L’UE Microbiologie est principalement composée de 5 travaux pratiques, au cours desquels plusieurs expériences ont été menées, afin d’acquérir les bases de la manipulation de microorganismes :

des bactéries : Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, un eucaryote unicellulaire : Saccharomyces cerevisiae, des archées : Haloferax volcanii, Sulfolobus solfataricus, un virus : bactériophage Lambda.

Ces travaux pratiques permettent d’acquérir une première approche des principales

expériences suivantes :

préparer un milieu de culture solide et stérile,

titrer une souche bactérienne ou virale,

travailler dans un cadre stérile,

effectuer des prélèvements, coupes, colorations, fixations et observations au

microscope optique de microorganismes de nature différente,

identifier les conditions de croissance (milieu de culture, environnement) de

différents microorganismes et calculer leur taux de croissance respectif,

réaliser un antibiogramme,

caractériser la diversité bactérienne selon plusieurs échantillons,

analyser un mélange de bactéries et savoir les différencier,

réaliser une PCR, une électrophorèse et identifier des organismes selon leur

code génétique. Les pages qui suivent relateront ces expériences une par une.

UE 2V424 MICROBIOLOGIE

COMPTE-RENDU DE TP

Binôme 4

Florence Burger

2

TP 1

EXPERIENCE N°1

But : déterminer la présence de colonies d’Escherichia coli selon l’utilisation ou non d’agents destructeurs de bactéries : antibiotique (ampicilline), alcool et savon.

Principe : préparer un milieu de culture gélosé LB-agar avec ou sans ampicilline et effectuer

des empreintes de doigts avec ou sans alcool et savon, puis faire incuber. Résultat :

Figure 1 : Colonies d’Escherichia coli sur milieu LB : Témoin (à gauche) / Sans ampicilline +

ou – savon ou alcool (au milieu) / Avec ampicilline + ou – savon ou alcool (à droite)

La boîte témoin (figure 1 à gauche) nous prouve qu’il y a bien présence de bactéries sur nos doigts, d’où la croissance de colonies bactériennes après incubation sur milieu riche gélosé LB-agar sans aucun traitement antibactérien. L’ampicilline est un antibiotique inhibant la synthèse de la paroi des bactéries Gram- et provoquant ainsi la lyse de la cellule. Sur la boîte ne contenant pas d’ampicilline (figure 1 au milieu), le test des empreintes de doigts a été effectué avant et après lavage à l’alcool d’une part, au savon d’autre part. On observe la présence de colonies bactériennes avant lavage, comme sur notre boîte témoin, mais on note bien l’absence de toute colonie bactérienne après lavage, que ce soit avec l’alcool ou avec le savon. On peut donc supposer que l’alcool et le savon contiennent des agents destructeurs de bactéries. Néanmoins, nous noterons le fait que certains binômes ayant effectué la même expérience ont tout de même obtenu la croissance de colonies bactériennes après lavage. On peut donc en déduire que l’efficacité de l’alcool et du savon sur la destruction des bactéries dépend de certains paramètres quantitatifs et qualitatifs : temps de lavage, qualité du lavage, quantité et concentration de produit utilisé... Sur la boîte contenant de l’ampicilline (figure 1 à droite), le protocole est le même que pour la boîte sans ampicilline. On constate l’absence de toute colonie bactérienne, que ce soit avant ou après lavage. Ceci confirme l’efficacité de l’ampicilline (du moins à la dose administrée dans cette expérience) et que les bactéries qui étaient présentes sur nos doigts sont de type Gram-. En observant nos boîtes, on sait que l’on peut distinguer des colonies bactériennes selon au moins deux critères : la couleur et la taille.

3

EXPERIENCE N°2

But : déterminer la concentration cellulaire (UFC/mL) d’une culture bactérienne d’Escherichia coli.

Principe : étaler la suspension bactérienne sur milieu gélosé LB-agar, après avoir effectué des

dilutions en série, puis faire incuber. Résultats :

Figure 2 : Colonies d'Escherichia coli selon différentes dilutions

On part de l’hypothèse que chaque bactérie a fait une colonie et on s’intéresse aux dilutions pour lesquelles le nombre de colonies est quantifiable, à savoir les dilutions de 10-6 à 10-9. En effet, moins la dilution est grande, plus il y a de bactéries et donc de plages de croissance de colonies, qui deviennent indénombrables. Chaque point noir sur les boîtes correspond à une colonie bactérienne (figure 2). On note ainsi la présence de 3 colonies à dilution 10-8, 27 à dilution 10-7 et 157 à dilution 10-6. Les résultats obtenus ne sont pas parfaits, étant donné qu’on devrait obtenir un nombre de colonies grandissant par facteur 10. Par exemple, en partant de 3 à dilution 10-8, on devrait théoriquement obtenir un nombre de colonies avoisinant 30 à dilution 10-7, ce qui est presque le cas puisqu’on a obtenu 27. Mais 27 x 10 = 270. Or, pour la dilution à 10-6, on a dénombré 157 colonies. Cette marge d’erreur peut être due à une erreur de manipulation (dosage) lors des dilutions effectuées.

