TUBERCULOSE: EPIDEMIOLOGIE ET

METHODES DE DIAGNOSTIC CLASSIQUE

Pr. L.SLIM-SAIDI

Laboratoire de microbiologie Hôpital A.Mami de Pneumologie – Ariana - TUNISIE

Amenophis IV

Tuberculose: maladie antique•La tuberculose (TBC) est une maladie infectieuse dûe à une mycobactérie: Mycobacterium tuberculosis (BK)

•1ers cas: 8000 ans Momies égyptiennes

•Infection redoutable1 homme / 7 en est mort

•Maladie contagieuse ; transmission interhumaine

•La TBC reste toujours un sujet d’actualité

Recrudescence TBC

TBC & SIDA

TBC multirésistante

Mycobacterium tuberculosis

• Bacille de Koch 1882

• Principal agent de

la tuberculose

MYCOBACTERIES

Complexe tuberculosis: Tuberculose

• Mycobacterium tuberculosis (homme)• Mycobacterium bovis (animal)• Mycobacterium africanum (homme)

Transmission interhumaine +++

• Mycobacterium leprae Lèpre

MYCOBACTERIES

• Mycobacéries atypiques:– M. kansasii gg, pneumopathies– M. marinum ulc. cutanées– M. scrofulaceum gg– M. avium-intracellulare gg, pneumopathies – M. fortuitum

Bactéries de l’environnement, commensales opportunistes

Immunodéprimés/ SIDA…

MYCOBACTERIES: bactéries particulières

• Bacilles aérobies strict, difficile à colorer• Paroi riche en lipides (ac.mycoliques,

· Acido-Alcoolo-Résistance => BAAR· Résistance aux désinfectants, antiseptiques, ATB · Résistance aux enzymes lysosomiales

• Multiplication lente: 18H (E.coli 20 mn)• Culture 2 – 3 semaines et plus• Multiplication intracellulaire (PN, macrophages)• Mutants résistants « souches sauvages »

(1/105 INH, Sm - 1/ 107 Rif)

• Association obligatoire d’antituberculeux

TUBERCULOSE

Transmission• Voie aérienne• Malades bacillifères

aérosols contaminés

Toux, éternuements,paroles

Inhalation de M.tuberculosis

Primo-infection

Asymptomatique (95 %)

Infection latente

Immunité cellulaire

Pas de maladie

90%

Tuberculose aiguë (5%)

Tuberculose de réactivation (10%)

PATHOGENIE DE LA TBC

Tuberculose pulmonaire

Tout symptôme respiratoire et toute anomalie RX inexpliqués

suspecter la TBC

Asthénie, Anorexie, Amaigrissement

Fièvre Sueurs nocturnes

Début progressif ++Toux sèche puis

productive trainante

Tuberculose extra-pulmonaire

Pulmonaire : 68 %•Extra-pulm : 32 %

–Ganglionnaire 13 %–Pleurale 10 %–Autre 9 %

•Adulte jeune:15 - 40ans (61–68%) Sexe ratio = 1,4

TBC pulmonaire Homme

TBC extra-pulm Femme

pulmonaire ganglion plevre osteo-articul miliaire uro-genitale autre

EPIDEMIOLOGIE

0

10

20

30

40

50

60

0 - 14 ans 15 - 59 ans 60ans

La TBC touche le sujet jeune de 15 à 40 ans : 61- 68 %

Taux d’incidence spécifique par tranche d’âge

EPIDEMIOLOGIE

• Sujets à risque +++

– Immunodéprimés– Infection HIV– Personnes défavorisées socio-économiquement

ou vivant en collectivité : • Sans domicile fixe, migrants• Orphelinat , maison de retraite, milieu carcéral

