TP : Enzymologieaeibiauri.free.fr/Files/80_compte_rendu_tp_enzymologie.doc · Web viewTP : Enzymologie L’objectif de ces TP est de se familiariser avec les réactions enzymatiques

TP : Enzymologie

L’objectif de ces TP est de se familiariser avec les réactions enzymatiques et d’avoir un support pratique au cours d’enzymologie. Nous aurions dû pendant les 8 heures imparties réaliser 3 TP, un sur l’activité de l’invertase, un sur l’effet d’un inhibiteur et le dernier sur les potentiels redox. Or le polarimètre étant tombé en panne lors d’un des premiers TP nous ne pourrons faire que les deux dernières manipulations.

Le travail de préparation des solutions nécessaires à la réalisation des TP étant long nous divisons notre groupe de 13 en deux de façon à ce que chaque groupe prépare les réactifs en prenant en compte le fait que le second groupe utilisera pour ses mesures les préparations du premier groupe.

Manipulation 1 : Potentiel redox et sens d’une réaction d’oxydoréduction.

On vise ici à s’assurer de la véracité des équations de Nernst dans un premier temps, et d’observer le sens dans lequel une réaction d’oxydoréduction se déroule en fonction des composés en présence dans un second temps.

Pour cela nous allons préparer différentes solutions, mesurer leur potentiel redox, les comparer avec les résultats théoriques donnés par les équations de Nernst, puis déterminer la fiabilité de ces calculs. Ensuite nous allons mélanger différentes solutions à des concentrations différentes pour voir dans quel sens celle-ci évolue.

Une seule réaction sera le thème de l’étude :

LDHPyruvate + NADH + H+ L-Lactate + NAD+

*Préparation des solutions :

La réaction est réversible, elle passe donc par un équilibre et de ce fait nous ne préparerons pas des solutions pures de réactifs mais contenant les deux molécules du couple à des concentrations différentes. On aura donc deux types de solutions, celles contenant du Pyruvate et du L-Lactate, et celles contenant du NADH + H+ et du NAD+. On a besoin pour chaque type de solutions de concentrations en réactifs différentes, une des deux solutions sera donc équimolaire, et dans la seconde l’une des molécules sera présente à une concentration 100 fois supérieure à l’autre. On va donc obtenir 4 types de solutions :

-Solution A : NAD+ (0,1 mM) + NADH+H+ (0,1 mM)-Solution B : NAD+ (10 mM) + NADH+H+ (0,1 mM)-Solution C : Pyruvate (0,1 mM) + L-Lactate (0,1 mM)-Solution D : Pyruvate (0,1 mM) + L-Lactate (10 mM)

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Note : Dans les solutions B et D on a choisi respectivement le NAD+ et le L-Lactate à des concentrations plus élevées, et ce de façon à observer une réaction ayant une cinétique pratiquement nulle. Si nous avions choisi NADH+H+ et le Pyruvate la réaction aurait été tellement rapide qu’il se peut qu’elle ait atteint saturation donc nous n’aurions rien pu quantifier quant à son sens ni à sa vitesse.

On doit préparer ces 4 solutions à partir de composés solides de Sodium Pyruvate, Sodium Lactate, NAD+ et NADH + H+.

Sur chaque flacon on peut lire les indications suivantes :

-NADH + H+ : 709,4 g/mol, 98% pureté-NAD+ : 685,4 g/mol, 95 % pureté-Sodium pyruvate : 110,04 g/mol, 99% pureté -Sodium L.Lactate : 112,06 g/mol, 98 % pureté

Nous aurons besoin d’environ 10 mL de chaque solution pour mesurer le potentiel redox (l’autre groupe pourra mesurer le potentiel dans le même bécher que nous) et quelques mL de plus pour les mesures du sens de la réaction. Nous préparerons donc 24 mL de chacune, ce qui nous paraît être un bon compromis afin d’être sur d’avoir assez de réactifs pour toutes les mesures de chaque groupe tout en ne gâchant pas trop de produits. Dans un premier temps, il nous faudra préparer des solutions ne contenant qu’un seul type de molécules, afin de n’avoir à dissoudre qu’un seul composé solide à la fois. On va donc préparer des solutions à des concentrations deux fois plus importantes que ce que l’on doit avoir au final de façon à avoir simplement à mélanger les mêmes volumes de chacune pour obtenir les solutions finales aux concentrations désirées. Pour ce qui est du NAD+ et du L-Lactate qui sont chacun présents dans une solution à 10 mM et dans une autre à 0,1 mM on ne préparera qu’une solution à 20 mM, pour la solution à 0,1 mM on prendra simplement 1/100 de la solution mère. On va donc préparer 4 solutions mères :

-#1 : NADH + H+ (0,2 mM) 24 mL (On a besoin de 12 mL*2)-#2 : NAD+ (20 mM) 12,5 mL (On a besoin de 12 mL + 0,12 mL)-#3 : Pyruvate (0,2 mM) 24 mL (On a besoin de 12 mL*2)-#4 : L-Lactate (20 mM) 12,5 mL (On a besoin de 12 mL + 0,12 mL)

Les solutions sont préparées dans un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,4).

