VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2017 - Thèse n° 015

UTILISATION HORS AMM D’INHIBITEURS DE TYROSINE-KINASES CHEZ LE CHIEN :

ETUDE RETROSPECTIVE DE DIX-HUIT CAS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 7 juillet 2017 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

BALLY Alice

Née le 29 octobre 1992 à Saint-Martin d’hères

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2017 - Thèse n° 015

UTILISATION HORS AMM D’INHIBITEURS DE TYROSINE-KINASES CHEZ LE CHIEN :

ETUDE RETROSPECTIVE DE DIX-HUIT CAS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 7 juillet 2017 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

BALLY Alice

Née le 29 octobre 1992 à Saint-Martin d’hères

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ListedesEnseignantsdeVetAgroSup–CampusVétérinairedeLyon

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5

Remerciements

A Madame le Professeur Françoise MORNEX de la Faculté de Médecine de Lyon,

qui m’a fait l’honneur d’accepter la présidence de mon Jury de thèse, pour l’intérêt porté à mon travail.

Hommages respectueux.

A Madame le Professeur Frédérique PONCE de VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon, pour avoir encouragé l’élaboration de ce travail,

pour m’avoir guidé et aidé tout au long de sa réalisation.

Sincères remerciements.

A Monsieur le Professeur Jean-Luc CADORE de VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon,

pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de participer à mon jury de thèse.

Sincères remerciements.

6

A mes parents, Papou, Mamou, Merci pour votre soutien toutes ces années,

Je vous aime très fort

A Mon Frère William, (Minou...), Merci pour ta patience et ton soutien inconditionnel.

Je t’aime mon frère !

A ma belle étoile, à ma Mamie,

Ce travail est pour toi, tu nous manques chaque jour, Je t’aime Mamie

A toute ma famille et à tous mes amis Merci à tous, vous êtes géniaux, je vous aime fort !

7

Table des matières ________________________________________________________

Table des illustrations 11

Figures 11 Tableaux 12

Liste des abréviations 13 Table des annexes 15 INTRODUCTION 17

PARTIE I : LES PROTEINES KINASES ET LEURS INHIBITEURS

I. Lesprotéinestyrosine-kinases 19

A. Structureetclassification 191. Définition 192. Structuregénérale 19

a. Structure 19b. Structuretertiaire 21c. Formesactivesetinactives 21

3. Classification 244. Exempledurécepteurtyrosine-kinasec-Kit 26

a. Structuredelaprotéinec-Kit 27b. Lesdifférentesformesdelaprotéinec-Kit 27c. Leliganddec-Kit,leStemCellFactor 28

B. LocalisationdesPTK:exempledelaprotéinec-Kit 311. Localisationnormale 312. Localisationtumorale 31

C. Moded’action 321. Casdesrécepteursàtyrosine-kinases 322. Casdesnonrécepteursàtyrosine-kinases 33

D. Régulation 33

1. RégulationdelatranscriptiondugèneKit 332. Régulationpardesfacteursdecroissance 33

8

3. Autorégulationvialedomainejuxtamembranaire(JM),laboucled’activationetlapartieC-terminale 34

4. Rôledesphosphatases 355. Autresmécanismesrégulateurs 35

E. Fonctions 36

II. Implicationdesprotéinestyrosine-kinasesencancérologie38

A. Dysfonctionnementdesprotéinestyrosine-kinases 38

1. Surexpressiond’unrécepteurtyrosine-kinase 382. Mutationdugènecodantpourunrécepteurtyrosine-kinase 383. Boucleautocrine/paracrine 404. Formationdeprotéinesfusion 405. Expressioninappropriéed’unekinase 406. Conséquences:activationconstitutivedesprotéinestyrosine-

kinases 40

B. Intérêtpronostiquedesprotéinestyrosine-kinases 411. Chezlechien 412. Chezl’homme 43

C. Quelquesexemplesdetyrosine-kinasesimpliquéesdansledéveloppementdecancers 45

1. LePDGFR 452. LaprotéineMet 473. LaprotéineLyn 494. LeVEGFR 50

III. Lesinhibiteursdetyrosine-kinases 52A. Lesinhibiteursdetyrosine-kinasesayantuneAMMchezle

chien 541. Lemasitinib(Masivet®) 54

a. Structure 54b. Cibles 54c. Moded’action 55d. Pharmacocinétique 58e. Protocole 58f. Efficacitésurlesmastocytomes 59g. Autresindicationsdumasitinib 61h. Effetssecondaires 65

2. Letoceranib(Palladia®) 66

a. Structure 66b. Cibles 67c. Moded’action 67

9

d. Protocolepourlesmastocytomes 68e. Efficacitésurlesmastocytomes 68f. Influencedustatutdec-Kit 69g. Autrestumeurs 71h. Effetssecondaires 74

B. UtilisationhorsAMMdesinhibiteursdetyrosine-kinaseschezle

chien 741. Etudesrelativesautoceranib 742. Etudesrelativesaumasitinib 77

C. Quelquesinhibiteursdetyrosine-kinasesayantuneAMMenmédecinehumaine 77

1. L’imatinib(Gleevec®) 77a. Généralités 78b. Efficacité 79c. Effetssecondairesetrésistances 80

2. Lesunitinib(Sutent®) 80a. Généralités 80b. Protocolesetétudes 81c. Effetssecondaires 81

D. Lesautrestypesd’inhibiteursdetyrosine-kinases 831. Lesanticorpsmonoclonaux 832. Lesnucléotidesnon-sens 843. Lesimmunotoxines 84

PARTIE II : ETUDES RETROSPECTIVE DE 18 CAS TRAITES HORS AMM

I. Matérieletméthodes 85

A. Populationétudiée 85

B. Collectedesinformationssurlescasdel’étude 86

C. Evaluationdel’efficacitéetdelatoxicitédutraitement 87

1. Définirlesréponsesautraitement 872. Définirlatoxicitérecherchéeenfonctiondesmolécules

utilisées 873. Consentementéclairédespropriétaires 88

10

II. Résultats 89A. Populationdechienscollectée 89

B. Diagnosticettraitement 90

C. Qualitédelaréponseetsurvie 93

D. Effetssecondairesetintoléranceautraitement 94

E. Discussion 97

1. Comparaisonavecnosrésultats 97a. Population 97b. Typestumoraux 97c. Traitements 98d. Réponses 98e. Effetssecondaires 98

2. Biais-discussion 993. Perspectivesd’avenir 100

CONCLUSION 103 BIBLIOGRAPHIE 105 ANNEXES 117

11

Table des illustrations ________________________________________________________

Figures :

Figure 1 : Exemple de structure d’une protéine tyrosine-kinase : la protéine c-Kit. 20 Figure 2 : Sites de modulation conservés de l’activité de la PTK. 22 Figure 3 : Représentation schématique de la forme activée et auto-inhibée de c-Kit. 23 Figure 4 : Domaines structuraux des non-récepteurs tyrosine-kinases (A) et des récepteurs tyrosine-kinases (B) humaines. 25 Figure 5 : Familles des RTK. 26 Figure 6 : Formes activées et inhibées de la protéine c-Kit. 27 Figure 7 : Trois isoformes de la protéine c-Kit. 28 Figure 8 : Structure d’un modèle humain du SCF. 29 Figure 9 : Formation des différentes formes du SCF. 30 Figure 10 : Formes solubles et transmembranaires du SCF humain. 30 Figure 11 : Modèle général d’auto-inhibition/activation d’un RTK. 34 Figure 12 : Exemple d’un monomère de c-Kit traversant la membrane cellulaire. 39 Figure 13 : Représentation schématique du récepteur au PDGF béta activé et ses seconds messagers. 45 Figure 14 : Superposition structurale du PDGFRA avec c-Kit et FLT3. 46 Figure 15 : Implication du PDGF dans les métastases tumorales. 47 Figure 16 : L’HGF, un facteur mitogène, motogène, morphogène, et angiogénique. 48 Figure 17 : Représentation de la structure et des domaines fonctionnels de c-Met. 48 Figure 18 : Mécanisme de la signalisation de c-Met et de la formation de métastases lors de tumeurs solides. 49 Figure 19 : Représentation de la structure et des voies de signalisation de la protéine Lyn. 50 Figure 20 : Les différents VEGF et leurs VEGFR. 51 Figure 21 : Représentation schématique du mécanisme d’activation des VEGFR. 51 Figure 22 : Mécanisme d’action des inhibiteurs des tyrosine-kinases. 52 Figure 23 : Inhibition des RTK par les ITK. 53 Figure 24 : Formule chimique du masitinib. 54 Figure 25 : Le réseau de signalisation induit par l’activation de c-Kit dans les mastocytes. 57 Figure 26 : TTP de chiens traités avec du masitinib et le placebo. 60 Figure 27 : Photographie d’une tumeur de l’œsophage intraluminale. 63 Figure 28 : Courbes d’inhibition de la croissance cellulaire en fonction de la dose de Gemcitabine (GCB) associée au masitinib. 64 Figure 29 : Courbes de l’inhibition de la croissance cellulaire en fonction des doses de doxorubicine (DOX) et de vinblastine (VBL). 65 Figure 30 : Structure chimique du toceranib. 67 Figure 31 : Temps de survie des chiens présentant un mastocytome dont la protéine c-Kit est mutée ou non, après traitement avec du SU11654. 70 Figure 32 : Réponse d’un adénocarcinome de la glande anale (AGASACA) au toceranib. 72 Figure 33 : Représentation graphique des effets secondaires retrouvés lors de l’étude

12

de London C. en 2012. 75 Figure 34 : Structure chimique de l’imatinib mesylate. 78 Figure 35 : Structure chimique du sunitinib. 80 Figure 36 : Différentes stratégies de lutte contre les RTK. 83 Figure 37 : Répartition graphique des chiens en fonction de leur âge. 89 Figure 38 : Représentation graphique des différents types tumoraux étudiés. 92 Figure 39 : Représentation graphique de la qualité des réponses. 94 Figure 40 : Représentation graphique des différents types d’effets secondaires. 96

Tableaux : Tableau I : Résumé des différentes fonctions des protéines tyrosine-kinases. 36 Tableau II : Grading de Patnaik comme facteur pronostique. 42 Tableau III : Marqueurs moléculaires liés à la prolifération et utilisables comme facteurs pronostiques pour les mastocytomes cutanés canins. 44 Tableau IV : Résumé des interactions de plusieurs membres de la famille des VEGF avec 3 VEGFR connus. 51 Tableau V : IC50 du masitinib sur différentes tyrosine-kinases. 55 Tableau VI : Les tyrosine-kinases cibles du masitinib. 56 Tableau VII : Principaux rôles du masitinib lors de différentes pathologies. 58 Tableau VIII : Comparaison des taux de survie à 12 et 24 mois de chiens atteints de mastocytomes non opérables et traités avec du masitinib ou un placebo. 60 Tableau IX : IC50 de trois lignées cellulaires d’hémangiosarcomes à 24, 48 et 72h. 62 Tableau X : IC50 du toceranib sur différentes TK. 67 Tableau XI : Taux de réponse au traitement en fonction du type de tumeur. 69 Tableau XII : Taux de réponse du mastocytome en fonction des nœuds lymphatiques et de la mutation de c-Kit. 70 Tableau XIII : Synthèse de l’application hors AMM du toceranib chez le chien en médecine vétérinaire. 76 Tableau XIV : Synthèse de l’application hors AMM du masitinib chez le chien. 77 Tableau XV : IC50 de l’imatinib sur différentes tyrosine-kinases. 78 Tableau XVI : IC50 du sunitinib sur différentes tyrosine-kinases. 81 Tableau XVII : Résumé des inhibiteurs de tyrosine-kinases utilisés chez le chien et le chat. 82 Tableau XVIII : Etapes de la recherche avancée. 86 Tableau XIX : Liste des deux types de recherches effectuées pour le troisième critère. 86 Tableau XX : Examens complémentaires réalisés avant un traitement avec des inhibiteurs de tyrosine-kinases hors homologation. 88 Tableau XXI : Sexe et statut hormonal de la série. 89 Tableau XXII : Diagnostic et traitements mis en place. 90 Tableau XXIII : Liste du temps de survie en fonction de la durée du traitement à base d’ITK et de la qualité de la réponse. 93 Tableau XXIV : Moyennes et médianes des durées de traitement et de survie. 93 Tableau XXV : Liste des effets secondaires et des conséquences en fonction du traitement. 94 Tableau XXVI : Etat actuel du développement clinique du masitinib en médecine humaine et statuts de ces compétiteurs. 101

13

Liste des abréviations _________________________________________________

ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADP : Adénosine DiPhosphate AMM : Autorisation de Mise sur le Marché AMP : Adénosine MonoPhosphate ARNm : Acide Ribo-Nucléique messager Asp816val : Substitution de l’aspartate en valine au codon 816 de la protéine c-Kit ATP : Adénosine TriPhosphate BID : Deux fois par jour CSF-1R : Colony Stimulating Factor 1 Receptor EGF : Epidermal Growth Factor, facteur EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor FAK : Focal Adhesion Kinase FDA : Food and Drug Administration FGF : Fibroblast Growth Factor FGFR (=HER2) : Fibroblast Growth Factor Receptor HGF : Hepatocyte Growth Factor HGFR (=Met) : Hepatocyte Growth Factor Receptor Hpf High power field GIST : Tumeur Stromale Gastro-Intestinale GM-CSF : Granulocyte Macrophage-Colony-Stimulating Factor IC 50 : Concentration Inhibitrice à 50% IFN : Interféron IGF-1 : Insulin Like Growth Factor 1 ITK : Inhibiteur de Tyrosine-Kinase ITD : Duplication Interne en Tandem JM : Juxtamembranaire Kb : Kilo base kDa: Kilodalton Mg : Magnésium NRTK : Non Récepteur Tyrosine-Kinase PAL : Phosphatases Alcalines Pb : Paire de base PCR : Polymerase Chain Reaction PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PDGFR : Platelet-Derived Growth Factor Receptor PKA : Protéine kinase A PO : Per Os PTK : Protéine Tyrosine-Kinase PTP : Non Récepteur Tyrosine-Phosphatase RPCU : Rapport protéine sur créatinine urinaire RPTP : Récepteur Tyrosine-Phosphatase RTK : Récepteur Tyrosine-Kinase SID : Une fois par jour SCF : Stem Cell Factor

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STAT : Signal Transducers and Activators of Transcription TID : Trois fois par jour TGF : Transforming Growth Factor TK : Tyrosine-Kinase TM : Trans-Membranaire TNF : Tumor Necrosis Factor TTP : Time To Progression VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor VEGFR : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

15

Table des annexes _____________________________________________

Annexe 1 : Classification des neutropénies 117 Annexe 2 : RECIST – VCOG 118

16

17

INTRODUCTION

Le traitement des cancers en médecine vétérinaire est en évolution permanente,

profitant des progrès de la recherche en cancérologie humaine. La première étape du traitement d’un processus tumoral est le plus souvent la chirurgie, technique qui reste incontournable. Si cette dernière se révèle non curative, une radiothérapie et/ou une chimiothérapie sont alors mises en place. La radiothérapie permet d’éliminer localement les cellules tumorales tandis que la chimiothérapie prévient ou ralentit l’évolution métastatique à distance. Bien qu’elle interagisse avec des macromolécules ou des enzymes identifiées, la chimiothérapie conventionnelle agit sans discrimination sur les cellules à division rapide des tissus normaux et sur les cellules tumorales. Cette absence de spécificité est à l’origine de nombreux effets indésirables qui limitent considérablement l’usage de la chimiothérapie, et contraint très souvent les thérapeutes à limiter les doses administrées. Plus récemment, le développement de l’immunothérapie et des thérapies ciblées ouvre une nouvelle voie thérapeutique. Le principe est de lutter contre l’anomalie cellulaire à l’origine de la transformation et de la croissance tumorale et ainsi de minimiser les effets secondaires des traitements classiques sur les cellules saines. Les inhibiteurs des tyrosine-kinases (ITK) sont une classe récente de médicaments anticancéreux regroupant les inhibiteurs des récepteurs à activité tyrosine-kinase et les inhibiteurs de tyrosine-kinases cytoplasmiques. L’imatinib (Gleevec®) est le premier ITK à avoir obtenu une AMM chez l'homme en 2001 pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique. Il existe désormais une dizaine d’autres inhibiteurs de tyrosine-kinases sur le marché. Actuellement, deux spécialités vétérinaires sont homologuées dans la prise en charge thérapeutique de certains mastocytomes chez le chien : le masitinib (Masivet®) et le toceranib (Palladia®). Les utilisations hors homologation du masitinib et du toceranib diffèrent en raison de leur spectre de sélectivité pour les récepteurs à activité tyrosine-kinase et des données disponibles dans les publications. Mais l’usage hors AMM d’un médicament anticancéreux impose le respect de règles légales (notamment l’article L. 5143-4 du Code de la santé publique pour le principe de la cascade) et de bonnes pratiques réglementaires, ainsi qu’un suivi adapté et une information objective des propriétaires. L’objectif de ce travail est d’étudier l’efficacité de l’utilisation des inhibiteurs de tyrosine-kinases hors homologation chez le chien. La première étape de ce travail sera de présenter les protéines tyrosine-kinases, leurs rôles et modes d’actions ainsi que leur régulation au sein de l’organisme. Ces prérequis sont nécessaires pour comprendre l’implication de ces protéines en cancérologie, ainsi que le mode de fonctionnement des inhibiteurs de tyrosine-kinases utilisés actuellement. Nous étudierons et comparerons ensuite les différents inhibiteurs de tyrosine-kinases disponibles en médecine vétérinaire et humaine. La seconde étape consiste en l’étude de l’efficacité des inhibiteurs de tyrosine-kinases utilisés hors homologation chez dix-huit chiens atteints de tumeurs ne répondant pas aux traitements conventionnels.

18

19

PARTIE I : LES TYROSINE-KINASES ET LEURS INHIBITEURS

__________________________________________________________________________________________

I. Les protéines tyrosine-kinases A. Structure et classification

1. Définition

Les protéines tyrosine-kinases (PTK) sont des protéines dont l’activité enzymatique

consiste à transférer un groupement phosphate d’une molécule d’ATP à une autre protéine, ce qui entraine un changement de conformation de celle-ci et donc une modification de son activité. Ces phosphorylations sont indispensables à une grande partie de l’activité cellulaire. Ces protéines jouent un rôle crucial dans le signalement intracellulaire qui régule la croissance, la différenciation, le développement, les fonctions ainsi que la mort cellulaire. Les protéines kinases catalysent cette réaction :

MgATP1- + protéine-OH à protéine-OPO32- + MgADP + H+

Il existe deux classifications des PTKs en fonction de la spécificité du substrat et de la

séquence d’acides aminés du domaine catalytique : - en fonction de l’acide aminé qu’elles phosphorylent : on distingue les PTK qui

transfèrent un groupement phosphate uniquement à un résidu tyrosine, des protéines sérine-thréonines kinases qui elles, transfèrent un groupement phosphate uniquement à des résidus sérines et/ou thréonines.

- en fonction de leur lieu d’expression : les récepteurs tyrosine-kinases (RTK) sont localisés à la surface cellulaire tandis que les non récepteurs tyrosine-kinases (NRTK) sont localisés dans le cytoplasme ou dans le noyau de la cellule.

Par la suite, le terme protéine tyrosine-kinase (PTK) regroupera donc les récepteurs tyrosine-kinase (RTK) et les protéines tyrosine-kinases cytoplasmiques (NRTK). Les phosphatases sont des protéines spécifiques qui permettent la déphosphorylation. (107)

Seules les PTK (RTK et NRTK) seront abordées dans la suite car ce sont les protéines les mieux connues et le plus souvent impliquées dans les processus cancéreux. Les protéines sérine-thréonine kinases et les phosphatases ne seront pas détaillées.

2. Structure générale

a. Structure

Dans la plupart des structures inactives, le site de liaison de l’ATP est bloqué par des inhibiteurs physiologiques ou par des mécanismes de régulation qui se lient de façon compétitive avec l’ATP.

20

Les analyses de la séquence du génome humain ont identifié 518 protéines kinases humaines. Quatre-vingt dix gènes codant pour les tyrosine-kinases ont été identifiés (58 RTK en 20 familles et 32 NRTK en 10 familles).

La plus grande majorité des RTK sont constitués d’une simple chaine polypeptidique, monomérique en l’absence de ligand, exception faite pour la protéine Met et la famille des récepteurs à l’insuline. (48)

Les RTK possèdent un large domaine de liaison au ligand extracellulaire amino-terminal (souvent glycosylé), une hélice transmembranaire hydrophobe ainsi qu’un domaine cytoplasmique (contenant le domaine catalytique protéine tyrosine-kinase TK, le domaine juxtamembranaire JM et une queue carboxyle-terminale). (79)

Figure 1 : Exemple de structure d’une protéine tyrosine-kinase : la protéine c-Kit. (76)

(a) Les 5 boucles extracellulaires d’Ig-like I-V sont représentées sous forme de cercles partiellement fermés. Du côté intracellulaire, on note les régions juxtamembranaires, Tyrosine-Kinase I et II entre lesquelles s’insère la région Interkinase. (b) Un modèle de KIT canin est aussi présenté.

Le site de liaison de l’ATP a une structure hautement conservée entre les différentes tyrosine-kinases. Il est divisé en 5 parties : la région adénine, la région du sucre, une poche hydrophobe, une chaine hydrophobe et la région de liaison des phosphates. (79, 110) :

- la région adénine est une région hydrophobe qui forme les deux ponts hydrogènes formés par l’interaction entre les groupes amines N-1 et N-6 de l’adénine et NH, et le groupe

21

carbonyle de la PTK. De nombreux inhibiteurs des PTK se lient à au moins un de ces deux ponts hydrogène.

