TUTORAT SANTE MONTPELLIER-NIMES

METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

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NOTIONS THÉORIQUES

• Un microscope est un système grossissant composé de deux lentilles convergentes:– L’objectif, proche de l’objet– L’oculaire, proche de l’œil.

• L’indice de réfraction définit la capacité d’un milieu translucide à dévier un rayon lumineux, et est nommé « n »= c/v.

• Un dioptre est l’interface entre deux milieux translucides d’indice de réfraction différents.

• Le pouvoir de résolution est la distance minimale qui doit séparer deux points pour être discernés au travers d’un système optique.

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GÉNÉRALITÉS

• Un microscope est caractérisé par:– Son grossissement (ou puissance) qui varie selon les

lentilles utilisées

– Son pouvoir de résolution, qui dépend de la longueur d’onde du rayonnement utilisé.

• Il existe deux grands types de microscopes:– Le microscope optique (MO), qui utilise les photons

de trois façons: transmission, réflexion, réémission

– Le microscope électronique (ME), qui utilise les électrons.

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Le microscope optique

• La puissance = le grossissement = grossissement oculaire x grossissement objectif

• Pouvoir de séparation = pouvoir de résolution = distance min entre 2 points pour qu’ils soient distinguables = fonction de la longueur d’onde du rayon utilisé

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LA TRANSMISSION (MO)

• On parle de transmission quand l’objet translucide est traversé par la lumière. Les photons interagissent de deux façons:– Absorption par l’objet (image nuancée en lumière

monochromatique et colorée et lumière polychromatique)

– Contraste de phase: les photons sont diffractés en décalage, ce qui provoque une différence d’intensité lumineuse entre deux points, qui est perçue par l’œil. L’objet doit être en relief!

• On utilise la transmission avec le microscope à fond clair, le microscope à contraste de phase, le microscope confocal.

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LA RÉFLEXION (MO)

• On parle de réflexion quand l’objet est latéralement éclairé et qu’il réfléchit les photons au niveau de sa surface, qui est donc la seule partie visible (on ne voit pas l’intérieur). L’objet doit être en relief!

• On utilise la réflexion avec le stéréomicroscope (ou loupe binoculaire ou microscope chirurgical) et le microscope à fond noir.

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LA RÉÉMISSION (MO)

• On parle de réémission quand les molécules instables de l’objet réémettent les photons à une longueur d’onde différente dans toutes les directions de l’espace.

• On utilise la réémission dans:– Le microscope à fluorescence: permet de visualiser des

substances fluorescentes ou rendues telles par l’utilisation d’un fluorochrome. Ceci permet de localiser des éléments dans une cellule.

– La microscopie bi ou multi photonique: on envoie des rayons de λ > 800 nm (IR) avec des lasers femtoseconde, pouvant donc traverser des objets épais. Ceci augmente la pb d’absorption de pls photons simultanément et donc d’obtenir beaucoup de fluorescence pour une faible intensité excitatrice.

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FABRICATION DE LAMES

• Pr observer une cellule, il faut inactiver les enzymes, durcir le tissu et le découper en « tranches » très fines de manière à ce qu’il soit translucide (coupes).

• Il y a pls étapes:

– Fixation avec des solutions diluées d’aldéhydes ou de sels oxygénés de métaux lourds

– Durcissement par congélation, polymérisation ou inclusion dans de la paraffine..

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FABRICATION DE LAMES

– Découpage en tranches d’une épaisseur de qqs microns par un microtome et recueil sur lames de verre traitées chimiquement pour coller la coupe.

– Réhydratation (s’il y a eu une déshydratation préalable) par immersion dans un solvant organique et des bains d’alcool de concentrations décroissantes.

– Coloration par:• Les colorants signalétiques: pr la forme de la cellule et des

organites volumineux (hématoxyline, éosine, bleu de méthylène). Ils sont basiques (pour les structures acides = basophiles) ou acides (pour les structures basiques = acidophiles).

• Les colorants cyto/histochimiques colorant une substance de manière spécifique.