Pour préparer chaque solution il faut déterminer combien on doit peser de composé solide, et ce à partir des indications du flacon :

Solution Concentration (C) Masse molaire du composé solide (M)

Volume de solution à

préparer (V)

Masse à peser (C*M*V/1000)

#1 0,2 mM 709,4 g/mol 24 mL 50 mL

3,41 mg 7,09 mg

#2 20 mM 685,4 g/mol 12,5 mL 171,35 mg#3 0,2 mM 110,04 g/mol 24 mL

400 mL0,53 mg8,80 mg

#4 20 mM 112,06 g/mol 12,5 mL 28,015 mg

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En dessous de 5-6 mg on ne considère plus la balance assez fiable donc pour les solutions de NADH + H+ et de Pyruvate on est obligés de préparer des volumes plus importants que ce qui sera utilisé afin de pouvoir garder une assez bonne précision dans nos calculs de concentration.

Il est impossible de peser exactement chacun de ces composés, on relèvera donc la masse exacte qui aura permis de préparer les solutions et ainsi nous pourrons avoir la concentration réelle de celles-ci. De plus il faudra considérer la pureté de chaque produit, puisque pour 1mg pesé on n’introduira que 95, 98 ou 99% de la molécule qui nous intéresse :

Solution Masse du recipient de

pesée (coupelle ou

papier aluminum)

Masse relevée sur la balance

Masse de composé

solide (Mc)

Pureté du composé

(P)

Concentration réelle de la solution

(1000*Mc/(M*V)*P)

#1 129,4 mg 136,5 mg 7,1 mg 98 % 0,1962 mM#2 9952,4 mg 10123,9 mg 171,5 mg 95 % 19,0166 mM#3 76,4 mg 85,3 mg 8,9 mg 99 % 0,2204 mM#4 57,4 mg 85,4 mg 28 mg 98 % 19,5895 mM

A partir de ces 4 solutions mères on peut obtenir les solutions A, B, C et D en mélangeant les volumes suivants :

-Solution A : 12 mL #1 + 0,12 mL #2 + q.s.p (tampon pH) 24 mL-Solution B : 12 mL #1 + 12 mL #2 -Solution C : 12 mL #3 + 0,12 mL #4 + q.s.p (tampon pH) 24 mL-Solution D : 12 mL #3 + 12 mL #4

On dispose donc des 4 solutions suivantes pour commencer les expériences :

-Solution A : NAD+ (0,095 mM) + NADH + H+ (0,098 mM)-Solution B : NAD+ (9,508 mM) + NADH + H+ (0,098 mM)-Solution C : Pyruvate (0,110 mM) + L-Lactate (0,098 mM)-Solution D : Pyruvate (0,110 mM) + L-Lactate (9,795 mM)

*Potentiels redox et équations de Nernst :

On va maintenant mesurer les potentiels redox de chacune des solutions à l’aide d’une électrode au KCl à 3 mol/L. Celle-ci nous donnera le potentiel de la solution en référence à celui du tampon phosphate. Le potentiel de celui-ci est de 0,175 V (Vt).

Solution Potentiel redox lu (Vl) Potentiel redox de la solution (Vt-Vl)

A 0,266 V -0,091 VB 0,250 V -0,075 VC 0,259 V -0,084 VD 0,261 V -0,086 V

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Les demi réactions d’oxydoréduction en présence sont les suivantes :

-NAD+ + H2 = NADH + H+

H-CH3-C-COOH + H2 = CH3-C-COOH O OH

Les équations de Nernst correspondantes :

-E(NAD+

/NADH+H+) = E0 + RT/2F*Ln ([NAD+]/[NADH + H+])

-E(Pyruvate/L-Lactate) = E0 + RT/2F*Ln ([Pyruvate]/[L-Lactate])

On devrait donc obtenir :

-EA-EB = RT/2F*(Ln ([NAD+]A/[NADH + H+]A) – Ln ([NAD+]B/[NADH + H+]B)) = 8,315*300/(2*96480)*(Ln (0,095*0,098/(0,098*9,508)) = - 0,06 V

-EC-ED = RT/2F*(Ln ([Pyruvate]C/[L-Lactate]C) – Ln ([Pyruvate]D/[L-Lactate]D)) = 8,315*300/(2*96480)*Ln (0,110*0,098/(0,110*9,795) = 0,06 V

Expérimentalement on a :

EA-EB = -0,16 VEC-ED = 0,02 V

On voit que les résultats expérimentaux sont de même signe et de même ordre de grandeur que les résultats théoriques, on peut donc en conclure que les équations de Nernst sont correctes. En effet la solution B contient plus de NAD+ que la solution A, donc plus d’oxydant, donc il est normal que son potentiel d’oxydoréduction soit plus négatif que celui de la solution A. Pour les solutions C et D l’effet est inverse, la solution D contient plus de L-Lactate que la solution C, donc plus de réducteur, donc il est normal que son potentiel d’oxydoréduction soit moins négatif.

