchornea cordifolia

KONE KOUWELTON PATRICK XXIII



Annexe 04 : Chromatogramme HPLC de Phyllanthus amarus

KONE KOUWELTON PATRICK XXIV



KONE KOUWELTON PATRICK XXV



Annexe 05 : Tableau de comparaison des méthodes de criblage

Plantes médicinales Fractions Méthode de screening Métabolites secondaires

Alcaloïdes Flavonoïdes Terpènes et stérols


Fraction à l'hexane

Screening chimique 1 1 0

HPTLC 1 1 1

IR 1 0 1

HPLC UV 1 1 1

Fraction au dichlorométhane


HPTLC 1 1 0

IR 1 1 1

Fraction à l'acétate d'éthyle


HPTLC 1 1 1

IR 0 1 1

HPLC UV 1 0 1

Fraction au butanol


HPTLC 0 1 1

IR 0 1 1

HPLC UV 0 1 1

Fraction résiduelle


HPTLC 0 1 1

IR 0 1 1

KONE KOUWELTON PATRICK XXVI



Plantes médicinales Fractions Méthode de screening Métabolites secondaires

Alcaloïdes Flavonoïdes Tepènes et stérols

Phyllanthus amarus

Fraction à l'hexane


HPTLC 1 1 1

IR 0 1 1

HPLC UV 1 0 1

Fraction au dichlorométhane


HPTLC 1 1 1

IR 1 1 1

Fraction à l'acétate d'éthyle


HPTLC 1 1 1

IR 0 1 1

HPLC UV 1 1 1

Fraction au butanol


HPTLC 0 1 1

IR 0 1 1

Fraction résiduelle


HPTLC 1 1 1

IR 0 1 1

HPLC UV 1 1 1

Détermination des paramètres influençant le rendement

d’extraction hydro-alcoolique des métabolites

secondaires de Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) et

Tridax procumbens linn (Asteraceae)

Kouwelton Patrick Franck Olivier Koné, Yaya Soro et Sorho Siaka

Journal de la Société Ouest-Africaine de Chimie J. Soc. Ouest-Afr. Chim.(2017), 044 : 15 - 22

22èmeAnnée, Décembre 2017

ISSN 0796-6687 Code Chemical Abstracts : JSOCF2

Cote INIST (CNRS France) : <27680> Site Web: http://www.soachim.org

J. Soc. Ouest-Afr. Chim. (2017) 044; 15- 22

K.P.F.O. Koné et al 15

Détermination des paramètres influençant le rendement d’extraction hydro-alcoolique des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) et Tridax

procumbens linn (Asteraceae)

Kouwelton Patrick Franck Olivier Koné, Yaya Soro* et Sorho Siaka

Laboratoire des Procédés Industriels de Synthèse, de l’Environnement et des Energies Nouvelles (LAPISEN), Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT-BOIGNY, BP 1093 Yamoussoukro, Côte d’Ivoire

(Reçu le 21/11/2017 – Accepté après corrections le 22/12/ 2017)

Résumé : Une étude des facteurs influençant le rendement d’extraction a été menée sur les feuilles de Alchornea cordifolia et sur la plante entière de Tridax procumbens. Le plan de criblage a été réalisé suivant la méthode de Plackett et Burmann pour analyser six facteurs qui sont : la durée de séchage, la granulométrie du broyat, le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique, le ratio volume de solvant par masse de broyat, le temps de macération et la vitesse d’agitation. La méthodologie utilisée a consisté en une série d’extraction des métabolites secondaires en variant simultanément les facteurs retenus et en réalisant une analyse statistique des rendements obtenus. Une optimisation a été faite en utilisant la méthode des simplex. Les résultats ont montré que le ratio volume de solvant par masse de broyat et le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique sont les deux facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia alors que le ratio volume de solvant par masse de broyat, le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération sont les quatre facteurs significatifs pour Tridax procumbens.

Mots clés : Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, plan de criblage, métabolites secondaires, rendement, optimisation.