– Toxicomanes

TUBERCULOSE DANS LE MONDE - 2000 Arch Intern Med.2003;163:1009-1021

–La TBC reste un fléau mondial, Pays en voie de développement++

2 Milliards personnes infectées

8,4 Millions nouveaux cas

20 Millions personnes atteintes de TBC

60 % TBC pulmonaire bacillifère

79 % tuberculeux n’ont pas accés aux traitements

3 Millions de décès

98 % :pays en voie de développement

TUBERCULOSE ET HIV chez l’ADULTEArch Intern Med.2003;163:1009-1021

Résistance aux antituberculeux

Réservoir de germe

Résistance primaire Résistance acquise

Programme de lutte

MDR= INH+ RIF

TUBERCULOSE MULTIRESISTANTE WHO/CDS/TB/2000.278

0 10 20 30 40 50 60

Bostw ana

Cent. Afric

South Africa

Guinea

Marocco

Mozambique

Sierra leone

South Africa

Uganda

Oman

Iran

Tchéquie

Estonia

Latvia

Russia-tomsk

Russia-Ivanova

India

Chine

Slovakia

Slovania

Korea

England

Finland

France

Germany

Spain

Italy

USA

Nv cas

cas traités

Comment réduire l’épidémie ?

Dépistage efficace Diagnostic sensible et rapide

Traitement précoce adapté et prolongé

Guérir les patients; éviter les récidives

Prévenir les formes chroniques et Résistantes

Briser la chaine de transmission

Tarir la source de contamination

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

• MICROSCOPIE• CULTURE (Lowenstein Jensen)

– Identification– Antibiogramme

Confirmation bactériologique tardive

Réduire délai de détection, d’identification

• RADIOMETRIQUE (BACTEC)• NON RADIOMETRIQUES (MGIT – MB redox)• HYBRIDATION • AMPLIFICATION GENIQUE / PCR

PRELEVEMENTS 

Tuberculose pulmonaire

• Expectoration • Tubages gastriques• Aspirations bronchiques• Lavages broncho-

alvéolaires

Répéter les prélèvements

( au moins 3 )

Tuberculose extra-pulmonaire

• Liquide pleural • LCR• Urines• Liquides de ponction :

péricardique, articulaire

Ganglionnaire• Hémocultures

Coloration de Ziehl-Neelsen • Coloration à l’Auramine O

Examen microscopique

Méthode simple peu coûteuse.Rapide (< 1H)

TBC bacillifères Contagieuses Isolement

M. quantitative

Gravité de la tuberculose

Evolution sous traitement

Non spécifique: BAAR (genre)

Peu sensible 5.103 à 104 bacilles /ml

Résultat négatif

n’exclut pas le diagnostic

CULTURE

MICROSCOPIE

PERFORMANCE de la MICROSCOPIE

Sensibilité

%

Spécificité

%

VPP

%

Levy (1989)

Gordin (1990)

Kramer*1990

Kim 1984

Greenbaum 1980

Klein 1989

53.1

45.7-55.3

61

74.4

32-52

45* - 81

99.8

> 99

-

-

-

-

98.5

91.5 - 98

MICROSCOPIE

• Tuberculoses pulmonaires

– Adulte 60 - 80%

– Enfant < 20%

– HIV 40-50%

• Tuberculoses extra-pulmonaires

– M+ 10 - 40%

EXAMEN MICROSCOPIQUE

De la théorie a la pratique

Résultat négatif

n’exclut pas le diagnostic

CULTURE

CULTURE 

• Améliore les résultats de l’examen direct

sensibilité ( 60- 90%) – spécificité 100%

Isolement de la mycobactérie

Identification

Antibiogramme

Epidémiologie Critère de guérison (négativation ultérieure)

• Inconvénient: Lenteur : 21- 28 jours - 2mois

CULTURE

Traitement des échantillons

• Culture en milieu solide (LJ référence)• Culture en milieu liquide

Prlvts monomicrobiens: lyse concentration,

centrifugation

Prlvts polymicrobiens:

fluidification + décontamination

élimine la flore associée

 

DECONTAMINATION-FLUIDIFICATION

  

