ToxicitC genetique du chlorure de methylmercure (CH3HgCl) sur les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae'

J. PHIPPS ET D. R. MILLER Ecotoxicologie, Division des Sciences Biologiques, Conseil national de recherches Canada, 100 Promenade Sussex,

Ottawa, Ont., Canada KIA OR6 ApprouvC le 5 mai 1983

PHIPPS, J., et D. R. MILLER. 1983. Toxicitt gCnCtique du chlorure de mCthylmercure (CH3HgCl) sur les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae. Can. J . Microbiol. 29: 1149-1 153.

L'organomercuriel mCthylmercure (11) ne semble pas induire de mutants cytoplasmiques "petite colonie" rho- parmi les souches de Saccharomyces cerevisiae testCes. Par contre, il induit la mutation rtsistance a 1'Crythromycine Eryr. Nous avons pu montrer dans ce cas l'existence d'un effet dose-rCponse. Ces effets du methylmercure sont discutks dans l'optique de la part que des Itsions discrktes du DNA pourraient prendre dans l'explication du mCcanisme de toxicit6 de I'organomercuriel.

PHIPPS, J., and D. R. MILLER. 1983. ToxicitC gCnCtique du chlorure de mCthylmercure (CH3HgCl) sur les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae. Can. J . Microbiol. 29: 1149-1153.

Among the strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae we investigated, the organic form of mercury:methylmercury (11) does not seem to induce any cytoplasmic mutant "petite colonie" rho-. However, it induces a significant number of the erythromycin-resistant mutant Ery'. A dose response is shown. These effects are discussed in the view of the part that discrete DNA lesions could take in the explanation of the mechanism of toxicity of the organomercurial.

Introduction Les formes organiques des mCtaux sont particuli5re-

ment toxiques h faible dose et il n'est nu1 besoin d'insister sur les aspects divers que revet la nocivitt du methylmercure (Reuhl et Chang 1979; Miller et Miller 1979). Chez l'homme notamment, la dissociation acro- centrique des chromosomes a CtC imputie, in vivo, A l'action d'organomercuriels (Verschaeve et al. 198 1). Chez les microorganismes, le methylmercure n'induit qu'un faible nombre de mutations nuclkaires (Nakai et Mashida 1973; Taira et Ohhashi 1980). Par contre, des mutants cytoplasmiques petite colonie ont CtC observCs chez la levure par Nakai et Mashida (1973). Plus rCcemment, l'induction de ces m&me mutants par le mercure inorganique a CtC signalee par Fukunaga et al. (1981).

Nous avons CtudiC les effets gCnCtiques du methyl- mercure sur les mitochondries de Saccharomyces cere- visiae, nos expCriences prkliminaires ayant montre que (i) une des consCquences du traitement au mtthylmer- cure Ctait la diminution de l'absorption d'oxygkne en culture aCrobie (rCsultats non publies) et (ii) ce produit a un effet cytostatique sur les levures (Phipps et Miller 1982) ce qui laisse prksager une activitC mutaghe.

Deux grandes classes de mutations sont caractkristi- ques du gtnome mitochondria1 des levures: (i) l'appari- tion de cellules rho- ou "petite colonie" chez lesquelles le DNA a perdu suffisamment de son intCgritC pour que les mitochondries ne soient plus fonctionnelles (Lusena et James 1976; Whitaker 1979) et (ii) l'apparition de mutants rksistants aux antibiotiques, capables de res-

'NRCC No. 22552.

piration, mais dont le DNA est lCsC (mutations ponc- tuelles (Linnane et al. 1968; Netter et al. 1974; Lawrence 1982)).

Notre but ultime n'est pas d'inventorier tous les types de mutations que pourrait engendrer le mkthylmercure chez divers organismes, mais de rechercher s'il occa- sionne au gCnome des dommages susceptibles d'expli- quer tout ou partie de sa toxicite.

Materiel et methodes Souches

Les souches diploide D7 ade 2-40/+ade 2-1 19, trp- 5-12/trp 5-27, ilv 1-92/ilv 1-92, et haploides C 465, RAD+ , arg 4, lys 1; C 324-5Aa, RAD+, lys 1, proviennent de la collection du Conseil national de recherches Canada (CNRC). Les mutants "petite" neutres C33-19B, a ad6 url et C81-14A aarg4 ont CtC aimablement fournis par A. L. James (CNRC).

