Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme ... · existe un système de défense, le système antioxydatif. Ce réseau d’antioxydants, enzymatiques

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUE

Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention du diplôme de

Licence Domaine : Sciences de la nature et de la vie

Filière : Biologie

Spécialité : Biochimie fondamentale et appliquée

Thème

Encadreur : Mme SAYAH zineb Présenté par :

MEDJOUJDA Ouafa

Examinateur : Melle

HADJADJ Soumia M.A. « A »

BENLIFA Atika

Méthodes d’études d’activité des antioxydants des plantes

médicinales

Année universitaire 2013/2014

Remerciements

Avant tout, nous remercions Dieu tout puissant de nous avoir donné la force, le courage, la

persistance et nous a permis d’exploiter les moyens disponibles à fin d’accomplir ce modeste

travail. Merci de nous avoir éclairé le chemin de la réussite.

Nous adressons nos plus sincères remerciements à notre promotrice Mme SAYAH Zineb

Enseignante au Département des Sciences Biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature

et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, qui nous a encadrées et dirigées ce travail

avec une grande rigueur scientifique, sa disponibilité, ses conseils et la confiance qu’il nos

accordé nos ont permet de réaliser ce travail.

Nous offrons nos plus sincères remerciements à l'examinatrice HADJADJ Soumia pour ses

précisions remarques pour corriger ce travail et pour l’assistance

par des conseils objectifs et éclairés.

Nous adressons nos plus sincères remerciements à Mme ANNOU Ghania

pour ses conseils.

Enseignante au Département des Sciences Biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature

et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla

Un grand merci BOUMAAZA Salman étudiant dans université

Mohammed Khider Beskra.

Nous remercions aussi tous les membres de la bibliothèque de Département des Sciences

Biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de

l’Université Kasdi Merbah-Ouargla.

Nous remercions aussi tous les membres de la bibliothèque de l’Université Mohammed Khider

Beskra.

Un grand merci à tous les enseignants du département des sciences de la nature

et la vie de l’université Ouargla.

Nos vifs et sincères remerciements s’adressent tout particulièrement à notre Université de

Kasdi Merbah – Ouargla-, qui nous a procuré une bonne formation Ouafa-Atika

Dédicace

Je dédié ce travail à Ma famille MEDJOUDJA Et aux personnes les plus chères au monde mes chers

parents ; A ma très chère mère Ramdana ;

Tu es l’exemple de dévouement qui n’a pas cessé de m’encourager et de prier pour moi. Et Puisse Dieu, le tout puissant, te préserver t’accorder

santé, longue vie et bonheur. A mon père Mohammed ;

Rien au monde ne vaut les efforts fournis jour et nuit pour mon éducation et mon bien être. Ce travail est fruit de tes sacrifices qui tu as consentis

pour mon éducation et ma formation. Je dédie spécial Mon mari BILAL qui n’a jamais cessé de croire source d’amour et de tendresse sans toi ce mémoire n’aurait jamais un le jour…

A mes sœurs: Meriem, Safa, Yamina, Khadidja.

A mes frères: Mohammed lakhader, Hamza, Youcef. A mes nièce: Isra, Arije

A mes nouveaux : Ahmed, Obaida , Seliman, Mohammed Isam.

A ma 2éme famille : Mes parents : Mohammed elhadi et Ouahiba, Mes sœurs et Mes frères.

A mon binôme Atika qui a partagée avec moi les moments difficiles de ce

travail et son famille. A La promotion de 3émeannée biochimie LMD.

Sans oublier mes amies et a Tous ceux qui ont connus. Ouafa

Dédicaces

A l’aide de dieu tout puissant, qui m’a tracé le chemin de ma vie,

J’ai pu réaliser ce travail que je dédie :

A la lumière de mes yeux, l’ombre de mes pas et le bonheur de ma vie ma mère qui ma apporté son appui durant toutes mes années d’étude, pour son

sacrifice et soutien qui m’ont donné confiance, courage et sécurité.

A mon cher père qui ma appris le sens de la persévérance tout au long de mes études, pour son sacrifice ses conseils et ses encouragements.

A ma grand-mère Aicha.

A mes tantes, mes oncles.

A toute ma famille Benlifa , Salah.

A mes très chères sœurs : Soumia , Soundes. A mes très chères frères : Abd ellalatif, Samir, Soufiane ,Younes.

A ma très chère sœur Asma et son marie tarik. A mon nouveau Med Said.

A ma très chère amie «Meriem».

A toute ma famille, proche ou éloignée.

A tout mes Amis : Bouthaina , Hayet , Zineb , Nadjia , Afaf , Hadjer, Massouda , Mouna , Imen , Sabah , Zineb B , Sabrinal , Mebaraka ,

Sara, Nour elhouda. A mon Binôme « Ouafa » qui a partagée avec moi les moments difficiles

de ce travail et son famille.

Sans oublier mes brave Amies de la promotion III de Biochimie.

Atika

Table des matières

Remerciement

Listes des tableaux

Listes des figures

Listes des abréviations

Introduction 1

Chapitre I- Plantes médicinales et principaux antioxydants naturels.

I.1- Plantes médicinales. 2

I.1.1- Définition de plantes médicinales. 2

I.1.2- Métabolismes secondaires. 2

I.1-3- Phytothérapie. 4

I.1.4- Pouvoir des plantes médicinales. 4

I.2- Mécanisme dégénération des radicaux libres.

I.2.1- Stress antioxydant. 5

I.2.2- Généralité sur l’oxydation et les antioxydants. 6

I.2.3- Définition des antioxydants. 7

I.2.4- Principaux antioxydants. 8

I.2.4.1- Antioxydants endogènes. 8

I.2.4.2- Antioxydants exogènes. 8

I.2.4.2.1- Médicament. 8

I.2.4.2.2- Porbucol(Lurselle). 8

I.2.4.2.3- N-acétylcystéine. 8

I.2.4.3- Alimentation. 9

I.2.4.3.1- Acide ascorbique : Vitamine C. 9

I.2.4.3.2- Vitamine E. 9

I.2.4.3.3- β- carotène. 10

I.2.5- Mécanismes d’action des antioxydants. 11

I.2.5.1- Classification des antioxydants par rapport à leur mécanisme d’action. 11

I.2.5.1.1- Antioxydants primaires ou radicalaires ou vrais. 11

I.2.5.1.2- Antioxydants secondaires ou préventifs. 11

I.2.5.2- Classification des antioxydants suivant la nature chimique dans les aliments. 12

I.2.5.2.1- Antioxydants naturels. 12

I.2.5.2.2- Antioxydants synthétiques. 12

I.2.5.2.3- Antioxydants synergiques. 14

I.2.6- Toxicité des antioxydants. 14

Chapitre II- Méthode d’étude d’activité antioxydants des plantes médicinales.

Introduction. 16

II.1- Test au DPPH. 16

II.2- Test de la réduction du fer FRAP ( Ferric reducing-antioxidant power). 18

II.3- Méthode de TRAP ( Total radical- trapping antioxidant parameter ). 20

II.4- Réduction du radical-cation ABTS ou détermination du TEAC. 20

II.5- Test de blanchissement du β-carotène. 21

II.6- Méthode de tiocyante ferrique(FTC). 22

II.7- Piégeage du radical superoxyde (O2.-). 23

II.8- Test ORAC ( Oxygen Radical Absorbance Capacity). 24

II.9- Piégeage du peroxyde d’hydrogène ( H2o2 scavening activity). 26

II.10- Méthode de la xantine oxydase. 27

II.11- Chélation du fer. 28

II.12- Méthode de DEPG ( N,N-dimethyl-p-phenylene diaminedihydrochloride. 28

II.13- Test qualitatif au β-carotène. 29

II.14- Pouvoir réducteur. 30

II.15- Test de blanchiment de β-carotène couplé à l’auto-oxydation de l’acide

linoléique.

30

II.16- Capacité antioxydant totale (TAC). 31

II.17- Procédé de puissance de réduction (RP). 32

II.18- Piégeage du radical hydroxyle. 32

II.19- Peroxydation de l’acide linoléique. 33

II.20- Procédé de phosphomolybdène. 34

II.21- Test mesurant l’activité antioxydant au moyen de caroténoïdes. 35

II.22- Activité de piégeage de l’oxyde nitrique. 35

Conclusion. 37

Références bibliographiques. 39

Liste des tableaux

Tableau Titre Page

Tableau I Effet synergique de l'association de plusieurs antioxydants

(MRIE-CLAUDE,2004).

15

Liste des figures

Figure Titre Page

1 Classification des quelques métabolites secondaires

(MUANDA, 2010).

3

2 Réaction de FENTON et de HABER-WEISS (PELLETIER et

al., 2004).

6

3 Régulation de la production d’espèces réactives de

l’oxygène par les systèmes de défenses antioxydants

(MILBURY et RICHER, 2008).

7

4 Structure de l’acide ascorbique (DIALLO, 2005).

9

5 Structure de la vitamine E (DIARRA, 2006).

10

6 Structure de la β-carotène (DIALLO, 2005).

10

7 Structures chimiques des antioxydants naturels (EL

KALAMOUNI, 2010).

13

8

Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-

Picryl-Hydrazyle) (POPOVICI et al., 2009).

16

9

Réaction de test DPPH (2.2 Diphenyl 1 picryl hydrazyl)

(CONGO, 2012).

17

10

Schéma sur la réaction de test FRAP (Ferric reducing

antioxidant power) (PRIOR et al., 2005).