Determination of the parameters influencing the hydroalcoholic extraction yield of the secondary metabolites of Alchornea cordifolia (Euphorbiaceae) and Tridax

procumbens linn (Asteraceae)

Abstract: A study of the extraction yield influencing factors was conducted on the leaves of Alchornea cordifolia and on the whole plant of Tridax procumbens. The screening plan carried out according to the Plackett and Burmann method aimed at analyzing the six following factors: the drying time, grinded matter particle size, ethanol percentage in hydroethanolic solvent, solvent volume per grinded matter mass ratio, maceration time and stirring speed. The methodology used consisted of a series of secondary metabolites extraction by varying the selected factors and simultaneously performing a statistical yields analysis. An optimization was done using the simplex method. The results showed that the solvent volume per grinded matter mass ratio and the ethanol percentage in the hydroethanolic solvent are the two significant factors for Alchornea cordifolia extraction yield, whereas the solvent volume per grinded matter mass ratio, the percentage of ethanol in the hydro-ethanolic solvent, the grain size of the crushed stone and the maceration time are the four significant factors for Tridax procumbens extraction yield. Key words: Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, screening plan, secondary metabolites, yield, optimization.

* Auteur correspondant : Soro Yaya ; [email protected]



1. Introduction

Alchornea cordifolia et Tridax procumbens sont deux plantes médicinales largement utilisées dans la pharmacopée ivoirienne pour la prise en charge du diabète et de l’hypertension artérielle [1]. Tridax procumbens est connue pour ses activités antivirales, antibiotiques, cicatrisantes, insecticides, antioxydantes, anti-inflammatoires et anticancéreuses [2,3]. Le screening phytochimique de Tridax procumbens linn a indiqué la présence d’alcaloïdes, de caroténoïdes, de flavonoïdes (catéchine et flavones), de tannins, de l'acide fumarique, du sitostérol fluoré, de saponines et de glycosides [4,5]. Ses feuilles contiennent 26% de protéines, 17% de fibres, 39% de carbohydrates solubles et 5% d’oxyde de calcium [6] et la plante entière est riche en ions comme le sodium, le potassium et le calcium [7]. Alchornea cordifolia est largement utilisée comme antidysentérique, anti-inflammatoire, antalgique, antimicrobien, antiparasitaire, veinotonique, antioxydant et astringent [8], dans le traitement du paludisme [9] ou encore dans la phytothérapie de la maladie hémorroïdaire [10-13]. Le screening phytochimique de Alchornea cordifolia révèle la présence de la quercétine et du gallate d’éthyle dans les feuilles [14], du l’indole, de stérols et des glycosides terpéniques dans les racines, des acides alchornoïques, l’alchorneïne et l’alchonidine dans les graines [15]. Les deux plantes renferment de nombreux métabolites secondaires responsables de leurs propriétés médicinales [16,17]. Il est donc important de maximiser l’extraction de ceux-ci en vue d’une meilleure exploitation de ces ressources comme des sources potentielles de nouveaux médicaments naturels, d’antibiotiques, d’insecticides et d’herbicides. La présente étude vise à déterminer les facteurs qui influencent les rendements et les conditions optimales de l’extraction des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia et Tridax procumbens.

2. Matériel et méthodes

2.1. Matériel végétal

Les feuilles de Alchornea cordifolia et la plante entière de Tridax procumbens ont été récoltées tôt le matin avant le lever du soleil en juin 2016 à Yamoussoukro (6°53’04.7’’ Nord et 5°13’54.9’’Ouest) au centre de la Côte d’Ivoire, en saison pluvieuse. Les plantes ont été identifiées par M. Amani N’Guessan, botaniste à l’Institut National Polytechnique Félix HOUPHOUËT-BOIGNY de Yamoussoukro.

2.2. Choix des facteurs influençant le rendement d’extraction Nous avons choisi six facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites secondaires qui sont la durée de séchage du matériel végétal, la granulométrie du broyat, le pourcentage d’alcool dans le solvant, le ratio volume de solvant sur masse de broyat, la durée de macération et la vitesse d’agitation [18-20]. Notons que le solvant hydro-éthanolique est largement utilisé pour l’extraction des métabolites secondaires des plantes [18-20] et il est proche de l’eau généralement utilisée en médecine traditionnelle.

2.3. Domaines de valeurs

Les domaines de valeurs des facteurs ont été fixés en fonction du matériel disponible au laboratoire. Au niveau de la granulométrie et de la vitesse d’agitation, le choix a été fait par rapport aux tamis et aux agitateurs magnétiques disponibles dans notre laboratoire. Quant aux autres facteurs, le choix a été fait en tenant compte des conditions de macération trouvées dans la littérature [21,22]. Le tableau I résume le choix des valeurs des facteurs énumérés.

