Étude du microbiome intestinal de Choristoneura fumiferana, la … · 2018. 4. 24. · iii Résumé La tordeuse des bourgeons dépinette (Choristoneura fumiferana) est l'un des insectes

Étude du microbiome intestinal de Choristoneura fumiferana, la tordeuse des bourgeons d’épinette

Mémoire

Mathieu Landry

Maîtrise en Microbiologie-Immunologie

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Mathieu Landry, 2015

iii

Résumé

La tordeuse des bourgeons d’épinette (Choristoneura fumiferana) est l'un des insectes ravageurs les plus

destructeurs au Canada. La principale méthode de contrôle de cet insecte est l’insecticide à base de bactéries

Bacillus thurigiensis (BT). La communauté bactérienne de l'intestin de la tordeuse des bourgeons de l'épinette

pourrait jouer un rôle dans l'action insecticide de BT, en plus de son rôle potentiel dans le métabolisme de

matière ligneuse. Cette étude visait à obtenir un premier aperçu des communautés bactériennes de l'intestin

de C. fumiferana et de mesurer l'effet des changements de régime alimentaire sur la composition de ces

communautés. Un groupe de larves a été élevé dans le laboratoire sur diète synthétique McMorran, tandis que

les deux autres groupes ont été recueillis sur le terrain sur le sapin baumier et l'épinette noire. L'intestin moyen

de larves a été extrait, broyé et l'ADN en a été extrait. La région V6-V8 des petites sous-unités ribosomiques

16S bactériennes a été amplifiée puis séquencée avec 454 GS FLX-titanium. Les séquences obtenues ont été

traitées, regroupées et classées avec le logiciel mothur. Nous avons trouvé que le microbiote intestinal de la

tordeuse était dominé par des Proteobactéries, principalement du genre Pseudomonas. En outre, le

microbiote des larves élevées sur l'alimentation synthétique était beaucoup plus riche en termes de diversité

taxonomique que pour les larves recueillies sur le terrain, et beaucoup plus uniforme entre chaque échantillon.

Nous en avons donc conclu que différentes méthodes d’élevage favorisaient différentes communautés

microbiennes dans l’intestin de C. fumiferana. Il reste à déterminer si cette différence est dûe au génotype de

l’insecte, son alimentation ou son environnement, et quel impact ont ces différences sur les capacités

métaboliques de l’insecte.

v

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................................... iii

Table des matières .............................................................................................................................................. v

Liste des tableaux et figures ............................................................................................................................... vii

Remerciements .................................................................................................................................................. ix

Avant-propos ...................................................................................................................................................... xi

1. Introduction ..................................................................................................................................................... 1

1.1. Le microbiome .............................................................................................................................................. 2

1.1.1. Le microbiome humain .......................................................................................................................... 3

1.1.1.1. Le microbiome de l’intestin humain ............................................................................................... 5

1.1.2. Les microbiomes intestinaux d’insectes ................................................................................................ 6

1.1.2.1. Microbiome spécifique à chaque groupe ....................................................................................... 6

1.1.2.2. Fonctions du microbiome chez l’insecte ........................................................................................ 7

1.1.2.3. Le microbiome chez les lépidoptères ............................................................................................ 8

1.1.2.4. Le microbiome de C. fumiferana .................................................................................................... 8

1.2. La tordeuse des bourgeons de l’épinette ..................................................................................................... 9

1.2.1. Description de l’insecte ......................................................................................................................... 9

1.2.1.1. Répercussions de C. fumiferana sur les forêts ............................................................................ 11

1.2.1.2 Cycle saisonnier de C. fumiferana ................................................................................................ 13

1.2.1.3. Aire de répartition de C. fumiferana ............................................................................................. 14

1.2.2. Hôtes et alimentation .......................................................................................................................... 15

1.2.2.1. Le sapin baumier ......................................................................................................................... 15

1.2.2.2. L’épinette blanche ....................................................................................................................... 15

1.2.2.3. L’épinette noire ............................................................................................................................ 15

1.2.2.4. La composition chimique et nutritive des aiguilles de conifère .................................................... 17

1.2.3. Régulation des populations de C. fumiferana ..................................................................................... 18

1.2.3.1. Agents pathogènes, prédateurs et climat .................................................................................... 18

1.2.3.2. Lutte contre C. fumiferana ........................................................................................................... 19

1.2.3.3. Bacillus thuringiensis ................................................................................................................... 20

1.3. Analyse du microbiome .............................................................................................................................. 21

1.3.1. Méthodes d’analyse du microbiome.................................................................................................... 21

1.3.1.1. Le gène ribosomique 16S ............................................................................................................ 21

vi

1.3.1.2. Culture des microorganismes ...................................................................................................... 23

1.3.1.3. Séquençage nouvelle génération ................................................................................................ 24

1.3.1.4. Séquençage d’amplicons 16S ..................................................................................................... 26

1.3.2. Statistiques et mesures reliées à l’étude du microbiome .................................................................... 29

1.3.2.1 Mesures de diversité ..................................................................................................................... 29

1.3.2.2. Arbres phylogénétiques ............................................................................................................... 30

1.3.2.3. Mesure Unifrac ............................................................................................................................ 31

1.3.2.4. La distance Bray-Curtis................................................................................................................ 32

1.4. Buts et motifs du présent travail de recherche ........................................................................................... 33

2. La composition des communautés bactériennes du mésentéron de Choristoneura fumiferana en fonction de

son alimentation. ............................................................................................................................................... 35

2.1. Résumé .................................................................................................................................................. 35

Composition of the spruce budworm (Choristoneura fumiferana) midgut microbiota as affected by rearing

conditions ...................................................................................................................................................... 36

ABSTRACT ................................................................................................................................................... 37

INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 37

MATERIALS AND METHODS ...................................................................................................................... 38

Experimental insects ................................................................................................................................. 38

Midgut dissections and DNA extraction .................................................................................................... 39

Choice of primers for Roche 454 pyrosequencing .................................................................................... 39

Pyrosequencing of the 16S rRNA gene .................................................................................................... 39

Sequence pre-processing ......................................................................................................................... 39

Data analysis ............................................................................................................................................ 40

Statistical analysis .................................................................................................................................... 40

RESULTS ..................................................................................................................................................... 40

Variation in richness among microbiotas (α-diversity) .............................................................................. 40

Overall composition of spruce budworm midgut microbiota ...................................................................... 42

Compositional variation among microbiotas (β-diversity).......................................................................... 43

DISCUSSION ................................................................................................................................................ 47

ACKNOWLEDGMENTS ................................................................................................................................ 49

REFERENCES.............................................................................................................................................. 49

3. Conclusion ..................................................................................................................................................... 53

4. Bibliographie .................................................................................................................................................. 57

vii

Liste des tableaux et figures

Tableau 1.1 – Associations entre problèmes de santé humaine et taxons bactériens d’après (Cho et Blaser,

2012) ................................................................................................................................................................... 4

Figure 1.1 – Larve de 6e stade de C. fumiferana (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

.......................................................................................................................................................................... 10

Figure 1.2 – Adulte de C. fumiferana (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts) .............. 10

Figure 1.3 - Nature cyclique des épidémies (Blais 1983) – Les dommages causés par C. fumiferana varient

grandement dans le temps. Les périodes de ravages importants, appelées épidémies, sont causées par

plusieurs facteurs contribuant à la prolifération de la tordeuse et arrêtées par d’autres facteurs, dont

l’épuisement de la nourriture, ce qui amène la phase endémique. ................................................................... 12

Figure 1.4 Cycle saisonnier de C. fumiferana. Source : Michel Cusson, Service Canadien des Forêts. .......... 12

Figure 1.5 - Aire de répartition de C. fumiferana au Canada, en Alaska et dans le nord-est des États-Unis

(Lumley et Sperling, 2011) ................................................................................................................................ 14

Figure 1.6 - Déplacement des populations de tordeuse vers le nord (Régnière 2012) – Carte réprésentant les

zones les plus touchées par C. fumiferana au 20e siècle (zone délimitée par les lignes noires). Les lignes

bleues délimitent la zone touchée par C. fumiferana au 19ème siècle et les lignes rouges délimitent la zone qui

sera vraisemblablement touchée au 21ème siècle. ............................................................................................. 14

Figure 1.7 - Aire de répartition du sapin baumier au Canada et au nord des États-Unis (Ressources naturelles

Canada, Service canadien des forêts) .............................................................................................................. 16

Figure 1.8– Aire de répartition de l’épinette blanche au Canada, en Alaska et au nord des États-Unis

(Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts) ......................................................................... 16

Figure 1.9 – Aire de répartition de l’épinette noire au Canada, en Alaska et au nord-est des États-Unis

(Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts) ......................................................................... 17

Figure 1.10 – Arbre de la vie de Woese démontrant la séparation en phylums des organismes vivants et la

distance génétique qui les sépare de l’ancêtre commun. Figure inspirée de (Woese et al., 1990) ................... 22

Figure 1.11- Taux de variabilité selon la position de la base dans la séquence du gène de l’ARN 16S de

Pseudomonas (d’après (Bodilis et al. 2012). Les pics identifiés V1 à V9 désignent les régions variables

pouvant être séquencées à des fins d’identification taxonomique. Le taux de variabilité en axe des Y est

mesuré en prenant en compte la fréquence moyenne dans une fenêtre de 50 bases de part et d’autre de

chaque position sur l’axe des X. ........................................................................................................................ 22

Tableau 1.2 - Comparaison de quelques méthodes de séquençage, permettant de déterminer quelle méthode

est la plus appropriée pour divers expériences. Source : Brian Boyle, coordonateur, plateforme d'analyse

génomiques, IBIS, U. Laval ............................................................................................................................... 25

Figure 1.12- Amplification des fragments lors du séquençage 454 de Roche (Metzker 2010). Les billes,

chacune dans leur microréacteur recouvert d’huile, sont soumises à une amplification PCR, recouvrant chaque

bille de fragments d’ADN identiques. ................................................................................................................ 25

Figure 1.13 – Amorces utilisées pour l’étude de biodiversité à partir du 16S bactérien. En bleu, séquences

complémentaires avec des régions conservées du 16S bactérien. En rouge, séquences d’identification

nécessaires au multiplexage. En vert, adaptateurs complémentaires aux amorces se trouvant sur les billes. En

gris, portion d’ADN à amplifier. .......................................................................................................................... 27

Figure 1.14 – Diagramme décrivant de façon schématique la procédure de regroupement des séquences en

OTU. .................................................................................................................................................................. 27

viii

Figure 1.15 – Exemple de résultat Unifrac (Lozupone et Knight 2005). La valeur D est la valeur Unifrac, qui

mesure à quel point chaque communauté est spécifique à son environnement. Les boîtes rouges représentent

des séquences provenant de l’environnement 1 alors que les boîtes bleues représentent les séquences

provenant de l’environnement 2. Ce qui est important est la distinction entre les branches rouges ou bleus

(uniques à un seul environnement et les branches violettes (communes aux deux environnements) .............. 31

Figure 2.1 - OTU rarefaction curves for each experimental group. Each group represents the aggregate of 12

individuals at 2 460 reads each (total 29 520 reads per group). Note that the balsam fir and black spruce

curves have overlapping 95% confidence intervals (i.e.: not significantly different). ......................................... 41

Figure 2.2 - Taxonomic distribution of reads at the phylum level for each experimental group. ........................ 43

Figure 2.3 - Taxonomic distribution of reads in the Proteobacteria for each experimental group. Only genera

comprising more than ~1% of the phylum are shown. ....................................................................................... 43

Figure 2.4 - Individual and group diversity patterns. Dendrogram of the Bray-Curtis distances between each

larva (left) and Sørensen similarities (right) between or within the three groups. Note that the individuals within

the two subclades of each fir and spruce group have high similarities (92-98% in parentheses) compared to

each group taken as a whole (62 and 67%). ..................................................................................................... 44

Table 2.1 List of top 10 OTUs within each experimental group, along with the names of the species they most

likely represent (from BLAST similarity)............................................................................................................. 44

Table 2.2 Sequences of primers used to amplify the 16S V6-V8 region for pyrosequencing (from Comeau et al.

2011). The dots are used to separate the different parts of the primers (Roche adaptor • multiplex identifier

(barcode) • specific primer). Multiplex identifiers are only present in the forward primers, hence there is only

one unique, shorter reverse primer. .................................................................................................................. 46

ix

Remerciements

Ces travaux de maîtrise n’auraient jamais vu le jour sans le support grandement apprécié de

plusieurs personnes.

Tout d’abord, je remercie chaleureusement mon directeur de recherche Roger Levesque, sans qui

rien de tout cela n’aurait été possible. Il m’a donné la chance de découvrir ce que c’était les études graduées.

Son grand enthousiasme, sa constante disponibilité et son ouverture d’esprit ont rendu ce projet un véritable

plaisir à accomplir. Je me considère chanceux d’être tombé sur un directeur d’une telle qualité.

Je tiens aussi à remercier Michel Cusson, qui a suivi ma formation scientifique depuis ma première

année de baccalauréat. Il a su me communiquer son amour pour la science, et c’est, entre autres, ce qui m’a

poussé vers les études graduées. Depuis qu’il m’a accueilli dans son laboratoire il y a de cela cinq ans, j’ai été

impressionné par son immense compréhension et sa patience pour bien former ses étudiants.