METHODES 

LAURYLSULFATE DE SODIUM

 Tacquet et Tison

SOUDE  Petroff

CHLORHEXIDINE N-Acétyl-L-Cystéine Soude

 Kubica

Prélèvement 2 ml maximum

       

HomogénéisationEt Décontamination

   

 Ajouter 3 ml deLaurylsulfate de sodium

 Vortexer

 Agitateur de Kahn

pendant 30 minutes

 Ajouter 2 ml de

soude à 4 % Vortexer

Placer à 37°c pendant 20 minutes + si le prelevement n’est pas correctement

fluidifie

Ajouter 2 ml de dithiothréitolVortexer

Agitateur de Kahn 15 minutesAjouter 6 ml de chlorhexidine

à 1%Vortexer

Agitateur de Kahn pendant 15 minutes

  Ajouter 2 ml de la solution :Soude/citrat+ N-Acétyl-L-Cystéine 0,5%VortexerAgitateur de Kahn 20 minutes

   

Neutralisation  

 Ajouter la solution

neutralisante jusqu’à virage au jaune

 Ajouter 18 ml de

tampon phosphate

 Ajouter 10 ml de solution

neutralisante

 Ajouter 18 ml

de tampon phosphate

  

Centrifugation 

  

20 minutes à 3500 tours / minute 

     

 *Décanter, Vortexer . Effectuer un étalement sur lames pour l’examen direct .*Reprendre le culot avec 0,2 à 0,5 ml de tampon phosphate pH 6,8 (volume pouvant varier en fonction du nombre de tubes à ensemencer ).*Ensemencer la totalité du culot à raison de 0,2 ml maximum par tube . 

 

CULTURE

• MILIEUX SOLIDES:– Lowenstein Jensen:

• méthode de référence

– Coletsos: pyruvate glycérolMycobactéries exigentes/ M.bovis, M.xenopi…

– Middelbrook 7H11

Résultat: 10 – 60 j

Bovis canetti africanum tuberculosis

Photochromogène shulgaii/T° gordonae scotochromogène/Shulgai

CULTURE EN MILIEU LIQUIDE AUTOMATISEE

BacT \Alert (BioMérieux):

mesure colorimétrique/CO2

BACTEC-MGIT(BD): Détection

d’un complexe fluorescent

après réduction de la tension

d’O2

MB Redox (Biotest): mesure

colorimétrique / système redox

des mycobacteries.

CULTURE EN MILIEU LIQUIDE AUTOMATISEE

•Lecture automatisée

•Résultat en 10- 14j

Techniques associées à l’identification

par sonde= réduction des délais du

diagnostic.

SENSIBILITE DES METHODES DE CULTURE P.Idigora et coll. Eu J Clin Microbiol infect Dis 2000 19:350-4

METHODES M+ (%) M- (%) M+ et M- (%)

Milieu liquide MGIT 960

95.5 88.4 93

L.Jensen 88.6 62.3 79.6

Coletsos 84.1 58 75.1

Middelb. 7H11 87.1 55.1 76.1

L.J+Colet+7H11 97.7 79.7 91.5

DELAIS DES DIFFERENTES METHODES DE CULTURE

P.Idigora et coll. Eu J Clin Microbiol infect Dis 2000 19:350-4

METHODES M+ (J) M- (J) M+ et M- (J)

Bactec MGIT 960 11 16.1 12.7

L.Jensen 21.4 26.7 22.8

Coletsos 21.3 26.8 22.7

Middelb. 7H11 10.4 20.7 13

L.J+Colet+7H11 12.2 23.3 15.5

IDENTIFICATION

• Identification classique: 3 - 4 semaines

• Temps de croissance

• Morphologie des colonies

• pigmentation

• caractères biochimiques

CARACTERES DIFFERENTIELS

Catalase

22 68 ºC

Niacine Nitrates PNB TCH

M.tuberculosis

M. bovis

M. africanum

M. Atypiques

+ -

+ -

+ -

+ +

+

-

d

-

+

-

d

d

S

S

S

R

+

-

-

+

ANTIBIOGRAMME

– Méthode des proportions

•Milieu solide LJ

•Milieu liquide

•Longue, fastidieuse laboratoire de référence

ANTIBIOGRAMME: METHODE des PROPORTIONS

• Apprécier le % de mutants R  au sein de la population bacillaire et de le confronter à 1 proportion dite «critique» de ces mutants