10-5 10

-4

10-9

10-8

10-7

10-6

4

Binôme Dilution UFC (par mL)

10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 1 Indéfini Indéfini 88 34 57 0 1 x 109 2 Indéfini Indéfini 107 14 4 0 1,4 x 109 3 Indéfini Indéfini 143 15 0 0 1,5 x 109 4 Indéfini Indéfini 157 27 3 0 3 x 109 5 Indéfini 300 78 6 2 0 7,8 x 108 6 Indéfini 131 59 12 1 0 1,2 x 109 7 Indéfini Indéfini 144 34 12 2 1,2 x 109

Figure 3 : Tableau représentant le nombre de colonies bactériennes formées en fonction de

la dilution effectuée, ainsi que l’UFC qui en découle

On souhaite ensuite calculer l’UFC (unité formant colonie), c’est-à-dire la concentration bactérienne obtenue (figure 3). Explication calcul UFC : on dénombre 3 colonies dans la boîte à dilution 10-8, donc pour obtenir une concentration bactérienne sans dilution, on multiplie par l’inverse du facteur de dilution : 3 x 108. Comme on a mis 100 µl de suspension bactérienne et qu’on souhaite connaître la concentration de bactéries dans 1 mL, alors on multiplie la concentration trouvée par 10 : 3 x 108 x 10 = 3 x 109.

Au regard de ces résultats, il semblerait qu’il y ait au moins 3 milliards de bactéries dans 1 mL de suspension !

EXPERIENCE N°3

But : comparer les caractéristiques physiques de trois microorganismes : une bactérie : Escherichia coli, une archée : Haloferax volcanii et un eucaryote unicellulaire (levure) : Saccharomyces cerevisiae.

Principe : préparer une lame contenant le microorganisme à l’état frais sans coloration ou

après frottis et coloration, puis observer au microscope optique. Résultats :

Figure 4 : Observation au microscope optique (x40) de Saccharomyces cerevisiae (à

gauche) et Haloferax volcanii (à droite), état frais sans coloration

5

Figure 5 : Observation au microscope optique (x40) d’Escherichia coli à l'état frais sans

coloration (à gauche), puis après frottis et coloration au Cristal violet (à droite)

Organisme Forme Taille

(en µm) Mobilité

Escherichia coli Bacille 0,5 à 3 Oui (flagelle) Haloferax volcanii Disque aplati 2 à 3 Non

Saccharomyces cerevisiae Ovoïde 6 à 12 Non

Figure 6 : Tableau représentant les différences phénotypiques des trois organismes étudiés

On remarque que ces trois microorganismes (figures 4 et 5) n’ont pas la même forme ni la même taille et certains sont mobiles, d’autres non. La taille est difficilement quantifiable, aussi le tableau (figure 6) fait-il référence à des valeurs recherchées.

TP 2 But : comparer les temps et taux de croissance de deux microorganismes (Escherichia coli et

Saccharomyces cerevisiae) en fonction de différentes conditions de croissance. Principe : ensemencer des fioles de Klett avec les microorganismes étudiés (différents

milieux et différentes conditions), les faire incuber, puis mesurer la densité optique (DO) à l’aide d’un colorimètre.

Résultats :

Figure 7 : Condition 1 : Courbe de croissance d’Escherichia coli en fonction du temps et de la

DO / Milieu LB versus milieu M63

6

Figure 8 : Condition 2 : Courbe de croissance d’Escherichia coli en fonction du temps et de la

DO / Avec glucose versus sans glucose

Figure 9 : Condition 3 : Courbe de croissance d’Escherichia coli en fonction du temps et de la

DO / Avec oxygène versus sans oxygène

Figure 10 : Condition 4 : Courbe de croissance d’Escherichia coli en fonction du temps et de

la DO / Température à 37°C versus 25°C

Figure 11 : Condition 5 : Courbe de croissance d’Escherichia coli et Saccharomyces

cerevisiae en fonction du temps et de la DO / Milieu LB à 37°C pour E.c versus YPG à 30°C

pour S.c

7

Pour établir la courbe de croissance bactérienne, c’est-à-dire le nombre de bactéries reproduites en fonction du temps, il existe plusieurs méthodes. En ce qui nous concerne, nous allons mesurer la DO à 590 nm toutes les 20 minutes. Il y a deux types de graphiques : linéaire et logarithmique. Nous nous intéresserons plutôt à l’échelle logarithmique (figures 7 à 11), sur laquelle 3 points sur la courbe obtenue seront choisis et pour lesquels on regarde à quels temps correspondants la culture (le nombre de bactéries) a doublé. Quand la DO devient trop forte, les résultats sont faussés. Il faut donc diluer. Mais on ne va pas procéder à des dilutions comme il serait fait au laboratoire. On s’arrêtera à un point où ce ne sera plus linéaire (entre 0,8 et 1).