- la région du sucre est hydrophile dans les plupart des PTK sauf pour le EGFR. - la poche hydrophobe n’est pas utilisée par l’ATP mais est exploitée par la majorité

des inhibiteurs. - la chaine hydrophobe du lobe N-terminal est commandée par l’hélice C-alpha et

n’est pas non plus utilisée par l’ATP. - la région de la liaison des phosphates contient le groupe triphosphate de l’ATP grâce

à une boucle riche en glycine. Les PTK se ressemblent fortement les unes avec les autres lorsque le domaine kinase est dans sa conformation active mais diffèrent lorsque le domaine est inactif. Les NRTK ont un domaine catalytique commun identique à celui des RTK avec un module N-terminal. (79). De plus, ces protéines contiennent des sous-domaines qui gèrent la régulation. Ils influencent positivement ou négativement la liaison des substrats ainsi que les phosphorylations. Il en est de même pour les sous-domaines impliqués dans la dimérisation obligatoire, et/ou les changements de structure durant l’activation de l’activité kinase après la liaison du ligand. (10)

b. Structure tertiaire

Les connaissances sur la structure tertiaire d’une cinquantaine de protéines kinases se sont développées grâce à la cristallographie. Le domaine kinase de toutes les PTK a une structure bilobaire avec un lobe N-terminal qui fixe l’ATP et le magnésium, et un lobe C-terminal contenant une boucle d’activation. Il y a une fente entre les lobes à laquelle s’attache les substrats polypeptidiques. (110) Le lobe N-terminal est composé de feuillets béta et le lobe C est composé d’hélices alpha. La moitié de l’adénosine de l’ATP se fixe dans une fente principalement hydrophobe formée par l’intersection de ces deux lobes dans le domaine catalytique. Il est attaché à la poche par des liaisons de van der Waals et des interactions H-bond.

c. Formes actives et inactives (30, 91)

La protéine kinase A (PKA) représente le prototype de l’état actif et catalytique d’une protéine kinase : une structure hautement conservée et un mécanisme de transfert de phosphates est désormais observé parmi les structures de protéines kinases actives découvertes à ce jour. A part quelques exceptions, comme la protéine kinase CK2 (30), seulement une petite partie de la population des protéines kinases est activée durant la signalisation, et celles-ci sont rapidement inactivées par divers mécanismes de régulation. Le contrôle de l’état inactif est crucial pour éviter une signalisation parasite. La comparaison des formes inactives et actives, telles que celles de la PKA, met en évidence un ensemble de différents sites structuraux dans le domaine kinase qui sont presque toujours déformés lorsque la kinase est inactive. Cet ensemble est constitué de quatre régions, parmi lesquelles, dans la forme inactive de la protéine, au moins deux ont une conformation différente de celle de la protéine sous forme active (30).

22

Figure 2 : Sites de modulation conservés de l’activité de la PTK. (30) La boucle d’activation est représentée en vert, l’hélice C-alpha en gris et la poche d’ATP en bleu.

Le site le plus connu est la boucle d’activation, site le plus clairement évolué pour contrôler l’état d’activation de l’enzyme. Un second mécanisme couramment utilisé est le blocage de la poche de liaison à l’ATP par différentes interférences extramoléculaires, la plus employée étant la boucle d’activation elle-même. La déformation du « flap » de la glycine par rapport à la structure active représente le troisième mécanisme d’inactivation. Enfin, le quatrième site d’inactivation est l’hélice C, la seule hélice conservée du lobe N des kinases, qui, dans la plupart des protéines inactivées, n’est pas correctement alignée. Dans environ 60% des kinases inactivées, la poche de liaison à l’ATP est bloquée. Il est important de noter que l’inactivation est toujours associée avec au moins deux de ces mécanismes, souvent trois et dans quelques rares cas avec les quatre.

Boucled’activation PPoche

P+1

DrapeauGlycine

PocheATP

HéliceC-alpha

23

Figure 3 : Représentation schématique de la forme activée (A) et auto-inhibée (B) de c-

Kit. (102)

Le domaine JM est représenté en rouge. La boucle d’activation (BA) en vert. Dans le schéma A, l’hélice C-alpha (violet) est dans la conformation active et la boucle d’activation est étendue : la protéine est active. Dans le schéma B, l’hélice C-alpha est dans sa conformation inactive, le domaine JM s’insère entre les deux lobes et la boucle d’activation n’est pas étendue : la protéine est sous forme inactive.

Il existe deux principaux mécanismes de régulation des récepteurs tyrosine-kinases (RTK):

- Autophosphorylation du résidu tyrosine : l’activation des RTK requière à la fois le

renforcement (ou l’augmentation) de l’activité catalytique, mais aussi la création de sites de liaison afin de recruter les protéines de signalisation en aval. Pour la majorité des RTK, ces deux événements se produisent grâce à l’autophosphorylation de résidus tyrosines.

- Dimérisation : la liaison du ligand sur la portion extracellulaire des RTK entraine l’oligomérisation non covalente des récepteurs monomériques, ou induit un réarrangement structural des récepteurs hétérotétramériques (comme le récepteur à l’insuline) ce qui facilite l’autophosphorylation des tyrosines dans le domaine cytoplasmique.

La régulation des NRTK est similaire à celle des RTK, le mécanisme le plus commun

étant la phosphorylation des tyrosines, avec quelques exceptions.

24

En résumé, les PTK sont des enzymes essentielles au bon fonctionnement cellulaire.

Leur structure est hautement conservée, notamment celle des RTK. En effet, les RTK sont des glycoprotéines composées d’une partie extracellulaire où se lie le ligand, une partie transmembranaire permettant l’ancrage de la protéine, une partie juxtamembranaire jouant un rôle dans la régulation négative de la protéine et une partie kinase permettant l’activité enzymatique. Ces enzymes existent sous une forme active en présence du substrat, du ligand et de l’ATP, et sous une forme inactive majoritaire.

3. Classification

Parmi les 518 protéines kinases identifiées actuellement, on dénombre 90 protéines tyrosine-kinases. (1,99). Ces PTK sont subdivisées en RTK (58 classées en 20 familles) et NRTK (32 classées en 10 familles).

Les familles des PTK ont été établies en fonction de l’homologie structurale basée sur la séquence des domaines kinases de ces PTK.

Il existe 4 types de RTK en fonction de la structure de leur domaine intracellulaire : - Type I : ils sont constitués de deux séquences riches en cystéine, répétées dans le

domaine extracellulaire et un domaine intracellulaire possédant l’activité tyrosine-kinase. Exemple de l’EGFR.

- Type II : ils ont aussi deux séquences riches en cystéine dans le domaine extracellulaire mais ont une structure hétéro-tétramérique avec 2 chaînes α et 2 chaînes β. Chaque chaîne α est unie par liaison disulfure à une chaîne β et à une autre chaîne α. Ce groupe inclut les récepteurs de l’insuline, du facteur de croissance insuline-like (IGF-1) et du facteur de croissance des hépatocytes (HGF-R).

- Type III : ils ont un domaine kinasique interrompu par un insert et 5 domaines

comparables aux immunoglobulines en région extracellulaire. Exemples : récepteurs du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R),

- Type IV : ils ont aussi un domaine kinasique interrompu par un insert et 3 domaines comparables aux immunoglobulines en région extracellulaire. Exemple : récepteur du facteur de croissance fibroblastique (FGF-R).

Les types I, III et IV sont monomériques, tandis que le type II est un tétramère α2β2.

Les types I, III et IV sont monomériques, tandis que le type II est un tétramère α2β2. Les chaînes transmembranaires de ces récepteurs ne traversent la double couche qu’une seule fois. (57)

25

Figure 4 : Domaines structuraux des non-récepteurs tyrosine-kinases (A) et des récepteurs tyrosine-kinases (B) humaines. (99)

Domainedeliaisonàl’ac/ne

Domainedeliaisonàl’ADN

v

DomainedeliaisonCdc42

Domained’adhésionfocale

Domained’homologieFes/CIP4

Domainedeliaisondesintégrines

Domainekinase

Domainekinase-like

Domained’homologiePleckstrin

Domained’homologieàSrcdeType2

Domained’homologieàSrcdeType3

Mo/fBTK

Régiontransmembranaireprédite

DomaineCadherine

DomaineDiscoidin(F5/F8detypeC)

Domainefibronec=nedetypeIII

DomaineFurin-likericheencystéine

DomaineFrizzledricheencystéine

Domaineimmunoglobuline-like

DomaineKringle

DomaineKinase

Domainedeliaisonduligandaurécepteur

Mo=falphaSterile

DomainSemaphorine

Domaindufacteurd’inhibi=onWnt

DomainEGF-Like

DomainLRR,richeenleucine

DomainIPT/TIG

DomainLRRC-terminal

DomainPlexin(richeencystéine)

Domainedeliaisonduliganddurécepteuràl’Ephrin

26

Figure 5 : Familles des RTK. (107) Les RTK humaines contiennent 20 sous-familles, représentées ici avec des exemples de membres de chaque famille sous chaque récepteur. Les domaines intracellulaires sont représentés par des rectangles rouges.

4. Exemple du récepteur tyrosine-kinase c-Kit et de son ligand

Ce récepteur c-Kit est bien connu car il est impliqué dans de nombreux cancers chez l’homme (dont les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), la mastocytose et le cancer du sein) ainsi que chez le chien (notamment dans les GIST, le mastocytome et les tumeurs mammaires). C-Kit est un récepteur glycoprotéique protéine-tyrosine kinase. Le Stem Cell Factor (SCF) est le ligand de la protéine c-Kit et entraine son activation. L’absence totale de la protéine c-Kit ou du SCF entraine la mort causée par une anémie sévère in utéro ou en périnatalité. (135)

27

a. Structure de la protéine c-Kit

Le récepteur c-Kit appartient au type III des RTK (dans lequel se trouvent également le PDGFR (Platelet-Derived Growth Factor Receptor), le macrophage colony-stimulating-factor receptor CSF-1 et le F1 cytokine receptor F1t3). Cette protéine est codée par un gène de 89 kb, et contient 21 exons. Ce récepteur c-Kit (976 acides aminés) a un poids moléculaire de 145 kDa. Ces récepteurs de type III sont caractérisés par la présence de 5 domaines de type immunoglobuline et d’un insert de 70 à 100 acides aminés situé entre les deux domaines kinases. A contrario, la famille du VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) contient quant à elle 7 domaines de type immunoglobuline extracellulaires. Le Stem Cell Factor (SCF) se lie au niveau du 2eme et du 3eme domaine type immunoglobuline, alors que le 4eme domaine joue un rôle dans la dimérisation du récepteur. La fonction de la partie située proche de la membrane n’est pas encore connue (101).

Figure 6 : Formes activées et inhibées de la protéine c-Kit. (101)

b. Les différentes formes de la protéine c-Kit

Il existe différentes isoformes de la protéine c-Kit, ainsi qu’une forme soluble et une forme tronquée. Les isoformes résultent d’un épissage alternatif de l’ARNm codant pour la protéine c-Kit, de clivages protéolytiques et de l’utilisation de promoteurs internes cryptiques dans certains types cellulaires. On retrouve alors quatre isoformes chez l’homme et deux chez la souris. Chez l’homme, les isoformes sont caractérisées par la présence ou l’absence d’une séquence de 4 acides aminés appelés GNNK (glycine-asparagine-asparagine-lysine) située dans la région extracellulaire proche du domaine transmembranaire et la présence ou l’absence d’un résidu sérine dans l’insert situé entre les deux domaines kinases. Chez la souris, les deux isoformes sont caractérisées par la présence ou l’absence d’une séquence de quatre acides aminés GNNK située dans la région extracellulaire proche du domaine transmembranaire. (8)

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Figure 7 : Trois isoformes de la protéine c-Kit. (8)

A : les 4 isoformes de c-Kit résultent d’un épissage alternatif de l’ARNm. B : une forme soluble de c-Kit est générée par protéolyse et est retrouvée dans le sérum normal. C : une forme tronquée de c-Kit dans laquelle il manque les domaines extracellulaires et transmembranaires est décrite. Elle serait due à un promoteur inconnu localisé sur les introns 15 et 16.

c. Le ligand de c-Kit, le Stem Cell Factor (SCF)

Son nom est à mettre en relation avec ses différents rôles dans la survie, l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques. Une perte de fonction partielle de c-Kit ou du SCF entraîne un déficit en mastocytes, une hypopigmentation, une anémie ainsi qu’une stérilité. (4) On a ainsi pu en déduire le rôle du SCF : ce facteur de croissance est essentiel pour le déroulement normal de l’hématopoïèse, le développement des mastocytes et des mélanocytes ainsi que pour la fertilité. (62)

Domaine Transmembranaire

Domaine deliaison

SCF

Domaine deliaison

SCF

Domaine Tyrosine Kinase

Domaine Tyrosine Kinase

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Figure 8 : Structure d’un modèle humain du SCF. (16)

Les quatre hélices reliées par deux grandes boucles sont représentées sous forme de rubans. Les deux ponts disulfures intramoléculaires sont en jaune.

Il existe deux isoformes de la protéine, une forme soluble et une forme membranaire, résultant d’un épissage alternatif de l’ARNm. La délétion ou l’inclusion de l’exon 6 entraîne la formation de deux formes transmembranaires du SCF (constituées de 220 et 248 acides aminés respectivement). Le SCF de 248 acides aminés est rapidement clivé et devient le SCF soluble pouvant former des dimères. Le SCF de 220 acides aminés forme le SCF membranaire. Il peut former des dimères. Le monomère peut, lui, être clivé lentement sur un site codé par l’exon 7 et donner le SCF soluble. (8) Le ratio des deux formes varie d’un tissu à l’autre. Miyazawa et al. (87) ont montré que l’activation de c-Kit est plus prolongée lors de la liaison du SCF membranaire par rapport au SCF soluble. Ce dernier pourrait entrainer une diminution de l’expression de la protéine à la surface cellulaire et une augmentation de sa vitesse de dégradation. Les deux isoformes ont donc des conséquences différentes sur la protéine c-Kit. (8, 87) En l’absence du SCF, c-Kit existe sous une forme monomérique inactive. Le mécanisme général pour activer les récepteurs tyrosine-kinases inactifs implique la liaison du ligand associé aux domaines extracellulaires de deux réc epteurs monomères et la dimérisation. SCF existe sous forme de dimère non covalent et entraine la liaison de deux monomères de c-Kit en un dimère. La bivalence du SCF est la seule force responsable de la dimérisation du domaine extracellulaire de c-Kit.

Pour la plupart des récepteurs tyrosine-kinases, la dimérisation est suivie par la transphosphorylation des résidus tyrosine 1-3 dans la boucle d’activation. Le segment JM de la protéine c-Kit est autoinhibant, et ce mécanisme supplémentaire de maintien de c-Kit dans son état inactif doit être dépassé.

30

Figure 9 : Formation des différentes formes du SCF. (8)

Figure 10 : Formes solubles et transmembranaires du SCF humain. (16) La flèche représente le lieu du clivage protéolytique au niveau de l’exon 6.

SCFsoluble

Protéolyse(lente)

Protéolyse(rapide)

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Après la dimérisation, a lieu la transphosphorylation de deux résidus tyrosine (568 et 570) dans le segment JM. Ce dernier ne peut alors plus maintenir le petit et le grand lobe dans leur configuration statique. La boucle d’activation est alors convertie dans sa forme active et la transphosphorylation de sa tyrosine 823 stabilise l’enzyme dans sa forme active.

En résumé, la protéine c-Kit (145 kDa) est un RTK de type III codé par un gène composé de 21 exons. Ce récepteur présente une forme membranaire et une forme soluble qui diffèrent dans le signal émis. C-Kit est impliquée dans de nombreux cancers chez l’homme et chez le chien, et présente une forte homologie entre ces deux espèces. Son ligand est le SCF, il permet son activation. Il présente également deux isoformes, ayant des conséquences différentes lors de l’activation de la protéine c-Kit.

B. Localisation des PTK : exemple de la protéine c-Kit

1. Localisation normale

Le récepteur c-Kit est largement distribué dans les cellules hématopoïétiques ainsi que dans d’autres tissus. Chez un individu sain, approximativement 1 à 4% des cellules souches de la moelle osseuse et 60 à 75% des cellules hématopoïétiques CD34+ expriment le récepteur c-Kit. Les types cellulaires dépendant de c-Kit sont les cellules hématopoïétiques, les cellules germinales, les mastocytes, les mélanocytes, ainsi que les cellules de Cajal du tractus gastro-intestinal. Il a été aussi montré que les déficiences dans la fonction de la protéine c-Kit peuvent causer des régénérations anormales des nerfs périphériques ainsi que des troubles de la mémoire.

Presque 85% des cellules souches des lymphocytes B expriment le récepteur c-Kit,

mais cela disparaît graduellement avec la différentiation et la maturation des lymphocytes B. Environ 30% des lymphocytes T CD4, CD8 et CD3 expriment le récepteur c-Kit. En plus de cela, le récepteur c-Kit est retrouvé dans les phanères, les cellules épithéliales du sein ainsi que dans les petits neurones du cerveau. Des données suggèrent que le récepteur c-Kit joue un rôle dans la croissance et le développement cellulaire des cellules souches du foie. De plus, la signalisation de c-Kit joue un rôle important dans la régulation de la production des cellules de la lignée rouge du sang, la prolifération des lymphocytes, le développement et la fonction des mastocytes, la formation de la mélanine ainsi que dans la formation des gamètes.

2. Localisation tumorale

Les mutations « gain of function » (= l’activité de la protéine est augmentée par rapport à une protéine normale) concernent les GIST (>90%), les mastocytomes (>70%), les lymphomes des cellules T nasales (>17%), les séminomes (>9%) et la leucémie myéloïde aiguë (>68%). Les mutations pour lesquelles un « élément » est manquant, une mutation ponctuelle, une duplication et une insertion peuvent conduire à l’activation du récepteur c-Kit.

32

Les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ont pour origine les cellules de Cajal du tractus gastro-intestinal et environ 70% de ces tumeurs apparaissent dans l’estomac, 20-30% dans l’intestin, et moins de 10% dans l’œsophage, le colon, les annexes et le rectum. La majorité des GIST est bégnine, alors que 10-30% sont malignes. On retrouve le récepteur c-Kit grâce à l’immunomarquage dans 95% des GIST ce qui est devenu un indicateur important pour le diagnostic des GIST. De plus, dans 20-80% des patients atteints de GIST, on retrouve des mutations avec gain de fonction du gène codant pour la protéine c-Kit. Enfin, Liang J. et al. (65) ont montré que sur 419 cas de GIST, des mutations sur les exons 9, 11, 13, 17 du gène codant pour c-Kit, apparaissent dans respectivement 73%, 10%, 3% et 1% des cas.

De plus, le récepteur c-Kit est exprimé dans 68% des leucémies myéloïdes aiguës (AML) et dans 80% des leucémies myéloïdes chroniques (CML) en phase blastique mais seulement dans 2% des leucémies aiguës lymphoïdes.

Le récepteur c-Kit est également exprimé dans les tumeurs de la moelle osseuse, des cellules germinales, les mastocytomes, les cancers de la prostate, des cellules gliales, des tumeurs pulmonaires à petite cellule, quelques tumeurs pulmonaires à grandes cellules et d’autres. Dans certains sarcomes, tels que les angiosarcomes et le sarcome d’Ewing (tumeur osseuse à petite cellule ronde et à fort potentiel métastasique), différents niveaux d’expression de c-Kit ont été montrés, mais son expression dans les sarcomes synoviaux, les leiomyosarcomes et les histiocytomes malins fibreux est toujours controversée. (65)

C. Mode d’action

1. Cas des récepteurs à tyrosine-kinases (104)

Comme expliqué précédemment, les RTK existent sous forme active et inactive. Le RTK ne peut exercer son activité enzymatique que lorsqu’il est sous forme active. Que le RTK sous forme inactive soit monomérique ou oligomérique, son activation requiert la liaison du ligand pour stabiliser une relation spécifique entre des récepteurs individuels afin qu’ils soient sous forme active. D’anciennes études sur les RTK et sur les récepteurs de cytokines proposent un mécanisme simple concernant la dimérisation provoquée par le ligand : un ligand bivalent interagit simultanément avec deux récepteurs et les lie efficacement en un complexe dimérique. On peut citer par exemple la protéine c-Kit (67), le VEGFR (63, 120), le NGF/TrkA (120), l’Axl (103), le Tie2 (9), et les récepteurs Eph (45). Dans chacun de ces cas, le ligand est lui-même un dimère qui lie simplement les sites de liaisons de deux récepteurs.

Puis il y a autophosphorylation de résidus tyrosines localisés sur la boucle d’activation (sous forme de transphosphorylation), et celle-ci a lieu dans un ordre précis. Cela entraîne la stimulation de l’activité kinase de la protéine, l’enlèvement des deux gènes stériques sur les deux sites de liaison (du substrat et de l’ATP). Finalement, les résidus impliqués dans la liaison du substrat et dans l’activité catalytique se positionnent correctement. De plus, d’autres tyrosines localisées dans la région JM, l’insert et la région C-terminale sont phosphorylées, sous forme cis (on parle alors de cisphosphorylation).

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2. Cas des non récepteurs tyrosine-kinases

Alors que les RTK possèdent un domaine d’auto-inhibition juxtamembranaire, les NRTK, typiquement le c-Abl, sont maintenus dans la forme inactive grâce à des protéines et des lipides cellulaires d’inhibition, ainsi que grâce à une auto-inhibition intramoléculaire. Les NRTK sont activés par différents signaux intracellulaires à travers la dissociation d’inhibiteurs, le recrutement de récepteurs transmembranaires (provoquant l’oligomérisation et l’autophosphorylation), ainsi qu’à travers la transphosphorylation par d’autres kinases. Cette activation des NRTK se termine via l’action de phosphatases qui hydrolysent les tyrosyl-phosphates, et via l’induction de molécules inhibitrices. (59, 110).

En résumé, les PTK sont activées grâce à la fixation du ligand. Il provoque alors la dimérisation du récepteur, et permet la fixation de l’ATP et du substrat sur leurs sites respectifs. L’autophosphorylation permet à la PTK d’exercer son activité. Les phosphatases sont des enzymes qui entraînent le passage de la forme active à la forme inactive de la PTK.

D. Régulation

1. Régulation de la transcription du gène Kit

De nombreuses régulations au niveau de la transcription du gène Kit, codant pour la protéine c-Kit ont été décrites. Les gènes humains et de souris de c-Kit sont composés de 21 exons s’étalant sur 80Kb d’ADN. De multiples facteurs de transcription influencent la transcription de ce gène : Sp1, AP-2, Ets, Myb, SCL et GATA-1. Ils agissent sur le promoteur du gène. Dans l’état actuel des connaissances, la fonction des différents facteurs n’est pas encore clairement définie. (8)

2. Régulation par des facteurs de croissance

En plus d’une régulation dépendante des types cellulaires, de nombreuses cytokines interviennent dans la régulation de la protéine c-Kit et de son ARNm chez l’homme. La protéine GM-CSF régule négativement l’ARN de c-Kit, ainsi que l’interleukine 4 mais celle-ci agit dans les mastocytes humains tout en ayant un effet complexe sur leur maturation. Le TGF-béta fait de même en agissant sur la stabilité de l’ARNm des cellules hématopoïétiques peu différenciées, alors qu’il antagonise l’action du SCF sans changer c-Kit à la surface des mastocytes.

