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UNIVERSITE D’AIX MARSEILLE Faculté des Sciences et Techniques

52 Avenue Escadrille Normandie Niemen, 13397 Marseille cedex 20

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE D’AIX MARSEILLE Discipline : chimie organique

présentée et soutenue publiquement par

Khalil HAMZE

le 24 avril 2014

TITRE DE LA THESE

Baeyer-Villiger Monooxygenases d’Acinetobacter :

Réactions biocatalysées et Dédoublements Cinétiques Dynamiques

Directrice de Thèse : Véronique ALPHAND (DR CNRS)

Co-directeur : Gilles IACAZIO (Professeur - Université Aix Marseille)

Jury

Laurence HECQUET (Professeur - Université Blaise Pascal) Rapporteur

Jamal OUAZZANI (CR CNRS – ICSN, Gif) Rapporteur

Véronique de BERARDINIS (Chercheur CEA - Génoscope d’Evry) Examinateur

Marius REGLIER (DR CNRS - Université Aix Marseille) Examinateur

Véronique ALPHAND (DR CNRS) Directrice de Thèse

Je dédie ce travail à la tendresse et l’amour de mes parents, à

mon amour Toola lhawa, à la FRANCE et au LIBAN.

Remerciements

Tout d’abord, je remercie Jean-Antoine Rodriguez d’avoir accepté que j’effectue ma thèse dans son laboratoire, l’Institut des Sciences Moléculaires de Marseille, et Marius Réglier dans son équipe Biosciences.

Bien sûr, je n’oublierai pas les chercheurs du groupe Biocatalyse, Véronique Alphand,

Alain Archelas, Valérie Deyris, Katia Duquesne et Gilles Iacazio. Je remercie également les membres du jury pour avoir examiné mon travail.

Au terme de ces trois années de thèse, je souhaite adresser mes remerciements à tous celles et ceux qui ont participé, de près ou de loin, à cette aventure.

Je tiens à remercier particulièrement ma directrice de thèse, Véronique Alphand, pour m’avoir permis de travailler sur un thème de recherche riche et passionnant, pour sa disponibilité, ses conseils et sa patience. Véronique, je tiens à t’exprimer ma profonde gratitude et toute ma sympathie. Je suis très reconnaissant de me faire découvrir la biocatalyse. Merci de ton investissement constant, pour les discussions scientifiques que nous avons pu avoir et enfin la confiance que tu m’as accordée. Katia Duquesne, merci beaucoup pour m’avoir aidé en biologie moléculaire.

Bien évidemment, je souhaite remercier tous les membres de mon équipe avec qui j’ai partagé ces trois dernières années: Thomas Reignier, Wei Zhao, Sidiky Menil, Ludovic Schneider et Laëtitia Bruel. Vous êtes vraiment des personnes très sympathiques et de bonne humeur. J’ai aussi une pensée à tous ceux qui ont déjà quitté le laboratoire en particulier à Sylvain Tranchimand, Elodie Girgenti et Sandy Hajji.

Je tiens à remercier V. de Berardinis et ses collaborateurs au Génoscope d’Evry (Paris) ainsi que A. de Brevern et J. Rehbemed du laboratoire DSIMB (Inserm, Paris).

Je tiens à manifester toute mon affection et mon amitié à tous mes amis en

particulier à A. Abo hamdan, A. Taher et Karam. Vous avez été toujours à mes côtés quand il fallait, merci beaucoup.

Ma mère, mon père, mon frère et mes sœurs, en particulier Bouba tout au long de mon séjour en France vous étiez ma force, je n’oublierai jamais vos soutiens dans mon désir de poursuivre mes études.

Voilà un grand merci à tous d’avoir permis d’effectuer mes travaux de doctorat dans d’aussi bonnes conditions.

Le savant n'est pas celui qui fournit les vraies réponses; c'est celui qui pose les vraies questions.

Claude LEVI-STRAUSS

Celui qui trouve sans chercher est celui qui a longtemps cherché sans trouver.

Gaston BACHELARD

Le principe d’un modèle, c’est d’avoir des imperfections.

Michel DIRAND

L’amour est une chimie complexe, l’amitié est une construction raisonnée.

Sorj CHALANDRON

L’intelligence ? Une question de chimie organique, rien de plus. On n’est pas plus responsable d’être intelligent que d’être bête.

Paul LEAUTAUD

Table des matières

Introduction .................................................................................... 1

Partie Bibliographique .......................................................................... 3

Chapitre I : Les réactions de Baeyer-Villiger ........................................... 5

I. Réaction de Baeyer-Villiger chimique ................................................................................................ 5 A. Mécanisme de la réaction .......................................................................................................... 6 B. Limites de la réaction ................................................................................................................ 7 Conclusion .............................................................................................................................................. 9

II. Les Baeyer-Villiger monooxygénases ............................................................................................... 10 A. Généralités ................................................................................................................................. 10 B. BVMOs de type I ...................................................................................................................... 13 C. BVMOs de type II ................................................................................................................... 29 Conclusion ........................................................................................................................................... 30

III. Propriétés biocatalytiques des BVMOs .......................................................................................... 31 A. Spécificité de substrats ........................................................................................................ 31 B. Régio et/ou stéréopréférence .............................................................................................. 33 Conclusion ........................................................................................................................................... 35

IV. Recherche de nouvelles BVMOs ....................................................................................................... 37 A. Tests de criblage ..................................................................................................................... 37 B. Exploration des génomes ...................................................................................................... 40 C- Ingénierie des protéines ........................................................................................................... 41 Conclusion ........................................................................................................................................... 45

V. Applications synthétiques des BVMOs ........................................................................................... 45 A. Les lactones bicycliques ......................................................................................................... 45 B. Les ƴ-butyrolactones ............................................................................................................... 46 C. Les -valérolactones et -caprolactones ............................................................................ 48 Conclusion ........................................................................................................................................... 49

VI. Développement de procédés biocatalytiques ................................................................................ 49 A. Microorganisme versus enzyme ............................................................................................ 49 B. Phénomènes d’inhibition .......................................................................................................... 54 Conclusion ........................................................................................................................................... 57

Conclusion du chapitre ................................................................................................................................ 58 CHAPITRE II : Dédoublements Cinétiques Dynamiques .................................. 59

I. Dédoublement cinétique .................................................................................................................... 59 A. Généralités ................................................................................................................................ 59 B. Mesure du degré d’énantiosélectivité d’un dédoublementcinétique ............................ 60 C. Limitations d’un dédoublement cinétique ............................................................................ 61

II. Dédoublement cinétique dynamique ................................................................................................ 62 A. Définition et études cinétiques ............................................................................................ 62 B. Optimisation de dédoublement cinétique dynamique ....................................................... 63

III. Dédoublements Cinétiques Dynamiques enzymatiques ............................................................... 64 A. DCD chimio-enzymatique ........................................................................................................ 64 B. DCD chimio-enzymatique avec des complexes métalliques ............................................ 70 C. DCD enzymo-enzymatique avec des racémases ................................................................ 73

IV. DCD enzymatique avec des BVMOs ................................................................................................ 78 A. Cyclopentanones α-substituées ........................................................................................... 79

B. Cétones benzyliques ................................................................................................................ 79 C. 2-alkyl-1-indanones ................................................................................................................... 81 D. α-alkyl- -cétoesters .............................................................................................................. 82 Conclusion ........................................................................................................................................... 83

Conclusion du chapitre ................................................................................................................................ 84 Partie Résultats et Discussion ............................................................... 87

Chapitre III : Recherche de nouvelles Baeyer-Villiger Monooxygénases ............. 89

I. Pourquoi s’intéresser au genre Acinetobacter ? .......................................................................... 89 II. Présentation des BVMOs retenues ................................................................................................ 92

A. BVMOs d’A. baumannii et A. baylyi ...................................................................................... 92 B. Choix des souches et contexte génomique ........................................................................ 92 C. Construction des souches ...................................................................................................... 97

III. Choix et obtention des composés testés ....................................................................................... 97 A. La bicyclohepténone ................................................................................................................ 98 B. Les cyclobutanones prochirales -substituées ................................................................. 99 C. Les cyclopentanones et cyclohexanones α-substituées .................................................. 99

IV. Etudes des conditions de culture ................................................................................................... 103 A. Tests d’activité ....................................................................................................................... 103 B. La souche E. coli CHMO TOP10[pQR239] ......................................................................... 104 C. Les souches E. coli BL21(DE3) recombinantes ................................................................. 109

V. Expression du gène de ABAYE 4 dans E. coli TOP10 [pBAD] .................................................. 114 A. Construction du vecteur ........................................................................................................ 114 B. Mise au point des conditions de culture ............................................................................ 114 Conclusion .......................................................................................................................................... 118

VI. Etude des six nouvelles BVMOs d’Acinetobacter ....................................................................... 119 A. Profil général de substrats .................................................................................................. 119 B. Biotransformations de la bicyclohepténone ..................................................................... 121 C. Biotransformations des cyclobutanones prochirales -substituées ........................... 126 D. Biotransformations avec les cétones cycliques α-alkylées ........................................... 129

VII. Discussion ............................................................................................................................................ 132 Conclusion ................................................................................................. Erreur ! Signet non défini.

Chapitre IV : Dédoublements Cinétiques Dynamiques ................................ 139

I. Biotransformations préparatives ................................................................................................... 139 A. Biotransformation de la 2-benzyloxyméthyl cyclopentanone 12a .............................. 140 B. Biotransformation de la 2-benzyloxyméthyl cyclohexanone 13a ............................... 141 C. Biotransformation de la 2-phénylcyclohexanone 14a .................................................. 142 D. Autres biotransformations ................................................................................................... 144 E. Résumé des résultats ............................................................................................................. 144

II. Racémisation ........................................................................................................................................ 145 A. Agents racémisants ................................................................................................................ 145 B. Mesure de la racémisation .................................................................................................... 146 C. Recherche de tampons « racémisants » ............................................................................ 146 D. Etude des conditions de racémisation ............................................................................... 148

III. Dédoublement dynamique avec le tampon phosphate ................................................................ 150 A. Concentration de tampon supportée par les cellules ...................................................... 150 B. Etude préliminaire de la DCD ............................................................................................... 151 C. DCD préparatives avec le tampon phosphate ................................................................... 155 Conclusion .......................................................................................................................................... 157

IV. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon glycine ..................................................... 157

A. Concentration de tampon supportée par les cellules ...................................................... 157

B. Essais analytiques préliminaires .......................................................................................... 158

C. DCD préparatives avec le tampon glycine ......................................................................... 160

V. Conclusion ............................................................................................................................................. 163

Conclusion générale ..................................................................... 165

Partie expérimentale ........................................................................ 167

I. Généralités ........................................................................................................................................... 169

A. Techniques d’analyse .............................................................................................................. 169

B. Matériels .................................................................................................................................. 170

C. Solvants et composés chimiques ......................................................................................... 170

II. Synthèses............................................................................................................................................. 171

A. Synthèse de la 2-benzyloxymethyl-cyclopentanone 12a ............................................. 171

B. Synthèse de la 2-benzyloxyméthyl-cyclohexanone 13a ................................................. 173

C. Synthèse des lactones racémiques par réaction de BV chimique ................................ 175

III. Gènes et enzymes ............................................................................................................................... 175

IV. Culture des microorganismes........................................................................................................... 175

Mesure du poids sec ....................................................................................................................... 175

Culture d’E coli Top10[pQR239] .................................................................................................. 175

Culture des nouvelles BVMOs ....................................................................................................... 176

Mesure d’activité ............................................................................................................................. 177

V. Expression de ABAYE4 dans E. coli TOP10[pBAD/MycHis B] ................................................ 178

VI. Bioconversions ..................................................................................................................................... 180

A. Bioconversions à l’échelle analytique ................................................................................. 180

B. Biotransformation de cycloalcanones α-substituées ...................................................... 180

C. Transformation de la bicyclohepténone par la souche E. coli BL21 ABAYE 4 .......... 185

VII. Dédoublements cinétiques dynamiques ......................................................................................... 187

A. Etudes de racémisation ......................................................................................................... 187

B. Méthylation des lactones et des hydroxyacides ............................................................. 188

C. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon phosphate ................................... 189

D. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon glycine ......................................... 191

VIII. Conditions d’analyses des produits en CPG sur phase chirale ............................................... 192

Annexes ...................................................................................... 197

Liste des Abbréviations

Bicyclohepténone: Bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one BTAH : BenzylTrimethylAmmonium Hydroxide DCD : Dédoublement Cinétique Dynamique DO : Densité Optique Ee : Excès Enantiomérique EtOH : Ethanol E. coli : Escherichia coli FAD : Flavine Adénine Dinucléotide. FMN : Flavine MonoNucléotide. LIC : Ligation Independant Cloning MCPBA : Acide Meta-ChloroPerBenzoïque MTBE : Méthyl tert-Butyl Ether MeCN : Acetonitrile MeOH : Méthanol NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide. NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate. Rdt : Rendement U : Unité d’activité enzymatique exprimée en µmoles/min

Enzymes

BVMOs : Baeyer-Villiger Monooxygénases BVMOAcineto : BVMO d’Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871 BVMOAradio : BVMO d’Acinetobacter radioresistens CHMO : CycloHexanone MonoOxygénase

CHMORhodoHI31 : CHMO de Rhodococcus sp.HI31 CHMORhodoRHA1: CHMO de Rhodococcus RHA1 CHMOBrevi1 : CHMO de Brevibacterium sp. HCU1 CHMOBrevi : CHMO de Brevibacterium sp. HCU2 CHMOBrachy : CHMO de Brachymonas petroleovorans CHMOArthro : CHMO d’Arthrobacter sp. BP2 CHMORhodo1 : CHMO de Rhodococcus sp. Phi1 CHMORhodo2 : CHMO de Rhodococcus sp. Phi2

CPMO : Cyclopentanone Monooxygénase CPMOComa : CPMO de Comamonas NCIMB9871 C. echinulata : Cunninghamella echinulata 2,5-DKCMO : 2,5-Diketocamphane Monooxygénase de Pseudomonas putida 3,6-DKCMO : 3,6-Diketocamphane Monooxygénase de Pseudomonas putida FMOs : Monooxygénases contenant des Flavines. HAPMO : 4-Hydroxyacétophénone Monooxygénase de Pseudomonas fluorescens ACB NMOs : N-Hydroxyl Monooxygénases. OTEMO : 2-Oxo-3-4,5,5-trimethylcyclopentenylacetyl-CoA Monooxygénase PAMO : Phénylacétone Monooxygénase de Thermoanaerobium brockii PTDH : Phosphite Déshydrogénase de Pseudomonas stutzeri STMO : Stéroïde Monooxygénase.

1

Introduction

La Biocatalyse est la transformation, au moyen d’un système biologique composé de

cellules ou d’enzymes, d’un composé en un nouveau produit. εon utilisation pour la

préparation de nouvelles molécules, en particulier chirales, se répand de plus en plus dans

les laboratoires et pénètre lentement le monde industriel.