Plusieurs autres personnes ont joué un rôle dans l’élaboration de ce projet. Nicolas Derome, qui a su

guider le projet lorsqu’il était question d’écologie microbienne. Irena Kukavica-Ibrulj, qui m’a si souvent aidé en

laboratoire et qui me supportait constamment dans mon projet. Bryan Boyle et son équipe, pour leur travail et

leurs conseils techniques au niveau du séquençage. André Comeau, qui a eu la patience de m’enseigner

comment utiliser le logiciel mothur et m’a accompagné dans mes premiers pas en bioinformatique. Catherine

Béliveau m’a beaucoup aidé au niveau des techniques de PCR et de la conception d’amorces PCR. Deepa

Pureswaran, qui a collecté une grande partie de mes échantillons sur le terrain. Finalement, Clothilde

Bourgeois, qui m’a encouragé et supporté tout au long de ce projet. Un chaleureux merci à tous !

En dernier lieu, je tiens à remercier le CRSNG pour le financement de mes travaux dans le

laboratoire de Roger Levesque et le Marine Biology Laboratory de Woodshole pour la bourse me permettant

d’assister à la formation S.T.A.M.P.S.

xi

Avant-propos

Les sections Matériel & Méthodes et Résultats de ce mémoire sont présentées sous forme de

manuscrit d’article scientifique, au chapitre 2. Ce manuscrit, intitulé « La composition des communautés

bactériennes du mésentéron de Choristoneura fumiferana » sera soumis très bientôt à un journal scientifique.

La conclusion générale des expériences traitées dans le manuscrit terminera ce mémoire. L’article aura

comme co-auteurs André M. Comeau, Nicolas Derome, Michel Cusson et Roger C. Levesque. Ma contribution

à l’article s’est faite au niveau des manipulations, de l’analyse et de la rédaction. J’ai élevé les larves en

laboratoire, les ai disséquées et en ai extrait l’ADN. Les larves ont été collectées sur le terrain par Deepa

Pureswaran, une collaboratrice de Michel Cusson. Le séquençage a été fait par l’équipe de Bryan Boyle à la

plate-forme de séquençage de l’IBIS. J’ai fait l’analyse bio-informatique sous la tutelle d’André Comeau. Tout

ce travail a été fait sous la supervision de Roger Levesque et Michel Cusson, qui ont révisé l’article et le

mémoire.

1

1. Introduction

Chaque année, au Canada, les ravageurs forestiers sont responsables de pertes considérables pour

l’industrie forestière. Ces pertes se mesurent en termes de réduction de volume de bois récoltable et, par

conséquent, peuvent représenter des diminutions importantes de revenus. La récente épidémie du

dendroctone du pin ponderosa, sur la côte ouest, nous en fournit d’ailleurs un exemple très probant (Taylor et

al. 2006).

La lutte contre ces ravageurs s’avère parfois difficile, et les scientifiques sont constamment à l’affût de

stratégies plus efficaces et/ou plus respectueuses de l’environnement pour réduire les pertes engendrées par

les insectes nuisibles. L’épandage d’insecticides de synthèse conventionnels n’étant plus préconisé en milieu

forestier au Canada, les chercheurs tentent maintenant de mettre au point des outils de lutte biologique ainsi

que des approches visant à perturber, de façon spécifique, la physiologie de l’insecte dont on espère réduire

les dégâts. Par exemple, plusieurs initiatives de recherche actuelles visent le séquençage de génomes

d’insectes ravageurs en vue d’identifier des gènes qui constituent des cibles prometteuses pour le

développement de nouveaux produits antiparasitaires. La flore intestinale des insectes pourrait, elle aussi,

s’avérer une cible intéressante pour la mise au point de nouveaux outils de lutte, étant donné l’impact

important que ces micro-organismes sont soupçonnés avoir sur la biologie de leurs hôtes.

C’est dans ce contexte qu’a pris forme le présent projet de maîtrise. Ainsi, les travaux qui font l’objet de ce

mémoire visaient la caractérisation du microbiote intestinal de la tordeuse des bourgeons de l’épinette,

(Choristoneura fumiferana, un des plus importants ravageurs des forêts conifériennes de l’Amérique du Nord.

Dans les lignes qui suivent, je me penche d’abord sur la définition et le concept de « microbiome » et je

résume les connaissances actuelles sur les microbiomes d’insectes, en particulier ceux des Lépidoptères

(groupe auquel appartient C. fumiferana). La deuxième section porte sur le ravageur ciblé par la présente

étude, C. fumiferana: sa biologie, les dégâts qu’elle cause et les outils disponibles pour réduire son impact. Je

traite subséquemment des différentes approches disponibles pour la caractérisation des microbiomes, puis je

conclus en présentant les objectifs spécifiques à la présente étude.

2

1.1. Le microbiome

Les termes « microbiome » et « microbiote » définissent deux concepts très proches et sont souvent

utilisés de façon interchangeable pour désigner l’ensemble des populations microbiennes habitant une niche

écologique donnée. Par contre, le concept de microbiome désigne les tissus hôtes et les populations

microbiennes alors que le concept de microbiote ne prend en compte que les populations microbiennes elles-

mêmes (Whiteside et al. 2015).Dans le présent mémoire, le terme microbiome est utilisé dans la revue de

littérature car c’est de ce concept que traitent la majorité des sources utilisées. Le terme de microbiote est

utilisé pour l’expérience traitée dans ce mémoire, qui ne concerne pas vraiment les tissus hôtes des

populations microbiennes étudiées. La niche occupée par le microbiote peut être un élément de

l’environnement, comme un lac, ou faire partie d’un autre organisme, comme l’intestin d’un insecte ou le

poumon d’un humain. Finalement, il est important de considérer que les populations désignées par ces termes

disposent de leur propres génomes et capacités métaboliques, dont l’ensemble est appelé métagénome

(Whiteside et al. 2015).

Le microbiome peut rendre de nombreux services à l’hôte. Dans l’intestin humain, par exemple, les

microorganismes résidents ont un génome collectif de plus de ~250 000 gènes fonctionnels, constituant une

importante boîte à outils, par rapport aux ~20 000 gènes humains fonctionnels (Gill et al. 2006). Ces

populations occupent un espace et consomment des nutriments qui, autrement, pourraient être utilisés par des

pathogènes plus transitoires. Par contre, si l’équilibre de ces populations est perturbé, le microbiome peut

entrer en dysbiose, qui est un débalancement microbien. Ce phénomène peut favoriser l’émergence de

pathogènes parmi ses populations et la perte de précieuses fonctions apportées à l’hôte.

3

1.1.1. Le microbiome humain

Avec l’avènement des technologies de séquençage haut-débit, l’intérêt pour les microorganismes

habitant le corps humain s’est grandement développé. Le Human Microbiome Project, financé par le National

Health Institute (NIH), a généré plus de 2.3 téraoctets de données sous la forme de 35 milliards de séquences

d’amplicons ribosomiques 16S, couvrant 690 échantillons provenant de 300 Américains (Cho et Blaser 2012).

D’autres projets visent à assembler le métagénome des populations microbiennes de l’humain et à comparer

cet assemblage avec le génome humain pour connaître la contribution fonctionnelle de ces populations. Ces

travaux ont pour but d’évaluer l’existence d’associations entre les maladies humaines et l’identité et la diversité

des microorganismes habitant l’humain. Déjà, on a noté une association entre plusieurs maladies et des

taxons bactériens particuliers (Tableau 1).

L’humain hérite d’une partie de la composition du microbiome de sa mère, influencé à la fois par

l’accouchement, l’allaitement et le contact direct après l’accouchement. Une perturbation comme la prise

d’antibiotique ou un changement de diète radical peut donc non seulement influencer le microbiome de la

mère mais aussi celui de sa progéniture (Cho et Blaser 2012).

L’étude du microbiome est aussi très intéressante dans le cas de maladies liées à une

immunodéficience partielle ou complète. Des bactéries jusqu’alors inoffensives prolifèrent hors de tout contrôle

et mettent en danger la santé humaine. Un exemple intéressant est la fibrose kystique, causée par un défaut

génétique rendant extrêmement difficile l’évacuation du mucus des poumons. Ceci crée un environnement

idéal pour des taxons bactériens comme Pseudomonas qui utilisent ce mucus pour se protéger du système

immunitaire. Une communauté microbienne importante se développe alors dans les poumons et forme un

biofilm réduisant grandement l’efficacité des traitements antibiotiques (Fodor et al. 2012). Un exemple similaire

est fourni par le développement du SIDA, au cours duquel l’épithélium du tractus intestinal est endommagé.

Ceci permet aux bactéries du microbiome intestinal de se déplacer vers les tissus avoisinants et de mettre le

système immunitaire en état d’alerte constant. Cette réaction immunitaire importante va contribuer

grandement à l’épuisement du système immunitaire et mener à l’immunodéficience typique du SIDA

(Cunningham-Rundles et al. 2011).

4

Tableau 1.1 – Associations entre problèmes de santé humaine et taxons bactériens d’après (Cho et Blaser, 2012)

Problème de santé Liens démontrés avec le microbiome

Psoriasis Proportion augmentée de Firmicutes/Actinobactéries

Reflux oesophagien Microbiome oesophagien dominé par des anaérobes à Gram négatif;

microbiome gastrique dépourvu d'Helicobacter pylori

Obésité Proportion diminuée de Bacteroidetes/Firmicutes

Asthme juvénile Absence d'Helicobacter pylori dans l'estomac (surtout le génotype

cagA)

Maladies inflammatoires

chroniques intestinales Populations abondantes d'Enterobacteriaceae

Colopathie fonctionnelle Populations abondantes de Veillonella et Lactobacillus

Cancer colorectal Populations abondantes de Fusobacterium

Maladies cardiovasculaires Métabolisme de la phosphatidylcholine dépendant du microbiome

intestinal

5

1.1.1.1. Le microbiome de l’intestin humain

Pour diverses raisons, l’intestin est l’organe dont le microbiome a été le mieux étudié chez l’humain. D’abord,

c’est l’organe affichant la plus grande abondance bactérienne, contenant dix fois plus de cellules bactériennes

que le corps humain ne contient de cellules humaines. C’est aussi un milieu facile à échantillonner, par les

selles. Finalement, le microbiome de l’intestin joue un rôle important dans la digestion, mais influence aussi la

sévérité de problèmes de santé tels l’obésité, le cancer colorectal et la maladie de Crohn (Kostic et al. 2014).

Le facteur le plus significatif reliant la santé humaine et le microbiome intestinal est la stabilité de ce dernier

(Backhed et al. 2012). Bien que les effets à long terme causés par les perturbations du microbiome n’aient pas

encore été pleinement évalués, les effets immédiats se présentent sous la forme de diarrhées, de colites, de

perturbations du métabolisme et de risques augmentés d’infection. Ces perturbations des populations du

microbiome peuvent être causées par un changement drastique de diète, un traitement antibiotique ou bien

d’autres facteurs extrinsèques.

A ce jour, il s’est avéré impossible d’identifier un microbiome intestinal "coeur" (c’est-à-dire espèces

microbiennes communes à tous les individus) chez les humains en santé. Les variations liées à l’âge, la diète,

le type d’accouchement, le génotype et le mode de vie sont trop grandes d’un individu à l’autre pour que des

taxons communs puissent être identifiés. Par contre, des fonctions métaboliques attribuées au microbiome

intestinal sont présentes chez tous les individus en santé (Backhed et al. 2012). Il est donc plus approprié de

parler de métagénome microbien "coeur" pour les humains en santé. Ce métagénome se divise en deux

groupes de fonctions principales, soit les interactions avec le système immunitaire et la métabolisation de la

nourriture. Certains microbes habitant l’intestin jouent un rôle dans la conversion des composés nutritifs ou

dans la détoxification de produits nocifs pour l’intestin humain. D’autres microbes interagissent avec le

système immunitaire et contribuent à son développement et sa bonne régulation (Cho et Blaser 2012).

6

1.1.2. Les microbiomes intestinaux d’insectes

Qu’ils soient des producteurs, des ravageurs ou simplement nuisibles, les insectes sont d’une grande

importance pour l’homme. Ils peuvent aussi servir de modèle pour l’étude de microbiomes d’organismes plus

complexes. L’étude du microbiome des insectes est grandement facilitée par le fait qu’ils se développent

rapidement, se reproduisent en grands nombres, sont faciles à élever et leur utilisation n’est pas soumise à

des contraintes éthiques. Par contre, en raison de leur petite taille, l’échantillonnage signifie souvent la mort

pour l’insecte étudié. Ceci empêche ainsi l’échantillonnage du même insecte à plusieurs points dans le temps.

Comme la plupart des organismes vivants possédant un système digestif, les insectes ont eux aussi un

microbiome intestinal. L’intestin des insectes est divisé en trois parties (Engel et Moran 2013). L’intestin

antérieur (stomodéum) est d’origine ectodermique et peut servir de réservoir de nourriture. L’intestin moyen,

ou mésentéron, est l’endroit où se produit en grande partie la digestion, c’est pourquoi l’expérience présente

s’attarde particulièrement à cette portion de l’intestin. Il est d’origine endodermique. L’intestin postérieur

(proctodéum) joue un rôle dans l’absorption de l’eau et des sels ainsi que dans l’expulsion des excréments et

est d’origine ectodermique. L’intestin d’insecte est un milieu très instable pour le maintien d’un microbiome.