18

Liste des abréviations

AAO : Activité antioxydant

ADN : Acide désoxyribonucléique

AUC : Aire sous la courbe

BHT : Butylated hydroxytoluene

Co : Degré Celsius

CCM : Chromatographie sur couche mince

CI50 : Concentration inhibitrice à 50%

DMPD : N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzene

DO : Densité optique

EDTA: Ethylene diamine tetraacetic

EqAA : Equivalent d’acide ascorbique

EOR : Espèce oxygénée radicalaire

g/l : Gramme par Litre

GF254 : Gel de silice

H : Atome d’hydrogène

h : Heure

H2O : Eau

H2O2 : Eau Oxygénée ou peroxyde d’hydrogène

H2SO4: Acide sulferique

I: Inhibition

KCN : Thiocyanate de potassium

L : Litre

LDL : Lipoprotéines à basse densité (low density lipoproteins)

M : Molarité

min : Minute

mg : Milligramme

mg /ml : Milligramme/ Millilitre

ml : Millilitre

mM : Milimolarié

mM /l : Milimolarié par litre

mmol/l : Milli mol par Litre

mV : milivolte

NBT2+

: Nitro-Blue Tétrazolium

nm: Nanometer

O2 :Oxygène moléculaire

O2.-

: Anion superoxyde

OH : Groupe hydroxyle

% : Pourcentage

U / µL : Unité par Microlitre

µg : Microgramme

µg/ml : Microgramme par Millilitre

µL : Microlitre

µmol/l : Micromole par litre

UV : Ultra violé

VIS : Visible

INTRODUCTION

Introduction

Nous ne pouvons survivre sans oxygène. Rares étaient ceux qui soupçonnaient

récemment encore que ce souffle de vie pouvait également être mais en rapport avec nombre de

maladies. Ce paradoxe de l’oxygène est une des phénomènes les plus curieux de la nature. Les

effets nocifs de l’oxygène ne sont pas provoqués par l’oxygène en soi, mais par les espèces

oxygénées réactives formées sur place. Celles-ci se créent notamment par pertes successives

d’un électron de l’oxygène moléculaire conduisant à la formation du radical superoxyde, du

peroxyde d’hydrogène et du radical hydroxyle (KOEN, 2004).

Les espèces oxygénées réactives oxydent lentement nos molécules biologiques. Heureusement, il

existe un système de défense, le système antioxydatif. Ce réseau d’antioxydants, enzymatiques

ou non, permet à notre corps de se défendre contre les substances réactives oxygénées (KOEN,

2004).

Les antioxydants sont des molécules capables d’interagir sans danger avec les radicaux libres et

de mettre fin à la réaction en chaîne avant que les molécules vitales ne soient endommagées.

Chaque molécule antioxydant ne peut réagir qu’avec un seul radical libre et par conséquent, il

faut constamment refaire le plein de ressources antioxydants (PELI et LYLY, 2003).

Dans l’organisme, il existe plusieurs types de molécules à activité antioxydant : les enzymes

antioxydants directement synthétisées par l’organisme (superoxyde dismutases, glutathion

peroxydases, β catalase…) et les composés antioxydants d’origine exogène c'est-à-dire

alimentaire (les vitamines A, C et E ; les caroténoïdes comme le lycopène et la lutéine ; la taurine

; les polyphénols ; certains minéraux et oligoéléments comme le magnésium, le zinc, le sélénium

et le manganèse). Ces systèmes antioxydants interviennent en protégeant les cellules des

dommages oxydatifs induits par les radicaux libres. Le principe de leur emploi pour prévenir

l’apparition et le développement de certaines maladies dans lesquelles sont impliqués des

phénomènes oxydatifs semble séduisant (PASTRE, 2007).

L’importance d’un système antioxydatif efficace est illustrée par la corrélation entre le stress

oxydatif et certaines maladies, y compris des cancers, des maladies cardio-vasculaires et le

diabète non insulinodépendant (KOEN, 2004).

Aujourd'hui, les traitements à base de plantes reviennent au premier plan, car l'efficacité des

médicaments tels que les antioxydants, les polyphénols et surtout les flavonoïdes sont des

antioxydants puissants susceptibles d’inhiber la formation des radicaux libres et de s’opposer à

l’oxydation des macromolécules (VAN ACKER et al., 1995 ; ISERIN, 2001).

Le présent travail porte sur une recherche des méthodes d’évaluation de l’activité antioxydant

des plantes médicinales. Il comprend deux chapitres :

Chapitre I : Définit les antioxydants des plantes médicinales.

Introduction

Chapitre II : Porte sur les différentes méthodes d’évaluation de l’activité antioxydant des plantes

médicinales.

CHAPITRE I-

Plantes médicinales et les

principaux antioxydants

naturels

CHAPITRE I- Plantes médicinales et les principaux antioxydants naturels

2

I.1- Planes médicinales

I.1.1- Définition des plantes médicinales

Se dit des nombreuses espèces végétales qui sont réputées avoir une action physiologique

et qui sont utilisées comme curatives sous forme de poudre, d’extraits, de teintures, d’infusion ou

de décoctions.

Les plantes médicinales contiennent une infinité de principes actifs dont la nature et les

propriétés sont mieux connues.

Les plantes médicinales sont parfois récoltées à l’état sauvage mais beaucoup d’entre elles sont

cultivées à grande échelle (Digitale, Pavot, Chanvre, etc.) pour répondre à la consommation. Les

méthodes de sélection ou de manipulation génétiques sont également utilisées pour augmenter

leur teneur en principes actifs.

Certaines familles sont particulièrement riches en principes actifs (Papavéracées, Apocynacées,

Liliacées, Rubiacées, Solanacées, Lamiacées). Certaines plantes sont inoffensives telles que le

Tilleul, la Camomille, la Menthe, etc. D’autres, très nombreuses, sont toxiques et ne doivent être

utilisées que sous forme pharmaceutique, telle que la Digitale, la Belladone, le Colchique, etc.

L’emploi inconsidéré de plantes cueillies dans les champs peut aboutir à des intoxications

graves, voire mortelles (MAROUF et REYNAUD, 2007).

I.1.2- Métabolites secondaires

Les métabolites secondaires des plantes constituent un groupe diversifié de composés

chimiques d’origine naturelle (fig. 1) qui n’ont généralement aucune fonction primaire évidente

en ce qui a trait à la croissance des cellules de la plante. Ils sont synthétisés par la plante en

réaction à des stimuli extérieurs et ont souvent une fonction régulatrice dans le cadre d’une série

de réactions physiologiques et métaboliques en cascade à la suite d’un stress environnemental ou

d’une attaque par des ravageurs. Lorsque l’on découvre une nouvelle fonction biologique à un

métabolite secondaire, ce dernier est généralement reclassifié à titre de vitamine (BRANDT et

al., 2001 site par BENBROOK, 2005).


3

Figure1- Classification des quelques métabolites secondaires (MUANDA, 2010).


4

I.1.3- Phytothérapie

La phytothérapie concerne le traitement des maladies par les plantes ou par leurs extraits

(BORDEAUX, 2009). Il est recommandé d’utiliser la plante entière, appelée aussi

«totum» plutôt que des extraits obtenus en laboratoire.

Il existe différents types de phytothérapie :

- L’aromathérapie : c’est une thérapeutique qui utilise les huiles essentielles, substances

aromatiques secrétées par de nombreuses familles de plantes.

- La gemmothérapie : se fonde sur l’utilisation d’extrait alcoolique de tissus jeunes de végétaux

tels que les bourgeons et les radicelles.

- L’herboristerie : correspond à la méthode de phytothérapie la plus classique et la plus ancienne.

L’herboriste se sert de la plante fraîche ou séchée, soit entière, soit une partie de celle-ci (écorce,

fruits, fleurs). La préparation repose sur des méthodes simples, le plus souvent à base d’eau :

décoction, infusion, macération. Ces préparations existent aussi sous forme plus moderne de

gélules de poudre de plante sèche que le sujet avale (BESANҀON, 2012).

I.1.4- Pouvoir des plantes médicinales

L'action de la phytothérapie sur l'organisme dépend de la composition des plantes, depuis

XVIII ème

siècle, au cours duquel des savants ont commencé à extraire et à isoler les substances

chimiques qu'elles contiennent. On considère les plantes et leurs effets en fonction de leurs

principes actifs. La recherche des principes actifs extraits des plantes est d'une importance

capitale car elle a permis la mise au point de médicaments essentiels.

Aujourd'hui les plantes sont de plus en plus utilisées par l'industrie pharmaceutique, il est

impossible d'imaginer le monde sans la quinine qui est employée contre la malaria ou sans la

diagoxine qui soigne le cœur, ou encore l'éphédrine que l'on retrouve dans de nombreuses

prescriptions contre les rhumes (ISERIN, 2001).


5

I.2- Mécanisme dégénération des radicaux libres

L’oxygène est un élément essentiel pour les organismes multicellulaires parce qu’il

permet de produire de l’énergie en oxydant de la matière organique. Mais nos cellules

convertissent une partie de cet oxygène en métabolites toxiques: les radicaux libres organiques

(DESCHEEMAEKER, 2004). Les radicaux libres sont des espèces chimiques (atomes ou

molécules) qui possèdent un électron célibataire (ou électron non apparié) sur leur couche

externe (TOUSSAINT, 2008). Leur principal danger vient des dommages qu'ils peuvent

provoquer lorsqu'ils réagissent avec des composants cellulaires importants tels que l'ADN ou la

membrane cellulaire, avec risque de multiplication anormale des cellules, entraînant un

dysfonctionnement ou une mort cellulaire, un cancer. Les radicaux libres nocifs sont produits

dans l'organisme au cours du métabolisme normal, mais plus encore en cas d'exposition à

diverses agressions de l'environnement (agents infectieux, pollution, UV, fumée de cigarettes,

rayonnement) (TANGUY et al., 2009).