Tableau I: Valeurs des facteurs recensés

2.4. Matrice de Plackett-Burman

Pour l’établissement de la matrice de Plackett-Burman [23,24]

, un facteur fictif (x7) a été ajouté pour que le nombre de facteurs k (fictifs et réels) soit du type (k + 1), multiple de 4 et corresponde au nombre d’expériences. Le tableau II présente la matrice des expériences.

Tableau II: Matrice des expériences

Tests x1 (semaines)

x2 (mm)

x3 (%)

x4 (g/mL)

x5 (h)

x6 (rpm)

1 4 0,4 50 10 12 1600 2 4 2 50 5 24 500 3 4 2 90 5 12 1600 4 2 2 90 10 12 500 5 4 0,4 90 10 24 500 6 2 2 50 10 24 1600 7 2 0,4 90 5 24 1600 8 2 0,4 50 5 12 500

Codage Facteurs Valeur (-1) Valeur (+1) X1 Durée de séchage 2 semaines 4 semaines X2 Granulométrie ≤ 0,4 mm ≤ 2 mm X3 Pourcentage d’alcool 50% 90%

X4 Ratio volume sur masse de broyat

5 mL/g 10 mL/g

X5 Durée de macération 12h 24h

X6 Vitesse d'agitation 500 rpm 1600 rpm



2.5. Procédure générale de réalisation des tests

Les feuilles de Alchornea cordifolia et la plante entière de Tridax procumbens ont été séchées pendant une durée x1 au laboratoire à l’abri de la lumière à une température de 28±2 °C. Elles ont ensuite été broyées à l’aide d’un broyeur électrique de marque IKA M20 (France) et tamisés pour donner une poudre de granulométrie x2. Les poudres obtenues ont été conservées au réfrigérateur dans des bocaux colorés à 4 °C pour les futurs tests. Une masse de 10 g du broyat a été introduite dans un volume x3 d’un solvant hydro-éthanolique de composition x4 et macérée pendant une durée x5 avec une vitesse de rotation x6. Après filtration sur du coton puis sur du papier wattman, l’extrait obtenu est concentré à l’évaporateur rotatif à 40 °C. Le résidu obtenu est pesé afin de calculer le

rendement d’extraction. Les tests 1 à 8 ont été réalisés trois fois dans les conditions du tableau 2.

2.6. Optimisation du modèle

L’optimisation du modèle obtenu après le traitement des résultats est réalisée par la suite Excel du logiciel Microsoft Office avec le complément solveur qui permet de faire une optimisation par la méthode des Simplex [25,26]. Cette méthode est utilisée pour les modèles linéaires et permet de trouver une solution optimum.

3. Résultats et discussion

3.1. Rendements des extractions

Les rendements obtenus, après la réalisation des expériences pour les deux plantes, sont donnés dans les figures 1 et 2.

Figure 1:Rendements des extractions des métabolites secondaires de Alchornea cordifolia

Figure 2: Rendements des extractions des métabolites secondaires de Tridax procumbens



Les rendements sont compris entre 0,004 et 0,24 %, les plus élevés (compris entre 0,02 et 0,24) ayant été obtenus avec les feuilles de Alchornea cordifolia. Quant à la plante entière de Tridax procumbens, les rendements sont compris entre 0,004 et 0,11. Les rendements sont plus élevés lorsque le ratio volume/masse du broyat est à sa borne (+1) quel que soit la plante. Les résultats obtenus confirment que les rendements d’extraction dépendent de plusieurs facteurs. Les résultats obtenus ont été traité en régression linéaire multiple à l’aide de la suite Excel de Microsoft Office avec le niveau de confiance fixé à 90%, α = 0,1. Ainsi, le calcul de l’erreur expérimentale avec les valeurs non assignées et la détermination des facteurs significatifs sont consignés respectivement dans les tableaux III et IV . Il ressort des résultats du tableau IV qu’il y a deux (2) facteurs significatifs pour Alchornea cordifolia, à savoir le pourcentage d’éthanol dans le solvant (x3) et le ratio volume sur la masse de broyat (x4). Le modèle obtenu est donc de la forme : �� 0,036125 � � 0,059375 � � � 0,119625 (1) avec Rdt le rendement en métabolites secondaires, P le pourcentage en éthanol dans le solvant eau-éthanol (entre 50 et 90%) et R le ratio volume de solvant sur la masse de broyat (entre 5 et 10 mL/g).