Ceci est principalement dû au fait que l’intestin subit d’importantes perturbations causées par les changements

développementaux que l’insecte traverse (Engel et Moran 2013). Les bactéries formant le microbiome

intestinal d’insectes peuvent, comme chez l’humain, jouer un rôle dans la digestion des nutriments et la

régulation du système immunitaire (Engel et Moran 2013). Ils joueraient aussi un rôle dans la protection contre

les agents pathogènes chez une grande majorité des espèces d’insectes étudiées. Entraîner des perturbations

supplémentaires de ce microbiome pourrait avoir des effets néfastes sur la santé de l’insecte, et serait

possiblement un moyen de contrôle alternatif contre les insectes considérés comme nuisibles.

1.1.2.1. Microbiome spécifique à chaque groupe

Les insectes forment une des classes du vivant démontrant la plus grande diversité en termes

d’espèces. Il n’est donc pas surprenant que les microbiomes d’insectes varient immensément d’un groupe

d’insectes à l’autre. Le fait que les habitudes alimentaires varient énormément à l’intérieur de la classe des

insectes explique en bonne partie ce phénomène (Engel et Moran 2013). Par exemple, les détritivores comme

les termites, criquets et cafards possèdent les microbiomes avec la plus grande charge bactérienne (Cazemier

et al. 1997). Les différents microbiomes peuvent aussi être reliés aux divers types spécifiques de système

digestifs à chaque groupe d’insectes. Certains insectes possèdent un système digestif doté d’adaptations,

permettant le maintien de populations microbiennes contribuant à leur survie. Parmi ces adaptations on

compte les replis et les poches dans l’épithélium intestinal, permettant aux microbes de mieux résister aux

7

perturbations subies par le système digestif, ce qui améliore la stabilité du microbiome intestinal. Une autre

adaptation intéressante est observée chez le termite, dont l’intestin est constitué de plusieurs compartiments,

chacun contenant des populations microbiennes différentes. Ces compartiments permettent aux bactéries qui

les habitent de maintenir les conditions physicochimiques (pH, ions) optimales à leur prolifération (Breznak et

Brune 1994).

1.1.2.2. Fonctions du microbiome chez l’insecte

La présence d’un microbiome intestinal peut apporter de multiples bienfaits à l’insecte hôte. La contribution du

microbiome à la digestion est le premier avantage qui vient à l’esprit. Le termite est encore une fois un

excellent exemple, représentant un des partenariats insecte-microorganisme les mieux connus. L’appareil

digestif du termite est formé de plusieurs compartiments contenant cette flore microbienne et jouant le rôle de

microréacteurs ayant chacun sa part à jouer dans la digestion. Les principales fonctions métaboliques

attribuées aux microorganismes habitant cet insecte sont l’hydrolyse de la cellulose et de l’hémicellulose, la

fermentation de produits complexes en acides gras et finalement le recyclage de l’azote intestinal et sa

fixation. Ces fonctions font intervenir des protozoaires, des champignons et des bactéries (Breznak et Brune

1994). En ce qui concerne ces dernières, la majorité des espèces de termites possèdent un microbiome

dominé par les Protéobacteries, les Spirochètes, les Bacteroidetes et les bactéries à Gram positif à faible

contenu en G+C (Kudo et al. 1998). Lors des premières avancées dans la caractérisation des microbiomes

d’insectes, on supposait que la plupart des bactéries qui en faisaient partie avaient un rôle à jouer dans la

digestion. Or, il s’avère maintenant que plusieurs insectes n’ont peu ou pas besoin des microbes dans leur

système digestif pour digérer leur nourriture (Calderón-Cortés et al. 2012). Par contre, diverses autres

fonctions ont été attribuées aux bactéries habitant les intestins d’insectes.

Le microbiome fournit une résistance à la colonisation des parasites et agents pathogènes tel que

montré chez l’abeille, le moustique et certains criquets (Engel et Moran 2013). Chez la drosophile, le

microbiome contribue au développement et au maintien de l’épithélium intestinal (Buchon et al. 2013).

Certaines molécules toxiques ingérées avec la diète, des insecticides par exemple, peuvent être métabolisées

et inactivées par des bactéries du microbiome, comme chez la punaise (Kikuchi et al. 2012). Finalement, les

bactéries du microbiome peuvent fournir à certains insectes des molécules nécessaires à la communication,

comme des phéromones (Dillon et al. 2002).

8

1.1.2.3. Le microbiome chez les lépidoptères

Les Lépidoptères sont un ordre d’insectes se nourrissant principalement de matière végétale. Ni des replis ni

des poches n’ont été observés dans le système digestif des Lépidoptères, ce système se présentant sous la

forme d’un tube assez simple, comparativement au système digestif d’autres insectes. Le pH à l’intérieur du

mésentéron de larves de Lépidoptères se situe autour de 11-12, limitant sévèrement la diversité des bactéries

pouvant le coloniser (Harrison 2001). Ce pH très élevé serait dû aux tannins présents dans la diète de la

majorité des Lépidoptères (Berenbaum 1980). Le système digestif des insectes de cet ordre ne semble donc

pas très bien adapté au maintien d’une communauté bactérienne stable et diverse.

Les études faites sur des larves de papillon démontrent que la majorité des bactéries composant leur

microbiome intestinal sont acquises dans la nourriture (Broderick et al. 2004). La nature de la diète a donc un

très grand impact sur la composition du microbiome intestinal de ces insectes. Par contre, certains taxons

bactériens semblent présents chez tous les individus de la même espèce de papillon, indépendamment de la

diète. Chez Lymantria dispar, Enteroccus faecalis domine le microbiome de tous les individus, ce qui pourrait

suggérer une transmission verticale de ce microbe (Broderick et al. 2004).

Le rôle du microbiome intestinal chez les Lépidoptères n’a pas encore été élucidé. Il a été proposé

que les bactéries du microbiome pouvaient neutraliser certaines molécules toxiques comme le tannin ou

certains insecticides (Xia et al. 2013). Le taxon bactérien des Enterobacteriaceae, qui domine le microbiome

de plusieurs Lépidoptères, jouerait un rôle dans la digestion des sucres (Anand et al. 2010). De plus, une

souche d’Aeromonas, isolée chez Samia cynthia pryeri, possèderait le bagage génétique nécessaire à la

digestion de polymères de xylane, qui est un composant important des membranes cellulaires végétales

(Narayan Roy et al. 2003). Par contre, d’autres études tendent à démontrer que ces bactéries ne sont pas

nécessaires à la digestion chez l’insecte (Calderón-Cortés et al. 2012).

1.1.2.4. Le microbiome de C. fumiferana

La caractérisation complète du microbiome de C. fumiferana, la tordeuse des bourgeons de

l’épinette, n’a toujours pas été réalisée. Des expériences en culture réalisée auparavant ont montré une

prédominance des espèces Enterococcus mundtii et Staphyloccocus succinus parmi les bactéries cultivables

de l’intestin de C. fumiferana. Parmi les taxons moins abondants, on a répertorié Bacillus subtilis et des

espèces appartenant aux genres Pseudomonas et Paenibacillus. Ces travaux ont aussi démontré que

l’auréomycine présente dans la diète synthétique n’était pas assez efficace pour éliminer les bactéries de

9

l’intestin (van Frankenhuyzen et al. 2010). Une autre étude concernant le lien diète-microbiome chez C.

fumiferana a démontré que les sucs intestinaux d’insectes se nourrissant de sapin baumier inhibaient la

croissance bactérienne, contrairement aux sucs intestinaux d’insectes se nourrissant de diète synthétique

(Pang 2010). Ainsi, on peut soupçonner que le microbiome de l’intestin de tordeuses se nourrissant de

conifères est moins diversifié que si ces dernières se nourrissaient de diète synthétique. Ce milieu intestinal

plus hostile à la croissance bactérienne est une explication potentielle pour laquelle l’insecticide Bt est moins

efficace en champ qu’en laboratoire (Tabashnik 1994).

1.2. La tordeuse des bourgeons de l’épinette

C. fumiferana est l’un des ravageurs forestiers les mieux connus au Canada. Elle fait partie de la famille des

Tortricidae et du complexe d’espèces des tordeuses, lequel compte plus de huit espèces de Choristoneura

étroitement apparentées à C. fumiferana (Brown 2005). La larve de l’insecte se nourrit des jeunes pousses de

sapin et d’épinette, causant d’importantes pertes en matière ligneuse. Ces pertes sont évaluées à 32 à 43

millions de m3 de bois chaque année dans la forêt boréale canadienne et sont le résultat de perte de

croissance ou de mortalité d’arbres trop affaiblis pour survivre (Fournier et al. 2010). De plus, les

gouvernements et les compagnies forestières doivent dépenser des millions en épandage d’insecticide pour

minimiser les dégâts causés par ce fléau.

1.2.1. Description de l’insecte

Les œufs sont adossés les uns aux autres sous forme de masses soyeuses aplaties, de couleur vert pomme

passant au brun puis au blanc-soie après l'éclosion. La larve est une chenille de couleur brune, tachetée de

blanc, ayant une longueur, au sixième (dernier) stade, d’environ 25 mm (Figure 1.1). La chrysalide est de

couleur rougeâtre et mesure environ 20 mm. La forme adulte est un papillon de grosseur moyenne, de couleur

gris-brun et tacheté de blanc, avec une envergure des ailes d’environ 22 mm (Figure 1.2) (Martineau 1985).

10

Figure 1.1 – Larve de 6e stade de C. fumiferana (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

Figure 1.2 – Adulte de C. fumiferana (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

11

1.2.1.1. Répercussions de C. fumiferana sur les forêts

Au stade larvaire, la tordeuse se nourrit d'aiguilles de conifères. Elle a une préférence pour les jeunes

pousses et c'est pourquoi les premières cibles sont les bourgeons fraîchement débourrés. Si la population de

tordeuses est faible, les bourgeons suffisent pour satisfaire l'appétit des larves et l'arbre ne perd que son

feuillage de l’année courante. Par contre, si ceci se produit plusieurs années en succession, le feuillage

s'éclaircit progressivement chaque année jusqu'au point où il n’est plus en quantité suffisante pour maintenir

l'arbre en vie. Ceci se produit généralement suite à quatre années de défoliation consécutives. Avec des

populations de tordeuse importantes, les arbres sont beaucoup plus à risque de mourir, car les chenilles

s'attaquent aussi au feuillage des années précédentes. L'arbre peut ainsi être privé de la presque totalité de

son feuillage. Même dans les cas où les dommages causés par les chenilles n’entraînent pas la mortalité, les

arbres touchés accusent des pertes de croissance. Les arbres ayant survécu se développent avec une forme

caractéristique de baïonnette, un des signes les plus évidents d'une invasion de C. fumiferana (McLintock

1955), outre l’abondance d’arbres morts.

Des invasions sévères de C. fumiferana se produisent tous les 30 à 50 ans et couvrent des territoires

de superficie variable. La probabilité d’apparition d’une épidémie varie de façon cyclique au fil des ans (Figure

1.3). La fin des épidémies est, en partie, entraînée par la raréfaction de la nourriture pouvant supporter les

populations importantes de chenilles. Une épidémie est présentement en cours au Québec, avec des millions

d’hectares défoliés chaque année au Lac-Saint-Jean, sur la Côte-Nord et plus récemment dans le Bas-Saint-

Laurent (Regnière 2014)

12

Figure 1.3 - Nature cyclique des épidémies (Blais 1983) – Les dommages causés par C. fumiferana varient grandement dans le temps. Les périodes de ravages importants, appelées épidémies, sont causées par plusieurs facteurs contribuant à la prolifération de la tordeuse et arrêtées par d’autres facteurs, dont l’épuisement de la nourriture, ce qui amène la phase endémique.

Figure 1.4 Cycle saisonnier de C. fumiferana. Source : Michel Cusson, Service Canadien des Forêts.

13

1.2.1.2 Cycle saisonnier de C. fumiferana

C. fumiferana a un cycle saisonnier assez simple qui dure un an. Les œufs sont pondus sur des aiguilles des

arbres hôtes au mois de juillet/août. Une dizaine de jours plus tard, les larves éclosent et commencent à se

chercher un abri pour passer l’hiver, souvent sur l’écorce de la cime des arbres où elles se tissent un

hibernacle en soie à l’intérieur duquel elles muent au deuxième stade avant d’entrer en diapause pour l’hiver.

Le printemps venu, les chenilles reprennent leur activité et commencent à arpenter les branches à la

recherche de bourgeons nouvellement débourrés. Elles peuvent aussi se nourrir des aiguilles des années

précédentes jusqu’à ce que les bourgeons débourrent. La larve pénètre alors dans le bourgeon et s’y réfugie

pour le consommer de l’intérieur, ou bien se tisse un abri en soie autour des jeunes aiguilles pour les manger

avec plus de facilité. Les chenilles continuent à se nourrir et traversent quatre autres stades larvaires jusqu’au

cœur de l’été, moment auquel elles se transforment en chrysalides. Une à deux semaines plus tard, les

papillons émergent. Ils ne se nourrissent pas et leur brève existence d’environ deux semaines ne consiste

qu’à s’accoupler et à pondre des œufs (Martineau 1985).

14

1.2.1.3. Aire de répartition de C. fumiferana

L’aire de répartition de C. fumiferana couvre une très grande partie du territoire canadien (Figure 1.5).

Cependant, on observe présentement un déplacement vers le nord des populations de tordeuse. Les

changements climatiques et leur influence sur le cycle d’émergence des bourgeons de conifères est la

principale raison avancée pour expliquer ce déplacement (Régnière 2012).