*Sens de la réaction :

Intéressons nous ensuite au sens de la réaction. Pour cela nous allons mettre en présence les solutions A et C et les solutions B et D à chaque fois à volumes équivalents. Ainsi nous aurons dans le premier cas un rapport de concentrations des produits sur concentrations des réactifs de 1 et dans l’autre de 10000.

Le NAD+ et le NADH+H+ absorbent tous deux dans l’UV, on ne peut donc doser par méthode photométrique que la somme des deux, sauf à 340 nm où le NAD+ absorbe trés peu devant NADH+H+, on ne dosera donc que le NADH+H+. C’est à cette longueur d’onde que l’on mesurera la densité optique de la solution, ce qui nous permettra de connaître l’évolution de la concentration en NADH+H+ au fil du temps.

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DO

NADH+H+

NAD+

0 280 340 (nm)

On réalise une première expérience témoin où l’on met dans une cuve de spectrophotomètre 1 mL de solution A, 1 mL de solution C et 1 mL de tampon phosphate et on enregistre la DO pendant quelques minutes. On refait la même expérience en remplaçant la solution A par la solution B et la solution C par la solution D.

Ensuite dans une autre cuve on met 1 mL de solution A, 1 mL de solution C, 100 µL de LDH contenant 10 mU d’activité enzymatique et le complément à 3 mL en tampon phosphate. On enregistre là encore les DO pendant quelques minutes puis on réitère l’opération en remplaçant la solution A par la solution C et la solution B par la solution D. On obtient les résultats suivants :

Temps (minutes)

DOSOL A+C

sans LDHDOSOL A+C

avec LDHDifférence

entre présence

et absence de LDH

DOSOL C+D

sans LDHDOSOL B+D

avec LDHDifférence

entre présence

et absence de LDH

0 0,174 0,172 -0,002 0,279 0,267 -0,0121 0,174 0,154 -0,02 0,277 0,264 -0,0132 0,174 0,147 -0,027 0,275 0,262 -0,0133 0,173 0,139 -0,034 0,274 0,259 -0,0154 0,173 0,134 -0,039 0,274 0,257 -0,0175 0,173 0,127 -0,046 0,273 0,255 -0,0186 0,173 0,122 -0,051 0,273 0,254 -0,0197 0,173 0,117 -0,056 0,273 0,253 -0,028 0,173 0,111 -0,062 0,273 0,251 -0,0229 0,173 0,107 -0,066 0,272 0,251 -0,02110 0,173 0,103 -0,07 0,272 0,251 -0,02111 0,173 0,098 -0,075 0,272 0,249 -0,023

On considère que du NADH+H+ peut disparaître spontanément sans intervenir dans la réaction, on va donc considérer uniquement la différence entre la présence et l’absence de LDH puisque cette enzyme catalyse une réaction qui n’est pas censée se produire sans sa présence.

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Evolution de la différence de DO en fonction du temps

-0,08

-0,06

-0,04

-0,02

00 5 10 15

Temps (mn)

DODifférence A+C

Différence B+D

Le graphique nous montre que la réaction va dans le sens de la disparition du NADH+H+, donc de formation de NAD+ + L-Lactate. Et ce que le rapport des concentrations des produits sur concentration des réactifs soit de 1 ou 10000. Toutefois la pente de la courbe nous montre que la réaction est bien plus rapide lorsque les 4 molécules sont au temps initial en proportions stoechiométriques que lorsque le NAD+ et le L-Lactate sont chacun 100 fois plus concentrés que le NADH+H+ et le Pyruvate. On peut donc conclure que l’équilibre est très déplacé vers la droite, ce qui est normal puisque dans l’organisme le pyruvate est un composé toxique qui, lorsqu’il est trop important, doit être éliminé. En continuant l’expérience on devrait arriver à des concentrations en L-Lactate et NAD+ guère bien supérieures à ce que l’on a dans le cas du mélange des solutions B et D, c’est à dire à chaque fois 100 fois plus de L-Lactate ou de NAD+ que de Pyruvate ou de NADH+H+.

Manipulation 2 : Calculs des Vm et Km d’une activité enzymatique. Etude de l’effet d’un inhibiteur.

Ici on va chercher dans un premier temps à calculer l’activité d’une enzyme puis la constante de Michaelis et la vitesse d’une réaction enzymatique. Ensuite on déterminera l’effet d’un inhibiteur sur cette réaction, c’est à dire sa constante et sa nature.

Pour cela nous allons tracer la cinétique de la réaction mettant en présence l’enzyme dont on veut calculer l’activité, puis recommencer cette opération avec des concentrations en substrat croissantes. Enfin nous ajouterons de l’inhibiteur au mélange à différentes concentrations et nous étudierons là encore la cinétique.

La même réaction que pour l’expérience précédente sera le thème de l’étude :

LDHPyruvate + NADH + H+ L-Lactate + NAD+

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Il nous faudra suivre l’apparition ou la disparition d’un composé afin de pouvoir tracer la cinétique de la réaction. De même que pour la première manipulation nous utiliserons une méthode spectrophotométrique permettant de suivre l’évolution de la densité optique du NADH+H+ à 340 nm.