Culture Les cellules sont cultivCes dans un milieu liquide YEPD

(extrait de levure DIFCO, 1 %; Bacto-peptone, 2%; glucose, 2%; dans de l'eau distillee dCionisCe). Les Ctalement sont effectuts sur milieu YEPD additionne de 2% d'agar ou sur YPG (similaire YEPD mais ou le dextrose est remplacC par du glycerol 21 3%). Les cultures aCrCes, en milieu liquide, sont maintenues dans un bain-marie B 30°C jusqu'a la phase stationnaire.

Traiternents Les cellules sont r6coltCes par centrifugation, lavtes deux

fois a l'eau distillCe et resuspendues a un titre donnC de 2 X lo7 cellules par millilitre, soit dans du tampon phosphate 0,1 M, pH 6,2, soit dans le milieu liquide YEPD tarnponnt (20 mL). Le traitement se fait ?i l'obscurit6, A 30°C, en milieu aCr6 par agitation, en prCsence de doses variCes de chlorure de mtthylmercure CH3HgCl (Strem Chemicals, Newburyport,

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TABLEAU 1. Sensibilitk au chlorure de mkthylmercure et absence d'effet positif sur l'induction de mutants petite colonie

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CH3HgCl

C 465 (sauvage) % survie 100 100 100 97,4 25,9 % petite 1,25 1,22 2,03 1,07 1,35

C 33-19B (petite mutant) % survie 100 100 99,8 96,3 26,3

C 81-14A (petite mutant) % survie 100 98,2 102 98,6 24,l

NOTE: Les survies sont exprimtes en pourcentage de la survie du temoin. La duree de I'incubation a kt6 de 4 h, dans du tampon phosphate, 0, l M, pH 6,2. Vingt boites de Petri ont et6 utilistes par traitement, environ 200 cellules ont Btt BtalCes par boite sur agar-YEPD. Le pourcentage de petite a it6 estime grsce au test de Ogur et al. (1957).

MA) durant 4 h. Les cellules sont ensuite lavkes et convenable- ment dilukes avant leur ensemencement sur boite de Petri. Cinquante a 100 boites de PCtri sont utilisCes par dose.

De'tection des mutants Les mutants "petite colonie" ou rho- sont dCtectCs par deux

mCthodes: (i) par comparaison des taux de survie sur milieu gClosk YEPD, qui permet a la fois respiration et fermentation, et sur YPG, non fermentescible, qui ne permet pas la croissance des colonies dont la capacitk respiratoire est dkficiente et (ii) par la techique d'Ogur et al. (1957). Ce procCdt permet de diffkrencier sur milieu glucose les colonies incapables de respiration, des colonies normales. Les pre- mikres restent blanches tandis que les secondes se colorent en rouge en prCsence de chlorure de tCtrazolium. Un tkmoin positif, cellules traitkes au bromure d'krithium, a Cte inclus lors de chaque expkrience pour aider ?I la lecture du test.

Les mutants resistants a l'erythromycine, Ery', sont dkter- minks par la viabilitk (en terme de nombre de colonies) sur

rkduite, mais rkpondent de maniere nCgative au test de Ogur et al. (1957) et il n'y a pas de difference dans la survie des cellules CtalCes sur milieux permettant ou non la fermentation (agar-YEPD; agar-YPG). L'examen des microcolonies sur film de gClatine d'aprbs la mCthode de Tobinow (1975) montre que la rkduction de taille est la consCquence d'un ralentissement des divi- sions cellulaires chez les levures traitCes.

Le DNA mitochondrial ne semble pas Ctre largement dCgradC par l'agent toxique: aprbs traitement au 4',6- diarnino-2-phenylindole (DAPI), un composC fluorescent qui se lie de fa~on sklective au DNA Williamson et Fennel 1979), les examen au microscope de fluorescence ont indiquC, dans les cellules exposCes au mtthylmercure, la pdsence de DNA mitochondria1 et d'un nombre de rnito- chondries apparamment comparable ?i celui des temoins.