Le TNF-alpha inhibe également l’influence du SCF dans la survie des cellules hématopoïétiques primitives. L’interféron-gamma, un régulateur négatif des cellules érythroïdes primitives, entraine une diminution de la concentration en ARNm codant pour c-Kit et pour les récepteurs à l’érythropoïétine. (8)

34

3. Autorégulation via le domaine juxtamembranaire (JM), la boucle d’activation et la partie C-terminale

Chez l’homme, dans la forme inactive de la protéine, le domaine JM se lie au niveau de l’interface entre les lobes N et C-terminaux et perturbe ainsi la conformation de la boucle d’activation et du motif DFG (Aspartate-Phénylalanine-Glycine). Ce domaine JM stabilise alors le segment d’activation dans sa forme inactive et la protéine ne peut pas passer en mode actif. (88) Par ailleurs, des mutations dans la région codant pour le domaine JM et modifiant sa structure entrainent une activation permanente de c-Kit indépendamment de la liaison du ligand. Ce phénomène est à l’origine de nombreux processus cancéreux.

Une autre partie de la PTK intervient dans l’auto-inhibition : la partie C-terminale, qui possède une longueur et une séquence en acides aminés variables, avec plusieurs résidus tyrosines. Prenons comme exemple la partie C-terminale du RTK Tie2 : lorsqu’elle est non phosphorylée, elle peut se lier à une zone proche du site de liaison du substrat ce qui rend ce site inaccessible. Des mutations de la région codant pour la partie C-terminale entrainent une augmentation de l’activité kinase de la PTK. Ceci prouve son rôle dans l’autoinhibition. (47) A contrario, lors de la phosphorylation du domaine JM et de la partie C-terminale, les changements de forme induits permettent à la boucle d’activation d’adopter une conformation active.

Figure 11 : Modèle général d’auto-inhibition/activation d’un RTK. (47)

a : En l’absence de ligand, le domaine TK (rouge) est maintenu à un niveau basal d’activité à cause des interactions entre le domaine JM (orange) et/ou la partie C-terminale (bleue) avec le domaine kinase. b : Lorsque le ligand (violet) se lie au RTK, il y a dimérisation et transphosphorylation des résidus tyrosines (cercles) dans le domaine JM, la boucle d’activation et la partie C-terminale. c : Après phosphorylation et reconfiguration des segments inhibiteurs, le domaine kinase est activé (vert) et les phosphotyrosines (cercles noirs) sont disponibles pour la liaison aux substrats.

Intracellulaire

Extracellulaire

35

4. Rôle des phosphatases

Les phosphatases catalysent les réactions de déphosphorylation des RTK et les rendent alors inactifs. On distingue deux types de phosphatases : les récepteurs tyrosine-phosphatases (RPTP) et les non récepteurs tyrosine-phosphatases (PTP).

- Les PTP sont localisés dans le cytoplasme ou dans le noyau. La grande majorité a un

seul domaine catalytique sauf SHp1 et Shp2 qui en ont deux. Shp1 est une enzyme phosphatase et contient 2 domaines SH2 en tandem, un domaine phosphatase et une partie C-terminale. Elle se lie à c-Kit sur des résidus tyrosines phosphorylés via son domaine SH2, et les déphosphoryle. Elle agit également en déphosphorylant les protéines kinases phosphorylées par c-Kit. Elle agit uniquement sur les cellules hématopoïétiques et épithéliales. Shp2 a la même structure que Shp1 mais agit sur tous les types cellulaires. Son mode d’action est lui aussi identique. (101)

- Les RPTP sont des protéines membranaires regroupées en famille selon la

conformation de leur domaine extracellulaire. Elles ont toutes deux domaines catalytiques intracellulaires sauf une famille appelée RPTP béta. Cependant le domaine catalytique distal n’a pas ou très peu d’activité. (50)

5. Autres mécanismes régulateurs

La liaison du SCF entraine rapidement l’endocytose de c-Kit, son ubiquitinylation et sa dégradation. L’ubiquitinylation est une modification biochimique nécessitant plusieurs étapes aboutissant in fine à la fixation covalente d’une ou plusieurs protéines d’ubiquitine (8 kDa) sur un ou plusieurs résidus lysine de la protéine substrat. Ces modifications entraînent la dégradation de la protéine ubiquitinée par un complexe enzymatique, le protéasome.

En résumé, les PTK sont finement régulées tout au long de leur vie, depuis la transcription de leur gène jusqu’à leur dégradation. La transcription du gène codant pour les RTK est régulée. Il en est de même pour l’ARNm. D’autre part, la PTK est autorégulée via le domaine JM, la boucle d’activation et la partie C-terminale. Sa régulation est également sous l’influence des phosphatases.

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E. Fonctions

Il a été montré que la phosphorylation des protéines régule différents aspects des fonctions cellulaires tels que la division, le métabolisme, la survie et l’apoptose. Par conséquent, n’importe quel dysfonctionnement dans la phosphorylation peut altérer la fonction cellulaire et être à l’origine de maladies (20). Il s’agit d’un mécanisme finement régulé, par lequel un signal extracellulaire peut être transmis à travers la cellule jusqu’au noyau et ainsi exercer son action sur l’ADN. Voici quelques fonctions des principales protéines tyrosine-kinases :

Tableau I : Résumé des différentes fonctions des protéines tyrosine-kinases.

Protéine kinase Autre désignation Rôle c-Kit CD117 - prolifération, différentiation et migration des cellules souches

- développement de l’hématopoïèse, mélanogénèse et gamétogénèse - croissance et différentiation des mastocytes et des cellules interstitielles de Cajal

PDGF MDGF / GSM - inflammation, angiogénèse - migration et prolifération des cellules mésenchymateuses - développement des reins, du système cardio-vasculaire, du cerveau lors de l’embryogénèse - régulation indirecte des fonctions des cellules endothéliales

CDKs Régulation du cycle et de la division cellulaire EGFRs - survie cellulaire

- angiogenèse - prolifération, différentiation et mobilité cellulaire - inhibition de la mort cellulaire programmée

JAKs Transduction du signal cellulaire depuis les récepteurs cytokines VEGFR 1 VEGFR 2 VEGFR 3

Flt1 Flk1 Flk4

Régulation positive de l’angiogénèse

Famille des Src Contrôle de nombreuses fonctions, notamment l’adhésion cellulaire, la croissance, le mouvement et la différentiation.

PDK-1 - activation de la protéine kinase B - croissance et prolifération cellulaire - protection contre les stimuli pro-apoptotiques - stimulation de la néo-angiogenèse

• c-Kit : L’importance de la protéine c-Kit a été démontrée par des expériences sur des souris

mutantes qui ne l’expriment pas ou qui n’expriment pas le SCF. Ces souris présentent toutes un phénotype particulier caractérisé par une altération de l’hématopoïèse, de la mélanogénèse et de la gamétogénèse. On dénombre donc de nombreuses fonctions à cette protéine :

o Prolifération et différenciation des cellules souches. o Migration des cellules germinales. o Déroulement normal et maintien d’une hématopoïèse, d’une mélanogénèse et

d’une gamétogénèse normale. o Croissance et différenciation des cellules interstitielles de Cajal.

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• Lyn : La protéine Lyn joue un rôle dans la régulation des flux à travers la barrière endothéliale

en phosphorylant la protéine FAK. Contrairement au protéines c-Src et Yes, Lyn n’augmente pas la perméabilité de l’endothélium en réponse aux stimuli inflammatoires notamment le lipopolysaccharide (LPS) mais la stabilise voire limite cette perméabilité. Elle est préférentiellement exprimée par les cellules hématopoïétiques telles que les macrophages, les monocytes, et les plaquettes. Cette protéine a la capacité très particulière de pouvoir réguler positivement ou négativement une information entre les cellules ou au sein même d’une cellule. (51)

• PDGFR : Pour le PDGFR, on peut citer quelques fonctions particulières telles que la cicatrisation,

l’angiogénèse également, mais aussi le développement des reins et du système cardiovasculaire. Il joue d’autre part un rôle dans la migration et la prolifération de cellules mésenchymateuses de différents organes. (110)

• VEGFR : Le VEGFR est quant à lui impliqué dans la régulation de l’angiogénèse. Il est considéré

comme l’inducteur le plus puissant de l’angiogénèse et de la lymphangiogénèse, processus indispensable entre autre à la dissémination dans les nœuds lymphatiques des cellules cancéreuses.

• EGFR : L’EGFR permet, en plus des activités citées précédemment, la mobilité des cellules et

l’inhibition de l’apoptose cellulaire.

• Met (HGFR) : La protéine Met intervient dans la croissance et la différenciation cellulaire ainsi qu’au

niveau de la régénération tissulaire avec la cicatrisation (69). D’autre part, des études ont montré son importance dans la croissance d’une matrice tridimensionnelle de certains types de cellules endothéliales et mésenchymateuses.

Les protéines kinases sont des protéines dont la structure est hautement conservée entre les différentes espèces. Elles occupent une place importante dans la cellule de part leurs différents rôles. Ce sont des protéines finement régulées et leur dérégulation peut avoir de graves conséquences sur le fonctionnement cellulaire et tissulaire. Grâce à la biologie moléculaire, les scientifiques ont pu mettre en évidence leur rôle dans l’apparition de certaines maladies comme les cancers. Nous allons donc étudier comment une PTK contribue à la formation d’un processus cancéreux.

38

II. Implication des protéines tyrosine-kinases en cancérologie

A. Dysfonctionnement des protéines tyrosine-kinases

La dérégulation des tyrosine-kinases peut se faire selon différentes modalités. Il peut

s’agir d’une surexpression des RTK, d’une mutation du gène codant pour les RTK ou d’une stimulation d’une boucle autocrine/paracrine. On peut également avoir formation de protéines fusion et expression inappropriée d’une kinase. Ces différentes anomalies entrainent une activation du RTK ou un renforcement du signal émis par le RTK et donc des conséquences sur la croissance cellulaire mais aussi sur toutes les fonctions dans lesquelles les tyrosine-kinases sont impliquées. Nous allons étudier plus en détail les causes de dysfonctionnement des RTK.

1. Surexpression d’un récepteur tyrosine-kinase

L’amplification des gènes et/ou une surexpression des kinases sont connus pour intervenir dans de nombreux cancers humains. Dans ce cas, le nombre de RTK est supérieur au nombre physiologique. Cela peut être lié à une amplification du gène codant pour le RTK ou à un dysfonctionnement de la dégradation des RTK. L’amplification des gènes peut être due à une augmentation du nombre de copies d’un gène ou être due à une perte de contrôle d’un gène liée à sa translocation proche d’un autre gène hautement exprimé (71).

L’amplification des gènes et/ou la surexpression des RTK sont présents dans de

nombreux cancers humains, ce qui augmente très certainement la réponse des cellules tumorales aux facteurs de croissance. De plus, la surexpression d’un RTK spécifique à la surface cellulaire augmente l’incidence de la dimérisation des récepteurs même en l’absence d’un ligand activateur. Dans de nombreux cas, cela aboutit à l’activation constitutive des RTK, ce qui provoque une prolifération exagérée et incontrôlée des cellules et donc la formation d’une tumeur. Un exemple important de ce type de scénario est la protéine HER2, aussi connue sous le nom de ErbB2, qui appartient à la famille des EGFR. Une surexpression est présente lors de cancer du sein chez la femme, ainsi que lors de carcinome ovarien (126, 71).

2. Mutation du gène codant pour un récepteur tyrosine-kinase

Les altérations génétiques représentent un mécanisme important lors de la dérégulation des protéines kinases. Celles-ci incluent des délétions, des insertions, des substitutions et des mutations dans le domaine extracellulaire mais aussi des altérations du domaine catalytique, le plus souvent au niveau du site de liaison de l’ATP. Ces changements dans la séquence d’acides aminés peuvent entraîner des changements de forme de la molécule et des modifications de son activité. Chez l’homme, le mutant EGFRvIII ne possède pas les acides aminés 6 à 273 dans son domaine extracellulaire. Ceci induit une activation du RTK et engendre une prolifération cellulaire sans liaison au ligand. On retrouve ce mutant dans les glioblastomes, les tumeurs ovariennes, le cancer du poumon non à petites cellules et les carcinomes mammaires. (126)

39

Il existe différents types de mutations des protéines, classées en fonction des conséquences sur l’activité de la protéine ou en fonction de leur localisation sur la protéine.

- On parle de mutation « gain of function » si l’activité de la protéine est augmentée par rapport à une protéine normale ou de mutation « loss of function » si l’activité de la protéine est diminuée par rapport à la protéine normale.

- Longley et al. (76) proposent quant à eux une classification qui distingue les deux types de mutations qui permettent d’activer la protéine c-Kit. Le premier groupe est le type de mutation « poche enzymatique ». Il est incarné par la substitution Asp816Val, caractéristique des mastocytoses adultes et qui affecte la boucle d’activation juste à l’entrée de la poche d’activation. (fig. 12) L’autre groupe, appelé « régulation », affecte les portions de la molécule régulant l’activité kinase de c-Kit. Par exemple, une hélice alpha amphipatique, découverte dans la région juxtamembranaire intracellulaire de c-Kit, supprime l’activité kinase et l’activité de phosphorylation lorsque le ligand n’est pas fixé à c-Kit, et régule ainsi son activité.

Cette classification a des implications thérapeutiques. On peut ainsi prévoir la réponse à un inhibiteur de tyrosine-kinase (ITK) en fonction du type de mutation car chaque ITK agit préférentiellement sur un type de mutation. Par exemple, l’imatinib inhibe seulement les cellules avec une mutation de type « régulation » qui affecte le domaine JM. Il n’est donc pas efficace sur les mastocytoses adultes qui elles, présentent une substitution au codon 816. (76)

Figure 12 : Exemple d’un monomère de c-Kit traversant la membrane cellulaire. (76) Cette figure présente un monomère de c-Kit traversant la membrane plasmique. Les exons codant les régions spécifiques sont inscrits sur la gauche. Les cinq domaines immunoglobuliniques formant le site de liaison du ligand sont extracellulaire. L’hélice juxtamembranaire, la poche enzymatique et la boucle d’activation sont en partie intracellulaire. Les rectangles représentent des deux parties du domaine split kinase et l’étoile correspond au site enzymatique. Les mutations spécifiques sont indiquées en regard des régions correspondantes. Les pathologies ou lignées cellulaires associées à ces mutations sont inscrites entre parenthèses.

Domaineextracellulaire

Muta0onsdec-Kit

MembranePlasmique

Hélicejuxtamembranaire

Pocheenzyma0que/Boucled’ac0va0on

Domaineintracellulaire

40

3. Boucle autocrine/paracrine

Une boucle autocrine est caractérisée par l’expression du RTK et du ligand par une même cellule, et une surexpression de l’un des deux. Une boucle paracrine est, elle, caractérisée par une surexpression du RTK dans une cellule et la présence du ligand synthétisé par une cellule voisine. Les deux boucles entraînent une augmentation de l’activité des RTK, et de ce fait une transformation tumorale des cellules impliquées. Quelques exemples : chez l’homme, la boucle autocrine de l’EGFR et de son ligand TGF-alpha est impliqué dans le développement de glioblastomes. Chez le chien, la boucle autocrine de HGFR et de son ligand HGF est responsable du développement d’ostéosarcomes. La boucle autocrine de c-Kit est retrouvée dans les hémangiosarcomes chez le chien. (71,126)

4. Formation de protéines fusion

Les kinases peuvent être dérégulées par la formation de protéines fusion. Dans ce cas, une portion d’un gène (généralement la portion codant pour la partie kinase) se lie à un autre gène. Ceci entraine une perte de régulation de la protéine. Chez l’homme, on peut citer, par exemple, la protéine fusion Bcr-Abl, retrouvée chez 90% des patients atteints de leucémie myéloïde chronique. Cette protéine fusion résulte de la translocation des bras longs des chromosomes 9 et 22. La protéine Abl a une activité catalytique excessive et entraîne la transformation maligne des cellules. (71)

5. Expression inappropriée d’une kinase

Cette dernière catégorie implique une expression inappropriée d’une kinase. Dans ce cas, le tissu normal n’exprime pas la protéine kinase mais le tissu néoplasique correspondant l’exprime. Il existe de nombreux exemples dans la littérature, les plus connus étant la protéine c-Kit et le cancer du poumon non à petites cellules chez l’homme ainsi que la protéine Met et le cancer de la thyroïde. Dans certains cas, l’expression inappropriée d’une kinase est corrélée avec un mauvais pronostic, bien que les effets biologiques d’une telle expression inappropriée ne soient pas toujours connus. (71)

6. Conséquences : activation constitutive des protéines tyrosine-kinases

Les conséquences de ces anomalies sont une perte de contrôle des tyrosine-kinases, ou leur autophosphorylation, responsables d’une augmentation de leur activité sans nécessiter la fixation du ligand. Il en résulte une stimulation de la croissance cellulaire et une augmentation de la survie des cellules.

41

En résumé, l’activité des PTK peut être dérégulée de différentes manières. Le gène peut présenter une anomalie (surexpression, mutations ou translocation entrainant la formation de protéine fusion). La PTK peut également s’exprimer dans un tissu dans lequel elle n’est pas normalement exprimée. Des boucles autocrine/paracrine sont également possibles. Tout ceci provoque une activation constitutive de la PTK, ce qui entraîne une stimulation de la croissance et de la survie cellulaire, et donc une transformation néoplasique de la cellule.

B. Intérêt pronostique des tyrosine-kinases

1. Chez le chien

Nous allons prendre comme exemple l’intérêt pronostique de la protéine c-Kit dans le cas des mastocytomes chez le chien. Le mastocytome cutané est une tumeur issue de la prolifération néoplasique de mastocytes dermiques et/ou sous-cutanés. Les mastocytomes sont principalement cutanés (origine dermique d’abord mais aussi sous-cutanée), mais il en existe aussi sous forme viscérale, atteignant le foie, la rate et les intestins. Le mastocytome est la première tumeur cutanée du chien (10-20%) ainsi que le premier cancer cutané (15 à 25% des tumeurs cutanées malignes chez le chien). Actuellement, le pronostic du mastocytome est basé sur le grade histologique déterminé par Patnaik, sur le stade clinique de la maladie et sur les différents marqueurs tels que le Ki-67.

Le système de classement par « grading » des tumeurs, comme celui de Patnaik, constitue le facteur pronostic le plus unanimement utilisé de nos jours. Ainsi, un chien atteint de mastocytome de bas grade aura un temps de survie plus élevé, moins de chances de récidive et un temps de rémission plus élevé qu’un animal atteint par des grades plus élevés et ce quel que soit le plan thérapeutique. L’ensemble des études s’intéressant au lien entre grading de Patnaik et pronostic est présenté dans le Tableau II. Quant au nouveau système de grading dit « à deux niveaux », très peu d’articles sont à l’heure actuelle parus sur le sujet mais il est facile d’imaginer qu’avec la simplification de classement qu’il apporte, les conséquences pronostiques qui en découlent seront elles aussi plus simples ; de fait, ce système s’affranchit du grade intermédiaire dont le comportement biologique est incertain, comparé aux tumeurs de bas grade et de haut grade pour lesquelles le pronostic est prédit de manière plus fiable.

Pour s’affranchir de ces variabilités inter-grades et intra-grades, il est possible de compléter l’analyse par des facteurs quantitatifs permettant donc d’objectiver un pronostic par des valeurs numériques précises (Tab. III).

Comme vu auparavant, l’index mitotique (IM) est une composante du nouveau système de classification « à deux niveaux » et permet donc de prédire le devenir des animaux atteints, quel que soit le grade. En effet, il a été vu que des chiens avec des tumeurs dont l’IM était inférieur ou égal à 5 pour 10 hpf avaient une durée de survie bien supérieure à des chiens avec un IM supérieur (70 mois contre 2 mois). (100) D’autres études avec des

42

valeurs seuil à 7, voire 10, s’accordent elles aussi sur la même conclusion. (14, 15) Le lien avec une probabilité de récidive n’a pas encore été clairement démontré même si Kiupel, dans son nouveau système de grading, présente l’ensemble comme prédictif par rapport à la réapparition de tumeurs. (55)

Tableau II : Grading de Patnaik comme facteur pronostique. (2, 13, 80, 90, 94)

Le facteur « grading » reste un élément pronostique très fiable. Sa seule limite repose dans le fait que le classement dépend clairement de la subjectivité du pathologiste qui analyse la lame histologique. On peut donc avoir une variabilité dans la classification ayant pour conséquence un pronostic parfois biaisé.

L’index AgNOR peut aussi être analysé comme facteur pronostique par rapport au caractère récidivant et au potentiel métastatique et plus récemment en relation avec le taux de survie. (49) Des auteurs ont fixé une valeur seuil à 2,25 par cellule au-dessus de laquelle le pronostic est plus sombre. En outre, cet index n’est pas indépendant du grade histologique et ne peut être interprété qu’en parallèle d’une histologie qualitative. Par ailleurs, même si ce facteur peut présenter de grandes variabilités notamment dues à sa méthode de détection, une nouvelle technique de mise en évidence de ces antigènes a été proposée, qui possède de meilleures sensibilité et spécificité et donc un pronostic plus fin. (49)

L’index PCNA est considéré dans la littérature comme un facteur pronostique associé à des valeurs d’index élevées, pour les tumeurs récidivantes et à potentiel métastatique. (2, 112) Même si cet élément apparaît comme un résultat pronostique prometteur, il reste encore beaucoup de travail afin d’adapter la technique pour diminuer sa variabilité. En pratique,

43

l’index Ki-67 est devenu le facteur le plus utilisé en routine car il est d’utilisation facile et donne une information pronostique pour de nombreux mastocytomes, et notamment ceux de grade intermédiaire pour lesquels la valeur pronostique de l’histologie conventionnelle est insuffisante. Un index bas serait donc corrélé, indépendamment du grade, avec des taux de survie et de rémission importants, tout comme leur durée. Abadie, dans son étude de 1999, fixe d’ailleurs l’index à 9,3% comme seuil au-dessus duquel les mastocytomes de grade II sont de moins bon pronostic (37% des chiens en vie à 1 an contre 88% si l’index est inférieur). Une autre étude réfute cette hypothèse et ne trouve pas de valeur pronostique à cet index, recommandant donc l’utilisation conjointe du facteur PCNA. Des études récentes ont, de même, tenté d’établir un lien entre pronostic et d’autres protéines jouant un rôle dans le cycle cellulaire tumoral comme la p53 ou la p27 et la p21 mais n’ont pas apporté des preuves assez précises pour conclure sur des résultats intéressants utilisables en routine de diagnostic. (52)

Finalement, afin de déterminer un traitement adapté à la tumeur, il est essentiel de connaître son pronostic. Dans le cas du mastocytome, des études ont permis de montrer que plusieurs facteurs permettent d’affiner son pronostic : une mutation de c-Kit (particulièrement une ITD), la localisation anormale de c-Kit, un Ki-67 et un AgNOR élevés, et un grade histologique élevé. Afin d’affiner l’évaluation, il est nécessaire d’utiliser ces marqueurs conjointement.