L’intérêt de la Biocatalyse est lié au fait que les transformations catalysées par les

enzymes s’effectuent dans des conditions expérimentales douces (température, pression,

pH), qui sont autant de conditions garantissant des gains énergétiques et une grande éco-

compatibilité. C’est donc une technique propre qui s’inscrit parfaitement dans le cadre de

la chimie verte et du développement durable.

Ces transformations, d’autre part, s’effectuent de façon très spécifique. Cette

spécificité a un double aspect, une spécificité réactionnelle et une spécificité du substrat.

Ces catalyseurs biologiques sont capables de créer des carbones asymétriques, aussi bien

en fonctionnalisant régiosélectivement un carbone non activé qu’en conduisant à une

molécule chirale à partir d’un centre prochiral ou par dédoublement cinétique. L’obtention

de composés optiquement actifs, qui peuvent être difficiles à synthétiser par voie chimique,

permet d’accéder à des synthons chiraux pour la synthèse de composés d’intérêt biologique,

ce qui représente un objectif d’une importance croissante en particulier dans les domaines

pharmaceutiques et agro-alimentaires.

De ce point de vue, les réactions de Baeyer-Villiger sont exemplaires. Les possibilités

de synthèse asymétrique par voie chimique sont peu nombreuses et nécessitent le plus

souventdes catalyseurs organométalliques complexes tandis que le nombre d’enzymes

capables de réaliser ces réactions ainsi que le nombre de composés transformés

augmentent de façon exponentielle.

Mais, comme cela est souvent le cas avec les réactions enzymatiques, il est difficile

de prédire quels composés seront substrats de ces enzymes et quelle sera la configuration

absolue des produits obtenus. C’est pourquoi il est essentiel de trouver de nouvelles

2

enzymes afin d’élargir le champ de ces biotransformations. Nous explorerons ici le profil

de réactivité de six nouvelles Baeyer-Villiger Monooxygénases en recherchant des

réactions complémentaires à celles existantes, notamment en terme de réactivité de

substrats et de stéréospécificité.

Plus généralement, une contrainte des dédoublements cinétiques, qu’ils soient

chimiques ou enzymatiques, est la perte inéluctable de 50% du produit de départ. En

associant à ces derniers une racémisation in situ, cette limitation peut être surmontée par

un procédé appelé Dédoublement Cinétique Dynamique. Nous décrirons ici l’exploration

d’une nouvelle stratégie de racémisation, compatible avec les réactions de Baeyer-Villiger

microbiologiques, qui a permis pour la première fois d’appliquer ces dédoublements à des

cyclohexanones α-substituées.

Ce manuscrit s’articulera suivant le plan général suivant :

La première partie est constituée par une étude bibliographique composée de deux

chapitres. Tout d’abord, un aperçu de la littérature récente concernant les

caractéristiques et les applications synthétiques des Baeyer-Villiger Monooxygénases sera

présenté, ainsi que les stratégies et les procédés biocatalytiques développés pour améliorer

les propriétés catalytiques et la productivité de ces réactions. Ensuite, nous nous

intéresserons aux stratégies de Dédoublement Cinétique Dynamique impliquant des

enzymes, en mettant l’accent sur des exemples utilisant des Baeyer-Villiger

Monooxygénases.

La deuxième partie décrira les résultats obtenus. Dans le premier chapitre, nous

présenterons de nouvelles Baeyer-Villiger Monooxygénases, issues de deux souches

d’Acinetobacter, A. baumannii et A. baylyi sélectionnées en collaboration avec le Génoscope

d’Evry dans le cadre du projet ANδ « NaturaDyRe ». Elles ont permis l’identification de

nouveaux couples de cétones cycliques et d’enzymes conduisant à des lactones

énantiopures. Dans le second chapitre, nous décrirons la mise en place de Dédoublements

Cinétiques Dynamiques en présence de solutions tampons concentrées.

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Partie Bibliographique

Dans cette partie, nous aborderons les deux éléments les plus caractéristiques de

notre travail, à savoir les Baeyer-Villiger monooxygénases (BVMOs) et le Dédoublement

Cinétique Dynamique (DCD).

Le premier chapitre portera précisément sur les caractéristiques de ces enzymes,

leur sélectivité, et le développement de procédés biocatalytiques.

Le second chapitre traitera des méthodes de DCD impliquant des enzymes et décrira

des applications réussies avec des BVMOs.

4

5

Chapitre I : Les réactions de Baeyer-Villiger

I. Réaction de Baeyer-Villiger chimique

C’est en 1899 que Adolf von Baeyer et Victor Villiger ont découvert la possibilité de

convertir des cétones cycliques en lactones par l’utilisation d’acide monopersulfurique ou

acide de Caro (Schéma 1). Depuis, l’oxydation de Baeyer-Villiger (BV) est devenue une des

réactions plus utilisée de la chimie de synthèse1, qui permet, sous l’action d’un peracide ou

d’un peroxyde, la transformation des cétones linéaires en esters et de cétones cycliques

en lactones.

Schéma 1 : Première réaction de Baeyer-Villige , utilisa t l’a ide de Ca o.

Cette réaction présente de nombreux avantages. Elle est réalisable dans des

conditions douces, les réactions secondaires sont peu nombreuses et les rendements

généralement élevés. Un large éventail de peracides et de peroxydes d’activités variées

est aussi disponible, qui va de l’acide meta-chloroperbenzoïque, le plus employé au plus

simple, le peroxyde d’hydrogène. L’ordre décroissant de réactivité est le suivant : l’acide

perméthanoïque, l’acide perbenzoïque, l’acide peroxyacétique, le peroxyde d’hydrogène et

l’hydroperoxyde de tert-butyle 2.

La régiosélectivité de cette réaction est généralement élevée. Elle peut être prévue

en fonction de l’aptitude migratoire de l’atome de carbone situé en alpha du groupe

carbonyle (tertiaire > secondaire > primaire). La migration est totalement stéréospécifique,

avec rétention de configuration de l’atome de carbone migrant.

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A. Mécanisme de la réaction

Criegee a proposé un mécanisme en deux étapes dès 19483, qui est aujourd’hui

toujours communément accepté. La première étape est une attaque nucléophile du

peroxyde ou du peracide sur le carbonyle conduisant à la formation de l’intermédiaire

réactionnel connu sous le nom d’adduit de Criegee (Schéma 2). Ce dernier se réarrange lors

de la seconde étape, par une migration concertée d’un des deux atomes de carbone

adjacents à l’oxygène, avec la libération d’un anion carboxylate.

Schéma 2

Ce réarrangement constitue l’étape déterminante de la réaction et s’effectue avec

conservation de la stéréochimie du groupe migrant, un des grands avantages de ces

réactions. La migration du groupe portant l’atome de carbone le plus substitué (ou le plus

nucléophile) s’effectue de façon largement préférentielle2. Ces effets électroniques

peuvent cependant être modulés par des effets stériques4 et surtout stéréoélectroniques5.

Selon ces derniers, la liaison qui subit une migration doit être antipériplanaire à la liaison

peroxyde O-O et à un des deux doublets électroniques libres de l’atome d’oxygène du

groupe hydroxyle (Schéma 3). Ainsi quand les deux groupes migrants sont en libre rotation,

la migration du plus substitué est préférentielle. Mais dans un environnement (par exemple

chiral) qui privilégiera une conformation plaçant le groupe le moins substitué

antipériplanaire à la liaison O-O, celui-ci sera alors favorisé.

Schéma 3

7

B. Limites de la réaction

Malgré ses avantages, la réaction de Baeyer-Villiger chimique possède deux

inconvénients majeurs : sa dangerosité à grande échelle et la rareté des catalyseurs

permettant de l’effectuer de manière asymétrique.

1) Inconvénients de la réaction à grande échelle

L’emploi de peracides ou de peroxydes dans la réaction de Baeyer-Villiger est simple

à l’échelle analytique ou de laboratoire. Mais à l’échelle industrielle, cette réaction, qui

nécessite le plus souvent des réactifs en quantités stœchiométriques, engendre autant de

résidus sous forme d’acides organiques que de produits. La purification de ces derniers est

donc coûteuse et peu écoresponsable. De plus, les oxydants les plus utilisés comme l’acide

m-chloroperbenzoïque et le peroxyde d'hydrogène présentent des risques d’explosion non

négligeables, lors de manipulations de grandes quantités, ce qui rend délicat leur emploi à

l’échelle industrielle. Néanmoins, il est à noter qu’une recherche importante se développe

pour trouver des catalyseurs de substitution moins dangereux (catalyseurs à base de

zéolites, d’hydrotalcites, d’argile) 6.

2) Chimiosélectivité

La plupart des réactifs de BV sont peu chimiosélectifs. Ils oxydent souvent les

doubles liaisons présentes dans la molécule ainsi que de nombreux hétéroatomes.

3) Stéréospécificité

Bien que les réactions de Baeyer-Villiger soient connues depuis un siècle et qu’elles

aient fait l’objet de nombreuses recherches, aucun exemple de réaction asymétrique

utilisant des réactifs chimiques n’a été rapporté avant 1994. Ces premiers exemples ont

été publiés simultanément par Bolm 7 et Strukul 8, et mettaient en jeu des catalyseurs à

base de nickel, de cuivre ou de platine, complexés à des ligands chiraux. Ils ont été utilisés

sur des cyclopentanones et des cyclohexanones α-substituées qui se sont révélées être

très peu réactives et ont donné des rendements et des excès énantiomériques (ee)

modérés. Depuis ces exemples, plusieurs catalyseurs ont été décrits 9,10,11 formés de

métaux et de ligands variés, sans amélioration notable.

8

Les cycloalcanones α-substituées ont été rapidement abandonnées au profit des

cyclobutanones -substituées prochirales ou de cyclobutanones bicycliques racémiques, en

particulier la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one. Cette dernière, du fait de sa réactivité, est

devenue le substrat modèle pour toutes les réactions de BV qu’elles soient chimiques ou

enzymatiques. Pendant longtemps, les meilleurs rendements et excès énantiomériques ont

été obtenus avec des complexes du zirconium et de cobalt à base de ligands Salen 12,13,14

(Tableau 1). Des complexes Co(salen) ont été immobilisés sur un polystyrène fonctionnalisé,

ce qui a permis de réutiliser les catalyseurs plusieurs fois sans perte d’activité.

Ce n’est que très récemment qu’un pas important a été franchi dans ce domaine. Un

complexe du Scandium, L-Sc(OTf)3 où L est un ligand N,N’-dioxyde dérivant du (S)-

Ramipril, s’est montré efficace en termes de réactivité, d’énantio- et

énantiotoposélectivité, non seulement sur un panel de cyclobutanones -substituées mais

aussi, pour la première fois, sur une gamme de cyclohexanones prochirales et α-

substituées15 (Tableau 2).

Tableau 1

9

Tableau 2

Conclusion

Les recherches pour améliorer les réactions de Baeyer-Villiger progressent depuis

quelques années mais la demande en réactions efficaces plus sûres et plus sélectives est

toujours d’actualité. Les réactions enzymatiques sont une alternative sérieuse comme nous

allons le voir maintenant.

10

II. Les Baeyer-Villiger monooxygénases

A. Généralités

Les réactions de Baeyer-Villiger ont aussi leur version enzymatique. Elles sont alors

catalysées par des enzymes appelées Baeyer-Villiger monooxygénases ou BVMOs que l’on

trouve surtout chez les champignons et les bactéries, et le plus souvent chez les

actinomycètes parmi ces dernières. Ce sont des enzymes qui interviennent essentiellement

dans les voies de dégradation de composés xénobiotiques. Le rôle de ces voies est soit de

permettre l’utilisation de sources de carbone pour la croissance bactérienne soit d’éliminer

des composés toxiques en les rendant plus solubles, un système de détoxification

fréquemment trouvé chez les champignons. Quelques enzymes cependant sont impliquées

dans des voies de biosynthèse comme, par exemple, la biosynthèse de sesquiterpénoides

(neopentalenolactone)16,17, d’aflatoxines (versiconal)18 ou de polycétides (cytochalasine )19.

Schéma 4

Ces réactions de BV enzymatiques présentent l’immense avantage sur leurs versions

chimiques d’être le plus souvent régio-, énantio- ou énantiotoposélectives. Ces

caractéristiques ont suscité de très nombreuses études explorant leurs capacités

biocatalytiques, résumées dans plusieurs revues relativement récentes 20,21, 22.

1) Historique

En début des années 50, l’existence d’une réaction de BV biologique a été décrite

pour la première fois après une série d’études microbiologiques sur les stéroïdes23.

L’incubation de la progestérone avec certains champignons comme Penicillium chrysogenum

a donné de la testololactone avec un rendement de 70%, mettant ainsi en évidence la

formation d’une lactone dans le cycle D24. Cependant, malgré ce début prometteur, il a fallu

11

attendre 1987 pour qu’une réaction de BV microbiologique soit explicitement décrite et

signe le début de l’utilisation de ces enzymes en biocatalyse 25 (Schéma 5).

Schéma 5 : Premiers exemples de réactions de BV microbiologiques

Les enzymes responsables de ces réactions ont été isolées et caractérisées dès les

années 1970. Les premières ont été la cyclohexanone monooxygénase d’Acinetobacter

calcoaceticus NCIMB 9871 (CHMOAcineto)26 et la cyclopentanone monooxygénase de

Comamonas* NCIMB 9872 (CPMOComa)27. Ces enzymes interviennent dans la biodégradation

d’alcools alicycliques (le cyclohexanol et le cyclopentanol respectivement) et sont destinées

à fournir une source de carbone à ces microorganismes. La CHMOAcineto a été la plus

largement étudiée tant du point de vue de la biochimie que de la biocatalyse 28. En effet,

son gène a été le premier gène de BVMO à être séquencé en 198829, reséquencé et cloné

dans Saccharomyces en 199630. D’autre part, ses propriétés biocatalytiques ont été l’objet

de nombreuses publications qui ont démontré les capacités exceptionnelles de cette

enzyme à oxyder une large gamme de composés avec une régio- et/ou une énantiosélectivité

particulièrement élevées. Depuis, une soixantaine de ces enzymes ont été identifiées, ce

nombre augmentant de façon exponentielle grâce aux progrès de l’analyse génomique. En

revanche seules six structures tridimensionnelles ont été obtenues à ce jour et, bien que

la compréhension de leur mécanisme enzymatique s’affine régulièrement, de nombreuses

interrogations demeurent, concernant en particulier leur sélectivité.

* identifié pendant longtemps comme un Pseudomonas

12

Figure 1 31 : Résumé historique

2) Nature des BVMOs

Les Baeyer-Villiger monooxygénases font partie des oxydoréductases (EC 1. 14. 13).

Comme leur nom l’indique, ce sont des monooxygénases. Par définition, ces enzymes

catalysent l’insertion d’un seul atome d’oxygène. Elles nécessitent pour cela un cofacteur

nicotinamide comme donneur d’électrons. Un coenzyme est également indispensable pour

transférer ces électrons sur l’oxygène. La nature du coenzyme est variable, il peut être

organique, comme la flavine ou la ptérine, ou métallique, le plus souvent du fer ou cuivre.