N(%)= Nbre de colonies sur milieu +ATB Nbre de colonies sur milieu Témoin

ATB CC° critique Proportions (mg/l) sur LJ critiques (%)

INH 0,2 1

Rif 40 1

Emb 2 1

Sm 4 1

• 0 , 2 m l

T T I N H I N H R I F R I F E E S S P Z P Z

1 0 - 5 1 0 - 3 1 0 - 5 1 0 - 3 1 0 - 5 1 0 - 3 1 0 - 5 1 0 - 3 1 0 - 5 1 0 - 3 1 0 - 2 1 0 - 4

I n c u b a t i o n 2 8 j

T : t é m o i n , I N H : I z o n i a z i d e , R i f : R i f a m p i c i n e , E : E t a m b u t o l , P Z : P i a z o l i n e , S : S t r e p t o m y c i n e .

C u l t u r e +

s u s p e n s i o n + h o m o g é i n i s a ti o nc a l i b r a t i o n = S ° B C G 1 m g / m l

1 0 - 3 1 0 - 5

N > % critique souche R

N < % critique souche S

DELAIS MOYENSDES METHODES CLASSIQUES

30j20j

ID+ ATB 20j

10j

ID + ATB 50j 60j

24j

15j

Liquide +Automate

Microscopie + Microscopie -

L.J

Culture

CONCLUSION

Maladie très grave, très contagieuse

Microscopie rapide

Diagnostic rapide+++

Peu sensible

Culture sensible Lente

Tuberculose /HIVMycobactéries atypiques Identification

Tuberculose MDR Détection rapide des résistances

Biologie moléculaire

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE DE LA

TUBERCULOSES

L. SLIM-SAIDI

Laboratoire de microbiologie hôpital A.Mami de l’Ariana

Amenophis IV Nefertiti

INTRODUCTION

• Tuberculose:1/3 population

mondiale

• T.B active– 8 millions de Nv cas /

an– Afrique 80% des cas– 3 million de morts

/an– SIDA

1990 2020

1 Infections respiratoires Maladies cardiaques

2 Diarrhées Dépression sévère3 Complications naissance Accidents

circulation4 Dépression sévère Attaque (AVC)5 Maladies cardiaques Maladie pulmonaire

chronique6 Attaque (AVC) Infections respiratoires7 Tuberculose Tuberculose8 Rougeole Guerre9 Accidents circulation Diarrhées10 Affections congénitales SIDA

Les 10 causes de mortalité les plus fréquentes

Mycobacterium tuberculosis

• Bacille de Koch

1882

• Principal agent de

la tuberculose

MYCOBACTERIES

• Mycobacterium tuberculosis Tuberculose

• Mycobacterium bovis • Mycobacterium africanum• Mycobacterium leprae Lèpre• Mycobacéries atypiques:

– M. kansasii gg, pneumopathies– M. marinum ulc. cutanées– M. scrofulaceum gg– M. avium-intracellulare gg, pneumopathies – M. fortuitum

CARACTERISTIQUES DES MYCOBACTERIES

• Bacilles aérobies strict, acapsulés, asporulés• Difficile à colorer• Paroi riche en lipides (ac.mycoliques,

Acido-Alcoolo-Résistance => BAAR

Résistance aux désinfectants, acides, bases, antiseptiques, antibiotiques

Résistance aux enzymes lysosomiales• Multiplication lente: 18H (E.coli 20 mn)• Culture 2 – 3 semaines et plus• Multiplication intracellulaire (PN, macrophages)

CARACTERISTIQUES DES MYCOBACTERIES

• Absence de facteurs de virulence identifiés/capsule, toxine, enzyme, phagocyté par les macrophages et PN dès sa pénétration dans l ’organisme