La figure 3 illustre la dépendance du rendement à ces deux facteurs. En effet, le rendement est maximum pour un ratio de 10 mL/g et un pourcentage de 90%

en éthanol dans le solvant.


Les résultats du tableau IV montrent également qu’il y a quatre (4) facteurs significatifs pour Tridax procumbens à savoir la granulométrie du broyat (x2), le ratio volume sur la masse de broyat (x3), le pourcentage en éthanol dans le solvant (x4) et la durée de macération (x5). Le modèle obtenu est donc de la forme :

�� 0,00475 � � � 0,00775 � � 0,03775 � � � 0,00475 �

�� 0,05925 (2) avec Rdt le rendement en métabolites secondaires, G la granulométrie du broyat (entre 0 et 4 mm), P le pourcentage en éthanol dans le solvant eau-éthanol (entre 50 et 90%), R le ratio volume de solvant sur la masse de broyat (entre 5 et 10 mL/g) et Dm la durée de macération (entre 12 et 24h).

Tableau III : Calcul des erreurs expérimentales

Plantes Variables Coefficients Coeff*2

Facteur de Student

Erreur expérimentale

Alchornea cordifolia Constante 0,119625 0,23925 3,07768 0,06078 x7 0,009875 0,01975

Tridax procumbens Constante 0,05925 0,1185 3,07768 0,00462 x7 0,00075 0,0015

Tableau IV: Détermination des facteurs significatifs Plantes Variable Coefficients Effets Effet*2 Pertinence


Constante 0,119625 0,119625 0,23925 OUI x1 0,008125 0,008125 0,01625 NON x2 -0,026375 0,026375 0,05275 NON x3 0,036125 0,036125 0,07225 OUI x4 0,059375 0,059375 0,11875 OUI x5 0,005375 0,005375 0,01075 NON

x6 0,006125 0,006125 0,01225 NON

Tridax procumbens

Constante 0,05925 0,05925 0,1185 OUI x1 -0,00125 0,00125 0,0025 NON x2 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI x3 0,03775 0,03775 0,0755 OUI x4 -0,00775 0,00775 0,0155 OUI x5 -0,00475 0,00475 0,0095 OUI x6 -0,00075 0,00075 0,0015 NON



La figure 4 montre que le ratio est plus influant que les autres facteurs significatifs car tous les rendements les plus élevés sont obtenus lorsqu’il est à son niveau (+1). Il y a une séparation visible en deux groupes du fait des deux bornes de ce facteur.


3.2. Optimisation des modèles

Les conditions optimales pour le modèle réalisé avec Alchornea cordifolia sont les suivantes : une durée de séchage de 28 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm, un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 90%, un ratio volume sur masse de 10 mL/g, une durée de macération de 24 heures et une vitesse d’agitation de 1600 rpm. Pour le modèle réalisé avec Tridax procumbens, les conditions optimales sont les suivantes : une durée de séchage de 14 jours, une granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm, un pourcentage d’éthanol dans le solvant de 50%, un ratio volume sur masse de 10

mL/g, une durée de macération de 12 heures et une vitesse d’agitation de 500 rpm. La granulométrie du broyat inférieure à 0,4 mm et le ratio volume sur masse de 10 mL/g sont les deux conditions identiques pour les modèles et pourraient être maintenues pour l’extraction des métabolites secondaires des plantes.

3.3. Vérification et comparaison

Des comparaisons entre les données obtenues avec les modèles et les données expérimentales ont été effectuées en calculant les coefficients de détermination linéaire [27,28,29]. Les différents résultats obtenus sont présentés dans les figures 5 et 6 pour Alchornea cordifolia avec un coefficient de corrélation de 0,9915 entre les données expérimentales et calculées et dans les figures 7 et 8 pour Tridax procumbens avec un coefficient de corrélation de 0,9933.