Les Baeyer-Villiger Monooxygénases sont des monooxygénases à flavine. Elles

utilisent le NADH ou le NADPH comme cofacteur et une molécule de dioxygène comme

oxydant. Le second oxygène est alors réduit en une molécule d’eau. Le coenzyme peut être

le FAD (Flavine Adénine Dinucléotide) ou le FMN (Flavine Mono Nucléotide), qui se

distinguent l’un de l’autre par un simple groupement phosphate (Schéma 6).

13

Schéma 6 : NADH et NADPH

3) Classification

Les caractéristiques biochimiques de ces enzymes ainsi que la spécificité du système

cofacteur/cosubstrat ont conduit Willets en 1997 32 à distinguer deux types. : les BVMOs

de type I sont FAD et NADPH dépendantes, et les BVMOs de type II, FMN et NADH

dépendantes*. Chaque type appartient également à une classe distincte de la super-famille

des Flavoprotéines Monooxygénases†. La classification proposée par Fraaije de cette

super-famille34 comporte six classes et est basée sur le type de réaction d’oxygénation,

ainsi que sur la similarité des séquences et de certaines caractéristiques structurales. Les

BVMOs de type I forment avec deux autres familles, les N-hydroxyl monooxygénases

(NMOs) et les monooxygénases contenant des flavines (FMOs), la classe B des

Flavoprotéines Monooxygénases tandis que les BVMOs de type II en forment, avec les

luciférases et les alcanesulfonates monooxygénases, la classe C.

B. BVMOs de type I

Les BVMOs de type I utilisent le FAD comme coenzyme, et sont strictement

dépendantes du NADPH. Ce sont les plus fréquemment rencontrées, elles ont été l’objet

de nombreuses études biocatalytiques et biochimiques. Elles sont le plus souvent solubles

et de taille allant d’environ 500 à 650 acides aminés. Plusieurs systèmes de surexpression

ont été développés dans Saccharomyces 30 et Escherichia coli 35 et leurs applications

synthétiques, au départ avec des microorganismes sauvages puis des bactéries

* Cette classification est à nuancer depuis la découverte d’une BVMO provenant d’une bacterie marine acceptant aussi bien le NADPH que le NADH 33 † A ne pas confondre avec la famille des monoxygénases contenant des flavines (FMOs)

14

recombinantes ou des enzymes purifiées, ont été largement étudiées 20,21,22,36,28. En effet

ces enzymes sont non seulement capables d’effectuer des réactions de BV mais aussi

d’oxyder des atomes comme le soufre37, l’azote38,39, le sélénium40,41 et le bore42. Leur

éventail de substrats est donc particulièrement large.

1) Mécanisme

Le mécanisme catalytique communément admis des BVMOs repose sur celui de la

CHMO d’A. calcoaceticus. Il a été proposé par Walsh en 1982 43 puis précisé par Massey

en 200144 et confirmé par des études cinétiques poussées s’appuyant sur des expériences

de stop-flow 45. εa caractéristique essentielle est l’existence de l’espèce réactive, la 4Ca-

peroxyflavine, qui correspond au peracide des réactions de BV chimiques, ainsi que la

formation d’un analogue de l’intermédiaire de Criegee dont le réarrangement suit les règles

de Deslongchamps concernant les effets stéréoélectroniques.

Le cycle catalytique est représenté Schéma 7. L’enzyme dans son état de repos est

liée à la Flavine par une liaison non covalente. Cette dernière est sous forme oxydée (E-

FAD) et doit être réduite par le NADPH. La flavine une fois réduite, le complexe E-FAD-

NADP+ réagit avec une molécule de dioxygène de l’air pour former la C4a-peroxyflavine.

Cet intermédiaire réactif agit sous sa forme anionique comme un nucléophile avec les

cétones et les atomes de bore tandis qu’il réagit sous sa forme protonée comme un

électrophile vis-à-vis d’hétéroatomes tels que le soufre, l’azote, le sélénium, le phosphore.

En présence d’une cétone, l’attaque nucléophile de cette entité oxydante sur le

groupe carbonyle conduit à la formation d’un intermédiaire tétraédrique de Criegee qui se

réarrange pour fournir la C4a-hydroxyflavine et une lactone. Une molécule d'eau est

ensuite éliminée pour générer le FAD oxydé. Les étapes limitantes dans cette cascade de

réactions sont soit la libération du produit oxydé, soit la libération de NADP+ afin qu’il

puisse être réduit en dehors de l’enzyme et participer au cycle suivant. Une caractéristique

cruciale de ce mécanisme est le fait que le coenzyme reste lié à l'enzyme pendant tout le

cycle catalytique. Ces observations mécanistiques ont été confirmées avec une autre BVMO

de type I, la 4-hydroxyacétophénone monooxygénase HAPMO de Pseudomonas

15

fluorescens ACB. Des expériences de spectroscopie de masse*, qui permettent de visualiser

en temps réel les complexes non covalent coenzyme-protéine , ont montré que le NADP+

interagit fortement avec la forme réduite de l’HAPMO durant la catalyse 46. Elles ont

également montré que son association à l’enzyme est cruciale pour la stabilité de cette

dernière. Ces caractéristiques originales seront largement confirmées lors d’études

structurales ultérieures.

.

Schéma 7 : Mécanisme de la réaction de BV enzymatique.

2) Aspect génomique

L’examen des séquences protéiques des BVMOs a révélé sans surprise la présence

systématique de deux motifs GXGXX(G/A) 47 qui forment une part de deux repliements de

* Spectrométrie de Masse avec Ionisation par ElectroNébulisation (SM-IEN)

16

Rossman*. Ces motifs sont généralement impliqués dans des liaisons de cofacteur

nicotinamide et de flavine avec l’enzyme via leur partie dinucléotide.

Fraaije a trouvé en 200148, après avoir étudié l’alignement des séquences protéiques

de toutes les BVMOs purifiées et séquencées à cette époque, une signature, c’est-à-dire

une région conservée chez toutes les BVMOs de type I et caractéristique de ces enzymes.

Il s’agit du motif FxGxxxHxxxW(P/D). Il est situé juste avant le second repliement de

Rossman et, étonnamment, à distance du site actif de l’enzyme. Des études par mutagénèse

dirigée ont néanmoins montré l’importance des résidus tryptophane (W) et histidine (H) de

ce motif. Le premier est essentiel au repliement de l’enzyme, le second à la catalyse. Le

rôle fonctionnel de cette séquence consensus a été précisé au cours d’études structurales

que nous détaillerons dans la suite de ce travail.

Cette séquence consensus permet de distinguer les BVMOs des autres Flavoprotéines

Monooxygénases ainsi que des autres membres de leur classe (FMO, NMO). En effet une

séquence très proche, FxGxxxHxxx(Y/F), différant par un seul résidu, est commune à

toutes les FMO tandis que le seul résidu de ce motif strictement conservé chez les NMOs

est l’histidine.

L’identification de ce motif a permis ensuite l’exploration de banques de données

génomiques et la découverte de nouvelles BVMOs. Une recherche spécifique dans le génome

de bactéries thermophiles a, par exemple, conduit à la découverte de la phénylacétone

monooxygénase (PAMO), une enzyme particulièrement stable à haute température et en

présence de solvants organiques et qui a été la première BVMO à être cristallisée. La liste

des BVMOs ne cessant de s’allonger, une seconde signature a été mise en évidence

récemment: le motif [A/G]GxWxxxx[F/Y]P[G/M]xxxD49. Elle est localisée entre le motif

N-terminal GxGxxG et le premier motif consensus. Ce nouveau motif, impliquant plus de

résidus conservés, semble être plus discriminant pour les BVMOs. Il permet par exemple

de les distinguer clairement des FMOs car la séquence et la structure du motif autour de

l’aspartate (D) sont totalement différentes50. Une recherche effectuée dans la base UniProt via le programme Psi-Blast a permis

de retenir 116 BVMOs putatives montrant plus de 50% d’identité avec trois des principales

* Le repliement de Rossman est un motif structural protéique présent dans les protéines qui lient des nucléotides. La structure est composée de six feuillets en parallèle liés à deux paires d’hélices α.

17

BVMOs (CHMORhodoHI31, PAMO et CPDMO) 51 . Une étude de la conservation des acides

aminés de ces BVMOs au cours de l’évolution a été effectuée, basée sur l’hypothèse que

les résidus structurellement et fonctionnellement les plus importants sont souvent les plus

conservés. Les scores obtenus ont été projetés sur une structure tridimensionnelle, en

l’occurrence celle de CHMORhodoHI31 dont nous discuterons dans le paragraphe suivant. Cette

structure est représenté Figure 2 et montre que la partie externe de l’enzyme est moins

conservée que la partie interne et qu’un domaine particulier, le domaine « hélicoïdal », est

le moins conservé.

Figure 2 : Conservation des acides aminés :

(en bleu : résidu faiblement conservé ; en rouge : résidu fortement conservé). Image J. Rehbemed

3) Etudes structurales

Malgré de nombreuses tentatives, seulement six BVMOs ont pu être cristallisées et

leur structure tridimensionnelle proposée. La première a été la PAMO en 2004 52, puis plus

récemment CHMORhodoHI31 53, OTEMO 54 et STMO 55. La structure d’une autre BVMO de

type I , la MtmOIV, a également été résolue 56. Elle présente une faible identité de

séquence avec les autres BVMOs (8% avec la PAMO) et est plus proche (en séquence et en

structure) d’une hydroxylase, PgaE, un membre typique de la classe A des Flavoprotéines

Monooxygénases. La sixième enzyme, SMFMO33, issue de la bactérie

marine Stenotrophomonas maltophilia, est également très particulière* et s’apparente

* 38 kDa, NADH dépendante

18

davantage à une FMO qu’à une BVMO. Les structures de ces deux enzymes ne seront pas

discutées ici car trop atypiques.

Deux équipes, celle de Fraaije et celle de Lau, ont été responsables d’avancées

importantes dans la compréhension fine du mécanisme réactionnel. Les différentes

structures cristallines décrites pour chaque enzyme et leur analyse ont permis de mieux

comprendre les changements conformationnels de certains éléments du site actif durant

la catalyse. En s’appuyant sur les études structurales menées avec PAMO et CHMORhodoHI31,

un mécanisme de catalyse a été proposé.

A. Phénylacétone monooxygènase PAMO

La phénylacétone monooxygénase (PAMO) est une protéine monomérique de 542

acides aminés qui provient de la bactérie thermophile Thermobifida fusca . Elle catalyse la

transformation de la phénylacétone en phénylacétate. Sa structure a d’abord été résolue

en liaison avec le FAD mais en absence de son cofacteur NADPH et du substrat. 52

Cette structure a révélé deux domaines, un premier domaine liant le FAD et l’autre

le NADP, le site actif se situant dans un creux entre les deux domaines (Figure 3). Le noyau

isoalloxazine de la flavine est incorporé à l’intérieur la protéine à laquelle il est lié par des

liaisons hydrogène et de Van der Waals ; en particulier, sa face Si est liée à un cluster

d’acides aminés aromatiques conservés chez toutes les BVMOs (W55, Y60 et Y72). Le motif

consensus FXGXXXHXXXW se situe loin du site actif et correspond à une boucle liant les

deux domaines FAD et NADPH. Il exerce un rôle surtout structurant.

19

Figure 3 51 : Structure cristalline de la PAMO.

Le domaine de liaison du FAD (résidus 10-158 et 390-542) est coloré en vert, le domaine de liaison du NADP

(résidus 159- est e leu. Le sous do ai e α-hélicoïdal (220-340) dans le domaine liant le NADP est en

turquoise, et les résidus du motif consensus (167-177) sont en rouge. Le cofacteur FAD est coloré en vert et

le NADPH en bleu.

L’Asparagine D66 de la seconde signature, proche du site actif, intervient dans

l’oxydation du NADPH. C’est elle qui le positionne correctement dans le site actif et qui

favorise la formation du NADP+. Le résidu Arginine R337, strictement conservé, joue un

rôle essentiel (Figure 4). En effet, il est localisé en face de l'atome C4a sur la face Re de

la flavine et sa chaîne latérale peut adopter deux conformations : l’une qui permet au

NADPH de se positionner près de la flavine et de la réduire, l’autre, observée dans la

structure cristalline, qui stabilise l’intermédiaire C4a-peroxyflavine chargé négativement

ainsi que cela avait déjà été suggéré par des études de cinétiques et de mutagenèse dirigée 57. Une étude très complète de Fraaije et Mattevi 58 en faisant intervenir mutagénèse,

études cinétiques, microphotospectrométrie et cristallographie a suggéré que, une fois le

peroxyflavine formé, le R337 recule, laissant de la place au substrat. Le R337 interagirait

alors avec l’oxygène du carbonyle pour faciliter l’attaque nucléophile par le peroxyflavine.

20

Figure 4 58 : Représentation s h ati ue du ôle de l’A gi i e et des ouve e ts du NADP+ chez

PAMO.

B. Cyclohexanone monooxygènase de Rhodococcus (CHMORhodoHI31)

Bien qu’il s’agit de l’enzyme de loin la plus étudiée et malgré de nombreuses tentatives,

la CHMOAcineto n’a jamais pu être cristallisée. Finalement, c’est la structure 3D d’une autre

CHMO, provenant de la bactérie Rhodococcus sp. HI-31 et dont la séquence présente une

similarité de 55% avec CHMOAcineto, qui a été publiée 53. Elle comprend 540 acides aminés

et, comme la PAMO, elle contient trois domaines distincts (Figure 5). Le domaine de liaison

au FAD est composé des 140 premiers résidus de la partie N-terminale ainsi que des résidus

387 à 540 de la partie C-terminale. Le domaine de liaison au NADP est composé de segments

discontinus (résidus 152 à 208 et 335 à 380). Ils sont reliés entre eux par deux boucles

composées des résidus 144 à 151 et 381 à 386. D’autre part, un domaine hélicoïdal formé

des résidus 224 à 322 est relié à la séquence du domaine du NADPH par les résidus 209 à

223 et 322 à 334. Ce domaine est crucial puisqu’il contient les acides aminés formant la

poche de liaison du substrat. Comme pour la PAMO, le FAD est placé au fond de son domaine

21

et ne se dissocie probablement pas de l’enzyme. Le NADPH est pris entre le repliement de

Rossman du domaine du NADPH et une boucle appartenant au domaine du FAD.

Figure 5 : Structure cristalline de la CHMORhodoHI31 (3GWF).

Le domaine de liaison du FAD est en vert, le domaine de liaison du NADP en bleu foncé, les régions liantes

en jaune. Le domaine hélicoïdal est en turquoise, le motif consensus en rouge.

Complexation avec le NADPH et le FAD :

Différentes structures cristallines complexées avec le FAD, le NADPH ou le substrat

ont été obtenues pour la première fois par Lau 53 et ont permis une avancée importante

dans la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la catalyse.