2. Chez l’homme

La famille EGFR est très étudiée, et de nombreuses études (79) ont montré que la surexpression du RTK HER1 est associée à un pronostic réservé dans les cancers de l’ovaire, de l’œsophage, cervical, de la vessie, du colon, de l’estomac et de l’endomètre. La surexpression du RTK HER2 est associée à un mauvais pronostic dans les cancers du sein, de l’ovaire, de la prostate, des os et du poumon. Dans le cancer du poumon à petites cellules et les GIST, l’expression de c-Kit est à relier avec un mauvais pronostic. De même, une mutation du VEGFR a été associée à un mauvais pronostic dans les cancers du poumon et du côlon ainsi que dans les cancers du sein.

44

Tableau III : Marqueurs moléculaires liés à la prolifération et utilisables comme facteurs pronostiques pour les mastocytomes cutanés canins.

(2, 14, 49, 60, 106, 112, 119)

45

C. Quelques exemples de tyrosine-kinases impliquées dans le développement de cancers

1. Le PDGFR

La famille des PDGF, qui appartient au type III des RTK, est composée de cinq isoformes dont 4 homodimères polypeptidiques A‐, B‐, C‐, et D‐, appelés PDGF‐AA, ‐BB, ‐CC, et ‐DD, et d’un hétérodimère PDGF‐AB.

Figure 13 : Représentation schématique du récepteur au PDGF béta activé et ses

seconds messagers. (117) La liaison avec son ligand induit la dimérisation et l’autophosphorylation du récepteur PDGF. Les tyrosines phosphorylées servent alors de site de liaison pour les domaines SH2 de nombreuses protéines. Les protéines adaptatrices sont placées à gauche et les protéines enzymatiques à droite.

46

Ces cinq isoformes exercent leur activité en se liant aux protéines kinases à structure identique : les PDGFR alpha et béta. La dimérisation des PDGFR, induite par la liaison du ligand, les active. Les PDGF A, B, C se lient au PDGFR alpha, tandis que les PDGF B et D se lient au PDGFR béta. Les dimères formés sont différents en fonction du ligand qui se lie mais également en fonction du type cellulaire qui exprime le récepteur. (93)

Figure 14 : Superposition structurale du PDGFRA avec c-Kit et FLT3.

PDGFRA, c-Kit et FLT3 sont respectivement représentées en turquoise, jaune, et magenta. Ces trois molécules sont toutes représentées dans leur conformation inactive. (66)

Les GIST sont des tumeurs dérivées des cellules intestinales de Cajal du tractus gastro-intestinal. La localisation la plus commune se trouve dans l’estomac. L’altération la plus fréquemment retrouvée lors des GIST est la mutation de la protéine c-Kit pour 85% des cas. La dérégulation du PDGFR alpha a été décrite dans de nombreuses tumeurs et des « mutations activatrices » ont été retrouvées dans 5 à 12% des GIST. Seules quelques mutations telles que la V561D sont sensibles aux ITK (Imatinib et Sunitinib) alors que la mutation D842V, mutation la plus courante, est résistante à ces molécules. Ce mécanisme de résistance est toujours inconnu. Par ailleurs, on note une implication d’une translocation de nucléotides au niveau du gène codant pour le PDGFR béta dans quelques rares tumeurs de la peau (Dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) et juvenile giant cell fibroblastoma (GCF))

Le PDGFR joue également un rôle majeur dans l’angiogénèse via le recrutement des péricytes vasculaires et la formation des métastases. Cette formation de métastases comprend la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) de cellules épithéliales malignes, la lymphangiogénèse, l’altération de la vascularisation tumorale qui devient perméable à l’extravasion de cellules tumorales, ainsi que les interactions entre le microenvironnement et les cellules malignes. (93)

Boucled’ac+va+on

47

Figure 15 : Implication du PDGF dans les métastases tumorales. (93)

Le PDGF aide à la migration et à l’invasion de certaines cellules tumorales (1), et aide aussi à leur dispersion via les vaisseaux lymphatiques (3). D’autre part, le PDGF peut promouvoir la couverture des péricytes des vaisseaux sanguins, et ainsi prévenir l’absorption des cellules

tumorales et leur dispersion via le sang (2).

Par ailleurs, le PDGF semblerait impliqué dans la formation et la progression des lymphomes T chez le chien. En effet, des études expérimentales ont montré qu’une expression concomitante des PDGF et des PDGFR par les mêmes cellules tumorales permet la progression de la tumeur grâce à la création d’une boucle autocrine. (41)

D’autres études sont nécessaires afin de savoir si c’est un événement primordial ou favorisant le développement des lymphomes T, et si le PDGF B et les PDGFR sont potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques. (6)

2. La protéine Met

Le récepteur tyrosine-kinase Met, également nommé récepteur du facteur de

croissance des hépatocytes (HGFR) joue un rôle important dans la stimulation de la croissance cellulaire, la diminution de l’apoptose, l’altération des fonctions du cytosquelette, les métastases, ainsi que dans d’autres changements biologiques. Le ligand du récepteur c-Met est la protéine HGF, encore connue sous le nom de facteur de dispersion.

Met est surexprimée et mutée dans de nombreuses maladies, au cours desquelles les

mutations germinales sont les plus intéressantes. La plupart de ces mutations sont retrouvées au niveau de la partie juxtamembranaire, le domaine tyrosine-kinase et la partie sémaphorine. Les mutations « gain of function » provoquent des dérégulations ou une prolongation de l’activité tyrosine-kinase qui joue un rôle dans son activité de transformation. (104)

48

Figure 16 : L’HGF, un facteur mitogène, motogène, morphogène, et angiogénique. (53)

Lors de la formation de la protéine Met, un précurseur de 190 kDa est glycosylé puis clivé en une chaine alpha de 50 kDa et une chaine béta de 140 kDa, liées par un pont disulfure. La protéine Met mature est un hétérodimère qui consiste donc en une sous-unité alpha hautement glycosylée et entièrement extracellulaire, ainsi qu’une sous-unité béta avec une large région extracellulaire, un segment transmembranaire et un domaine tyrosine-kinase intracellulaire.

Figure 17 : Représentation de la structure et des domaines fonctionnels de c-Met. (84)

Le HGF ou facteur de dispersion (=Scatter factor SF) a été originellement identifié comme un mitogène potentiel. De sa purification résulte un hétérodimère relié par un pont disulfure, contenant une sous-unité alpha de 62 kDa et d’une sous-unité béta de 34 kDa. Des mutations de c-Met, une surexpression de c-Met et/ou de HGF/SF, et l’expression de c-Met et de HGF/SF par la même cellule peuvent contribuer à la formation de tumeurs.

MitogénèseMotogénèse An

giogén

èse

Morphogénèse

49

Figure 18 : Mécanisme de la signalisation de c-Met et de la formation de métastases lors

de tumeurs solides. (84)

On sait de plus que c-MET est surexprimée dans des carcinomes du poumon, du pancréas, de la thyroïde, du côlon, de l’estomac et aussi dans des glioblastomes. Environ 50% des carcinomes papillaires de la thyroïde présentent une surexpression de cMET, à laquelle est associé un pronostic défavorable (Suárez et al., résultats non publiés).

3. La protéine Lyn

Lyn appartient à la famille des Src. Deux isoformes de la protéine existent résultant d’un épissage alternatif (via l’exon 2) de l’ARNm : Lyn A (p56 kDa) et Lyn B (p53 kDa), qui diffèrent de 20 acides aminés dans le domaine SH4 qui comprend un motif pY (pY32).

La protéine Lyn joue un rôle dans la régulation des flux à travers la barrière

endothéliale en phosphorylant la protéine FAK et participe au maintien de l’intégrité et de la résistance de la membrane endothéliale. Cette fonction est réalisée par la phosphorylation de la protéine FAK sur les résidus tyrosine 576/577 et 925.

Contrairement aux protéines c-Src et Yes, Lyn n’augmente pas la perméabilité de l’endothélium en réponse aux stimuli inflammatoires notamment le lipopolysaccharide (LPS) mais la stabilise voire limite cette perméabilité.

Cancerdupoumon(Tumeurprimaire)

ce

Cellulesépithéliales

VoieIntegrines

Voiec-Met/HGF

ayCCerveau

Foie

Squele>e

Moelleosseuse

Cellulestumoraleset

«métastases»

Intégrinec-Met/HGF&

AutresmoléculesdetransducEon

Cellulestumorales

Vaisseausanguin CellulesendothélialesFibroblastes

Transforma7oncellulaireMo7litéDiffusionMigra7onInvasion

Metastases

50

Figure 19 : Représentation de la structure et des voies de signalisation de la protéine

Lyn. (51) A) Schéma de l’architecture de Lyn.

B) Schéma des voies de régulation positives et négatives de Lyn grâce à la phosphorylation de molécules.

Elle est préférentiellement exprimée par les cellules hématopoïétiques telles que les macrophages, les monocytes, et les plaquettes. (40)

De nombreuses études prouvent l’implication majeure et le rôle important de la protéine Lyn dans plusieurs types de leucémies et de lymphomes, surtout dans la leucémie myéloïde chronique (CML), la leucémie myéloïde aiguë (AML), la leucémie lymphocytaire chronique (CLL), la leucémie lymphoblastique aigüe de type B (B-ALL), la leucémie lymphocytaire B chronique (B-CLL), et les lymphomes non Hodgkiniens de type B (B-NHL).

Récemment, Lyn a été identifiée comme étant impliquée dans des troubles myélo-prolifératifs. Lyn est également retrouvée lors de cancer de la prostate, du colon, de glioblastomes, et lors de tumeurs de la vessie. (51)

4. Le VEGFR

Les récepteurs du VEGF sont les protéines tyrosine-kinases Flt-1 (VEGFR-1), KDR (Région du Domaine Kinase, VEGFR-2) et Flt-4 (VEGFR-3).

Ces trois récepteurs possèdent sept domaines immunoglobuline (Ig)-like dans le domaine extracellulaire, une simple région transmembranaire, et un domaine Tyrosine Kinase (TK) interrompu par un domaine d’insertion kinase.

Leur structure les place dans le type V des tyrosine-kinases. (33, 34)

Régula'onposi've

Régula'onnéga've

51

Figure 20 : Les différents VEGF et leurs VEGFR. (111)

Tableau IV : Résumé des interactions de plusieurs membres de la famille des VEGF avec 3 VEGFR connus. (33)

VEGFR-1 (Flt-1) VEGFR-2 (Flk-

1/KDR) VEGFR-3 (Flt-4)

VEGF-A Oui Oui Non

VEGF-B Oui Non Non

VEGF-C Non Oui Oui

VEGF-D Non Oui Oui

VEGF-E Non Oui Non

PIGF Oui Non Non

Figure 21 : Représentation schématique du mécanisme d’activation des VEGFR. (114)

Le VEGF sous forme de dimère (liaison covalente) en vert se lie au VEGFR (bleu) ce qui entraîne la dimérisation de deux récepteurs monomériques. D’autres interactions supplémentaires entre les domaines immunoglobulines 4 et 7, les domaines transmembranaires et les domaines juxtamembranaires (bleu foncé) stabilisent le complexe VEGF-VEGFR ce qui provoque une activation de la kinase et une autophosphorylation des résidus tyrosine nécessaires pour le signalement en aval.

Sitedeclivage Membrane

cellulaire

DomaineTyrosinekinase

52

In situ, des études d’hybridation ont montré que l’ARNm du VEGF est nettement régulé dans la plupart des tumeurs humaines étudiées, à savoir les tumeurs concernant les organes suivants : les poumons, la thyroïde, le sein, le tractus gastro-intestinal, le rein et la vessie, les ovaires et les carcinomes utérins, les angiosarcomes et de nombreuses tumeurs intracrâniennes. La présence du VEGF dans les tumeurs est corrélée avec le développement des vaisseaux, des métastases dans les nœuds lymphatiques ainsi que dans le foie. De plus, les patients pour lesquels le VEGF est détecté dans leur tumeur présentent un pronostic plus sombre que ceux pour lesquels le VEGF n’a pas été mis en évidence. (34)

III. Les inhibiteurs de tyrosine-kinases

Nous avons vu précédemment que de nombreux cancers sont associés à une dérégulation d’une ou plusieurs tyrosine-kinases. La stratégie thérapeutique consiste donc à cibler ces protéines et à inhiber leur action. À partir de structures de base comme celles des anilino-quinazolines, de nombreux composés ont été synthétisés avec l’aide de la cristallographie des tyrosine-kinases, ce qui a permis d’optimiser les interactions protéine-ligand. Les domaines catalytiques de toutes les kinases possèdent une structure tridimensionnelle comparable, ce qui explique qu’il est souvent difficile d’isoler des molécules spécifiques d’une tyrosine kinase précise.

De nombreux ITK ont déjà prouvé leur efficacité chez l’homme. Certains d’entre eux sont aujourd’hui à l’étude chez le chien. Cette famille de composés est appelée à une extension majeure dans les années qui viennent et plusieurs dizaines de molécules sont actuellement en essais cliniques chez l’homme.

Figure 22 : Mécanisme d’action des inhibiteurs des tyrosine-kinases. (85) Les inhibiteurs de tyrosine-kinases se fixent de manière compétitive sur les sites de liaisons de l’ATP bloquant ainsi l’activation des sites tyrosine-kinases et la signalisation cellulaire en aval.

53

Un inhibiteur des tyrosine-kinases optimal doit avoir plusieurs caractéristiques particulières. Absorption, distribution, métabolisme, excrétion et toxicité (ADMET) sont autant d’éléments à prendre en compte afin d’optimiser au mieux l’utilisation in vivo de la molécule. Basés sur ces conditions, de nombreux challenges sont à surmonter afin de trouver un inhibiteur efficace. La perméabilité membranaire, l’inactivation de la molécule par le métabolisme, une diminution de son activité causée par des interactions avec d’autres composants intracellulaires ou son excrétion rapide, sa toxicité et son étroite distribution représentent les problèmes majeurs rencontrés lors des études. (46)

Figure 23 : Inhibition des RTK par les ITK. (46)

Ce blocage prévient la phosphorylation du domaine TK du récepteur et empêche ainsi la prolifération, la différenciation, la migration et la survie cellulaire et provoque l’apoptose de

la cellule. Les groupements phosphates sont en jaune. Chez le chien, deux ITK font l’objet d’une AMM à l’heure actuelle : il s’agit du Masivet® (masitinib) et du Palladia® (toceranib). Des études sur d’autres ITK sont en cours. A contrario, chez l’homme une dizaine d’ITK possèdent une AMM.

Proliféra)on,Différen)a)onMigra)on,Survie

Apopotoseetmortcellulaire

DomaineTK ITK

RTKac)ve RTKinhibéeparlesITK

Tran

sduc)o

ndu

signal

Préven

)onde

la

tran

sduc)o

ndu

signal

54

A. Les inhibiteurs de tyrosine-kinase ayant une AMM chez le chien

1. Le masitinib (Masivet®)

Le Masivet® a obtenu l’AMM en novembre 2008 pour le traitement des mastocytomes cutanés de grade 2 ou 3, non opérables ou récidivants après chirurgie sans atteinte métastatique et avec mutation de la protéine c-Kit. Il a été commercialisé par le laboratoire AB Science en 2009. Il s’agit du premier anticancéreux commercialisé en médecine vétérinaire.

a. Structure Le masitinib mesylate est le sel de mesylate biodisponible par voie orale.

Le masitinib est le 4-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]-N-[4-methyl-3-[(4-pyridin-3-yl-1,3-thiazol-2 l)amino]phenyl] benzamide.

Figure 24 : Formule chimique du masitinib. (1)

b. Cibles

La masitinib agit à la fois sur des RTK et sur des NRTK. Il exerce principalement une

forte inhibition sur (78) : - Le récepteur c-Kit (c-KitR) - Le PDGFR alpha et beta (Platelet Derived Growth Factor alpha/beta) - Le FGFR3 (Fibroblast Growth Factor 3) - La protéine Lck/Lyn (LYn) - Légèrement sur la protéine FAK (Focal Adhesion Kinase) - La protéine Lck (Lymphocyte-specific kinase)

L’IC50 (concentration inhibitrice à 50%) d’un ITK correspond à la concentration

nécessaire pour inhiber 50% de l’activité d’une tyrosine-kinase. Elle permet de mesurer l’efficacité d’un ITK. En effet, plus l’IC50 est faible, plus l’ITK est efficace. Voici un tableau regroupant les IC50 du masitinib sur les TK :

55

Tableau V : IC50 du masitinib sur différentes tyrosine-kinases. (29, 64)

Tyrosine-kinases IC50 (µM) c-Kit 0,20 LYN 0,5

PDGFRα 0,54 PDGFRβ 0,80

ABL 1,20 FMS 1,48 SRC 1,9

TRK B 10 ALK 10 FLT3 >10

VEGFR1 >10 VEGFR2 >10

EGFR >10 FGFR1 >10 FGFR3 >10 IGF1R >10 MET >10 RET >10 FAK >10 PYK2 >10 JAK1 >10 JAK2 >10 JAK3 >10 TYK2 >10 BTK >10 BMX >10 SYK >10

On voit ainsi que le masitinib est un inhibiteur très spécifique de c-Kit. In vitro, son

affinité et sa spécificité pour la protéine c-Kit sont meilleures que celles de l’imatinib. Sa forte spécificité permet de limiter les effets secondaires.

c. Mode d’action

Le masitinib se lie au site de liaison de l’ATP empêchant ainsi la phosphorylation de

la protéine en la bloquant dans sa conformation inactive. Il a une affinité supérieure à celle de l’ATP.

56

Tableau VI : Les tyrosine-kinases cibles du masitinib. (1)

Cibles majeures Récepteurs tyrosine-kinases

c-Kit chez le chien d Kit WT ++ d Kit EC exon 8 +++ d Kit EC exon 9 ++ d Kit JM exon 11 +++ c-Kit chez l’homme h Kit WT ++ h Kit EC exon 9 ++ h Kit EC exon 8 ++ h Kit JM exon 11 +++ h Kit TK1 exon 13 +++ h Kit TK2 exon 17 - c-Kit chez la souris m Kit WT ++ m Kit JM exon 11 +++ PDGFR FIP1L1-PDGFRα +++ PDGFRα WT ++ PDGFRβ WT +++

Kinases cytoplasmiques LynB ++ Fyn ++ Lck +++

Cibles de faible affinité Récepteurs tyrosine-kinases

fms* + FGFR3 WT + FGFR2 K650E +

Kinases cytoplasmiques SYK + SRC + p210 Bcr-Abl -

+++ : très forte inhibition ++ : forte inhibition + : légère inhibition - : inhibition insignifiante aux concentrations thérapeutiques

57

Ø Action sur la protéine c-Kit :

Le masitinib inhibe la phosphorylation des différentes isoformes de la protéine c-Kit : c-Kit non mutée (WT, 145 kDa) et c-Kit mutée (125 kDa) pour laquelle les mutations sont présentes sur les exons 8 et 9 au niveau du 5ème domaine extracellulaire, sur l’exon 11 dans le domaine JM ainsi que sur l’exon 17 du domaine kinase. Ce sont les mutations les plus retrouvées lors de mastocytome. (1, 82)

La prolifération des cellules tumorales mastocytaires est alors inhibée. En effet, le masitinib induit un arrêt du cycle cellulaire et une apoptose des cellules dépendantes de la voie de signalisation de c-Kit. Le masitinib a donc une action antiproliférative et pro-apoptotique sur les mastocytes tumoraux via son inhibition de la protéine c-Kit.

Figure 25 : Le réseau de signalisation induit par l’activation de c-Kit dans les

mastocytes. (82)

Ø Action sur le système Lyn/FAK :

La protéine Lyn est une protéine de la famille des Src exprimée essentiellement dans le tissu nerveux et surtout dans les cellules hématopoïétiques. La protéine Lyn active la protéine NRTK FAK qui active la dégranulation des mastocytes dépendante des immunoglobulines E. Cette protéine FAK est impliquée dans l’adhésion, l’invasion, la formation de métastases ainsi que dans la résistance à certaines chimiothérapies. (51, 92)

Lyn est surexprimée dans un certains nombre de cancers, notamment dans les leucémies myéloïdes chroniques, les leucémies, les lymphomes ainsi que dans certaines tumeurs solides telles que les glioblastomes, les tumeurs du colon et de la prostate.

58

En bloquant la protéine Lyn, le masitinib permet de limiter la formation de métastases et l’apparition de résistance aux chimiothérapies. Il permet également d’empêcher la dégranulation des mastocytes.

Ø Action sur le PDGFR :

En agissant sur les PDGFR, le masitinib a une action anti-tumorale, anti-angiogénique et permet de resensibiliser la tumeur aux agents de chimiothérapie. En effet, il a été montré que l’inhibition du PDGFR béta réduit la pression interstitielle intra-tumorale et augmente ainsi l’assimilation des agents de chimiothérapie. Voici un tableau résumé des différentes actions du masitinib dans différentes maladies :

Tableau VII : Principaux rôles du masitinib lors de différentes pathologies. (92)

Cibles Actions Maladies potentiellement traitées

c-Kit, PDGFR, Lyn/FAK Inhibition des tyrosine-kinases

Mastocytome, Lymphome à cellule T, Mélanome,

Hémangiosarcome splénique PDGFR, Lyn/FAK Potentialise les effets des

agents de chimiothérapie Tumeurs traitées par

chimiothérapie Mastocytes via c-Kit/Lyn Inhibition de l’activation des

mastocytes Dermatite atopique, arthrite,

asthme, MICI

d. Pharmacocinétique

Le masitinib présente une bonne disponibilité par voie orale de 83% avec une large

distribution dans tout le corps et une élimination rapide (on ne détecte seulement que des traces 24 heures après exposition). Le masitinib est fortement lié aux protéines plasmatiques (93%) et son excrétion est majoritairement intestinale (90%). Huit métabolites sont retrouvés dans les fèces et jusqu’à douze métabolites sont retrouvés dans les urines. Sa concentration augmente proportionnellement lorsque les doses d’administration augmentent.

e. Protocole

Voici le protocole recommandé dans le cadre de l’AMM : La posologie proposée est de 12,5 mg/kg une fois par jour per os. Le Masivet® est conditionné en boite de 30 comprimés de 50 mg ou 150 mg. (1) En fonction des effets adverses rencontrés, le traitement peut être interrompu, réduit à 9 mg/kg/jour ou 6 mg/kg/jour ou arrêté transitoirement.