Figure 1.5 - Aire de répartition de C. fumiferana au Canada, en Alaska et dans le nord-est des États-Unis (Lumley et Sperling, 2011)

Figure 1.6 - Déplacement des populations de tordeuse vers le nord (Régnière 2012) – Carte réprésentant les zones les plus touchées par C. fumiferana au 20e siècle (zone délimitée par les lignes noires). Les lignes bleues délimitent la zone touchée par C. fumiferana au 19ème siècle et les lignes rouges délimitent la zone qui sera vraisemblablement touchée au 21ème siècle.

15

1.2.2. Hôtes et alimentation

C. fumiferana tire tous les nutriments nécessaires à sa survie de la matière végétale. Plus particulièrement, la

larve se nourrit d’aiguilles de conifères. Elle privilégie les jeunes aiguilles des bourgeons fraîchement

débourés, mais en situation d’indisponibilité, la larve s’attaque aux aiguilles plus âgées et aux fleurs mâles.

Les hôtes principaux de la tordeuse sont le sapin baumier (Abies balsamea), l’épinette blanche (Picea glauca),

l’épinette rouge, (Picea rubens) et dans une moindre mesure, l’épinette noire (Picea mariana)

(http://www.rncan.gc.ca/forets/insectes-maladies/13404).

1.2.2.1. Le sapin baumier

Le sapin baumier est l’hôte de prédilection de C. fumiferana. C’est un conifère poussant dans divers

sols et sous les climats observés dans les forêts septentrionales du centre et de l’est du Canada. Cet arbre

peut atteindre une taille de 25 mètres et un âge de 150 ans. On l’observe dans des forêts consistant

seulement de sapin baumier ou bien avec des peupliers faux-trembles, des bouleaux à papier, des épinettes

blanches, des épinettes noires, des épinettes rouges et des pruches du Canada (figure 1.7). L’arbre est

principalement utilisé pour les sapins de Noël, le bois d’œuvre ou les pâte et papiers

(http://tidcf.nrcan.gc.ca/fr/arbres/fiche/38).

1.2.2.2. L’épinette blanche

L’épinette blanche est la deuxième espèce d’arbre la plus touchée par C. fumiferana. Le nom de

tordeuse des bourgeons de l’épinette vient du fait que lors des premières invasions de cet insecte, l’industrie

forestière utilisait principalement l’épinette blanche comme essence et voyait sa destruction comme le

principal impact de C. fumiferana (Martineau 1985). On trouve cet arbre partout au Canada sauf sur la côte du

Pacifique et dans le grand Nord (figure 1.8). L’épinette blanche peut atteindre 25 m de hauteur et peut vivre

jusqu’à 200 ans. Son bois est utilisé pour les pâtes et papier et le bois d’œuvre

(http://tidcf.nrcan.gc.ca/fr/arbres/fiche/38).

1.2.2.3. L’épinette noire

L’épinette noire est un conifère de plus en plus touché par la tordeuse des bourgeons de l’épinette,

en raison du déplacement vers le nord de cette dernière. On trouve l’épinette noire à travers la partie nord le

continent sur des sols généralement assez humides( figure 1.9). L’arbre peut atteindre jusqu’à 30 mètres en

16

hauteur et peut vivre plus de 200 ans. On peut le différencier des autres espèces d’épinette par ses courtes

aiguilles (0.5 à 1.5 cm), ses petits cônes et son port étroit. Son bois est utilisé pour les pâtes et papiers et le

bois d’œuvre (http://tidcf.nrcan.gc.ca/fr/arbres/fiche/39).

Figure 1.7 - Aire de répartition du sapin baumier au Canada et au nord des États-Unis (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

Figure 1.8– Aire de répartition de l’épinette blanche au Canada, en Alaska et au nord des États-Unis (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

17

1.2.2.4. La composition chimique et nutritive des aiguilles de conifère

Comme les aiguilles de conifères sont la seule source de nourriture connue des larves de tordeuse,

on peut supposer qu’elles contiennent tous les nutriments nécessaires à leur croissance. Des études faites sur

le contenu chimique des aiguilles d’autres conifères comme l’épinette de Norvège ont révélé une forte teneur

en lignine, cellulose et hémicellulose (Johansson 1995). Ces produits sont les principaux composants des

cellules végétales et sont probablement la principale source de carbone des larves de tordeuse. Chez

quelques insectes bien connus, la digestion de ces produits fait intervenir une symbiose avec un

microorganisme se trouvant dans le système digestif de l’insecte (Calderón-Cortés et al. 2012). On ne peut

donc exclure la possibilité que la digestion des aiguilles d’épinette et de sapin baumier se fasse, ne serait-ce

qu’en partie, par l’intermédiaire de microorganismes habitant le tube digestif des larves de C. fumiferana.

Ces aiguilles contiennent aussi plusieurs nutriments inorganiques comme l’azote, le phosphore, le

potassium, le calcium et le magnésium, tous en assez bonne quantité pour constituer une bonne source de

nourriture (Johansson 1995). Les aiguilles contiennent aussi des composés phénoliques appelés « tannins »

qui pourraient avoir un effet toxique sur les larves de tordeuse (Kumbaşlı 2005). Par contre, ces mêmes

tannins pourraient aussi diminuer la survie de la bactérie B. thuringiensis et ainsi diminuer l’efficacité du

principal moyen de contrôle de cet insecte (Pang 2010).

Figure 1.9 – Aire de répartition de l’épinette noire au Canada, en Alaska et au nord-est des États-Unis (Ressources naturelles Canada, Service canadien des forêts)

18

1.2.3. Régulation des populations de C. fumiferana

Étant donné les dommages importants causés par la tordeuse aux forêts canadiennes et à l’industrie

forestière, ses populations font l’objet de mesures de répression. La tordeuse compte déjà de nombreux

ennemis naturels (agents pathogènes, parasites et prédateurs) qui contribuent au maintien des populations à

de faibles densités pendant la phase endémique et à leur chute à la fin de la phase épidémique. Toutefois,

pendant les pullulations, il est nécessaire d’intervenir avec des pulvérisations insecticides afin de protéger les

peuplements les plus touchés. En 2014, deux produits sont homologués au Canada pour le contrôle de la

tordeuse, l’insecticide à base de Bacillus thuringiensis et le Mimic, un perturbateur de croissance, mais seul le

premier est autorisé au Québec.

1.2.3.1. Agents pathogènes, prédateurs et climat

Comme bien des organismes pluricellulaires, la tordeuse est l’hôte de divers agents pathogènes qui peuvent

mettre en péril sa survie et ainsi limiter sa prolifération. Parmi ces agents pathogènes se trouvent des

microsporidies, des champignons, des virus et des bactéries. La vulnérabilité de la tordeuse à ces divers

agents pathogènes varie en fonction de son stade de développement, de son alimentation et du climat (Morris

1963).

Les populations peuvent aussi être grandement diminuées par l’action des oiseaux prédateurs, qui se

nourrissent des larves et des chrysalides et en éliminent ainsi un grand nombre. Des araignées et de

nombreux insectes se nourrissent des œufs, des larves et des adultes de C. fumiferana. Parmi ces insectes,

les guêpes parasitoïdes comptent parmi les ennemis naturels ayant le plus grand impact sur les populations

de tordeuse. Ces guêpes pondent leurs œufs à l’intérieur de la cavité abdominale des embryons, des larves et

des pupes de C. fumiferana (Sippell 1982). Parmi les espèces les plus efficaces, on compte Tranosema

rostrale, Apanteles fumiferanae et Glypta fumiferanae. Certaines espèces ont été introduites par l’homme

dans des zones touchées par la tordeuse, sans grand succès (Morris 1963).

Le climat joue aussi un grand rôle dans la régulation des populations de tordeuses. Les larves sont

particulièrement vulnérables au climat à deux périodes de l’année. Après leur éclosion, elles doivent trouver

un abri avant les premières gelées d’automne et sont donc à la merci de vents forts et de gelées hâtives. Lors

de la sortie de leur hibernation, elles sont encore une fois vulnérables aux vents forts et aux gelées tardives du

printemps, jusqu’à ce qu’elles se tissent un abri en soie pour se nourrir des aiguilles. La dispersion par le vent

peut être responsable de la mort de jusqu’à 20% des larves chaque année. Des conditions climatiques

19

favorables à la prolifération de la tordeuse plusieurs années consécutives comptent parmi les facteurs

présumés importants au déclenchement d’une épidémie (Morris 1963).

1.2.3.2. Lutte contre C. fumiferana

Comme les facteurs de régulation naturels ne suffisent pas à limiter les pullulations de C. fumiferana, les

gouvernements provinciaux utilisent divers moyens pour combattre ce fléau. En détectant des signes avant-

coureurs d’une épidémie, comme une défoliation hâtive dans les forêts d’arbres matures, il est possible de

conserver une certaine quantité de bois en récoltant les peuplements les plus à risques avant l’arrivée de

l’invasion. Pendant la période endémique, les peuplements d’arbres vulnérables sont aménagés de façon à ce

que d’autres espèces d’arbres, résistantes à la tordeuse prolifèrent, augmentant la diversité du peuplement.

Malgré tout, l’épandage d’insecticide est souvent la méthode permettant de mieux protéger la forêt lors

d’invasions importantes. Le seul moyen ayant vraiment fait ses preuves est l’épandage aérien d’insecticide à

base de Bacillus thuringiensis. Cet insecticide est épandu dans les zones les plus à risque à travers le Canada

avec comme objectif de préserver au moins 50% du feuillage des zones touchées (Davidson 1999).

20

1.2.3.3. Bacillus thuringiensis

B. thuringiensis est une bactérie Gram positive sporulante du sol. On la trouve souvent dans des

environnements habités par des insectes. Cette espèce est particulièrement connue en raison de sa capacité

à produire un cristal, la delta-endotoxine, lors de la sporulation. Ce cristal a la capacité de créer des pores

dans la paroi du tube digestif de nombreux insectes, dont les larves de papillons, de mouches, de moustiques

et de Coléoptères (Cranshaw 2013). Les pores dans la paroi du tube digestif empêchent l’insecte de se

nourrir, mais permettent aussi le passage des microorganismes de l’intestin vers l’hémocèle de l’insecte. La

mort de l’insecte peut donc résulter d’une inanition et/ou d’une septicémie. Cette bactérie est l’un des

insecticides biologiques les plus utilisés sur la planète. Dans le cas de la lutte contre la tordeuse, c’est la

variété kurstaki, spécifique aux Lépidoptères, qui est utilisée (Davidson 1999). L’insecticide peut être très

efficace, mais doit être utilisé dans des conditions spécifiques pour que les résultats soient satisfaisants.

L’insecticide doit tomber directement sur les aiguilles et y rester; il ne doit donc pas être appliqué lors de pluies

et de forts vents. Il doit être appliqué après la sortie des aiguilles, mais assez tôt pour pouvoir accomplir son

action qui est assez lente. De plus, cet insecticide est assez coûteux, limitant la superficie des zones pouvant

être protégées. Des études ont aussi démontré que le tannins contenus dans les aiguilles de conifères

pouvaient inactiver la delta-endotoxine (Lüthy et al. 1985). Finalement, il peut aussi toucher des Lépidoptères

non-ciblés, ce qui pourrait entraîner des effets indirects non-souhaités. 1.1.2.4. Bacillus thuringiensis et son

lien avec le microbiome intestinal

La cause de la mort causée par B. thurigiensis et son lien potentiel avec le microbiome sont encore

sujet à controverse. Les premières études sur le sujet concluaient que la présence de bactéries commensales

dans l’intestin de l’insecte était nécessaire à l’action insecticide de B. thuringiensis (Broderick et al. 2006,

Broderick et al. 2009). Des études subséquentes sont toutefois arrivées à des conclusions inverses, la toxine

ayant entraîné la mort de larves de Lépidoptères axéniques (Johnston et Crickmore 2009, van Frankenhuyzen

et al. 2010). Ultérieurement, une autre équipe s’est penchée sur le sujet et leurs résultats ont suggéré que les

bactéries présentes dans l’intestin accéléraient la mort de l’insecte sans toutefois être essentielles (Mason et

al. 2011). En effet, les larves axéniques touchées par la toxine cessent de se nourrir et meurent de faim.

D’autre part, les pores intestinaux créés par la toxine permettent aux bactéries commensales d’accéder à

l’hémocèle de l’insecte et d’accélérer sa mort par septicémie. Finalement, d’autres facteurs comme la diète et

l’espèce d’insecte peuvent probablement influencer l’impact du microbiome sur l’efficacité de B. thuringiensis.

21

1.3. Analyse du microbiome

1.3.1. Méthodes d’analyse du microbiome

Comme le concept de microbiome est assez récent, peu de méthodes standardisées ont été

développées à ce jour pour en faire l’analyse. Les premières études d’écologie microbienne consistaient en

différentes étapes d’isolement, d’enrichissement et de croissance sur gélose suivies par différents tests

biochimiques visant à classer les microorganismes dans un taxon connu. Des pionniers comme Carl Woese

ont démontré l’utilité du gène codant pour l’ARN ribosomal 16S bactérien pour faire la classification

bactérienne (Fox et al. 1980). Aux fins d’analyse, le gène en question était cloné puis soumis à une digestion

avec des enzymes de restriction, générant un patron de restriction permettant l’identification du taxon. Mitchell

Sogin a ensuite développé un protocole d’isolation d’ARN et de rétro-transcription suivi par du séquençage

Sanger pour accélérer l’identification de bactéries (Lane et al. 1985). Suite à la découverte de la réaction

d’amplification en chaîne par polymérisation (PCR), il devint possible d’amplifier le gène codant pour l’ARN

ribosomal 16S chez les bactéries et l’ARN ribosomal 18S chez les eucaryotes. C’est à partir des résultats

obtenus en utilisant ces techniques que Woese a pu proposer sa version de l’arbre phylogénétique de la vie

(Woese et al. 1990) (Figure 10). Avec l’avènement du séquençage nouvelle génération, il devint possible de

faire séquencer tous les gènes du 16S ou 18S contenus dans un échantillon. Il fut aussi possible de

séquencer les génomes ou les ARN transcrits de tous les microorganismes contenus dans un échantillon.