Pour ce qui est de l’inhibiteur on nous propose l’acide oxalique, qui pourrait inhiber la réaction de la façon suivante :

O O LDH OH OH C - C + NADH+H+ C - C + NAD+

OH OH OH OH Acide oxalique

Cette réaction est réversible et on peut supposer qu’elle est de type compétitive, dans ce cas l’acide oxalique devrait occuper le même site catalytique que le pyruvate, donc la vitesse initiale de la réaction en serait modifiée ainsi que la constante de Michaelis.

*Préparation des solutions :

On désire calculer la vitesse de la réaction et l’activité d’une enzyme, donc nous aurons cette fois, contrairement à l’expérience précédente, besoin de solutions ne contenant aucun des produits au temps initial. Nous allons donc devoir préparer une solution de NADH+H+, une solution de Pyruvate, et une solution de l’inhibiteur dont nous voulons étudier l’effet, c’est à dire d’acide oxalique. La solution d’enzyme nous étant fournie prête à l’emploi, nous l’utiliserons telle qu’elle. On aura donc 3 solutions à préparer :

-#1 : Pyruvate (21 mM)-#2 : NADH+H+ (3 mM)-#3 : Oxalate (3 mM)

Sur chaque flacon on peut lire les indications suivantes :

-Sodium pyruvate : 110,04 g/mol-NADH + H+ : 709,4 g/mol-Oxalate de sodium : 134,0 g/mol

Nous aurons besoin de :

-Pyruvate : 0,1 mL*2groupes + ((0,1+0,2+0,3+0,4+0,5+0,6+0,7+0,8+0,9+1*2groupes*2manipulations + (0,2+0,4+0,6)*3expériences*2groupes) /10(facteur de dilution), soit 9,6 mL

-NADH+H+ : 0,1 mL*2groupes + 0,1*10expériences*3manipulations*2groupes, soit 6,2 mL

-Acide oxalique : 0,1mL*10expériences*2groupes + (0,1 mL+0,2 mL+0,3mL)*3 expériences*2groupes, soit 5,6mL

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Afin d’avoir assez de réactifs tout en ne gaspillant pas trop de produits nous préparerons les solutions de cette façon :

Solution Concentration (C)

Masse molaire du composé solide (M)

Volume de solution à

préparer (V)

Masse à peser (C*M*V/1000)

#1 21 mM 110,04 g/mol 10 mL 23,1 mg#2 3 mM 709,4 g/mol 20 mL 42,6 mg#3 3 mM 134 g/mol 10 mL

30 mL4,02 mg12,06 mg

De même que pour la première manipulation la balance n’est pas assez fiable pour des masses inférieures à 5-6 mg, nous préparerons donc non pas 10 mL mais 30 mL de solution d’oxalate.

Il est impossible de peser exactement chacun de ces composés, on relèvera donc la masse exacte qui aura permis de préparer les solutions et ainsi nous pourrons recalculer le volume de tampon à ajouter pour avoir les concentrations voulues des réactifs.

Solution Masse du recipient de

pesée (coupelle ou papier

aluminum)

Masse relevée sur la balance

Masse de composé solide

(Mc)

Volume de solution à préparer

(Mc/M/C*1000)

#1 52,4 mg 76,8 mg 24,4 mg 10,56 mL#2 78,7 mg 125,2 mg 46,4 mg 21,80 mL#3 79,6 mg 100 mg 20,4 mg 50,75 mL

Note : Cette méthode, utilisée par l’autre partie du groupe, est différente de celle que nous avions utilisée pour la première manipulation. Ici au lieu de recalculer les concentrations exactes et d’utiliser ces valeurs pour les calculs à venir on recalcule les volumes. Celle-ci est très avantageuse car elle permet d’avoir des valeurs de concentrations simples et donc de faciliter les calculs à venir.

On dispose donc des 3 solutions suivantes pour commencer les expériences :

-#1 : Pyruvate (21 mM)-#2 : NADH+H+ (3 mM)-#3 : Oxalate (3 mM)

*Calcul de l’activité exacte de la préparation enzymatique :

On va ici tracer la cinétique de la réaction enzymatique, ensuite nous déterminerons l’équation de celle-ci puis nous pourrons en déduire la vitesse initiale de la réaction, qui correspond à l’activité de la préparation enzymatique.

Dans une cuve de spectrophotomètre on met 0,1 mL de NAH+H+, 0,1 mL de Pyruvate, 0,1 mL de LDH et le complément à 3 mL en tampon phosphate, puis on mesure la densité optique de la solution pendant quelques minutes :

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Temps (secondes) DO0 0,53215 0,46730 0,44945 0,43160 0,41375 0,39690 0,378105 0,362120 0,347135 0,33135 0,316150 0,301165 0,287180 0,274195 0,26210 0,247225 0,236240 0,223255 0,212270 0,201285 0,191300 0,181

Note : Etant donné que l’on ne peut pas mesurer la DO exactement au temps 0, c’est à dire lorsqu’on ajoute l’enzyme à la solution, et donc que la réaction commence, on mesure la DO avant ajout de l’enzyme et on la recalcule au temps 0 en tenant compte de la dilution que provoque l’ajout de la solution enzymatique. On trouve sans enzyme une DO de 0,55, donc 0,55*2,9mL/3mL = 0,532. On prendra comme DO initiale 0,532.