59

Un arrêt définitif doit être entrepris en cas de : - hausse anormale des facteurs rénaux - anémie hémolytique non régénérative - une neutropénie sévère et/ou une diarrhée sévère, et/ou des vomissements sévères

persistant après diminution de la dose journalière. Lorsque la maladie se stabilise, le traitement doit être poursuivi. Il est vivement recommandé de réaliser un suivi régulier et fréquent des fonctions rénales et hépatiques.

f. Efficacité sur les mastocytomes (36, 113)

Selon les critères VCOG (référence dans le VCO, Annexe 2) : - Une réponse complète est définie par une disparition des signes de la maladie

évalués à au moins 3 semaines d’intervalle. - Une réponse partielle est définie par une réduction supérieure à 30% de la somme

des diamètres les plus longs des lésions cibles mesurée à au moins 3 semaines d’intervalle. - Une maladie est qualifiée de stable lorsque la maladie ne progresse pas. - Une progression de la maladie est définie par une augmentation d’au moins 20% de

la somme des diamètres des lésions cibles, de la progression de lésions non cibles ou de l’apparition de nouvelles lésions.

- Une maladie contrôlée correspond à une réponse complète, partielle ou une maladie stable.

- Le TTP correspond à la durée entre le 1er jour de traitement et le jour où la maladie progresse.

Deux études ont été menées en parallèle par Hahn et al. sur ce sujet : une étude sur 202 chiens de races différentes évalue l’efficacité du masitinib pendant 6 mois (39), alors que l’autre évalue le taux de survie à 12 et 24 mois après le début du traitement sur 132 chiens de l’étude précédente (38). Ces chiens présentaient un mastocytome cutané de grade 2 ou 3, non opérable ou récidivant après chirurgie, sans atteinte métastatique. Ces études ont permis de montrer que :

- Le masitinib induit une bonne réponse tumorale (réponse complète ou partielle). En effet, au bout de 6 mois, on a 50% de réponse (n=161) au masitinib contre 29% de réponse (n=41) au placebo, n étant le nombre de chiens (p=0,020).

- Le masitinib retarde la progression de la tumeur quelque soit le statut de c-Kit (mutée ou non). La chirurgie reste l’option thérapeutique de choix lorsqu’elle est possible. Cependant lorsque la tumeur n’est pas opérable, le masitinib retarde significativement la progression de la tumeur (TTP de 173 jours contre 75 jours ; p=0,001). Par ailleurs, le TTP est amélioré sur les mastocytomes dont la protéine c-Kit est mutée (241 jours contre 83 jours ; p=0,002) ou non mutée (140 jours contre 75 jours ; p=0,027) (38 et 39).

Son action sur les mastocytomes peut s’expliquer par l’affinité du masitinib pour la forme sauvage de c-Kit. L’inhibition de c-Kit entraîne alors une baisse de la prolifération des mastocytes même si l’événement oncogénique se situe sur une autre molécule que c-Kit.

60

Figure 26 : TTP de chiens traités avec du masitinib et le placebo. (39)

(A) TTP médian pour tous les chiens de l’étude recevant le masitinib (trait plein) ou le placebo (pointillés). (B) TTP médian pour les chiens recevant en traitement de première ligne le masitinib (trait plein) ou le placebo (pointillés). (C) TTP médian pour les chiens recevant le traitement de première ligne en fonction de l’absence (pointillés) ou de la présence (trait plein) d’une mutation de c-Kit. Les lignes épaisses représentent les chiens recevant le masitinib et les traits fins ceux recevant le placebo. (D) TTP médian pour les chiens qui reçoivent en traitement de seconde ligne (ou plus) en fonction de l’absence (pointillés) ou de la présence (traits pleins) d’une mutation de c-Kit.

- Le masitinib augmente le temps de survie : 617 jours contre 322 jours dans le groupe placebo (p=0,121). (35)

Tableau VIII : Comparaison des taux de survie à 12 et 24 mois de chiens atteints de mastocytomes non opérables et traités avec du masitinib ou un placebo. (38)

- Le masitinib est plus efficace s’il est utilisé en première intention. Le TPP est de 253 jours chez l’ensemble des chiens traités en première intention avec du masitinib contre 75 jours chez ceux traités avec le placebo (p=0,001). (39)

Jours

JoursJours

Jours

%desurvivan

ts

%desurvivan

ts

%desurvivan

ts

%desurvivan

ts

61

- Le contrôle de la tumeur après 6 mois de traitement permet de prédire le temps de survie alors que la réponse à 6 semaines de traitement n’est pas prédictive. (44) Le Masivet a permis d’introduire une nouvelle règle en oncologie vétérinaire : le contrôle de la tumeur est corrélé au temps de survie. En effet, avec la chimiothérapie, l’objectif était de faire disparaître la tumeur alors qu’avec les ITK le but est de contrôler la tumeur. Lorsque la tumeur est contrôlée, la durée de survie est la même que la réponse soit complète ou que la maladie soit stable.

- Le masitinib permet de diminuer le risque d’apparition des métastases.

Son action anti-métastatique peut être expliquée par l’effet sur la protéine Lyn, le PDGFR et par l’inactivation de la dégranulation des mastocytes. En effet, l’émergence de nouvelles métastases est plus faible chez les chiens traités avec Masivet® par rapport à ceux traités avec le placebo (3,7% contre 17,1%). De plus, le masitinib est efficace sur les chiens atteints de mastocytomes avec des métastases (39, 42 et 43). Une étude sur 4 chiens atteints de mastocytomes de grade 2 et 3 métastasés et chimiorésistants a montré que le masitinib est efficace pour induire une rémission du cancer ; cependant le faible nombre de patients et la durée limitée de l’étude ne permettent pas de conclure. (24)

Il existe néanmoins des mécanismes de résistance et d’échappement au traitement : dans de nombreuses tumeurs présentant une mutation de la protéine c-Kit, il a été observé que dans certains sous-clones, de nouvelles mutations de c-Kit peuvent s’ajouter, conférant ainsi une résistance au masitinib, sans pour autant que le mécanisme ne soit encore connu. (82)

En résumé, le Masivet® est donc efficace pour le traitement des mastocytomes cutanés de grade 2 ou 3, non opérables ou récidivants après chirurgie, sans atteinte métastatique avec une mutation de la protéine c-Kit. Il permet d’augmenter la durée et le confort de vie de l’animal et est d’autant plus efficace s’il est utilisé en première intention indépendamment du statut c-Kit. Il est néanmoins plus efficace sur la protéine c-Kit mutée. Il permet également de diminuer le risque d’apparition de métastases. La réponse au traitement à 6 mois permet d’affiner le pronostic à long terme.

g. Autres indications du masitinib en cancérologie

Une étude menée par Gramer I. en 2016 (35) analyse l’expression de la protéine c-Kit chez 14 chiens présentant des ostéosarcomes, des mélanomes, des hémangiosarcomes, des lymphomes ou des fibrosarcomes. Des échantillons de tissus ont été utilisés afin de séquencer la protéine c-Kit dans le but de détecter la transcription de c-Kit et d’identifier les mutations « gain-of-function ». Le transcrit de c-Kit a été détecté chez 10 chiens. Quatre nouvelles substitutions d’acides aminés et cinq polymorphismes silencieux ont été identifiés. De plus, une insertion (GNSK) dans le gène Kit a été découverte dans le tissu mais pas dans le sang d’un des chiens. On voit donc que l’expression de c-Kit est retrouvée dans différentes tumeurs et que les inhibiteurs de tyrosine-kinases peuvent avoir d’autres indications que le traitement des mastocytomes cutanés canins. D’autres recherches devront être nécessaires

62

afin de localiser la protéine c-Kit et d’évaluer les conséquences fonctionnelles de ces différentes mutations.

Ø Lymphome T

Le professeur Olivier Hermine, président du comité scientifique d’AB Science et à la tête

du département d’hématologie de l’hôpital Necker à Paris, explique que les facteurs oncogéniques lors de lymphomes T périphériques (PTCL) ne sont pas encore tous identifiés. Néanmoins, il a été prouvé que dans 80% des cas, le PDGFR est anormalement présent dans les lymphocytes T tumoraux chez l’homme. Le masitinib est un inhibiteur potentiel du PDGFR et devient un candidat potentiel pour la lutte contre les lymphomes T réfractaires aux traitements classiquement mis en place. (1, 7 et 109)

Ø Ostéosarcome

Une étude menée par Fahey et al. en 2013 (32) évalue l’activité in vitro du masitinib à l’encontre de trois lignées cellulaires responsables d’ostéosarcomes canins, après augmentation progressive des concentrations (0,01-50 µmol/L) pendant 24, 48 et 72h. Les valeurs de l’IC50 à 72h pour les trois lignées cellulaires (POS, HMPOS, et COS31) sont respectivement de 11.04, 7.09 et 9.74 µmol/L. De plus, l’augmentation de l’activité de la caspase-3/7 indique une mort cellulaire apoptotique. De par le fait que des taux de VEGFR sont retrouvés lors d’ostéosarcomes chez le chien, la quantité de VEGFR dans le surnageant a par ailleurs été dosée lors de cette étude.

De plus, cette étude prouve que le masitinib cause une mort dose-temps dépendante des cellules OSA in vitro à travers l’initiation de l’apoptose méditée par les caspases.

Ø Hémangiosarcome

Une étude menée par Lyles et al. en 2012 (77) évalue l’activité in vitro du masitinib mesylate à l’encontre de lignées cellulaires responsables d’hémangiosarcomes canins, après augmentation progressive des concentrations (0,01-100 µM) pendant 24, 48 et 72h.

Tableau IX : IC50 de trois lignées cellulaires d’hémangiosarcomes à 24, 48 et 72 h. (77) IC50 (uM) DEN Fitz SB

24h 10,64 16,84 17,43 48h 9,88 12,44 10,82 72h 8,56 9,41 10,65

Les données concernant la viabilité cellulaire ont été établies via un modèle de régression de 4 équations pour déterminer l’IC50 de chaque lignée cellulaire. On montre alors une diminution de l’IC50 avec l’augmentation de la durée d’exposition au masitinib mesylate.

Les résultats montrent que le masitinib mesylate provoque une diminution dose- et temps-dépendante de la prolifération des lignées cellulaires responsables d’hémangiosarcome. L’IC50 à 72h pour les trois lignées (DEN, Fitz et SB) est respectivement de 8,56, 9,41 et 10,65µM ; d’autres investigations ont montré que le masitinib mesylate induit l’apoptose des trois lignées cellulaires, en activant la caspase-3/7. Des mesures des taux de VEGF dans le surnageant cellulaire montrent une augmentation

63

significative de ce taux à proximité de l’IC50 de chaque lignée cellulaire suivie d’une diminution jusqu’au taux de base. Ces résultats montrent que le masitinib mesylate cause une mort cellulaire dose dépendante des différentes lignées responsables d’hémangiosarcomes in vitro. (77)

Ø Mélanome

AB Science fait état de la publication d'un article qui présente le premier cas d`un patient atteint d`un mélanome primaire de l’oesophage avec une mutation au niveau de l’exon 11 de c-Kit, métastasé dans les organes viscéraux et dans le cerveau et traité avec le masitinib. « Le patient a montré une réponse thérapeutique objective et cliniquement significative au masitinib », souligne le laboratoire. Cette réponse thérapeutique a permis au patient de bénéficier pendant 6 mois d`une bonne qualité de vie, malgré l`agressivité de la maladie au démarrage du traitement. « Ce rapport de cas fournit une preuve supplémentaire de la puissance du masitinib dans les tumeurs exprimant la mutation juxtamembranaire de c-Kit », explique la société, qui rappelle qu'une étude de phase 3 est en cours chez les patients atteints de mélanome non opérable ou métastatique de stade 3 ou 4, présentant une mutation du domaine juxtamembranaire (JM) de c-Kit. Ce cas est cependant très rare et ne concerne qu'environ 7.500 patients en Europe et aux Etats-Unis.

Figure 27 : Photographie d’une tumeur de l’œsophage intraluminale, proéminente, ulcérée, circulaire, située à 30-41cm des incisives, fragile, avec présence de saignements

de contact. (95)

64

Ø Rôle de sensibilisation à la chimiothérapie :

L’objectif de cette étude est d’évaluer la capacité du masitinib à sensibiliser différentes lignées cellulaires cancéreuses à des agents cytotoxiques. Cette chimiosensibilisation, ou l’inhibition de la croissance, peuvent permettre l’utilisation de dose plus faible d’agents de chimiothérapie, et ainsi réduire le risque ou augmenter l’efficacité de doses standard.

Figure 28 : Courbes d’inhibition de la croissance cellulaire en fonction de la dose de Gemcitabine (GCB) associée au masitinib. (116)

(A) Ostéosarcome D17. (B) Ostéosarcome d’Abrams. (C) Carcinome pulmonaire CMT12 (D) Carcinome pulmonaire CMT27.

65

Figure 29 : Courbes de l’inhibition de la croissance cellulaire en fonction des doses de

doxorubicine (DOX) et de vinblastine (VBL). (116) (A) Hémangiosarcome de Fitz. (B) Carcinome de la vessie K9TCC. (C) Sarcome histiocytaire

DH82 (D) Hémangiosarcome DEN.

Il est possible que la combinaison masitinib/doxorubicine puisse être utile pour le traitement des lymphomes à cellules B, des hémangiosarcomes, des mélanomes et des carcinomes de la vessie ; une combinaison masitinib/vinblastine pour le traitement des sarcomes histiocytaires; et une combinaison masitinib/gemcitabine pour traiter les ostéosarcomes et les carcinomes mammaires.

A l’heure actuelle, il est question d’explorer davantage l’utilisation du masitinib dans différentes chimiothérapies combinées. Cette exploration nécessite des études de phase I afin de déterminer la dose maximale tolérée de ces thérapies combinées chez les chiens présentant des tumeurs avancées. (82 et 116)

Finalement, le masitinib a montré son efficacité contre les mastocytomes cutanés du chien. Il permet de plus une resensibilisation à la chimiothérapie de certaines lignées cellulaires cancéreuses. Des études sont en cours quant à son efficacité contre d’autres tumeurs (ostéosarcomes, mélanomes, lymphomes, hémangiosarcomes...).

h. Effets secondaires

Les principaux effets secondaires mis en évidence dans ces études sont : - vomissements et diarrhées (très fréquents mais d’intensité modérée et souvent

transitoire). - fatigue, léthargie et anorexie (fréquents). - neutropénie, hausse des enzymes hépatiques, anémie hémolytique, syndrome de fuite

protéique.

66

Ces effets secondaires sont à relier avec l’inhibition de c-Kit dans les cellules normales.

En effet, l’inhibition de c-Kit dans les cellules de Cajal dans l’intestin est responsable de diarrhées. L’apoptose des mastocytes entraîne un relargage de médiateurs pouvant entraîner des effets systémiques comme la diarrhée et les vomissements. Ces effets sont en général d’intensité faible à modérée, transitoires et sont contrôlés si nécessaire par un traitement symptomatique classique.

Le syndrome de fuite protéique peut parfois être présent chez quelques chiens : l’inhibition du PDGFR est responsable d’une disjonction des podocytes entrainant une fuite d’albumine en dehors des vaisseaux. La fraction de masitinib non liée aux protéines augmente alors et l’activité du masitinib est donc plus importante ce qui peut entraîner des diarrhées et des vomissements à l’origine d’une déshydratation. Il s’agit d’un syndrome prévisible, d’apparition progressive et réversible. Le suivi de l’albuminémie doit être fait régulièrement (toutes les deux semaines). En cas d’albuminémie inférieure à 20g/L, le traitement doit être interrompu.

En résumé, le masitinib engendre des effets secondaires liés à l’action de la molécule sur les PTK de cellules non cancéreuses (c-Kit et PDGFR principalement). On observe alors des signes gastro-intestinaux, de la fatigue, une anorexie, des modifications hématologiques et biochimiques. Ces signes sont en général d’intensité faible à modérée, transitoires et peuvent être gérés par un traitement symptomatique.

2. Le toceranib (Palladia®)

Le Palladia® a obtenu l’AMM en 2009 et a été commercialisé en début d’année 2010 par le laboratoire Pfizer Santé Animale. Il est indiqué chez le chien pour le traitement des mastocytomes cutanés de grade 2 ou 3 selon la classification de Patnaik, récidivants avec ou sans atteinte des nœuds lymphatiques régionaux.

a. Structure

Le toceranib a une structure chimique de type indolinone, qui est un composé polycyclique. (115) Les 3-substitut indolin-2-ones sont des composés inventés, synthétisés en tant qu’ITK et qui peuvent exercer leur sélectivité sur différents types de RTK. En modifiant leur composition chimique, on a pu synthétiser des molécules distinctes capables de cibler des RTK particuliers. (5, 78) L’analyse cristallographique de ces molécules permet de montrer qu’elles se lient au site de liaison de l’ATP des RTK. Le toceranib est le 5-[(5Z)-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-N-[2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl]-1H-pyrrole-3-carboxamide.

67

Figure 30 : Structure chimique du toceranib. (73)

b. Cibles

Le toceranib cible le VEGFR2, le PDGFR, l’EGFR et c-Kit ainsi que d’autres molécules de la famille des split kinases. SU11654 est la molécule du toceranib.

Tableau X : IC 50 du toceranib sur différentes TK. (69)

Ki (µM) (Constantes Inhibitrices) IC50 cellulaire de la kinase (µM)

Composé Flk-1 PDGFR FGFR EGFRa* Flk-1 PDGFR c-Kit SU5416 0,16 0,32 19,5 >100 0,05 0,3 0,1 SU6668 2,1 0,008 1,2 >100 0,5 1,0 0,5 SU11654 0,006 0,005 0,5 >10 0,03 0,01 0,05 *Les valeurs pour l’EGFR sont les IC50

On remarque que le toceranib inhibe de nombreuses kinases : il est donc moins spécifique et son action est alors moins prévisible que celle du masitinib.

c. Mode d’action

Le toceranib agit de plusieurs manières. Il possède principalement des actions anti-angiogéniques et anti-tumorales.

Il agit d’une part sur la protéine c-Kit des mastocytes in vitro : l’étude menée par

Albert T. Liao en 2005 montre les effets de trois ITK de type indolinone (SU11652, SU11654 qui est le toceranib et SU11655) sur quatre lignées cellulaires mastocytaires présentant une protéine c-Kit normale ou avec des mutations affectant soit le domaine JM soit le domaine catalytique. En induisant l’arrêt de leur cycle cellulaire et leur apoptose, les trois ITK sont capables d’inhiber les formes mutées ou normales de la protéine c-Kit de façon dose-dépendante. Ils sont néanmoins plus efficaces sur les protéines c-Kit présentant une mutation du domaine JM. (69) On pourrait expliquer cette plus grande efficacité par le fait qu’une mutation de c-Kit dans le domaine catalytique induit une plus forte activation de la PI3 kinase et de ce fait un plus fort pouvoir cancérigène qu’une mutation du domaine JM.

D’autre part, une étude menée par Pryer NK. en 2003 (96) analyse l’action du toceranib sur la protéine c-Kit de mastocytomes in vivo : une étude menée sur 11 chiens

68

montre que le toceranib inhibe la phosphorylation de la protéine c-Kit dans les mastocytomes et affecte ainsi la voie de signalisation en aval de c-Kit, à une dose de 3,25 mg/kg. Cette inhibition de la phosphorylation de la protéine c-Kit est mise en évidence sur 73% de ces chiens, après une administration d’une simple dose orale de toceranib. Les 27% restant ont un faible taux de phosphorylation de la protéine c-Kit avant l’administration du toceranib, la sensibilité des anticorps dirigés contre la protéine c-Kit phosphorylée n’est alors pas suffisante pour détecter une modulation de la phosphorylation induite par le toceranib.

d. Protocole pour les mastocytomes

Le Palladia® se présente sous forme de comprimés de 10, 15 et 50 mg. La posologie indiquée est de 3,25 mg/kg un jour sur deux. Elle peut être diminuée de 0,5 mg/kg si les effets secondaires sont gênants avec un minimum de 2,2 mg/kg. Par ailleurs, un arrêt transitoire du traitement est possible. Il faut suivre les animaux très régulièrement lorsque le traitement est mis en place. Il est d’ailleurs conseillé d’arrêter le traitement en cas :

- d’anémie - d’hypo-albuminémie et d’hyperphosphatémie simultanées - d’hématocrite inférieur à 26% - de créatinémie supérieure à 2 mg/dL - de neutropénie inférieure à 1000 /µL

Il est recommandé d’utiliser conjointement de la cimétidine afin d’éviter les effets

secondaires de l’histamine suite à une éventuelle dégranulation mastocytaire massive et également pour lutter contre les érosions et ulcérations digestives observées chez quelques animaux traités avec le Palladia®.

e. Efficacité sur les mastocytomes (74, 97)

Le toceranib phosphate (SU11654) est un nouvel inhibiteur de tyrosine-kinases ayant une double activité : anti-tumorale et anti-angiogénique grâce à l’inhibition des protéines c-Kit, VEGFR-2, et PDGFRb. Dans une première phase d’essai, 57 chiens avec des tumeurs spontanées ont reçu des doses croissantes de SU11654 par voie orale. Le médicament était assez sûr et bien toléré à des doses allant jusqu’à (et incluant) 3.25 mg/kg et administrées un jour sur deux. Une réponse objective et mesurable a été observée chez 16 chiens, essentiellement sur les mastocytomes (n=11), ce qui représente un taux de réponse de 28%, et une stabilisation de la maladie a été observée sur 15 autres chiens. Cette étude amène la première preuve que les inhibiteurs de kinases administrés oralement sont capables d’exercer leur activité contre différentes maladies. Elle suggère également que cet inhibiteur de kinases peut être administré continuellement sans nécessiter de pauses fréquentes dans le traitement.

69

Tableau XI : Taux de réponse au traitement en fonction du type de tumeur. (73)

Type de tumeur

Nombre de cas

Réponse objective

(diminution de la tumeur)

SD >10 semaines

Activité biologique

Mastocytome ITD positif ITD négatif

22 11 11

11 9 2

2 1 1

13 (59%) 10 (91%) 3 (27%)

Lymphome 6 0 1 1 (17%) Carcinome mammaire 5 2 2 5 (80%) Sarcome « soft tissue » 4 2 0 2 (50%) Carcinome de la vessie 4 0 3 3 (75%)

Mélanome malin 3 0 2 2 (67%) Hémangiosarcome 3 0 0 0 (0%)

Ostéosarcome 3 0 2 2 (67%) Carcinome divers 2 0 1 1 (50%) Myélome multiple 2 1 0 1 (50%)

Carcinome des cellules squameuses

2 0 1 1 (50%)

Carcinome pulmonaire 1 0 1 1 (100%)

Par conséquent, un composé similaire nommé Sutent (SU11248) a été plus tardivement approuvé pour le traitement de tumeurs humaines. Le toceranib phosphate a été ensuite développé dans un essai clinique sur des chiens en phase III, dans lequel les chiens ont été répartis au hasard afin de recevoir par voie orale du toceranib à la dose de 3.25 mg/kg ou du placebo, et ce, un jour sur deux durant les 6 semaines de la phase aveugle. Le taux de réponse total (ORR) de la phase aveugle pour les chiens ayant reçu le toceranib (n = 86) est de 37.2% (7 CR, 25 PR) alors qu’il est de 7.9% (5 PR) pour ceux ayant reçu le placebo (n = 63; p = 0.0004). Parmi les 58 chiens qui ont échappé au traitement placebo et ont reçu du toceranib en 2ème intention, 41.4% ont totalement répondu. L’ORR pour tous les 145 chiens ayant eu le Toceranib était de 42.8% (21 CR, 41 PR); parmi les 62 répondants, la durée médiane de la réponse totale et du TTP était respectivement de 12.0 semaines et 18.1 semaines.

f. Influence du statut de c-Kit (73)

Dans cette même étude, on compare l’implication de la mutation de la protéine c-Kit et l’implication du statut des nœuds lymphatiques. Il en ressort que tous les chiens présentant une mutation de c-Kit, dont la tumeur ne s’est pas encore étendue aux nœuds lymphatiques, ont répondu totalement ou partiellement au traitement. Aucun des chiens avec un type sauvage de c-Kit et une invasion des nœuds lymphatiques n’ont répondu objectivement au traitement (Tab. XII).

