TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques

titre

TP 6

Dosage de la tyrosinase

et

influence des effecteurs

enzymatiques.

1.1

1. Contacts. 1.1. Contact 1.

Ron attend patiemment que passent les 18 minutes séparant l’envoie de son message à l’arrivée de la réponse. Enfin, lapetite voix enfantine résonne dans ses écouteurs.-- Papa, tout ce passe bien ?-- Oui, mon chou. Nous avons dépassé l’orbite de Mars. Nous avons effectués presque les deux tiers du trajet pour Jupiter.-- Tu as pu la voir ?-- Nous sommes passés à des millions de kilomètres. Par contre nous approchons de Vesta, dans la Ceinture interne. J’embarque dans le Héra dans quelques heures avec Ripley et John. Ripley est furieuse de ne pas avoir été désignée comme chef de l’expédition alors qu’elle est la plus gradée et la plus compétente. C’est John le chef !.-- Les journaux ont encore parlé d’elle et Eva. Tu crois qu’elles iront en prison pour détraqués sexuels? Elles sont comment ?-- Tu sais, depuis les réformes morales, les femmes sont séparées des hommes dans le vaisseau. Je ne les ai pas vues en six mois de voyage. Je vais faire la connaissance de Ripley au cours de cette mission. -- Mais toi, tu es un néo-templier, ta moralité est irréprochable.-- Les templiers n’ont pas un grand pouvoir dans la société moderne. Cela ne fait que quelques années que le pape à réhabilité l’ordre. Nous n’avons pas reconstitué l’organisation de l’époque ancienne. Nous ne pesons pas encore très lourd face aux Talibans-chrétiens. Quand je pense que la papauté, malgré ses réticences face à tout syncrétisme, avait donné son aval pour la création de ce mouvement religieux fusionnant Islam et christianisme. Rome pensait qu’il drainerait les musulmans occidentaux dans les rangs de l’église. Ca a été un mauvais calcul.-- Tu ne te sens pas trop seul, là-haut ?-- Le signal clignote ! Mon temps de communication est achevé. La prochaine fois que je t’appellerai, je serais revenu de Vesta.

1.2

1. Contacts. 1.1. Contact 1. 1.2. Contact 2.

Ripley a les yeux rivés sur l’écran de contrôle. Le point qu’était Vesta est devenu une tâche qui occupe la presque totalité de l’écran. Elle parviendrait même à oublier la présence de l’horripilant J.M. si celui-ci cessait ses remarques stériles. Encore un médiocre dont le titre de chef d’expédition a tourné la tête.-- Combien de temps avant contact ?-- 7 minutes ! C’est affiché dans ce cadran. Et maintenant pourrais-tu avoir l’amabilité de me laisser me concentrer ?-- Je n’aime pas ton ton, pilote ! C’est moi qui commande, ici ?.

-- Nous savons tous ici pourquoi toi, simple mécanicien, as été choisi à ma place. Alors maintenant, tais-toi !

Ripley manipule les commandes avec douceur. Les rétrofusées crachent leurs panaches de gaz dans le vide de l’espace. Le module s’incline.

-- Mise en orbite réussie ! Ron, tu peux envoyer la sonde.

Le géologue s’active sur l’écran tactile. Le petit appareil se détache de l’Hera et descend vers l’astéroïde. Ripley suit sa trajectoire sur son écran. Elle le voit se poser dans un tourbillon de poussière.

1.2

1. Contacts.

-- Contact !

Ripley se laisse aller en arrière contre le dossier de son siège. Cette grosse brute de Ron la prend dans ses bras et la comprime contre lui.-- Nous avons 48 heures pour effectuer les prélèvements. Ensuite retour au Junon.