Condition Temps (en min) Temps de croissance (en min)

T0 20 40 60 80 100 120

1 Escherichia coli LB

M63

23 60

2 Escherichia coli LB sans glucose LB avec glucose

16 17-20

3 Escherichia coli LB avec O2 LB sans O2

0,07 0,07

0,08 0,08

0,16 0,13

0,27 0,23

0,52 0,41

0,76 0,58

1,08 0,63

20-25 20-25

4 Escherichia coli LB à 37°C LB à 28°C

27 44

5 Escherichia coli / Saccharomyces cerevisiae

LB + E.c YPG + S.c

20 ?

Figure 12 : Tableau représentant le temps de croissance d'Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae selon les 5

conditions appliquées

Analyse des résultats selon les différentes conditions (figure 12) :

Condition 1 : le milieu LB est un milieu riche alors que M63 est un milieu pauvre. On note l’impact du milieu pauvre sur la croissance d’Escherichia coli, qui est beaucoup moins bonne puisqu’une cellule met presque 3 fois plus de temps à se diviser. Il existe donc dans le milieu LB des éléments nécessaires à sa croissance que la bactérie ne trouve pas dans le milieu M63.

8

Condition 2 : l’ajout de glucose ne semble en rien modifier la croissance d’Escherichia coli. La bactérie se suffirait donc au milieu LB et prendrait uniquement les éléments dont elle a besoin, sans excès. Condition 3 : on part du postulat que sans oxygène, la bactérie est cantonnée à la voie de la fermentation, qui produit 15 fois moins d’énergie que lors du cycle de la respiration. Par conséquent, on devrait observer une croissance beaucoup moins rapide. Or, les deux courbes représentant les deux conditions (aérobie versus anaérobie) sont quasiment identiques et ne sont donc pas représentatives de la réalité. Ce résultat non probant est certainement dû à une erreur de manipulation. Condition 4 : on constate que la croissance avec une température plus basse de 28°C est presque 2 fois plus lente qu’à 37°C. Il y a donc une influence de la température sur la croissance d’Escherichia coli, qui peut être due aux enzymes, qui fonctionnent mieux à une certaine température. Condition 5 : sauf erreur ou omission de ma part, il semble que les résultats obtenus par le binôme ayant réalisé l’expérience sous cette condition ne sont pas complets. Néanmoins, il a été relevé le fait que les levures n’ont pas le temps de se diviser en 20 minutes, alors qu’on obtient un temps optimal pour la bactérie (20 min).

TP 3

EXPERIENCE N°1

But : déterminer la sensibilité de trois organismes : une bactérie : Escherichia coli, une archée : Haloferax volcanii et un eucaryote unicellulaire (levure) : Saccharomyces cerevisiae, à différents antibiotiques.

Principe : réaliser un antibiogramme déterminant la concentration minimale inhibitrice (CMI)

de 6 antibiotiques sur 3 espèces microbiennes, en utilisant la méthode de diffusion en milieu gélosé.

Résultats :

AMX = amoxicilline : antibiotique de la famille des pénicillines à spectre large (actif sur un plus grand nombre de germes que la pénicilline simple). Il agit sur les peptidoglycanes de la paroi bactérienne, empêchant leur liaison peptidique et conduisant à la mort cellulaire. Il a pour cible principale les bactéries Gram+.

BCT = bacitracine : antibiotique de la famille des polypeptides, formé par un complexe de 6 antibiotiques qui inhibent la synthèse de la paroi bactérienne. Il a pour cible principale les bactéries Gram+.

9

CEF = céfalotine : antibiotique de la famille des bêtalactamines. Il inhibe également la réaction de transpeptidation des peptidoglycanes de la paroi bactérienne et bloque ainsi leur synthèse, ayant pour finalité la mort de la cellule. Il a pour cible principale les bactéries aérobies Gram+ et Gram-.

CHL = chloramphénicol : antibiotique à spectre large de la famille des phénicolés. Il inhibe l’activité peptidyltransférase du ribosome bactérien, empêchant ainsi la synthèse des protéines. Il a pour cible principale les bactéries Gram-.

G418 = geneticin 418 : antibiotique de la famille des aminoglycosides. Il inhibe l’étape d’élongation polypeptidique et empêche ainsi la synthèse des protéines. Il a pour cible principale les bactéries aérobies Gram-, mais agit également sur certains eucaryotes.

NOV = novobiocine : antibiotique de la famille des aminocoumarines. Il inhibe l’ADN-gyrase, empêchant ainsi la réplication de l’ADN. Il a pour cible principale les bactéries Gram+.

Figure 13 : Escherichia coli + milieu LB (à gauche) / Saccharomyces cerevisiae + milieu YPG

(au milieu) / Haloferax volcanii + milieu Hv-YPC (à droite)

Si la gélose a été préalablement ensemencée avec la bactérie, celle-ci ne se développera que si la concentration en antibiotique est inférieure à la CMI. On observe autour de certains disques une zone circulaire d’inhibition de croissance (figure 13). La présence d’une zone d’inhibition n’indique pas forcément que la bactérie est sensible à l’antibiotique. C’est le diamètre de cette zone qui est directement lié à la CMI.