YPG gklosC 'Ontenant 4mg/mL d'Crythrom~cine Sensibiliti des mutants rho- au chlorure de rn&thyl- Linnane et al. (1968). Le taux de survie sur YPG en presence mercure d'krythromycine represente le nombre de mutants. I1 est compark a la survie sur le meme milieu sans antibiotique. Nous avons vCrifiC que l'absence apparente d'induc-

Les colonies sent d&ombr&s apr&s 5 a 10 jours d'incuba- tion de nlutants petite n'ktait Pas la ~0nsCquence tion 30°C. ~ e s experiences ant rkpkees au rnoins trois Cventuelle d'une sensibilitC particulibre de ces mutants a fois. l'organomercuriel. I1 n'y a pas d'effet sClectif (tableaux

Resultats et discussion Induction de mutants petite rho-

Dans nos conditions d'expkrience, nous n'avons pu dCtecter d'induction de mutants petite chez aucune des souches utilides: diploide D7 ou haploides C465 et C324, quelles que soient la dose de mkthylmercure et la durCe du traitement. Ceci pour des doses variant de 1 X

?i 1 X M pour lesquelles les pourcentages de survie allaient de 100 ii 0,014% et des dukes de traiitement de 0 2 6 h pour les traitements aigus et de 48 h (survie 0.008%) pour les traitements chroniques. Un exemple est donnC dans le tableau 1.

Les colonies des cultures traitees sont de taille

1 ei2) . Nos essais ont pokt sur les mutants rho- C 33-198 et C 81-14A. Un mutant spontanC Ade- de D7 produisant, en culture, un nombre Clevt de rho- (tableau 2) a CtC aussi CtudiC. Le nombre de mutants rho- spontanCs apparus au cours de deux gCnCrations est diminuC par la prCsence de mCthylmercure. Cette diminution ne peut Ctre attribuCe a une augmentation sClective de la lCthalitC des mutants petite (tableaux 1 et 2). En condquence, la diminution du nombre de petite colonie formCes spontankment (tableau 2) rCsulte d'un effet inhibiteur du mtthylmercure.

Nous avons dCmontrC, par ailleurs (risultats non publiCs), que le mCthylmercure inhibe de manibre spCcifique les processus de recombinaison intragkniques

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TABLEAU 2. Effet du chlorure de mCthylmercure sur l'apparition de mutants petite colonie

TCmoin +CH3HgCl, 5 X M CH3HgCl, - 5 x M

No de No de - colonies colonies % survie

% sumie comptkes % petite % survie comptkes % petite petite clone

Ensemencement immCdiat 100 1851 32,l 100 1851 32,l 100

Aprks incubation 77,O 4767 37,7 89,3 5334 26.6 83,6

NOTE: Des suspensions (2 x lo7 cellules/mL YEPD) du mutant auxotrophe de S. cerevisiae D7 (ade-) sont maintenues dans un hain-marie B 30°C. Les duries d'incuhation sont calcultes de telle sorte que deux cycles de divisions cellulaires se produisent soit 2 h 30 min pour le temoin et 5 h pour les cellules traitees (le mithylmercure ralentit les divisions). Les cellules son1 ensuite comptkes A I'hematimktre, convenahlement diluks et ensemenctes sur YEPD-agar. Les mutants petite sont estimks par le test de Ogur et a1. (1957). Leur frequence est exprimee par rapport aux survivants. Le clone petite a etk isole d'une culture de la m&me souche, mis en culture et traite individuellement.

nuclkaires. Or, Moustacchi (1973) a montre que les Induction de mutants de phknotype Eryr produits de gbnes nuclkaires participant au processus de Ces mutants sont rksistants il l'krythromycine. La recombinaison intragknique sont nkcessaires 2 certaines respiration des levures sauvages est bloquke par l'anti- ktapes molkculaires menant ii la mutation petite. Nous biotique par suite d'une inhibition selective des pro- pouvions donc predire que, dans nos conditions d'ex- tkines mitochondriales. La mutation, qui altbre le site de pkrience, non seulement le toxique n'induirait pas de liaison de l'antibiotique sur les ribosomes, confbre aux mutants rho-, mais qu'il pourrait avoir au contraire, un mutants des propriktks de rksistance qui se matkrialisent effet inhibiteur sur leur induction. On peut noter une par le maintien de leurs capacitks respiratoires. diminution de frkquence de ces mutants (tableau 2) h des Comme l'indique le tableau 3, le mkthylmercure doses ou le methylmercure n'affecte pas la survie. induit une nette augmentation de la frequence des