• Parasite intracellulaire facultatif => HSR, tropisme lymphatique

• Formation d’un granulome dans l ’organisme avec caseification : Diagnostic histopathologique

• Mutants résistants « souches sauvages » varie selon l’antituberculeux(1/105 INH, Sm - 1/ 107 Rif)

• Antibiogramme, association obligatoire d’antiTBC

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

• MICROSCOPIE• CULTURE (Lowenstein Jensen)

– Identification– Antibiogramme

Confirmation bactériologique tardive

Réduire délai de détection, d’identification

• RADIOMETRIQUE (BACTEC)• NON RADIOMETRIQUES (MGIT – MB redox)• HYBRIDATION • AMPLIFICATION GENIQUE / PCR

PRELEVEMENTS 

Tuberculose pulmonaire

• Crachats : matin au réveil

• Tubages gastriques• Aspirations

bronchiques• Lavages broncho-

alvéolaires

Tuberculose extra-pulmonaire

• Liq.pleural /biopsie pleurale• LCR• Urines• Liquides de ponction :

ascite, péricardique, articulaire

• Hémocultures• Ganglions

PRELEVEMENTS

• Prélèvements répètés 3 j de suite:- Afin d’accroître les chances de mise en évidence des

bacilles, l’émission du BK dans les liquides biologiques étant intermittente.

- Avant la mise en route de l’antibiothérapie.

• Dans les formes pulmonaires– première expectoration émise le matin. – tubage gastrique réalise le matin des le réveil.– Aspiration bronchique par fibroscopie .

• Dans les formes extra pulmonaires:

– LCR, sang, ponctions, biopsies, Urines

DIAGNOSTIC de la TUBERCULOSE

• MICROSCOPIE

EXAMEN MICROSCOPIQUE: Coloration de Ziehl-Neelsen

3 étapes:• Coloration à chaud/ fuschine phéniquée• Décoloration: acide /alcool• Contre coloration: bleu de méthylène

Lecture: microscope (x100)- 20’

EXAMEN MICROSCOPIQUE: Coloration à l’auramine

• Technique dérivée

• Lecture microscope à fluorescence (x25)- 5mn

• Résultat positif confirmer par un Ziehl

MICROSCOPIE

• Méthode directe, simple, peu

coûteuse.

• Détection rapide (< 1H)

• Etape essentielle diagnostic des

TBC bacillifères, contagieuses.

MICROSCOPIE QUANTITATIVE

Gravité de la tuberculose

Evolution sous traitement

Microscopie quantitative et concentration bacillaire :

Nombre de BAAR Réponse Cc de BAAR /ml crachat %crachat +

• 0 sur 300 champs - 100 à 1000 10 – 30

• 1 – 2 / 300champs + à contrôler

• 1 – 10/ 100 champs 1+ 2000 à 10 000 50 – 58

• 1 – 10/ 10 champs 2+ 30 000 à 50 000 90 – 96

• 1 – 10 / champ 3+ 100 000 95 – 100

• 10 ou plus / champ 4+ 300 000 à 500 000 ou + 99 - 100

EXAMEN MICROSCOPIQUE

• Non spécifique: BAAR

• Sensibilité: 5 103 à 104 bacilles /ml de

produit => 1 BAAR sur le frottis

• 10 bacilles => infection

PERFORMANCE de la MICROSCOPIE

Sensibilité

%

Spécificité

%

VPP

%

Levy (1989)

Gordin (1990)

Kramer*1990

Kim 1984

Greenbaum 1980

Klein 1989

53.1

45.7-55.3

61

74.4

32-52

45* - 81

99.8

> 99

-

-

-

-

98.5

91.5 - 98

MICROSCOPIE

• Tuberculoses pulmonaires

– Adulte 60 - 80%

– Enfant <20%

– HIV 40-50%

• Tuberculoses extra-pulmonaires

– M+ 10 - 40%

PRELEVEMENTS

• Prélèvements répétés 32-81%– Examen de 3 frottis améliore la sensibilité de la technique