L’exercice vigoureux accélère la formation de radicaux libres, tout comme l’inflammation,

l’exposition à certains produits chimiques, la fumée de cigarette, l’alcool, la pollution ambiante

et les diètes riches en matières grasses (BENBROOK, 2005). Les radicaux libres peuvent se

former lorsque l’oxygène interagit avec certaines molécules. Très instables, ils réagissent

rapidement avec les autres composants, essayant de capturer l’électron qui leur est nécessaire

pour acquérir de la stabilité. Une réaction en chaîne débute lorsqu’ils attaquent la molécule stable

la plus proche en lui «volant» son électron, la transformant elle-même en radical libre

(TANGUY et al., 2009). Les radicaux libres sont piégés par des composés facilement oxydables

(TOUSSAINT, 2008).

I.2.1- Stress oxydant

Le stress oxydatif se définit comme étant un déséquilibre profond de la balance entre les

prooxydants et les antioxydants (PINCEMAIL et al., 1999) en faveur des premiers et impliquant

la production d’espèces réactives de l’oxygène (SIES, 1991 ; PELLETIER et al., 2004). La

formation incontrôlée d’espèces réactives de l’oxygène comme l’anion superoxyde (O2-), le

peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou le radical hydroxyle (OH°) aura la conséquence souvent lourde

pour l’organisme. La formation d’espèces réactives n’est pas toujours synonyme de toxicité. En

effet, certaines sont des intermédiaires de processus physiologiques normaux. Ce n’est que


6

lorsque les systèmes de défense sont dépassés et ne suffisent plus à neutraliser la surproduction

de ces espèces que la toxicité apparaît.

Un stress oxydative pourra être induit lors de la surproduction d’espèces réactives et /ou par suit

de l’inhibition des systèmes antioxydants qui peuvent être inactivés, soit directement, soit par

défaut de synthèse. Parmi les espèces réactives de l’oxygène, le radical hydroxyle, présenté

comme le plus toxique malgré sa faible diffusion, peut attaquer tous les types de constituants

cellulaires et engendrer diverses altérations (dégradation protéique, inactivation enzymatique,

lipoperoxydation, adduits à L' ADN, etc.). Il résulte de la fission homolytique de la liaison O-O

du peroxyde d’hydrogène (PELLETIER et al., 2004). Il peut être produit par les réactions de

FENTON et de HABER-WEISS (fig. 2).

Figure 2- Réaction de FENTON et de HABER-WEISS (PELLETIER et al., 2004).

I.2.2- Généralité sur l’oxydation et les antioxydants

L’oxydation est le phénomène qui fait rouiller les métaux, qui fait flétrir les légumes et

les fruits, rancir les graisses. Il modifie le goût et la couleur des aliments.

L’organisme subit également le phénomène d’oxydation, mais il est équipé pour lutter contre ces

altérations: un énorme système de défense est en permanence en place, avec des systèmes

enzymatiques et/ou des systèmes dégénératifs de complexe mettant en jeu par exemple l’acide

ascorbique (vit C) ou le glutathion. Mais ce système de défense est parfois débordé, surtout

quand les agressions sont multipliées sous l’effet de la fumée du tabac, de pollution, du soleil,

d’un effort physique intense, etc.

- Soit dans des conditions de stress et alors l’oxydation augmente au point de ne pas pouvoir être

régulée.


7

- Soit dans des conditions de mouvais alimentation et alors des quantités d’antioxydants apportés

ne sont pas suffisant pour rétablir l’équilibre. C’est là ou il y a des dégâts (ROLLAND et al.,

2004).

I.2.3- Définition des antioxydants

Les antioxydants sont définis par HALLIWELL comme «toute substance qui en faible

concentration par rapport au substrat susceptible d’être oxydé prévient ou ralentit l’oxydation de

ce substrat» (PASTRE et PRIYMENKO, 2007).

Les antioxydants piègent les radicaux libres en inhibant les réactions à l’intérieur des cellules

provoquées par les molécules de dioxygène et de peroxyde, aussi appelées espèces oxygénées

radicalaires (EOR) et espèces azotées radicalaires (fig. 3) (BENBROOK, 2005).

Les antioxydants sont largement présents dans nos aliments, soit sous forme naturelle, soit sous

forme d'additifs utilisés dans l’industrie agroalimentaire (TANGUY et al., 2009).

Figure3- Régulation de la production d’espèces réactives de l’oxygène par les systèmes de

défenses antioxydants (MILBURY et RICHER, 2008).


8

I.2.4- Principaux antioxydants

Il existe de très nombreuses sources d’antioxydants (tant ceux fabriqués par l’organisme

que ceux qui sont fournis par les aliments) et que ces derniers réagissent constamment avec

d’autres molécules et tissus, ce qui en change la forme. Il est difficile de départager, par rapport à

la quantité totale d’antioxydants présents dans l’organisme, la proportion d’antioxydants

attribuables à l’alimentation (antioxydants exogènes) et la proportion attribuable à la synthèse

par l’organisme (antioxydants endogènes). Cela dit, on en sait beaucoup sur le rôle et

l’importance relative des sources d’antioxydants endogènes et exogènes (BENBROOK, 2005).

I.2.4.1- Antioxydants endogènes

Antioxydants endogènes sont des enzymes ou protéines antioxydants (Superoxyde

dismutase, Catalase, et Glutathion peroxydase) élaborés par notre organisme avec l’aide de

certains minéraux. Elles sont présentes en permanence dans l’organisme mais leur quantité

diminue avec l’âge (MIKA et al., 2004).

I.2.4.2- Antioxydants exogènes

I.2.4.2.1- Médicaments

I.2.4.2.2- Probucol ( Lurselle )

Probucol est un médicament qui en plus de ces effets reconnus dans la baisse du taux

sanguin de cholestérol, prévient l’athérogénèse en agissant comme antioxydant et en supprimant

l'oxydation des lipoprotéines de faible densité (LDL) (BOSSOKPI, 2002).

I.2.4.2.3- N-acétylcystéine

N-acétylcystéine est une molécule intéressante qui pénètre les cellules et agit de manière

très efficace dans la régénération du gluthation. Des recherches ont également démontré que la

N–acetylcystéine peut être utile dans le traitement des blessures de poumon dues à des espèces

réactives de l’oxygène (BOSSOKPI, 2002).


9

I.2.4.3- Alimentation

I.2.4.3.1- Acide ascorbique: vitamine C

La vitamine C est un antioxydant puissant (fig. 4). Elle participe dans les réactions avec

la vitamine E et l’enzyme glutathion peroxydase pour neutralisation des radicaux libres

(CHEICK TRAORE, 2006). La vitamine C agit principalement en piégeant directement les ROS

(majoritairement l'O2.-

et le ONOO-) (BELKHEIRI, 2010). Il est présent dans les légumes, le

choux, le poivron, les agrumes. (COLETTE E., 2003). Elle joue un rôle important dans la

régénération de la vitamine E (BOSSOKPI, 2002).

Figure4- Structure de l’acide ascorbique (DIALLO, 2005).

I.2.4.3.2- Vitamine E

La vitamine E (fig. 5) prévient la peroxydation des lipides membranaires in vivo en

captant les radicaux peroxyles. Elle est présente dans les huiles végétales (huiles d’arachide, de

soja, de chardon, de tournesol et d’olive pressées à froid) ainsi que dans les noix, les amandes,

les graines, le lait, les œufs, et les légumes à feuilles vertes (AHAMET, 2003). Elle joue un rôle

préventif dans le développement des cancers et sur le vieillissement (CHEICK TRAORE, 2006).


10

Figure 5- Structure de la vitamine E (DIARRA, 2006).

I.2.4.3.3- β carotène

β-carotène (fig. 6) qui outre l’activité provitaminique A possède la capacité de capter

l’oxygène singulet. La recommandation officielle parle d’un apport quotidien de 60 mg de

vitamine C et 10 mg de vitamine E. Il n’en existe pas pour le ß-carotène. Toutefois ces quantités

suffisent juste pour prévenir les phénomènes de carences. C’est la raison pour laquelle les

spécialistes recommandent en général un apport quotidien nettement plus élevé : 150 à 300 mg

de vitamine C, 50 à 150 mg de vitamine E et 2 à 6 mg de ß-carotène.

Il est présent dans les légumes verts, la salade, les carottes, l’abricot, le melon, les épinards, la

papaye (BOSSOKPI, 2002).

Figure 6- Structure de la β-carotène (DIALLO, 2005).


11

I.5- Classification des antioxydants

I.5.1- Classification des antioxydants par rapport à leurs mécanismes d’action

Il y deux options pour retarder la réaction d’oxydation :

- Soit intercepter les radicaux libres responsables de la réaction en chaîne.

- Soit éviter la décomposition des hydroperoxydes dans les radicaux libres.

Ces deux options fournissent la base de classification des antioxydants sous forme primaire ou

secondaire selon leur mécanisme d’action (ROLLAND, 2004).

I.5.1.1- Antioxydants primaires ou radicalaires ou vrais

Antioxydants primaires permettent l’interruption de la chaîne auto catalytique :

AH + R• → A

• + RH

A• : radical libre.

AH : molécule antioxydant (ROLLAND, 2004).

La molécule AH est antioxydant si le radical formé A• est plus stable. La stabilité du

radical A• peut s’expliquer par sa conversion en composés non radicalaires (ROLLAND, 2004)

selon la réaction suivant :

A• + A’ → A-A

A’ : Autre radical libre (ROLLAND, 2004).

I.5.1.2- Antioxydants secondaires ou préventifs

Les antioxydants secondaires assurent l’inhibition de la production des radicaux libres.

Ce sont des substances décomposant les hydroperoxydes en alcool, comme thiols (glutathion,

acides aminés soufrés) ou les disulfures, des protecteurs vis-à-vis des UV, comme les carotènes,

des chélatants des métaux promoteurs d’oxydation type fer et cuivre, comme l’acide citrique et

les lécithines ou enfin de séquestrant d’oxygène comme l’acide ascorbique (ROLLAND, 2004).


12

I.5.2- Classification des antioxydants suivant la nature chimique dans les aliments

Les antioxydants sont classés dans trois catégories différentes (naturelles, synthétiques et

synergiques) (PELLI et LYLY, 2003).