1.3.1.1. Le gène ribosomique 16S

L’ARN 16S est un fragment d’ARN servant d’échafaudage à la petite sous-unité du ribosome

bactérien. Le gène codant pour ce dernier est un des gènes les mieux conservés du domaine bactérien. Par

contre, il est aussi constitué de régions hypervariables, comme l’illustre la Figure 1.11, où neuf régions

affichent un taux de variation nettement plus élevé. Cette structure particulière permet à ce gène d’être utilisé

comme marqueur de divergence phylogénétique ou simplement comme identificateur taxonomique. Les

régions conservées (creux dans la figure) permettent la conception d’amorces universelles pour le domaine

bactérien alors que les régions variables permettent de distinguer des bactéries au niveau de l’espèce. Chez

les eucaryotes, l’ADN ribosomique qui porte les gènes codant pour les ARN ribosomiques 18S, 5.8S et 28S,

ainsi que les deux espaces intergéniques ITS1 et ITS2 peut être utilisé aux mêmes fins (Hunt et al. 2004).

22

Figure 1.10 – Arbre de la vie de Woese démontrant la séparation en phylums des organismes vivants et la distance génétique qui les sépare de l’ancêtre commun. Figure inspirée de (Woese et al., 1990)

Figure 1.11- Taux de variabilité selon la position de la base dans la séquence du gène de l’ARN 16S de Pseudomonas (d’après (Bodilis et al. 2012). Les pics identifiés V1 à V9 désignent les régions variables pouvant être séquencées à des fins d’identification taxonomique. Le taux de variabilité en axe des Y est mesuré en prenant en compte la fréquence moyenne dans une fenêtre de 50 bases de part et d’autre de chaque position sur l’axe des X.

23

1.3.1.2. Culture des microorganismes

Avant l’avènement de la biologie moléculaire, la seule méthode d’identification des populations

microbiennes dans un échantillon naturel était l’isolement en culture. L’échantillon était homogénéisé et étalé

sur un milieu permettant à la majorité des organismes connus de croître, c’est-à-dire un milieu comportant des

sources de carbone et d’énergie faciles à métaboliser. On isolait ensuite chaque type microbien retrouvé, soit

par des méthodes physiques comme la striation en trois étapes, soit par étalement sur divers milieux sélectifs.

Une fois que l’on avait obtenu des cultures pures, il fallait utiliser divers tests biochimiques pour tenter de

classer les microorganismes isolés selon leurs capacités physiologiques ou métaboliques. Parmi ces tests, on

compte la dégradation des nitrites ou de certaines formes de glucose, les tests de motilité, la couleur des

colonies sur milieu MacConkey et la coloration de Gram. Le résultat de ces tests donnait un bon aperçu des

capacités métaboliques de la communauté microbienne de l’échantillon et permettent de classer certains de

ses composants dans des taxons connus (Dance et al. 1989).

Suite au développement de la PCR et du séquençage Sanger, le gène codant pour l’ARN faisant partie de la

petite sous-unité du ribosome devint un outil de choix permettant de classer les microbes en fonction de

l’espèce. La séquence de ce gène permet effectivement de différencier des bactéries appartenant à

différentes espèces. Donc, avec des amorces universelles 16S pour les bactéries ou 18S et ITS pour les

eucaryotes, on obtient un amplicon dont la séquence indique, lorsque comparée à une base de données, à

quel taxon appartient l’organisme en question. Pour les bactéries, il suffit donc d’isoler chaque organisme en

culture comme mentionné précédemment, d’extraire son ADN génomique et de l’amplifier par PCR avec les

amorces 16S. L’amplicon obtenu peut être séquencé par la méthode de Sanger et sa séquence peut être

comparée par analyses BLAST aux séquences déposées dans diverses bases de données telles que

Greengenes et Genebank (Lane et al. 1985).

La méthode par culture comprend quelques désavantages assez importants. Premièrement, moins de 1% des

espèces bactériennes connues à ce jour sont considérées cultivables (Ward et al. 1990). Cela diminue

grandement la valeur des recensements bactériens obtenus à partir de cultures, étant donné qu’ils ne

représentent qu’une infime partie de la population réellement présente dans l’échantillon. Deuxièmement, c’est

24

une méthode extrêmement inefficace en termes de temps et d’argent. Chaque espèce présente dans

l’échantillon doit être soumise à toutes les étapes du protocole. Donc si avant l’isolement on obtient 100

colonies différentes, cela veut dire 100 étalements et cultures pour chaque milieu sélectif utilisé, 100 réactions

PCR différentes et 100 échantillons à faire séquencer, sans compter les réplicats et témoins.

1.3.1.3. Séquençage nouvelle génération

Le développement de nouvelles méthodes de séquençage au cours des dernières décennies a

donné naissance à de nouveaux domaines de recherche et initié l’ère des technologies –omiques. Parmi les

avantages des méthodes de séquençage haut débit se trouvent le coût moindre par base et la rapidité de

séquençage (Tableau 1.2). Ces particularités ont grandement augmenté la faisabilité de projets de

séquençage de génome et d’études de biodiversité pour des laboratoires n’ayant pas nécessairement les

moyens de mener ces projets à terme par séquençage Sanger.

Toutefois, le principal avantage du séquençage haut débit pour l’étude des génomes et de la

biodiversité est la possibilité qu’il offre de séquencer à partir d’un mélange de fragments d’ADN différents

(contrairement au Sanger où chaque échantillon ne doit contenir que des fragments d’ADN identiques). Parmi

les appareils de séquençage haut-débit les plus utilisés on compte le GS-FLX+ de Roche, utilisant la

technologie de pyroséquençage 454, et les HiSeq et MiSeq d’Illumina utilisant la technologie « bridge

amplification » (Metzker 2010). Par contre, au cours des dernières années, les technologies Illumina ont

progressivement surpassé les capacités de la technologie 454 et sont maintenant le principal outil pour les

études génomiques et d’écologie microbienne.

25

Tableau 1.2 - Comparaison de quelques méthodes de séquençage, permettant de déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour divers expériences. Source : Brian Boyle, coordonateur, plateforme d'analyse génomiques, IBIS, U. Laval

Sanger 454 Illumina

Appareil 384 capillaires GS-FLX+ HiSeq2000

Longueur

moyenne (bases)

650-750 550-650 150

Longueur

maximale

(bases)

1000 1000 150

Quantité de

nucléotides par

analyse

(gigabases)

0.0003 0.6 600

Durée de

l’analyse

6 heures 2 jours 13 jours

Coût par

kilobase ($)

5 0.016 0.000032

Application la

mieux adaptée

Construction de

références

Séquençage de

novo et

amplicons

Séquençage et

transcriptomique

Figure 1.12- Amplification des fragments lors du séquençage 454 de Roche (Metzker 2010). Les billes, chacune dans leur microréacteur recouvert d’huile, sont soumises à une amplification PCR, recouvrant chaque bille de fragments d’ADN identiques.

26

Le pyroséquençage (figure 1.12) est effectué en fragmentant l’ADN et en liant des adaptateurs aux

extrémités de chaque fragment. Les fragments sont mélangés avec des billes couvertes d’amorces

complémentaires aux adaptateurs. Le ratio billes/ADN est tel que chaque bille portera un seul fragment. Les

billes, en solution dans l’eau sont alors couvertes d’huile de façon à ce que chaque bille soit contenue dans

une gouttelette aqueuse entourée d’huile, un type d’émulsion. Une amplification PCR est alors réalisée et

chaque gouttelette sert de microréacteur. Chaque bille est recouverte de fragments d’ADN identiques, simple

brin, l’huile est éliminée et le mélange de billes est coulé sur une plaque contenant des puits permettant

l’entrée d’une seule bille par puits pendant la centrifugation de la plaque. Celle-ci est subséquemment

recouverte d’un mélange d’enzymes, dont une DNA polymérase, une ATP sulfurylase et une luciferase.

Différents nucléotides sont appliqués de façon séquentielle et un ordinateur enregistre les signaux lumineux

captés par un photorécepteur et déduit ainsi la séquence des fragments (Metzker 2010).

1.3.1.4. Séquençage d’amplicons 16S

L’étude de la biodiversité d’un échantillon par séquençage d’amplicons 16 S est une des premières

méthodes d’écologie microbienne développées suite à l’avènement du séquençage haut débit. On extrait

l’ADN bactérien de l’échantillon et on amplifie une portion de la séquence du gène codant pour l’ARN 16S. La

technologie 454 est tout indiquée pour cette méthode, pouvant séquencer des fragments d’une longueur

équivalente au tiers du gène 16S. Les amorces utilisées contiennent déjà les adapteurs nécessaires (A et B

sur la Figure 1.13) et les amplicons obtenus sont mélangés avec les billes pour la poursuite de la procédure.

Chaque séquence obtenue représente un fragment d’ADN matrice pouvant être considéré comme un individu

bactérien, et ces séquences sont regroupées en "Operational Taxonomic Units" (OTUs). Ces derniers ne

peuvent être considérés comme représentant un niveau taxonomique formellement défini mais, en pratique, ils

permettent de ségréguer les organismes à un niveau se rapprochant de celui de l’espèce. Comme l’illustre la

Figure 1.14, les séquences ayant plus de 97% d’identité entre elles sont considérées comme appartenant à un

même OTU (Edgar 2013). Ainsi, le seuil de 97% d’identité est considéré comme le seuil permettant de

rassembler les séquences provenant vraisemblablement d’un même taxon. Chaque OTU généré par l’analyse

est donc considéré ici comme représentant un seul taxon.

27

Figure 1.13 – Amorces utilisées pour l’étude de biodiversité à partir du 16S bactérien. En bleu, séquences complémentaires avec des régions conservées du 16S bactérien. En rouge, séquences d’identification nécessaires au multiplexage. En vert, adaptateurs complémentaires aux amorces se trouvant sur les billes. En gris, portion d’ADN à amplifier.

Figure 1.14 – Diagramme décrivant de façon schématique la procédure de regroupement des séquences en OTU.

28

Les séquences sont comparées à celles déposées dans des bases de données d’ARN 16S bactérien

afin d’évaluer l’identité des espèces bactériennes présentes dans l’échantillon. Cette méthode permet de faire

un inventaire des espèces bactériennes présentes dans l’échantillon et de mesurer leur abondance relative.

On peut ainsi déterminer quelles espèces de bactéries sont favorisées sous certaines conditions et d’identifier

le microbiome « cœur » correspondant aux taxons présents dans tous les échantillons provenant de

l’environnement choisi. Par contre, cette méthode ne donne pas d’information sur l’identité des gènes

microbiens ou sur les voies métaboliques auxquelles ils participent.

29

1.3.2. Statistiques et mesures reliées à l’étude du microbiome

Au-delà de l’identification des microorganismes présents dans l’échantillon étudié, il est intéressant

d’évaluer à quel point ces microorganismes sont proches génétiquement, et comment les populations

bactériennes sont réparties parmi les taxons recensés. En raison d’un intérêt grandissant pour l’écologie

microbienne, de nombreuses méthodes statistiques et informatiques ont été développées pour obtenir ce type

d’information.

1.3.2.1 Mesures de diversité

La diversité est une valeur prenant en compte deux concepts extrêmement importants en écologie.

Elle prend en compte la richesse, qui est la quantité de taxons différents retrouvés dans une population, mais

elle prend aussi en compte l’abondance relative de chaque taxon, c’est-à-dire la proportion d’individus

appartenant à chaque taxon de la population. La diversité est souvent reliée à la stabilité et à la productivité

d’un environnement (Stirling et Wilsey 2001). Les deux indices les plus utilisés pour mesurer la diversité sont

l’indice Shannon et l’indice Simpson.

Le « Shannon index » fut proposé par Claude Shannon pour mesurer l’entropie de caractères dans

une ligne de texte. Ce concept repose sur le fait que plus il existe de caractères et plus ces caractères sont

utilisés à la même fréquence, plus le prochain caractère utilisé sera difficile à prédire. L’indice est calculé

comme suit :

Où R est la quantité de caractères (ou taxons) différents présents et pi est la proportion de caractères du type i

(abondance relative) dans la ligne de texte. Plus la valeur P varie parmi les divers caractères, plus l’indice se

rapproche de 0, et plus le caractère est facile à prédire (Shannon 1997).

Le « Simpson index », proposé par Edward H. Simpson, mesure la probabilité que deux individus pris

au hasard dans une population appartiennent au même taxon. L’indice est calculé ainsi :

30

Où R est la richesse et pi est l’abondance relative du taxon i. Comme la valeur diminue en fonction de la

diversité de la population, l’indice inverse Simpson est plus souvent utilisé en écologie, en divisant 1 par

l’indice Simpson obtenu (Simpson 1949).