10

Bactérie

Escherichia coli Archée

Haloferax volcanii

Levure eucaryote Saccharomyces

cerevisiae

Antibiotique Diamètre (en cm)

Résistant (R) ou

Sensible (S)

Diamètre (en cm)

Résistant (R) ou

Sensible (S)

Diamètre (en cm)

Résistant (R) ou

Sensible (S)

AMX 2,2 S 1,6 R - R BCT 0,8 R 1,7 S - R CEF 1,7 I* 0,7 R - R CHL 2,7 S 0,8 R - R G418 2,4 S 0,7 - 1,6 - NOV - R 1,2 - - -

Figure 14 : Tableau représentant la sensibilité ou la résistance des trois organismes aux 6

antibiotiques testés

*I = Intermédiaire On remarque (figure 14) que la bactérie est sensible à l’AMX, ainsi qu’au CEF, mais pas au BCT. En effet, le BCT agit sur les bactéries Gram+ et non sur les bactéries Gram-, résultat logique donc, puisqu’Escherichia coli est une bactérie Gram-. La levure n’est sensible à aucun de ces antibiotiques. Quant à elle, l’archée est sensible au BCT uniquement. Ces trois antibiotiques ayant la même cible, on peut en déduire que la paroi de Saccharomyces cerevisiae est différente de la paroi d’Escherichia coli, mais celle d’Haloferax volcanii est manifestement composée d’éléments similaires. Ne possédant pas les CMI de l’archée et de la levure pour les antibiotiques G418 et NOV, nous n’en commenterons l’effet que sur la bactérie. Ici, la bactérie est sensible au CHL et au G418, mais pas au NOV. Si NOV n’agit pas sur Escherichia coli, il peut s’agir non du fait qu’elle y est résistante, mais qu’elle est résistante à une certaine dose (= CMI). C’est la notion d’effet de dose : il faut une certaine quantité d’antibiotique pour obtenir un effet sur la bactérie donnée.

EXPERIENCE N°2

But : déterminer certains paramètres microbiologiques à partir d’une analyse qualitative et quantitative de différents types bactériens : I/ un échantillon d’eau de Seine II/ un mélange de deux bactéries : Escherichia coli et Staphylococcus epidermidis.

Principe : réaliser des dilutions en série à partir d’échantillons contenant une diversité

microbienne, les filtrer et les ensemencer sur différents milieux sélectifs : LB-agar, Tergitol vert, Slanetz, Drigalski et Chapman.

11

Résultats : I/ Echantillon d’eau de Seine

Figure 15 : Colonies bactériennes sur milieu gélosé Tergitol vert (TTC)

On analyse un échantillon d’eau de Seine, qui est supposé contenir une certaine flore microbienne. Pour être certain de récupérer le maximum de bactéries, on a procédé à une filtration de l’eau, afin de concentrer les cellules bactériennes sur la membrane (on part de l’hypothèse que la cellule bactérienne est supérieure à 0,5 µm, qui correspond au diamètre des pores du filtre). On effectue ensuite des stries avec la suspension microbienne sur les boîtes de pétri, ce qui revient à faire, en 3 stries, une dilution à 10-6. En observant les colonies bactériennes formées sur les boîtes (une seule en photo car résultat plus représentatif – figure 15), on constate qu’il y a au moins deux types de colonies : différentes formes (petites et grandes) et couleurs (jaune/vert, marron/rouge).

Milieu Dilution Organisme sélectionné

Nombre de colonies

UFC (par L)

Tergitol Vert 10-2 Gram- 30 3 x 105 Slanetz 10-1 Gram+ 20 2 x 104

Figure 16 : Tableau représentant le nombre de colonies de bactéries Gram+ et Gram-

formées selon le type de milieu sélectionné, ainsi que l'UFC/L qui en découle

Le milieu LB-agar est un milieu riche non limitant, donc favorisant la croissance bactérienne. Nous nous intéresserons plutôt aux résultats sur les milieux sélectifs. On fait une estimation du nombre de bactéries présentes dans 1 L d’eau de Seine. Explication calcul UFC (figure 16) pour le milieu Slanetz : on compte le nombre de colonies présentes sur la boîte : 20. On le multiplie par l’inverse de la dilution : 20 x 101. Puis on multiplie par 100 puisque notre calcul est basé sur 10 mL de suspension et qu’on veut l’UFC pour 1 L : 20 x 101 x 100 = 2 x 104. Nous noterons que les autres binômes ont obtenu les mêmes résultats.

12

II/ Mélange de deux bactéries

Figure 17 : Observation au microscope optique (x40) d'un mélange bactérien d'Escherichia

coli et Staphylococcus epidermidis après coloration de Gram

La coloration de Gram est un procédé mettant en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, permettant ainsi de distinguer les bactéries à Gram positif (+), dotées d'une simple paroi avec une grande quantité de peptidoglycanes, qui prennent une coloration violette, des bactéries à Gram négatif (-), composées de moins de peptidoglycanes mais pourvues d'une membrane externe supplémentaire, qui prennent une coloration rose. Cette distinction est notamment utile concernant les effets des antibiotiques sur les bactéries. Escherichia coli est une bactérie Gram- alors que Staphylococcus epidermidis est une bactérie Gram+. L’observation microscopique (figure 17) permet de distinguer les deux couleurs (rose et violet), donc de dire que le mélange contient des bactéries Gram+ et des bactéries Gram-.