70

Tableau XII : Taux de réponse du mastocytome en fonction des nœuds lymphatiques et de la mutation de c-Kit. (73)

Nœud lymphatique non

infiltré Nœud lymphatique infiltré

Pas de mutation de c-Kit 50% (2/4) 0% (0/7) Mutation de c-Kit 100% (6/6) 60% (3/5)

Figure 31 : Temps de survie des chiens présentant un mastocytome dont la protéine c-

Kit est mutée ou non, après traitement avec du SU11654. (73) a. Temps moyen de progression de la tumeur.

b. Temps de survie des chiens.

Prop

or%o

ndesurvivan

ts

Temps(semaines)

Temps(semaines)

71

La figure 31 ci-desus montre les différences de durée de progression et le temps de survie de 22 chiens avec un mastocytome traités avec le SU11654 pour lesquels la mutation de c-Kit était (n=11) ou n’était pas (n=11) présente. Les chiens avec une protéine c-Kit mutée vivent plus longtemps (36,9 semaines contre 15,4 semaines), résultat à interpréter avec prudence car la taille de l’échantillon reste peu représentative (P=0,12) (Fig. 31b). Par ailleurs, le temps de progression moyen de la tumeur avec une c-Kit mutée est de 21 semaines contre 3,9 pour les autres (P=0,05 ; Fig. 31a). Ces résultats indiquent que l’effet du SU11654 sur la progression de la tumeur est clairement influencé par la mutation de c-Kit.

g. Autres tumeurs (70, 73 et 75)

Suite à son approbation en 2009, le toceranib a été utilisé afin de traiter différentes

tumeurs solides chez le chien, majoritairement lors d’un premier échec thérapeutique ou dès lors que des métastases sont présentes.

Une analyse rétrospective de son utilisation hors AMM montre une activité biologique du toceranib envers les adénocarcinomes des glandes anales, des ostéosarcomes métastatiques, des carcinomes de la thyroïde, du cou, de la tête et du nez.

En effet, 90 bénéfices cliniques ont été observés chez 63 chiens sur 85 (74%), dont 28 sur 32 adénocarcinomes des glandes anales (8 réponses partielles et 20 maladies stables), 11 sur 23 ostéosarcomes (une réponse partielle et 10 réponses stables), 12 sur 15 carcinomes de la thyroïde (quatre réponses partielles et 8 réponses stables), 7 sur 8 carcinomes de la tête et du cou (une réponse complète, 5 réponses partielles et une réponse stable), et 5 sur 7 carcinomes nasaux (une réponse complète et 4 maladies stables).

Ces données fournissent ainsi des preuves préliminaires d’une certaine activité

biologique du toceranib à l’encontre des tumeurs solides, bien que d’autres études prospectives seront nécessaires afin de préciser ses véritables effets. (70)

72

Figure 32 : Réponse d’un adénocarcinome de la glande anale (AGASACA) au toceranib. (75)

32a). Un chien croisé mâle castré de 8 ans présentant des métastases d’un AGASACA au niveau du nœud lymphatique sous-lombaire et des poumons, a été traité avec du toceranib

après une récidive post-chirurgicale, une radiothérapie et une chimiothérapie. Les photos ci-dessus ont été prises avant l’administration de Palladia® et 46 jours après le début du

traitement. On peut noter la régression de plusieurs lésions métastatiques.

73

32b). Une femelle Golden Retriever stérilisée de 9 ans présentant des lésions métastatiques d’un AGASACA au niveau des nœuds lymphatiques iliaques, de l’espace rétropériotonéal

ainsi que des poumons, a été traitée avec du toceranib après un échec chirurgical et de multiples essais thérapeutiques.

Ici figurent des radiographies de son abdomen caudal avant sa première administration de toceranib, et 4 semaines après. On note une nette régression de ses nœuds lymphatiques

iliaques (et de ses nœuds lymphatiques pulmonaires, non montrés ici).

En résumé, le toceranib cible des PTK de la famille des split kinases. C’est une molécule moins spécifique que le masitinib. Son efficacité sur les mastocytomes du chien a été prouvée, et il semble également agir sur d’autres cancers chez le chien (carcinomes mammaires, myélomes multiples...).

74

h. Effets secondaires

Les effets secondaires les plus souvent rencontrés sont : - Signes gastro-intestinaux : diarrhée, vomissement, anorexie - Signes généraux : léthargie, neutropénie, thrombocytopénie, hypo-albuminémie,

augmentation de l’alanine aminotransférase très fréquemment. - Plus rarement : boiterie, perte de poids, sang dans les selles et désordre

musculosquelettique Les signes digestifs sont expliqués par l’action du toceranib sur le VEGFR, ce qui entraine une ischémie digestive à l’origine de ces troubles. Des effets secondaires plus sévères ont été rapportés chez plus d’un tiers des chiens traités, et 5 chiens sont morts, potentiellement en relation avec la molécule. (31)

B. Utilisation hors AMM des inhibiteurs de tyrosine-kinases chez le chien

Peu d’études ont été menées et sont menées à l’heure actuelle sur l’utilisation hors AMM du toceranib et du masitinib chez le chien, et encore moins chez le chat. Il en existe néanmoins quelques unes, sur lesquelles nous allons nous appuyer.

1. Etudes relatives au toceranib

Dans une étude menée par London C. en 2012 (75), des bénéfices cliniques ont été observés pour 63 chiens sur les 85 de l’étude, soit pour 74% des chiens. Ces résultats concernent 28/32 chiens présentant des tumeurs des sacs anaux (8PR, 20SD), 11/23 des ostéosarcomes (1PR, 10SD), 12/15 des carcinomes de la tyroïde (4PR, 8SD), 7/8 des carcinomes de la tête et du cou (1CR, 5PR, 1SD) et 5/7 (1CR, 4SD) des carcinomes nasaux. Pour les chiens ayant eu un bénéfice clinique, la dose médiane de toceranib utilisée était de 2.8 mg/kg, pour 36/63 (58.7%) des chiens, le toceranib a été administré les Lundi/Mercredi/Vendredi, et 47/63 (74.6%) ont été traités pendant 4 mois ou plus. Des effets secondaires sont apparus chez 66 chiens (77,6%). Il faut toujours rester prudent quant à leur interprétation, puisqu’il est difficile de les attribuer exclusivement à l’administration de toceranib, du fait de l’âge avancé des chiens. Néanmoins, les toxicités rapportées étaient par ordre de fréquence :

- Diarrhée (n=44, 51.8%) - Anorexie (n=30, 35.3%) - Vomissement (n=16, 18.8%) - Douleur et/ou faiblesse musculaire (n=16, 18.8%) - Perte de poids (n=15, 17.6%) - Test hemoccult positif (présence de sang dans les selles) (n=13, 15.3%) - Léthargie (n=11, 12.9%) - Neutropénie (n=9, 10.6%) - Lésions cutanées (dépigmentation, pyodermite, n=6, 7.1%).

75

Ces résultats peuvent être regroupés par grandes catégories, et représentés ainsi :

Figure 33 : Représentation graphique des effets secondaires retrouvés lors de l’étude de

London C. en 2012. (75)

En 2011, Robat C. et London C. (98), utilisent une autre approche du traitement hors AMM à base d’ITK en associant le Palladia® avec de la vinblastine. Sur les 14 chiens traités, une réponse complète a été retrouvée pour 2 chiens (14%), (réponse toujours complète respectivement à 80 jours et à 62 jours après leur entrée dans l’étude). Parmi ces deux réponses complètes, un chien n’est plus sous traitement et l’autre reçoit encore du toceranib et de la prednisolone en alternance (un jour sur deux).

Des réponses partielles sont notées pour 8 chiens (57%), et parmi eux, 3 ont maintenu

leur réponse pendant 3 mois. La maladie est donc contrôlée chez 71% des cas. La maladie est stable chez 3 chiens durant la période de l’étude (4 semaines), ce qui n’est cependant pas une période assez longue pour pouvoir correctement définir une maladie stable selon le critère RECIST v1.1. Seul un chien a développé une maladie progressive durant le protocole.

Effets secondaires

Atteinte de l'état général Troubles digestifs

Modification de la NFS Atteintes cutanées

76

Voici un tableau bilan recoupant les résultats obtenus dans les 4 plus grandes études menées à l’heure actuelle sur l’utilisation hors AMM du toceranib en médecine vétérinaire chez le chien :

Tableau XIII : Synthèse de l’application hors AMM du toceranib chez le chien en médecine vétérinaire.

Type de tumeur

Nombre de cas

Traitements adjuvants

Efficacité Référence

Adénocarcinome des glandes

apocrines des sacs anaux

32 AINS et/ou cyclophosphamide

RP 25% MS 62,5%

75

2 Piroxicam RP 50% 18

Carcinome thyroïdien

15 AINS et/ou cyclophosphamide

RP 27% MS 53%

75

Carcinome de la tête et du cou

8 AINS et/ou cyclophosphamide

RC 12,5% RP 62,5% MS 12,5%

75

2 Piroxicam RP 100% 18 1 25

Carcinome nasal 7 AINS et/ou cyclophosphamide

RC 14% MS 54%

75

3 Piroxicam MS 67% 18 Autres

carcinomes* 3 Piroxicam MS 100% 18 5 - RP 40%

MS 40% 73

Ostéosarcomes avec métastases

pulmonaires

23 AINS et/ou cyclophosphamide

RP 4% MS 43%

75

Sarcome des tissus mous

3 Piroxicam RP 33% 18

Sarcome des tissus mous avec

métastases pulmonaires

4 - RP 50% 73

*autres carcinomes : carcinome prostatique, adénocarcinome salivaire, carcinome pulmonaire, carcinome mammaire avec métastases pulmonaires, etc.)

77

2. Etudes relatives au masitinib

Une seule grande étude est publiée à ce jour quant à l’utilisation hors AMM du masitinib chez le chien. Cette étude a été menée en 2012 par Kitchell B. (54). Les résultats obtenus sur les 84 chiens traités (à la dose de 12,5mg/kg) sont les suivants :

Tableau XIV : Synthèse de l’application hors AMM du masitinib chez le chien. (54)

Type de tumeur

Nombre de cas Efficacité

Adénocarcinome des glandes apocrines des sacs anaux

8 RP 25%

Carcinomes épidermoïdes 3 RP 33% MS 33%

Autres carcinomes 14 RC 7% RP 14% MS 21%

Ostéosarcomes 14 RP 7% MS 21%

Sarcome des tissus mous 11 RC 29% RC 25%

Hémangiosarcome 12 RP 8% MS 8%

Lymphome 22 RC 14% RP 9%

MS 18% On peut voir que 84 chiens ont pu être traités à l’aide du masitinib. Ils sont regroupés en 7 grands types tumoraux. La maladie a été contrôlée chez 31 chiens sur les 84 traités, ce qui représente 37% des animaux qui ont répondu au traitement.

C. Quelques inhibiteurs de tyrosine-kinases ayant une AMM en médecine humaine

1. L’imatinib (Gleevec®)

Distribué par le laboratoire Novartis sous le nom de Gleevec® (Etats-Unis) ou Glivec® (Europe/Australie/Amérique latine), l’imatinib mesylate (STI571) a obtenu l’AMM en 2001 pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique (chromosome Philadelphia positif (Ph+)) chez l’homme. Il a ensuite été approuvé en 2008 dans le cadre du traitement des GIST malignes métastasiques et/ou non opérables.

78

a. Généralités La formule chimique de l’imatinib mesylate est le 4-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-N-[4- methyl-3-[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]aminophenyl] benzamide methanesulfonate.

Figure 34 : Structure chimique de l’imatinib mesylate. (21)

L’imatinib agit de façon compétitive avec l’ATP en se fixant sur certaines protéines

tyrosine-kinases. En effet, il montre une activité contre la protéine Abl avec une IC50 autour de 0,25 µM. Il en est presque de même contre le PDGFR et c-Kit. Par ailleurs, les valeurs de l’IC50 pour de nombreuses autres PTK sont 100 fois plus fortes. Ceci démontre que l’imatinib présente une forte spécificité pour les protéines Abl, c-Kit et PDGFR.

Tableau XV : IC50 de l’imatinib sur différentes tyrosine-kinases. (17, 26)

Tyrosine-kinases IC 50 (µm) v-ABL 0,1-0,3

BCR-ABL 0,25 TEL-ABL 0,35 TEL-ARG 0,5

PDGFR 0,1 TEL-PDGFR 0,15

c-Kit 0,15 Flt-3 >10

c-Fms et v-Fms >10 KDR >10

HER1 et HER2 >100 IGF-1R >100 v-Src >10 Jak-2 >100

Les posologies recommandées sont :

- 400 mg/jour en une prise unique en phase chronique de leucémie myéloïde chronique, 600 mg (en une ou deux prises) dans les phases d’accélération ou en crise blastique aiguë, avec augmentation respective à 600 mg et 800 mg si la réponse est jugée insuffisante, la tolérance restant correcte et sous surveillance rapprochée. La dose minimale efficace permettant une réponse thérapeutique optimale dans la leucémie myéloïde chronique est supérieure ou égale à 300 mg.

79

- 400 mg/jour dans les GIST. - 100 mg suffisent souvent dans les syndromes hyper-éosinophiliques mais 400 mg est

une dose optimale dans les leucémies myélomonocytaires chroniques présentant une translocation précise.

b. Efficacité

Ø Sur la leucémie myéloïde chronique :

La leucémie myéloïde chronique résulte de la transformation néoplasique d’une cellule souche hématopoïétique primitive. La maladie est due à une translocation appelée translocation de Philadelphie impliquant les bras longs des chromosomes 9 (gène Abl) et 22 (gène Bcr). Il y a formation d’une protéine kinase fusion Bcr-Abl qui est activée de façon constitutive et entraîne une augmentation de la prolifération cellulaire, une diminution de l’apoptose et une perturbation des interactions avec le domaine extracellulaire.

L’imatinib, qui cible la protéine Abl, est efficace pour traiter les patients en phase aiguë, en phase d’accélération et en phase chronique. Les meilleurs résultats sont obtenus pour la phase chronique avec 95% des patients qui ont obtenu une réponse hématologique complète avec un taux de survie sans progression de la maladie à 18 mois de 89%. Cependant, en association, l’imatinib agit de façon synergique avec l’interféron alpha et la cytarabine. (26)

Ø Sur les GIST :

Les GIST sont liées à des mutations de la protéine c-Kit le plus souvent mais peuvent également être liées à des mutations du PDGFR alpha.

75 à 90% des patients bénéficient d’un traitement à base d’imatinib. Dans les études précliniques, l’imatinib inhibe la prolifération et induit l’apoptose des cellules issues de GIST. Dans l’étude de phase II, 147 patients ayant une GIST avancée ont participé afin d’évaluer l’activité de l’imatinib. Ils ont reçu une dose quotidienne de 400 mg ou 600 mg. 53,7% d’entre eux ont présenté une réponse partielle, 27,9% ont présenté une maladie stable. Aucun patient n’a eu de réponse complète. 13,6% des patients ont présenté une résistance à l’imatinib. La thérapie a été bien tolérée malgré quelques effets secondaires d’intensité faible à modéré (œdème, fatigue, diarrhée). Dans 5% des cas, des hémorragies intra-abdominales ou gastro-intestinales ont été présentes. Il n’y a pas eu de différences significatives entre les effets secondaires et la réponse aux 2 doses d’imatinib. (27)

L’étude permet de conclure que l’imatinib est un traitement efficace des GIST à un stade avancé qui sont des maladies résistantes aux agents conventionnels de chimiothérapie. Suite à cette étude, la FDA a approuvé l’imatinib en 2008 pour le traitement des GIST malignes métastatiques et/ou non opérables.

80

c. Effets secondaires et résistances

L’imatinib est en général bien toléré et les effets secondaires sont souvent d’intensité faible à modérée. On peut retrouver :

- œdème et rétention de fluide (souvent superficiels et atteinte de la zone périorbitaire dans 50% des cas)

- signes gastro-intestinaux (nausée fréquente, diarrhée, douleur abdominale) - réactions cutanées (éruptions cutanées chez 1/3 des patients, urticaire) - arthralgie, myalgie et douleur osseuse (fréquent) - toxicité hépatique (rare) - myélosuppression Les résistances secondaires à l’imatinib sont relativement fréquentes. Elles sont observées

dans la leucémie myéloïde chronique et les GIST. On observe également des résistances primaires comme par exemple la mutation asp816val du gène codant pour la protéine c-Kit présente dans la majorité des mastocytoses systémiques. Les résistances secondaires sont souvent des mutations dans le domaine kinase qui empêche la liaison de l’imatinib avec la tyrosine-kinase. In vivo, on retrouve une mutation dans le domaine kinase de la protéine Abl qui empêche la liaison de l’imatinib, cette mutation serait présente avant la thérapie et la pression de sélection exercée par l’imatinib favoriserait son émergence. On retrouve également une surexpression de la protéine Bcr-Abl.

2. Le sunitinib (Sutent®)

Le Sutent® a été développé par le laboratoire Pfizer ; il est indiqué dans le carcinome rénal métastatique et dans le traitement des GIST malignes non opérables et/ou métastatiques après échec à une thérapie à base d’imatinib due à une résistance ou une intolérance. Il a été approuvé par la FDA en 2006. Il vient également d’avoir un avis positif pour le traitement des tumeurs neuroendocrines pancréatiques par le comité scientifique de l’Agence Européenne du médicament en mai 2011.

a. Généralités

Sa formule chimique est : l’acide butanedioique hydroxy-, (2S)-, composé avec N-[2- (diethylamino)ethyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidine)methyl]-2,4- dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide.

Figure 35 : Structure chimique du sunitinib. (3)

81

Le sunitinib cible particulièrement le PDGFR-alpha et béta, le VEGFR1, 2 et 3, c-Kit, Flt-3, CSF-1R et RET en se liant sur le site de l’ATP de manière compétitive avec celui-ci. Cette molécule est peu spécifique et agit sur de nombreuses protéines kinases.

Tableau XVI : IC50 du sunitinib sur différentes tyrosine-kinases. (28)

Tyrosine-kinases IC 50 (µmol)

VEGFR2 0,004 VEGFR1 ND, Ki=0,002 VEGFR3 ND, Ki=0,017 PDGFRα 0,069 PDGFRβ 0,039

c-Kit 0,002 Flt-3 IRD 0,001 à 0,01

Flt-3 0,25 RET 0,05

b. Protocole et études

La dose recommandée est de 50 mg par jour selon un schéma d’administration de 4 semaines de traitement suivies de 2 semaines sans traitement. Une dose de 3,75 mg/kg par jour peut être administrée de façon continue chez les patients ayant un changement cyclique de symptômes lors du schéma d’administration 4/2.

Le sunitinib est métabolisé par l’enzyme CYP3A4 du cytochrome P450. La dose doit être modifiée selon l’administration d’inhibiteur ou d’activateur de cette enzyme. Par exemple, on retrouve comme inhibiteurs du CYP3A4 le kétoconazole, l’itraconazole, la clarithromycine, l’atazanavir, et l’indinavir. Les activateurs de l’enzyme sont par exemple la dexaméthasone, la phenytoïne, la carbamazépine, la rifampine et le phénobarbital.

Différentes études ont montré l’efficacité du sunitinib dans le traitement des GIST malignes non résécables et/ou métastatiques après échec d’une thérapie à base d’imatinib due à une résistance ou une intolérance, et dans le cancer du rein métastatique naïf ou réfractaire aux cytokines. Une étude de phase 3 met en évidence l’intérêt thérapeutique de cette molécule sur le cancer du pancréas neuroendocrinien.

Des études ont montré l’activité anticancéreuse du sunitinib dans différents cancers. Cependant, le bénéfice de l’inhibition du VEGFR peut être transitoire. Il y a en effet un risque métastatique plus important lors de traitement de courte durée.

82

c. Effets secondaires

Les effets secondaires les plus communs sont : - signes gastro-intestinaux (diarrhée, vomissements, nausée et inflammation des

muqueuses) - effet sur la thyroïde (hypothyroïdie le plus souvent) - hémorragie (le sunitinib a un effet anti-angiogénique et peut compromettre la

cicatrisation) - hypertension par l’action anti-VEGF - effets cardiaques : dysfonctionnement du ventricule gauche et insuffisance cardiaque

congestive associée, arythmie ventriculaire - effets dermatologiques : changement de couleur de la peau, érythrodysesthésie

palmoplantaire - myélosuppression - autres (toxicité sur les surrénales, syndrome du mal de tête)

Ces effets sont généralement de faible intensité et peuvent être gérés via des traitements symptomatiques. Un arrêt du traitement ou une diminution de la dose de sunitinib peuvent être envisagés.

Tableau XVII : Résumé des inhibiteurs de tyrosine-kinases utilisés chez le chien et le chat.

ITK Cible Type de

tumeur Espèces

Dose

Toceranib Kit, VEGFR, PDGFR, Flt-3

MCT, sarcomes, carcinomes, mélanomes, myélomes

Chien

3,25 mg/kg tous les autres jours

Masitinib Kit, (PDGFR) MCT Chien 12,5 mg/kg SID Imatinib Kit, Abl,

PDGFR MCT, sarcomes Chien et chat 5-10 mg/kg SID

Abréviations : ITK Inhibiteur de Tyrosine-Kinase, MCT mastocytome, PDGFR platelet-dervived growth factor receptor, VEGFR vascular endothelial growth factor receptor, SID une fois par jour.

83

D. Les autres types d’inhibiteurs de tyrosine-kinases

Il existe d’autres molécules capables d’inhiber l’activité des protéines tyrosine-kinases : il s’agit des anticorps monoclonaux, des nucléotides non-sens ainsi que des immunotoxines.