Deux formes cristallines contenant le NADP+ et le FAD ont été résolues, révélant

deux états conformationnels différents, CHMOopen et CHMOclosed, correspondants à une

forme ouverte et à une forme fermée. Une comparaison des sites actifs de ces deux

conformations montre que la forme fermée comporte une cavité de 150 Å formée de

résidus essentiellement hydrophobes tandis que, dans la forme ouverte, cette même poche

est agrandie et rendue accessible grâce au mouvement d’une boucle mobile (résidus 487 à

504) (Figure 6). Autre différence, l’orientation relative du domaine du NADP+ qui suggère

des modes de liaison variables pour le NADP+. Ainsi la rotation de ce domaine a pour

conséquence d’importants déplacements de plusieurs résidus du site actif et notamment du

R329 (équivalent au R337 de PAMO) (Figure 7). Dans la conformation «closed», la flexion

de la boucle oblige la chaine latérale du R329 à pousser la tête nicotinamide du NADP+ vers

la flavine afin de stabiliser la peroxyflavine puis l’intermédiaire de Criegee, ce qui explique

22

le fait que la peroxyflavine ne se forme pas en l’absence de NADP+. La

conformation «closed » représenterait donc la conformation de l'enzyme dans l'état post-

réduction de la flavine, et la conformation « open » dans la dernière étape du cycle

catalytique à savoir la libération du NADP+.

Figure 6 31 : Structure cristallographique de la CHMO sous ses deux formes closed (3GWD) et open (3GWF).

Le FAD est coloré en jaune, et le NADPH en violet.

Bien que cette étude ait fait considérablement avancer la compréhension du

mécanisme enzymatique, des questions restent en suspens. Par exemple, la manière dont

s’opère la réaction par une enzyme dont le site actif est encombré par le cofacteur tout au

long de la réaction. La formation de l’adduit de la peroxyflavine avec des substrats plus

volumineux que la cyclohexanone devrait donner lieu à des encombrements stériques avec

le NADP+ et/ou avec certains résidus du site actif. Ces substrats ne devraient donc pas

d’être oxydés, ce qui est en contradiction avec les observations puisque cette enzyme est

capable de réagir sur des cétones substituées et bicycliques volumineuses. Comment alors

le site actif se réorganise-t-il pour accepter la formation du complexe et quelle est la

conformation qui définit le profil du substrat?

23

Figure 7 31: Comparaison de modes de liaisons du NADP+ pour CHMOopen (3GWF, bleu) et CHMOclosed (3UCL,

vert). Le cofacteur est lié au domaine NADP dans les deux conformations par les mêmes interactions avec les

résidus (T210, R209, T186, T189, and Q192). Au contraire, des déplacements importants sont visibles pour

D59, K328, R329, and W492 conduisant à la conformation « push » observée dans CHMOclosed.

Complexation avec le substrat :

Une nouvelle structure (CHMOrotated), cristallisée avec un substrat (la

cyclohexanone), a été résolue très récemment59 par la même équipe et a permis de répondre

aux questions précédentes. Elle est très proche de la conformation CHMOopen, dont elle se

distingue par une légère rotation du domaine de fixation du NADPH. Ce mouvement déplace

la tête nicotinamide du NADP+ loin de sa position au-dessus de l’isoalloxazine et l’enfouit

plus profondément dans la cavité hydrophobe observée dans CHMOopen. Ce mouvement a un

double effet ; 1) il crée de l’espace au substrat pour entrer dans la position catalytique. 2)

il bloque partiellement cette région et empêche le substrat de diffuser dans le milieu tant

que la protéine est dans cette conformation.

Curieusement, des résidus précédemment impliqués dans la spécificité de substrats

de la CHMO et d’autres BVMOs 60,61, ne sont pas retrouvés à proximité du substrat dans

la conformation CHMOrotated, mais sont alignés dans la poche de liaison du substrat dans la

conformation CHMOclosed. Ils ont été identifiés principalement en observant deux

différences structurales fondamentales entre la CHMO et la PAMO : i) Un dipeptide inséré

entre les résidus 278 et 279 chez la CHMO et un autre entre les positions 433 et 444

chez la PAMO (numérotation CHMO), ii) La boucle de résidus 487-504 différemment

structurée chez la PAMO, qui fait partie du site actif de CHMOclosed et permet l’interaction

de W492 avec le ribose de NADP+. Les différentes mutations effectuées au niveau de ces

24

résidus, chez la CHMO ou la PAMO ont donc affecté l’activité, la régio et/ou

l’énantiopréférence de l’enzyme. La conformation CHMOclosed est probablement responsable

de la sélectivité, de la régio et l’énantiosélectivité de l’enzyme. Le résidu clé arginine δ329

pourrait jouer un rôle dans l’orientation du substrat, en le maintenant dans la même position

lors du passage de la conformation CHMOclosed à la conformation CHMOrotated.

Figure 8 44 : Schéma du mécanisme de la CHMO proposé par Lau.

Le FAD est indiqué par trois hexagones fusionnés. Le NADPH réduit est affiché en bleu, avec la partie adénine

sous forme de rectangle, la nicotinamide comme un hexagone et le phosphate comme une ligne ondulée

épaisse. Le NADP+ oxydé est en rouge, le substrat en vert, la lacto e e o a ge et l’i te diai e de Criegee

en brun. La partie peroxyanion est représentée en bleu attaché au FAD.

Les données structurales des trois conformations ont permis de proposer un

mécanisme structural de la catalyse qui soit compatible avec le mécanisme cinétique déjà

élucidé. Comme illustré Figure 8, le mécanisme commence en absence de NADPH et du

substrat (état A). Suit la liaison du NADPH et la réduction du FAD (état B) qui s’effectue

dans la conformation «open », le NADP+ et le R329 occupant des positions qui stabilisent

la flavine réduite. Cette dernière réagit avec une molécule d’oxygène pour former l’anion

peroxy (état C), qui est aussi stabilisé par les mêmes résidus dans une conformation « open-

like ». Le substrat va se lier dans la poche de liaison observée dans CHMOopen (état D).

Ceci entraine une réorganisation d’une large boucle permettant à l’enzyme d’adopter une

conformation CHMOclosed (état E) ; c’est cette structure qui détermine si le substrat sera

25

accepté ainsi que l’aspect régio et énantiosélectif de la réaction. A partir de là, l’enzyme

passe à son état de conformation ‘’rotated’’ (état F) marqué par la rotation de NADP+ et la

migration du substrat en position catalytique ; le R329 oriente celui-ci en préservant sa

stéréochimie et le NADP+ bloque la voie de sortie du site réactionnel. L’intermédiaire de

Criegee va ainsi se réarranger (état G) pour former la lactone. L’enzyme commence à

inverser ses étapes ; le R329 repositionne le produit en permettant au NADP+ de retourner

à sa position au-dessus des cycles flaviniques, soit en passant par la liaison de la lactone

dans la poche CHMOclosed (état H), soit en passant directement dans la conformation open

(état I). Le produit peut enfin être libéré puis le NADP+ oxydé, ce qui se traduit par le

retour de l’enzyme à son état initial (état A).

Les structures proposées de la CHMO avec son substrat décrivent l'état de l'enzyme,

plaçant le substrat dans sa position idéale pour la formation de l'intermédiaire de Criegee.

En même temps, elles montrent l'espace et la flexibilité du site nécessaires pour permettre

l’accès d'une large gamme de substrats de différentes tailles. Enfin, elles ont répondu à la

question précédemment posée, à savoir comment le substrat peut-il atteindre le site actif

alors que le cofacteur NADP+ reste lié à l’enzyme, conformément au mécanisme cinétique

établi.

Ces études ont aussi permis de préciser le rôle du motif consensus FXGXXXHXXXW

en montrant son implication dans la coordination des mouvements du domaine du NADPH et

donc dans la liaison du cofacteur. En effet, les deux acides aminés aux extrémités de la

signature (F160 et W170) interagissent avec des poches hydrophobes du domaine de liaison

du NADPH tandis que l’Histidine (H166) centrale forme une liaison H avec un des segments

liant les domaines du FAD et du NADPH ce qui conduit à un positionnement favorable du

NADP+.

Il reste néanmoins à expliquer : i) la formation et stabilisation de l'intermédiaire de

Criegee au cours de la catalyse, ii) la nature de la poche de liaison du substrat lorsqu’une

BVMO donnée accepte une large gamme de substrats allant de grande à petite taille et iii)

l'influence probable d’autres zones de la protéine dans la catalyse.

C. Stéroïde Monooxygénase (STMO)

La Stéroïde Monooxygénase (STMO) de Rhodococcus rhodochrous a été la deuxième

enzyme dont le gène a été cloné et exprimé de façon hétérologue dans E. coli. Sa structure

26

cristallographique a été résolue récemment par Mattevi 55. Cette enzyme de 549 acides

aminés présente une forte homologie de séquence avec les autres BVMOs de structures

cristallines connues notamment PAMO (53% d’identité), et CHMO (45%), et OTEMO (43%),

homologie qui se retrouve aussi dans leurs structures tridimensionnelles. La stratégie des

auteurs de cette étude est de comparer PAMO et STMO, ces enzymes apparentées qui ont

pourtant des préférences de substrat très diverses, allant d'une molécule aromatique

simple (la phénylacétone) à un stéroïde, l’objectif étant d’identifier les éléments

structuraux du site actif qui orientent la liaison du substrat et sa sélectivité.

Quatre structures ont été analysées : l’enzyme dans son état oxydé et en

complexation avec le NADP+, ainsi que les sites actifs de deux mutants. Les deux domaines

liant FAD et NADPH chez la STMO se superposent exactement aux domaines

correspondants chez PAMO, et un peu moins à ceux de CHMO et OTEMO, ce qui en fait,

selon les auteurs, un modèle générique possible des BVMOs. En revanche, le cycle

nicotinamide est légèrement déplacé par rapport à la flavine si on le compare aux autres

structures connues. Ce dernier point accrédite l’hypothèse du « NADPH glissant », l’idée

que le cofacteur adopte plusieurs positions durant le cycle catalytique.

Une poche ouverte globulaire, à l'interface entre les deux domaines, porte les sites

de liaison du cofacteur et du substrat stéroïdique qui se situent sur les parois opposées de

cette poche. Une arginine (R342) conservée, essentielle car favorisant probablement

l’intermédiaire de Criegee, est proche de la partie ribose du cofacteur.

La STMO est capable de convertir son substrat, la progestérone, ainsi que la

phénylacétone alors que la PAMO, malgré un site actif très proche de la STMO, est

incapable de convertir la progestérone. La seule différence claire entre les deux enzymes

concerne la boucle 286-295 (numérotation de STMO). Cette boucle est localisée au-dessus

du site actif et est surement impliquée dans la liaison du substrat.

Pour mieux comprendre la spécificité de substrats, des mutants ont été construits.

Les mutations du site actif ont porté sur des résidus plus ou moins éloignés de la flavine et

supposés être impliqués dans la liaison avec le substrat. Etonnamment l’activité enzymatique

de ces mutants envers la progestérone et la phénylacétone s’est avérée peu sensible au

changement pourtant drastique d’acides aminés (P157Q, K295A, L500Y) qui a conduit à une

modification de la distribution des charges et de l’hydrophobicité des parois du site actif.

Parmi les six mutants générés de la STMO, un seul a une activité améliorée envers la

27

progestérone mais pas envers la phénylacétone, ce qui peut s’expliquer par la suppression

d’une charge positive du site de liaison à distance de la flavine. Les auteurs de cette étude

en concluent que la préférence pour un substrat donné est apparemment fonction

d’interactions non spécifiques (plutôt hydrophobes) que les groupes à la surface du site de

liaison établissent avec le substrat et non pas d’interactions avec quelques résidus

précisément définis.

D. 2-oxo-3-4,5,5-trimethylcyclopentenylacetyl-CoA monooxygénase (OTEMO)

La 2-oxo-3-4,5,5-trimethylcyclopentenylacetyl-CoA monooxygénase (OTEMO) est

la seconde BVMO impliquée dans la dégradation du camphre par Pseudomonas putida

NCIMB10007 62 (Schéma 8). Elle est aussi est la première enzyme dimérique à être

cristallisée 54.

Schéma 8 : Dégradation du camphre par Pseudomonas putida.

Le contact entre les deux monomères s’effectue par les hélices du domaine de liaison

au NADPH et par celle du domaine hélicoïdal. Le mécanisme enzymatique fait intervenir les

mêmes éléments clés que celui de PAMO : la flavine, le NADP+ et les résidus R337 et D59.

Cependant, parmi les formes cristallines obtenues, certaines se caractérisent par des

arrangements différents de plusieurs régions proches du site actif. Cette flexibilité

pourrait expliquer l’acceptation par cette enzyme de substrats plutôt volumineux comme

28

les esters CoA* aussi bien que de petite molécules comme des méthylcyclohexanones ou la

bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one 54,62.

Figure 9 : St u tu e istalli e di i ue d’OTEMO 54.

Conclusion

Les BVMOs procèdent selon un mécanisme original, complexe et fascinant qui

commence à être partiellement élucidé. Il est basé sur un triple rôle du NADPH qui agit

comme un réducteur de la flavine et comme un élément à part entière du site actif qui

intervient à la fois dans l’activation du dioxygène et l’oxygénation du substrat. Ce triple

rôle ne peut exister que grâce à des changements conformationnels du NADP+ (notion de

« NADPH glissant ») qui, de fait, conduisent aussi à une modification importante de la

géométrie du site actif. Malheureusement, les nombreuses études structurales et de

mutagenèse menées jusqu’à présent n'ont pas indiqué clairement la présence d'éléments

dans le site actif qui reconnaitraient les caractéristiques chimiques et structurales des

substrats et/ou de l’intermédiaire de Criegee et qui seraient responsables des différentes

sélectivités observées. L’élucidation de cette partie du mécanisme réactionnel représente

un défi important tant d’un point de vue théorique que pratique. En effet la prédiction et

le contrôle de la régio-, énantio- ou énantiotoposélectivité sont un point essentiel pour un

futur développement industriel de ces réactions.

* CoA ou coenzyme A est composée de différents éléments : un nucléotide, l'adénosine diphosphate (ADP), la vitamine B5 et la cystéine, légèrement modifiés et liés entre eux.

29

C. BVMO de type II

Les BVMOs de type II ont comme groupe prosthétique le FMN et sont NADH

dépendantes. Seul un petit nombre de ces enzymes a été identifiés jusqu’à présent et leurs

applications à des fins synthétiques restent très limitées. Cela provient probablement de

leurs caractéristiques structurales. En effet, ces enzymes sont composées de plusieurs

chaines polypeptidiques, elles-mêmes codées par plusieurs gènes, ce qui rend difficile leur

purification ainsi que leur expression dans des systèmes hôtes hétérologues. Néanmoins

des progrès importants ont été fait depuis 2011 par les équipes de Bornscheuer et de Lau

qui travaillent sur deux isoenzymes de Pseudomonas putida ATCC 17453* appelées 2,5-

diketocamphane 1,2-monooxygenase (2,5-DKCMO) et 3,6-diketocamphane 1,2-

monooxygenase (3,6-DKCMO) 63. Celles-ci catalysent l’oxydation du 2,5-dicétocamphane et

du 3,6-dicétocamphane† qui sont formés lors de la dégradation respectivement du (+) et (-

) camphre ‡ (Schéma 8).