– Observation à sec ou en immersion dans l’huile de cèdre.

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AUTRES EXAMENS

• Les extemporanées sont des coupes issues d’échantillons congelés au CO2 dans un cryostat et découpés en tranches de plus de 15 microns pour être colorées et observées rapidement lors d’un opération chirurgicale (pas de fixation!). Certaines sont conservées pour étudier l’activité enzymatique (cyto/histo-enzymologie).

• Les cellules sur frottis sont observées après dépôt sur lame, dessication et coloration (pas de fixation! en général)

• L’examen de cellules vivantes nécessite un microscope inversé (la lumière arrive par le bas) et l’utilisation de colorants non toxiques (=vitaux ex: vert Janus B). On peut aussi utiliser le microscope à contraste de phase.

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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

• Les rayons de faible λ étant non incurvables, on utilise les électrons pour augmenter la résolution.

• On utilise trois types d’électrons:– Les primaires sont ceux qui traversent l’objet (MET)– Les secondaires sont arrachés aux atomes par les

primaires, ont une faible énergie et permettent une bonne résolution (MEB)

– Les rétrodiffusés sont renvoyés par les noyaux, ont une forte énergie et ne permettent qu’une faible résolution (qqs applications du MEB).

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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

• Il est formé:– -D’un canon à électrons (une anode et

une cathode produisant le flux)

– -De bobines électromagnétiques focalisant le flux d’électrons et dont la variation de puissance est continue (avantage +++ comparé au MO)

– -Une autre bobine projette l’image produite sur un écran fluorescent pour qu’elle soit visible, et on observe au travers de hublots teintés de plomb pour arrêter les rayons X nocifs.

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LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

• Il existe deux types de ME:– Le MET (à transmission) pour les coupes– Le MEB (à balayage) qui récupère les électrons secondaires

renvoyés par la surface de l’objet par un collecteur.

• Travail dans le vide• Coupes réalisées de 50 nm d’épaisseur• Grilles et non plaques de verre comme support pour

limiter l’interaction avec la matière• Colorants spécifiques, les métaux lourds, pour

optimiser l’absorption par l’échantillon.

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LE MET

• Il fonctionne comme un MO, mais utilise des électrons.• La fixation se fait au glutaraldéhyde et est renforcée par

l’acide osmique. • L’objet est ensuite durci par des résines époxy, bcp plus

solides que la paraffine: araldite, cyanolite ou métacrylate(polymérisation irréversible).

• On emploie donc des « colorants » particuliers:– Signalétiques: – Spécifiques: anticorps fixés à des métaux lourds et spécifiques

d’une structure de la cellule (avant inclusion!).– Négatifs: colorent tout sauf les particules que l’on souhaite voir

comme les virus ou les protéines.

• On découpe avec un ultra microtome.

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CRYOFRACTURE ET CRYODÉCAPAGE

• Techniques pour visualiser la surface des objets au MET.

• Refroidissement de l’objet à – 196°C en présence d’un cryoprotecteur (évite que l’objet ne s’abîme), puis fracture:– Dans la cryofracture, on réalise un ombrage

métallique sur la zone de fracture, qui est une zone de moindre résistance (comme la membrane plasmique)

– Dans le cryodécapage, on réalise une sublimation de l’eau contenue dans la zone de clivage pour faire ressortir les objets, puis on réalise un ombrage métallique (cytosquelette).

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LE MEB

• Il balaye l’objet avec un faisceau d’électrons primaires qui produisent des électrons secondaires. Ceux ci sont collectés pour former une image de la surface de l’objet.

• La fixation et la déshydratation rétractent l’échantillon, d’ou l’utilisation de CO2 pour redonner du volume.

• L’objet ne doit ni être inclus, ni être coupé.• Il faut également faire un ombrage métallique

pour accentuer la libération d’électrons secondaires.

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COMPARAISON

• Grossissement:

– MET: 500 000

– MEB: 100 000

• Pouvoir séparateur: MET < MEB (le pouvoir de séparation le meilleur est le plus faible).

• Ces techniques sont complémentaires pour une étude complète.

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