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LE GÈNE ROM2, UN SUPPRESSEUR MULTICOPIE DE LA
DÉLÉTION DU GÈNE DE LA PROFILINE, PFYI, CHEZ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Mémoire présenté
à ia Faculté des études supérieures
de l'Université Laval
pour obtention
du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
Département de biologie
FAcULTÉ DES SCIENCES ET GENIES
UNWERSITÉ LAVAL
Q Ewa Hrynkïewicz
National Library 1+1 ,,ma& Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wellington OttawaON KIAON4 OttawaON K1AON4 Canada Canada
The author has granted a non- exclusive Licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distrriute or sell copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distriiuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation,
La profiline est une protéine qui, grâce à sa liaison
directe à l'actine et son implication dans la signalisation
cellulaire, joue un rôle important dans l'organisation du
cytosquelette d' actine. Les cellules de Saccharomyces
cerevisiae, dont le gène de la profiline a été délété, pfy ld ,
montrent plusieurs caractéristiques anormales. Nous avons
transformé les cellules pfylA avec une banque génornique
construite dans des plasmides multicopies et nous avons cherché
des suppresseurs de la délétion du gène de la prof line en
utilisant le NaC1 et la caféine en tant que facteurs de
sélection. Ce procédé nous a permis d'identifier le gène R O L ~
en tant que suppresseur multicopie de la délétion du gène de la
profiline chez Saccharomyces cerevisiae.
Ewa *ewicz -zakrzewska
D o m i n i c k Pallotta
REMERCIEMENTS
Si ce travail a pu voir le jour, c'est grâce à l'aide de
plusieurs personnes qui m'ont soutenue tout au long de mes deux
années d'études et de recherche,
Je tiens à remercier de façon particulière mon directeur,
M. Dominick Pallotta, pour ses conseils et sa présence
encourageante. surtout dans les moments un peu plus difficiles.
Je remercie également mon codirecteur, M. Yves Bourbonnais,
pour ses conseils, M. André Laroche et Mme Nathaly Marcoux,
pour leurs conseils et leur aide pratique. ~nfin, à toute
l'équipe du laboratoire, merci pour avoir créé une athmosphère
agréable qui favorise le questionnement (scientifique. bien
s u y ) .
ABS600 - absorbance à la longueur d'ondes de 600 qm
ADN - acide désoxyribonucléique
ADP - adénosine diphosphate
amp - ampicilline
AMPc - adénosine monophosphate cyclique
ATP - adénosine triphosphate
CTAB - bromure d'hexadécyltrL~éthylammonium
DABCO - 1,4-diazabicyclo(2,2,2)octane
DTT - dithiothréitol
EDTA - acide éthylène diamine tétraacétique
FITC - fluorescein isothiocyanate
kb - kilopaire de bases
kV - kilovolt
min. - minute
ml - millilitre mM - millimolaire
pb - paire de bases
PEG - polyéthylène glycol
r p m - révolution par minute SDS - dodécyl sulfate de sodium
Xgal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-~eta-~-ga~actosidase
qm - nanomètre
pF - microFarad
pl - microlitre
LISTE DES FIGURES
Cycle vital de S . cerevisiae ................................ 4 Distribution du cytosquelette d'actine ...................... 7
plasmide YEp24. ............................................ 21
Plasmide pVT102U ........................................... 22 Plasmide pRS426 ............................................ 23 Croissance des souches P m 1 etpfyld ....................... 38
Digestion des plasmides recombinants ....................... 46 caractérisation des fragments ~'ADN génomiques de
S . cerevisiae présents dans les plasmides recombinants. .... 47
Séquence du plasmide p-2 ................................. 49 Séquence du plasmide p-2 ................................. 50
Plasmides récupérés des transformants capables de
croître en présence de NaCl et en présence de caféine . . . . . . 51 Carte de restriction et plasmides recombinants obtenus
grâce aux délétions du plasmide p-2 ...................... 56 Sous-clonage du fragment HindIII ........................... 58
Croissance des souches recombinantes ....................... 59 Morphologie des cellules ................................... 61 Test de zone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Courbes de croissance à 30°C ............................... 66 ............................... Courbes de croissance à 37°C 67
. . . . . . . . . . . . . . Coloration des plaquettes corticales d'actine 69
Modèle d'implication du gène ROM2 dans la signalisation
cellulaire ............................................. 78
Modèle d'interaction des gènes dans la régulation du
cytosquelette .............................................. 82
LISTE DES TABLEAUX
protéines qui se fixent à l'actine. ........................ 10
Souches de S.cerevisiae .................................... 19 Plasmides. ................................................ 20 Transformants sélectionnés sur 1, 25 M NaC1 .............. 41-42 Regroupement des souches .................................. 43
........................................... 1- IXIRODUCTION 1
1.1. Cycle cellulaire de la levure Saccharomyces
........................................... cerevisiae 1
1.2 . Cytosquelette d'actine .......................... 5 1.3. Contrôle de la distribution de l'actine ......... 8
....... . 1.4 Cytosquelette d'actine et choc osmotique 11
..................... 1.6. Mutant de profiline, p f y l A 16
......................................... 1.7. Projet 18
II . MATÉRIEL ET &THODES ................................. 19
.......................... 11.1. Souches et plasmides 19
................................ 11.1.1. Souches 19
. 11.1.1.1. Souches de S cerevisiae ........ 19 ....... 11.1.1.2. Souche diEscherichia co l i 20
.............................. 11.1.2. Plasmides 20
........... 11.2. Conditions et milieux de croissance 24
.......................... 11.3. préparation de l'ADN 24
11.3.1- Minipréparations de I'ADN plasmidique
.................................. des bactéries 24
II . 3 - 2 . Maxipréparations de 1 ' ADN plasmidique .................................. des bactéries 25
11.3.3. Préparation de l'ADN génornique des
........................................ levures 26
11.4. préparation de la banque génornique des
............................................. levures 27
. ............................... 11.5 Transformations 27
............ 11.5.1. Transformation des levures- 27
I1.5,2. Transformation des bactéries par
électroporation ................................ 28 11.5.3. Transformation des bactéries par la méthode de CaC12 ..,............................ 29
II . 6 . Sélection des transformants de S . cerevisiae . . 30 II . 7 . Récupération des plasmides de cellules de S . cerevisiae .......................................... 32
11.8. Séquençage .................................... 32 11.9. Clonage ....................................... 33 11.10. Courbes de croissance ........................ 33 11.11. Test de zone ................................. 34 11.12. Coloration des cellules de S . cerevisiae à
la phalloïdine ...................................... 34 ~II. RÉSULTATS ........................................... 3 6
111.1. Transformation de cellules p f y l A et choix de
milieux de sélection ................................ 3 6
. . . 111.3. Identification et séquençage des plasmides 44
111.4. Identification des gènes ..................... 53
111.4.1. &ne ROM2 ............................. 53
111.4.1.1. Morphologie des transformants
contenant le gène ROM2 .................... 60 III.4,l.S. Test de zone pour les
transformants contenant le gène ROM2 . . . . . . 62 111.4.1-3. Croissance des transformants
contenant le gène ROM2 à 37OC . . . . . . . . . . . . . 65 III . 4 1.4 Répartition d'actine dans les transformants contenant le gène ROM2 . . . . . . 68
111.5. Transformation des cellules p f y l A avec les
gènes RKOl et RH02 .................................. 70
IV . DISCUSSION ........................................... 71 IV.1, Les suppresseurs multicopies de la délétion
du gène de la profiline ............................. 71 IV.1. Le gène MID2 .................................. 73 IV.1. Le gène ROM2 .................................. 74
V . CONCLUSION ............................................ 79 RÉFÉRENCES ............................................... 83
INTRODUCTION
1.1. Cycle cellulaire de la levure Saccharomyces
cerevis iae
~'ascomycète unicellulaire Saccharomyces cerevisiae, grâce
à sa relative simplicité, est utilisé dans la recherche en tant
que cellule eucaryote modèle. Étant donné la facilité de
culture et la connaissance très poussée de son génome, la
levure à bourgeonnement est un organisme idéal pour la
recherche.
S. cerevisiae peut croître sous une forme haploïde ou
diploïde sans différences morphologiques visibles entre les
deux types de cellules (Barnes et al., 1990) . Il se multiplie par bourgeonnement. Au début de la phase S, le site de
bourgeonnement est choisi et, à partir de ce moment, toute la
-1-
croissance et la sécrétion sont polarisées vers le bourgeon,
qui devient la cellule-f ille (Drubin et al., 1988) . S. cerevisiae existe sous forme de deux types sexuels (mating
type) : MATa et MA% (Lindegren et Lindegren, 1943) . Deux
cellules haploïdes des sexes opposés peuvent fusionner pour
former une cellule diploïde. Les cellules de la levure
bourgeonnent selon deux modeles spatiaux, qui sont déterminés
par le type de cellule (Hicks et al,, 1977) - Le bourgeonnement des cellules haploïdes M A T a (ainsi que diploïdes MATa/a) et
des cellules haploïdes MAT(X (ainsi que diploïdes mm/a) est
axial, c'est-à-dire que le premier site de bourgeonnement est
choisi à côté de la "cicatrice de naissance" (birth s c a r ) , et
chaque bourgeonnement suivant est placé toujours près du site
précédent. Les cellules diploïdes MATa/a bourgeonnent de
manière bipolaire. Le premier site de bourgeonnement est choisi
au pôle opposé à la "cicatrice de naissance", et chaque site
suivant est placé soit au pôle opposé de la cellule, soit à
côté du site précédent-
Les deux types sexuels sont déterminés par les phéromones
qui sont des oligopeptides sécrétées par la cellule dans le
milieu de culture (Thorner, 1981). Les cellules haploïdes MATa
sécrètent le facteur a et les cellules haploïdes MATcx
sécrètent le facteur a. Les phéromones sont reconnues par les
récepteurs spécifiques situés à la surface de la cellule de
type sexuel opposé (Bender et Sprague, 1986; Bender et Sprague,
1989). Ces deux phéromones sont nécessaires pour la conjugaison
(mating) de deux cellules haplozdes, une MATa et une M A m , qui
en fusiomant forment une cellule diploïde (Nasmyth et Shore,
1987; Cross et al,, 1988; Herskowitz, 1989). Une cellule répond
au signal de phéromone en induisant la transcription des gènes
qui codent pour des protéines nécessaires pour la conjugaison
(par ex.: des agglutinines spécifiques) (Wetzele et al., 1988;
Lipke et al., 1989), des protéines nécessaires pour la
k a r y o g d e (une fusion des noyaux) (Rose et al., 1986), et la
protéine du gène FUS1 indispensable pour la fusion cellulaire
(Trueheart et al., 1987; McCaffrey et al., 1987). Une cellule
diploïde peut se multiplier par le bourgeonnement de même façon
qu'une cellule haploïde. Mais, dans certaines conditions, par
exemple, dans le cas d'une carence en azote ou en présence de
source de carbone non-fermentable, comme l'acétate, les
cellules diploïdes forment des spores (Haber et Halvorson,
1975) . La formation des spores est une excellente façon de survivre aux conditions non favorables et de prolonger
1 ' espèce.