1. Les anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux sont spécifiquement dirigés contre le domaine extracellulaire des RTK. Ils empêchent l’interaction ligand-RTK et de ce fait aucun signal n’est transmis par le RTK. Ils entraînent également une augmentation de l’internalisation du RTK. De plus, ils induisent une réaction immunitaire via le complément ou par ADCC entrainant la lyse des cellules tumorales. Par exemple, l’Herceptin® (transtuzumab), approuvé en 1998 par la FDA, a été développé pour cibler la protéine HER2 dans les cancers du sein. En tant que premier traitement dans les cancers du sein métastatique, le taux de réponse est de 25% et lorsqu’il est combiné à une chimiothérapie le taux de réponse est d’environ 50%. Un autre exemple est celui de l’Erbitux® (cetuximab) ciblant la protéine EGFR dans un certain nombre de cancers tels que le cancer du pancréas, le cancer du rein et le carcinome du sein. (71, 126)

Figure 36 : Différentes stratégies de lutte contre les RTK. (126)

Abréviations : ODN= OligoDésoxyNucléotide MAb=Monoclonal Antibody

Transcrip)on ODNAn)sens

Immunotoxine

Toxineligand

Maladiedelavoiedesignalisa)ondesRTK

84

2. Les nucléotides non-sens

Ce sont des oligodésoxynucléotides qui interagissent avec l’ARNm et bloquent la transcription et donc l’expression de protéines spécifiques. Il existe notamment un oligodésoxynucléotide qui cible IGF-1R et qui induit l’apoptose des cellules de mélanomes malins. Par ailleurs, une nouvelle technique d’interférence par l’ARN permet de mettre sous silence l’expression de gène ciblé de façon puissante et spécifique. Cette technique est investiguée pour les isoformes de VEGF et pourrait avoir de futures applications. (79)

3. Les immunotoxines

Ces molécules contiennent à la fois une toxine et un conjugué ce qui leur permet de se lier au RTK. Le conjugué peut être une chaîne de l’anticorps dirigé contre le RTK, ou une partie du facteur de croissance se liant au RTK. Les immunotoxines ciblent spécifiquement un antigène des cellules cancéreuses. Lors de la liaison de l’immunotoxine au RTK, la toxine est internalisée dans un endosome puis libérée dans le cytoplasme, elle inhibe alors la synthèse protéique ce qui entraine l’apoptose de la cellule cancéreuse. Un exemple est la protéine DAB389EGF qui contient une partie de la toxine diphtérique et une séquence du ligand EGF. Cette protéine cible les EGFR de cancers tels que le cancer du sein ou le cancer du poumon non à petites cellules et entraîne ainsi la mort des cellules cancéreuses.

En résumé, il existe différents types d’inhibiteurs autres que les ITK. Ce sont les anticorps monoclonaux, les immunotoxines, et les nucléotides non-sens. Les anticorps monoclonaux tels que l’Herceptin® et l’Erbitux® ont été développés et représentent la première génération de thérapies ciblées, mais leur principal inconvénient reste une durée d’efficacité limitée.

85

PARTIE II : ETUDE RETROSPECTIVE DE 18 CAS TRAITÉS HORS AMM

_____________________________________________________________________________________________________ Nous avons réalisé une étude rétrospective sur la prise en charge thérapeutique de tout type de tumeur, à l’exception des mastocytomes, à l’aide d’inhibiteurs de tyrosine-kinases, dans l’espèce canine au campus vétérinaire de Lyon. Dans un premier temps, notre analyse et nos résultats seront descriptifs. Puis nous comparerons nos résultats avec ceux de la littérature et discuterons des similitudes ainsi que des différences observées avec les différentes études publiées.

I. Matériel et méthode

A. Population étudiée

Nous avons réalisé une étude rétrospective sur l’ensemble des chiens reçus en consultation sur le campus vétérinaire de Lyon entre le 1er janvier 2009 et le 1er février 2017 pour le traitement de différentes tumeurs à l’aide d’inhibiteurs de tyrosine-kinases. Les données relatives au signalement ainsi qu’une synthèse clinique ont été récoltées. L’obtention de données cliniques et épidémiologiques suffisantes au moment du diagnostic de néoplasie, l’utilisation hors homologation du toceranib et du masitinib après information complète et éclairée des propriétaires et, un suivi clinique et paraclinique suffisant afin d’évaluer de manière objective la réponse et la tolérance figuraient parmi les critères d’inclusion.

Avant l’initiation du traitement, un bilan clinique (examen clinique, mesure de la

pression artérielle par méthode Doppler), sanguin (numération formule sanguine, profil biochimique plasmatique de base) et urinaire (bandelette, densité, analyse du culot urinaire, rapport protéines/créatinine urinaire) a été réalisé afin d’évaluer l’état général, l’état des émonctoires et d’anticiper tout effet indésirable. Le toceranib était initialement prescrit à une dose cible de 2,5 mg/kg, 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Le masitinib était quant à lui initialement prescrit à une dose cible de 12,5 mg/kg tous les jours. Les doses étaient adaptées en fonction de la galénique de la spécialité.

La collecte des informations sur les différents chiens de l’étude, dénommés « cas » par la suite, s’est faite à partir de la base de données CLOVIS, qui répertorie tous les animaux vus à l’Ecole Vétérinaire de Lyon, quel que soit le service. Ainsi pour chacun des animaux ayant consulté à l’Ecole, la consultation et les examens cliniques et complémentaires sont inscrits dans le dossier informatique de l’animal concerné.

Nous avons inclus dans l’étude tous les chiens présentés à l’école vétérinaire de Lyon entre le 1er janvier 2009 et le 1er février 2017, dates de début et de fin d’étude. Nous avons ainsi obtenu un total de 18 cas.

86

B. Collecte des informations sur les cas de l’étude

La récolte des cas proprement dite s’est faite en différentes étapes. Il a été nécessaire de recroiser les résultats de recherche sur CLOVIS car il était impossible d’obtenir une liste exhaustive en une seule recherche. Les différentes recherches mises en place se sont faites par l’intermédiaire de l’onglet « Recherches... », puis l’onglet « Consultation ». On accède alors à un ensemble de critères qui permettent d’effectuer une recherche avancée. Ensuite, seulement trois critères ont été remplis. Pour deux des trois critères, la même information a été rentrée pour l’ensemble des recherches effectuées, comme illustré dans le tableau XVIII .

Tableau XVIII : Etapes de la recherche avancée.

Grande section concernée Critère de recherche Réponse souhaitée Animal Espèce Chien

Consultation Date => Date <=

« 01/01/09 » « 01/02/17 »

Le troisième critère « Motif de consultation » était le seul dont la réponse variait, ce qui nous a permis d’obtenir une liste exhaustive des consultations canines pour lesquelles une chimiothérapie à base d’inhibiteurs de tyrosine-kinases a été mise en place. Deux recherches différentes ont été lancées et sont consignées dans le tableau XIX.

Tableau XIX : Liste des deux types de recherches effectuées pour le troisième critère.

3ème critère : Motif de consultation

Nombre de consultations remplissant ces 3 critères

Inhibiteur de tyrosine kinase 46 Chimiothérapie 272

Etant donné que plusieurs des cas trouvés sont apparus dans une ou plusieurs recherches, les résultats ont été croisés afin d’éviter les redondances ce qui nous a permis d’inclure 18 cas.

Pour chacun des cas, un ensemble de variables a été répertorié à partir des comptes

rendus de consultations, ainsi que d’appels téléphoniques aux propriétaires quand les informations sur CLOVIS étaient incomplètes :

- Race - Sexe et statut hormonal - Age lors de la mise de place de l’ITK - Diagnostic - Maladie intercurrente - Dates de début et de fin d’administration de l’ITK - Traitement adjuvant - Tolérance - Réponse évaluée grâce aux critères établis par le VICOG (Annexe 1)

87

C. Evaluation de l’efficacité et de la toxicité du traitement.

1. Définir les réponses au traitement Avant de proposer un ITK dans la prise en charge d’un cancer autre qu’un

mastocytome, nous devons nous assurer que les options thérapeutiques classiques (chirurgie, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie) ne sont pas envisageables, soit parce que le stade de la maladie est trop avancé, soit parce que le propriétaire le refuse en toute connaissance de cause. Cette démarche thérapeutique doit s’inscrire dans le cadre du principe de la cascade et adopter une approche rationnelle de prescription (la responsabilité du praticien est directement engagée lors d’emploi d’un médicament hors AMM).

Les ITK sont souvent utilisés hors homologation dans les stades avancés de la maladie (présence de métastases) et/ou lors d’impasse thérapeutique (chirurgie impossible, échec de plusieurs protocoles de chimiothérapie, etc.). Aucun arbre décisionnel ne peut donc être appliqué, et leur usage doit rester raisonné et individualisé. Il est avant tout indispensable de définir une méthode rigoureuse afin d’évaluer la réponse de la tumeur et/ou des métastases au traitement instauré. Celle-ci est établie grâce aux critères RECIST (Response Evaluation Criteria for Solid Tumors in dogs), du VCOG (Veterinary Cooperative Oncology Group), qui sont, pour rappel :

- Une réponse complète est définie par une disparition des signes de la maladie évalués à au moins 3 semaines d’intervalle.

- Une réponse partielle est définie par une réduction supérieure à 30% de la somme

des diamètres les plus longs des lésions cibles mesurée à au moins 3 semaines d’intervalle.

- Une maladie est qualifiée de stable lorsque la maladie ne progresse pas.

- Une progression de la maladie est définie par une augmentation d’au moins 20%

de la somme des diamètres des lésions cibles, de la progression de lésions non cibles ou de l’apparition de nouvelles lésions.

- Une maladie contrôlée correspond à une réponse complète, partielle ou une

maladie stable.

2. Définir la toxicité recherchée en fonction des molécules utilisées

Un bilan à la fois clinique, sanguin et urinaire initial, ainsi qu’un bilan d’extension

complet sont réalisés (Tab. XX). Si le bilan initial est bon, le traitement est instauré. Les laboratoires mettent à disposition des vétérinaires des recommandations quant à la dose initiale de médicament, au suivi nécessaire et aux ajustements de dosage. Les doses conseillées se situent entre 2,4 et 3,25 mg/kg un jour sur deux ou trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi) pour le toceranib, et entre 6 et 12,5 mg/kg tous les jours chez le chien pour le masitinib. (18, 19, 22, 23, 25, 29, 75, 81, 86)

88

Tableau XX : Examens complémentaires réalisés avant un traitement avec des inhibiteurs de tyrosine-kinases hors homologation. (105)

Examen clinique

Examen clinique complet avec une mesure précise au pied à coulisse de chaque masse palpable

Analyse sanguine

Numération et formule sanguine, albumine, créatinine, protéines totales, urée, alanine amino-transférases (ALAT), bilirubine totale

Analyse d’urine

Densité et bandelette urinaires

Bilan d’extension

Radiographies thoraciques, échographies abdominales, analyse cytologique des nœuds lymphatiques sentinelles

3. Consentement éclairé des propriétaires

Une information précise et objective des propriétaires est essentielle et nécessaire à la bonne observance du traitement. Pour cela, les objectifs thérapeutiques sont fixés dès le début et ils se doivent de rester réalistes en fonction du niveau de preuve avancé dans les publications, ainsi qu’en fonction de l’état général de l’animal. Une information sur les coûts et la durée du traitement est aussi donnée dès le début de la mise en place du traitement, les différentes molécules utilisées étant onéreuses.

89

II. Résultats A. Population de chiens collectée

Tableau XXI : Sexe et statut hormonal de la série

La série de 18 chiens est composée de 9 femelles (50%) et 9 mâles (50%).

Parmi les femelles, 8 ont été stérilisées (89% des femelles), alors qu’une seule n’est pas stérilisée (11% des femelles). Parmi les mâles, 7 sont entiers (78% des mâles) et 2 mâles sont castrés (22%).

L’âge des chiens au début de la mise en place du traitement à base d’inhibiteurs de tyrosine-kinases varie de 4 à 13 ans, l’âge moyen est de 9,3 ans et l’âge médian est de 9,5 ans.

Figure 37 : Répartition graphique des chiens en fonction de leur âge. En ce qui concerne le traitement à base d’inhibiteurs de tyrosine-kinases, 16 chiens ont reçu du toceranib (Palladia®), et seulement 2 ont reçu du masitinib (Masivet®). Les doses exactes de chacune des molécules administrées seront présentées par la suite.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Nom

bre

Age

Répar..ondeschiensenfonc.onsdeleurâge

Sexe Stérilisé Non stérilisé

Femelle (n=9) 8 1 Mâle (n=9) 2 7

90

B. Diagnostic et traitement

Tableau XXII : Diagnostic et traitements mis en place.

Animal Diagnostic ITK et dose

(en mg/kg)

Traitement adjuvant précédant

Traitement adjuvant

concomittant

Angèle

Ostéosarcome scapulaire avec métastases pulmonaires

Toceranib

2,88

Firocoxib 4,67

mg/kg SID Cyclophosphamide

15mg/m2 SID

Gabapentine

8,2mg.kg BID Firocoxib 4,67

mg.kg SID Cyclophosphamide 15mg/m2 SID

Vahine Adénocarcinome thyroïdien folliculaire solide avec métastases pulmonaires

Toceranib 2,3

-

Colleen

Carcinome des cellules transitionnelles de la vessie répondant partiellement à la

radiothérapie et à la mitoxantrone

Toceranib 2,5

Meloxicam 0,1 mg/kg SID

Mitoxantrone (5,5mg/m2)

Radiothérapie

Mitoxantrone (5,5mg/m2)

Dianoe Carcinome indifférencié de stade 4 de la base de la griffe

du doigt III du membre thoracique gauche

Toceranib 2,5

-

Firocoxib 5 mg.kg SID

Cyclophosphamide 15mg/m2 SID

Eros Synoviosarcome du tarse droit de grade 3 avec

métastases pulmonaires

Toceranib 2,7

Amputation Carprofène 4 mg/kg SID

Urikane Sarcome métastatique de l’humérus gauche et du

corps vertébral de L2, avec de nombreuses masses

hépatiques dont l’origine primaire est non identifiée

Toceranib 2,46

- Firocoxib 5mg.kg SID

S-adénosyl méthionine 400mg

SID Cyclophosphamide

15mg/m2 SID Leeloo Ostéosarcome de la cavité

buccale Toceranib

2,5 Prednisolone 0,5mg/kg SID

Prednisolone 0,5mg/kg SID

Bosco Fibrosarcome récidivant en région infra-et rétro-

orbitaire, sans métastases mais très agressif localement

Toceranib 2,45 puis 2 puis 2,75

- Prednisolone 0,5mg/kg SID

Roxy Adénocarcinome pancréatique avec

métastases hépatiques et carcinomatose abdominale

Masitinib 14,2

- Prednisolone 1mg/kg SID

91

Maika Sarcome des tissus mous sur l’épaule gauche avec

métastases pulmonaires

Toceranib 2,75

Chlorambucil 0,06mg/kg

Prednisolone 2mg/kg SID

Prednisolone 0,5mg/kg SID

Eops

Ostéosarcome du métacarpe droit avec métastases

pulmonaires

Toceranib 2,64

Amputation complète du

membre Carboplatine + Doxorubicine

Cyclophosphamide 15mg/m2 SID

Diego Chémodectome de la base cardiaque de stade I

Toceranib 3

Péricardectomie -

Victor Carcinome épidermoïde du plantum nasal

Toceranib2,6

Piroxicam 0,2 mg/kg SID

-

Bambou Chémodectome malin sans métastases

Toceranib 2,75

Péricardectomie Meloxicam

0,1mg/kg SID

Meloxicam 0,1mg/kg SID

Valisqua Carcinome amygdalien adéno-squameux gauche

Toceranib 3

Amygdalectomie Cyclophosphamide 15mg/m2 Piroxicam 0,25mg/kg

Lulu Mélanome oral de stade III Toceranib 3,75

- Firocoxib 7,5mg/kg SID

Cyclophosphamide 15mg/m2

Autovaccin APAVAC*

Micky Lymphome cutané T non épithéliotrope anaplasique,

sans généralisation

Masitinib 12,5

Prednisolone 0,5mg/kg PO SID

Prednisolone 2mg/kg PO SID 15j puis 1mg/kg

PO SID 15j Oliver Myxosarcome en région

inter-scapulaire droite Toceranib

2,5 - Prednisolone

0,5mg/kg *Procédé APAVAC : Le procédé APAVAC permet de purifier certaines protéines anormales à partir d'une biopsie tumorale et les associer ensuite à un adjuvant afin de stimuler le système immunitaire du patient contre les cellules cancéreuses.

On peut classer les différentes tumeurs présentes dans cette étude en plusieurs grands groupes, représentés dans la figure 38:

- Sarcome des tissus mous (n=1) - Myxosarcome (n=1) - Ostéosarcome (n=4) - Synoviosarcome (n=1) - Carcinome et adénocarcinome (n=6) - Lymphome (n=1) - Mélanome (n=1)

92

- Chémodectome (n=2) - Fibrosarcome (n=1)

Figure 38 : Représentation graphique des différents types tumoraux étudiés.

On constate donc que les deux types tumoraux majoritaires dans notre étude sont à

33,3% les carcinomes/adénocarcinomes (n=6) et à 22,2% les ostéosarcomes (n=4). On a ainsi 9 grandes catégories de tumeurs dans notre étude, ce qui est représentatif de la population globale.

La dose moyenne de toceranib administrée est de 2,7 mg/kg, trois fois par semaine, à savoir les Lundi, Mercredi et Vendredi.

Parmi les 18 cas, deux ont été traités avec du masitinib à 12,5 mg/kg une fois par jour

ainsi qu’avec de la prednisolone à 1 ou 2 mg/kg une fois par jour : il s’agit d’un lymphome cutané T non épithéliotrope anaplasique, sans généralisation et d’un adénocarcinome pancréatique avec métastases hépatiques et carcinomatose abdominale.

Par ailleurs, il faut savoir que 4 cas présentaient une maladie intercurrente sous-

jacente, à savoir : - Vahiné, présentant une hypothyroïdie contrôlée grâce à de la Levothyroxine à la

dose de 15 µg/kg BID, et du Calcitriol à la dose de 0,2 µg/kg SID en fin de journée.

- Diego, présentant une maladie valvulaire dégénérative de stade I ou B2 débutant traitée avec du Bénazépril à la dose de 0,25 mg/kg PO SID.

- Lulu, présentant une cardiopathie dont le diagnostic n’a pu être approfondi. - Victor, présentant un diabète sucré, diagnostiqué à l'âge de 4 ans, parfaitement

contrôlé par 30 UI d'insuline BID. Cette maladie sous-jacente intercurrente peut interférer avec nos résultats du fait de l’affaiblissement de l’état général du chien, et de la présence d’autres médications en parallèle des ITK. Néanmoins, seuls 4 chiens sur 18 sont concernés par la présence de cette maladie intercurrente (22%), et la maladie est correctement voire parfaitement contrôlée et stabilisée pour 3 cas, soit 75% (3/4) des chiens concernés.

TypedetumeursCarcinomeetadénocarcinome

Sarcomedestissusmous

Myxosarcome

Ostéosarcome

Synoviosarcome

Lymphome

Mélanome

Chémodectome

Fibrosarcome

93

C. Qualité de la réponse et survie

Tableau XXIII : Liste du temps de survie en fonction de la durée du traitement à base d’ITK et de la qualité de la réponse.

Chien Durée du

traitement (en jours)

Qualité de la réponse au traitement (critères VICOG)

Temps de survie depuis la mise en place de l’ITK

(en jours) Angèle 47 Maladie progressive 47 Vahine 91 Maladie stable 91 Colleen 410 Réponse partielle 30% Encore en vie

(>940j)* Eros 2 Mort subite à 48h 2

Dianoe 150 Maladie progressive 160 Urikane 120 Maladie progressive 120 Leeloo 290 Réponse partielle 30% 301 Bosco 520 Maladie stable 700 Roxy 29 Maladie progressive 30 Maika 125 Maladie stable 130 Eops 169 Maladie progressive 197 Diego 300 Réponse partielle 50% Encore en vie (>600j)* Victor 137 Maladie stable 137

Bambou 60 Maladie progressive 390 Valisqua Depuis le

10.07.2015 (>600j)

Réponse complète Encore en vie (>600j)*

Lulu 214 Maladie progressive 214 Micky 27 Réponse complète 27 Oliver 90 Maladie progressive 90

*: valeur valable au 1er février 2017

Dans notre étude, la moyenne de durée du traitement est de 188 jours, ce qui représente un peu moins de 6 mois de traitement. La médiane est quant à elle de 131 jours, ce qui représente un peu plus de 4 mois. Par ailleurs, le temps de survie moyen est de 285 jours soit un peu plus de 9 mois. La médiane est quant à elle de 149 jours, soit environ 5 mois.

Tableau XXIV: Moyennes et médianes des durées de traitement et de survie.

Moyenne (en jours) Médiane (en jours) Durée de traitement 188 131 Durée de survie 285 149

94

Figure 39 : Représentation graphique de la qualité des réponses.

Nous pouvons ainsi constater que 50% des chiens (9/18) de cette étude ne répondent pas au traitement mis en place, c’est à dire qu’ils présentent soit une mortalité brutale (5,5% des chiens, n=1) soit une maladie progressive (44% des chiens, n=8) A contrario, 2 chiens (11%) ont présenté une rémission complète. La maladie a été contrôlée (réponse complète, partielle ou maladie stable) grâce à la mise en place des ITK pour 9/18 chiens soit 50%.

D. Effets secondaires et intolérance au traitement

Dans cette dernière partie, nous allons nous intéresser aux effets secondaires cliniques et biologiques dus à l’administration des ITK.

Tableau XXV : Liste des effets secondaires et des conséquences en fonction du traitement.