II.5.2.1- Antioxydants naturels

Les antioxydants naturellement sont présents dans presque toutes les plantes, tous les

micro-organismes, les champignons et même dans les tissus animaux. Le groupe le plus

important d’antioxydants naturel comprend la vitamine E (tocophérol), les flavonoïdes et autres

composés végétaux (Fig. 3) (PELLI et LYLY, 2003).

I.5.2.2- Antioxydants synthétiques

Les antioxydants synthétiques sont généralement préparés en laboratoire, et

principalement à partir de composants chimiques. Dans l’industrie alimentaire, l’ajout

d’antioxydants naturels dans les aliments est une technique complètement nouvelle. Depuis à peu

près 1980, les antioxydants naturels sont apparus comme alternative aux antioxydants, ils sont

aujourd’hui généralement préférés par les consommateurs. Toutefois, le fait de trouver

communément une substance dans un aliment ne constitue pas une garantie de son absence totale

de toxicité. Les antioxydants synthétiques ont été testés quant à leurs effets carcinogènes ou

mutagènes, mais de nombreux constituants naturels des aliments n’ont pas encore été testés

(PELLI et LYLY, 2003).


13

Figure7- Structures chimiques des antioxydants naturels (EL KALAMOUNI, 2010).


14

I.5.2.3- Antioxydants synergiques

Les antioxydants synergiques sont des substances qui ne sont guère actives en tant

qu'antioxydants, et dont les propriétés apparaissent surtout en présence des autres antioxydants.

Il en est ainsi des lécithines, des acides citrique et tartrique, des acides aminés, de certains

flavonoïdes. Leurs propriétés peuvent s'expliquer par un effet chélatant de métaux comme le fer

ou le cuivre, dont on connaît bien l'effet pro-oxydant à faible dose. Cependant, ce n'est peut-être

pas la seule explication, car plusieurs de ces produits sont d'assez mauvais chélatants. Certains

produits ont un effet inhibiteur de la décomposition des hydroperoxydes, et d'autres semblent

régénérer des antioxydants, comme les tocophérols ou les dérivés de l'acide ascorbique à partir

de leurs formes oxydées. Un exemple d'association d'antioxydants agissant en synergie est

représenté dans le tableau 1.

C'est sans doute à ce groupe des synergistes qu'il faut rattacher les lipoaminoacides étudiés par

MORELLE et al. (MARIE-CLAUDE, 2004), qui trouveraient leurs applications spécifiques en

cosmétologie. Ce sont des sels d'acides aminés basiques comme la lysine et l'arginine avec des

acides gras. Ils sont commercialisés sous le nom de Lysofat®. Le glutathion a également été

proposé en formulation cosmétique (MARIE-CLAUDE, 2004).

I.6- Toxicité des antioxydants

Les antioxydants sont des molécules en général faiblement toxiques. Pourtant, pour

certains d’entre eux, leur utilisation à forte dose n’est pas dénuée de danger. Par exemple, le

radical α-tocophérol (α-TO.) stabilisé par mésomérie, peut initier des réactions d’oxydation avec

les acides gras mono et poly insaturés des phospholipides membranaires (LH, LOOH) à l’origine

de radicaux libres, et peut ainsi contribuer à la phase de propagation des réactions radicalaires

survenant dans la peroxydation lipidique. Ce rôle pro oxydant de l’α-tocophérol en tant

qu’initiateur des réactions radicalaires n’est néanmoins possible que si le radical α-tocophéryl est

présent en forte concentration dans les membranes et que la vitamine C n’assure pas sa

régénération (PASTRE et PRIYMENKO, 2007).


15

Tableau1- Effet synergique de l'association de plusieurs antioxydants (MARIE-CLAUDE,

2004).

CHAPITRE II-

Méthode d’étude d’activité

des antioxydants des

plantes médicinales

Chapitre II- Méthode d’étude d’activité des antioxydants des plantes médicinales

16

L’activité antioxydant ne doit pas être conclue sur la base d'un seul modèle de test

antioxydant. Et en pratique, plusieurs essais in vitro procédures sont menés pour évaluer les

activités antioxydants avec les échantillons d’intérêt. Un autre aspect est qu’antioxydant des

modèles de test varient dans les différents points de vue. Par conséquent, il est difficile pour

comparer une méthode entièrement à autre. Dans une certaine mesure, la comparaison entre

différentes méthodes in vitro a été effectuée par BADARINATH et al. (2010) et NUR ALAM et

al. ( 2013).

Plusieurs méthodes sont utilisées pour la détermination de l’activité antioxydant, nommées

d’après le nom de la substance utilisée comme source de radicaux libres, par exemple : FRAP

(Ferric reducing antioxidant power), ORAC (oxygen radical absorbance capacity), TEAC

(Trolox équivalent antioxidant capacity) ou ABTS (2,2-azinobis 3-ethyl-benzothyazoline 6-

sulphonate) et DPPH+ (2,2- diphényl-1-picrylhydrazyl) etc. Il est à indiquer que différentes

méthodes donnent des résultats assez différents et devraient être appliquées préférentiellement

pour la comparaison de produits similaires (GEORGIEVA et al., 2010).

II.1- Test au DPPH

Le composé chimique 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyle (α,α-diphenylβ picrylhydrazylе)

fut l’un des premiers radicaux libres utilise pour étudier la relation structure-activité antioxydant

des composes phénoliques (BLOIS,1958; BRAND-WILLIAMS et al., 1995). Il possède un

électron non apparie sur un atome du pont, d’azote (Fig. 8) (POPOVICI et al., 2009).

Figure8- Structure chimique du radical libre DPPH• (2,2 DiPhenyle-1-Picryl-Hydrazyle)

(POPOVICI et al., 2009).


17

II.1.1- Principe

La réduction du radical libre DPPH° (2,2’-diphenyle-1-picryl hydrazyl) par un antioxydant

peut être suivie par spectrométrie UV- Visible, en mesurant la diminution de l’absorbance à 517

nm provoquée par les antioxydants (MOLYNEUX, 2004). En présence des piégeurs de radicaux

libres, le DPPH. (2.2 Diphenyl 1 picryl hydrazyl) de couleur violette se réduit en 2.2 Diphenyl 1

picryl hydrazine de couleur jaune (Fig. 9) (MAATAOUI et al., 2006).

Figure9- Réaction de test DPPH (2.2 Diphenyl 1 picryl hydrazyl) (CONGO, 2012).

II.1.2- Dosage

L’activité du piégeage du radical DPPH a été mesurée selon le protocole décrit par

LOPES-LUTZ et al. (2008)(ATHAMENA et al., 2010). 50μl de chaque solution méthanolique

des extraits à différentes concentrations sont ajoutés à 1,95 ml de la solution méthanoïque du

DPPH (0,025g/l). Parallèlement, un témoin négatif est préparé en mélangeant 50μl de méthanol

avec 1,95 ml de la solution méthanolique de DPPH. La lecture de l’absorbance est faite contre un

blanc préparé pour chaque concentration à 515nm après 30 min d’incubation à l’obscurité et à la

température ambiante. Le contrôle positif est représenté par une solution d’un antioxydant

standard; l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les mêmes conditions que les

échantillons et pour chaque concentration (BOUGANDOURA, 2013).


18

Les résultats sont exprimés en tant qu’activité anti-radicalaire ou l’inhibition des radicaux libres

en pourcentages (I %) en utilisant la formule suivante:

I % = [1 – (Abs Échantillon – Abs Contrôle négatif)] x 100

I %: Pourcentage de l’activité anti-radicalaire (AAR%).

Abs Échantillon : Absorbance de l’échantillon.

Abs Contrôle négatif : Absorbance du contrôle négatif (MEDDOUR, 2013).

II.2- Test de la réduction du fer FRAP (Ferric reducing-antioxidant power)

II.2.1- Principe

Le pouvoir réducteur du fer (Fe3+

) dans les extraits est déterminé selon la méthode

décrite par OYAIZ (1986) (BOUGANDOURA, 2013). La méthode de la réduction du fer est

basée sur la réduction de fer ferrique en sel de fer par les antioxydants qui donnent la couleur

bleu (OU et al., 2001) selon la figure 10.

Figure 10- Schéma sur la réaction de test FRAP (Ferric reducing antioxidant power) (PRIOR et

al., 2005).


19

TPTZ : ferric2,4,6-tripyridyl-s-triazine.

Fe2+

: Ions ferreux.

Fe3+

: Ions ferriques (PRIOR et al., 2005).

II.2.2- Dosage

Un millilitre de l’extrait à différentes concentrations (de 0,007à 2,5mg/ml) est mélangé

avec 2,5ml d’une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5ml d’une solution de

ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1%. L’ensemble est incubé au bain-marie à 50°C

pendant 20 min ensuite, 2.5ml d’acide trichloracétique à 10% sont ajoutés pour stopper la

réaction. Les tubes sont centrifugés à 3000 rpm pendant 10min. Un aliquote (2,5ml) de

surnageant est combinée avec 2,5ml d’eau distillée et 0,5ml d’une solution aqueuse de FeCl3

(Chlorure ferrique) à 0,1%. La lecture de l’absorbance du milieu réactionnel se fait à 700 nm

contre un blanc semblablement préparé, en remplaçant l’extrait par de l’eau distillée qui permet

de calibrer l’appareil (spectrophotomètre UV-VIS). Le contrôle positif est représenté par un

standard d’un antioxydant; l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les mêmes

conditions que les échantillons. Une augmentation de l’absorbance correspond à une

augmentation du pouvoir réducteur des extraits testés (SINGLETON et ROSSI, 1965).

Le pourcentage de pouvoir réducteur de fer est calculé par la réaction suivant :

Pouvoir réducteur de fer (%) = [{Ao - A1/ Ao}] × 100.

Ao : est l'absorbance de FeCl3.