Figure 1. Cycle vital de S. cerevisiae.
présentation schématique du cycle vital de S. cerevisiae. Prolifération d'une cellule diploïde, M a t a / c x , par
bourgeonnement et formation de deux cellules diploïdes.
~éiose et formation des spores. Chaque ascus contient
quatre ascospores.
Libération des ascospores qui sont des cellules haploïdes,
Prolifération des cellules haploYdes par bourgeonnement-
Fornation de shmoo. Fusion de deux cellules haploïdes MATa et suivie de la
fusion des noyaux et formation d'une cellule diploïde, mTa/a.
1.2. Cytosquelette dfactine
L'actine est une protéine majeure, une des mieux
conservées chez les eucaryotes et qui joue dans la cellule des
rôles multiples- Son rôle prépondérant dans les cellules non
musculaires est la formation du cytosquelette, un réseau
protéique de la cellule, qui est responsable du maintien de la
forme de la cellule et assure la plupart des transports
cellulaires (Weeds , 19 82 ) - Dans la cellule, l'actine se présente sous une forme
globulaire (actine G) et sous une forme filamenteuse (actine
F), qui résulte de la polymérisation des moléculos d'actine G.
La polymérisation d'actine globulaire permet la formation de
structures plus complexes faisant partie du réseau
cytosqueletique. Deux de ces structures peuvent être mises en
évidence par I'immunofluorescerice: les câbles et les plaquettes
corticales d'actine (actin patches). Le fait qu'ils peuvent
être visualisés grâce à la coloration avec phalloïdine-
rhodamine suggère que les câbles et les plaquettes corticales
contiennent de l'actine filamenteuse (Adams et Pringle, 1984).
La polymérisation et la dépolymérisation de 1 ' actine
filamenteuse dans la cellule non musculaire sont très bien
contrôlées, aussi bien du point de vue temporel que spatial, ce
qui assure à la cellule une possibilité de r6arranger son
cytosquelette en réponse aux stimuli externes et au moment
précis du cycle cellulaire (Theriot et Mitchison, 1993).
Chez la levure S. cerevisiae, le cytosquelette d ' actine
est impliqué dans la polarisation de la croissance et de la
sécrétion pendant le bourgeonnement, dans la cytokinèse, dans
l'endocytose, ainsi que dans la formation de protubérance
(shmoo) pendant le croisement (Adams et Pringle, 1984) . La figure 2 montre la distribution des structures du cytosquelette
d'actine pendant le cycle cellulaire et le croisement. Les
câbles d'actine sont de longues structures filamenteuses
placées dans l'axe de croissance de la cellule, retrouvées dans
la cellule-mère et orientées vers la cellule-fille (Byers,
1981; Kilrnartin et Adams, 1984). Les plaquettes corticales
d'actine sont concentrées sur la membrane plasmique du
bourgeon, aux endroits de croissance accrue. Premièrement, les
plaquettes d'actine apparaissent sur la membrane plasmique en
formant un cercle qui entoure l'endroit choisi pour l'émergence
du bourgeon. Pendant la croissance du bourgeon, les plaquettes
sont localisées presgue uniquement dans celui-ci, et plus tard,
dans le cycle cellulaire, les plaquettes d'actine se regroupent
autour du cou de bourgeon, là, où a lieu la séparation de la
cellule-fille de la cellule-mère (Barnes et al., 1990) .
Figure 2 . Distribution du cytosquelette d' actine. présentation schématique de la distribution des câbles ( - 1 et
des plaquettes corticales dlactine ( O ) , tout au long du cycle
cellulaire et pendant le croisement- Tiré de Barnes et al.,
1990,
1.3. Contrôle de la distribution de llactine
Dans la cellule, tout au long du cycle cellulaire, les
changements précis du cytosquelette d'actine sont à la base du
contrôle spatial de la croissance de la paroi et, de cette
façon, déterminent la morphologie de la cellule (Kihartin et
Adams, 1984; Adams et Pringle, 1984; Novick et Botstein, 1995).
La question importante concerne le mécanisme de contrôle de
l'organisation du cytosquelette dfactine et la façon dont ces
structures influencent la croissance polarisée de la paroi.
La délétion du gène de l'actine, ACTI, est létale et les
phénotypes des mutants d'actine ( a c t l ) suggèrent un rôle de
lfactine dans l'organisation spatiale de la croissance de la
membrane cellulaire (Novick et Botstein, 1985). Ces mutants ont
un défaut dans la formation du bourgeon : leur croissance est
uniforme au lieu d'être concentrée dans le bourgeon. La chitine
est déposée partout sur la surface de la cellule, tandis que
dans la cellule normale, elle est localisée autour du cou du
bourgeon (bud neck). En plus, les vésicules de sécrétion
s'accumulent dans la cellule et la forme pleinement glycosylée
de l'invertase est retenue. Finalement, les mutants d'actine
sont osmosensibles et. souvent, les cellules meurent pendant le
bourgeonnement.
Les mutations dans plusieurs autres protéines donnent des
phénotypes semblables. telle la délocalisation des plaquettes
gène protéine
prof iline
tropomyosine
capping pro tein
fonction
favorise ou inhibe la polymérisation de l'actine en se liant aux
monomères d'actine
stabilise les filaments d'actine en
s ' y liant de façon latérale
stabilise le bout "barbun (barbed
end) des filaments d'actine en s 'y
liant . . . - . . . . - - - - - - - . -. -
réticule les filaments adjacents en
cort ical ac t i n -
b i n d i n q pro tein
fibres d'actine parallèles
impliqué dans lrassemblage du
cytosquelette cortical d'actine
impliqué dans l'assemblage du
cytosquelette cortical et dans
l'endocytose
stabilise les filaments d'actine
dans le site de bourgeonnement
Tableau 1. Protéines qui se fixent à llactine.
Le tableau présente certaines gènes codant pour des protéines
qui se fixent à 1 ' actine (act in-binding pro teins) ainsi qu ' une courte description de leurs fonctions.
1.4 . Cytosquelette dlactine et choc osmotique
Une exposition de cellules de levures S. cerevisiae à une
haute osmolarité du milieu entrazne une déshydratation, un
dérèglement du gradient des ions à travers la membrane
plasmique et une diminution de la viabilité cellulaire (Mager
et Varela, 1993). En réponse générale au stress osmotique, la
cellule accumule rapidement des osmoIites compensatoires
(Yancey et al., 1982) . Chez les levures, ce rôle est rempli par le glycérol dont la production est augmentée de façon
significative (Brown, 1978) . En général, les réponses
d'osmotolérance se situent à plusieurs niveaux et comprennent,
entre autres: 1) une augmentation d'activité du système de
transport des ions ~+(Gaber et al., 1988; Ko et G a b e r , 1991);
2) l'induction du système de transport des ions ~ a + toxiques
pour la cellule (Garciadeblas et al. , 1993 ; Haro et al. , 199 1) ;
3) l'augmentation de la synthèse du glycérol et la diminution
de la perméabilit4 de la membrane plasmique pour le glycérol
(André, 1991; Blomberg et Adler, 1989); 4) l'augmentation de la
synthèse de la tréhalose (Wiemken, 1990) ; 5) les changements
dans l'expression génique (Norbeck et Blomberg, 1997; Mager et
Varela, 1993; Gaxiola et al., 1992; Gaxiola et al., 1996;
Varela et al., 1992) ; et 6) l'augmentation de l'activité H+-
ATPase membranaire (Reuveni et al. , 199 0 ) .
Un aspect majeur, mais toujours pas très bien connu, de la
réponse de la cellule au stress osmotique est un remaniement du
cytosquelette d'actine. En réponse à l'augmentation
d'osmolarité du milieu, le cytosquelette subit de rapides et
réversibles changements dans l'organisation des filaments
d'actine (Chowdhury et al., 1992). Dans un premier temps, les
cables d'actine présents dans la cellule-mère disparaissent, ce
qui provoque une diminution de la concentration d'actine
polymérisée dans la cellule ( Y e h et Haarer, 1996). Ebsuite, des
plaquettes corticales d' actine ( a c t i n patches) sont
délocalisées de la cellule-fille vers la cellule-mère.
Toutefois, ces changements sont réversibles et après une à deux
heures, la cellule restaure son cytosquellete. Cette réponse
est la même pour plusieurs agents osmoactifs tels: glucose,
glycérol, KCl, NaCi et sorbitol (Chowdhury et al. , 1992) . Tel est le cas de la cellule sauvage ( P F Y I ) . Cependant, dans la
cellule dont le gène de la profiline est délété ( p f y l d ) ,
l'augmentation de l'osmolarité du milieu semble causer plutôt
l'augmentation de la concentration d'actine polymérisée dans la
cellule (Yeh et Haarer, 1996) . Le mécanisme responsable des changements d'organisation d'actine en réponse au choc
osmotique reste obscur, mais il suggère des changements dans
l'association de l'actine avec plusieurs autres protéines.
La profiline est une des nombreuses protéines qui
s'associent à l'actine et jouent un rôle dans l'organisation du
cytosquelette. C'est une petite protéine (12 - 15 kD), dont les
homologues sont présents dans plusieurs organismes. La
profiline était isolée pour la première fois de la rate de veau
(Carlsson et al., 1977) et les découvertes dans d'autres tissus
de vertébrés ont suivi (Blikstad et al., 1980; Fattoum et al.,
1980; Ohshima et al., 1989). Ses homologues étaient retrouvés
dans Acan thamoeba castellani (Arnpe et al. , 198 5 ; Keiser et al - ,
1986; Ampe et al., 1988) , P h y s m polycephalum (Osaki et al.,
1983 ; Osaki et Hatano, 1984) et Thyone briareus (Tilney et al.,
1983 ) . Chez la levure S. cerevisiae, la prof iline est codée par un seul gène, P F Y I , situé sur le chromosome XV (Magdolen et
al., 1988) . La profiline a été découverte en tant que protéine qui
£orme un complexe 1:1 avec des monomères d'actine (Carlsson et
al., 1976), poux être ensuite désignée comme un agent inhibant
la croissance de filaments d'actine in vitro (Carlsson et al.,
(1977). Pendant longtemps, la profiline a été tenue pour
l'agent majeur responsable de la séquestration de monomères
d'actine, et ce rôle était le seul connu de cette protéine.