Note 2 : On peut à partir de la DO connaître la concentration de la solution et vérifier la conformité de celle-ci. Le coefficient d’extinction molaire de la LDH à 340 nm est connu, c’est 6,22.103 L.mol-1.cm-1. DO = *l*C, donc C = DO/(*l)

= 0,55/(6,22.103*1) = 0,084 mM

Théoriquement on s’attend à obtenir 3mM*0,1mL/2,9mL, soit 0,103 mM. Le résultat théorique est proche du résultat expérimental, on peut donc considérer que la concentration de la solution est correcte.

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Evolution de la DO en fonction du temps

y = -0,0008x 3 + 0,0123x2 - 0,104x + 0,5084R2 = 0,996

y = -0,104x + 0,532

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (minutes)

DO

A l’aide d’une régression polynomiale de degré 3 on trouve l’équation de la cinétique enzymatique de la réaction, ensuite en dérivant cette équation on a le coefficient directeur de sa tangente, qui correspond au ∆DO de la réaction enzymatique à l’état initial. Donc on a ici ∆DO = 0,104. A partir de cette valeur on calcule la V0 : V0 = ∆DO/(*∆t)

= 0,104/(6,22.103*1) = 0,0167 mM.min-1

L’activité enzymatique de la solution est de 0,0167 mM.mn-1. Connaissant le volume de la solution on peut calculer la vitesse initiale en mmol de substrat transformé par minute.

V0 = 0,0167*3*10-3

V0 = 0,050 mol/min

L’activité enzymatique de la solution est donc de 0,050 mol/min, la solution de LDH est censée nous être donnée à 1 mol.min-1.mL-1. On en introduit 0,1 mL dans la cuve de spectrophotomètre, on devrait donc s’attendre à trouver une activité enzymatique de 0,1 mol/min. La différence entre le résultat théorique et le résultat expérimental peut s’expliquer par le fait que l’activité nous est donnée à la température optimale de la LDH, c’est à dire 32°C, la température de la salle étant d’environ 26°C l’activité est automatiquement plus faible. Mais il est également possible que de l’enzyme ait été dénaturé avant d’être introduit dans la solution, à cause d’une mauvaise décongélation ou d’une trop longue attente à température ambiante. Enfin l’enzyme a pu avoir été mal préparé.

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*Constante de Michaelis et Vitesse maximum :

L’expérience consiste ici à reproduire la même réaction que précédemment en ayant tout d’abord dilué la solution de Pyruvate au dixième, de façon à pouvoir introduire des quantités croissantes de substrat dans des cuves de spectrophotomètre et étudier leurs cinétiques. Ainsi en utilisant la même méthode que précédemment nous pourrons calculer la V0 de la réaction en fonction des différentes concentrations en substrat. Ensuite à partir de l’inverse de la concentration en substrat et l’inverse de la vitesse initiale nous pourrons construire la représentation de Lineweaver-Burk. Puis par régression linéaire nous pourrons trouver les valeurs de -1/Km et 1/Vm qui nous donneront les deux constantes recherchées. On étudie ainsi les cinétiques des réactions enzymatiques des 10 cuves suivantes contenant des concentrations en substrat croissantes :

Cuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volume de Pyruvate

(2,1mM) Vp

0,1mL 0,2mL 0,3mL 0,4mL 0,5mL 0,6mL 0,7mL 0,8mL 0,9mL 1mL

Volume de solution tampon

2,7mL 2,6mL 2,5mL 2,4mL 2,3mL 2,2mL 2,1mL 2,0mL 1,9mL 1,8mL

Volume de NADH+H+

(3mM)


Volume de solution

enzymatique


Ce qui nous donne les résultats suivants :

Temps (min) DO1 DO2 DO3 DO4 DO5 DO6 DO7 DO8 DO9 DO10

0 0,566 0,582 0,525 0,537 0,512 0,502 0,524 0,418 0,523 0,4880,5 0,56 0,563 0,508 0,515 0,497 0,471 0,491 0,394 0,473 0,4671 0,549 0,542 0,484 0,494 0,462 0,442 0,461 0,375 0,458 0,418

1,5 0,537 0,524 0,461 0,473 0,437 0,414 0,431 0,355 0,428 0,3862 0,527 0,506 0,438 0,452 0,414 0,386 0,401 0,333 0,37 0,338

2,5 0,517 0,488 0,417 0,433 0,39 0,359 0,373 0,309 0,354 0,3113 0,507 0,473 0,395 0,413 0,368 0,334 0,346 0,29 0,328 0,284