A1 : est l'absorbance de FeCl3 solution en présence de l'extrait (GHAISAS et al., 2008).


20

II.3- Méthode de TRAP (Total radical-trapping antioxidant parameter)

II.3.1- Principe

Cette méthode est basée sur la protection fournie par les antioxydants sur la décroissance

de la fluorescence de la R-phycoérythrine (R-PE) au cours d'une réaction de peroxydation

contrôlée. La fluorescence de R-phycoérythrine est désactivée par ABAP (2,2’ - azo-bis (2 -

amidino- propane) de chlorhydrate en tant que générateur de radicaux. Ce stoppage de la réaction

est mesuré en présence d’antioxydants. Le potentiel antioxydant est évalué en mesurant la

décroissance de la décoloration selon GHISELLI et al. (1995) (NUR ALAM et al., 2013).

II.3.2- Dosage

120 µL de l'échantillon dilué est ajouté à 2,4 ml du tampon phosphate (pH 7,4), 375 µL

d'eau distillée, 30 µL de R-PE dilué et 75 µL de ABAP; la cinétique de réaction à 38 Co est

enregistrée pendant 45 min par un spectromètre de luminescence. Les valeurs de TRAP sont

calculée à partir de la longueur de la phase de latence due à l'échantillon par rapport à la norme

(NUR ALAM et al., 2013).

II.4- Réduction du radical- cation ABTS ou détermination du TEAC

II.4.1- Principe

La méthode de radicale ABTS est l'un des tests les plus utilisés pour la détermination de

la concentration des radicaux libres. Il est basé sur la neutralisation d'un radical - cation résultant

de la mono électronique oxydation du chromophore synthétique 2,2'- azino-bis (3 -

éthylbenzothiazoline -6- sulfonique acide) (ABTS•) :

ABTS• ABTS

•+ + e

- .

Cette réaction est suivie par spectrophotométrie par la variation de spectre d’absorption (JIRI et

al., 2010).


21

II.4.2- Dosage

Le radical cation ABTS est généré en mélangeant à volume égal une solution de 3 mM de

persulfate de potassium K2S2O8 et une solution stock d’ABTS à 8 mM, le tout est conservé à

l’abri de la lumière et à la température ambiante durant 16 h avant utilisation (AWIKA et al.,

2004). La solution obtenue est diluée avec du tampon phosphate (0,2 M, pH 7,4) contenant 150

mM de NaCl pour obtenir une absorbance de 1,5 à 734 nm. 2,9 ml de cette solution fraichement

préparée sont ajoutés à 0,1 ml d’extrait et la lecture est faite à 734 nm après 30 min pour chaque

série d’analyses. Le Trolox est utilisé comme standard et le résultat final est exprimé en

micromoles d’équivalent Trolox par gramme de matière sèche (BA et al., 2010).

Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante :

Pourcentage inhibition (%) = [(Abs témoin – Abs blanc)] / (Abs témoin)] x 100

Abs témoin : l'absorbance du radical ABTS+ méthanol.

Abs blanc : l'absorbance de l'échantillon ABTS radical + Extrait / standard (ADEOLU A et al.,

2008).

II.5- Test de blanchissement du β- carotène

II.5.1- Principe

Dans ce test l’activité antiradicalaire des extraits est déterminée en mesurant l’inhibition

de la dégradation oxydatif du β-carotène (décoloration) par les produits d’oxydation de l’acide

linoléique selon la méthode décrite par KARTAL et al (2007) (KOUAMÉ et al., 2009).

II.5.2- Dosage

Brièvement 2 mg de β - carotène ont été dissous dans 1 ml de chloroforme. La solution

obtenue a été introduite dans un ballon contenant 2 mg d’acide linoléique et 200 mg de Tween

40. Après évaporation du chloroforme, 100 ml d’eau distillée saturée en oxygène ont été ajoutés


22

avec agitation vigoureuse. 2.5 ml de la solution obtenu est mélangée avec 350μl de chaque

extrait (2g/l) et du témoin BHT. L’absorbance a été immédiatement mesurée pour le BHT à 490

nm. Les autres lectures sont mesurées à différents intervalles de temps (2h, 4h, 6h, 12h, et48h)

(TEPE et al., 2006).

L’activité anti-oxydante relative après 48 heures est calculée selon la relation suivante :

AAR = (Abs Échantillon/ Abs BHT) x 100

AAR : activité anti-oxydante relative.

Abs Échantillon : absorbance de l’échantillon après 48 heures.

Abs BHT : absorbance du BHT après 48 heures (ATHAMENA et al., 2010).

II.6- Méthode de thiocyanate ferrique (FTC)

II.6.1- Principe

L’activité antioxydant des extraits de plantes est mesurée par l’inhibition de la

peroxydation de l’acide linoléique en utilisant la méthode au thiocyanate ferrique selon la

méthode décrite par TAKAO et al. (1994)(BIDIE et al., 2011).

II.6.2- Dosage

Le mélange réactionnel contenant 0,4 ml d’extraits (100 μg/ml), 0,4 ml d’acide linoléique

(2,52 % dans l’éthanol absolu) et 0,8 ml de tampon phosphate (pH 7,4) est incubé dans un bain-

marie pendant 1 heure à 40 Co. Un aliquote (0,1 ml) de cette solution est alors ajouté au mélange

constitué de 5 ml d’éthanol 70 % et 0,1 ml de thiocyanate ammonium (30 %). Après 3 minutes,

0,1 ml de FeCl2 (Chlorure de fer) préparé dans 3,5 % de HCl (20 mM) est ajouté au milieu

réactionnel. Le blanc est réalisé en remplaçant les extraits par de l’eau distillée l'absorbance du

mélange obtenu (couleur rouge) est mesurée à 500 nm toutes les 24 h jusqu'à ce que l’absorbance

du témoin atteint son maximum. L'antioxydant standard (concentration finale de 0,02 % p/v) est


23

utilisé comme contrôle positif, et le mélange sans l'échantillon est utilisé comme contrôle négatif

(NUR ALAM et al., 2012).

Le pourcentage d’inhibition de la peroxydation lipidique est alors calculé selon l’équation

suivante:

Inhibition (%) = (1- (DO essai/ DO blanc)) x 100

DO blanc : densité optique du blanc.

DO essai : densité optique d'échantillon (BIDIE et al., 2011).

II.7- Piégeage du radical superoxyde (O2·-)

II.7.1- Principe

Cet essai évalue la capacité d’un produit à capter un radical libre, l’anion superoxyde O2·.

Ce radical est généré in vitro par le système hypoxanthine/xanthine oxydase.

Dans cette méthode, le radical réduit le NBT2+

(Nitro-Blue Tétrazolium) de couleur jaune, en

bleu de formazan de couleur pourpre qui absorbe à 560 nm. Ainsi un composé antioxydant

capable de capter l’anion superoxyde empêchera la formation du bleu de formazan et la solution

restera jaune. Les absorbances obtenues permettent de calculer un pourcentage d’inhibition de la

réduction du NBT2+

par rapport à un témoin constitué du milieu réactionnel dépourvu de

composé antioxydant. On peut ensuite tracer une courbe représentant le logarithme du

pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de composé testé, et déterminer la CI50

(concentration inhibant 50% de l’activité) du composé (PAREJO et al., 2002).

III.7.2- Dosage

Le piégeage du radical superoxyde (O2·-) peut être effectué par un mélange de tampon

phosphate 50 mM (pH 7,5) contenant de l'EDTA (Ethylene diamine tetraacetic) (0,05 mM),

hypoxanthine (0,2 mM), 63 µL NBT( Nitro-Blue Tétrazolium) (1mM), 63 µL de l'extrait aqueux

ou éthanolique (eau distillée pour la contrôle), et 63 de l' µL xanthine oxydase (1,2U/µL).


24

La xanthine d'oxydase a été ajoutée en dernier. Le taux de la réduction du NBT a été déterminé

par la lecture de l'absorbance spectrophotométriques à 560 nm (PAREJO et al., 2002).

Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la NBT par rapport au tampon selon

la formule suivant :

(Cabs-CBabs) - (Sabs-SBabs)

Inhibition % = ×100

(Cabs - CBabs)

Cabs : L’absorbance de l’échantillon.

CBabs : L’absorbance du blanc.

Sabs : L’absorbance de témoin.

SBabs : L’absorbance du blanc de témoin (PAREJO et al., 2002).

II.8- Test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)

II.8.1- Principe

La mesure ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) permet de déterminer si une

source organique possède un effet antioxydant en le comparant à un analogue de la vitamine E :

le trolox. Dans cet essai, l’AAPH (2.2’-azobis-2-aminopropane dihydrochloride) est utilisé

comme source génératrice de radicaux peroxyles. L’addition de fluorescéine comme sonde

fluorescente permet de quantifier, à l’aide d’une analyse spectrophotométrique, en fonction du

temps, la perte de fluorescence associée à la réaction avec les radicaux libres fournit par l’AAPH

par un mécanisme de transfert d’atome d’hydrogène. La présence d’antioxydants empêche ou

ralenti la perte de fluorescence qui est calculée par l’aire sous la courbe en fonction du temps.

Celle-ci peut être détectée à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et d’émission de 520

nm. Il s’agit donc d’une méthode permettant de mesurer la capacité antioxydant contre les

radicaux peroxyles (OU et al., 2001). Lorsqu’un capteur de radicaux libres est incorporé dans le


25

milieu, les radicaux libres sont captés, et la fluorescence persiste, donnant ainsi une idée précise

du pouvoir anti-radical libre, donc antioxydant de l’échantillon (ROLLAND, 2004).

(AUC échantillon- AUC blanc) x (molarité du standard)

Valeur relative ORAC =

(AUC standard-AUC blanc) x (molarité de l’échantillon)

AUC = Aire sous la courbe (ROLLAND, 2004).