Figure 18 : Colonies bactériennes sur milieu gélosé Drigalski

On observe une croissance sur les trois boîtes (une seule en photo, car plus représentative de la croissance bactérienne – figure 18), ce qui amène à penser qu’il y a dans le mélange à la fois des bactéries Gram+ et des bactéries Gram-, puisque certains milieux sélectionnent les bactéries Gram+ et d’autres les bactéries Gram- (figure 19).

13

Milieu Gram+ Gram- Spécificités du milieu Organisme sélectionné

Chapman Oui Non

Rouge phénol et Mannitol : inhibiteurs des Gram- et indicateurs du pH donc s’il y a acidification du milieu, les colonies passent du rouge au jaune (ici pas de virage de coloration, donc les organismes sont mannitol-).

Staphylococcus epidermidis

Drigalski Non Oui Désoxycolate de sodium et Cristal violet : inhibiteurs des Gram+. Escherichia coli

Slanetz Oui Non

Azide de sodium : inhibiteur des Gram- TTC : indicateur du métabolisme respiratoire : réduit, il donne du formason, responsable de la coloration rouge/marron (les coliformes, comme E.coli, ne peuvent pas le réduire).

Staphylococcus epidermidis

Tergitol Vert

Non Oui

Tergitol : inhibiteur des Gram+ Bleu de bromothymol : à pH alcalin, la couleur vire au vert, à pH très alcalin ça vire au bleu et à pH acide ça vire au jaune : mise en évidence de l’acidification du milieu par les bactéries. Ex : E. coli est une bactérie Gram- qui forme des colonies jaunes ou orange avec un halo jaune car elles fermentent le lactose et acidifient ainsi le milieu, d’où une coloration du vert vers le jaune.

Escherichia coli

Figure 19 : Tableau représentant les organismes sélectionnés selon les milieux de culture

TP 4

EXPERIENCE N°1

But : identifier la nature d’un organisme contenu dans un échantillon, qui peut être soit une bactérie, soit un eucaryote, soit une archée, selon son code génétique.

Principe : réaliser une PCR, qui consiste à amplifier le gène de l’ADN ribosomique 16S à

l’aide de 4 paires d’oligonucléotides complémentaires de cette séquence d’ADN, dont l’une est spécifique à toutes les espèces (universelle), la deuxième uniquement aux eucaryotes, la troisième uniquement aux bactéries et la dernière uniquement aux archées. Ensuite, réaliser une électrophorèse suivie d’une radiographie.

Résultats :

14

Echantillon 1 : Archée

Figure 20 : Résultats de la PCR par radiographie

Les résultats de la PCR (figure 20) sont difficilement interprétables. Ceci est probablement lié à la contamination par des bactéries de l'eau utilisée pour faire des dilutions. Dans ces conditions nous ne pouvons pas identifier les échantillons. Ainsi, il nous a été indiqué que notre échantillon contenait l’espèce archéenne. Dans la colonne A de la radiographie, on devrait en conséquence obtenir une bande de radio-fluorescence puisqu’il s’agit du tube contenant les oligonucléotides s’hybridant à l’ADN archéen. Or, c’est le noir total, ce qui confirme l’hypothèse d’une erreur de manipulation. Dans la colonne U, on obtient une bande de radio-fluorescence, ce qui est normal, puisqu’il s’agit du tube contenant les oligonucléotides universels, s’hybridant avec les trois espèces testées. Dans les colonnes E et B, on ne comprend pas pourquoi on a toutes ces bandes, puisque ces tubes contiennent les oligonucléotides s’hybridant respectivement à l’eucaryote unicellulaire et à la bactérie.

Pb Témoin U E A B

1 500 1 400

1 000

700

50

Figure 21 : Tableau représentant le poids moléculaire apparent correspondant à la

séquence de l’ADNr 16S de chaque espèce

15

Le témoin (figure 21) permet de situer les bandes et de savoir à quel poids moléculaire apparent elles correspondent. On constate donc que le gène de l’ADNr 16S eucaryote a une taille d’environ 700 paires de bases (Pb), environ 1 500 Pb pour l’ADNr 16S archéen et environ 1 400 Pb pour l’ADNr 16S bactérien. Ci-dessous se trouve la séquence de l’ADNr 16S de l’archée, trouvée sur la base de données du site BLAST, qui est un programme informatique accessible sur internet, qui permet de comparer des séquences génétiques. On découvre ainsi qu’il s’agit de l’archée Haloferax volcanii et que sa séquence nucléotidique est composée de 1 473 Pb : Sequence ID: ref|NR_074218.1|Length: 1473Number of Matches: 1 See 2 more title(s) Related Information Range 1: 3 to 1443GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alignment statistics fo r match #1