Des travaux récents ont montré que la profiline remplit
aussi d'autres fonctions dans la cellule. L'une d'elles est la
promotion d'échange des nucléotides d'adénine (ADP et ATP) liés
aux monomères d'actine (Pantaloni et Carlier, 1993). L1actine
est une ATPase, qui peut être liée à l'ATP ou à 1'ADP. Grâce à
l'hydrolyse, ces nucléotides peuvent être échangés
(Goldschmidt-Clermont et al ,, 1992b) . L 'hydrolyse d' ATP est associee à la polymérisation car l'actine associée à 1'ATP
(ATP-actine) polymérise plus vite et à une concentration
critique plus basse que 1'ADP-actine (Pollard, 1986). La
liaison de l'actine à la profiline diminue de 1000 fois
l'affinité de l'actine au nucléotide lié, ce qui a pour
résultat le relâchement de ce nucléotide et la liaison d'un
autre (Goldschmidt-Clermont et al. , 1991b) . Étant donné que dans la cellule le niveau de 1'ATP est beaucoup plus élevé que
le niveau de llADP, la liaison de la profiline à l'actine
promeut le remplacement de llADP par l'ATP sur des monomères
d'actine. et de cette façon accélère la polymérisation d'actine
(Theriot et Mitchison, 1993) . Dans la cellule qui manque de profiline, l'échange des nucléotides sur les monomères d'actine
se fait très lentement, d'autant plus qu'une autre protéine, la
Thymosin 64, se charge de la séquestration des monomères
d'actine (Safer et al., 1990) . L'implication de la profiline dans la polymérisation
d'actine est supportée par son remplacement aux sites où la
croissance des filaments dlactine a lieu, par exemple, dans
lammelipodia, dans l'anneau contractile pendant la cytokinèse
(Edamatsu et al., 1992 ; Balasubramanian et al. , 1994) et à la
surface de certaines bactéries pathogènes (e. g. Lys teria
monocytogenes) pendant leur déplacement dans les cellules
infectées (Gossart, 1995) . La profiline semble également être impliquée dans au moins
deux voies de la signalisation cellulaire. La voie de protéine
kinase C (PKC) , impliquée dans la production de la paroi
cellulaire (Goldschmidt - Clermont et al,, 1991; Goldschxnidt - Clermont et al., 1990), et dans la voie de protéine kinase A
(PKA), impliquée dans la reconnaissance des nutriments dans le
milieu de croissance (Voj tek et al., 1991) . L' implication de la profiline dans la voie de PKA est soutenue par sa liaison au
complexe d'adenylate cyclase, l'enzyme responsable de la
production ~'AMPc, une molécule qui active la cascade de
signalisation de PKA.
La profiline se lie à un phospholipide membranaire,
phosphatidylinositol 4.5-biphosphate (P IP2 ) . Le PIP2 est un
substrat pour une enzyme de la voie de signalisation des MAP
kinases, la phospholipase C (PLC) , qui est activée par la
phosphorylation (Goldschmidt - Clermont et al., 1991). Le clivage de P I P 2 par PLC produit le diacylglycérol ( D A G ) , un
deuxième messager qui active la voie de PKC. La liaison au PIP2
diminue de façon spectaculaire l'affinité de la profiline pour
l'actine. La présence de P1P2 peut m ê m e causer la dissociation
du complexe actine - profiline (Lassing et ~indberg, 1985;
Katakami et al., 1992).
La profiline se lie aussi à la polyproline, ce qui
n'affecte pas sa capacité de lier l'actine (Perelroizen et
al. , 1994) . Cette affinité est A la base de la liaison avec
plusieurs protéines telles Bnilp (Imamura et al., 1997),
drebrin et gephyrin (Mammoto et al. , 1998) , VASP et murine
Mena protéines (Kang et al., 1997)
Tout cela nous donne une image assez complexe de la
profiline qui, malgré sa petite taille, semble être très
importante pour le fonctionnement normal de la cellule, Son
rôle dans la polymérisation - dépolymérisation d ' actine est
prépondérant pour le remaniement rapide du cytosquelette.
1.6. Mutant de profiline, p f y l d
Les cellules de S. cerevisiae, dont le gène de profiline a
été délété, p f y l d , montrent plusieurs caractéristiques
anormales (Haarer et al., 1990). Elles perdent leur forme
ellipsoïdale pour devenir rondes et plus grosses que les
cellules sauvages, P F Y l . Leur croissance à 30°C est trois fois
plus lente que celle de cellules normales et elles ne croissent
pas à 37OC. Chez la levure, la chitine est déposée en forme de
petits cercles sur la membrane cellulaire à l'endroit
d'émergence du bourgeon (Pringle et Hartwell, 1981) et elle
reste en place après le bourgeonnement. Dans les cellules
dépourvues de profiline, la chitine est délocalis6e et déposée
sur toute la surface de la cellule-mère (Haarer et al., 1990).
Leur schéma de bourgeonnement est dérangé, le site est choisi
au hasard (random budding) , et étant donn6 que 1 ' émergence de
bourgeon, elle-même, est souvent compromise, les cellules
peuvent devenir multinucl&es, la division nucléaire étant
normale.
Dans la cellule sauvage, l'actine est présente sous forme
de câbles, s'étirant dans l'axe de croissance de la cellule, et
sous forme des plaquettes corticales ( a c t i n patches) déposées
sur la membrane cellulaire. ( K i h a r t i n et Adams, 1984; Adams et
Pringle, 1984; Novick et Botstein, 1985; Drubin et al., 1988).
Pendant le cycle cellulaire, les plaquettes corticales sont
relocalisées en suivant la croissance et la sécrétion (Lew et
Reed, 1995) . Dans les cellules sauvages, P F Y I , avec un petit
bourgeon, les plaquettes corticales sont concentrées dans
celui-là pendant sa croissance. Dans les cellules pfyld, les
plaquettes d'actine sont délocalisées et déposées sur toute la
surface de la cellule-mère et du bourgeon, les câbles d'actine
sont absents (Haarer et al. , 1990 ) . Les plus récentes recherches (Marcoux et al., 1998) ont
démontré plusieurs autres caractéristiques des cellules pfyld.
Il y a une accumulation des vésicules, contenant des
glycoprotéines, ce qui présage un problème de transport, mais
la sécrétion de Ilinvertase est normale. L'efficacité de
croisement de cellules haploïdes MAW p f y l A est moindre que
celle d'une cellule M;ATuI P F Y l , malgré la formation normale de
shmoo. Ce défaut est dû aux problèmes de maturation et de
sécrétion de facteur a dans les cellules p f y l d .
1.7. P r o j e t
Le projet porte sur la recherche des suppresseurs de la
délétion du gène de la profiline chez la levure S. cerevisiae.
La recherche des suppresseurs d'une mutation est un procédé
classique qui permet d'identifier les protéines agissant dans
la même voie métabolique ou dans une cascade de signalisation.
Étant donné que le rôle de la profiline n'est pas encore
pleinement éclairci, en cherchant les suppresseurs de la
délétion du gène de la pro£iline, nous espérons ajouter
quelques indications coccernant les interactions de la
profiline avec d'autres protéines dans la cellule, ainsi que
son implication dans divers événements.
11.1. Souches et plasmides
11.11 Souches
1 . 1 . 1 1 . Souches de S. cerevisiae
SOUCHE
Mat-a, lys2-80 (am), ura3-52,
his3 -4200, t-1-1 (am) ,
1eu2-3,112, PFYl
Mat-a, 1 ~ ~ 2 - 8 0 (am} , ~ a 3 - 5 2 ,
his3-4200, trpl-1 (am) , 1eu2-
3,112,pfylA: :LEU2
ce travail
Tableau 2 . Souches de S. cerevisiae,
1 2 Souche dtEsrherichia coli
Dans notre recherche, nous avons utilisé la souche
XLI-Blue (Stratagene) de bactéries E x d i , dont le génotype
est: recAl endAl gyrA96 thi-2 hs-17 supE44 r e i A l l a c [F'proAB
lac1 qZ DM15 TnlO (Tetr) ]
11.1.2. Plasmides (Figures 3 ,4 ,5 )
Tableau 3 . Plasmides utilisés. Le tableau montre les plasmides utilisés pour les
transformations ainsi que leurs marqueurs. Les plasmides YEp24,
pVT102 et pRS426 ont été utilisés pour transformer les cellules
de levures. Le plasmide YEp24 a été également utilisé pour
transformer les cellules de bact6ries.
PLASMIDE
YE@24
pVT102
pRS42 6
MARQUEXJR
URA3,Tc,Amp
-,Am&?
-,-
Pvu Il
S p h l 3971' b h h e 1 3638
amH 1 3784
Figure 3 .Plasmide -24.
Le plasmide YEp24 a été utilisé pour les transformations de
levures et de bactéries. Il possède les gènes de résistance à
l'ampicilline (amp) et à la tétracycline (Tc) permettant la
sélection des transformants de bactéries, ainsi qu'une origine
de réplication (ORI) nécessaire pour la réplication du =lasrnide
dans les cellules bactériennes. Le gène URA3 codant pour
l'uracile permet la sélection de transformants de levure sur le
milieu -ura et l'origine de réplication 2p ori permet la
réplication du plasmide dans les cellules de levure. Les sites
de restriction montrés sont ceux le plus souvent utilisés dans cette recherche.
Figure 4. plasmide p W l O 2 U
Le plasmide pVT102U a été utilisé pour transformer les cellules
sauvages, P F Y l , et mutantes, pfyld, de levure pour permettre
leur croissance sur le milieu -ura (URA3) . Le plasmide possède
aussi trois origines de réplication, 2lori, permettant la
réplication du plasmide dans les cellules de levures; ori,
permettant la réplication du plasmide dans les cellules de
bactéries et flori, pour la replication du plasmide dans les
phages. Il y a aussi les gène de résistance à l'ampicilline
(Amp), les sèquences ADKp et ADH3' constituant, respectivement,
le promoteur et la région 3' non codante de l'alcool
dehyàrogenase Le site multiple de clonage se trouvant entre les
séquences ADH3 ' et ADHp
URA 3 1
Figure 5 . Plasmide pRS426. Le plasmide pRS426 a été utilisé pour sous-cloner le gène ROM2.
Le plasmide possède le gène codant pour 1 'uracile (URA3 ) . le gène de résistance à llampicilline (Amp), le gène codant pour
iS-galactosidase (lac21 et trois origines de repication: 2 p or i ,
pour la réplication du plasmide dans les cellules de levures;
ori, pour la réplication du plasmide dans les cellules des
bactéries et fl+, pour la réplication du plasmide dans les
phages.
11.2. Conditions et milieux de croissance
Les cultures des levures S. cerevisiae étaient incubées à
30°C dans l e milieu YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2%
glucose) , ou dans le milieu de sélection SD ( 0 , 6 7 % Yeast
nitrogen base w/o a.a . , 2% glucose) complété avec des acides
aminés*, mis à part l'acide aminé dont le marqueur est présent
dans la souche- Les milieux solides contenaient 2% d'agar.