3,5 0,498 0,456 0,375 0,394 0,346 0,312 0,32 0,275 0,306 0,2594 0,488 0,44 0,356 0,376 0,326 0,288 0,296 0,262 0,283 0,237

4,5 0,48 0,424 0,338 0,358 0,306 0,267 0,274 0,248 0,261 0,216

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y = 0,0003x3 - 0,002x 2 - 0,0171x + 0,5671

R2 = 0,9993

y = -4E-05x 3 + 0,0015x2 - 0,041x + 0,5823

R2 = 0,9999

y = 0,0004x3 - 0,002x 2 - 0,0413x + 0,5266

R2 = 0,9997

y = 3E-05x 3 + 0,0008x2 - 0,0439x + 0,5369R2 = 1

y = 0,0003x3 - 0,0002x 2 - 0,0511x + 0,5154

R2 = 0,9987

y = 6E-05x 3 + 0,0019x2 - 0,0621x + 0,5019R2 = 1

y = 0,0001x3 + 0,0013x2 - 0,0644x + 0,5237R2 = 1

y = -6E-06x 3 + 0,0041x2 - 0,0763x + 0,5209

R2 = 0,9932y = 0,0006x3 - 0,0017x 2 - 0,0417x + 0,4174

R2 = 0,9993

y = 0,0006x3 + 0,0008x2 - 0,0779x + 0,4949

R2 = 0,997

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0 2 4Temps (min)

DO

DO1DO2DO3DO4DO5DO6DO7DO8DO9DO10

12

A partir des régressions polynomiales de degré 3 on obtient les ∆DO des cuves en dérivant à t0 chaque équation. Puis on calcule V0 pour chacune des cuves ainsi que l’inverse de V0 et de la concentration en substrat qui nous permettront ensuite de construire la représentation de Lineweaver-Burk :

Cuve Concentration en substrat

(Vp*2,1/3)

∆DO V0 (∆DO/(*∆t)*3.10-

3)

1/[S] 1/V0

1 0,07 mM 0,0171 0,008 mol/min 14,29 mM-1 121,25 min/mol2 0,14 mM 0,041 0,020 mol/min 7,14 mM-1 50,57 min/mol3 0,21 mM 0,0413 0,020 mol/min 4,76 mM-1 50,20 min/mol4 0,28 mM 0,0439 0,021 mol/min 3,57 mM-1 47,23 min/mol5 0,35 mM 0,0511 0,025 mol/min 2,86 mM-1 40,57 min/mol6 0,42 mM 0,0621 0,030 mol/min 2,38 mM-1 33,39 min/mol7 0,49 mM 0,0644 0,031 mol/min 2,04 mM-1 32,19 min/mol8 0,56 mM 0,0417 0,020 mol/min - -9 0,63 mM 0,0763 0,037 mol/min 1,59 mM-1 27,17 min/mol

10 0,70 mM 0,0779 0,038 mol/min 1,43 mM-1 26,62 min/mol

Note : Pour la cuve 8 on remarque une valeur aberrante, celle-ci est probablement due à une erreur lors de l’introduction de l’enzyme dans la cuve spectrophotométrique (erreur de pipetage d’où introduction d’une trop faible quantité d’enzyme). Nous ne prendrons donc pas en compte cette cuve afin de ne pas fausser les équations de la représentation de Lineweaver-Burk.

Représentation de Lineweaver-Burk

y = 6,9217x + 16,881R2 = 0,9518

-50,00

0,00

50,00

100,00

150,00

-5 0 5 10 15 20

1/[S]

1/V

0

13

A partir de cette courbe on a directement accès aux valeurs de Vm et Km, en effet l’ordonnée à l’origine nous donne 1/Vm tandis que l’abscisse du point ayant pour ordonnée 0 correspond à -1/Km.La régression linéaire de la courbe nous donne l’équation suivante : y =6,9217x + 16,881.

Donc 1/Vm = f(0) = 16,881

Vm = 1/16,881 Vm = 0,059 mol/min

La vitesse de la réaction lorsque la concentration en substrat est saturante est de 0,059mol/min.

Et f(-1/Km) = 0 -1/Km = -16,881/6,9217 Km = 6,9217/16,881 Km = 0,41 mMLa concentration pour laquelle V0 est égale à la moitié de sa vitesse maximum (Vm/2) est de 0,41 mmol.L-1.