1.2. Contact 2.

1.3

1. Contacts. 1.2. Contact 2.

Ripley sursaute. Une main s’est posé lourdement sur son épaule.-- Ron, je t’ai déjà demandé d’arrêter de faire ça. Je vais devenir cardiaque.-- Je croyais que c’était par dégoût des hommes, dit-il en riant.-- Quand on voit ta sale g... on doute que tu en sois un !-- C’est pas ma tête qu’il faut regarder pour le savoir. Mais je suis bête, tu ne sais pas à quoi ça ressemble.Ripley envoie violemment sa main dans son entre-jambe. Ron grimace sous la douleur.-- Je cherche, je cherche, mais je ne trouve rien !-- Je me rends. De nous deux, c’est toi le vrai mec !Tous deux se mettent à rire. Ripley passe sa main sur la joue de Ron.-- Je suis bien avec toi, Ron. Tu ne me juges pas. Tu me considères comme ton égale. Cela fait longtemps que je n’ai pas ressenti ça avec un homme. Quand nous retournerons sur le Junon, nous serons à nouveau séparés.-- Tu retrouveras Eva. Sa tronche vaut mieux que la mienne.-- Tu as le même cœur qu’elle. Tendre et immense comme l’univers.-- Fais gaffe, tu me fais une déclaration d’amour. Si J.M. entendait ça...-- Il serait jaloux tu veux dire ?L’appareil se met à bipper.-- Voici les premiers résultats des prélèvements.Elle siffle entre ses dents.-- Il faut appeler Angie !

1.3. Contact 3.

2

1. Contacts. 2. Situation des prélèvements. -- Comment ça va, ma belle, dit la voix dans le haut-parleur ?-- Bien, à part que je suis collée par une espèce d’ours qui sent la transpiration.-- Tu es dans ton élément, alors. Qu’est-ce que ça donne ces échantillons ?La sonde a rapporté 3 échantillons provenant de 3 zones de Vesta. Ce sont 3 formations géologiques très différentes.

L’échantillon A provient de la cheminée d’un ancien volcan.

L’échantillon B a été recueilli sur les pentes d’un « pic » qui résulte sans doute de l’impact d’un astéroïde de grande taille au pôle sud.

L’échantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques d’impacts de météorites.

1.3. Contact 3.

2

2. Situation des prélèvements. -- Je les ai passés au spectromètre de masse. J’ai trouvé des traces de huit acides aminés. Ce n’est pas surprenant en soi, mais compare les trois profils et dis-moi ce que tu en penses. Je t’ai envoyé les résultats.-- Je les ai bien reçus.

L’échantillon A provient de la cheminée d’un ancien volcan.

L’échantillon B a été recueilli sur les pentes d’un « pic » qui résulte sans doute de l’impact d’un astéroïde de grande taille au pôle sud.

L’échantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques d’impacts de météorites.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

2.5

5

7.5

échantillon A

échantillon B

échantillon C

-- Tu penses la même chose que moi ?-- Soit, le contexte géologique de la cheminée du volcan perturbe la synthèse non organique des acides aminés, soit nous sommes en présence d’une activité tyrosinase. Il va falloir que tu testes tout ça avant de revenir.-- Je ne suis pas scientifique, moi !-- Ron va t’aider. N’est-ce pas, Ron ?-- Je suis à vos ordres, mes toutes belles !

Pourquoi ces résultats impliquent-ils les recherches

qui suivent?

3

2. Situation des prélèvements. 3. Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.

-- C’est quoi cette tyrosinase ?-- C’est une enzyme qui catalyse la formation des pigments dans les mélanocytes de la peau et les follicules pileux. On l’appelle tyrosinase car la première étape consiste en la transformation de la tyrosine. Elle est aussi présente chez les végétaux, mais on ne sait pas trop à quoi elle sert. Elle provoque le brunissement des fruits et des légumes en présence de dioxygène.

-- Si nous mettons en évidence une activité tyrosinase, nous aurons démontré qu’il existe un métabolisme complexe sur cette planète naine.-- Et la présence de vie ?-- Métabolisme ne veut pas dire nécessairement vie. Mais c’est une première étape.

-- Angie ? Tu me reçois ?

-- Fort et clair ! J’ai étudié les données que tu m’as envoyées. Je suis de ton avis, il faut caractériser cette activité tyrosinase, si elle existe. Pour plus de sécurité, tu vas employer plusieurs méthodes de dosage.

3.1 4 MC

3. Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.

-- La méthode la plus simple est celle qui utilise le 4MC. Elle se base sur le principe que la tyrosinase est une enzyme relativement peu spécifique. Elle reconnaît plusieurs substrats différents qui possèdent une analogie de structure avec les 2-diphénol. Elle catalyse la réaction ci-contre:

3.1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC).