Ces isoenzymes ne sont pas codées par des gènes chromosomiques mais par des gènes

qui se situent sur un plasmide de Pseudomonas appelé CAM. Elles opèrent comme un

assemblage faiblement associé de trois composantes : une composante oxygénase sous

forme d’un homodimère d’environ 40kDa, une flavine réductase monomérique FMN/NADH

dépendante et le FMN.

La sous-unité oxygénase de 2,5-DKCMO a été la première BVMO de type II à être

surexprimée de façon hétérologue en 2011 66 mais une étude récente révèle une complexité

inattendue : deux gènes différents codent pour deux isoenzymes de 2,5-DKCMO de

propriétés biocatalytiques quasi-identiques 67.

En ce qui concerne la composante oxygénase de 3,6-DKCMO, une structure

faiblement résolue avait déjà été publiée en 1998 et avait révélé une structure de type

TIM-barrel§ à cœur hydrophobe. 68. Cette sous-unité a été co-exprimée dans E. coli avec

ou sans 62 protéines chaperonnes, GroES and GroEL, dans le premier cas afin de limiter sa

* Autre nom de NCIMB 10007 † Ces deux composés sont des énantiomères et devraient avoir la même numérotation. ‡ Le mélange de ces deux isoenzymes a longtemps été connu et étudié sous le nom de MO1 64. § Un repliement comprenant huit hélices α et 8 brins parallèles nommée d’après la triosephosphate isomerase.

30

formation sous forme de corps d’inclusion et d’augmenter sa solubilité. Des

biotransformations ont pu être effectuées dans un premier temps en utilisant des extraits

cellulaires de cette souche recombinante afin de profiter d’une réductase endogène 66,62.

Très récemment, la co-expression de chacune des isoenzymes de DKCMOs avec soit

une flavine réductase de E. coli 69, soit la réductase PpCam Fred portée par le plasmide

CAM 67, a permis d’améliorer la bioconversion du camphre et du norcamphre. En revanche

la fusion des gènes de l’oxygénase et de la réductase de E. coli a conduit à une protéine

instable, qui révèle bien une activité réductase mais seulement une très faible activité

oxygénase 69.

A part ces trois isoenzymes, seules trois autres BVMOs de type II ont été

identifiées mais peu étudiées : deux luciférases FMN et NADH-dépendantes de

Photobacterium phosphoreum NCIMB 844 et de Vibrio fischeri ATCC 7744, capables de

transformer la 2-tridécanone et plusieurs cétones mono et bicycliques70, ainsi qu’une BVMO

de Rhodococcus erythropolis impliquée dans le métabolisme du limonène71.

Conclusion

Les caractéristiques structurales et génomiques des BVMOs de type I ont permis

des grandes avancées dans leurs études biochimiques et mécanistiques, contrairement aux

BVMOs de type II pour lesquelles les données sont toujours relativement rares. La

meilleure connaissance et la facilité d’expression de ces BVMOs ont eu des conséquences

importantes, elles ont permis une intensification des études concernant leurs applications

synthétiques ainsi que la modification ciblée de certaines enzymes afin d’en améliorer les

performances, comme nous le verrons ultérieurement.

31

III. Propriétés biocatalytiques des BVMOs

Les BVMOs présentent des propriétés biocatalytiques très larges, notamment du fait

de leurs spécificités de substrats souvent remarquablement étendues associées à leur

capacité de régio- et/ou d’énantiosélection. Plusieurs revues, très complètes, ont été

consacrées à cet aspect 20,21,22,22. Nous ne le détaillerons donc pas ici mais nous citerons

quelques exemples en rapport avec notre travail.

A. Spécificité de substrats

La liste des BVMOs testées pour leur activité biocatalytique a fortement augmenté

ces dernières années parallèlement à l’élargissement de la gamme de substrats oxydés.

Deux revues récentes sont une mine d’informations pour trouver les couples

enzyme/substrat donnant les meilleures sélectivités 21,22 Nous nous contenterons donc de

nous focaliser sur les composés les plus pertinents pour nos études ultérieures. Il est à

noter que, pour les raisons que nous avons vues précédemment, la plupart des BVMOs

étudiées du point de vue de leur capacité de biotransformation sont des BVMOs de type I.

Pour l’instant, malgré des avancées notables dans la compréhension des BVMOs de type II,

celles-ci sont peu étudiées du point de vue de la biocatalyse.

Certaines BVMOs agissent principalement sur les petites cétones cycliques (CHMO

et CPMO) 21,22 d’autres sont spécifiques des cétones cycliques plus grandes (CDMO et

CPDMO)72,73, d’autres encore acceptent facilement des cétones aromatiques (HAPMO,

PAMO)74,75 ou réagissent avec des stéroïdes (STMO)76. Il a été suggéré que chaque BVMO,

bien qu’acceptant une gamme large de substrats, souvent communs à plusieurs d’entre elles,

garde une préférence pour un type spécifique. Fraaije a ainsi représenté les spécificités

de substrats de quatre enzymes parmi les plus connues77 (Schéma 9). La CHMO et la CPMO

sont très actives avec des cétones cycliques (aliphatiques), alors que l’HAPMO et la PAMO

préfèrent des cétones aromatiques linéaires.

32

D’autres groupes ont cherché à mettre en évidence une relation entre profil de

substrat et données génomiques. Les séquences de dix-huit BVMOs ont été alignées et

leurs relations génomiques ont été analysées et illustrées sous forme d’arbre

phylogénétique par Mihovilovic78 (Figure 10). Une correspondance entre les enzymes

appartenant à une même branche et leur spécificité de substrat a été proposée. L’arbre

phylogénétique présente à gauche deux branches auxquelles appartiennent respectivement

CHMO et CPMO. Les enzymes de ces groupes convertissent effectivement de petites

cycloalcanones. Une autre branche correspond à des enzymes (CPDMO et CDMO)

convertissant des cycloalcanones volumineuses. D’autres branches encore sont spécifiques

de cétones linéaires aromatiques ou à longues chaines.

Schéma 9 : Profils de substrats de quelques BVMOs 79.

La restriction du champ de substrats de ces enzymes n’est pas encore comprise.

Ainsi, la séquence protéique de la PAMO est très similaire à celle de la εTMO, alors qu’elle

n’est pas active avec les stéroïdes. Comme nous venons de le voir dans le paragraphe sur

les études structurales, la comparaison des structures cristallines de ces enzymes et

33

l’étude par mutagenèse de la STMO n’ont pas fourni des indices clairs sur les résidus

responsables de la discrimination du substrat 55.

Figure 1078: Comparaison entre relations phylogénétiques de dix-huit BVMOs et leur profil de substrats.

B. Régio et/ou stéréopréférence

Alors que des BVMOs peuvent avoir une même spécificité de substrats, leur capacité

de régio et/ou d’énantiosélection est souvent significativement différente. Des homologues

de CHMO et CPMO, originaires de différentes bactéries, ont été explorés

biocatalytiquement après expression hétérologue de leurs gènes dans E. coli. Ces enzymes

pourtant proches transforment toutes une même gamme de substrats, mais avec des régio

et/ou des énantiosélectivités différentes. En d’autres termes, il est difficile de prévoir

avec certitude la régio- ou la stéréopréférence d’une enzyme que cela soit empirique (basé

sur la classification phylogénétique) ou rationnel (basé sur la connaissance du site actif).

34

Cependant, comme pour la spécificité de substrat, de grandes règles peuvent être

tracées. Un composé donné sera souvent transformé avec la même régio (ou stéréo)

préférence par les enzymes d’une même branche. En revanche, il est difficile de prédire la

regio- (ou stéréo-) préférence qui dominera dans une branche. Ainsi les groupes de

CHMOAcineto et CPMOComa sont réputés proposer des énantio- ou des énantiotoposélectivités

opposées, comme illustré Tableau 3 et, plus largement, dans les revues de Alphand21 et

Lau22. L’enzyme CHMOBrevi1, qui appartient à une autre branche, aura un comportement qui,

selon les cas, se rapprochera soit de celui de CHMOAcineto, soit de celui de CPMOComa.

Tableau 3 : St op f e e d’u e s ie de iot a sfo atio s de cétones prochirales.

[a] Cette la to e p ovie t du a a ge e t spo ta de la ε- ap ola to e issue de l’oxydation de BV

de la , ’-methyl-hydroxy cyclohexanone. na : non actif.

La régiopréférence des réactions de BV microbiologiques est un élément important

de l’intérêt qui leur est porté. A la différence des réactions de BV chimiques, qui sont elles-

mêmes généralement régiosélectives mais qui donnent majoritairement toujours le même

régioisomère (correspondant à la migration de l’atome de carbone le plus substitué), il est

possible de trouver des BVMOs donnant l’un ou l’autre des régioisomères. Une explication

plausible est le fait que le régioisomère « chimique », souvent appelé « normal », peut ne

pas être formé dans le site actif de l’enzyme. Plus précisément, l’intermédiaire de Criegee

ne peut pas adopter la conformation correspondante, même si elle est

thermodynamiquement favorisée, pour des raisons stériques ou électroniques. C’est donc

l’autre conformation possible qui sera adoptée et qui conduira à la lactone régioisomère,

appelée « anormale ».

35

L’oxydation de cétones bicycliques de structure [3.2.0] ou [4.2.0] en est l’exemple le

plus original 78,80,81. Certaines BVMOs sont capables de transformer ces cétones

racémiques en un mélange de lactones regioisomères, chacune de ces lactones étant quasi

énantiopure. En d’autres termes, chaque énantiomère des cétones réagit selon une

régiosélectivité opposée.

La première identification de ce type de réaction a eu lieu en 1989 et a concerné la

transformation de la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one racémique par des cellules entières

d’A. calcoaceticus 82. Depuis de nombreux autres exemples ont été décrits 21,22,36 y compris

lors de réactions de BV chimiques asymétriques 14. Cette réaction est donc devenue la

référence pour toute étude, chimique ou enzymatique, de la réaction de BV asymétrique.

Elle a été rationalisée sous le nom de Dédoublement Cinétique Parallèle Regiodivergent par

Gotor 83. De façon surprenante, si de nombreuses enzymes agissent comme CHMOAcineto,

d’autres forment l’une ou l’autre des lactones avec des ees variés. Etonnamment, la réaction

énantiocomplémentaire, qui donne les deux lactones regioisomères de configurations

opposées n’a jamais été décrite avec des BVMOs de type I. Ces configurations ont en

revanche été majoritaires mais avec des ees modérés chez les lactones formées lors de

biotransformations avec des extraits cellulaires de deux BVMOs de type II, les

diketocamphane monooxygenases 2,5-DKCMO et 3,6-DKCMO.

Conclusion

Ces observations montrent bien la nécessité d’avoir à disposition un grand nombre de

BVMOs, de manière à répondre à la demande en biocatalyseurs efficaces, énantio et/ou

régio complémentaires et à couvrir un large champ de substrats potentiels.

36

Biocatalyseur Rdt en

lactones (%)

Rapport

A:B

ee A %

(conf. abs.) ee B %

(conf. abs.)

Ref

CHMOAcineto 86 51:49 > 97 (1S, 5R) > 97 (1R, 5S) 82

CHMOBrevi 1 85 51:49 96 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 84

CHMORhodo 1 83 50:50 99 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 64

CHMORhodo 2 81 50:50 97 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 64

CHMOBrachy 73 50:50 94 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 64

CHMOArthro 86 53:47 88 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 64

HAPMO 56 32:68 75 (1S, 5R) 99 (1R, 5S) 85

OTEMO 100 72:28 35(1S, 5R) 95 (1R, 5S) 64

CPMOComa 61 97:3 trace 99 (1R, 5S) 86

CHMOBrevi 2 61 98:2 trace 99 (1R, 5S) 84

C. echinulata 30 1:99 trace > 98 (1R, 5S) 87

BVMOMO9 35 49:51 72 (1S, 5R) 99 (1S, 5R) 88

BVMOMO20 75 99:1 rac trace 88

BVMOMO14 36 99:1 86 (1S, 5R) trace 88

BVMOMO4 54 99:1 22 (1R, 5S) trace 88

2,5-DKCMO 100* 1 :1,3 100 (1R, 5S) 82 (1S, 5R) 64

3,6-DKCMO 30* 1:1,3 72 (1R, 5S) 10 (1S, 5R) 64

Tableau 4 : Régio et énantiopréférence d’u e série de biotransformations de la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-

one par diverses enzymes.

BVMOMO4, BVMOMO9, BVMOMO14 et BVMOMO20 sont des BVMOs issues de la bactérie Rhodococcus jostii. Les

autres enzymes ont déjà été évoquées dans le texte. * :taux de conversion

37

I. Recherche de nouvelles BVMOs

Initialement, la recherche de nouvelles BVMOS se faisait par criblage systématique

d’organismes entiers (champignons ou bactéries). Or, cette approche consistant à isoler un

microorganisme spécifique, purifier et séquencer l'enzyme, cloner le gène, est laborieuse.

Bien que de nombreuses BVMOs efficaces aient été obtenues par cette stratégie (comme

la CHMO), d’autres méthodes attrayantes ont été développées ; l’exploration des génomes

et l’amélioration des BVMOs connues par les approches d’ingénierie des protéines. Le

succès de ces méthodes est évidemment conditionné par l'efficacité des tests de criblage

pour de grandes librairies d’enzymes.

A. Tests de criblage

1) Détection de l’activité BVase

Plusieurs méthodes pour détecter des activités BVase ont été décrites. Nous pouvons

les classer en deux catégories : celles qui nécessitent un substrat spécifique et celles qui

sont universelles.

Trois méthodes se situent dans la première catégorie. Deux tests fluorogéniques 89,90

détectent des signaux émis par l’umbelliférone. Cette molécule est libérée par le substrat

après réaction avec l’enzyme et -oxydation chimique. Une méthode colorimétrique

dépendante, elle, de l’hydrolyse du produit, est aussi décrite. La 3-acetylindole est

transformé en acétate d’indoxyle, son hydrolyse chimique ou enzymatique donne l’indoxyle

qui réagit avec une molécule d’eau pour former le composé indigo coloré en bleu (Schéma

10). L’inconvénient majeur de ces méthodes réside dans le fait que la molécule utilisée dans

le test peut ne pas être substrat de l’enzyme considéré ce qui conduit à de faux résultats

négatifs.

Parmi les méthodes plus universelles, la plus couramment utilisée et la plus simple est

celle quantifiant la consommation du NADPH par spectroscopie UV. Elle est cependant à

employer avec précaution. Utilisée avec des extraits cellulaires, elle peut facilement être

biaisée par la présence d’autres enzymes NADPH dépendantes. Autre inconvénient, elle

n’est pas applicable aux cellules entières.

38

Une méthode colorimétrique a été mise au point par Littlechild 91 reposant sur une

variation du pH. Le produit doit cependant être hydrolysé soit spontanément soit

enzymatiquement, la formation d’un acide étant alors visualisé par des indicateurs de pH.