Les cultures bactériennes étaient incubées à 37°C
dans l e milieu LB (1% tryptone, 1% NaCl, 0 , 5 % Y e a s t extract)
complété avec de l'ampicilline (100 pg/ml) . Le milieu solide contenait 1 , 7 % d'agar-
* Les acides aminés utilisés pour la préparation de milieu
minimal sans uracile:
Adenine
~rginine
Histidine
Leucine
LYS ine
Methionine
~henylalanine
~hreonine
Tryptophan
Tyrosine
11.3. Preparation de l'ADN
XI.3.1. ~inigr6parations de l'ADN plasmidipue des
bactéries
Trois millilitres d'une culture bactérienne de nuit
étaient centrifugés dans un tube. Les cellules étaient
suspendues dans 200 pl de tampon STET (8% sucrose, 50 mM Tris
pH 8,0, 50 mM EDTA, 0,1% Triton X-100), 4 pl de lysozyme
(50 mg/&) étaient ajoutés et après 5 minutes d'incubation à la
température de la pièce, le mélange était placé dans un bain
d'eau bouillante pendant 45 S. Après 10 min. de centrifugation
à la vitesse maximale, le culot constitué des protéines et de
l'ADN chromosomique était enlevé. Le surnageant était incubé à
65OC pendant 10 min. avec 5 pl de RNase (10 mg/ml) . L'ADN était précipité avec 10 pl de tampon CTAB (5% [P/V] CTAB, 0,s M NaCl)
et centrifugé pendant 5 min. Le surnageant était enlevé et le
culot suspendu dans 300 pl de N a C l 1,2 M. La précipitation
finale était effectuée par ajout de 750 pl d'éthanol 95% le
mélange était incubé sur la glace pendant 30 min. et centrifugé
10 min. à la vitesse maximale, Le culot était lavé avec de
l'éthanol 70% et dissout dans 25 pl de TE (10 mM ~ris-Cl pH
8,0, 1 mM EDTA)
11.3.2. Maxipréparations de l'ADN plasmidique des
bactéries
Les maxipréparations d'ADN plasmidique de bactéries
étaient faites selon la méthode de Feliciello et Chinali
(1993).
Une culture bactérienne de nuit (100-500 ml) était
centrifug6e (10 ml dans un tube de 2 m i ) , les cellules étaient
lavges avec du tampon STE (0,l M NaCl. 10 mM Tris pH 8,0, 1 rriM
EDTA) froid et centrifugées 1 min. à 13000 rpm. On a ajouté 250
pl de la solution 1 froide (50 mM glucose, 10 mM Tris p H 8,0, 1
mM EDTA). 500 pl de la solution 2 (0,2 M NaOH, 1% SDS) et 750
pl de la solution 3 (4 vol de 5 M CH3COOK, 1 vol de 10 M
CH3COOH) . Après l'ajout de chaque solution, les cellules
étaient incubées sur la glace pendant 5-10 min. Les tubes
étaient centrifugés pendant 10 min. à 13000 r p m à 4OC. Le
surnageant était transféré dans un tube de 2 ml et on a ajouté
0,7 m l d'isopropanol. Le mélange était incubé pendant 5 min. à
la température de la pièce et centrifugé pendant 10 min. à
13000 r p m . Le culot était dissout dans 250 pl du TE, et incubé
avec 10 mg/ml RNase pendant 15 min. L'ADN était précipité par
ajout de 300 pl du 88% isopropanol-0,2 M CH3COOKr centrifugé et
solubilisk dans 100 pl du TE. Ensuite, on a procédé à une
déprotéinisation. Cent microlitres du mélange phénol-
chloroforme (1 vol. de phénol, 1 vol. de chloroforme-acide
isoamylique 24:l) étaient ajoutés à 100 pl de solution
d'ADN, mélangés pendant 5 min. et centrifugés pour bien diviser
les phases. La phase aqueuse était reprise et l'ADN précipité
par ajout de 1/10 de volume de CH3COONa 3 M et de deux volumes
d'éthanol 95%. L'ADN était resolubilisé dans 100 pl de TE.
11.3.3, Préparation de l'ADN genomigue des
levures,
Trois millilitres d'une culture de levures de 16 heures
étaient centrifugés et les cellules suspendues dans un mélange
de 200 ~1 de tampon de lyse (2% [v/v] rito on X-100, 1% SDS
[p/v], 100 rnM NaCl, 10 mM ris-HC1 pH & O t 1 mM EDTA), 200 pl
de phénol/chloroforme, billes de verre en quantité égale au
volume du culot. Les cellules étaient: agitées auvortex pendant
4 min., ensuite centrifugées pendanr 5 min. pour bien diviser
les phases. La phase aqueuse était recueillie et t ra i tée avec
un volume égal de phénol/chloroforme pendant une minute. A p r è s
la centrifugation, la phase aqueuse était reprise et l'ADN
précipite par ajout de 200 pl dléthanol 95% avec l'incubation
sur la glace pendant 30 min. Le culot était recueilli par
centrifugation à 13000 r p m et solubilisé dans 50 pl de TE.
11.4. Préparation de la banque génomique des
levures
La banque génomique a été préparée par la digestion
partielle de l'ADN génornique de la souche S288C de
S. cerevisiae avec une endonucléase de resric tion Sau3A, suivi
par le clonage de l'ADN digéré dans le site BamHI du plasmide
-24. La banque a été préparée et mise à notre disposition par
Monsieur Yves Eouxbonnais.
11.5 Transformations
1 . 5 . Transformation des levures.
Trois millilitres de milieu YPD étaient inoculés et la
culture incubée à 30°c pendant 16 heures, Un millilitre de
cette culture était centrifugé et les cellules recueillies dans
50-100 pl de milieu. Ensuite, on y a ajouté 2 pl de l'ADN du
sperme de Hareng, bouilli précédemment pendant 20 min., et 1 pl
de minipréparation de l'ADN plasmidique, tout était
délicatement mélangé. Ensuite, on a ajouté 500 pl de Plate
mixture et 20 pl de 1 M DTT. L'incubation était effectuée
pendant 24 heures à la température de la pièce et suivie d'un
choc thermique de 10 min. à 42OC. Ensuite, les cellules étaient
recueillies par centrifugation, suspendues dans 100-200 pl
d'eau stérile et déposées sur la boîte contenant le milieu de
s4lection. La boxte était incubée à 30°C jusqu'à l'apparition
des colonies de transformants.
Pl a te mixture
45% PEG 4000 stérile 90 m l
1 M LiOAc 10 ml
1 M Tris-CI (pH 7,s) 1 ml
0,s M EDTA 0,2 ml
11.5.2. Transformation des bactéries par
électrogoration
Cent millilitres de milieu LB sans ampicilline étaient
inoculés avec 1/100 de volume de culture de nuit des cellules
XLI Blue. La culture était incubée à 37OC avec agitation
jusqu'à ce que l'absorbante (ABS~OO) atteigne la valeur de 0,5
- 1,O. Ensuite, la culture était mise sur la glace pour 15-30
min. et centrifugée à OC pour recueillir les cellules. La
centrifugation était suivie par trois lavages : le premier avec
1 volume d'eau froide, le deuxième avec 1/2 volume d'eau
froide et le troisième avec 1/50 de volume de glycérol 10%.
Finalement, les cellules étaient suspendues dans 1/500 - 1/300
de volume de glycérol et gardées sur la glace.
Un millilitre de suspension des cellules était mélangé
avec 1-2 pl d'ADN et gardé sur la glace pendant 1 min.
L'appareil Gene Pulser était réglé 25 FF et 2 - 5 kV, Pulse
Controller à 200 Ohms. Le mélange de cellules et d'ADN était
transféré dans une cuvette d'électroporation de 0,2 ml, et la
cuvette mise dans le support assurant le contact avec les
électrodes. Les cellules étaient électroporées avec un p u l s e
-29-
durant 4-5 msec. Irnm6diatement aprés, la cuvette était enlevée
et 1 ml de milieu SOC (2% Bacto Twtone, 0,5% Bacto Yeast
Extract, 10 rnM NaCl, 2,s mM KC1, 10 mM MgC12, 10 mM MgS04, 2 0
mM Glucose) était ajouté aux cellules. La culture était incubée
à 37°C pendant î heure et déposée sur du milieu LB-amp solide.
11.5.3. Transformation des bactéries par la
méthode de CaC12
Un volume de milieu LB (100-200 ml) était incubé avec
1/100 de volume de culture de nuit et incubé à 37°C jusqu'à
1 ' absorbance ABS60 O = O, 5 Ensuite, les cellules étaient
centrifugées à 4OC, et rendues compétentes par l'ajout de 1/10
de volume de CaC12 (50 mM) froid suivi d'une incubation sur la
glace pendant 1 heure. Les cellules étaient recueillies par
centrifugation à 4OC, suspendues dans 1/100 de volume de CaC12
(50 mM) et gardées sur la glace. À la fin de la transformation,
100 pl de cellules étaient mélangés avec 5 p1 de ADN et gardés
sur la glace pendant 1 heure. Pour augmenter l'efficacité de la
transformation, les cellules étaient soumises au choc
thermique, voire à une incubation pendant 5 min. à 37OC (ou
pendant 20 s à 42OC). Ensuite, 400 pl du milieu LB étaient
ajoutés aux cellules et la culture était incubée avec
l'agitation à 37OC pendant 1 heure. Finalement, la culture
était déposée sur une borte de Pétri contenant du milieu LB-amp
solide et celle-ci était incubée à 37OC jusqu'à 1 'apparition
des colonies.
II 6 Sélection des transformants de
S. cerevisiae
L e s milieux de sélection des transformants étaient: le
milieu -ura (0,67% Yeast nitrogen base w / o a - a . , 2% glucose
complété avec 720 mgIl du mélange d'acides aminés sans
uracile), le milieu -ura avec 1,5 M NaCl et le milieu -ura avec
1,5 mg/ml caféine. Les transformants de S. cerevisiae, obtenus
sur un milieu solide -ura, à la suite de la transformation des
cellules p f y l A avec la banque génomique, étaient testés pour la
croissance sur les milieux -ura contenant 1,5 M NaCl et sur du
milieu -ura contenant 1.5 m g / r n l de caféine. Le NaCl contenu
dans le milieu - u r a avec 1,5 M NaCl, était stérilisé
séparément. Pour tester la croissance des transformants sur des
milieux avec du NaCl et de la caféine, les répliques des boîtes
de Pétri contenant les colonies des transformants sur du milieu
-ura étaient faites sur des milieux avec du NaCl et de la
caféine. Ensuite, les boPtes étaient incubées à 30°C jusqu'à
l'apparition des colonies.
11.7. Récupération des plasmides de cellules de
S. cerevisiae
L'ADN total (génomique plus plasmidique) de S. cerevisiae
était préparé et utilisé pour transformer les cellules
compétentes d8E.coli. Les dilutions 1:10, 1:20, 1:30 et 1:40
d'ADN total ont été préparées et 1 pl de chaque dilution était
utilisé pour transformer 100 pl de cellules compétentes. Les
cellules transformées étaient incubées sur du milieu LB solide
à 37OC pendant 16-24 heures. De chaque clone obtenu, une
culture liquide en milieu LB était préparée et l'ADN plasmique
était récupéré en utilisant la méthode de maxipréparations.