• Tubages gastriques 10-34%

• Expectoration provoquée 87%

• Prélèvements endoscopiques 32-48%

– Aspiration 79%

– Brossage 20- 62.5%

– Biopsies 28-50%

• Crachats en postfibroscopie 5-21%

DIAGNOSTIC de la TUBERCULOSE

CULTURE

CULTUREsur milieu de Lowenstein-

Jensen • Technique de référence :

Moyen de diagnostic sensible ( 50 - 80%)

• Améliore les résultats de l’examen direct

Isolement de la mycobactérie Identification Antibiogramme Epidémiologie Critère de guérison (négativation ultérieure)

• Inconvénient: Lenteur : 21- 28 jours - 2mois

CULTURE

Traitement des échantillons :– Prélèvements polymicrobiens:

fluidification + décontamination

– Prélèvements monomicrobiens: lyse concentration, centrifugation

 

DECONTAMINATION-FLUIDIFICATION

  

METHODES 

LAURYLSULFATE DE SODIUM

 Tacquet et Tison

SOUDE  Petroff

CHLORHEXIDINE N-Acétyl-L-Cystéine Soude

 Kubica

Prélèvement 2 ml maximum

       

HomogénéisationEt Décontamination

   

 Ajouter 3 ml deLaurylsulfate de sodium

 Vortexer

 Agitateur de Kahn

pendant 30 minutes

 Ajouter 2 ml de

soude à 4 % Vortexer

Placer à 37°c pendant 20 minutes + si le prelevement n’est pas correctement

fluidifie

Ajouter 2 ml de dithiothréitolVortexer

Agitateur de Kahn 15 minutesAjouter 6 ml de chlorhexidine

à 1%Vortexer

Agitateur de Kahn pendant 15 minutes

  Ajouter 2 ml de la solution :Soude/citrat+ N-Acétyl-L-Cystéine 0,5%VortexerAgitateur de Kahn 20 minutes

   

Neutralisation  

 Ajouter la solution

neutralisante jusqu’à virage au jaune

 Ajouter 18 ml de

tampon phosphate

 Ajouter 10 ml de solution

neutralisante

 Ajouter 18 ml

de tampon phosphate

  

Centrifugation 

  

20 minutes à 3500 tours / minute 

     

 *Décanter, Vortexer . Effectuer un étalement sur lames pour l’examen direct .*Reprendre le culot avec 0,2 à 0,5 ml de tampon phosphate pH 6,8 (volume pouvant varier en fonction du nombre de tubes à ensemencer ).*Ensemencer la totalité du culot à raison de 0,2 ml maximum par tube . 

 

MISE EN CULTURE

• 2 tubes de L-J sont ensemencés pour chaque échantillon.

• Tubes incubés à 37C, inclinés et légèrement débouchés.

• Lecture:3emej (éliminer les tubes contaminés)

• Lecture chaque semaine, puis tous les 15 j.

• Réponse quantitative au 28eme j.

• Contrôle au 48eme j, 60eme j et au 3eme mois.

CULTURE

• AUTRES MILIEUX DE CULTURE:

=>Milieu Coletsos: M.bovis.

=>Milieux géloses: Middelbrook 7H10 - 7H11.

=>Milieux mixtes

=>Milieux liquides AUTOMATES

METHODES RADIOMETRIQUES (BACTEC)

• Mesure le 14CO2  à partir d’une culture contenant de l’acide palmitique radioactif.

• Détection précoce de la croissance: 10–18j M.tuberculosis• Avantages : rapide

Sensible

Recherche des mycobactéries dans les p.pathologiques/ 

Sang, ponctions, crachats décontaminés

Sensibilité aux antibiotiques

• Inconvénients :Appareillage coûteux ( 6x méthode classique )

Coût de fonctionnement

Produits radioactifs : contrainte de livraison, de stockage et d’élimination

METHODES NON RADIOMETRIQUES

• Nouveaux systèmes :

BACTEC-MGIT(BD): Détection d’un complexe

fluorescent après réduction de la tension d’O2

BacT \Alert (BioM): mesure colorimétrique/CO2

MB Redox (Biotest): mesure colorimétrique /

système redox des mycobacteries.