Schéma 10 : P i ipe de deu tests de i lage d’a tivit BVase

Plus récemment, Fraaije a décrit une élégante méthode chromogénique applicable aux

cellules entières de E. coli recombinantes 92. Un système d’expression de la BVMO,

spécifique, adressant celle-ci dans le périplasme doit être utilisé. La transformation

catalytique s’effectue ainsi dans le périplasme au lieu du cytoplasme ce qui facilite l’accès

du substrat à l’enzyme et l’échange du NAD(P)H/NAD(P)+ avec le milieu extérieur. De cette

manière, le recyclage du NADPH peut être assuré par une phosphite déshydrogénase

(PTDH) ajoutée avant le test qui transforme le phosphite présent dans le milieu en

phosphate. C’est lui qui sera dosé par formation avec du molybdate d’un complexe

chromogénique de couleur bleue (Figure 11). Cette méthode présente donc l’avantage de

cribler une activité BVase sur n’importe quel substrat à condition que le système

d’expression de l’enzyme soit adéquat.

39

Figure 11 92 : Schéma de principe de la méthode de criblage par suivi de la formation de phosphate.

La Phénylacétone Monooxygénase (PAMO) est transloquée au périplasme par le transporteur Tat. Elle

atal se l’o datio du su st at avec consommation de NADPH. Le NADPH et NADP+ peuvent diffuser

facilement entre les deux milieux intra et extra-périplasmiques. La Phosphite Déshydrogénase (PTDH) ajoutée

au milieu réactionnel réduit le NADP+ en NADPH en oxydant le phosphite en phosphate. Ce dernier est mésuré

par réaction avec le molybdate (formation d’u p oduit de ouleu leue .

2) Détection de la sélectivité des BVMOs

Il n’existe malheureusement pas de méthodes à haut débit permettant d’évaluer la

régio ou l’énantiosélectivité de ces réactions enzymatiques. Les tests les plus rapides sont

des analyses directes du milieu de biotransformation par HPLC et CPG couplées ou non avec

la spectroscopie de masse. L’automatisation du procédé (culture, biotransformation et

analyse) a cependant permis à l’équipe de δeetz de suffisamment augmenter la capacité

d’analyse d’un test par CPG sur colonne chirale pour cribler une banque de mutants de 104

clones 93.

Conclusion

Trouver une méthode d’analyse universelle qui soit adaptable au criblage à haut débit

est donc toujours d’actualité. Une telle méthode est particulièrement nécessaire pour le

criblage des librairies de gènes engendrés lors d’expériences d’évolution dirigée dont

l’ordre de grandeur est souvent de 106 à 107 clones.

40

B. Exploration des génomes

L'identification de la signature FxGxxxHxxxW(P/D) des BVMOs a offert une

nouvelle manière, efficace, pour rechercher ces enzymes dans le millier de génomes

microbiens complètement séquencés et publiés aujourd’hui. Une simple recherche de

séquences protéiques qui possèdent la séquence motif BVMO et qui partagent une similarité

significative avec des BVMOs connues, permet de les distinguer des autres flavoenzymes.

A titre d’illustration, une recherche de la première signature des BVMOs, effectuée

en 2006 79, a donné 219 gènes putatifs de BVMOs trouvés dans les 348 génomes microbiens

disponibles à l’époque (Tableau 5). La distribution de ces enzymes s’est avérée remarquable;

tous ces gènes ont été identifiés chez des bactéries et des champignons, alors qu'aucun

n'a été trouvé chez les archaebactèries, les plantes, les animaux ou dans le génome humain.

Parmi les bactéries, les BVMOs sont largement répandues chez les actinomycètes, ce qui

pourrait être un argument en faveur de leur rôle dans la synthèse de métabolites

secondaires.

Tableau 5 79 : Répartition des BVMOs (2006).

L’efficacité de cette approche a été mise en valeur dans trois exemples choisis

décrits ci-dessous.

Un des plus importants concerne la découverte de la PAMO thermostable qui est la

première BVMO à avoir été cristallisée. Son gène a été identifié en recherchant le premier

41

motif consensus dans le génome de l’actinomycète mésothermophile Thermobifida fusca

qui se développe à 55-60°C . Cette recherche s’appuie sur l’hypothèse suivante : les enzymes

d’un microorganisme thermophile sont plus stables que ceux d’un microorganisme mésophile.

La caractéristique principale de cette enzyme est sa stabilité à des températures élevées

et en présence de certains solvants, ce qui a probablement facilité sa cristallisation. Outre

le fait que la résolution de sa structure 3D ait fait considérablement avancer la

connaissance des BVMOs, cette enzyme a également montré sa capacité de régio et

d’énantiosélection sur des composés aromatiques 75,94. Sa résistance aux solvants a aussi

permis de montrer que leur utilisation peut jouer sur le caractère énantiosélectif de

l’enzyme 95.

L’utilisation d’une nouvelle technique de clonage, la « ligation independant cloning » ou

LIC a permis une intensification de l’exploration des génomes. Ainsi les équipes de Grogan

et de Fraaije ont décrit le clonage de vingt-neuf BVMOs putatives dans les seules souches

de Mycobacterium tuberculosis 96 et Rhodococcus jostii 88,49. Un des six gènes trouvé chez

M. tuberculosis correspond à l’éthionamide monooxygenase (EtaA), qui est impliquée dans

l'activation de médicaments antituberculeux d’usage courant97. Son activité BVase a été

vérifiée sur quelques cétones 98,99. Chez R. jostii RHA1, vingt-trois gènes ont été clonés et

vingt-deux enzymes ont été exprimées via un système d’expression optimisé 49.

Le criblage d’activité a été réalisé avec des extraits cellulaires, en utilisant la détection

chromogénique avec le molybdate, que nous venons de décrire. Trente-neuf substrats de

nature diverse ont été testés, allant des cétones linéaires, cycliques, aromatiques à des

amines et des sulfures aromatiques. Le profilage des substrats acceptés par quatorze de

ces enzymes a été ainsi déterminé, cinq d’entre elles ayant été actives sur plus de dix

composés. En revanche, les autres se sont montrées inactives, probablement parce que

leurs substrats naturels sont très différents des composés testés.

C- Ingénierie des protéines

Deux approches d’ingénierie de protéines ont été utilisées pour améliorer les

propriétés catalytiques spécifiques des BVMOs; l’évolution dirigée et les mutations

rationnelles. En absence des données structurales, l’évolution dirigée, qui repose sur des

42

méthodes de mutagénèse aléatoire, s’est imposée dans un premier temps. Des mutations

rationnelles plus ciblées ont été possibles ultérieurement, grâce à l’examen de structures

3D de BVMOs.

1) Evolution dirigée :

L’approche par évolution dirigée a été appliquée par le groupe de Reetz sur la CHMO

d’A. calcoaceticus 93. 10000 mutants ont été criblés par analyses de CPG chirale afin

d’améliorer l’énantiosélectivité de la CHMO envers la 4-hydroxycyclohexanone. En effet,

la CHMO affiche des énantiotoposélectivités élevées sur une série de cyclohexanones

prochirales substituées en position 4 (méthyl, éthyl, isopropyl, allyl, méthoxy) avec une

préférence pour la configuration absolue S. En revanche la 4-hydroxycyclohexanone

conduit à une lactone de configuration opposée R avec une énantiotoposélectivité faible

(ee=9%). Bien qu’une librairie relativement petite de mutants ait été analysée en raison de

la limitation du criblage (800 mutants/jour), des résultats impressionnants ont été obtenus.

Des mutants ont montré une préférence améliorée pour la configuration (R) de la 4-

hydroxycyclohexanone, et d’autres une préférence opposée. Parmi ces derniers, le mutant

Phe432εer, porteur d’une seule mutation, a attiré beaucoup d’attention, la lactone de

configuration ε ayant été obtenue avec 80% d’ee. Testé sur la série de cyclohexanones

substituées en position 4 précédente, il convertit ces substrats avec des

énantiotoposélectivités similaires et même améliorées par rapport à la CHMO. Son

évaluation sur une série de cétones cycliques et bicycliques 100 (Tableau 6) a confirmé une

activité et une sélectivité (régio-, énantio- ou énantiotopo-) souvent supérieures à la CHMO

d’origine. Il est intéressant de noter que la cétone tricyclique (entrée 7) non acceptée avec

la CHMO, est transformée par ce mutant avec une énantiosélectivité élevée.

43

Tableau 6 : Profil de substrats du mutant Phe432Ser de CHMOAcineto.

2) Mutagénèse dirigée :

La PAMO, avec la découverte de sa structure tridimensionnelle, a servi de cible à

plusieurs expériences de mutagénèse dirigée. Malgré ses caractéristiques très

particulières (thermostablilité, tolérance envers les solvants organiques), elle est peu

appropriée aux procédés biocatalytiques car ses substrats se limitent à des cétones et à

des sulfures linéaires aromatiques, avec une énantiosélectivité souvent faible.

Une première tentative a été faite pour améliorer rationnellement cette enzyme par

comparaison avec la CHMOAcineto, afin d’élargir ses substrats de base et augmenter sa

capacité d’énantiosélection, tout en gardant ses propriétés uniques d’enzyme robuste.

L’examen de la structure de la PAMO avec un modèle structural homologue de la CHMO,

ont montré une différence apparente dans une boucle de trois acides aminés (Ser441,

44

Ala442, Leu-443), située à côté du site actif de la PAMO, et qui est absente chez la CHMO 101. Trois mutants engendrés par délétion d’un ou deux de ces acides aminés, ont montré

une augmentation significative de l’activité et de l’énantiosélectivité avec la 2-

phénylcyclohexanone et la 2-benzylcyclohexanone, par rapport à celle observée avec la

PAMO sauvage tout en conservant ses propriétés de thermostabilité. Le mutant ayant subi

la délétion des acides aminés Ser441 et de Ala442 a donné de meilleurs résultats (Tableau

7). Ainsi, une simple délétion dans la boucle a rendu la PAMO plus catalytiquement efficace

sans diversifier ses substrats de base.

Tableau 7 : Comparaison de la réactivité de PAMO et de son mutant obtenu par délétion de Ser441 et

d’Ala .

Une autre tentative pour améliorer sa spécificité de substrats a été réalisée en

utilisant un modèle homologue de la CPMO. PAMO et CPMO présentent 41% d’identité de

séquence, mais une spécificité de substrats différente. La comparaison des résidus

d’acides aminés entre la structure de la PAMO et le modèle de la CPMO, a révélé une

différence fondamentale sur trois acides aminés 38. Le remplacement de la méthionine en

position 446 chez la PAMO par la glycine, l’acide aminé correspondant chez la CPMO, a

engendré le mutant M446G. Contrairement à l’enzyme sauvage, celui-ci est actif avec un

grand nombre de cétones, sulfures et amines aromatiques. L’énantiosélectivité a été

également améliorée avec certains sulfures phényliques.

45

Conclusion

Une stratégie évidente pour engendrer de nouvelles BVMOs est l’exploration des

génomes. Plusieurs exemples ont été décrits, donnant de nouvelles enzymes avec des

propriétés catalytiques intéressantes. Ils soulignent également les inconvénients de cette

approche ; par exemple, il est impossible de prédire si un gène pourra facilement être

exprimé dans un hôte ou si l’enzyme correspondante présentera une activité spécifique.

Néanmoins, compte tenu de l’accumulation phénoménale des données génomiques, cette

approche ne pourra que se développer et s’affiner au fur et à mesure des études qui se

succèderont.

D’autre part, les techniques de biologie moléculaire et d’ingénierie des protéines ont

rendu possible le « redesign » de BVMOs aux propriétés catalytiques améliorées.

L’approche rationnelle devrait donc s’intensifier en fonction de la mise à disposition de

structures tridimensionnelles et de l’identification de résidus cruciaux pour la sélectivité.

IV. Applications synthétiques des BVMOs

La capacité catalytique démontrée des BVMOS en terme de régio et/ou

énantiosélectivité et le fait que le nombre de BVMOs recombinantes augmente rapidement

rendent leurs applications synthétiques particulièrement prometteuses. Une large variété

de lactones énantiopures, toujours croissante, peut maintenant être obtenue par

transformation biologique. De nombreuses lactones ont été utilisées comme intermédiaires

principaux dans la synthèse d’importants composés bioactifs et sont donc demandées pour

la chimie fine. 20,22,102. Nous présenterons ici quelques exemples représentatifs de ces

transformations en nous focalisant plus particulièrement sur ceux en lien avec le travail

expérimental que nous avons effectué.

A. Les lactones bicycliques

Comme nous l’avons vu précédemment, la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one racémique a

été transformée par des cellules entières d’A. calcoaceticus NCIMB 9871 et a donné deux

lactones régioisomères en proportions équivalentes quasi énantiopures. Ces lactones, qui

46

portent deux stéréocentres et deux groupes fonctionnels, sont d’excellents intermédiaires

pour la synthèse asymétrique. Par exemple la (1S, 5R)-2-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-3-one

est un élément clé de la synthèse des prostaglandines alors que la (1R, 5S)-3-oxa-

bicyclo[3.3.0]oct-6-en-2-one conduit à la sarkomycine A 103 et à des phéromones d’algues

brunes 87,104. Des analogues oxygénés ont été employés pour la synthèse d’autres composés

d’intérêt, des dérivés de clérodane 105 et de prostanoïde 99 (Tableau 8).

Tableau 8

B. Les ƴ-butyrolactones

Les ƴ-butyrolactones chirales -substituées sont trouvées dans une variété de

produits naturels. Elles servent aussi d’intermédiaires pour la synthèse de substances

biologiquement actives comme les lignanes qui sont connues pour leurs activités anti-

leucémiques et anti-cancéreuses 106. Ces lactones ont été obtenues par désymétrisation

(réaction énantiotoposélective) de cyclobutanones prochirales -substituées. Ces cétones,

particulièrement réactives du fait de leur cycle à quatre membres, sont substrats de

nombreuses BVMOs ainsi que l’on montré plusieurs études 65,107 (Schéma 11). Ainsi, un

criblage d’une dizaine de ces substrats a été réalisé avec huit BVMOs recombinantes

d’origine bactérienne différente 108. La diversité naturelle de ces enzymes a permis de

créer une plateforme de butyrolactones chirales qui sont, pour certaines,

énantiocomplémentaires et d’excellente pureté optique.

47

Schéma 11 : Rep se tatio g ale de l’o datio de BV i o iologi ue de lo uta o es p o hi ales β-substituées.

Leurs applications se retrouvent dans la synthèse de composés à activité

antitumorale, antivirales, antifongiques, comme le (R)-Baclofen, un agoniste du récepteur

GABAB 109, la -proline 110, des lignanes (l’hinokinine et l’enterolactone) 111, la schizandrine

108 et bien d’autres (Tableau 9).

.

Tableau 9

48

C. Les -valérolactones et -caprolactones

Les -valérolactones et les -caprolactones, en particulier celles substituées par des

chaînes latérales fonctionnalisées, sont également des synthons importants pour la

synthèse.