Score Expect Identities Gaps Strand

2662 bits(1441) 0.0 1441/1441(100%) 0/1441(0%) Plus/PlusQuery 1 TCCGGTTGATCCTGCCGGAGGTCATTGCTATTGGGGTCCGATTTAGCCATGCTAGTTGCA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3 TCCGGTTGATCCTGCCGGAGGTCATTGCTATTGGGGTCCGATTTAGCCATGCTAGTTGCA 62 Query 61 CGAGTTCATACTCGTGGCGAAAAGCTCAGTAACACGTGGCCAAACTACCCTACAGAGAAC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 63 CGAGTTCATACTCGTGGCGAAAAGCTCAGTAACACGTGGCCAAACTACCCTACAGAGAAC 122 Query 121 GATAACCTCGGGAAACTGAGGCTAATAGTTCATACGGGAGTCATGCTGGAATGCCGACTC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 123 GATAACCTCGGGAAACTGAGGCTAATAGTTCATACGGGAGTCATGCTGGAATGCCGACTC 182 Query 181 CCCGAAACGCTCAGGCGCTGTAGGATGTGGCTGCGGCCGATTAGGTAGACGGTGGGGTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 183 CCCGAAACGCTCAGGCGCTGTAGGATGTGGCTGCGGCCGATTAGGTAGACGGTGGGGTAA 242 Query 241 CGGCCCACCGTGCCGATAATCGGTACGGGTTGTGAGAGCAAGAGCCCGGAGACGGAATCT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 243 CGGCCCACCGTGCCGATAATCGGTACGGGTTGTGAGAGCAAGAGCCCGGAGACGGAATCT 302 Query 301 GAGACAAGATTCCGGGCCCTACGGGGCGCAGCAGGCGCGAAACCTTTACACTGCACGCAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 303 GAGACAAGATTCCGGGCCCTACGGGGCGCAGCAGGCGCGAAACCTTTACACTGCACGCAA 362 Query 361 GTGCGATAAGGGGACCCCAAGTGCGAGGGCATATAGTCCTCGCTTTTCTCGACCGTAAGG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 363 GTGCGATAAGGGGACCCCAAGTGCGAGGGCATATAGTCCTCGCTTTTCTCGACCGTAAGG 422 Query 421 CGGTCGAGGAATAAGAGCTGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAATACCGGCAGCT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 423 CGGTCGAGGAATAAGAGCTGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGTAATACCGGCAGCT 482 Query 481 CAAGTGATGACCGATATTATTGGGCCTAAAGCGTCCGTAGCCGGCCACGAAGGTTCATCG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 483 CAAGTGATGACCGATATTATTGGGCCTAAAGCGTCCGTAGCCGGCCACGAAGGTTCATCG 542 Query 541 GGAAATCCGCCAGCTCAACTGGCGGGCGTCCGGTGAAAACCACGTGGCTTGGGACCGGAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 543 GGAAATCCGCCAGCTCAACTGGCGGGCGTCCGGTGAAAACCACGTGGCTTGGGACCGGAA 602 Query 601 GGCTCGAGGGGTACGTCCGGGGTAGGAGTGAAATCCCGTAATCCTGGACGGACCACCGAT 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 603 GGCTCGAGGGGTACGTCCGGGGTAGGAGTGAAATCCCGTAATCCTGGACGGACCACCGAT 662 Query 661 GGCGAAAGCACCTCGAGAAGACGGATCCGACGGTGAGGGACGAAAGCTAGGGTCTCGAAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 663 GGCGAAAGCACCTCGAGAAGACGGATCCGACGGTGAGGGACGAAAGCTAGGGTCTCGAAC 722 Query 721 CGGATTAGATACCCGGGTAGTCCTAGCTGTAAACGATGCTCGCTAGGTGTGACACAGGCT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 723 CGGATTAGATACCCGGGTAGTCCTAGCTGTAAACGATGCTCGCTAGGTGTGACACAGGCT 782 Query 781 ACGAGCCTGTGTTGTGCCGTAGGGAAGCCGAGAAGCGAGCCGCCTGGGAAGTACGTCCGC 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 783 ACGAGCCTGTGTTGTGCCGTAGGGAAGCCGAGAAGCGAGCCGCCTGGGAAGTACGTCCGC 842 Query 841 AAGGATGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCACTACAACCGGAGGAGCCTGCGGTTTA 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 843 AAGGATGAAACTTAAAGGAATTGGCGGGGGAGCACTACAACCGGAGGAGCCTGCGGTTTA 902 Query 901 ATTGGACTCAACGCCGGACATCTCACCAGCTCCGACTACAGTGATGACGATCAGGTTGAT 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 903 ATTGGACTCAACGCCGGACATCTCACCAGCTCCGACTACAGTGATGACGATCAGGTTGAT 962 Query 961 GACCTTATCACGACGCTGTAGAGAGGAGGTGCATGGCCGCCGTCAGCTCGTACCGTGAGG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 963 GACCTTATCACGACGCTGTAGAGAGGAGGTGCATGGCCGCCGTCAGCTCGTACCGTGAGG 1022 Query 1021 CGTCCTGTTAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGCACTTCTAATTGCCAGCAGCAGTTTCG 1080 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1023 CGTCCTGTTAAGTCAGGCAACGAGCGAGACCCGCACTTCTAATTGCCAGCAGCAGTTTCG 1082 Query 1081 ACTGGCTGGGTACATTAGAAGGACTGCCGCTGCTAAAGCGGAGGAAGGAACGGGCAACGG 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1083 ACTGGCTGGGTACATTAGAAGGACTGCCGCTGCTAAAGCGGAGGAAGGAACGGGCAACGG 1142 Query 1141 TAGGTCAGTATGCCCCGAATGAGCTGGGCTACACGCGGGCTACAATGGTCGAGACAATGG 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1143 TAGGTCAGTATGCCCCGAATGAGCTGGGCTACACGCGGGCTACAATGGTCGAGACAATGG 1202 Query 1201 GTTGCTATCTCGAAAGAGAACGCTAATCTCCTAAACTCGATCGTAGTTCGGATTGAGGGC 1260 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