Techniques associées à l’identification par sonde =>

réduction des délais du diagnostic.

SENSIBILITE DES METHODES DE CULTURE

P.Idigora et coll. Eu J Clin Microbiol infect Dis 2000 19:350-4

METHODES M+ (%) M- (%) M+ et M- (%)

Bactec MGIT 960 95.5 88.4 93

L.Jensen 88.6 62.3 79.6

Coletsos 84.1 58 75.1

Middelb. 7H11 87.1 55.1 76.1

L.J+Colet+7H11 97.7 79.7 91.5

DELAIS DES DIFFERENTES METHODES DE CULTURE

P.Idigora et coll. Eu J Clin Microbiol infect Dis 2000 19:350-4

METHODES M+ (J) M- (J) M+ et M- (J)

Bactec MGIT 960 11

3 - 39

16.1

7 - 34

12.7

3 – 39

L.Jensen 21.4

6 - 60

26.7

14- 66

22.8

6 - 66

Coletsos 21.3

6 - 60

26.8

11 - 60

22.7

6 – 60

Middelb. 7H11 10.4

3 - 35

20.7

10 - 47

13

3 - 47

L.J+Colet+7H11 12.2 23.3 15.5

IDENTIFICATION

• Etiologies: M. tuberculosis; M. atypique

• Identification classique: 3 - 4 semaines• Temps de croissance• Morphologie• pigmentation• caractères biochimiques

• Identification par sondes nucleiques– Spécifique, rapide < 2H – Non applicable sur les produits

pathologiques ( > 104 bactéries/ml)

IDENTIFICATION :

Mycobactéries Catalase PAS TCH NIACINE ADN 22°C 68°C

• M. tuberculosis + - S R + +

• M.atypiques ++ + R S - -

AUTRES METHODES DE DIAGNOSTIC

METHODES CHIMIQUES

• Profil des acides mycoliques (HPLC):– Spécifique, peu sensible 2.5 106 bactérie\ml– Matériel coûteux

• Détection de l’acide tuberculostearique(CPG-SM):– Très sensible =>Echantillons cliniques,

rapide.– Réaction croisée.– Coûteuse, peu adaptée a la routine.

SEROLOGIE

• Technique immunoenzymatique:ELISA A 60

• Détection des anticorps IgG,IgM,IgA

• Peu spécifique ( faux négatifs et faux positifs )

• Peu sensible (< 60% )

• Antigènes spécifiques de M. tuberculosis:

– LSD, DAT, PGLTb1=> Spécificité de 98%, sensibilité

de 50-60% ( 70% en cas d’association)

• Pas de distinction entre tuberculose guérie ou

tuberculose évolutive

Pas de sérodiagnostic pour la TBC

Aucun sérodiagnostic ne permet actuellement de porter le

diagnostic d’une tuberculose

Sensibilité aux antituberculeux

• milieux solides (plusieurs semaines)

• milieux liquides (plus rapide)

• recherche de mutations par PCR ou puces

à ADN (rifampicine)

Test tuberculinique

• protéines de M. tuberculosis

• administration intradermique de 10 UI

• lecture à 72 h

• diamètre d’induration > 5 mm

Test tuberculinique

• positif :– sujet a été en contact et a

développé réponse immunitaire T-dépendante

– vaccination par BCG– augmentation franche

infection par BK ?