Animal Diagnostic ITK et

dose (en mg/kg)

Effets secondaires Conséquences

Angèle Ostéosarcome scapulaire

Toceranib 2,88

Bonne tolérance -

Vahine Adénocarcinome thyroïdien

folliculaire solide

Toceranib 2,3

Neutropénie grade 2*

Arrêt toceranib : 2 semaines

Colleen Carcinome des cellules

transitionnelles de la vessie

Toceranib 2,5

Neutropénie grade 2 Pancréatite récidivante

Arrêt toceranib : 2 semaines Puis arrêt définitif

2

3

4

8

1

Qualité de la réponse au traitement

Réponse complète

Réponse partielle

Maladie stable

Maladie progressive

Autre

95

Dianoe Carcinome indifférencié de

stade 4 de la base de la griffe du doigt III

du MTG

Toceranib 2,5

Protéinurie marquée (RPCU=5,5)

Arrêt toceranib : 2 semaines

Eros Synoviosarcome du tarse droit de grade 3

Toceranib 2,7

Mort subite -

Urikane Sarcome métastatique de

l’humérus gauche et du corps vertébral de

L2

Toceranib 2,46

Bonne tolérance -

Leeloo Ostéosarcome de la cavité buccale

Toceranib 2,5

Abattement marqué Arrêt toceranib : 10 jours

Bosco Fibrosarcome récidivant en région

infra-et rétro-orbitaire

Toceranib 2,45 puis

2 puis 2,75

Leucopénie modérée à sévère

Diminution de la dose de toceranib,

arrêt définitif 6 mois avant décès

Roxy Adénocarcinome pancréatique

Masitinib 50 mg/j

SID

Fort abattement général avec anorexie au bout de 3 semaines de traitement

Décès

Maika Sarcome des tissus mous sur l’épaule

gauche

Toceranib 2,75

PUPD, amaigrissement, épisodes de

vomissements, anorexie et diarrhées,

hypoalbuminémie

Arrêt toceranib 4 mois avant décès

Eops

Ostéosarcome du métacarpe droit

Toceranib 2,64

Bonne tolérance -

Diego Chémodectome de la base cardiaque de

stade I

Toceranib 3

Bonne tolérance. Episode de

thrombocytopénie sévère (plaquettes 8000/µL)

Arrêt toceranib : 1,5mois

Victor Carcinome épidermoïde du plantum nasal

Toceranib 2,6

Bonne tolérance -

Bambou Chémodectome malin

Toceranib 2,75

Bonne tolérance -

Valisqua Carcinome amygdalien adéno-squameux gauche

Toceranib 3

Episodes de cystites hémorragiques stériles

subcliniques.

-

Lulu Mélanome oral de stade III

Toceranib 3,75

Bonne tolérance -

Micky Lymphome cutané T non épithéliotrope

anaplasique

Masitinib 12,5

Episode de méléna, anorexie et faiblesse

généralisée

Décès

96

Oliver Myxosarcome en région inter-

scapulaire droite

Toceranib 2,5

Leucopénie, hypoalbuminémie et

augmentation des PAL

Diminution de la dose de toceranib à 2 et arrêt de la corticothérapie

* neutropénie grade 2 (selon VCOG, Annexe 2) : nombre de neutrophiles compris entre 1000-1499/µL D’après le tableau XXV , on peut voir globalement que trois cas de figures apparaissent :

- 33% des chiens (n=6) présentent une bonne tolérance sans aucun effet secondaire. - 50% des chiens (n=9) présentent une bonne tolérance malgré la présence d’un

épisode d’apparition d’effets secondaires. - 17% des chiens (n=3) décèdent des suites d’effets secondaires trop importants (liés

à l’ITK ou à la maladie elle-même). On peut ainsi s’apercevoir que 67% des animaux (12 chiens) ne tolèrent pas (par épisode ou ne tolèrent pas totalement) le traitement à base d’ITK. Plus précisément, les effets secondaires rencontrés peuvent être classés et regroupés en différentes catégories :

- Altération de l’état général : abattement, amaigrissement, anorexie... - Vomissements/diarrhées - Hépatotoxicité - Affection du tractus urinaire : cystite hémorragique, présence d’une protéinurie... - Modification de la numération formule sanguine : leucopénie, neutropénie,

thrombocytopénie... En regroupant ainsi les effets secondaires, on obtient alors la figure 40 ci-dessous :

Figure 40 : Représentation graphique des différents types d’effets secondaires. NFS* : Numération Formule Sanguine. Ses modifications incluent 2 neutropénies, 1

leucopénie et 1 thrombocytopénie.

Effets secondaires

Atteintedel'étatgénéral

Hépatotoxicité

ModigicationsdelaNFS*

Atteintedel'appareiluro-génital

Effetssecondairesdigestifs

97

Dans 11,1% des cas (n=2), les effets secondaires liés au traitement ou liés à la maladie ont été d’une telle sévérité que l’animal est décédé (euthanasie ou décès non provoqué). Il a fallu, pour 44,4% des chiens (n=8), diminuer la dose d’ITK administrée, voir arrêter temporairement ou définitivement le traitement.

E. Discussion

1. Comparaison de nos résultats

a. Population La population de notre étude comporte un nombre de cas (18 chiens) satisfaisant, même s’il reste plus faible que dans les études publiées (34 cas dans l’étude de Kitchell B (54), 57 dans celle menée par London C. (73)). La proportion de mâles et de femelles est représentative de la population globale (50%-50%). L’âge moyen des chiens, qui est de 9,3 ans dans notre étude, est également celui obtenu dans les publication : l’âge moyen des chiens est de 10 ans dans l’étude de London C. en 2012 (75) et de 8 ans dans son étude de 2003 (73).

b. Types tumoraux

Les types tumoraux majoritairement présents dans notre étude sont, comme nous l’avons déjà décrit, les carcinomes (et adénocarcinomes) au sens large, les sarcomes des tissus mous, les ostéosarcomes ainsi que les chémodectomes. Ces résultats sont également ceux retrouvés dans les études publiées, que cela concerne les études relatives à l’utilisation du mastinib ou du toceranib.

Néanmoins, aucun cas d’hémangiosarcome n’a été traité avec un ITK à l’école depuis le 1er janvier 2009, et seulement un cas de lymphome a pu être étudié (cas d’un lymphome T cutané épithéliotrope, présentant une réponse complète au traitement à base de masitinib pendant 27 jours, cf Tab. XXV). Ceci est lié au fait que les cas de lymphomes cutanés répondent plutôt bien dans l’ensemble aux traitements conventionnels mis en place en première intention. Les hémangiosarcomes, quant à eux, sont préférentiellement traités par chirurgie puis chimiothérapie à dose maximale tolérée suivie par une chimiothérapie métronomique. (121)

Or, dans l’étude menée par Kitchell B. en 2012 (54), la maladie a été contrôlée à

l’aide de l’utilisation de masitinib chez 9 chiens sur 22 présentant un lymphome, et chez 2 chiens sur 12 présentant un hémangiosarcome. Ces résultats sont malgré tout assez encourageants, et des essais thérapeutiques sur des nouveaux cas d’hémangiosarcomes ou de lymphomes ne répondant pas au traitement conventionnel pourraient être envisagés au sein de l’école vétérinaire de Lyon.

98

c. Traitements

Concernant les doses d’inhibiteur de tyrosine-kinases administrées, la dose de toceranib moyenne utilisée dans notre étude (2,7 mg/kg) est similaire à la dose utilisée dans l’étude de London C. en 2012 (75), à savoir 2,8 mg/kg.

Pour le masitinib, la dose moyenne utilisée sur nos deux cas est de 13,2 mg/kg, ce qui reste légèrement plus élevé que la dose utilisée lors de l’étude de Kitchell B. (12,5 mg/kg). Cependant, la dose dépend du poids et du conditionnement des comprimés. Cette dose peut donc varier très facilement afin de faciliter la prise quotidienne des comprimés.

Par ailleurs, les trois types de traitements adjuvants utilisés dans les publications (à savoir AINS, cyclophosphamide et piroxicam) sont également les plus utilisés dans notre étude. Néanmoins, nous avons dû utiliser chez 6 chiens sur 18 (33,3%) de la prednisolone, ce qui n’a pas été décrit dans les études ultérieures. Il est cependant impossible de savoir si de la prednisolone a été utilisée lors de ces études antérieures, mais la prednisolone n’est pas considérée comme traitement adjuvant dans ces publications, ou bien si celle-ci n’a en aucun cas été utilisée.

d. Réponses Comparons à présent la réponse clinique au traitement. Les résultats obtenus suite à

notre étude sont les suivants : 50% des chiens ont répondu au traitement et 50% des chiens n’ont pas répondu au traitement à base d’ITK. Ces résultats diffèrent fortement de ceux trouvés par C. London en 2012 (75), pour qui 74% des chiens ont répondu au traitement à base de toceranib.

Cependant, lors d’une précédente étude menée par C. London en 2003 (73), 57 chiens

présentant différentes tumeurs ont pu être traités avec du toceranib (SU11654) per os. Des réponses objectives ont pu être mesurées pour 16 chiens (dont 6 réponses complètes), plus précisément 11 mastocytomes, 2 carcinomes mammaires, 2 sarcomes des tissus mous et 1 myélome multiple, soit un taux de réponse total de 28% (16 sur 57). Une maladie stable (>10 semaines) a été retrouvée sur 15 chiens. On a donc un taux de réponse de 54% (31 sur 57). Ce taux de réponse est donc similaire à celui de notre étude.

e. Effets secondaires

Les effets secondaires retrouvés au cours de notre étude sont similaires à ceux des différentes études publiées. Premièrement, dans l’étude de 2012 de Robat C. (98), 77,6% des chiens ont présenté des signes cliniques et/ou biologiques d’intolérance, contre 67% dans notre étude, ce qui est relativement identique. Mais les proportions représentant chaque classe de signes cliniques (digestif, atteinte de l’état général...) et de signes biologiques diffèrent quant à eux. En effet, dans notre étude, les signes cliniques majoritairement retrouvés sont une atteinte de l’état général et des modifications biologiques de la numération formule (présence d’une neutropénie en grande majorité), tandis que les signes cliniques les plus présents dans les études sont, d’une part, également une

99

atteinte de l’état général, mais aussi de nombreux troubles digestifs, qui sont nettement plus majoritaires que les perturbations biologiques de la numération formule sanguine.

De plus, il est noté dans le RCP que les effets secondaires les plus fréquemment rencontrés (1 chien sur 10) lors de l’utilisation du toceranib et/ou du masitinib (dans le cadre de l’AMM, cf. Partie I, III. A)), sont de la diarrhée, une neutropénie, une perte de poids, la présence de sang dans les fèces, une diarrhée hémorragique ou des saignements gastro-intestinaux, une anorexie, une léthargie, des vomissements... Néanmoins, il faut garder à l’esprit que ces répercussions cliniques et biologiques ne sont pas toujours uniquement dues à l’administration des ITK mais peuvent être parfois corrélées aux molécules des traitements adjuvants (prednisolone, cyclophosphamide, anti-inflammatoires non stéroïdiens...) et/ou à la maladie elle-même (qui est généralement de stade avancé lors de la mise en place du diagnostic). On constate donc finalement que les ITK sont des molécules ayant de nombreux effets secondaires, dont la sévérité est très variable, et qu’il faut impérativement adapter la posologie et soit diminuer la dose d’ITK administrée soit arrêter l’administration temporairement voire définitivement dès lors que ces effets indésirables surviennent. Finalement, tous les résultats que nous avons obtenus grâce à notre étude sont retrouvés dans les différentes études menées au cours des années précédentes. Les résultats, en termes de réponse et de confort de vie, sont assez satisfaisants dans l’ensemble, malgré la présence de nombreux effets secondaires, dont les proportions varient d’une étude à l’autre.

2. Biais-discussion

Les erreurs, lacunes et imprécisions ont été des obstacles récurrents que nous avons rencontrés lors de la collecte des données de l’étude. En effet, Les informations recueillies ne proviennent pas directement des propriétaires et des cas eux-mêmes mais de la base de données utilisée et complétée par plusieurs personnes intermédiaires. Lorsque les informations ont pu être recueillies directement auprès des propriétaires par appels téléphoniques, certaines données ont alors été complétées. Néanmoins, il est important d’orienter correctement les questions, afin que le propriétaire puisse répondre le plus précisément qu’il soit.

Une des principales limites de cette étude a été la prise de l’anamnèse et des commémoratifs (quantifier la durée d’évolution des symptômes par exemple) de manière systématisée et uniforme auprès des propriétaires. L’ensemble des cas ayant été recueillis au sein d’une structure universitaire, chacun d’eux a été pris en charge par plusieurs étudiants. A chaque cas correspond une équipe d’étudiants différents. De ce fait, le recueil des informations peut s’avérer être différent. Une évidente absence d’uniformisation dans la manière de compléter les informations rentrées par les étudiants dans la base de données CLOVIS pour chaque animal a été observée.

Néanmoins, l’examen clinique de l’animal ainsi que la synthèse des commémoratifs sont effectués à chaque consultation par le sénior et validées dans le compte rendu clinique. Afin d’estimer la taille des lésions tumorales, les mesures sont effectuées à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui permet globalement de s’affranchir des variations, même si de légères variations intra-observateur ne peuvent être exclues. De plus, les critères s’appuient sur ceux

100

de la classification du VCOG, ce qui limite la présence de biais.

Par ailleurs, le nombre de cas recueillis reste assez faible pour pouvoir réaliser une étude statistique. Ceci est dû au fait que l’utilisation des ITK est un traitement de dernière ligne, à titre palliatif, sur des cas de stade avancé, pour lesquels aucun autre traitement standard n’est plus efficace. Compte tenu du stade avancé de la maladie les propriétaires peuvent aussi décliner cette dernière proposition de traitement palliatif. Il en est de même quant à la représentation des différents types tumoraux, où notre cohorte est assez hétérogène et bien représentative des nombreux types tumoraux existants. C’est pour cela que cette étude rétrospective est une étude qualitative et descriptive. Enfin il est important de noter que les effets secondaires présentés ne sont pas toujours imputables à l’administration des ITK. Ils peuvent en effet être dû au stade avancé de la maladie dans certains cas, à son extension, et à la fragilisation de l’organisme par celle-ci.

De plus, la qualité et le confort de vie de l’animal durant le traitement sont un élément important à prendre en compte en dehors de la progression ou non de la maladie. Cet élément n’a pas souvent été indiqué dans les compte-rendus de consultation. Les propriétaires auxquels nous avons pu poser la question par appel téléphonique ont été globalement satisfaits de la qualité de vie de leur animal. Néanmoins leur réponse est souvent biaisée par la pensée que leur animal est décédé au moment du recueil de cas pour l’étude à posteriori et leur réponse n’est donc plus très objective.

3. Perspectives d’avenir

Le masitinib a fait l’objet de nombreuses études in vitro au cours des dernières années. Son potentiel rôle adjuvant en tant qu’agent chimiosensibilisant et radiosensibilisant, et surtout son effet sur la glycoprotéine P, entraînant une potentielle réversion de la résistance à la doxorubicine, sont des effets très intéressants. (61, 116, 124).

De plus, une efficacité sur des lignées cellulaires d’hémangiosarcome et d’ostéosarcome canins, ainsi que sur des lignées de cellules de sarcome au site d’injection chez le chat a été mise en évidence, ouvrant la voie à des études cliniques. (32, 61, 77)

Le toceranib vient de faire l’objet de plusieurs essais pilotes dont les résultats sont

attendus prochainement. Son association avec la vinblastine dans la prise en charge thérapeutique des carcinomes à cellules transitionnelles de la vessie, ainsi que ses effets cliniques lors d’ostéosarcome chez le chien ont notamment été publiés. Chez l’homme, le masitinib présente un intérêt thérapeutique dans le traitement des GIST, des mélanomes, les myélomes multiples, le cancer du pancréas et les mastocytoses, mais également dans le traitement de maladies inflammatoires telles que l’arthrite rhumatoïde, l’asthme, la sclérose en plaque et la maladie d’Alzheimer. Les études de phase III actuellement en cours concernant l’utilisation du masitinib sont (1) :

- traitement de 1ere ligne et de 2nde ligne des GIST - mélanome métastatique avec une mutation JM de c-Kit - cancer du pancréas - cancer colorectal métastatique avec rechute - lymphome T périphérique avec rechute - tumeur ovarienne métastatique avec rechute

101

De nombreuses autres molécules sont actuellement sur le marché en médecine humaine, telles que l’imatinib. L’apparition de nombreuses résistances à cette molécule a permis le développement d’autres ITK, telles que le sunitinib, le gefitinib, l’erlotinib, le sorafenib... Leur utilisation seule ou associée à d’autres molécules de chimiothérapie se révèle efficace à l’encontre de nombreux types tumoraux (Tab. XXVI).

Tableau XXVI : Etat actuel du développement clinique du masitinib en médecine humaine et statuts de ses compétiteurs. (1)

SPONSOR COMPOSÉ INDICATION STATUS AB Science Masitinib Mastocytome cutané avec

handicape, systémique indolent Phase III

AB Science Masitinib GIST

Phase III Novartis Imatinib Approuvé

Pfizer Sunitinib Approuvé Novartis Nilotinib Phase III

Ab Science Masitinib Arthrite rhumatoïde

Phase III AstraZeneca Fostamatinib Phase III

Pfizer Tofacitinib Phase III AB Science Masitinib Mélanome avec mutation JM de

c-Kit Phase III

Novartis Nilotinib Phase III AB Science Masitinib Cancer du pancréas

avancé/métastatique en combinaison avec la Gemcitabine

Phase III OSI

Pharmaceuticals Erlotinib, Tarceva

FDA Approuvé

AB Science Masitinib Myélome multiple Phase III AB Science Masitinib Asthme sévère persistant Phase III AB Science Masitinib Sclérose en plaque Phase III

102

103

Conclusion La cancérologie est un domaine de la médecine vétérinaire aujourd’hui en plein développement. Les thérapies moléculaires ciblées sont une nouvelle voie thérapeutique très encourageante. Les inhibiteurs de tyrosine-kinases ont prouvé leur efficacité à l’encontre des mastocytomes chez le chien. Deux ITK ont été mis sur le marché vétérinaire pour cette indication : il s’agit du toceranib (Palladia®) et du masitinib (Masivet®). Ces deux molécules possèdent, entre autre, une forte affinité et une forte spécificité à l’égard d’une protéine tyrosine-kinase fortement exprimée par les cellules tumorales impliquées dans les mastocytomes, les GIST, et les tumeurs mammaires chez l’homme et chez le chien : la protéine c-Kit. Cette protéine est notamment retrouvée sous forme mutée et non-mutée dans les processus tumoraux, et son inhibition par les ITK entraîne un arrêt de la prolifération cellulaire ainsi qu’une apoptose des cellules cancéreuses qui l’expriment. De plus en plus d’études s’orientent aujourd’hui vers l’utilisation des ITK hors AMM contre les autres types tumoraux, pour leurs actions sur divers RTK et pour leurs rôles sur le microenvironnement tumoral. Notre étude rétrospective a permis de recruter 18 chiens atteints de tumeurs de divers types, présentés en consultation à VetAgro Sup et pour lesquels aucun traitement standard ne pouvait être utilisé. Ces chiens ont reçu du toceranib (16 chiens) ou du masitinib (2 chiens) hors AMM. La durée moyenne du traitement était de 188 jours, et le temps de survie moyen de 285 jours. La maladie a été contrôlée pour 9 chiens, dont 2 ayant présenté une rémission complète. Des effets secondaires au traitement sont apparus chez 12 chiens, provoquant chez 2 chiens une mort brutale. Finalement, les résultats obtenus, dans notre étude, en terme de réponse au traitement et de confort de vie sont encourageants, malgré la présence d’effets secondaires dont la sévérité varient d’un individu à un autre. Une approche multimodale combinant traitements standard, et notamment cytotoxiques, et thérapies ciblées permet déjà, chez l’homme, d’apporter des rémissions plus longues et encourage les vétérinaires oncologues dans cette voie d’avenir.

104

105

Bibliographie __________________________________________________

1. AB SCIENCE. (Page consultée le 11 janvier 2017) http://masivet.com/.

2. ABADIE J.J. et al. 1999. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in mast cell tumors from dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc., 215, (11), 1629-34.

3. ADAMS V.R., LEGGAS M. 2007. Sunitinib malate for the treatment of metastatic

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119. WEBSTER J.D., YUZBASIYAN-GURKAN V., MILLER R.A., KANEENE

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115

116

117

ANNEXES _____________________________________________

Annexe 1: Classification des neutropénies. CTACAE : Common Terminology Criteria For Adverse Event, Veterinary Cooperative

Oncology Group, 2009 Vol 4 pp.77

118

Annexe 2 : RECIST : Response Evaluation Criteria for Solid Tumors in dogs (v1.0) : a Veterinary Cooperative Oncology Group (VCOG) consensus

document. Nguyen S., Thamm D., Vail D., London C. (2013).

Patient présentant une maladie ciblée. Lésions cibles Lésions non-

cibles Nouvelles lésions Réponse

CR CR Non CR CR SD ou NE Non PR PR SD ou NE Non SD NE SD ou NE Non NE PD Aucune Oui ou non PD

Aucune PD Oui ou non PD Aucune Aucune Oui PD

CR : Réponse complète PR : Réponse partielle NE : Non évaluable PD : Maladie progressive SD : Maladie stable

Patient présentant une maladie non ciblée. Lésions non cibles Nouvelles lésions Réponse

CR Non CR SD Non SD NE Non NE PD Oui ou non PD

Aucune Oui PD

119

BALLY Alice UTILISATION HORS AMM DES INHIBITEURS DE TYROSINE-KINASES EN CANCEROLOGIE CHEZ LE CHIEN : ETUDE RETROSPECTIVE DE DIX-HUIT CAS. Thèsed’EtatdeDoctoratVétérinaire:Lyon,le 7 juillet 2017 RESUME : Les inhibiteurs de tyrosine-kinases sont une nouvelle classe de molécules de chimiothérapie en médecine humaine et vétérinaire. Ils ciblent ces enzymes qui sont fortement impliquées dans le développement de tumeurs chez l’homme et le chien. Les protéines tyrosine-kinases sont exprimées dans de nombreuses tumeurs, autres que les mastocytomes, où elles sont particulièrement impliquées dans la néovascularisation tumorale mais aussi dans les voies de signalisation de la croissance et de la survie cellulaires. Deux molécules possèdent une AMM à l’heure actuelle pour le traitement des mastocytomes cutanés non opérables chez le chien : il s’agit du masitinib (Masivet®) et du toceranib (Palladia®). Chez l’homme, de nombreuses molécules ont été développées, la plus connue est l’imatinib (Gleevec®), utilisée lors de leucémie myéloïde chronique. Notre travail consiste en l’étude de l’efficacité des inhibiteurs de tyrosine-kinases utilisés hors homologation chez 18 chiens atteints de tumeurs ne répondant pas aux traitements conventionnels. Cette étude a également pour objectif d’évaluer le confort de vie des animaux ainsi que les effets secondaires provoqués par les molécules utilisées. Chez l’homme comme chez le chien, l’utilisation des inhibiteurs de tyrosine-kinases hors AMM, seuls, ou lors de thérapie combinée avec des anticancéreux classiques, représente une nouvelle voie thérapeutique très encourageante. MOTS CLES : - Chimiothérapie

- Chien - Inhibiteurs des tyrosine kinases - Protéine kinase - Sarcome

JURY :

Président : Madame le Professeur Françoise MORNEX 1er Assesseur : Madame le Professeur Frédérique PONCE 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Jean-Luc CADORE

DATE DE SOUTENENACE : Vendredi 7 juillet 2017 ADRESSE DE L’AUTEUR : 7bis rue FETOLA

38120 FONTANIL-CORNILLON