II.8.2- Dosage

Ce dosage est basé sur la génération de radicaux libres en utilisant AAPH (2,2 -azo-bis

-2 amidopropane dichlorhydrate) et mesure de la diminution de la fluorescence en présence des

capteurs des radicaux (PIRIOR et al., 2003). Dans cet essai, β-phycoérythrine (β -PE) a été

utilisé comme piégeages des radicaux libres cible, AAPH comme un radical peroxyle générateur

et Trolox comme un contrôle standard. après addition de AAPH à la solution d’essai, la

fluorescence est enregistrée et l'activité antioxydant est exprimée en équivalent Trolox (CAO et

al., 1993 ; FREI et al., 1990).

Le dosage peut être effectué selon la PIRIOR et al. (2003) dans des plaques à 96 puits de

fluorescence de polypropylène avec un volume finale de 200 µL. Les analyses sont effectuées à

pH 7,0 avec de Trolox (6,25, 12,5, 25, et 50 µmol/ L pour les dosages lipophiles ; 12,5, 25, 50 et

100 µmol /L pour les dosages lipophiles hydrophile) et 75 mM / L du tampon phosphate comme

le blanc. Après l'addition de l'AAPH, la plaque est placée immédiatement dans un compteur à

Multilabel préchauffé à 37 C°. La plaque est agitée pendant 10 s et la fluorescence est lue à des

intervalles de 1 min pour 35 min à la longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une longueur

d'onde d'émission de 520 nm. L'aire sous la courbe est calculée pour chaque échantillon en

utilisant le logiciel Wallac Workout 1.5. Le calcul final des résultats a été déterminé dans la

partie linéaire de la courbe du - désintégration entre blanc et de l'échantillon et / ou standard

(Trolox). Les résultats sont exprimés en LM d'équivalents Trolox (TE) par g de poids sec de

l'échantillon (IM TE / g) (NUR ALAM et al., 2012).


26

II.9- Piégeage du peroxyde d’hydrogène (H2O2 scavenging activity)

Le peroxyde d'hydrogène est un dérivé non-radicalaire d’oxygène et considéré comme

toxique pour les cellules car il permet la formation des radicaux hydroxyles à l'intérieur de la

cellule (SHRINIVAS et al., 2011).

II.9.1- Principe

Une des méthodes les plus communes pour évaluer la capacité du piégeage du peroxyde

d’hydrogène est basée sur l’absorption de cette molécule dans le domaine de l’UV.

Comme la concentration de H2O diminue par les composés piégeurs, la valeur d’absorbance de

ce dernier à 230nm diminue également. Néanmoins il est tout à fait normal que les échantillons

absorbent également à cette longueur d’onde, exigeant ainsi l’exécution d’une mesure blanc

(MALGALHAES et al., 2008).

II.9.2- Dosage

Le piégeage du peroxyde d'hydrogène (H2O2) peut être déterminé par la méthode décrite

par RUCH et al. (1989). Une solution de H2O2 (10 mM) a été préparée dans un tampon

phosphate (pH 7,4). Le mélange réactionnel est composé de 10 mM de H2O2 et de différentes

concentrations d'échantillons. Les valeurs d'absorbance ont été mesurées à 0 min et après 60 min

à 240nm. L'acide ascorbique a été utilisé comme standard (BUMRELA et NAIK, 2011).

Le pourcentage de piégeage de H2O2 de l’extrait a été calculé d'après la formule suivante :

L’activité de piégeage des radicaux libres H2O2 (%) = [{Ao - A1/ Ao}] × 100.

Ao : l'absorption de H2O2.

A1 : l'absorbance de H2O2 en présence de l'extrait (GHAISAS et al., 2008).


27

II.10- Méthode de la xanthine oxydase

II.10.1- Principe

Cette méthode est basée sur l'inhibition de XO (xanthine oxydase) qui conduit une

diminution de la production d'acide urique, qui a été déterminée par spectrophotométrie. Tous

les extraits ont inhibé les activités XO d'une manière dépendante de la dose ( OSKOUEIAN et

al., 2011).

II.10.2- Dosage

L'extrait (500 µL de 0,1 mg/ml) et allopurinol (100µ g/ml) (dans le méthanol) sont

mélangés avec 1,3 ml du tampon phosphate (0,05 M, pH 7,5) et 0,2 ml de 0,2 unités/ ml de

solution de xanthine oxydase. Après 10 min d'incubation à la température ambiante (25 C°), 1,5

ml de substrat de la solution de xanthine de 0,15 M est ajoutée à ce mélange. Le mélange est à

nouveau incubé pendant 30 min à température ambiante (25 C°), puis l’absorbance est mesurée

à 293 nm en utilisant un spectrophotomètre contre le blanc (0,5 ml de méthanol, de 1,3 ml du

tampon phosphate et 0,2 ml de la xanthine oxydase). La solution de mélange de 0,5 ml de

méthanol, 1,3 ml du tampon phosphate, de 0,2 ml de la xanthine oxydase et 1, 5 ml du substrat

de xanthine est utilisé comme témoins (NUR ALAM et al., 2012).

Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante :

Pourcentage d’inhibition = 1- (As/Ac) 100

As : Absorbance de l'échantillon d'essai.

Ac : Absorbance de l'échantillon de contrôle (NUR ALAM et al., 2012).

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=fr&prev=/search%3Fq%3Dprincipe%2Bde%2Btest%2Bxanthine%2Boxidase%2Bd%2527antioxydant%26newwindow%3D1%26site%3Dwebhp&rurl=translate.google.dz&sl=en&u=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/%3Fterm%3DOskoueian%2520E%255Bauth%255D&usg=ALkJrhjv7Cw_9I_QBfuPoOud5WE9WkZ8Sg


28

II.11- Chélation du fer

II.11.1- Principe

La capacité chélatrice des extraits des plantes est déterminée selon la méthode de LE et

ses collaborateurs (2006). La méthode est basée sur l’inhibition de la formation du complexe

Fe(II)-Ferrosine après le traitement des échantillons avec les ions Fe2+

(BENBRINIS, 2012).

II.11.2- Dosage

500 µl des solutions d’extraits ou du chélateur standard (EDTA) à différentes

concentrations sont additionnées à 100 µl de chlorure de fer (FeCl) (0.6 mM) et 900 µl de

méthanol. Après 5 min d’incubation, cent microlitres de ferrosine (5 mM) sont ajoutés, et le

mélange est agité et laissé réagir pendant 10 min pour permettre la compléxation du fer résiduel.

L’absorbance du complexe Fe2+

-ferrosine est mesurée à 562 nm (BENBRINIS, 2012).

L’activité chélatrice est exprimée en pourcentage en utilisant l’équation ci-dessous:

Activité chélatrice (%) = [(Ac- At)/ Ac] x100

Ac : absorbance du standard.

At : absorbance de l'échantillon (BENBRINIS, 2012).

II.12- Méthode de DEPG (N,N-dimethyl-p-phenylene diaminedihydrochloride)

II.12.1- Principe

Cette méthode est basé sur la réduction de couleur de la solution tamponnée de DEPG

dans un tampon acétate et le chlorure ferrique. La procédure implique la mesure de la diminution

de l'absorbance de DEPG en présence d'accepteurs avec maximum d’absorption de 505 nm.

L'activité a été exprimée en pourcentage de réduction de DEPG (NUR ALAM et al., 2012).


29

II.12.2- Dosage

Le dosage peut être effectué selon la méthode de FOGLIANO et al. (1999) par un

mélange de 1 ml de solution de DEPG (200 mM), de 0,4 ml de chlorure ferrique (III) (0,05 M),

et de 100 ml d'une solution tampon d'acétate de sodium à 0,1 M, en modifiant le pH à 5,25. Le

mélange à être maintenu dans l’obscurité, sous réfrigération, et à une température basse (4-5 C°).

La réaction a lieu lorsque 50 µL de l’échantillon (une dilution de 1:10 dans de l’eau) est ajouté à

950 µL de solution de DMPD.+

. L'absorbance est mesurée après 10 min d'agitation continue, qui

est le temps pris pour atteindre constante les valeurs de décoloration. Les résultats sont quantifiés

en mm Tolox sur la courbe d'étalonnage correspondante (NUR ALAM et al., 2012).

II.13- Test qualitatif au β-carotène

II.13.1- Principe

Ce test permet de mettre en évidence le pouvoir antioxydant des extraits. En effet, l’acide

linoléique oxydé en radical peroxyle agit sur le β-carotène de couleur orange qui devient

incolore. La présence d’antioxydant dans l'extrait de plante par exemple inhibe cette décoloration

dans le milieu gélosé (GRAVEN et al., 1992).

II.13.2- Dosage

Préparer le milieu gélosé, dans un bécher, en dissolvant 0,75 % (masse/volume) d’agar

dans l’eau distillée; chauffer en agitant sur une plaque chauffante. Laisser refroidir jusqu’à

environ 50C°, y transvaser 7,5 ml de solution acétonique de β-carotène (1 mg/ml) et 1,5 ml de

solution éthanolique d’acide linoléique (5 μl ml d’éthanol); couler dans des boites pétri; laisser

solidifier puis creuser des puits et y verser 30 μl de chaque extrait (1mg/ml). Laisser incuber 3 à

4 h à 45C°. Dans des boites témoins les extraits sont remplacés par la quercétine et le BHT

(témoins positifs), l’éthanol (témoins négatifs).

Une zone de rétention de la couleur orange autour des puits indique l’activité antioxydant des

extraits (BELHATTAB, 2007).