• négatif :– pas d’infection – phase initiale de primo-

infection– rougeole– déficit immunité cellulaire

Diagnostic anatomopathologique

• fragment biopsique– muqueuse

bronchique – plèvre– foie– ganglion

• lésions typiques :– granulome – BAAR

• Nécrose caséuse

CONCLUSION

• Microscopie: outil de base dans la lutte anti-tuberculeuse

• Culture: Méthode de référence: souche; ATB; épidémiologie

• Test rapide et sensible– =Diagnostic des tuberculoses

paucibacillaires; extrapulmonaires

BIOLOGIE MOLECULAIRE

• SONDES NUCLEIQUES

• AMPLIFICATION GENIQUE

• Puce à ADN

Diagnostic tuberculoses extrapulmonaires

Microscopie%

Culture%

autres

T. ganglionnaire

Méningite

Miliaire : crachat Urines LCR Hémoc

Mal de Pott

Articulaire

Urinaire

Péricardique

Péritonéale

30 (70-80*)

10-40

30

30

30

48

-

5

57

50 – 80

50 - 8015 - 40

3037*

80 -95

90

80 -95

30 –76

80

Cult biopsie 75%

PCR (80% ; 97%)Ag solubleS(80% ;100%)

LBA, biopsie…

Biopsie 95%

CONCLUSION

• Les nouvelles techniques actuellement proposées pour le diagnostic de la tuberculose, présentent certes un certains nombres d’avantages, contournant les difficultés rencontrées avec les méthodes classiques; mais aussi des inconvénients ( coût, contraintes, manque de recul, faux négatifs et faux positifs ),constituant des limites a leurs installation en routine.

• Elles restent toujours a confirmer par la culture classique.

ANTISEPTIQUES - DESINFECTANTS

ET MYCOBACTERIESAntiseptique Activité• Alcool 70° ++• Aldéhydes ++• Ammoniums quaternaires 0• Chlorhexidine 0• Chlore ++• Iode ++• Iodophores +• Hexachlorophène 0• Dérivés mercuriels 0

MICROSCOPIE

• Tuberculoses pulmonaires

– Adulte 60 - 80%

– Enfant <20%

– HIV 40-50%

• Tuberculoses extra-pulmonaires

– M+ 10 - 40%

MICROSCOPIE

• Tuberculoses pulmonaires– M+ 60 - 80%– M- C+ 20 - 30%– M- C- 10 - 20%

• Tuberculoses extra-pulmonaires– M+ 10 - 40%– M-/+ C+ 30 - 90%– M- C- ?

CARACTERES DIFFERENTIELS

PNB Catalase22 68 ºC

Niacine Nitrates TCH

M.tuberculosis

M. bovis

M. africanum

M. Atypiques

S

S

S

R

+ -

+ -

+ -

+ +

+

-

d

-

+

-

d

d

+

-

-

+

METHODES D’AMPLIFICATION GENIQUE

• Réaction de polymérisation en chaîne: (PCR)• Réaction Amplification-ligation:(LCR)• Réaction Amplification-transcriptionnelle: (TMA)• Réaction Amplification-displacement: (SDA)

- Sondes specifiques: 65KD, MPP64, IS 6110, 16S rARN

- Méthodes de diagnostic et d’identification directes, rapides.

- Spécifiques 97-98%

- Sensibilité varie en fonction du résultat de la bascilloscopie

INTRODUCTION

• Tuberculose: Problème majeur de santé publique.• Morbidité, mortalité importante, pays en voie de

développement.• OMS (Avril 2001) 2.109 personnes infectées.• 5 – 10% =>tuberculose.• Risque augmenté HIV.• Apparition de souches résistantes et

multirésistantes.

• TUNISIE: décroissance régulière depuis 1960.– En 2000 l’incidence est de 21cas \ 100.000 habitants.

DIAGNOSTIC de la TUBERCULOSE

• Microscopie

• Culture

• Autres Méthodes– Culture en milieu liquide et détection

radiométrique/colorimétrique– Chimique– Moléculaire: PCR

NOUVELLES TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC RAPIDE

- Détection rapide de la croissance par technique

radiométrique et non radiométrique.

- Détection de constituants spécifiques par méthodes

chimiques.

- Détection d’anticorps par méthodes immunologiques

- Biologie moléculaire