Figure 5: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Alchornea cordifolia

Figure 6: corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Alchornea cordifolia

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

1 2 3 4 5 6 7 8

Ren

dem

ent

TestY exp

Y calc

y = 0.9831x + 0.002

R² = 0.9831

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00% 30.00%

Do

nn

ée

s e

xp

éri

me

nta

les


Y Mac

Linéaire (Y Mac)



Les figures 6 et 8 montrent une bonne corrélation entre les modèles obtenus et les données expérimentales, ce qui permet de valider nos modèles. 3.4. Modélisation des données d’une plante avec le modèle de l’autre

La comparaison entre les modèles développés sur Alchornea cordifolia et sur Tridax procumbens a été menée en testant le modèle d’une plante sur les données de l’autre. Les résultats obtenus sont présentés dans les figures 9 et 10.

Figure 6: Résultats de l'approximation des rendements expérimentaux par le modèle de Tridax procumbens

Figure 8: Corrélation entre le modèle et l'expérimentation sur Tridax procumbens

.

Figure 9: Modélisation des données de Tridax procumbens avec le modèle de A. cordifolia

0.00%

2.00%

4.00%

6.00%

8.00%

10.00%

12.00%

1 2 3 4 5 6 7 8

Re

nd

em

en

t

Test

Y exp Y calc

y = 0.9863x + 0.0008

R² = 0.9866

0.00%

2.00%

4.00%

6.00%

8.00%

10.00%

12.00%

0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00%

Do

nn

ée

s e

xpé

rim

en

tale

s


Y Mtp

Linéaire (Y Mtp)

y = 0.3602x + 0.0162

R² = 0.4789

0.00%

2.00%

4.00%

6.00%

8.00%

10.00%

12.00%

0.00% 10.00% 20.00% 30.00%

Do

nn

ée

s

exp

éri

me

nta

les

de

T.

pro

cum

be

ns

Données modélisées avec A. cordifolia

modèle de T.

procumbens par A.

cordifolia

Linéaire (modèle de

T. procumbens par A.

cordifolia)



Figure 10: Modélisation des données de Alchornea cordifolia avec le modèle de Tridax procumbens

Il ressort de cette étude que le modèle de Alchornea cordifolia modélise mieux les données de Tridax procumbens que celle de cette dernière pour la première. En effet, comme le montre les figures 9 et 10, le coefficient de corrélation de Alchornea cordifolia (0,6920) est plus grand que celui de Tridax procumbens (0,3329). Cela montre que le type de plante influe sur le rendement d’extraction. Cependant, le coefficient du modèle de Alchornea cordifolia pourrait rassurer sur une potentielle relation permettant de faire passer le modèle d’une plante à une autre. 4. Conclusion

Un plan de criblage suivant la méthode de Plackett et Burmann a été réalisé pour déterminer les facteurs influençant le rendement d’extraction des métabolites secondaires dans les feuilles de Alchornea cordifolia et sur la plante entière de Tridax procumbens. Des six (6) facteurs sélectionnés, deux (2) se sont avérés significatifs pour Alchornea cordifolia et quatre (4) pour Tridax procumbens. Les modèles obtenus ont été optimisés et des conditions expérimentales optimales ont été établies. Chaque modèle est proche de l’expérimentation avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. Il serait intéressant de confirmer leur précision avec des données expérimentales autres que celles de nos expériences. La présente étude pourrait être une contribution intéressante dans l’amélioration des rendements d’extraction des métabolites secondaires en médecine traditionnelle.

5. Remerciements Les auteurs remercient Dr Akmel Djédjro clément et Dr Nogbou Arsène tous les deux membres du LAPISEN pour avoir apporté des corrections au texte initial.