-- Le 4 Méthyl catéchol (4 MC) correspond à cette catégorie. Lorsqu’il subit la réaction, il donne un produit coloré, la quinone:

3.1.1 cin prélim

3. Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.3.1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC).

-- Ripley ? Tu vas commencer par une cinétique pour tester la valeur de dilution de l’extrait. Tu prépares le mélange réactionnel : - 1,5 mL de tampon acétate - 1 mL de 4 MC à 5 mmol.L-1 - 2,8 mL d'eau Tu ajoutes 0,2 mL d'extrait à t = 0 s et tu notes l'absorbance à 400 nm à t = 15 s et t = 135 s. Si cette dernière est comprise entre 0,8 et 1,2 c’est bon. Tu peux l’utiliser. Si elle est supérieure, tu le dilueras et tu recommenceras le test.-- Je teste les 3 échantillons ?-- Non, prends celui qui est le plus pertinent.

3.1.1. Cinétique préliminaire.

-- Ensuite, tu laisses la réaction aller à son terme. Lorsque l'absorbance ne varie plus, tu notes l’absorbance et tu évalues la valeur de e.quinone.

Déterminer l’échantillon à

tester !

Déterminer et justifier la méthode

de calcul !

3.1.2 param enz


-- Pour la détermination des paramètres, tu suis les instructions du tableau. Tu utilises les données de la cinétique pour choisir une dilution adéquate de l’extrait.

3.1.2. Détermination des paramètres enzymatiques.

Vérifier que la cinétique est linéaire

entre 15 et 135 s.

3.1.1. Cinétique préliminaire.

0 I II III IV

Tampon acétate (µL) 550 550 550 550 550

4MC (à 5 mmol.L-1)(µL)

0 500 350 250 125

pré-incubation à 37°Cdirectement dans une micro-cuve.

H2Oqsp 2 mL

(après addition de l’extrait)

Extrait A, B, C (µL) 100 100 100 100 100

Comparer les échantillons et

conclure.

3.2 catéchol 265


-- Il serait intéressant de comparer ces résultats avec ceux d’une méthode voisine. Nous nous contenterons de l’extrait E-A. Nous allons utiliser le catéchol comme substrat. Contrairement à son dérivé, le 4-MC, il possède un pic d’absorbance à 265 nm.

3.1.2. Détermination des paramètres enzymatiques.3.2. Méthode « catéchol 265 ».

-- Il ne suffit plus que d’appliquer le protocole décrit par le tableau.

I II III IV

ac ascorbique (5 mmol.L-1) 100

EDTA (0,065 mmol.L-1) 100

Catéchol (5 mmol.L-1) 50 100 150 200

Tp pH 6,5qsp 3 mL


pré-incubation5 mn à 25°C (si possible)

Evaluer la vitesse spontanée de la réaction

extrait E-A (µL) 50 50 50 50

Ne pas faire le zéro

- Mélanger par retournement.- Suivre absorbance à 265 nm pendant 5 mn

utiliser des cuves « spécial UV »

- On définit une unité de tyrosinase comme la quantité qui provoque une diminution d’absorbance de 0,001 uA par minute dans ces conditions opératoires.

Il faut faire un essai préliminaire (avec quel tube ?) pour vérifier que le volume de la prise d’extrait est bien adapté et déterminer si une

dilution est nécessaire.

3.3 DL DOPA 475

3. Dosage de l’activité tyrosinase des 3 échantillons.

-- La méthode à la DOPA utilise le substrat naturel de la tyrosinase. L’avantage est que l’on connaît de e du dopachrome (e = 3 600 mol-1.L.cm-1)

3.3. Méthode « DL DOPA 475 ».

-- Le protocole est particulièrement simple à suivre.

I II III IV

DL DOPA (20 mmol.L-1) 500 750 1000 1 200

Tp pH 6,5qsp 3 mL


pré-incubation5 mn à 25°C (si possible)

Evaluer la vitesse spontanée de la réaction

extrait E-A (µL) ?

- Mélanger par retournement.- Suivre absorbance à 475 nm pendant 3 mn

La variation d’absorbance doit être comprise entre 0,03 et 0,3 uA.mn-1. La période de linéarité est alors inférieure ou égale à 3 mn. Au-delà, un brunissement du milieu réactionnel est normal.

