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B.O

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Irradiation des levures dans l'enceinte UV.

Variation génétique et mutation de l'ADN (1-A)

Problématique scientifi que Lors de la réplication de l'ADN, des erreurs peuvent subvenir dont la fréquence peut varier en fonction d'agents extérieurs. Ces erreurs peuvent perdurer pour aboutir à une muta-tion qui participe au fi l du temps à la variabilité géné-tique. Certains facteurs environ-nementaux (UV, benzène) ont pour conséquence une multiplication de ces muta-tions.

Comment mettre en évi-dence et analyser l'in-fl uence de ces facteurs sur une culture de levures ?

TP Infl uence de l'irradiation aux UV sur une culture de levures Nombre de séances : 1Niveau de diffi culté :Nombre de séances : 1Niveau de diffi culté :

Mode opératoire

On soumet une population de cette levure S.cerevisiae ADE2 à un niveau progressif de rayon-nement ultraviolet. On mesure ensuite les effets de cette exposition : - Par comptage du nombre de colonies viables,- Par rétablissement d’un phénotype sauvage (vu en

seconde).

Pourquoi la levure S.cerevisiae ADE 2 ?Avec cette souche, on peut visualiser la conséquence de certaines mutations.

La levure S.cerevisiae ADE2 est une levure qui a subi une mutation sur sa chaîne de biosynthèse de l’Adénine, qui la rend auxotrophe, c’est-à-dire qu’elle est incapable de synthétiser ce composé. En l’absence d’une quantité suffi sante d’Adénine dans le milieu, la levure accumule un produit intermédiaire de couleur rose.

Avant le TP

- Coulage du milieu dans les boîtes de Pétri (selon le kit)

- Repiquage des levures souchesAvant d’ouvrir la boîte de Pétri contenant les levures souches, veillez à nettoyer le poste de travail à la javel, les mains à l’alcool et portez une blouse. Tout le matériel au contact des levures et des boîtes de Pétri doit être stérile.

- Préparation de la suspension de levure➝ Ouvrir la boîte de S.cerevisiae et récuperer 2

colonies de levures à l’aide d’un inoculateur stérile

➝ Mettre en suspension ces colonies dans un tube stérile avec 2 mL d’eau stérile. (1 colonie de 1 mm environ pour suspension dans 1 mL d’eau)

➝ Agiter cette solution au vortex, elle doit être légèrement trouble

➝ Répéter cette opération pour chaque binôme

Il est conseillé à l’enseignant de réaliser lui-même cette phase préparatoire.

Pendant le TP

Préparation des boîtes de gélose YPG :Chaque binôme dispose de 5 boîtes de Pétri, identi-fi er sur le fond à l’aide d’un marqueur comme suit :t 0 s / t 15 s / t 30 s / t 60 s / t 120 sÀ partir de la solution préparée précédemment, déposer dans chaque boîte 2 gouttes de solution de levure au centre de la boîte.Utiliser l’étaleur stérile de façon circulaire afi n de répartir les levures sur toute la surface de la boîte, jusqu’à ce que celles-ci apparaissent sèches (les levures doivent bien imprégner l’agar, pour assurer une répartition homogène), puis refermer.

Exposition des boîtes aux UV :4 des boîtes vont subir une exposition aux UV (1 pendant 15 s, 1 pendant 30 s, 1 pendant 60 s, 1 pendant 120 s). La 5e boîte t 0 s servira de témoin.La lampe doit est réglée sur λ = 254 nm (UV-C). Les couvercles sont ôtés le temps de l’exposition (car le rayonnement UV ne traverse pas le polycarbonate).

Ensuite, stocker les boîtes de Pétri dans un incuba-teur à 28 °C. Les résultats seront visibles dès le 5e jour. En l’absence d’incubateur, laisser les boîtes de Pétri à température ambiante durant 2 jours de plus.

Elimination des boîtes :Ne pas jeter les boîtes à la poubelle, il faut détruire les cultures par stérilisation auparavant.Après l’observation, placer les boîtes dans de l’eau de javel diluée pendant 48 heures.Vous pouvez également utiliser un autoclave (120 °C pendant 20 minutes).

Trucs et astuces Il est possible en utilisant un masque cachant trois quarts de la boîte de Pétri, d'exposer 1 seule boîte à 4 temps diffé-rents d'exposition et ainsi de faire travailler les binômes sur 1 seule boîte.

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Matériel nécessaire

TP Influence de l'irradiation aux UV sur une culture de levures

S. cerivisiae + adénine + 500 mL milieu YPG prêt à couler Réf. 108 022

Mini-incubateur Réf. 535 050

Pack de matériel stérile prêt à l'emploi Réf. 543 005

Enceinte UV Réf. 701 435

Agitateur type Vortex Réf. 701 441

Bec électrique Techni + Réf. 701 548

Résultats et exploitations

Compter le nombre de colonies dans un logiciel de traitement de photo ou en comptant le nombre de colonies sur 1 cm2 en utilisant un masque puis extrapolé cette valeur pour l’ensemble de la culture.

Renouveler l’opération pour chaque boîte ayant eu des temps d’exposition différents.

En résumé

Le nombre de colonies qui se développe est directement impacté par le temps d'exposi-tion aux UV, le nombre de colonies diminue quand le temps d'exposition augmente. Les UV ont donc un effet létal sur les levures.

Le pourcentage de colonies blanches augmente avec le temps d'exposition aux UV. Les mutations sont favorisées par l'exposition aux UV.

Pour aller plus loinCertains groupes peuvent :- Réaliser l'expérience à une longueur

différente (= 365 nm) afin de comparer la dangerosité des rayonnements.

- Faire varier la concentration d'Adenine dans le milieu.

En parallèle, un groupe peut compter le nombre de colonies blanches.

TP SV

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