6. Bibliographie [1] Tra Bi F., Irié G., N’Gaman K., Mohou C. Études de quelques plantes thérapeutiques utilisées dans le traitement de l’hypertension artérielle et du diabète : deux maladies émergentes en Côte d’Ivoire. Sci. Nat. (2008) 5, 39–48. [2] Suseela L., Sarsvathy A., Brindha P. Pharmacognostic studies on Tridax procumbens L. (Asteraceae). Journal of Phytological Research (2002) 15 (2), 141-147. [3] Manjamalai A., Kumar M.J., Grace V.M. Essential Oil of Tridax procumbens L. Induces Apoptosis and Suppresses Angiogenesis and Lung Metastasis of the B16F-10 Cell. Line in C57BL/6 Mice. Asian Pac. J. Cancer Prev. (2012) 13(11), 5887-5895. [4] Ali M., Rawinder E., Ramachamdram R. A new flavonoid from the aerial parts of Tridax procumbens L. Fitoterapia (2001) 72(3), 313-315. [5] Yadawa R.N., Saurabh K. A new flavone glycoside: 5,7,4-Trihydraxy- 6,3-dimethasey Falavone 5-0 alpha-L-rhamnopyramoside from the leaves of Tridax procumbens Linn. J. Asian Nat. Prod. Res. (1998) 1(2), 147-152. [6] Verma R.K., Gupta M.M. Lipid constituents of Tridax procumbens. Phytochemistry (1988) 27(2), 459-463. [7] Mohammed A., Earla R., Ramidi R. A new flavonoids from the aerial parts of Tridax procumbens Linn. Fitoterapia (2001) 72, 313-315. [8] Dibong S.D., Mpondo Mpondo E., Ngoye A., Kwin N.F. Plantes médicinales utilisées par les populations bassa de la région de Douala au Cameroun. Int. J. Biol. Chem. Sci. (2011) 5 (3), 1105-1117. [9] Mustofa A.V., Francoise B., Yves P., Koné-Bamba D., Mallié M. Antiplasmodial activity of plant extract used in west african traditional medicine. J. of Etno. Pharm. (2000) 73, 145-151. [10] Ilumbe B.G., Van Damme P., Lukoki L.F., Joiris V., Visser M., Lejoly J. Contribution à l'étude des plantes médicinales dans le traitement des hémorroïdes par les pygmées Twa et leur voisin Oto de Bikoro, en RDC. Congo Sci. (2014) 2 (1), 46-54. [11] Dibong S.D., Ottou P.B.M., Vandi D., Ndjib R.C., Mpondo Mpondo E. Ethnobotanique des plantes médicinales anti hémorroïdaires des marchés et villages du Centre et du Littoral Cameroun. J. Appl. Biosci. (2015) 96, 9072-9093. [12] Ngene J.P., Ngoule C.C., Kidik P.C., Ottou P.M., Dibong S.D., Mpondo Mpondo E. Importance dans la pharmacopée traditionnelle des plantes à flavonoïdes vendues dans les marchés de Douala est (Cameroun). J. Appl. Biosci. (2015) 88 (1), 8194-8210. [13] Nga E. N., Yinyang J., Baran à Bidias E., Etame-Loe G., Dibong S.D. Étude phytochimique et pharmacologique d’Alchornea cordifolia (Schum. & Thonn.) Mull. Arg. et de Mangifera indica dans le traitement traditionnel de la maladie hémorroïdaire. J. Appl. Biosci. (2017) 109, 10649-10661. [14] Pruja S. Contribution à l´étude phytochimique de Alchornea cordifolia. 1987, INP de Toulouse. [15] Ajali U. Anibacterial activity of Alchornea cordifolia stem bark. Fitoterapia (2000), 436-438. [16] Adeshina G.O., Onaolapo J.A., Ehinmidu J.O., Odama L.E., Kunle O.F., Phytochemical and Antibacterial Studies of the Hexane Extract of Alchornea cordifolia Leaf, Phytochemicals as Nutraceuticals - Global

y = 0.6451x + 0.0814

R² = 0.1108

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00%

Do

nn

ée

s e

xp

éri

me

nta

les

A.

cord

ifo

lia

Données modélisées par T. procumbens

modèle de A. cordifolia avec

Tridax

Linéaire (modèle de A.

cordifolia avec Tridax)



Approaches to Their Role in Nutrition and Health, Dr Venketeshwer Rao (Ed.), InTech Open Access Publisher 2012. [17] Bhagwat D., Killedar S., Adnaik R. Anti-diabetic activity of leaf extract of Tridax procumbens. Int. J. Green Pharm. (2008) 2, 126-128. [18] Chemat F., Strube J., Green Extraction of Natural Products: Theory and Practice. John Wiley & Sons 2015. [19] Raaman, N., Phytochemical Techniques. New India Publishing 2006. [20] Walton N.J., Brown D.E., Chemicals from Plants: Perspectives on Plant Secondary Products. World Scientific1999. [21] Ćujić N., Šavikin K., Janković T., Pljevljakušić D., Zdunić G., Ibrić S. Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using maceration as traditional technique. Food Chem. (2016) 194, 135–142. [22] Huie C.W. A review of modern sample-preparation techniques for the extraction and analysis of medicinal plants. Anal. Bioanal. Anal. Bioanal. Chem. (2002) 373, 23–30. [23] Plackett R.L., Burman J.P. The Design of Optimum Multifactorial Experiments. Biometrika (1946) 33, 305–325. [24] Wallis J.S., Hadamard Matrices, in: Combinatorics: Room Squares, Sum-Free Sets, Hadamard Matrices, Lecture Notes in Mathematics. Springer Berlin Heidelberg 1972, pp 274–489.