1.3.2.2. Arbres phylogénétiques

Un arbre phylogénétique est une représentation graphique des relations de parenté entre organismes

vivants. Il permet de visualiser la proximité évolutive entre divers individus ou espèces inférées à partir de

critères biologiques telles la distance génétique. Ces arbres peuvent être construits à partir d’alignements de

séquences ou bien avec une matrice de distance génétique entre des séquences provenant des individus de

la population étudiée. « Clearcut » est un des logiciels les plus utilisés pour la production d’arbres

phylogénétiques dans le contexte d’études de microbiomes. Il utilise une variante à stringence limitée,

l’algorithme du neighbor-joining, qui consiste en l’utilisation de distances génétiques entre individus pour

évaluer leur niveau de parenté (Evans et al. 2006).

31

1.3.2.3. Mesure Unifrac

Lorsqu’on compare la composition de microbiomes provenant d’environnements différents ou

d’organismes soumis à des conditions différentes, il est intéressant d’avoir une mesure indiquant si ces

microbiomes sont significativement différents. La distance Unifrac permet de tester cette hypothèse. Elle se

calcule à partir d’un arbre phylogénétique.

Figure 1.15 – Exemple de résultat Unifrac (Lozupone et Knight 2005). La valeur D est la valeur Unifrac, qui mesure à quel point chaque communauté est spécifique à son environnement. Les boîtes rouges représentent des séquences provenant de l’environnement 1 alors que les boîtes bleues représentent les séquences provenant de l’environnement 2. Ce qui est important est la distinction entre les branches rouges ou bleus (uniques à un seul environnement et les branches violettes (communes aux deux environnements)

L’indice évalue à quel point chaque branche de l’arbre est unique à chaque environnement. Dans le

premier arbre, la moitié des branches est unique à l’environnement 1 (rouge) et l’autre moitié est unique à

l’environnement 2 (bleu). Ce qui pousse la distance Unifrac à son maximum de 1 et signifie que les

microbiomes de chaque environnement sont très différents. Dans le deuxième arbre, environ la moitié des

embranchements sont uniques (bleus ou rouges) alors que l’autre moitié sont des embranchements partagés

par les deux environnements (violets). Ceci donne une valeur de 0.5. Une valeur de 0 serait obtenue si

exactement les mêmes taxons étaient retrouvés dans les deux environnements. Cette distance est souvent

surestimée à cause de taxons très rares qui sont présents dans un seul environnement, mais dont l’impact sur

cet environnement est potentiellement négligeable. Plus précisément, ces taxons rares sont aléatoirement

détectés entre les différents échantillons, créant par la même une différenciation artéfactuelle entre les

32

échantillons. C’est pourquoi il est possible d’utiliser l’option « weighted » au moment de faire ce calcul, de

façon à prendre en compte l’abondance relative de chaque embranchement (Lozupone et Knight 2005)

1.3.2.4. La distance Bray-Curtis

Il est également possible d’évaluer la distance ou la dissimilarité entre les microbiomes de deux

environnements donnés du point de vue de l’abondance des espèces dans chacun des deux environnements.

L’indice Bray-Curtis mesure ainsi la divergence entre deux environnements en fonction des OTUs qu’on y

trouve et de leur abondance relative. Ce calcul permet de produire une matrice de distances pour chacun des

OTUS échantillonnés dans les différentes communautés comparées. Cette matrice peut être représentée par

une figure s’apparentant à un arbre phylogénétique, mais qui compare des environnements et plutôt que des

individus et qui les regroupe selon leur composition. La distance Bray-Curtis est mesurée comme suit :

où SA,I est le nombre d’individus dans l’OTU i de l’environnement A et où SB,I est le nombre d’individus dans

l’OTU i de l’environnement B (Greenacre et Primicerio 2014).

33

1.4. Buts et motifs du présent travail de recherche

Ce projet de maîtrise porte sur le microbiome de l’intestin de C. fumiferana. Les populations

microbiennes de l’intestin de tordeuse pourraient jouer un rôle dans la digestion de sa nourriture et dans la

protection contre les agents pathogènes, comme chez d’autres insectes (Engel et Moran 2013). De plus, le

contenu microbien de l’intestin pourrait avoir une influence sur l’efficacité de l’insecticide biologique Bt.

Finalement, cet insecte pourrait servir de modèle pour l’étude de microbiomes plus complexes.

Le travail présent visait d’abord l’établissement d’un premier inventaire des populations bactériennes

habitant l’intestin de C. fumiferana. Ces bactéries ont été identifiées et leur abondance relative a été mesurée

en fonction du nombre de séquences les représentant dans le jeu de donnée. Un deuxième objectif consistait

à évaluer l’impact de la diète des larves (diète artificielle, sapin baumier et épinette noire) sur la composition

de leur microbiome. Comme ce travail s’intéresse particulièrement à l’effet de la diète sur le microbiote, seule

la partie de l’intestin où la digestion (mésentéron) se produit à été étudiée. Il a ainsi été possible d’établir la

liste des taxons communs aux larves des différents traitements et de mesurer le niveau de dissimilarité entre

leurs microbiotes. Des indices de diversité ont également été comparés entre les différents groupes. Comme

dernier objectif, ce projet visait l’exploration du rôle du microbiome dans la digestion de l’insecte.

Conséquemment, la composition du microbiome intestinal de C. fumiferana a été comparée avec celle du

microbiome d’autres insectes, en particulier ceux pour lesquels des données existent sur le rôle du

microbiome dans la digestion.

35

2. La composition des communautés bactériennes

du mésentéron de Choristoneura fumiferana en

fonction de son alimentation.

2.1. Résumé

La tordeuse des bourgeons d’épinette (Choristoneura fumiferana) est l'un des insectes ravageurs les plus

destructeurs au Canada. La principale méthode de contrôle de cet insecte est l’insecticide à base de bactéries

Bacillus thurigiensis (BT). La communauté bactérienne de l'intestin de la tordeuse des bourgeons de l'épinette

pourrait jouer un rôle dans l'action insecticide de BT, en plus de son rôle potentiel dans le métabolisme de

matière ligneuse. Cette étude visait à obtenir un premier aperçu des communautés bactériennes de l'intestin

de C. fumiferana et de mesurer l'effet des changements de régime alimentaire sur la composition de ces

communautés. Un groupe de larves a été élevé dans le laboratoire sur diète synthétique McMorran, tandis que

les deux autres groupes ont été recueillis sur le terrain sur le sapin baumier et l'épinette noire. L'intestin moyen

de larves a été extrait, broyé et l'ADN en a été extrait. La région V6-V8 des petites sous-unités ribosomiques

16S bactériennes a été amplifiée puis séquencée avec 454 GS FLX-titanium. Les séquences obtenues ont été

traitées, regroupées et classées avec le logiciel mothur. Nous avons trouvé que le microbiome intestinal de la

tordeuse était dominé par des Proteobactéries, principalement du genre Pseudomonas. En outre, le

microbiome des larves élevées sur l'alimentation synthétique était beaucoup plus riche que pour les larves

recueillies sur le terrain, et beaucoup plus uniforme entre chaque échantillon. Nous en avons donc conclu que

différentes méthodes d’élevage favorisaient différentes communautés microbiennes dans l’intestin de C.

fumiferana. Il reste à déterminer si cette différence est dûe au génotype de l’insecte, son alimentation ou son

environnement, et quel impact ont ces différences sur les capacités métaboliques de l’insecte.

36

Composition of the spruce budworm (Choristoneura fumiferana) midgut

microbiota as affected by rearing conditions

Mathieu Landrya, André M. Comeaub, Nicolas Deromed, Michel Cussonc, and

Roger C. Levesquea,*

aInstitut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS) et Faculté de médecine, Université Laval, Québec,

Canada, G1A 0A6

bCGEB-Integrated Microbiome Resource (CGEB-IMR), Department of Pharmacology, Dalhousie University,

Halifax, Nova Scotia, Canada, B3H 4R2

cNatural Resources Canada, Laurentian Forest Centre, Québec, Canada, G1V 4C7

dInstitut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS) et Faculté des sciences et de génie, Université Laval,

Québec, Canada, G1A 0A6

Keywords: Spruce budworm, Choristoneura fumiferana, midgut microbiota, pyrosequencing

*Corresponding author.

E-mail address: [email protected].

Running title: Spruce budworm midgut microbiota

mailto:[email protected]

37

ABSTRACT

The eastern spruce budworm (Choristoneura fumiferana) is one of the most destructive forest insect pests in

Canada. Little is known about its intestinal microbiota, which could play a role in digestion, immune protection,

communication and/or development. The present study was designed to provide a first characterization of the

effects of rearing conditions on the taxonomic diversity and structure of the C. fumiferana midgut microbiota,

using a culture-independent approach. Three diets and insect sources were examined: larvae from a

laboratory colony reared on a synthetic diet and field-collected larvae reared on balsam fir or black spruce

foliage. Bacterial DNA from the larval midguts was extracted to amplify and sequence the V6-V8 region of the

16S rRNA gene, using the Roche 454 GS-FLX technology. Our results showed a dominance of

Proteobacteria, mainly Pseudomonas spp., in the spruce budworm midgut, irrespective of treatment group.

Taxonomic diversity of the midgut microbiota was greater for larvae reared on synthetic diet than for those

collected and reared on host plants, a difference that is likely accounted for by several factors. A greater

proportion of bacteria from the phylum Bacteroidetes in insects fed artificial diet constituted the main difference

between this group and those reared on foliage; within the phylum Proteobacteria, the presence of the genus

Bradyrhizobium was also unique to insects reared on artificial diet. Strikingly, a Bray-Curtis analysis showed

important differences in microbial diversity among the treatment groups, pointing to the importance of diet and

environment in defining the spruce budworm midgut microbiota.

INTRODUCTION

Insects can derive diverse benefits from their intestinal microbiota. The best example is the termite, whose

digestive track is specifically adapted for colonization by various microbes essential to the digestion of wood

biomass [1]. The microbial community of the termite intestinal microbiota consists largely of Proteobacteria,

Spirochetes, Bacteroidetes and Gram-positive bacteria with a low G+C content [2]. In contrast, bacterial

symbionts are apparently not essential for digestion of the plant cell wall in many other insect species that

secrete digestive enzymes encoded in their own genomes. [3]. However, there are other benefits associated

with midgut bacteria, including enhanced resistance to pathogens [4], promotion of intestinal epithelium

development [5], neutralization of toxins [6] and production of chemical communication molecules [7].

Lepidopteran insects feed mostly on plants and possess a very simple digestive system devoid of any known

adaptation for the maintenance of microbes. The majority of bacteria composing their microbiota are acquired

from their food plants [8], making diet an important factor in microbiota composition. The microbiota has no

defined role in the Lepidoptera, but it is often dominated by Enterobacteriaceae, which could play a role in

carbohydrate metabolism [9].

38

Each year in Canada, defoliating insects are responsible for important timber volume losses for the

forest industry. Controlling these pests is a significant challenge and scientists are constantly looking for novel

strategies that are more cost-efficient and/or eco-friendly. As chemical pesticides are no longer looked upon

favorably for use in forest pest management, molecular and biological targets that can be perturbed in a pest-

specific manner have become the focus of many current research efforts aimed at developing alternative pest-

control tools. The intestinal flora of these insects could be one such target, particularly where it plays a

significant role in host health.

It is in this context that we undertook the present work on the microbiota of the spruce budworm,

Choristoneura fumiferana, a major pest of spruce and fir in Canada. Our primary objective was to conduct a

survey of this insect’s gut microflora using a next-generation sequencing (NGS) approach. A pioneering study

that examined the intestinal microbiota of C. fumiferana indicated a dominance of Enterococcus and

Staphylococcus bacteria among microorganisms that could be cultured from its midgut, and showed that

antibiotics present in a synthetic diet [10] were not potent enough to eliminate gut bacteria at the

concentrations used [11]. Another study also showed that intestinal juices from larvae fed balsam fir foliage

could inhibit bacterial growth [12], suggesting that the host plant could have a negative impact on the budworm

midgut microflora. For this reason, the second objective of our study was to conduct a preliminary assessment

of the effect of rearing conditions, including diet (synthetic, black spruce, balsam fir) and insect sources

(laboratory colony versus field-collected) on budworm midgut microbiota composition. Our results point to a

significant effect of food and insect source on the taxonomic diversity and structure of the budworm midgut

microbiota.

MATERIALS AND METHODS

Experimental insects

For this study we used 36 C. fumiferana larvae, distributed evenly among three experimental groups (food

sources). For the first group, larvae were obtained from Insect Production Services (Natural Resources

Canada, Sault Ste. Marie, Canada) as post-diapause second instars and were reared at room temperature on

a synthetic wheat germ diet containing Aureomycin at a level of 0.56% [10]. The other two experimental

groups were made up of larvae collected in the field near Baie-Comeau, Quebec, as third and fourth instars

feeding on balsam fir (Abies balsamea) or black spruce (Picea mariana). These larvae were held in plastic

containers and reared on young shoots from the same trees they were collected on until they reached the sixth

instar. All larvae were sacrificed as mid-sixth instars for midgut dissection.

39

Midgut dissections and DNA extraction

To remove surface microbes, larvae were briefly dipped in 70% ethanol prior to midgut dissection. Tissue was

excised using ethanol-sterilized fine forceps and opened up longitudinally to gently remove coarse, undigested

material remaining at the time of dissection. The midguts were homogenized individually in 1.5 mL microfuge

tubes containing 200 µL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) using sterile plastic pestles. Genomic DNA

was extracted from the midguts following the Gram-positive protocol of the DNeasy Blood and Tissue Kit

(Qiagen).