La encore il faut faire un essai préliminaire pour déterminer le

volume de prise d’essai et la dilution éventuelle.

3.2. Méthode « catéchol 265 ».

4

4. Chantage.

C’est la dernière journée autour de Vesta. Dans h + 20 le module Héra entamera son retour vers Junon. Ripley se lave dans la salle des moteurs à un filet d’eau provenant de la condensation dans le circuit de refroidissement. -- Je me demandais ce que tu manigançais ici.-- Ca te ferai mal d’annoncer quand tu arrives ?-- C’est mon vaisseau. Je suis le commandant, et je fais ce que je veux dans mon vaisseau.-- Ca ne t’empêche pas de respecter l’intimité des autres.

-- Tu n’as pas plus droit à l’intimité qu’un vulgaire animal. J’ai lu ton rapport. Je sais que tu es condamnée par contumace. Je sais le sort qu’on te réserve lorsque nous reviendrons sur Terre.-- Ces renseignements ne te concernent pas. Ils sont confidentiels. Comment te les es-tu procurés.-- Peu importe. Ce qui est important c’est ce que je peux faire pour toi. Si tu montres que tu t’es amendée, je suis sûr que les juges seront cléments. Il faut juste que tu te montres gentil...

-- Tu es une ordure.-- Pense à toi, et à Eva. Sais-tu ce qu’ils sont capables de faire aux gens comme vous. Tu te souviens de la journaliste venue faire un reportage sur le Junon juste avant notre départ. Son article a été condamnée car il cautionné votre mode de vie. La journaliste a été internée. Les images des caméras de surveillance ont été diffusées sur le net. Ca a été un des meilleurs scores d’audience. Il y a eu jusqu’à deux milliards de connections payantes à l’heure où ses codétenus regagnaient la cellule. Elle s’est suicidée au bout de dix jours. Je te laisse réfléchir. Dans le fond, peut-être qu’elle aimerait ça.

Ripley tombe à genoux. Elle tient son visage entre ses mains et sert les dents pour ne pas hurler.

5

Ripley glisse ses 1m 85 dans le minuscule laboratoire de recherche du module. Ron est plongé dans la contemplation de ses colonnes de purification.

-- Ron ?-- Ripley ! Qu’est-ce qu’il

t’arrive ? Tu as pleuré ?-- C’est rien. Un peu de vague à

l’âme.-- C’est Eva qui te manque.

Dans quelques jours tu la retrouveras.

-- Mais je serai à nouveau isolée. Je ne te verrai plus comme maintenant.

-- C’est pas grave, je ne suis qu’un ours solitaire.

5. Influences environnementales.

-- Tu es un mec bien, Ron. Qu’est-ce que tu penses de moi et d’Eva ?-- Du fait que vous soyez ensemble ? Je n’ai rien à y penser, c’est votre vie privée. L’important c’est que tu as trouvé quelqu’un que tu aimes et qui te le rend. C’est si rare dans notre monde détraqué qu’il faut le protéger à tout prix.-- Tu as raison ! Je ferai ce qu’il faudra pour la protéger.

-- Pour en revenir à nos moutons électriques, comme dirait Philip K. Dick, la différence d’activité tyrosinase des échantillons peuvent avoir deux origines : ou bien nous sommes en présence de trois phénomènes catalytiques distincts, provoqués par trois catalyseurs totalement différents. Ou bien il s’agit du même catalyseur dont l’activité est modifiée par l’environnement physico-chimique. Je penche pour cette seconde hypothèse.-- Pourquoi ?-- Tu connais la règle du rasoir d’Occam ! L’hypothèse la plus simple a la plus grande probabilité d’être exacte. Il n’existe pas une infinité de catalyseurs non protéiques. La probabilité d’en trouver trois différents sur un même astéroïde est minuscule. Par contre, les trois sites sont très différents et peuvent posséder des compositions chimiques différentes.-- J’ai fini l’étude des prélèvements. Après élimination des éléments cristallins communs, j’ai découverts deux molécules spécifiques. Le site B contient du méta bisulfite. Le site C, quant à lui, contient de l’acide cinaminique. C’est également un effecteur de tyrosinase.-- Nous allons testons l’action de ces molécules sur l’activité catalytique de l’échantillon A. Si ceux-ci présentent un effet inhibiteur, on pourra sérieusement suspecter la présence d’une enzyme, et donc, de vie sur Vesta.