11.8. Séquençage
L'ADN plasmidique de cellules de S. cerevisiae
transformées avec la banque, a été récupéré (voir II, 7, ) et
purifié par la méthode de maxipréparations (voir II. 3 . 2 . ) . L'ADN plasmidique obtenu a été séquencé. Le séquençage a été
fait avec la méthode de didésoxynucléotides e t fourni par le
service de séquençage de l'université Laval. Les amorces
utilisées pour séquencer les plasmides étaient : amorce
YEp24.anti (ATGCCGGCCACGATGCGTCC) et amorce YB 108 située dans
la région du site SmaI du plasmide YEp24. Les séquences
obtenues du séquençage constituaient les deux bouts de la
séquence génomique clonée dans le plasmide en question. Elles
ont été comparées avec la séquence génoznique publiée de
S. cerevisiae en utilisant le progrme BLAST (http://genome-
www2.stariford.edu/cgi-bin/SGD/nph-blast2). La concordance de la
séquence entière retrouvée dans le plasmide avec la séquence
publiée a été vérifiée par une série de digestions avec des
endonuciéases de restriction.
II. 9 . Clonage
Les constructions étaient préparées par la digestion des
plasmides avec des endonucléases de restriction appropriées et
les ligations effectuées en utilisant la T4 Ligase (BRL Gibco),
selon les techniques standards en biologie moléculaire.
O . Courbes de croissance
Pour tester la croissance des souches, les cellules de
levures S. cerevisiae étaient incubées à 30°C et à 37OC. Les
cellules d'une culture de nuit étaient comptées et 2x106 des
cellules étaient inoculées dans 30 ml de milieu YPD. Après 3
heures d'incubation à 30°C, la culture était divisée en deux,
une moitié étant incubée à 30°C, l'autre moitié à 37'~ pendant
16 heures. Ensuite, les échantillons étaient pris et les
cellules comptées à chaque heure, pendant 8 heures. Le
diagramme était effectué en utilisant le logiciel Excel
version IV.
11.11. Test de zone
Trois millilitres de milieu YPD (1% yeast extract,
2% peptone, 2% glucose, 1,7% agar) en 6tat liquide (-40°C)
étaient mélangés avec trois millilitres de culture de nuit des
cellules de S. cerevisiae AWM4, Le mélange était déposé sur une
boîte de Pétri contenant du milieu YPD solide (1% yeast
extract, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar). La boîte était
laissée pour que l'agar se solidifie; ensuite, 2x106 des
cellules à tester contenues dans 10 pl d'eau étaient déposées
sur la surface de la boîte, La boîte était incubée à 30°C
pendant 16 heures.
11,12, Coloration des cellules de S. cerevisiae à
la ghalloïdine
La coloration des cellules de S. cerevisiae à la
phalloïdine était effectuée selon la méthode d'Adams et Pringle
(1991)
Les cellules d'une culture exponentielle étaient fixées
avec 1/10 de volume de formaldéhyde, qui était ajouté
directement dans le milieu de culture, d près 30 min,, les
cellules étaient centrifugées et lavées 3 fois avec du PBS
(O,8% N a C l , O,02% KC1, O,092% NasHPO4, KH2POq) et
suspendues dans 1 ml de PBS. Cent microlitres de cellules
étaient colorés avec 50 pl de FITC-Phalloïdine (3,3 mM dans
méthanol) pendant 90 min. 2 heures, dans le noir, à la
température de la pièce. Ensuite, les cellules étaient lavées
4-5 fois avec du PBS et suspendues dans du milieu de montage
contenant de 1 ' antifade (DABCO ou P P D ) . Trois microlitres étaient étalés s u une lame traitée à la polylysine,
Préparation du DABCO: pour 10 m l : 9 mi glycérol; 1 ml PBS
0,01 M pH 8,6; 0,25 g DABCO. Dissoudre DABCO dans le glycérol
(sans PBS) , Chauffer légèrement dans un bain-marie pour bien
dissoudre.
Pr6paration d'une lame traitée à la Poly-L-Lysyne (Sigma):
Préparer une dilution 1 : 10 de la Poly-L-Lysyne (O, l%, ) dans de
l'eau déicnis4e. Tremper la lame dans la solution pendant 5
m i n . Égoutter et sécher dans le four à 60°C pendant une heure
ou à la température de la pièce (18-26'C) pendant une nuit.
III.1. Transforxnation de cellules g f y l A et choix
de milieux de sélection
Les cellules de la levure S. cerevisiae dont le gène de
profiline était délété, p f y l d , étaient transformées avec une
banque génomique. La banque était composée des plasmides
multicopies, YEp24, contenant les fragments génomiques de 10 -
15 kb. Les cellules transformées étaient incubées sur du milieu
-ura à 30°C jusqu'à l'apparition des colonies; ensuite, les
répliques sur un milieu de sélection (minimal -ura contenant
1,25 M NaCI) étaient effectuées.
Pour choisir le milieu de sélection, la croissance des
cellules sauvages, 6A ( P F Y I ) , et des cellules mutantes, HO55
( p f y l d ) , était vérifiée sur des milieux minimaux sans uracile
(-ura) contenant 1 M NaCl; 1,25 M NaCl et 1,s M NaCl. Les
cellules 6A et HO55 portent une mutation dans le gène d'uracile
(ura3-52 ) qui rend leur croissance sur un milieu minimal sans
uracile impossible. Pour surmonter cet obstacle, les cellules
étaient précédemment transformées avec le plasmide pVT102U
contenant le gène d'uracile (URA3).
Les cellules sauvages, PFYI, étaient capables de croître
sur un milieu contenant 1,5 M NaCl, tandis que la croissznce
des cellules mutantes, p f y l d , était déjà gravement compromise
sur 1,25 M NaCl, En conséquence, la concentration de 1,5 M NaCl
a été choisie pour faire la sélection. Malheureusement, cette
concentration s'est avérée trop stringeante (on n'a obtenu que
quatre transforrnants), alors la sélection a été effectuée sur
1,25 M NaCl et ensuite chacun des clones obtenus a été testé
pour la croissance sur 1,5 M NaCl. Uniquement les clones qui
ont été capables de croître en présence de 1,5 M NaCl étaient
considérés. Par la suite, la croissance de tous les plasmides
recombinants issus de sous-clonage a &té vérifiée sur 1,5 M
NaCl.
PFYl PFYl
PFYl PFYl
Figure 6 . Croissance des souches P F Y ~ et p f y l A .
La souche sauvage, PFYI, et la souche mutante, p f y l d , ont été
striées sur les mêmes boîtes et leur croissance a été vérifiée
sur le milieu minimal sans uracile (no 1) , et sur milieu minimal sans uracile en présence de 1 M NaCl (no 2 ) , 1,25 M NaCl (no 3) et 1,s M NaCl (no 4) .
-3 8-
111.2. Sélection des transformant8
Les répliques sur un milieu avec 1,25 M NaCl ont donné
110 transformants capables de croître dans les conditions
d'osmolarité accrue, ~nsuite, les 110 transformants étaient
testés pour la croissance sur un milieu contenant 1,5 M NaCl,
Il y en avait 53 capables de croître dans ces conditions et ils
ont été retenus pour la suite de la recherche, Pour regrouper
ces clones de façon sommaire, leur croissance était vérifiée à
37OC, sur un milieu contenant de la caféine (1,5 mg/ml) et le
test de zone était effectué pour chacun d'eux. Le tableau 4
montre les résultats. Etant donné la sensibilité des cellules
p f y l A à la caféine, elle était choisie comme deuxième cri tére
de sélection des transformants. Le choix de la concentration de
la caféine était effectué de façon analogue au choix de la
concentration du NaCl,
La croissance sur 1,5 M NaCl variait d'un transformant à
l'autre (désignée +, ++ ou +++). Deux transformants (8 et 62)
étaient incapables de faire une zone; ils n'étaient plus
considérés par la suite. Trente-cinq transformants ont crû
uniquement sur un milieu avec 1,s M NaC1 et seize
transformants étaient aussi capables de croître sur un milieu
contenant 1,5 mg/ml de caféine. Pour vérifier la croissance à
370Cr les transformants étaient mis en cultures liquides. Les
cellules étaient comptées et les cultures étaient incubées à
37OC pendant 48 heures. Après ce temps-là, les cellules étaient
comptées de nouveau. D'aprés les chiffres obtenus, l'indice de
croissance, montrant combien de fois les cellules se sont
multipliées, était calculé. Le comptage nr était fait qu ' une
fois, pour permettre le regroupement sommaire de tous les
transformants en six groupes. parmi ces trazisforïnants, les
seize qui croissaient sur des milieux contenant de la caféine
et du NaCl, étaient pris en considération par la suite. Les
plasmides des souches MEH54 et MEH68 n'étaient pas récupérés
(Tableau 5 ) .
Souche croissance à 37OC 1,5 m g f m l
caféine
MEH 11 7,5 + MEH 14 3,4 + MEH 23 7,O + MEX 30 2,8 - MEH: 41 MEH 48 14,5 - MEH 49 5,9 - MEH 50 2,1 - MEH 52 23,8 -
MEH 63 4,9 MEH 64
Croissance
Tableau 4. Transformants sélectionnés sur 1,25 M NaCI.
Nous avons sélectionné, sur 1,25 M NaCl, 110 transformants dont
53 ont été capables de croître sur 1,5 M
Ceux-ci ont été testés pour la croissance
1,s m g / r n l caféine. Étant donné que leur
NaC1 différait d'un transformant à 1'
comparée avec la croissance de la souche
NaCl (souches MEHX) . à 37OC, ainsi que sur
croissance sur 1,5 M
autre, nous l'avons
sauvage, P F Y I , et de
la souche mutante, p f y l d . Le test de zone a été egalernent
effectué
L'indice de croissance montre le nombre de fois que les souches
se sont multipliées pendant 48 heures à 37OC.
Les "+ " utilisés pour démontrer la croissance
NaCl:"+" = faible, "++" = bonne, "+++" = très bonne,
de croissance.
sur 1,5 M II - Il = pas
Indice de croissance à 37OC
croissance1 Test S u r
Croissance S u r
1 - 5 M NaC1 Souche
-
MEH 67 1 2 , 3
MEH 72 2 , o MEH 76 13,3
Tableau 4. (suite)
Indice de
croissance à
37Oc
Caféine " - "
MEH
MEH
MEH 4,
MEH 14,
MEH
MEH
m H
MEH
MEH
MEH
MEH
MEH 50,
MEH 67,
MEH 80,
MEH 84,
MEH 94,
MEH 107,
MEH 55,
MEH 72,
MEH 81,
MEH 89,
MEH 96,
M E € 108,
MEH 1, MEH 11,
M'EH 23, MEH 63,
MEH 66, MEH 68,
MEH 78, MEK 79,
MEH 106
MEH 6 MEH 4 9 , MEH 87,
MEH 90, MEH 92, MEH 9 5 ,
MEX 100, MEH 103, MEH 110
MEH 2, MEH 54 MEH 41,MEH 48, MEH 52,
MEH 65,MEH 69, MEH 70,
MEH 76
Tableau 5 . Regroupement des souches. Les souches capables de croître sur 1,5 M NaCl ont été
regroupées selon leur croissance sur 1,5 mg/ml caféine et à
37OC. L'indice de croissance indique combien de fois les
cellules se sont multipliées dans le milieu YPD liquide à 37°C
pendant 48 heures.