16

Sbjct 1203 GTTGCTATCTCGAAAGAGAACGCTAATCTCCTAAACTCGATCGTAGTTCGGATTGAGGGC 1262 Query 1261 TGAAACTCGCCCTCATGAAGCTGGATTCGGTAGTAATCGCATTTCAATAGAGTGCGGTGA 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1263 TGAAACTCGCCCTCATGAAGCTGGATTCGGTAGTAATCGCATTTCAATAGAGTGCGGTGA 1322 Query 1321 ATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAAGCACCCGAGTGAGGTCCGGATGAG 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1323 ATACGTCCCTGCTCCTTGCACACACCGCCCGTCAAAGCACCCGAGTGAGGTCCGGATGAG 1382 Query 1381 GCCACCACACGGTGGTCGAATCTGGGCTTCGCAAGGGGGCTTAAGTCGTAACAAGGTAGC 1440 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1383 GCCACCACACGGTGGTCGAATCTGGGCTTCGCAAGGGGGCTTAAGTCGTAACAAGGTAGC 1442 Query 1441 C 1441 | Sbjct 1443 C 1443

EXPERIENCE N°2

But : comparer les conditions de croissance de deux microorganismes : une bactérie mésophile : Escherichia coli et une archée halophile : Haloferax volcanii.

Principe : ensemencer les cultures des deux espèces sur 2 milieux solides différents : LB-agar

versus Hv-YPC-agar, et les faire incuber à des températures différentes : 37 °C versus 45°C, sur 3 niveaux de dilution.

Résultats :

Figure 22 : Croissance d’Haloferax volcanii sur milieu Hv-YPC-agar à 37°C (à gauche) et

45°C (à droite)

Figure 23 : Croissance d'Escherichia coli sur milieu LB-agar à 37°C (à gauche) et 45°C (à

droite)

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On teste l’effet de la température et de la composition du milieu LB-agar ou Hv-YPC-agar (concentré en sel) sur la croissance d’Escherichia coli et Haloferax volcanii. L’observation de ces boîtes de pétri (figures 22 et 23) permet de comprendre quelles conditions sont idéales pour la croissance de chaque espèce :

Escherichia coli : croissance gigantesque due à la mobilité de la bactérie (qui possède un flagelle). Croissance sur milieu LB-agar à 37°C ainsi qu’à 45°C : elle est thermo-tolérante. Croissance inhibée par le milieu hypersalin Hv-YPC-agar, quelle que soit la température. Haloferax volcanii : croissance plus petite car archée non mobile. Croisance sur milieu très salé Hv-YPC-agar, donc organisme halophile, quelle que soit la température, donc organisme thermo-tolérant également. Mais croissance inhibée sur milieu insuffisant en sel, quelle que soit la température, donc halophilie stricte.

En conséquence, on peut penser qu’il y a bien un effet de la composition du milieu (ici pauvre ou riche en sel) et des conditions externes (ici, la température) sur la croissance des organismes.

Température Binôme 37°C 45°C 37°C 45°C 37°C 45°C 37°C 45°C

1 + + - - - - + + 2 + + - - - - + + 3 + + - - - - + + 4 + + - - - - + + 5 + + - - - - + + 6 + + - - - - + + 7 + + - - - - + +

Figure 24 : Tableau représentant la réponse de croissance d'Escherichia coli et Haloferax

volcanii face aux conditions qui leurs sont imposées

On constate que les résultats (figure 24) sont les mêmes pour tous les binômes, ce qui leur donne un meilleur degré de signification.

TP 5

EXPERIENCE N°1

But : déterminer le titre du bactériophage Lambda sur une souche sensible d’Escherichia coli.

LB LB YPC YPC

Escherichia coli Haloferax volcanii

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Principe : mélanger une suspension d’Escherichia coli avec une suspension du bactériophage Lambda, ensemencer la culture sur des boîtes contenant un milieu LB à des dilutions différentes. Puis faire incuber.