Nos resultats s'opposent i ceux obtenus par Nakai et mutants Eryr, mCme ?i des doses ou la survie n'est pas Mashida (1973) qui ont mentionnk dans un bref rksume, affectke par le traitement. I1 y a un effet dose-rkponse l'induction par le rnkthylmercure de mutants rho- chez Saccharomyces. Plusieurs raisons peuvent expliquer cette contradition. (i) Fukunaga et al. (1981) ont obtenu l'induction de mutants petite par le mercure inorgani- que. Ce composk peut se former h partir de solutions de mkthylmercure par dkgradation chimique ou enzymati- que. I1 est possible que cetaines souches de levure soient capables d'effectuer cette transformation. Le mercure inorganique ainsi gknkrk pourrait induire des mutants rho-. (ii) Si les dommages causks au DNA par le mercure et les organomercuriels sont identiques in vitro et in vivo, le mercure inorganique sera plus apte a induire une dkgradation du DNA que son homologue organique. Le mercure inorganique ouvre les liaisons de Watson-Crick et dknature le DNA. Le methylmercure ne l'altbre de cette manibre, qu'a forte concentration (Walter 1980; Anderson et al. 1980; Maki et Ott 1981). Le mkthylmercure pourrait donc induire des mutants rho- mais B des doses ou la survie est trbs faible pour la plupart des souches de levure. I1 est probable que seules les souches rksistantes B l'exposition 2 des concentra- tions Clevkes de l'organometal engendreront des mu- tants rho-. Ainsi, l'induction de mutants petite en rkponse B un traitement par le CH3HgC1 reflbterait soit la capacitk des souches ii degrader le mkthylmercure, soit leur plus grande rksistance 3 l'organomercuriel.

tres net. L'aspect gknktique de la mutation Eryr a kt6 CtudiC par

Netter et al. (1974). Les mutants rksultent de l'altkration de deux loci ery1 et ery2. Nous ne savons pas si le mkthylmercure produit prefkrentiellernent l'un ou l'autre de ces mutants. D'autres mktaux sont capables d'induire des mutants rksistants aux antibiotiques. Par exemple, les dkrivks organiques de l'ktain induisent des mutants rksistants B l'oligomycine (Avner et Griffiths 1973a, 197321; Lancashire et Griffiths 1975). A l'inverse de ceux rksistants B l'oligomycine et au chloramphenicol qui peuvent Ctre en grande part nu- clkaires les mutants resistants a l'krythromycine sont essentiellement mitochondriaux (Ejchart et Putrament 1979). Nous pensons qu'il y a de grandes chances pour que la mutation Eryr ne soit pas la seule infligee au DNA mitochondria1 par le methylmercure. I1 est probable que d'autres lksions discrbtes du DNA de ces organites soient responsables de leur malfonction. Plusieurs auteurs ont suggkrk une relation entre des perturbations des fonctions mitochondriales et la diminution de la synthbse des macromolkcules. La diminution de la consommation d'oxygbne et des taux d'ATP a Cte mise en Cvidence chez la levure en prksence de mercure (Brunker 1976) et de mkthylmercure (J. Phipps, D. R. Miller et R. L. Ally, rksultats non publiks). Ally et

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TABLEAU 3. Induction de mutants Eryr par le mCthylmercure (CH3HgCl)

No de mutations Frequence des mutations ng CH3HgCl Eryr/cellules ensemencees (mutants Eryr/survivants) par 1 x 105 % sumie

cellules sur YPG TCmoins TraitCes ContrBles TraitCes

NOTE: Les cellules sont traittes dans le tampon phosphates 0 , l M, pH 6,2, durant 4 h avant d'&tre ensemenctes sur YPG a raison de 200 cellules par boite de Pttri pour ttablir la snwie et sur YPG + 4 mg/mL d'erythromycine (I X lo7 cellules par boite) pour estimer les mutants rtsistants. La suwie est exprimee en pourcentage de la suwie des ttmoins non traitks; les frequences en pour cent sont exprimkes en fonction du nombre de cellules ensemenctes (deuxieme et troisieme colonnes) et du nombre des suwivants (quatrieme et cinquitme colonnes).

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Remerciements Les auteurs souhaitent remercier le Dr. B. Johnson

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