Certaines d’entre elles sont dotées d'odeurs attractives utilisées dans les parfums

et les fragrances et donc recherchées par les industriels de la cosmétique, des parfums ou

des arômes. Les molécules principales de l’arôme de jasmin112 et de l’arôme d’une orchidée

africaine113 ont ainsi été synthétisées à partir des cyclopentanones correspondantes. La 2-

undecylcyclopentanone a été utilisée pour la synthèse d’une phéromone de la guêpe Vespa

orientalis114. Une synthèse élégante a été reportée du (+)-acide lipoïque115, une molécule

utilisée dans le traitement de certains types de cirrhoses et d’intoxications116.

Tableau 10

49

Conclusion

Malgré l’intérêt synthétique de ces enzymes, il n’existe que peu de brevets impliquant

une BVMO 117–122, ce qui souligne la nécessité de développer des procédés efficaces et

faciles d’utilisation afin de répondre aux difficultés pratiques soulevées par l’emploi des de

cette famille d’enzymes.

V. Développement de procédés biocatalytiques

Des procédés biocatalytiques simples ont été décrits pour l’oxydation de BV, ils

nécessitent un équipement standard disponible dans un laboratoire de chimie. Pourtant, le

passage d’une petite à une grande échelle ne va pas de soi.

Les biotransformations avec les BVMOs peuvent être effectuées soit avec des

enzymes purifiées, soit avec des cellules entières mais leur application à grande échelle a

rencontré deux difficultés majeures : l’instabilité du biocatalyseur et l'inhibition de

l’activité enzymatique par des concentrations élevées du substrat et/ou du produit. Nous

montrerons les stratégies développées pour contourner ces limitations ainsi que la manière

dont ces procédés expérimentaux ont évolué.

A. Microorganisme versus enzyme

L’examen de la stabilité d’un biocatalyseur, qu’il soit sous forme d’enzyme isolée ou

de cellules entières, est essentiel pour une biotransformation à l’échelle préparative. Il

s’agit dans le cas d’une enzyme isolée d’assurer les éléments nécessaires pour son activité

catalytique et de rechercher ses conditions de fonctionnement optimales. Dans le cas de

cellules entières, l’enjeu est de maintenir un métabolisme cellulaire permettant aux

enzymes produites d’effectuer la catalyse. La possibilité de réutiliser le biocatalyseur est

également préférable pour des applications à grande échelle.

50

1) Cellules entières

Les modalités d’utilisation de cellules entières dépendent évidemment du type de

microorganisme considéré. Elles seront différentes selon qu’il s’agisse d’une bactérie ou

d’un champignon, d’un microorganisme sauvage ou recombinant.

Les premières réactions de BV microbiologiques étaient essentiellement basées sur

des bactéries sauvages mais elles ont été largement supplantées par des bactéries

recombinantes, meilleures productrices d’enzyme et de maniement plus facile. De plus, la

plupart des BVMOs bactériennes étaient inductibles ce qui nécessitait de connaitre

l’inducteur. Certaines bactéries, comme Acinetobacter calcoaceticus, étaient considérées

comme des pathogènes de type II.

Les BVMOs fongiques étant souvent constitutives, les réactions de BV avec les

microorganismes sauvages présentent l’avantage de ne pas nécessiter d’inducteur 123.

Cependant cet avantage est compensé par la présence fréquente de plusieurs enzymes de

profil de substrats et de sélectivité différente ce qui limite leurs applications. D’autre

part, elles sont moins faciles à exprimer dans E. coli que les BVMOs bactériennes. Les

premiers exemples de BVMOs fongiques recombinantes sont récents : l’une provient de

Cylindrocarpon radicicola 124, l’autre d’Aspergillus fumigatus 125,124.

Les premiers clonages de BVMOs, réalisés dans Saccharomyces ont été abandonnés

car cette bactérie possède des réductases efficaces sur les cétones. Les BVMOs sont

maintenant essentiellement exprimées dans E. coli bien que quelques publications soulignent

l’avantage que peuvent présenter d’autres microorganismes hôtes.

Les cellules d’E. coli recombinantes peuvent être utilisées comme catalyseur de

réaction de BV. La croissance et l’induction de l’enzyme s’effectuent généralement en

l’absence du composé à transformer 126, c’est à-dire en conditions non proliférantes afin de

limiter les phénomènes de toxicité. Le composé peut être ajouté directement dans le milieu

de culture contenant les cellules arrivées en phase exponentielle ou après centrifugation

dans un milieu minéral minimal (« resting cells » ou « cellules au repos »). Sur ce point, les

conclusions de diverses publications sont assez contradictoires. Il semble que l’emploi d’un

milieu manquant d'azote inhibe la réplication cellulaire mais permette au mécanisme

biologique de régénérer le NADPH, à condition de maintenir un apport en carbone, par

exemple le glucose 127,128. D’autres exemples décrivent des biotransformations améliorées

51

par l’ajout de glycérol au milieu de culture 129. Dans tous les cas il est préférable de

maintenir un métabolisme cellulaire assurant le recyclage du NADPH par la machinerie

interne de la bactérie hôte.

2) Enzyme purifiées

L’utilisation de BVMOs sous forme d’enzymes isolées doit impérativement être

associée au recyclage de leur cofacteur. En effet, les protons doivent être apportés à la

flavine en quantité stœchiométrique qu’ils proviennent du NADPH ou du NADH, ce qui

représenterait un coût trop élevé, rédhibitoire pour des utilisations à grande échelle.

La stratégie généralement utilisée est la régénération enzymatique du cofacteur ;

une seconde enzyme est ajoutée à la BVMO pour la réduction du NADP+ oxydé en NADPH.

Les plus couramment utilisés dans les oxydations avec des BVMOs sont les systèmes

glucose-6-phosphate/ glucose-6-phosphate déshydrogénase130, formate/ formate

déshydrogénase131, 2-propanol/ alcool déshydrogénase de Thermoanaerobium brockii 132 et

le phosphite/ phosphite déshydrogénase de Pseudomonas stutzeri 133,134 (Schéma 12). Les

avantages et les limitations de ces systèmes ont été largement discutés dans plusieurs

revues 135,136,137. Le développement de stratégies de recyclage plus élégantes, plus

efficaces, moins coûteuses et faciles à utiliser est donc toujours un enjeu de taille.

Schéma 12 : Systèmes enzymatiques du recyclage de NADPH

52

Récemment, une réaction de BV enzymatique a été réalisée avec succès dans un

système de nanoréacteurs régénérant le cofacteur NADPH 138. Ce système est composé de

vésicules (polymersomes) ressemblant à des liposomes, qui sont à base de copolymères

amphiphiles poreux (polystyrene-b-poly(3-(isocyano-L-alanyl-amino-ethyl)-thiophene))

contenant la BVMO et l’enzyme régénérant le cofacteur. L’avantage de ces polymersomes

est qu’ils sont perméables aux de petites molécules (le cofacteur) mais pas aux biomolécules

complexes comme les enzymes, ce qui permet de protéger l’activité de l’enzyme encapsulée.

Le procédé est appliqué à la réaction BV de la phénylacétone par la PAMO. La Glucose-6-

phosphate déshydrogénase (G6PDH) est encapsulée dans la cavité du vésicule alors que la

PAMO est ajoutée à la dispersion de polymersomes. L’activité est réduite lorsque la PAMO

est immobilisée sur les vésicules chargées en G6PDH (Figure 12).

Figure 12 : Régénération du cofacteur NADP+ par la G6PDH encapsulée dans un polymersome.

Deux systèmes sont représentés : la PAMO en solution (à gauche) et immobilisée à la surface du

polymersome (à droite).

BVMO autosuffisante

Une évolution remarquable a été proposée par Fraaije avec la construction de BVMOs

auto-suffisantes 139. Il s’agissait de créer une protéine chimérique liant de façon covalente

une phosphite déshydrogénase (PTDH) et une BVMO et qui soit capable à la fois de

catalyser une réaction de BV et de réduire le cofacteur. Ce type de protéine bi-

fonctionnelle a été construit en assemblant deux gènes, qui codent à l’origine pour des

protéines distinctes (Figure 13).

53

L’activité catalytique et la sélectivité de trois protéines fusionnées CHMO/PTDH,

PAMO/PTDH et CPMO/PTDH se sont révélées identiques à celles des enzymes d’origine.

De plus, la conversion de 4-méthylcyclohexanone a été réussie à l’échelle préparative avec

un extrait enzymatique d’E. coli produisant la CHMO/PTDH sans addition de NADP+,

indiquant que le taux de nicotinamide libéré lors de la casse cellulaire est suffisant pour la

catalyse, et que le système de régénération fonctionne efficacement.

Figure 13 : Régénération du cofacteur par une enzyme fusionnée.

Une seconde génération de BVMOs fusionnées140,141, liant un mutant de PTDH

thermostable142,143 a été créée. L’oxydation de 4-méthylcyclohexanone par

CHMO/PTDHsauvage s’est arrêtée après 40% de conversion et 6h de réaction alors que la

CHMO/PTDHmutant n’a pas été inactivée et a conduit à 80% de conversion après 24h.

3) Immobilisation

La réutilisation et la régénération de l’activité d’un biocatalyseur, qu’il soit sous forme

d’enzyme isolée ou de cellules entières, est fortement recherchée à l’échelle industrielle

pour des raisons économiques.

Immobilisation d’enzymes

La stabilité de CHMOAcineto a grandement été augmentée par sa co-immobilisation sur

Eupergit C avec l’alcool déshydrogénase ADHTB. Elle est ainsi passée d’un temps de demi-

vie de 1 à 2,5 jours 144. Ce système d’enzymes co-immobilisés a été réutilisé dans 16 cycles

de conversions complètes avec 5 g/L de thioanisole pour chaque cycle.

Très récemment, la PAMO a été co-immobilisée avec la G6PDH sur des amino

polyphosphazenes 145. Les deux enzymes sont attachés par des liaisons covalentes sur une

même chaine de ces polymères (Figure 14). La PAMO immobilisée a montré une

54

stéréosélectivité similaire à celle de la PAMO purifiée, dans la conversion d’une série de

cétones linéaires racémiques et de sulfures prochirales. La réutilisation du système devrait

cependant être améliorée.

Figure 14 : Co-immobilisation de la PAMO avec la G6PDH sur des polyphosphazenes.

Immobilisation de cellules entières

Une immobilisation de cellules entières a été récemment reportée 146. L’encapsulation

des E. coli produisant la CPMO dans un complexe polyélectrolyte PEC a amélioré la

conservation de la stabilité des cellules. Celles-ci préservent leur activité initiale après 4

jours de stockage à 4°C, alors que celle des cellules libres baisse jusqu’à 56%. L’oxydation

de BV d’une cétone bicyclique racémique ayant été étudiée avec des cellules libres et

cellules encapsulées, a donné des résultats similaires en rendement, ee du produit et temps

de réaction. Cependant, la réutilisation du biocatalyseur n’a pas été décrite.

B. Phénomènes d’inhibition

Pour augmenter la productivité d’une biotransformation avec les BVMOs, il faut avant

tout limiter les phénomènes d’inhibition par le substrat et/ou le produit. Des

concentrations élevées de ces composés inhibent l’activité enzymatique (cas des enzymes

isolées) ou induisent un effet de toxicité (cas des cellules entières). Des stratégies ont

été développées pour contourner cette limitation.

1) Ajout progressif du substrat

Une première stratégie consiste à ajouter progressivement la cétone en continue

dans le milieu, en maintenant sa concentration inférieure à son niveau inhibiteur.

55

Lors de l’oxydation de la bicyclohepténone racémique avec des cellules entières d’E.

coli TOP10 CHMOAcineto, une inhibition de la réaction est observée à partir de 0,4 g/L de

substrat et de 5 g/L de produits. L’ajout continu de substrat appliqué à l’échelle de 55L, a

permis d’augmenter la concentration en lactones jusqu’à un maximum de 3,5 g/L limité du

fait de l’inhibition par le produit 147. Des améliorations ont été apportées au procédé à

l’échelle de 200 L, concernant la mode d’ajout du substrat et le traitement des cellules

avant la bioconversion, qui ont conduit à une production en lactones de 4,5 g/L 148.

Cette stratégie n’est cependant pas toujours facile à mettre en œuvre car elle

nécessite une bonne connaissance, si possible en temps réel, de la consommation du

substrat, celle-ci variant souvent au cours de la biotransformation*.

2) Utilisation de résines

Un procédé élégant pour contrôler l’inhibition par le substrat et le produit, nommé

« in situ SFPR »† a été appliqué à la même biotransformation 149,149a. Ce procédé a permis

de surmonter à la fois les problèmes posés par l’inhibition par le substrat et le produit mais

aussi par la solubilité de ces composés en milieu aqueux. L’idée fondamentale était d'utiliser

une résine capable de désorber le substrat et d’adsorber le produit in situ de manière à en

maintenir les concentrations inférieures aux valeurs inhibitrices (Figure 15). Le substrat

est tout d’abord adsorbé sur la résine et introduit dans le milieu de culture. Il est ensuite

désorbé de la résine et transformé en produit qui est réadsorbé sur la résine solide selon

un équilibre d’adsorption/désorption contrôlable par la quantité de résine employée.

* Le développement de senseurs in situ capables de doser « en direct » un composé donné serait donc un avantage important pour la généralisation de son application † Pour « Substrate Feeding and Product Removal » par analogie avec le procédé ISPR (in Situ Product Removal) où une résine est utilisée en fin de réaction pour la récupération du produit formé.

56

Figure 15149a : Principe du procédé « in situ SFPR »

Cette stratégie a été optimisée pour plusieurs paramètres : type du réacteur, nature

et quantité de résine, pH, aération. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant la

résine macroporeuse (Optipore L-493) dans un réacteur à lit fluidisé, très bien aéré grâce

à un fritté microporeux150. 25 g de la bicyclohepténone ont été transformés dans un

bioréacteur de 1L avec une productivité de 1,2 g/L/h. Les 2 lactones régioisomères ont été

obtenues avec d’excellents ees supérieurs à 98% et un rendement élevé de 84% (24,3 g).

La possibilité d’exploitation industrielle des BVMOs a été démontrée par la mise au point

d’un scale up de cette biotransformation à l’échelle du kilogramme. Le remplacement du

sparger d’un bioréacteur de 75L (fritté métallique à la place du fritté standard) et

l’utilisation de la technique de chromatographie préparative εMB (εimulated Moving Bed)

pour purifier les deux lactones produites ont permis la réussite de ce procédé 151,152.

Ce procédé a été étendu à plusieurs autres applications. Ainsi, l’oxydation de la 4-

methylcyclohexanone et deux autres cétones a été effectuée à l’échelle de 15 g/L en

utilisant la résine Lewatit VPOC 1163 avec des cellules au repos d’E. coli produisant la

CPMOComa153. Il a aussi permis d’augmenter la concentration utilisable de la 3-phényl-2-

butanone de 1,4 mM à 26 mM (4 g/L) lors de la résolution cinétique avec des extraits

cellulaires de l’HAPMO de P. putida JD1 154. En revanche, le procédé n’a pu être utilisé avec

la CHMOAcineto purifiée. Trois résines adsorbantes ont été testées lors de l’oxydation du

1,3-dithiane mais l'enzyme s’est adsorbé sur la résine ce qui a diminué considérablement

son activité catalytique 155.