Qu’est-ce que c’est que cette histoire de moutons

électriques?

5.1 bisulf


C’est un agent réducteur puissant capable d’inhiber un certain nombre d’enzyme. C’est un candidat de poids pour ton étude.

5.1. Site B : effet du méta-bisulfite.

En quoi un réducteur peut-il interférer sur le pouvoir

catalytique de la tyrosinase.

Vol en mL 0 I II III IV

Tampon acétate (µL) 550 550 550 550 550


0 500 350 250 125

prélèvement B Méta-bisulfite de Na :

(0,25 mmol.L-1)(en µL)

0 0 0 0 0

50 50 50 50 50

100 100 100 100 100

pré-incubation à 37°Cdirectement dans une micro-cuve.

H2Oqsp 2 mL


Extrait E-A (µL) 100 100 100 100 100

noter l'absorbanceà t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s)

Quand on analyse globalement la manip, on se rend compte

qu’il n’est pas obligé de préparer tous les tubes décrits dans le

tableau.

5.1


-- Ron, qu’est-ce que tu ferais si pour protéger la personne que tu aimes tu devais la perdre ?-- Je me demanderai si la personne que j’aime supporterait l’idée de me perdre.-- Sans doute pas plus que toi tu supporterais de la perdre.-- Alors c’est une décision à prendre à deux ! Je suis sûr qu’Eva refuserait que tu assumes toute la responsabilité d’une décision qui vous concerne toute les deux.

5.1. Site B : effet du méta-bisulfite.

5.2 cinam


-- Oublie ce que je viens de te dire et continuons notre exploration. Nous devons tester le prélèvement C qui contient de l’acide cinaminique.-- J’ai la formule chimique.-- Quand on voit la molécule, on devine par quel mécanisme il peut bloquer le fonctionnement de l’activité tyrosinase.

5.1. Site B : effet du méta-bisulfite.5.2. Site C : effet du cinaminate.

Développer cette argumentation.

-- Le principe de la manipulation est le même que pour le prélèvement B. On garde le bocal et on change les cornichons !

Vol en mL I II III IVTampon acétate (µL) 550 550 550 550


500 350 250 125

prélèvement Cac cinaminique

(3 mmol.L-1)(en µL)

0 0 0 020 20 20 2050 50 50 5080 80 80 80

100 100 100 100

H2Oqsp 2 mL


Extrait E-A (µL) 100 100 100 100


5.2

5. Influences environnementales.5.2. Site C : effet du cinaminate.

-- Si c’est John qui te pose des problèmes, tu n’as qu’un mot à dire et je lui explique que l’on n’importune pas les dames. Je me sens des talents de pédagogue.

-- Il vaut mieux que tu ne t’en mêles pas. Je suis assez grande pour me débrouiller toute seule.

5.3 complémentaire

5. Influences environnementales.5.3. Etudes complémentaires.

-- Si on a le temps, je voudrais tenter un dosage. Mesurer l’effet du cinaminate par la méthode « DOPA 475 ».

Vol en mL I II III IV

DL DOPA (20 mmol.L-1) 500 750 1000 1 200

Tp pH 6,5qsp 3 mL


prélèvement C(ac cinaminique)

(en µL)

0 0 0 0

100 100 100 100

200 200 200 200

400 400 400 400

600 600 600 600

Extrait E-A (µL) voir 3.2.2.


conclusion

-- Il ne me reste plus qu’a taper le rapport. Angie doit être impatiente de regarder nos résultats.-- Qu’est-ce qu’elle attend exactement ?-- Tous les calculs de vitesses justifiés par nos choix de manip. L’analyse comparée de ces résultats et les conclusions. La routine, quoi.-- Je vais rester avec toi pour t’aider.-- Dis-moi un truc, Ron ! Tu ne serais pas en train de tomber amoureux de moi ?-- Moi ? Surement pas, c’est trop dangereux de fréquenter des « louves » !

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