Choice of primers for Roche 454 pyrosequencing

We used primers designed by Comeau et al. (2011) that target the V6-V8 region of bacterial 16S rRNA. In

preliminary tests using spruce budworm midgut DNA, amplicons from this region provided the best taxonomic

resolution. Forward (F) primers included Roche’s A adaptor and MIDs (‘‘multiplex identifiers’’) in the following

arrangement: 5’-[A-adaptor]+[MID1 to 10]+[specific F primer]-3’. Reverse (R) primers included Roche’s B

adaptor in the following arrangement: 5’-[B-adaptor]+[specific R primer]-3’. Full primer sequences are listed in

Table S1.

Pyrosequencing of the 16S rRNA gene

Amplification of the 16s rRNA gene, equimolar pooling and sequencing was performed at the Plateforme

d’analyses génomiques (IBIS, Université Laval, Quebec City, Canada) following the procedure described in

Comeau et al. [13]. Briefly, the extracted DNA was amplified by PCR using the aforementioned fusion primers,

followed by amplicon purification. Then, for each of the three treatments, equimolar amounts of the 12

replicate amplicons were pooled and loaded onto 1/8th of a sequencing plate and sequenced on a Roche 454

GS-FLX + platform.

Sequence pre-processing

We used mothur v.1.30.2 [14] to curate the dataset so as to retain only reads with a length between 350 and

450 bps, without Ns and with 100% correct F primer sequences. Sequences were aligned using mothur and

chimeras were removed by alignment of a query sequence with two parent sequences using UCHIME [15].

40

Sequences classified as originating from chloroplasts were also removed using mothur. Finally, samples

(individual larvae) were normalized by random down-sampling to 2460 reads each (the smallest number of

final, quality-controlled reads among the samples).

Data analysis

Mothur was used for all the subsequent analyses. The curated reads were first clustered at a 97% identity

cutoff in order to generate operational taxonomic units (OTUs) that roughly correspond to individual bacterial

species [14]. Rarefaction curves (α-diversity) for each experimental group were generated and β-diversity

analyses (among samples and treatments) were done by calculating Bray-Curtis distances and Sørensen

similarity values (abundance-based version �̂�𝑎𝑏𝑑 suggested by Chao et al. [2005]). OTUs were classified

using the GreenGenes97 reference database as modified by Comeau et al. (2011), and selected sequences

were manually compared to the NCBI nr database using the BLASTn algorithm [16].

Statistical analysis

The non-parametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests were used to assess the statistical

significance of differences among treatments when the data did not fulfill the conditions of normality. In all

other cases, ANOVA, F- and t-tests (equal or unequal variance, as the case may be) were used. All

statistical analyses were carried out using the software PAST (folk.uio.no/ohammer/past/).

RESULTS

Variation in richness among microbiotas (α-diversity)

For each of the three treatment groups, the OTU rarefaction curves began to plateau by the time all reads had

been analyzed, indicating that the sequencing depth was sufficient to capture most of the biodiversity found in

the larval midguts (Fig. 1). Interestingly, far more OTUs were detected in larvae reared on a synthetic diet

containing Aureomycin (>1000) than in larvae collected in the field on either balsam fir or black spruce (<600).

41

Figure 2.1 - OTU rarefaction curves for each experimental group. Each group represents the aggregate of 12 individuals at 2 460 reads each (total 29 520 reads per group). Note that the balsam fir and black spruce curves have overlapping 95% confidence intervals (i.e.: not significantly different).

42

Overall composition of spruce budworm midgut microbiota

Overall, the budworm midgut microbiota was composed primarily of Proteobacteria (Fig. 2). The dominant

genus was Pseudomonas, which constituted the majority of the Proteobacteria (Fig. 3), whereas

Bradyrhizobium was essentially specific to larvae reared on synthetic diet (915 reads vs 30-62 reads for each

of the other two diet groups). An examination of the top 10 OTUs within the three diet groups (Table 1) clearly

showed that the genus Pseudomonas was indeed the most abundant taxon in the budworm midgut microbiota,

as the majority of dominant OTUs belonged to this genus. These Pseudomonas OTUs could not be assigned

to species using the NCBI 16S database, since each typically had several hits with an E-value of zero and an

identity of 100%. This being said, species such as P. fluorescens and P. paea were often among these hits.

Table 1 also shows that the communities were highly skewed with respect to OTU distribution, with the 10 top

OTUs representing a very large proportion of the total reads obtained (~60-80%), indicating that the remaining

OTUs represented low-abundance, less frequent taxonomic groups. Surprisingly, the two taxa –

Staphylococcus and Enterococcus – that were identified in an earlier study [11] as the most abundant in the

budworm midgut, using a bacterial culture approach, were among the lower abundance OTUs in this study,

represented by 249 and 4 reads, respectively, among the 88,560 reads of the dataset. At the phylum level, the

microbiotas of larvae fed either spruce or fir were very similar, except for a higher proportion of Actinobacteria

(majority Propionibacterium) in larvae collected and reared on balsam fir (Fig. 2; p < 0.01, Mann-Whitney). In

larvae reared on artificial diet, the proportion of Bacteroidetes was much higher than in larvae collected and

reared on the other two food types (p < 0.01, Kruskal-Wallis). More than 97% of these Bacteroidetes were

assigned to the family Chitinophagacaea, but we could not assign them to specific genera using the

GreenGenes database. However, some of the most abundant OTUs found in larvae fed artificial diet belonged

to this family and were identified as Hydrotalea flava or Sediminibacterium gingensoli using the NCBI 16S

database (Table 1).

43

Figure 2.2 - Taxonomic distribution of reads at the phylum level for each experimental group.

Figure 2.3 - Taxonomic distribution of reads in the Proteobacteria for each experimental group. Only genera comprising more than ~1% of the phylum are shown.

Compositional variation among microbiotas (β-diversity)

The Bray-Curtis analysis, which is based on the presence/absence and relative abundance of OTUs in each

sample, showed a strong clustering of individual larval microbiotas according to rearing conditions (Fig. 4).

Interestingly, the microbiotas of larvae reared on the two host trees clearly formed two compositional sub-

clusters. To further compare the composition of the microbiotas among the three food sources, we calculated

abundance-based Sørensen similarity values among and within the groups (Fig. 4). The results of this analysis

support the conclusions drawn from the Bray-Curtis similarity analysis, i.e., strong separation as a function of

food source, with very little overlap (only ~1-5%) among diet groups. However, microbiotas of individual larvae

reared on artificial diet all displayed very high similarity among one another (92%). For the two groups of

44

larvae reared on host trees, the Sørensen similarity values calculated for each sub-cluster were higher than

those calculated for the whole group, supporting the conclusion drawn from the Bray-Curtis analysis and

pointing to the greater variation in the composition of the midgut microflora among larvae collected and reared

on natural foliage.

Fir Spr

Fir Syn

Spr Syn

Fir

Spr

Syn

Between

(β-diversity)

Within

(α-diversity)

0.8%

62% (96/98%)

92%

67% (92/96%)

5.2%

3.4%

Figure 2.4 - Individual and group diversity patterns. Dendrogram of the Bray-Curtis distances between each larva (left) and Sørensen similarities (right) between or within the three groups. Note that the individuals within the two subclades of each fir and spruce group have high similarities (92-98% in parentheses) compared to each group taken as a whole (62 and 67%).

Table 2.1 List of top 10 OTUs within each experimental group, along with the names of the species they most likely represent (from BLAST similarity).

Group OTU ID Most likely species Reads Abundance

(%)

Balsam fir Otu0348 Pseudomonas sp. 5584 18.9

Otu0352 Pseudomonas sp. 4711 16.0







Otu1277 Rugamonas rubra 534 1.8


http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_631252449










45

Total = 79.4

Black spruce Otu0346 Pseudomonas sp. 7315 24.8










Total = 78.9

Synthetic diet Otu0351 Pseudomonas sp. 4566 15.5




Otu0517 Hydrotalea flava 1719 5.8

Otu0519 Sediminibacterium ginsengisoli 834 2.8




Otu2190 Methylobacterium aerolatum 627 2.1

Total = 59.1




















46

Supporting information

Table 2.2 Sequences of primers used to amplify the 16S V6-V8 region for pyrosequencing (from Comeau et al. 2011). The dots are used to separate the different parts of the primers (Roche adaptor • multiplex identifier (barcode) • specific primer). Multiplex identifiers are only present in the forward primers, hence there is only one unique, shorter reverse primer.

Primer Name Sequence 5’-3’

A1-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•ACGAGTGCGT•ACGCGHNRAACCTTACC

A2-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•ACGCTCGACA•ACGCGHNRAACCTTACC

A3-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•AGACGCACTC•ACGCGHNRAACCTTACC

A4-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•AGCACTGTAG•ACGCGHNRAACCTTACC

A5-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•ATCAGACACG•ACGCGHNRAACCTTACC

A6-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•ATATCGCGAG•ACGCGHNRAACCTTACC

A7-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•CGTGTCTCTA•ACGCGHNRAACCTTACC

A8-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•CTCGCGTGTC•ACGCGHNRAACCTTACC

A9-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•TAGTATCAGC•ACGCGHNRAACCTTACC

A10-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•TCTCTATGCG•ACGCGHNRAACCTTACC

A11-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•TGATACGTCT•ACGCGHNRAACCTTACC

A12-B969F CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG•TACTGAGCTA•ACGCGHNRAACCTTACC

B-BA1406R CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG•ACGGGCRGTGWGTRCAA

47

DISCUSSION

The present study shows that the vast majority of bacteria found in the spruce budworm midgut belong to the

phylum Proteobacteria (Fig. 2), with the genus Pseudomonas constituting the dominant taxon, irrespective of

rearing conditions (Fig. 3). Indeed, more than 60% of the reads generated from larvae reared on artificial diet

belonged to this genus, while this proportion increased > 80% in field-collected insects. A previous study using

culture-dependent methods to identify bacteria from spruce budworm midguts also identified Pseudomonas as

one of the taxa present in laboratory-reared insects, although in much lower proportions than those reported

here [11]. This difference could result from taxon-specific differential growth of midgut bacteria on the tryptic

soy agar medium used by these authors. Differential growth may also explain why the same study reported

Enterococcus and Staphylococcus as the two dominant bacterial genera in budworm midguts, while these two

Firmicute genera represented a low proportion of the culture-independent experiment reported here. It should

also be pointed out that notable differences in the presence/absence of midgut bacterial taxa have been

reported for different laboratory cultures of the same insect (e.g., Enterobacter in Lymantria dispar; [8,11] ),

suggesting the possibility of important differences in host genotypes controlling gut bacterial communities

among different sources of laboratory-reared insects [17]. A study combining culture-dependent and culture-

independent approaches for the characterization of the gypsy moth (L. dispar) midgut microbial community

also identified Pseudomonas as representing a significant proportion of the microbiota [8]. Pseudomonas

fluorescens, which is very closely related to the dominant bacterial OTUs in our samples, has been shown to

degrade pectin, one of the components of plant cell walls [9]. Whether this bacterium plays a role in foliage

digestion remains to be determined, but it could explain its possible dominance in the budworm midgut

bacterial community.

The main difference between the communities of larvae reared in the laboratory and sampled in the

field was the presence of a higher proportion of bacteria belonging to the phylum Bacteroidetes in insects

reared on artificial diet (Fig. 2). Prominent among these bacteria were the Chitinophagacea (more than 97% of

Bacteroidetes reads), which could not be assigned to specific genera using the GreenGenes97 reference

database; however, they were identified as Hydrotalea flava or Sediminibacterium gingensoli using the NCBI

16S database (see Table 1). These bacteria have also been reported in the gut of Nyssomyia neivai sandflies,

which feed on the blood of other insects [18]. Their role, if any, in the biology of C. fumiferana is unknown, but

their absence in field-collected insects suggests they are not essential and that they may be repressed by

antibacterial compounds present in conifer leaves [12] or their growth may be favored in insects fed on artificial

diet.

48

We found twice as many OTUs in larvae reared on artificial diet as compared to those collected in the

field (Fig. 1). Whether the presence of antimicrobial secondary metabolites in fir and spruce foliage is

responsible for the lower taxonomic richness assessed in larvae collected on host plant materials is unclear at

this point, as several other factors could account for this difference. Although the antibiotic present in the

synthetic diet apparently did not inhibit midgut bacterial growth, it may nonetheless have affected the

taxonomic composition of the intestinal microbiota. For example, rearing of budworms on an Aureomycin-laden

diet over several generations may have led to the elimination of some bacterial taxa, leaving their niches open

to the establishment of others. Similarly, the greater diversity of midgut bacteria in artificial-diet-reared insects

could be an adaptive response to the diversity of components in this wheat-germ-based diet, thus favoring the

growth of gut Bacteroidetes which have been associated with degradation of high-molecular-weight proteins

and carbohydrates [19]. Finally, various other factors, including genetic differences between field-collected and

laboratory-reared insects, could play a role in shaping the observed differences. An experiment involving the

rearing of budworms from a single genetic stock on different diets over several generations would likely shed

light on this issue. Interestingly, earlier studies focusing on lepidopteran midgut microbiota have reported a

poorer microbial diversity in insects reared on artificial diet as compared to insects reared on natural host

plants [20,21]. This discrepancy may simply be related to differences in experimental design, although the

possibility remains that there are fir- and spruce-borne compounds that interfere with budworm midgut

bacterial growth [12], whereas the opposite may be true for species where the insect’s gut microbiota depends

largely on the microbial community present on the surface of the host plant [20].