*Constante d’inhibiton :

On va refaire l’expérience précédente en rajoutant 0,1 mL d’inhibiteur, de cette façon on pourra à nouveau calculer Vm et Km mais cette fois en présence d’inhibition, connaissant la concentration en inhibiteur on pourra ensuite déterminer la constante d’inhibition Ki. On va ainsi mesurer la DO de 10 nouvelles cuves :

Cuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Volume de Pyruvate

(2,1mM) Vp

0,1mL 0,2mL 0,3mL 0,4mL 0,5mL 0,6mL 0,7mL 0,8mL 0,9mL 1mL



Volume de NADH+H+

(3mM)


Volume de solution

enzymatique


Volume d’inhibiteur

(3mM)


14


Temps (min) DO1 DO2 DO3 DO4 DO5 DO6 DO7 DO8 DO9 DO10

0 1,067 0,85 1,116 0,996 1,047 0,871 1,24 1,051 1,204 1,080,5 0,996 0,847 1,089 0,975 1,027 0,852 1,206 1,018 1,143 1,0491 0,992 0,814 1,088 0,964 1,092 0,825 1,148 0,981 1,093 1,033

1,5 0,98 0,806 1,082 0,946 1,055 0,813 1,1 0,961 1,053 12 0,964 0,793 1,05 0,903 1,027 0,781 1,072 0,913 1,018 0,948

2,5 0,95 0,767 1,034 0,874 1,005 0,772 1,043 0,9 0,983 0,9323 0,931 0,761 0,999 0,839 0,966 0,753 0,999 0,863 0,941 0,907

3,5 0,915 0,752 0,988 0,817 0,951 0,726 0,973 0,843 0,909 0,864 0,899 0,853 0,979 0,814 0,94 0,696 0,941 0,822 0,878 0,853

4,5 0,904 0,848 0,955 0,777 0,926 0,698 0,912 0,789 0,85 0,826

15


y = -0,0002x 3 + 0,0069x2 - 0,0993x + 1,2437

R2 = 0,9977

y = 0,0004x3 - 0,0053x 2 - 0,0214x + 1,1122R2 = 0,9841

y = 0,0041x3 - 0,0363x 2 + 0,0524x + 1,0401

R2 = 0,931

y = -0,0011x 3 + 0,0126x2 - 0,0687x + 1,052

R2 = 0,9585

y = 0,0005x3 + 0,0004x2 - 0,036x + 0,855

R2 = 0,9796

y = -0,0007x 3 + 0,011x2 - 0,1124x + 1,2001

R2 = 0,9991y = 0,0004x3 - 0,0023x 2 - 0,0567x + 1,0817

R2 = 0,9922y = 0,003x3 - 0,0209x 2 - 0,0141x + 0,9939

R2 = 0,9917y = -0,0006x 3 + 0,0065x2 - 0,0753x + 1,0524

R2 = 0,9969

y = 0,0012x3 - 0,007x 2 - 0,0316x + 0,8689

R2 = 0,9902

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2

1,3

0 1 2 3 4 5Temps (min)

DO

DO1DO2DO3DO4DO5DO6DO7 DO8DO9DO10

16



(Vpy*2,1/3)

∆DO V0 (∆DO/(*∆t)*3.10-

3)

1/[S] 1/V0

1 0,07 mM 0,0687 0,033 mol/min 14,29 mM-1 30,180 min/mol2 0,14 mM 0,036 0,017 mol/min 7,14 mM-1 57,593 min/mol3 0,21 mM 0,0214 0,010 mol/min 4,76 mM-1 96,885 min/mol4 0,28 mM 0,0141 0,007 mol/min 3,57 mM-1 147,045 min/mol5 0,35 mM 0,0524 0,025 mol/min 2,86 mM-1 39,567 min/mol6 0,42 mM 0,0316 0,015 mol/min 2,38 mM-1 65,612 min/mol7 0,49 mM 0,0993 0,048 mol/min 2,04 mM-1 20,879 min/mol8 0,56 mM 0,0753 0,036 mol/min 1,79 mM-1 27,534 min/mol9 0,63 mM 0,1124 0,054 mol/min 1,59 mM-1 18,446 min/mol

10 0,70 mM 0,0567 0,027 mol/min 1,43 mM-1 36,567 min/mol

On a ici des valeurs n’ayant aucune corrélation entre elles, on en déduit donc que celles-ci sont fausses et que l’on ne peut déterminer la constante d’inhibition de l’oxalate.

Note : Si les valeurs avaient été correctes il aurait fallu déterminer de la même façon que pour l’expérience précédente Vm et Km en présence d’inhibiteur. Connaissant la concentration en inhibiteur ([I] = 0,1*10-3*3/(3*10-3), soit 0,1mM) on aurait pu déterminer Ki à l’aide de la relation Kminhib = Km*(1+[I]/Ki).

*Nature de l’inhibition :

L’expérience consiste à déterminer les Km et Vm de différentes réactions avec des concentrations en substrat croissantes et des concentration en oxalate elles aussi croissantes. De ce fait on peut obtenir des représentations de Lineweaver-Burk en fonction de la concentration en inhibiteur et calculer les constantes Km et Vm qui nous permettent ensuite de conclure sur le type d’inhibition. Nous aurons donc à mesurer la DO de 9 nouvelles cuves contenant les proportions en réactifs suivants :

Cuve 1 2 3 4 5 6 7 8 9

17

Volume de Pyruvate

(2,1mM) Vpyr

0,2mL 0,2mL 0,2mL 0,4mL 0,4mL 0,4mL 0,6mL 0,6mL 0,6mL



Volume de NADH+H+

(3mM)


Volume de solution

enzymatique


Volume d’inhibiteur

(3mM)