30

II.14- Pouvoir réducteur

II.14.1- Dosage

Les mélanges réactionnels ont été préparés par addition de 2,5 ml du tampon phosphate

(0,2 M, pH 6,6) à 2,5 ml de potassium Ferricyanide (1%) et les extraits de concentration variable

(40-200 mg). Ces mélanges sont incubés dans un bain marie pendant 30 minutes à 50C°. Après

refroidissement à température ambiante (28C°), 2,5 ml de TCA (acide trichloracétique) à 10%

est ajouté à chaque mélange réactionnel, puis centrifugé à 2000 rpm pendant 10 min. Le

surnageant (2,5 ml) a été déposé dans un tube à essai et mélangé avec 2,5 ml d'eau distillée et 0,5

ml FeCl3 (0,1%) et laissé réagir pendant 10 min à température ambiante. L'absorbance a été

mesurée à 700 nm. L'acide ascorbique (ASA) a été utilisé comme standard (PISE et al., 2010).

II.15- Test de blanchiment de β-carotène couplé à l’auto-oxydation de l’acide linoléique

II.15.1- Principe

Le test de blanchiment de β-carotène couplé à l’auto-oxydation de l’acide linoléique est

une méthode rapide basée principalement sur le principe que l'acide linoléique, qui est un acide

gras insaturé, s'oxyde par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) produits par l'eau oxygénée.

Le produit formé lancera l'oxydation du β-carotène, ce qui conduira à la décoloration. Les

antioxydants diminuent le degré de décoloration, qui est mesurée à 434 nm (NUR ALAM et al.,

2013).

II.15.2- Dosage

La méthode de KABOUCHE et al. (2007) consiste à mélangé la β-carotène (0,5 mg) dans

1 ml de chloroforme avec 25 µL de l'acide linoléique et 200 mg de Tween-80. Le chloroforme

est évaporé à 40 C°. 100 ml d'eau distillée saturée avec de l'oxygène est lentement ajouté au

résidu et la solution est agitée vigoureusement pour former une émulsion stable. 4 ml de ce

mélange est ajouté dans les tubes à essai contenant 200 µL de l'échantillon préparé dans le

méthanol à des concentrations finales (25, 50, 100, 200 et 400 µg / ml). Dès que la solution

émulsionnée est ajouté aux tubes, l'absorbance de temps 0 est mesuré à 470 nm. Les tubes sont


31

incubés pendant 2 heures à 50 C°. La vitamine C peut être utilisé comme standard (NUR ALAM

et al., 2013).

L'activité antioxydant est calculée en pourcentage d'inhibition (I %) par rapport au témoin en

utilisant l'équation suivante:

I% = [1- (As-As120)/ (Ac-Ac120)]

As : Absorbance initiale de l'échantillon.

As120: Absorbance de l'échantillon à 120 min.

Ac : Absorbance initiale du témoin négatif.

Ac120: Absorbance du témoins négatif à 120 min (NUR ALAM et al., 2013).

II.16- Capacité antioxydant totale (TAC)

II.16.1- Principe

La capacité antioxydant totale (TAC) des extraits des plantes est évaluée par la méthode

de Phosphomolybdène. Cette technique est basée sur la réduction de molybdène Mo (VI) présent

sous la forme d’ions molybdate MoO42-

à molybdène Mo (V) MoO2+

en présence de l’extrait

pour former un complexe vert de phosphate/ Mo(V) à pH acide (PRIETO et al.,1999).

II.16.2- Dosage

Un volume de 0.3 ml de chaque extrait méthanolique est mélangé avec 3 ml de solution

du réactif (0.6 M acide sulfurique, 28 mM de phosphate de sodium et 4 mM de molybdate

d’ammonium). Les tubes sont vissés et incubés à 95C° pendant 90 min. Après refroidissement,

l’absorbance des solutions est mesurée à 695 nm contre le blanc qui contient 3 ml de la solution

du réactif et 0.3 ml du méthanol et il est incubé dans les mêmes conditions que l’échantillon. La

capacité antioxydant totale est exprimée en milligramme équivalents d’acide ascorbique par

gramme de la matière sèche (mg EAA/ g MS) (PRIETO et al., 1999).


32

II.17- Procédé de puissance de réduction (RP)

II.17.1- Principe

Cette méthode est basée sur le principe d'augmentation de l’absorbance des mélanges

réactionnels. L'augmentation de l'absorbance indique une augmentation de l’activité antioxydant.

Dans ce procédé, l'antioxydant forme un complexe coloré avec ferricyanure de potassium, l'acide

acétique et le chlorure ferrique trichloro, l'absorbance du complexe est mesurée à 700 nm.

L'augmentation de l'absorbance de mélange réactionnel indique le pouvoir réducteur des

échantillons (JAYAPRAKASH et al., 2001).

II.17.2- Dosage

Dans la méthode décrite par OYAIZU (1986), 2,5 ml du tampon phosphate de 0,2 M (pH

6,6) et 2,5 ml de K3Fe (CN)6 (1 % massa/volume) sont ajoutés à 1,0 ml d'échantillon dissous

dans de l'eau distillée. Le mélange résultant est incube à 50C° pendant 20 min, suivi par

l'addition de 2,5 ml d'acide acétique trichloro (10 % massa/volume). Le mélange est centrifugé à

3000 rpm pendant 10 minutes. La couche supérieure de la solution (2,5 ml) est mélangée avec

l'eau distillée (2,5 ml) et 0,5 ml de FeCl3 (0,1 % massa/volume). L'absorbance est alors mesurée

à 700 nm contre le blanc (NUR ALAM et al., 2012).

II.18- Piégeage du radical hydroxyle

Le radical hydroxyle (OH°) est un radical libre extrêmement réactif formé dans les

systèmes biologiques à partir d’anion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène en présence des

ions métalliques comme le fer et le cuivre suivant la réaction de HABER WEISS (CASTRO et

FREEMAN, 2001). Ce radical possède un électron libre avec un potentiel de réduction plus

élevé (2310 mV) lui permet de réagir avec les lipides, les protéines les polypeptides et l’ADN

particulièrement la thiamine et la guanine (SIDDHURAJU et BECKER, 2007).


33

II.18.1- Dosage

La méthode de désoxyribose adoptée dans cette étude :

Le mélange réactionnel contient les réactifs suivants : 0,4 ml de la solution tampon phosphate

(50 mmol/ l, pH 7.4), 0,1 ml de l’extrait à différentes concentrations, 0,1 ml de l’EDTA (1.04

mmol/l), 0,1 ml de FeCl (1 mmol/l) et 0,1 ml de 2-désoxyribose (60 mmol/l). La réaction est

commencée par l’addition de 0.1 ml de l’acide ascorbique (2 mmol/l) et 0.1 ml de H2O2 (10

mmol/l). Après l’incubation à 37C° pendant 1 heure, 1 ml de l’acide thiobarbutirique (TBA)

(10g/l) est ajouté dans le milieu réactionnel suivi par 1 ml de l’acide chlorhydrique (HCl) (25%).

Les mélanges sont placés au bain marie à 100C° pendant 15 min puis sont refroidits avec de

l’eau. L’absorbance des solutions est mesurée à 532 nm avec le spectrophotomètre contre le

blanc. La capacité du piégeage du radical hydroxyle est évaluée comme le pourcentage

d’inhibition de l’oxydation de 2-désoxyribose par les radicaux hydroxyles (HALLIWELL et al.,

1987).

Le pourcentage du piégeage est calculé en basant sur la formule suivante :

Pourcentage de piégeage (%) = [A0 – (A1-A2)] ×100/A0

A0 : l’absorbance du contrôle sans extrait.

A1 : l’absorbance après l’addition de l’extrait et de désoxyribose.

A2 : l’absorbance de l’extrait sans désoxyribose.

Le contrôle positif utilisé est celui du BHA (HALLIWELL et al., 1987).

II.19- Peroxydation de l’acide linoléique

II.19.1- Principe

L’activité antioxydant des extraits de plantes est mesurée par l’inhibition de la

peroxydation de l’acide linoléique en utilisant la méthode au thiocyanate ferrique, selon la

méthode décrite par TAKAO et al. (1994) (BIDIE et al., 2011).


34

II.19.2- Dosage

Premièrement, une émulsion de l’acide linoléique est préparée en mélangeant 0,028 g

d’acide linoléique, 0,028 g de Tween 20 et 10 ml de solution tampon phosphate (0,04 M, pH

7.0). Le milieu réactionnel contient 600 µl de solutions d’extraits ou de l’antioxydant standard

(BHT) à une concentration bien définie (50µg/ml) et 600 µl de l’émulsion de l’acide linoléique.

Le contrôle négatif contient tous les réactifs sauf l’échantillon à tester (extraits ou antioxydant

standard) qui est remplacé par un volume égal de la solution tampon. Après agitation, le mélange

est incubé à 25C° à l’obscurité. La lecture est faite après 15 min d’incubation puis chaque 24

heures pendant 96 heures, en mélangeant 1ml d’éthanol, 20 µl KCN, 20 µl d’échantillon et 20 µl

de FeCl2 et après 3min, l’absorbance est lue à 500 nm contre un blanc d’éthanol (GULCIN,

2005).

Le pourcentage d’inhibition de la peroxydation lipidique est calculé selon l’équation suivante:

% d’inhibition de peroxydation = [(Ac - At)/ Ac] x100

Ac: absorbance du contrôle.

At: Absorbance du test (BENBRINIS, 2012).

II.20- Procédé de phosphomolybdène

II.20.1- Principe

Ce procédé est une méthode spectroscopique pour la détermination quantitative de la

capacité antioxydant, par la formation d'un complexe de phosphomolybdène. Le dosage est basé

sur la réduction de Mo (VI) en Mo (V) par l'analyse de l'échantillon et la formation subséquente

d'un vert phosphate Mo (V) complexe à pH acide. Antioxydant totale capacité peut être calculé

par la méthode décrite par PRIETO et al. (1999) (NUR ALAM, 2013).