In comparing the effects of diet on features of the budworm midgut microbiota, we observed a greater

bacterial taxonomic similarity among larvae reared on artificial diet (92% Sørensen similarity), as compared to

larvae collected on either host tree (62-67% Sørensen similarity; Fig. 4). Although this difference could be due,

at least in part, to the normalizing/homogenizing effects of Aureomycin (in the synthetic diet) and multi-

generation rearing in the laboratory, it seems largely attributable to the presence of two clearly distinct Bray-

Curtis clusters in each group of field-collected larvae (Fig. 4). Since all larvae obtained from the field were

processed in the same fashion, it appears that the deep within-host-tree taxonomic subdivision results from

factors inherent to the larvae themselves. Given a sex ratio of ~50:50 in the spruce budworm [22] and an

observed segregation of larvae in the same proportions within each host group (Fig. 4), we speculate that the

sex of the larvae (not recorded in this study) may be the factor responsible for the observed clustering.

Relatively minor differences were observed between the midgut microbiotas of larvae collected on

balsam fir as opposed to those collected on black spruce, at least at the phylum (Fig. 2) and genus (for

Proteobacteria; Fig. 3) levels. The main difference was a slightly greater proportion of Actinobacteria in the gut

of larvae collected on balsam fir. Additional differences are likely present at the species level, as suggested by

49

the presence of different phylotypes within each of these two diet groups (Table 1). However, the significance

of such differences is unclear at this point and its assessment will require more extensive sampling of larvae

on host trees from different geographical regions and habitats.

Interestingly, the present analysis suggested the absence, in the spruce budworm, of a distinct, core

midgut microbiota, i.e., a set of bacterial taxa present in all processed larvae. Although some genera were

present in all three diet groups (Table 1), none of the phylotypes were detected in all sampled larvae. This

observation is in contrast with earlier studies where the authors reported the presence of a few bacterial

species in all insects examined (e.g., [8,20]). It has been pointed out, however, that a lack of core gut

microbiota among healthy individuals of a given species may not be critical so long as the microbial phylotypes

present in the gut collectively provide a core set of bacterial genes required by the host [23], a situation that

may apply to the spruce budworm gut microbiota.

In summary, the present work provides baseline data on the spruce budworm midgut microbiota, as

determined using a culture-independent NGS approach. It also provides evidence that rearing conditions,

including diet, can have a significant effect on budworm midgut microbiota species diversity. As such, the

findings reported here should serve as a starting point for more in-depth studies examining the possible

functions of the budworm intestinal microbiota; such functions could include processing of secondary plant

metabolites, nutrition/digestion, immunity and communication, among others [4]. To this end, metagenomics

and transcriptomics approaches will likely be required.

ACKNOWLEDGMENTS

We express our gratitude to members of the next generation sequencing platform and bioinformatics platform

at the Institut de biologie integrative et des systèmes (IBIS), Université Laval, and to Catherine Beliveau for

technical assistance with the PCR work. We thank Dr. D. Pureswaran (Natural Resources Canada, Quebec

City) for providing the field-collected larvae. This research was funded by grants to R. C. Levesque and to M.

Cusson (NSERC Discovery grant # 171350-2012 and by Génome Québec).

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53

3. Conclusion

Le microbiome intestinal est une communauté qui peut avoir une grande influence sur la performance

et la santé de son hôte. Chez l’humain, ces communautés jouent un grand rôle dans la prévention de plusieurs

maladies, que ce soit par coopération avec le système immunitaire, la digestion de composés toxiques ou

simplement par compétition avec les agents pathogènes (Cho et Blaser 2012). Chez les insectes, le

microbiome intestinal peut contribuer à la digestion de composés difficiles à métaboliser, à la protection contre

les agents pathogènes par la production de molécules antimicrobiennes et à la communication en participant à

la synthèse de phéromones (Engel et Moran 2013). Le rôle de ce microbiome chez les lépidoptères est assez

peu connu et c’est à cet ordre qu’appartient l’insecte qui nous intéresse, Choristoneura fumiferana (Calderón-

Cortés et al. 2012).

Choristoneura fumiferana est une chenille causant d’importants dommages aux forêts de sapin et

d’épinette au Canada, et plus particulièrement au Québec. A l’état larvaire, elle se nourrit des jeunes

bourgeons, ce qui peut entraîner la mort des arbres attaqués. Le principal moyen de lutte utilisé par l’homme

contre cet insecte est l’insecticide BT, qui fait intervenir la bactérie Bacillus thurigiensis, laquelle interagit

possiblement avec la flore intestinale de l’insecte (Broderick et al. 2009). Comme il se nourrit de matière

végétale, l’insecte pourrait aussi avoir besoin de cette flore intestinale pour métaboliser les nutriments

nécessaires à sa survie, comme chez le termite (Hongoh 2011).

Ce projet se voulait un premier échantillonnage microbien de l’intestin de C. fumiferana. Cet

échantillonnage à été fait avec l’objectif à long terme d’évaluer la contribution potentielle de cette flore

microbienne à la biologie de l’insecte. Une comparaison a ainsi été faite entre le microbiome de larves ayant

consommé différentes diètes. Cette comparaison avait pour but de tester l’influence de la diète sur la

composition taxonomique du microbiome intestinal. Un microbiome facilement manipulable permettrait

d’utiliser C. fumiferana comme modèle pour l’étude du microbiome intestinal d’herbivores, car l’insecte est

facile à obtenir en grand nombre et à élever.

Le microbiome de C. fumiferana semble être dominé par le genre bactérien Pseudomonas. En effet,

plus de 60% des séquences analysées appartenaient à ce genre. Pseudomonas est un genre bactérien

retrouvé en grand nombre sur la surface des végétaux et dans l’intestin d’autres papillons herbivores

(Broderick et al. 2004). Des espèces de Pseudomonas possèdent des gènes pouvant dégrader la pectine, un

composé faisant partie des membranes cellulaires végétales et pourraient donc jouer un rôle dans la digestion

(Anand et al. 2010).

54

Des différences marquées ont été observées entre le microbiote de larves collectées dans la nature

et le microbiote de larves élevées en laboratoire. Les larves s’étant nourries de diète McMorran possédaient

un microbiote au moins deux fois plus riche en termes de diversité taxonomique que celui de larves s’étant

nourries d’aiguilles de conifères. Cette différence est possiblement due à la présence de tannins retrouvés

dans les aiguilles de conifères et ayant un effet anti-bactérien (Pang 2010). Le groupe des Chitinophagacaea

semble être particulièrement touché par ce phénomène, car il est très abondant chez les larves de laboratoire

et presque absent chez les larves recueillies en nature. Pourtant, on le retrouve chez d’autres insectes

recueillis dans la nature (Machado et al. 2014). Il serait intéressant de déterminer si ces souches de

Chitinophagacaea retrouvées dans l’intestin de la tordeuse sont cultivables. Si oui, elles pourraient être isolées

et cultivées à partir d’intestin de C. fumiferana. Elles pourraient ensuite être exposées à des tannins extraits

d’aiguilles de différents conifères. L’effet du tannin sur ces bactéries pourrait être comparé avec l’effet sur

d’autres bactéries retrouvées dans le même environnement, de façon à déterminer si les tannins avaient bel et

bien un rôle à jouer dans ces différences d’abondance.

Par contre, il est fort possible que l’alimentation ne soit pas la principale raison pour les différences

de composition microbienne dans l’intestin des tordeuses. Il est très probable que le génotype des larves

étudiées ait une importante influence sur leur microbiote. Les larves élevées en laboratoire provenaient de

souches d’élevage dont le génotype varie très peu et c’est probablement pourquoi la communauté bactérienne

de larves élevées dans le laboratoire varie beaucoup moins d’un individu à l’autre que dans le cas de larves

ayant vécu dans la nature, qui possèdent des génotypes potentiellement très variés, leur reproduction n’étant

pas contrôlée.

Comme l’indique la figure 4 du chapitre 2, un autre facteur semblait jouer dans la composition des

communautés microbienne de l’intestin de C. fumiferana. Les larves appartenant à chaque groupe semblaient

se diviser en deux sous-groupes de tailles équivalentes. Ceci concorderait avec le sexe des insectes, qui

influence les communautés microbiennes chez certains insectes (Engel et Moran 2013) mais qui n’a

malheureusement pas été déterminé avant l’expérience. Pour tester l’hypothèse que le sexe d’une larve de

tordeuse influence la composition de son microbiote intestinal, il faudrait répéter cette expérience avec des

insectes dont on identifie le sexe en observant les gonades lors de l’extraction du mésentéron.

Alternativement, lorsque plus d’information sera disponible sur le génome de l’insecte, des gènes spécifiques

au sexe pourraient être identifiés. Des amorces spécifiques pour ces gènes pourraient être conçues et

utilisées sur l’ADN extrait au cours l’expérience décrite dans ce mémoire.

55

En bref, ce projet a permis d’avoir un bon aperçu de la composition des communautés microbiennes habitant

l’intestin de C. fumiferana. Il a été démontré qu’un changement de diète et/ou de conditions d’élevage pouvait

altérer de façon importante ces communautés, que ce soit au niveau de la diversité ou de la structure de la

communauté. Ce projet a aussi permis de découvrir quelques pistes intéressantes qui, avec l’aide d’analyses

métagénomiques et métatranscriptomiques pourraient mener à l’élucidation du rôle que le microbiome

intestinal peut jouer dans la biologie de C. fumiferana.

Effectivement, les méthodes de séquençage utilisées dans cette expérience ne donnaient que très

peu d’information sur la fonction et l’activité des communautés microbiennes décrites. Lorsqu’on désire obtenir

de l’information sur la contribution du microbiome à son environnement, il faut aller chercher au-delà de

l’identité des bactéries présentes et de leur abondance relative, qui sont tout ce que l’identification par

séquençage du gène 16S permet d’obtenir comme information. Pour aller au-delà de la question «Qui est

là ? » et répondre aux questions «Que font les bactéries présentes dans l’intestin ? » ou «Ces bactéries sont-

elles bénéfiques ou nuisibles à l’insecte ?» des technologies telles que la métatranscriptomique et la

métagénomique sont nécessaires.

Le métatranscriptome est un portrait de toutes les activités métaboliques présentes dans

l’environnement étudié. À partir d’un échantillon d’ARN provenant du microbiote de l’insecte, il serait possible

d’obtenir la séquence de tous les gènes exprimés par cette communauté et leur niveau d’expression. La

comparaison de ces séquences à celles déposées dans les bases de données permet d’identifier les gènes

exprimés et les voies métaboliques les plus actives. Elle permet aussi de déterminer si certaines voies

métaboliques font intervenir plus d’un organisme. Par exemple, ce sont principalement des études en

métatranscriptomique qui ont permis de dresser un portrait des voies métaboliques complexes permettant au

termite de tirer du bois qu’il consomme les nutriments nécessaires à sa survie (Tartar et al. 2009). Cette

méthode permettrait donc d’identifier certaines voies métaboliques importantes à la tordeuse et de déterminer

dans quelles conditions l’expression des gènes reliés à ces voies métaboliques est la plus forte.

Le métagénome, quant à lui, est obtenu en fragmentant aléatoirement l’ADN total de l’échantillon

étudié et en séquençant la totalité de ces fragments. Un génome collectif est alors assemblé à partir de ces

séquences, ce qui rend possible l’étude de la contribution métabolique potentielle du microbiome. Cette

approche permet aussi de dresser un inventaire quantitatif des organismes présents dans le microbiome.

Cette méthode a plusieurs avantages par rapport au séquençage des amplicons 16S. D’abord, l’identification

taxonomique pourra être beaucoup plus poussée, la séquence complète du génome de l’individu étant

disponible pour comparaison avec des banques de données. Ensuite, les comptes ne seront pas affectés par

les variations du nombre de copies comme l’est le gène codant pour l’ARN ribosomal 16S. Finalement, les

56

résultats ne souffriront pas du biais causé par les amorces, ces dernières pouvant être incapables de

reconnaître certains taxons bactériens (Morgan et Huttenhower 2014). Cette méthode permet aussi de relier

chaque gène à un microbe particulier et ainsi connaître la fonction de ce microbe s’il est un symbiote ou le

risque qu’il pose s’il est un agent pathogène pour l’insecte.

L’information générée par ces méthodes, en plus de celle obtenue lors de l’expérience décrite dans

ce mémoire, contribuera potentiellement à la lutte biologique contre C. fumiferana. Déterminer le rôle et

l’identité des bactéries habitant l’intestin de cet insecte ainsi que les conditions dans lesquelles ces bactéries y

sont présentes ou abondantes pourrait permettre de cibler des conditions dans laquelle la tordeuse serait plus

vulnérable à une perturbation de son microbiome. Cette perturbation pourrait être l’élimination d’un symbiote

important ou l’enrichissement d’un pathogène dangereux pour l’insecte. Une meilleure connaissance de ces

phénomènes pourrait contribuer à l’élaboration d’une méthode de lutte biologique plus spécifique et efficace

que celles utilisées présentement. Alternativement, ces connaissances pourraient aussi contribuer à améliorer

l’efficacité de l’insecticide à base de B. thurigiensis. En effet, relier chaque bactérie du microbiote et son rôle

avec l’activité insecticide de B. thurigiensis permettrait d’en savoir plus sur son mode d’action et de

possiblement déterminer des périodes ou des régions où l’insecte est plus vulnérable.

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