IIX.3. Identification et séquençage des
plasmides.
L ' ~ N total des transformants était pr6paré et utilisé
pour transformer les cellules compétentes XLI-blue dtE.coli.
Les clones obtenus étaient vérifiés pour la présence des
plasmides. Les ADN plasmidiques, obtenus par la méthode de
minipréparations, étaient digérés avec l'endonucléase EcoRI.
Les digestions ont été mises sur le gel d'agarose (1%) et
migraient sous tension de 100 V en présence d'un marqueur de
poids moléculaire (FX174/HaeI11 et k/~ind111) .
Pour visualiser l'ADN sur gel, celui-ci était coloré avec
le bromure d' éthidium. Une digestion EcoRI du plasmide YEp24
sauvage donne deux bandes: une de 2,2 kb et une de 5,5 kb. La
présence dans les échantillons de la bande de 2241 paires de
bases confirmait qu'il s'agissait de plasmide YEp24, et celle
de plusieurs autres que la bande de 5,5 kb, confirmait que le
plasmide était recombinant (figure 7 ) .
Ensuite, 1 'ADN plasmidique était extrait et séquencé en
utilisant l'amorce YEp24.anti ATGCCGGCCACGATGCGTCC et l'amorce
YB 108 située dans la région du site S m a I du plasmide YEp24
(figure 8). Les séquences obtenues, (figures 9 et 10) ont été
comparées avec la séquence publiée du génome de S. cerevisiae
en utilisant le programme BLAST. Cette comparaison a permis
d'identifier la séquence entière clonée dans le plasmide en
question. Une série de digestions avec des endonucléases a &té
effectuée pour confirmer la concordance du fragment retrouvé
dans le plasmide avec la séquence publiée.
La figure Il montre les séquences génomiques contenues
dans les plasmides et révélées par cette méthode, Pour les
plasmides retrouvés plusieurs fois, la région montrée est
commune et contient le gène responsable de la correction.
Figure 7 . Digestion des plasmides recombinants.
Les plasmides recombinants et le plasmide -24 ont été digerés
avec l'enzyme EcoRI. Les échantillons ont été déposés sur un
gel d'agarose (1% p/v) en présence de marqueurs de poids
moléculaires. Les puits représentent respectivement:
puit 1 - marqueur - @XI74 digéré avec HaeIII et h digéré avec
puits 2-6 - les plasmides recombinants digérés avec Eco=
puit 7- le plasmide -24 digéré avec Eco=
4 6 -
Figure 8. Caractérisation des fragments d'ADN génomique de
S. cerevisiae présents dans les plasmides recombinants.
Les plasmides recombinants, contenant des gènes suppresseurs,
ont été séquencés. Les deux bouts du fragment cloné ont été
séquencés en utilisant les amorces YEp24 et YB108 (-) .
Les séquences obtenues comprenaient quelques nucléotides
provenant du plasmide, et une partie de la séquence génomique
clonée ( 1 - En utilisant le programme BLAST, ces
séquences ont été cornparees avec la séquence du génome de S.
cerevisiae (la barre pleine), ce qui a permis de connaître
l'identité des gènes sur le fragment.
YEp 24
CCGTCCCGTGGATCAGATGCGAGAGCTCGAAG~T~GTATUTACT~CGTTTUCA
TAGTAATTAGGTAAAAAATGACTCGCETTCCGT'I"r?:AGCTGATGCTTTGAATGCCATTAATA
ACGCCGAAAAGACCGGTAAACGTCAGGTTCTATTGAGACCTTCTTCW~WATCATWGT
TTTTACAAGmA~GCATGGTATGTTCCAACTATTTTTCAATATTTTCALATGTGTTT
C A A T T T C T G C T T A T T T T T A A A T G T C T C T
AACG'"G~TAATTA'rrGCCATTGTTTTTTACTCCGGGCTGATAACTAGATGGTGTGATcGG
GCAGTATACT~TTTATACTGGACAAAGACTCGTAAAAGATGTTCTTTGTGCTTAGTCCCATA
CTGTTTTTTAAGTGTCCGGGATATTTAATCCCATGTGGAAATGCTTCTTACACGGTTATGGAT
TACACCTCATGTGTAGCTACTATATATCn'rYrACCGWACTTTTCCTCAAAATCTCACTCTTAA
AATTTTCAATGGCAAAATTCTTCCGcaCAACTTAGACAACATTTTCTTGT~ATGAAGTA
AGCAAAAATTTCGAATCAACAACGCTCCATGAGATTCTTCAATACTAACATTTACTCCTTATT
TAGGTTACATTGGCGAATTCGAATACATTGACGACCACAGATCTGGTAAGATTGTCCTCCAAC
TGAACGGT
Figure 9. Séquence du plasmide pMEH2.
La séquence obtenue de séquençage du plasmide pMEH2 en
utilisant l'amorce YB 108. La première partie de la séquence,
en caractère gras, provient du plasmide
constitue l'insert (l'ADN ghomique cloné
, la partie qui suit dans le plasmide).
Figure 10 . Séquence du plasmide pMM2.
La séquence de l'ADN génornique obtenue de séquençage du
p l a s m i d e pMEH2 en utilisant l'amorce YEp24.anti.
pMEH 1 PMEH 3 PMEH 4 pMEH 7 PMEH Il pMEH 23
DMEH 66 pMEH 79
TEF4 CIMA5 ÇMY 1 YKL078W YKL077W DMEH 63 pMEH 106
YKLai82C Y K L ~ ? ~ C Y KL075C
Figure 11. Plasmides récupérgs des transformants capables de croître en présence de NaCl et en présence de caféine.
Représentation schématique des cartes physiques montrant des
f ragmens d'ADN cloné. Les gènes (p. ex. :MID2 ) et Les cadres
ouverts de lecture (p. ex. : YLR33 1C) répresentés par les
rectangles pleins.
Pour les plasmides retrouvés plusieurs fois (p - ex- :pMEHI , 3 , 4,
7, 11 et 23), la région montrée est cornune et contient le gène
responsable de la correction.
La barre représente une kilopaire de bases-
pMEH 2
HSL1
pMEH 78 YKLl05C GFA1 LAP4 YKLi02C
UPF3 SMDi
pMEH 102 YCR071C YCR073C PEH8
PRP38 MRPL25
pMEH 14
Figure 11 (suite)
111.4. Identification des gènes
Pour identifier les gènes responsables de la correction de
délétion du gène de la profiline, les plasmides étaient digérés
avec des enzymes appropriées, de façon permettant de faire des
délétions dans les inserts contenus dans les plasmides. Les
plasmides recombinants obtenus de cette façon étaient utilisés
pour transformer les cellules p f y l A de S. cerevisiae. Les
clones obtenus à la suite de cette transformation étaient
vérifiés pour la croissance sur 1,5 M NaCl et 1,5 mg/ml
caféine, ~usqu'à maintenant, ce procédé a permis d'identifier
trois gènes, pemettant à une cellule de S. cerevisiae délétée
dans le gène de la profiline de croître en présence du NaCl et
de la caféine, ainsi qu'à 37OC. Ces gènes sont: M m , YCR030C
et R O M 2
1 Gène ROM2
Notre recherche plus approfondie était consacrée à un des
plasmides, pMEH2, contenant cinq gènes. Le fragment génomique
cloné dans ce plasmide provenait du chromosome XII de
S. cerevisiae. Pour identifier le gène permettant la
suppression de la délétion de la profiline, une série de
délétions a été pratiquée. L e s quatre plasmides recombinants
obtenus étaient utilisés pour la transformation des cellules
pfyld . La figure 12 présente la région génomique clonée dans ce
plasmide. la carte d' enzymes utilisées pour effectuer les
délétions, ainsi que les plasmides recombinants obtenus-
Parmi les quatre plasmides recombinants. uniquement le
plasmide pMEH2ABglII a corrigé la délétion de la profiline
pemettant aux cellules p f y l A de levure de cro4tre en présence
de NaCl et de caféine. Aussi, la croissance à 37OC était-elle
possible.
Le plasmide pMM2mglII contient trois gènes : ARC18, ROM&
Sm4. Étant donné le fait que ni le plasmide pMEH2hBglïïAPvuïI.
contenant uniquement le gène A R C l 8 , ni le plasmide pMEH2ASacI.
contenant le gène SURI, n'étaient capables de permettre aux
cellules p f y l A de croître en présence de la caféine, en
présence du NaCl ou à 37"C, tout semble désigner le gène ROM2
comme le seul permettant la correction des cellules p f y l A dans
les conditions mentionnées. Finalement, un fragment HindIII de
6 kb. contenant les gènes ROM2 et ARC18 était sous-cloné daris
un site HindIII d'un plasmide rnulticopie, pRS426, et ce
plasmide recombinant était utilisé pour transformer les
cellules p f y l d (Figure 13) . Les cellules p f y l d contenant le
plasmide pRS42 6ROMZ ktaient soumises aux mêmes tests : la
vérification de croissance sur 1,5 M NaCl, sur 1,5 mg/ml
caféine. à 37OC et la formation d'une zone. Les résultats
obtenus étaient les mêmes que dans le cas des cellules p f y l d
contenant le plasmide p~ÎhBgl11, ce qui confirme le rôle du
gène ROM2 en tant que suppresseur de la délétion de la
profiline. Toutefois, il faut mentionner que les résultats
montrés ont été obtenus avec les cellules pfylA/pMEH2ABgl11
(Figure 14) -
Figure 12. Carte de restriction et plasmides recombinants
obtenus grâce aux délétions du plasmide pMEH2.
L e s
des
les
gènes et les cadres de lecture ouverts sont représentés par
rectangles pleins. Les deux traits parallèles présents dans
plasmides pMEH2AKpn1, p ~ E H 2 A s a CI,
pMEH2ABglIIAPvuII montrent les endroits où
été effectuées-
La barre représente une kilopaire de bases.
pMEH2ABglII et
les délétions ont
pMEH 2 ~ ~ 2 3 6 8 ~ RPS24B YLR369W ROP12 SUR4 5 = 3' - -
ARC18 YLR3753C
pMEH 2 AIYj>nl
pMEH 2 A Bglll S N R ~ ~ SUR4
"'si 3'
SHR44 pMEH 2 A@ll A FWll
- 5 '
Figure
Kpnl. Xhol. Sall. Hind Ill. ./--
ROM 2
Le fragment HindIII de 6 kb. provenant du plasmide p-2, a été
sous-cloné dans le site HindIII du plasmide multicopie pRS426.
Ce fragment contenait les gènes ROM2, ARC18 et une portion du
cadre de lecture ouvert YLR369W.
-58-
Figure 14. Croissance des souches recombinantes.