Concentration en Oxalate

0,1mM 0,2mM 0,3mM 0,1mM 0,2mM 0,3mM 0,1mM 0,2mM 0,3mM


Temps (min) DO1 DO2 DO3 DO4 DO5 DO6 DO7 DO8 DO9

0 0,612 0,559 0,559 0,67 0,554 0,644 0,594 0,553 0,5830,5 0,616 0,572 0,556 0,649 0,53 0,574 0,545 0,537 0,5591 0,608 0,561 0,542 0,661 0,482 0,535 0,521 0,5 0,527

1,5 0,578 0,534 0,535 0,662 0,454 0,495 0,5 0,466 0,4822 0,527 0,521 0,533 0,663 0,423 0,455 0,468 0,445 0,462

2,5 0,533 0,519 0,524 0,673 0,396 0,425 0,416 0,418 0,4233 0,52 0,521 0,516 0,67 0,372 0,394 0,387 0,383 0,412

3,5 0,538 0,509 0,508 0,66 0,336 0,363 0,341 0,35 0,3784 0,523 0,488 0,501 0,675 0,3 0,334 0,299 0,318 0,336

4,5 0,499 0,495 0,498 0,674 0,281 0,304 0,273 0,288 0,3095 0,503 0,494 0,49 0,654 0,275 0,275 0,27 0,272 0,281

18


y = 0,0005x 3 + 0,0002x2 - 0,037x + 0,6246

R2 = 0,8877y = 0,0011x3 - 0,0066x 2 - 0,0085x +

0,5666R2 = 0,9197

y = 6E-05x 3 - 1E-04x 2 - 0,0149x + 0,5599

R2 = 0,9919

y = -0,0004x 3 + 0,0033x2 - 0,0678x + 0,5866

R2 = 0,996

y = -0,0018x 3 + 0,0186x2 - 0,122x + 0,6393

R2 = 0,9991y = 0,0009x 3 - 0,0071x 2 - 0,045x +

0,5545R2 = 0,9978y = 0,0025x3 - 0,0178x 2 - 0,0368x +

0,5824R2 = 0,9933

y = 0,0009x3 - 0,0034x 2 - 0,0617x + 0,5545

R2 = 0,9959

y = -0,0015x 3 + 0,0106x2 - 0,0162x + 0,6652

R2 = 0,4308

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0 1 2 3 4 5Temps (min)

DO

DO1

DO2

DO3

DO4

DO5

DO6

DO7

DO8

DO9

19



(Vpyr*2,1/3)

∆DO V0 (∆DO/(*∆t)*3.10-

3)

1/[S] 1/V0

1 0,14 mM 0,037 - 7,14 mM-1 -2 0,14 mM 0,0085 0,004 mol/min 3,57 mM-1 243,92 min/mol3 0,14 mM 0,0149 0,007 mol/min 2,38 mM-1 139,15 min/mol4 0,28 mM 0,0162 - 7,14 mM-1 -5 0,28 mM 0,0617 0,030 mol/min 3,57 mM-1 33,60 min/mol6 0,28 mM 0,122 0,059 mol/min 2,38 mM-1 16,99 min/mol7 0,42 mM 0,0368 0,018 mol/min 7,14 mM-1 56,34 min/mol8 0,42 mM 0,045 0,022 mol/min 3,57 mM-1 46,07 min/mol9 0,42 mM 0,0678 0,033 mol/min 2,38 mM-1 30,58 min/mol

Note : On élimine les valeurs dont le coefficient de corrélation est inférieur à 0,9 puisque si la régression polynomiale n’est pas fiable la vitesse initiale qu’elle nous permet de calculer ne peut pas l’être non plus.

A partir de ces valeurs on trace 3 courbes sur le représentation de Lineweaver-Burk, une pour chaque concentration en Oxalate. On ne pourra tracer que deux courbes puisque pour la concentration en oxalate de 0,1mM on n’a qu’une seule valeur fiable. Pour la première courbe on prendra les cuves 2, 5 et 8 et pour la seconde les cuves 3, 6 et 9 :

Représentation de Lineweaver-Burk

y = 45,55x - 90,962R2 = 0,9152

y = 25,431x - 48,768R2 = 0,88610,00

50,00100,00150,00200,00250,00300,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,001/[S]

1/V0[Oxalate] =0,2mM[Oxalate] =0,3mM

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Ici c’est le coefficient de corrélation de la régression linéaire de la représentation de Lineweaver-Burk pour une concentration en Oxalate de 0,3mM qui est inférieur à 0,9 et donc qui n’est pas fiable, on ne pourra donc pas déterminer le type d’inhibition en présence.

Note : Si l’on avait pu tracer les 3 courbes il aurait fallu comparer les Vm et Km de chacune de trois, si les on obtenait à chaque fois les mêmes Vm mais des Km différents on aurait été en présence d’une inhibition compétitive, si les Km avaient été les mêmes mais pas les Vm l’inhibition aurait été non compétitive et enfin si les deux constantes avaient été différentes l’inhibition aurait été de type in-compétitive.

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