Résultats :

Figure 25 : Plages de lyse dues à la destruction des cellules d'Escherichia coli par le

bactériophage Lambda, selon différentes dilutions

On a créé les conditions favorisant le développement du bactériophage Lambda, qui est un virus ayant pour cible principale la bactérie Escherichia coli, chez qui il s’installe, réplique son ADN puis ressort, provoquant la lyse de la cellule bactérienne. On observe les conséquences de son développement sur les boîtes de pétri (figure 25) : les trous dans les colonies bactériennes correspondent à des plages de lyse cellulaire. Une plage de lyse visible correspond à environ 108 particules virales. En effet, à partir d’une particule virale, on obtient, au bout de 45 min, 102 particules, puis au bout de 45 min, 104, puis au bout de 45 min, 106 particules virales. Au bout d’un certain moment, le cycle s’arrête, car le virus n’a plus de quoi se développer. S’il semble rester des places de culture bactérienne entre les plages de lyse, ceci est notamment dû au fait que les cellules bactériennes sont vieilles et ne se divisent plus, mais également que la diffusion est de plus en plus faible car les bactéries sont de plus en plus éloignées.

10-5

10-6

10-7

10-8

19

Binôme Nombre de plages de lyse par dilution Titre

(pour 10-7) 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

1 Indéfini 496 57 13 0 5,7 x 109 2 Indéfini Indéfini 36 5 0 3,6 x 109 3 Indéfini Indéfini 65 4 3 6,5 x 109 4 Indéfini Indéfini 47 5 2 4,7 x 109 5 Indéfini Indéfini 60 6 1 6 x 109 6 - - - - - - 7 Indéfini 728 60 24 1 6 x 109

Figure 26 : Tableau représentant le nombre de plages de lyses en fonction des dilutions

effectuées et le titre qui en découle

Titre (figure 26) = nombre de particules de virus dans 1 mL de lysat. Pour le déterminer, on prend en compte le volume étalé sur la boite et la dilution appliquée. Explication calcul du titre pour la dilution à 10-7 : on prend le nombre de plages de lyse à la dilution 10-7 = 47. On multiplie ce nombre par l’inverse de la dilution pour avoir le concentré : 47 x 107, équivalent à 4,7 x 108. Puis on multiplie ce nombre par 10, car il vaut pour 100 µL de produit et il nous faut la concentration pour 1 mL : 4,7 x 108 x 10 = 4,7 x 109.

EXPERIENCE N°2

But : observer les caractères phénotypiques d’une nouvelle archée : Sulfolobus solfataricus. Principe : préparer une lame contenant le microorganisme après frottis et coloration et

l’observer au microscope optique. Résultats :

Figure 27 : Observation au microscope optique (x40 à gauche et x100 à droite) de

Sulfolobus solfataricus, après frottis et coloration au Cristal violet

20

Les archées sont des microorganismes unicellulaires procaryotes, dépourvus de noyau et organites. Elles sont ubiquitaires, mais leur particularité est de les trouver dans des milieux extrêmes que peu d’organismes supportent : obscurité totale, absence d’oxygène, températures supérieures à 100°C ou inférieures à 0°C, pressions très élevées, hautes concentrations en acide ou en sel, radioactivité... Sulfolobus solfataricus fait partie de ces archées (figures 27 et 28). C’est donc un microorganisme extrémophile, plus spécifiquement thermoacidophile, qui peut donc se développer dans des milieux à température très élevée : 80°C et très acides : pH entre 2 et 4. Il est autotrophe et tire son énergie du soufre.

Figure 28 : Grossissement d'une cellule de Sulfolobus solfataricus (à gauche) / Colonies de

Sulfolobus solfataricus (couleur rouge/marron) dans source chaude acide du parc national

du Yellowstone (à droite)

Sa résistance à de hautes températures est due aux protéines naturellement thermostables qu’il synthétise. Cela lui confère d’ailleurs une place de choix parmi les organismes modèles archéens étudiés en génétique, notamment dans le cadre d’expériences de recombinaison de protéines. En effet, les propriétés de ses enzymes répondent aux conditions de transformation de la biomasse. Suite à des manipulations génétiques effectuées par les chercheurs, il pourrait produire des quantités industrielles de ces nouvelles enzymes. Combiné au procédé de prétraitement de la cellulose par l'acide et la chaleur, ces enzymes pourraient accélérer le processus de dégradation de la cellulose, diminuer le temps et l'énergie nécessaires et accroître l'efficacité et la rentabilité de la production des biocarburants. Par ailleurs, Sulfolobus solfataricus est utilisée dans la recherche contre les virus. En effet, certains virus tels que HIV (responsable du sida) et le virus Ebola ont pour hôte (cible) le même groupe de protéines chez cette archée que chez l’être humain (un complexe de protéines lié au transport endosomique). Cela permet de supposer que ce complexe (appelé ESCRT) est ancien, puisque commun à une archée et un eucaryote, qui font partie de deux branches différentes de l’arbre du vivant.