Nous avons comparé la croissance de cellules sauvages, P m , et
de cellules mutantes, p f y l d , avec celle de trois de nos
transfomants. Chaque boete de Pétri a été divisé en cinq
parties, et les cellules sauvages et mutantes ainsi que les
cellules mutantes contenant le gène ROM2, le gène ARC18 et le
gène SUR4 ont été striées sur un milieu minimal sans uracile
(-ura) (1) et en présence de 1,5 M NaCl (2) et 1,5 mg/ml
caféine (3 ) . -59-
11L4A.l. Morphologie des transformant s
contenant le gène ROM2.
Les cellules de S. cerevisiae sont petites et légèrement
allongées. Elles possèdent tou j ours un seul bourgeon. Les
cellules dépourvues de la profiline, pfyld, sont beaucoup plus
grandes, elles perdent leur forme allongée pour devenir rondes,
et souvent possèdent deux bourgeons à la fois. La
transformation des cellules p f y l d avec le plasmide pMEH2ABglII
contenant le gène ROM2 a permis de restaurer la morphologie
normale à ces cellules. L'observation au microscope en
contraste des phases a permis de constater les changements
apportés par le gène Rom. Les cellules pfylA/pMMZABglII sont
plus petites que les cellules mutantes tout en restant
légèrement plus grandes que les cellules sauvages; elles
retrouvent leur forme en devenant légèrement allongées et ne
possèdent qu'un seul bourgeon (Figure 15) .
B ~ Y ~ A
Figure 15 . Morphologie des cellules.
Les cellules sauvages, PFYI, les cellules mutantes, p f y l d ,
les cellules mutantes contenant le gène Rom, (le plasmide
pMEH2UglII) pfylA/RO&Q ont été observées en contraste de
phases.
1 1 4 . . 2 Test de zone pour les transfsrmants
contenant la gène R0iY2.
Les cellules sauvages PFYI, les cellules mutantes pfy ld ,
et les cellules mutantes contenant le plasmide p M E H 2 m g l f 1
(~~''~A-~MEHSAB~~II), étaient testées pour la sécrétion de la
phéromone a (facteur 01) mature. En présence du facteur a, les
cellules du type sexuel MATa s ' arrêtent en phase G1 du cycle
cellulaire, mais après un certain temps, le cycle reprend, et
les cellules sont à nouveau capables de se diviser (Jackson et
al., 1991). La souche tester utilisée (AWM 4) est de type
sexuel MATa. Elle porte une mutation, s s t l A , qui la rend
incapable de dégrader la phéromone a, sécrétée par les
cellules testées, et l'empêche de reprendre le cycle cellulaire
(Sprague et Herskowitz, 1981; Chan et Otte, 1982 a; Chan et
O t t e , 1982 b) . En résultat, l'arrêt de croissance de ces cellules cause l'apparition d'une zone claire autour des
cellules testées. Les cellules de type sexuel MAZU, sécrétant
le facteur a mature, sont alors capables d'inhiber la
croissance des cellules MATa - s s t l A . Ce fait est utilisé pour
tester la sécrétion du facteur a mature par les cellules
portant diverses mutations. Les cellules testées sont déposées
sur un milieu solide contenant la souche tester (MATa -
sstlA). Si elles sécrètent du facteur mature, elles arrêtent
la croissance de la souche tester, ce qui donne en résultat une
zone claire entourant les cellules déposées. La dimension de
cette zone d4pend de la quantité de facteur a s&crété. Si le
facteur a n'est pas sécrété, ou il n'est pas mature, il n'y
aura pas d'inhibition de croissance de la souche tester et, en
conséquence, pas de zone-
Les cellules mutantes utilisées dans cette recherche,
p f y l A , ont un défaut de maturation de facteur a, ce qui les
rend incapables d'inhiber la croissance des cellules
MATa - s s t l A , et ainsi incapables de faire une zone ( M a r c o u x
et al., 1 9 9 8 ) . Parmi les cellules testés, les cellules p f y l d
n'ont pas donné de zone, les cellules PEYl et pfyld/pMEH2LIBglII
ont donné une zone. ou te fois, il faut mentionner que la zone
autour des cellules mutantes, pfylA/p~~2hBglII, était moindre
que celle donnée par les cellules sauvages, PFYZ (figure 16L
ce qui signifie que la présence du gène ROM2 dans les cellules
pfyZA permet d'augmenter la sécrétion du facteur a mature par
ces cellules.
Figure 16. Test de zone.
Les cellules sauvages, PFYl, les cellules mutantes, pfyld, et
les cellules mutantes transformées avec le gène R O M 2 , (le plasmide pMEH2 Bgl1I ) pfylA/ROM2, type sexuel NATa ont été
déposées sur un tapis de cellules AWMC, type sexuel MATa. Les
bîotes ont été incubées à 30 'C pendant 16 heures-
IST:,4,1,3, Croissance des transformants contenant
le gène ROM2 a 37OC.
La croissance des cellules sauvages, PFYI , des cellules
mutantes, pfylA, et des cellules mutantes contenant le gène
ROM2, pfylA/pMEHZABglII, était vérifié à 37O. À la temperature
permissive, 3 O°C, les cellules sauvages, PFYI, et les cellules
mutantes, p f y l d , poussent bien (Figure 17) . Cependant, à 37OC,
les cellules da la souche portant la délétion de la profiline,
p f y l d , ne poussent pas. La transformation de cette souche avec
le plasmide contenant le gène ROMS, a permis de restaurer sa
îxoissance à la température non - permissive, 37OC (Figure 18 ) .
Figure 17. Courbes de croissance à 30°C. La croissance de la souche sauvage, PFYl (I) et de la souche mutante, pfyld (O) à 30°C.
1 2 3 4 5 6 7 8 O
temps (H)
Figure 18. Courbes de croissance 37°C.
La croissance de la souche sauvage, PFYl ( ) de la souche mutante, pfy ld (O), et de la
souche mutante contenant le gène ROM2, (+) 37OC.
3 4
temps (H)
III.4.1.4. Répartition d'actine dans l e s
transformants contenant le gène R O M Z .
Dans la cellule normale, l'actine est présente sous forme
de cables, de longs filaments dans le cytoplasme, et sous forme
de plaquettes corticales, déposées sur la membrane cellulaire
aux endroits de croissance accrue (shmoo et bourgeon)
(Kilmartin et Adams, 1984; Adams et Pringle, 1984; Novick et
Botstein, 1985; Drubin et al., 1988) - Dans la cellule dépourvue de profiline, les câbles d'actine sont absents et les
plaquettes corticales sont déposées uniformément sur toute la
surface de la cellule-mère et du bourgeon (Haarer et al. ,
1990) . La coloration des cellules de S. cerevisiae avec la FITC-phalloïdine permet de visualiser l'emplacement des
plaquettes corticales d'actine (Adams et Pringle, 1984) . La
coloration des cellules mutantes, p f y l d , contenant le gène
ROM2, a montré une amélioration de la répartition de plaquettes
d'actine dans ces cellules. La correction n'est pas parfaite et
varie d'une cellule à l'autre; toutefois, dans plusieurs
cellules, les plaquettes d'actine étaient déposées
maj oritairernent dans
corticale déposée dans
19).
le bourgeon et la quantité d'actine
la cellule-mère était minimale (Figure
Figure 19 . Coloration des plaquettes corticales d' actine .
Les plaquettes corticales d'actine dans les cellules sauvages,
P m l , dans les cellules mutantes, pfy ld , et dans les cellules
mutantes trans f ornées avec le gène RO- (plasmide pMEH2 Bq111 )
ont été colorées à la FITC-phalloïdine. Les cellules ont été
observées en épifluorescence.
III. 5 . ~ransf ormation des cellules pfyld avec
les gènes RaOl et RB02.
Étant donné que les produits de deux gènes de la famille
Rho (RH01 et RH02) sont activés directement par RomZp, ces
gènes ont été utilisés pour transformer les cellules p f y l d . Les
cellules pfy ld étaient transformées séparément avec les gènes
RHûZ et RH02 clonés dans des plasmides multicopies. La présence
du gène RH02 a corrigé la délétion de la profiline dans les
cellules p f y l d en permettant leur croissance sur un milieu
contenant 1,5 M NaCl et en présence de 1,5 mg/ml caféine. Par
contre, la surexpression du gène R X O l dans les cellules p f y l A
n'a pas apporté de correction des phénotypes associés à la
délétion de la prafiline.
IV. DISCUSSION
IV. 1. Les suppresseurs multicopies de la délation
du gène de la profiline.
En nous servant de la caféine et du NaCl en tant que
critères de sélection, nous avons isolé 54 suppresseurs
multicopies de la délétion du gène de la profiline dont deux,
MID2 et ROM2, ont été investigués en détail. Jusqulà présent,
le gène MID2 était isolé sur du milieu contenant de la caféine
(concentration finale 1,5 mg/ml) (Marcoux et al., 1 9 9 8 ) . 11
était aussi retrouvé sur du milieu contenant 1,s M NaCl. Le
gène ROM2 (ce travail) était isolé sur du milieu contenant 1,5
M NaCl. La surexpression de ces gènes permet de corriger des
phénotypes retrouvés dans les cellules pfy ld : l'impossibilité
de croissance à 37OC, la sécrétion du facteur a immature, la
délocalisation des plaquettes corticales d'actine. Les cellules
p f y l A surexprimant le gène MID2 ou ROM2 ont aussi retrouvé leur
résistance à la caféine et au NaCl-
La caféine est un inhibiteur de phosphodiestérase de
I'AMPc (Parsons et al., 1988). L'AMPc est une molécule
impliquée dans la voie de transduction des signaux de PKAI . Plusieurs gènes, impliqués dans la régulation de la croissance
et dans la voie de signalisation de P K C I , lorsque mutés,
causent la sensibilité des cellules à la caféine (Costigan et
al., 1992; Paravicini et al., 1992; Ram et al., 1995; Lussier
et al., 1997). C'est aussi le cas des cellules pfy ld .
Le NaCl est un agent osmoactif; son addition au milieu de
croissance augmente l'osmolarité du milieu. Une des façons dont
une cellule sauvage de S. cerevisiae répond à l'augmentation de
l'osmolarité du milieu est le remaniement de son cytosquelette,
qui subit de rapides et réversibles changements dans
l'organisation des filaments d'actine (Chowdhury et al., 1992).
Dans un premier temps, l'actine filamenteuse est rapidement
dépolymérisée, ce qui cause la disparition des câbles d'actine,
pour être ensuite repolymérisée de façon à permettre la mise en
place de "nouveaux" cytosquelettes d' actine (Yeh et Haarer,
1996). Cette réponse n'est pas possible dans les cellules p f y l d
où 1 ' on observe la dépolymérisation des filaments d' actine . Mais la repolymérisation en l'absence de la profiline étant
impossible, les cellules ne peuvent pas restaurer leur
cytosquelette et, en conséquence, elles ne poussent pas en
présence du NaCl. La transformation des cellules p f y l A avec le
gène MIR2 (Marco- et al., 1998) ou ROM2 (ce travail) leur
permet de retrouver la résistance à la caféine et de remodeler
le cytosquelette d'actine en r4ponse au stress osmotique.