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RESUME

L’étude de Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus et Tridax procumbens a été menée afin d’identifier

les grandes familles de métabolites secondaires en appliquant des techniques chromatographiques et

spectroscopiques. La bibliographique sur le thème et la méthodologie de travail adoptée ont permis

d’aboutir à plusieurs résultats. Une première étude des facteurs influençant le rendement d’extraction a

été menée sur les feuilles de A. cordifolia et sur la plante entière de T. procumbens. Le plan de criblage

a été réalisé suivant la méthode de Plackett et Burmann pour analyser six facteurs et une optimisation a

été faite en utilisant la méthode des simplex. Les résultats ont montré que le ratio volume de solvant par

masse de broyat et le pourcentage en éthanol du solvant hydro-éthanolique sont les deux facteurs

significatifs pour A. cordifolia alors que le ratio volume de solvant par masse de broyat, le pourcentage

en éthanol du solvant hydro-éthanolique, la granulométrie du broyat et la durée de macération sont les

quatre facteurs significatifs pour T. procumbens. Une deuxième étude sur l’identification des

métabolites secondaires des trois plantes par des méthodes de criblage phytochimique (CP), de

Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC), de Chromatographie liquide à haute

performance couplée à la spectroscopie Ultra-Violette (HPLC-UV) et de spectroscopie Infra rouge (IR)

a été effectuée. Ces méthodes ont montré quelques différences dans la détection des familles de

métabolites secondaires. Une comparaison de ces méthodes à l’aide de l’analyse de données par des

tableaux croisés dynamiques a montré que la méthode de criblage par HPTLC est la plus satisfaisante

avec des détections de 30,00-31,82 % suivie du CP (16,67-31,82 %), de l’IR (13,64-33,33 %) et de la

HPLC-UV (12,12-22,73 %). La détermination structurale de quarante et un (41) métabolites secondaires

de T. procumbens a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectroscopie de

masse.

Mots clés : Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, Phyllanthus amarus plan de criblage, métabolites

secondaires, rendement, optimisation, criblage phytochimique, méthodes chromatographiques,

méthodes spectroscopiques.

ABSTRACT

The study of Alchornea cordifolia, Phyllanthus amarus and Tridax procumbens was conducted to

identify large families of secondary metabolites by applying chromatographic and spectroscopic

techniques. The bibliography on the subject and methodology of work gave several results. A first study

of the extraction yield influencing factors was conducted on the leaves of A. cordifolia and on the whole

plant of T. procumbens. The screening was done using the simplex method according to the Plackett and

Burmann method aimed at analyzing six factors and optimization. The results showed that the solvent

volume per grinded matter mass ratio and the ethanol percentage in the hydroethanolic solvent are the

two significant factors for A. cordifolia extraction yield, whereas the solvent volume per grinded matter

mass ratio, the percentage of ethanol in the hydro-ethanolic solvent, the grain size of the crushed stone

and the maceration time are the four significant factors for T. procumbens extraction yield. A second

study was performed on the identification of secondary metabolites of the three plants by methods of

Phytochemical Screening (PS), High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High

Performance Liquid Chromatography coupled with Ultra-Violet spectroscopy (HPLC-UV) and Infra-

Red (IR) spectroscopy. These methods have shown some differences in the detection of families of

secondary metabolites. A comparison of these methods using Pivot Tables data analysis showed that the

HPTLC screening method is the most satisfactory with detections of 30.00-31.82% followed by CP

(16.67-31.82%), IR (13.64-33.33%) and HPLC-UV (12.12-22.73%). The structural determination of

forty-one (41) secondary metabolites of T. procumbens was performed by gas chromatography coupled

with mass spectroscopy.

Key words: Alchornea cordifolia, Tridax procumbens, Phyllanthus amarus, screening plan, secondary

metabolites, yield, optimization, Phytochemical Screening, chromatographic methods, spectroscopic

methods.

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