35

II.20.2-Dosage

Mettre 0,1 ml de l'échantillon (100 µg) solution est combiné avec 1 ml de réactif (0,6 M

d'acide sulfurique, 28 mM sodium phosphate et mM de molybdate d'ammonium 4). Le tube est

coiffé et incubé dans un bain d'eau bouillante à 95C° pendant 90 min. Après refroidissement de

l'échantillon à la température ambiante, l'absorbance de la solution aqueuse est mesurée à 695

nm contre blanc dans spectrophotomètre UV. Une solution à blanc typique contenue 1 ml de

solution de réactif et le cas échéant le même volume de solvant utilisé pour l'échantillon et on

l'incube dans les mêmes conditions que reste de l’échantillon. Pour les échantillons de

composition inconnue, la capacité antioxydant peut être exprimée en équivalents d’α- tocophérol

(NUR ALAM, 2013).

II.21- Test mesurant l’activité antioxydant au moyen de caroténoïdes

II.21.1- Dosage

Il s’agit de déposer des extraits purs à tester sur une plaque CCM de gel de silice GF254 en

aluminium et développées dans les systèmes de solvants appropriés. Après séchage, gicler la

plaque avec une solution chloroformique à 0,5 mg/ml de ß-carotène. La plaque CCM est ensuite

exposée sous une lampe UV à 254 nm jusqu’à décoloration de la plaque. Les zones antioxydants

apparaissent en jaune sur fond blanc. Il faut faire particulièrement attention aux substances déjà

colorées en jaune, car elles peuvent donner de faux positifs (CHEICK TRAORE, 2006).

II.22- Activité de piégeage de l'oxyde nitrique

II.22.1- Principe

L'activité de piégeage de l'oxyde nitrique peut être mesurée par la réaction de GRIESS

décrite par GREEN et al (1982) (NUR ALAM et al., 2012).


36

II.22.2- Dosage

Le mélange réactionnel contenant 4 ml de nitropruside de sodium à 10 mM, de 1 ml d'une

solution saline du tampon phosphate (pH 7,4) et 1 ml de l’extrait à (0.1875-3mg/ml), l'acide

ascorbique ou le BHT ont été incubées à 25 o C pendant 150 min. Après incubation, 0,5 ml de

réactif de GRIESS (1% de sulfanilamide, 2% Ophosphoric et 0,1% d'acide NEDD) a été ajoutée

en 0,5 ml de mélange réactionnel. Le mélange est incubé à l'abri de la lumière pendant 30

minutes. L'absorbance est mesuré à 535 nm contre le blanc (BUMRELA et NAIK, 2011).

Le pourcentage d’inhibition est calculé par la formule suivant:

I(%) = [A1-A2/A2] x 100

A1 : absorbance sans extrait.

A2 : absorbance avec de l'extrait (BUMRELA et NAIK, 2011).

CONCLUSION

Conclusion

37

Les antioxydants ont un rôle bénéfique pour la santé grâce à la protection contre les

vieillissements, réduisent les risques de cancers et de maladies cardio-vasculaires…

Les principales méthodes d’évaluation du potentiel antioxydant des plantes médicinales ont

été examinées et regroupées selon leurs principes.

Le test DPPH+ (2,2 DiPhenyle-1-Picryl-Hydrazyle) est basé sure la mesure de la capacité de

piégeage de radicaux à l’aide de radical stable DPPH. Le test FRAP (Ferric reducing

antioxidant power) est basé sur la réduction de fer ferrique en sel de fer par les antioxydants.

Le paramètre d’antioxydant total de piégeage des radicaux (TRAP) est basé sur la protection

fournie par les antioxydants sur la décroissance de la fluorescence de la R-phycoérythrine (R-

PE). Le test ABTS (2,2-azinobis 3-ethyl-benzothyazoline 6-sulphonate) est basé sur

neutralisation d’un radical cationique ABTS.+

. Le test de blanchissement du β-carotène est

déterminé en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydatif au β-carotène. La méthode de

thiocyanate ferrique (FTC) est mesurée par l’inhibition de la peroxydation de l’acide

linoléique. Le piégeage du radical superoxyde (O2.-) (SRSA) est évalué la capacité d’un

produit à capter un radical libre ; l’anion superoxyde. Le test ORAC (Oxygen Radical

Absorbance Capacity) permet de déterminer si une source organique possède un effet

antioxydant en le comparant à un analogue de la vitamine E. Le piégeage du peroxyde

d’hydrogène (H2O2 scavenging activity) pour permet l’évaluation de la capacité du piégeage

du peroxyde d’hydrogène est basée sur l’absorption de cette molécule dans le domaine de

l’UV. La méthode de la xanthine oxydase est basée sur l'inhibition de la XO (Xanthine

oxydase) a qui conduit à une diminution de la production d'acide urique, qui a été déterminée

par spectrophotométrie. La méthode de DEPG (N,N-dimethyl-p-phenylene

diaminedihydrochloride) est basée sur la réduction de solution tamponnée de DEPG . Le test

qualitatif au β-carotène permet de mettre en évidence le pouvoir antioxydant des extraits. En

effet, l’acide linoléique oxydé en radical peroxyl agit sur le β-carotène de couleur orange qui

devient incolore. La présence d’antioxydant dans l'extrait de plante par exemple inhibe cette

décoloration dans le milieu gélosé. Pouvoir réducteur les extraits étaient déterminés pour leur

réduction de la puissance de modifier. Le test de blanchiment de β-carotène couplé à l’auto-

oxydation de l’acide linoléique est principalement basé sur le principe que l'acide linoléique

La chélation de fer est basée sur l’inhibition de la formation du complexe Fe(II)-Ferrosine. La

capacité antioxydant totale (TAC) est évaluée par la méthode de Phosphomolybdène. Le

piégeage du radical hydroxyle (OHo) est basé sur la capacité des substances à piéger le radical

hydroxyle est souvent évaluée par le pourcentage d’inhibition de la réaction du radical OH•

Conclusion

38

avec une molécule détectrice. La peroxydation de l’acide linoléique est déterminée selon la

méthode de thiocyanate ferrique .Le procédé de phosphore molybdène est basé sur la

détermination quantitative de la capacité antioxydant, par la formation d'un complexe de

phosphomolybdène. Le procédé de réduction est basé sur le principe d'augmentation de

l’absorbance des mélanges réactionnels. L'augmentation de l'absorbance indique une

augmentation de l’activité antioxydant.

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Study of antioxidant activity of medicinal plants methods

Summary

The antioxidant activity of medicinal plants is measured either by assaying the products formed ( in particular

hydroperoxides) by photometric techniques of varying direct or through measuring the efficiency of the compound to

scavenge free radicals .The main methods for assessing the activity of medicinal plants are : ORAC ( oxygen radical

absorbance capacity) , TEAC ( Trolox equivalent antioxidant capacity) or ABTS (2,2- azinobis 3 -ethyl- 6 -sulphonate

benzothyazoline ) and DPPH+ ( 2,2 - diphenyl-1 - picrylhydrazyl ) by these methods different mechanisms reduce the

free radicals by the antioxidants : singlet by electron transfer or by hydrogen transfer.The ABTS.+

Methods,

decolorization Assay ( or TEAC ) DPPH and is based on the electron transfer singlet , while the ORAC method is based

on the transfer of a hydrogen atom .

Key words: antioxidant activity, medicinal plants, photometric techniques, scavenging free radicals.

طرق دراست نشاطيت مضاداث األكسذة للنباتاث الطبيت

ملخص

مه خالل انتمىياث انضىئيت متفاوتت (hydroperoxydesخاصت )يتم تمذيش وشاطيت مضاداث األكسذة نهىباتاث انطبيت إما عه طشيك انمىتجاث انمشكهت

. انمباشش أو مه خالل لياس فعانيت انمشكب إلصاحت انجزوس انحشة

: انطشق انشئيسيت نتمييم انىشاط نهىباتاث انطبيت هي

ORAC (oxygen radical absorbance capacity), TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) -ABTS (2,2-azinobis 3 أو

ethyl- benzothyazoline 6-sulphonate) و DPPH+ (2,2- diphényl-1-picrylhydrazyl).

. مه خالل ومم انهيذسوجيه طشق إسجاع انجزوس انحشة بمضاداث األكسذة ودنك بإعطاء إنكتشون أوو تختهف هزي انطشق مه خالل

بيىما طشق إسجاع انجزوس انحشة بمضاداث األكسذة ودنك بإعطاء إنكتشون، تستىذ عهى DPPHو ABTS( :Decolorization Assay (ou TEAC)) طشيمت

. تستىذ عهى ومم رسة انهيذسوجيهORACطشيمت

. وشاطيت مضاداث األكسذة ،انىباتاث انطبيت ، انتمىياث انضىئيت ، إصاحت انجزوس انحشة: الكلماث المفتاحيت

Méthodes d’études d’activité des antioxydants des plantes médicinales

Résumé

L’activité antioxydant des plantes médicinales est évaluée soit par le dosage des produits formés (en particulier des

hydroperoxydes) par des techniques photométriques plus ou moins directes, soit par la mesure de l’efficacité du

composé à piéger des radicaux libres.

Les principales méthodes d’évaluation de l’activité des plantes médicinales sont : ORAC (oxygen radical absorbance

capacity), TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) ou ABTS (2,2-azinobis 3-ethyl-benzothyazoline 6-sulphonate)

et DPPH+ (2,2- diphényl-1-picrylhydrazyl). Ces méthodes se différentent par les mécanismes de réduction des radicaux

libres par les antioxydants: par transfert d’électron ou par transfert d’atome d’hydrogène. Les méthodes ABTS.+

,

Decolorization Assay (ou TEAC) et DPPH sont basées sur le transfert l’électron, alors que la méthode ORAC sont basée

sur le transfert d’un atome d’hydrogène.

Mots clés : activité antioxydant, plantes médicinales, techniques photométriques, piégeage des radicaux libres.

Documents

Projet de Fin d’Etudes En vue de l’obtention du diplôme ... · existe un système de défense, le système antioxydatif. Ce réseau d’antioxydants, enzymatiques