Les cellules p f y l d démontrent un défaut dans la
polarisation d'actine. Des plaquettes corticales d'actine
(actin patches) sont déposées uniformément à la surface de la
cellule-mère et du bourgeon au lieu d'être concentrées dans le
bourgeon, comme c'est le cas dans les cellules sauvages. La
surexpression de MID2 ou de ROM2 dans les cellules p f y l A a
corrigé ce défaut, puisque la coloration des plaquettes
corticales d'actine avec la FITC-phalloïdine a démontré que,
dans les cellules transformées avec un de ces gènes, celles-ci
sont déposées de façon correcte dans le bourgeon.
IV, 1. Le gène MID2
Le MID2 est un gène encodant une protéine membranaire et
il était identifié en tant que suppresseur multicopie de
mutations: c i k l A et k a r 3 A (Manning et al., 1997) , Sa
surexpression supprime des défauts associés à la surexpression
de TPKI , qui est un régulateur négatif de la protéine kinase A,
PKAl (Daniel, 1993). Dernièrement, MID2 a été identifié comme
un suppresseur multicopie de la délétion du gène de la
profiline, p f y l d (Marcoux et al., 1998) . MID2 semble être impliqué dans l'activation du start après un arrêt en G1 car
les mutants m i d 2 A meurent après une exposition aux phéromones
(Ono et al. , 1994) . La surexpression de Mid2p a corrigé les
phénotypes de p f y l d , mais le mécanisme de cette correction
reste à expliquer. Il est possiblement lié à l'implication de
la profiline dans la signalisation cellulaire, étant donné la
participation de Pfylp dans la voie de signalisation de P m et
sa liaison au complexe d'adenylate cyclase.
IV. 1. Le gène ROM2
Le gène ROM2 code pour une protéine de 1356 acides aminés
qui possède deux domaines connus : DH et PH (Ozaki et al, ,
1996) . Le domaine DH (Dbl homologous) est responsable de l'activité GEF (GDP/GTP Exchange Factor) permettant l'échange
de GDP pour GTP sur des protéines cibles- Ce domaine a été
retrouve dans plusieurs protéines fonctionnant en tant que GEF
pour des membres de la famille Ras dont cinq agissent aussi
comme GEF pour des protéines de la famille Rho. Il s'agit de:
Cdc24 (Zheng et al., 1994), D b l ( H a r t et al-, 1991; Yaku et
al., 1994); Tiaml (Michiela et al., 1995), Ost (Horii et al.,
1994) et Lbc (Zheng et al. , 1995b) . Le deuxième domaine, PH (Pleckstrin homologous), est retrouvé dans plusieurs protéines
de signalisation et du cytosquelette (Musacchio et al., 1993;
Gibson et al., 1994). Ce domaine permet la liaison avec des
dérivés de phosphatidylinositol (~arlan et al., 1994) et aux
sous-unités bêta et gamma de la protéine G (Touhara et al.,
1994), et sa fonction implique aussi le transport aux membranes
des protéines contenant ce domaine. Ce rôle semble être en
accord avec la localisation de la protéine RomSp, qui est
retrouvée dans les plaquettes corticales, aux endroits où il y
la croissance polarisée (shmoo et bourgeon) et la formation de
nouvelle paroi (Manning et al., 1997) - L a protéine RonSp est une GEF pour deux GTPases, produits
des gènes RHOl et RNO2 (Ozaki et al., 1996, Manning et al.,
1997). Le gène RH01 code pour une rnol6cule de signalisation, de
la famille Rho, qui fait partie d'une cascade de signalisation
impliquée dans la production de la paroi cellulaire. C'est une
cascade des MAP kinases appel& aussi la voie de PKCl (protéine
kinase C) (Drgonova et al., 1996; Qadota et al., 1996).
Rholp se lie à GTP et étant donné que Rholp/GTP est iocaiis6 à
la membrane plasmique aux sites de sa croissance (Yamochi et
al., 1994), il est possible que ~om2p soit mobilisée aux mêmes
endroits pour activer Rholp.
L e gène RH02 code pour une autre protéine de la famille
Rho, RhoSp. Le rôle de cette protéine n'est pas connu. Sa
surexpression dans la cellule supprime certaines mutations tor2
(Helliwell et al., 1998), deux délétions touchant des gènes du
cytosquelette de tubuline: c i k l A et k a r 3 A ( M m i n g et al. ,
1997) et la délétion du gène de la profiline, p f y l A (ce
travail). A i n s i , la Rho2p peut être impliqué dans
l'organisation du cytosquelette dvactine et de tubuline. Étant
donné que la délétion de RH02 ne dome pas du phénotype (Cid et
al., 1995), il est difficie de faire des présomptions en ce qui
concerne des implications de cette protéine dans le
fonctionnement de la cellule.
Le gène ROM2 était identifié en tant que suppresseur
rnulticopie de plusieurs mutations chez S. cerevisiae.
La surexpression du ROM2 supprime deux mutations touchant des
protéines d'une même voie de signalisation: torl et rhol
(Schmidt et al., 1997, Ozaki et al., 1996) . ROM2 a été aussi
sélectionné en tant que suppresseur multicopie de deux
délétions touchant le cytosquelette de tubuline: c i k l A et k a r 3 A
(Manning et al., 1997). Les protéines Ciklp et Kar3p sont
impliquees dans la formation et le fonctionnement des
microtubules, dans la ségrégation des chromosomes et dans la
karyoganie (Meluh et Rose, 11990; Page et Snyder, 1992; Page et
al., 1994). Finalement, nous avons identifié ROM2 en tant que
suppresseur de pfyld-
Les phénotypes associés à la délétion du gène ROM2
concernent la croissance et la morphogénèse des cellules, et
prouvent aussi l'implication de la protéine Rorn2p dans le
fonctionnement du cytosquelette d'actine et de tubuline
(Manning et al., 1997). Les cellules rom2A sont sensibles aux
hautes et aux basses températures ( tempera ture-sensi tive e t
cold-sensi tive) . Elles forment un bourgeon très allongé, et
démontrent une hyperpolarisation d'actine qui est concentrée
dans le bout distal du bourgeon au lieu d'y être déposée de
façon uniforme. La formation de sM.00 pendant le croisement est
aussi affectée dans les cellules ronQA. Ces cellules deviennent
plus grosses que les cellules sauvages et elles forment un très
petit shmoo, ou n' en forment pas du tout. La sensibilité des
cellules r o d A au bénomyl confirme l'implication de la protéine
Rom2p dans la formation et le fonctionnement des microtubules-
Le bénornyl est un agent qui depolymérise les microtubules. Le
manque de croissance ou une croissance accrue en présence de
bériomyl est une caractéristique commune des souches qui portent
des mutations dans les gènes qui encodent des éléments
structuraux ou régulateurs des microtubules (Huffaker et al.,
1988; Hoyt et al., 1991; Pelhan et al., 1995; Saunders et al.,
1997) .
Figure 19. Modèle d'implication du gène ROM2 dans la
signalisation cellulaire.
Les gènes faisant part ie des cascades de signalisation sont en
italique, les facteurs d'échange des nucléotides (GTP e t GDP)
sont en caractère standard.
V. CONCLUSION
Le gène ROM2 a été identifié en tant que suppresseur
multicopie de la délétion du gène de la profiline chez
S. cerevisiae. Par sa fonction de GEF auprès de deux protéines
Rho (Rholp et Rho2p), Rom2p est impliquée dans la signalisation
cellulaire. La protéine Rholp active la voie de PKC responsable
de la production de la paroi cellulaire. Mais, puisque la
surexpression du N O 1 ne corrige pas des phénotypes de p f y Z A ,
ce n'est pas cette voie qui permettrait la correction des
défauts du cytosquelette.
Étant donné que la surexpression de ROM2 ou de RH02
supprime les délétions dans deux gènes qui encodent des
éléments des microtubules : c i k l A et kar3A (Manning et al.,
1997). grâce à son interaction avec la protéine Rhoap, Rom2p
est impliquee dans la formation et le fonctionnement du réseau
des microtubules- ROM2 est aussi impliqué dans la formation
et le fonctionnement du cytosquelette d 'actine, puisque sa
surexpression dans les cellules p f y l A a permis le remaniement
du cytosquelette dtactine en présence du NaCl et la correction
de la polarisation des plaquettes corticales dtactine pendant
la bourgeo~ement. Toutefois, il est difficile d'expliquer de
quelle façon ROM2 agit sur le cytosquelette d'actine. Une
possibilité serait sa fonction de GEF auprès de R H û l qui. à son
tour. agit sur les deux protéines qui se lient à la profiline:
Bnilp et B n r l p . Mais la transformation des cellules pfy ld avec
RH01 n'a pas corrigé ni la croissance sur NaCi ou sur caféine,
ni la délocalisation des plaquettes corticales dtactine. Par
contre, la transformation des cellules p f y l A avec RH02 a permis
de corriger ces phénotypes, malgré le fait que. pendant cette
recherche. RH02 n'a pas été sélectionné en tant que suppresseur
de p f y l d . La sélection peut être ici en cause. puisque les
cellules pfylA transformées avec le gène RH02 poussent bien sur
des milieux contenant 1.25 M NaCl et 1,25 mg/ml caféine, et
beaucoup moins bien en présence des concentrations plus
élevées. qui ont été employées pendant la sélection (1,5 M NaCl
et 1,5 rng/rnl caféine) . Alors. il existe une possibilité que ROM2 agisse par le
biais de RH02 pour corriger les dgfauts du réseau dtactine des
cellules pfyld. Toutefois. étant donné le peu d'informations
qu'on possède sur les fonctions de RH02, il est difficile de
l'affirmer. Une autre possibilité est une action via une autre
protéine de la fanille Rho, peut-être encore inconnue chez
S. cerevisiae.
La protéine Rho2p et son GEF, Roep, sont localisées dans
les cortical patches, déposés sur la membrane plasmique. Étant
donné que la protéine M i d 2 p est une protéine rnembranaire, on
pourrait envisager une possibilité d'interaction entre Rom.2~ et
Mid2p. La Mid2p étant déjà impliquée dans la signalisation
cellulaire (la voie de Pm), celle-ci peut aussi, à l'instar de
la profiline, être impliquée dans d'autres voies. Par exemple,
MID2 peut se trouver en amont du ROM2 dans la même cascade de
signalisation, mais son action sur le cytosquelette peut aussi
se faire par l'entremise d'autres facteurs (figure 20). Ces
trois protéines sont déjà connues en tant que suppresseurs
multicopies des mutations touchant le cytosquelette de la
tubuline ( c i k l A et k a r 3 A ) , ce qui semble suggérer leur
implication commune dans le même processus, et ce peut-être
aussi le cas pour la régulation de lractine dans la cellule.
tubuline actine
tubuline adine
Figure 2 0 . Modèle dl interaction des gènes dans la régulation
du cytosquelette.
Les gènes faisant partie des cascades sont en italique et les
protéines sur lequelles ils agissent sont en caractère
s tandard.
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