3) Utilisation de solvant organique :

Une autre stratégie possible consiste en l’utilisation d’un système biphasique

liquide/liquide formé du milieu aqueux et d’un solvant non miscible à l’eau. Comme la résine

dans l’exemple précédent, la phase organique sert de réservoir pour le substrat et

d’extracteur du produit formé dans la phase aqueuse.

L’oxydation de la bicyclohepténone avec des cellules entières d’un mutant de la PAMO

est totalement inhibée à partir de 1 g/L 156. Cette concentration a pu être augmentée

jusqu’à 3 g/L en utilisant l’octylphtalate comme solvant en proportion 1:1 tandis que une

57

concentration de 5 g/L a été atteinte avec des enzymes isolées, en utilisant un mélange 1 :1

de cyclohexane et d’un tampon contenant 0,1% v/v de Tween 20.

La première bioproduction de la lactone de l’acide laurylique a été obtenue avec des

cellules entières d’E. coli produisant la CPDMO, dans un système biphasique en semi-continu 157. De 10 à 16 g de lactones ont été produites dans un bioréacteur de 3L avec une grande

productivité, en comparaison avec 2,4 g formées en mode ‘’batch’’.

Conclusion

Des avancées notables ont été apportées aux stratégies de recyclage du cofacteur

NADPH comme à celles d’utilisation de cellules entières. Elles devraient permettre

maintenant le développement de nouvelles applications à grande échelle même si les

procédés utilisant des BVMOs doivent encore être améliorés.

58

Conclusion du chapitre

Les BVMOs sont maintenant reconnues comme des biocatalyseurs efficaces non

seulement pour les oxydations de BV asymétriques mais aussi pour de nombreuses

sulfoxydations que nous n’avons pas traitées dans ce manuscrit. Ainsi, elles ont permis

l’accès à de synthons chiraux difficiles à préparer chimiquement et qui ont été utilisés pour

la synthèse de produits naturels.

Des stratégies élégantes ont été appliquées avec succès au recyclage du cofacteur

NADPH et aux problèmes d’inhibition. Malgré ces évolutions, un vrai développement à

l’échelle industrielle est toujours attendu qui viendra peut-être grâce aux progrès

combinés de l’Ingénierie des protéines, de l’Ingénierie du métabolisme et du Génie des

procédés.

Un autre type d’amélioration doit aussi être mis en œuvre, l’amélioration des

rendements et de la productivité. Parmi les différentes approches possibles, une méthode

parait tout à fait adaptée, le Dédoublement Cinétique Dynamique, que nous allons évoquer

maintenant.

59

CHAPITRE II :

Dédoublements Cinétiques Dynamiques

L'importance de la chiralité est largement reconnue de nos jours et en particulier

dans les processus biologiques. Les propriétés pharmacologiques de nombreux produits,

naturels ou non, s’appuient sur leur reconnaissance par des récepteurs chiraux qui

interagissent uniquement avec leurs ligands de configuration absolue spécifique. De ce fait,

l'utilisation de principes actifs sous forme optiquement pure est devenue une exigence dans

la fabrication de médicaments. Ceci a joué un rôle particulièrement important dans la

production de molécules énantiomériquement pures pour l’industrie pharmaceutique, mais

également dans les secteurs de l’agroalimentaire, des fragrances et des parfums.

La recherche de nouvelles méthodes efficaces pour la synthèse de composés

optiquement purs est devenue un objectif clé pour les chimistes organiciens, notamment en

milieu industriel. Parmi toutes les approches développées, le dédoublement cinétique

dynamique (DCD) s’est révélé être une approche particulièrement séduisante. Elle permet

d’obtenir théoriquement en partant d’un mélange racémique, un produit à 100% d’excès

énantiomérique et 100% de rendement. Nous intéresserons ici aux DCD impliquant des

enzymes et nous décrirons les récents développements de DCD appliqués aux BVMOs.

I. Dédoublement cinétique

A. Généralités

Plusieurs stratégies sont classiquement utilisées pour l’obtention de molécules

énantiomériquement pures, telles que la synthèse asymétrique et le dédoublement cinétique

(CD) de racémates.

La désymétrisation de composés méso- et prochiraux consiste à éliminer un ou

plusieurs éléments de symétrie d’un substrat prochiral ou méso pour établir la chiralité158

(Figure 16). Ces réactions, énantio ou diastérérotopiques, présentent l’avantage d’un

rendement élevé pouvant atteindre théoriquement 100%. Cependant ce genre de composés

60

se rencontre bien moins fréquemment que les racémates, ce qui a fait du dédoublement

cinétique l’approche dominante dans la synthèse de molécules optiquement pures.

Le dédoublement cinétique est défini comme un processus où les deux énantiomères

d'un mélange racémique sont transformés à des vitesses différentes ; si

l’énantiosélectivité est élevée, l'un des énantiomères est transformé tandis que l'autre est

retrouvé quasi inchangé.

Figure 16

B. Mesure du degré d’énantiosélectivité d’un Dédoublement Cinétique

L’énantiosélectivité d’un dédoublement cinétique est évalué par la mesure de la

grandeur ‘’E’’ appelée coefficient d’énantiosélectivité. C’est une constante caractéristique

de l’énantiosélectivité d’un couple enzyme-substrat dans des conditions données, calculée

à partir d’équations élaborées par Sih 159,160.

Le coefficient d’énantiosélectivité, E, a été défini comme étant le rapport entre les

constantes cinétiques Vm et Km des deux énantiomères :

E = (VmR/KmR) / (VmS/KmS), R étant l’énantiomère le plus réactif.

L’intégration de l’équation des vitesses a permis de relier ce coefficient aux

évolutions des ees du substrat et du produit, ainsi qu’au taux de conversion, c. Ainsi, E est

accessible en utilisant les équations suivantes à partir de soit le taux de conversion et l’ee

du substrat, soit le taux de conversion et l’ee du produit, soit les ees du substrat et du

produit mesurés à un temps donné au cours de la réaction.

E = ln [(1-c)(1-ees)] / ln [(1-c)(1+ees)] avec c, le taux de conversion

E = ln [1-c(1+eep)] / ln [1-c(1-eep)] ee(S), l’ee du substrat

61

E = ln [(1-ees)/(1+ees/eep)] / ln [(1+ees)/(1+ees/eep)] ee(P), l’ee du produit

Une représentation graphique a été rapportée sur la dépendance de l’ee(ε) et de

l’ee(P), en fonction des deux paramètres E et c (Figure 17). Il a été ainsi établi que

l’obtention du substrat restant ou du produit formé sous forme énantiomériquement pure

demande en pratique une réaction présentant une valeur de E supérieure à 20-30. Une telle

valeur est nécessaire pour une utilisation industrielle éventuelle de la réaction, en effet

pour des valeurs plus faibles le rendement final sera plus faible. Au-delà d’un degré

d’énantiosélectivité de 100 la réaction peut être considérée comme presque parfaite, un

énantiomère étant transformé l’autre restant inchangé.

Figure 17 : Ee en fonction du taux de conversion pour différentes valeurs de E

(à gauche : substrat, à droite : produit)

C. Limitations d’un dédoublement cinétique

Comme souligné précédemment, l’application pratique du dédoublement cinétique à

l’échelle industrielle est confrontée à la faible productivité de ces réactions. En effet, elle

ne permet d’obtenir au mieux que 50% du produit recherché sous forme optiquement pure

(conditions d’énantiosélectivité élevée), correspondant à la transformation d’un seul

énantiomère du mélange racémique initial. Une seconde difficulté peut éventuellement se

rajouter à ce problème de rendement, la séparation du produitet du substrat. En effet, la

présence du substrat de départ en quantité importante dans le milieu réactionnel peut

rendre la purification du produit final laborieuse. De nombreux efforts ont ainsi été

62

consacrés à surmonter cette limitation à 50% de rendement inhérente au dédoublement

cinétique.

II. Dédoublement cinétique dynamique

Obtenir 100% de rendement et 100% d’excès énantiomérique d’un produit, en partant

d’un substrat racémique, est l’un des rêves du chimiste organicien. Les différentes

techniques potentiellement utilisables ont été définies par Faber161, elles sont basées sur

les principes de dédoublement cinétique dynamique, la stéréoinversion,

l’énantioconvergence et la déracémisation cyclique. Le dédoublement cinétique dynamique

(DCD) est l’approche la plus fréquemment rencontrée et sera décrite en détail par la suite.

A. Définition et études cinétiques

Le dédoublement cinétique dynamique associe au dédoublement cinétique une

racémisation in situ de l’énantiomère le moins réactif du substrat. Cette méthode élégante

permet, à condition que l’énantiosélectivité de la réaction soit très élevée, d’effectuer en

un seul réacteur deux réactions qui mènent finalement au produit énantiopur avec un

rendement théorique de 100%.

Lors d’un dédoublement cinétique, la réaction s’arrête ou ralentit à 50% de conversion

lorsque l'énantiomère le plus rapidement SR est consommé et ne reste que l’énantiomère

SS se transformant lentement (Figure 18), alors que lors d’un dédoublement dynamique la

racémisation du substrat in situ assure la transformation complète de l’énantiomère SS en

SR. Une modélisation des cinétiques mis en jeu dans le cas d’un dédoublement cinétique

montrent que l’excès énantiomérique du produit ee(p) baisse rapidement après 50% de

conversion, alors qu’il reste élevé si le substrat est constamment racémisé durant le

processus de dédoublement dynamique et égal à ce qu’il était en tout début de réaction.

63

Figure 18

Le rapport des vitesses des deux réactions en parallèle (dédoublement cinétique et

racémisation) est le point crucial du succès d’un dédoublement dynamique. Le traitement

mathématique de ce type de réaction a été développé par Noyori 162, et des programmes

informatiques ont été élaborés pour analyser et optimiser les applications pratiques de

DCD. Des règles générales ont été ainsi décrites pour assurer la bonne réalisation d’un

processus de DCD : i) le dédoublement cinétique doit être suffisamment énantiosélectif,

le coefficient d’énantiosélectivité E doit être au moins supérieur à 20; ii) la vitesse de

racémisation doit être égale ou supérieure à la vitesse réactionnelle de l'énantiomère le

plus rapide c’est-à-dire la constante de vitesse krac doit être supérieure à la constante de

vitesse kR ; iii) dans le cas où le dédoublement cinétique très énantiosélectif (E>100), krac

peut être inférieur à kR.

B. Optimisation de DCD

Le processus de DCD doit généralement se terminer en un temps court, et toute

réaction secondaire pouvant affecter le substrat ou pouvant entrainer la racémisation du

produit, doit être évitée. En d’autres termes, l’enjeu d’un DCD efficace est de trouver des

conditions, assurant une racémisation rapide du substrat et qui seront compatibles avec le

dédoublement cinétique se déroulant en parallèle. Cette racémisation peut être effectuée

chimiquement, biocatalytiquement ou même spontanément, les conditions choisies ne devant

pas affecter la performance du catalyseur.

Bien que la recherche d’un catalyseur permettant un dédoublement cinétique efficace

des deux énantiomères du substrat soit une étape importante, la racémisation contrôlant

64

l’équilibre entre ces deux énantiomères est aussi un paramètre à être optimisé. Zwanenburg

a mis en évidence dans sa revue 163 l’absence d’approche systématique permettant

d’optimiser simultanément les deux processus. La racémisation nécessite d’être améliorée

séparément et cette amélioration dépend largement du composé à racémiser. Il a regroupé

les techniques de racémisation connues à cette époque (1967-1996) et les a classées en

différentes catégories selon leur mécanisme: 1) thermique, 2) catalysée par une base ou un

acide 3) via la formation d’une base de Schiff, 4) enzymatique 5) via des réactions rédox.

Il évoque aussi le besoin de développer de nouvelles méthodes de racémisation douces de

sorte à les rendre compatibles avec les processus de dédoublement cinétique, surtout ceux

utilisant des biocatalyseurs.

III. Dédoublements Cinétiques Dynamiques enzymatiques

De nombreux DCD ont été décrits jusqu’à présent et sont généralement classés en

deux types, chimiques et enzymatiques, suivant la nature du catalyseur utilisé lors du

dédoublement cinétique ou de la racémisation. Le DCD chimique emploie des auxiliaires

chiraux, des catalyseurs organiques ou organométalliques alors que le DCD enzymatique

utilise évidemment des enzymes. Un bilan de l’utilisation des différents types de DCD a été

détaillé dans plusieurs revues 164,165,166,167,168.

Nous nous sommes particulièrement intéressés aux DCD enzymatiques. Pour ce type

de DCD la réaction de racémisation utilisée est souvent de nature chimique. Cependant un

certain nombre de DCD enzymatiques ont été développés en utilisant des enzymes

(racémases) comme agent racémisant.

A. DCD chimio-enzymatique

Il a été montré qu’un certain nombre de méthodes de racémisation chimique étaient

compatibles avec l’utilisation simultanée d’enzymes. Elles ont été classées en fonction de la

nature de la réaction de racémisation ou du catalyseur utilisé.

65

1) Racémisation via une protonation/déprotonation

La méthode de racémisation la plus largement utilisée, est la racémisation acido-

basique de composés ayant un stéréocentre avec un proton acide, adjacent à un groupe

carbonyle. La formation d’un énol ou d’un énolate achiral permet la racémisation du substrat

de départ (Figure 19). Si les conditions de racémisation sont suffisamment douces, elles

peuvent alors être compatibles avec l’utilisation d’un biocatalyseur. De nombreux DCD

utilisant cette technique ont été appliqués à des dérivés d’acides carboxyliques α-

substitués comme des esters, des oxazolones et des hydantoïnes ainsi qu’à des cétones α-

substituées. Les bioconversions utilisées étaient des réactions d’hydrolyse, de réduction

et de transesterification.

Figure 19

Les oxazolones sont de bons candidats au DCD via cette méthode, du fait du faible

pKa de leur proton en C4, et de leur réactivité avec différents nucléophiles. Ainsi, un DCD

élégant d’oxazolones substituées en position 4 a été développé pour la synthèse de L-

phényl-alanine169 et L-tert-leucine170 énantiopures. Plus récemment, des esters α-amino

propyliques ont été produits avec des rendements quantitatifs et des ees élevés à partir

des oxazolones correspondantes (Figure 20)171. L’étape de transestérification utilisant la

lipase Novozym 435 s’effectue dans des conditions douces de température et en présence

de solvant organique. L’influence du solvant et du nucléophile sur la sélectivité de l’enzyme

a été mise en évidence : Le dioxane s’est avéré être le solvant le plus sélectif pour

l’ouverture biocatalytique du cycle, alors que le n-propanol est l'agent nucléophile le plus

sélectif pour tous les substrats.

66

Figure 20

D’autres exemples impliquants des substrats aisément énolisables et diverses

enzymes comme des lipases, des réductases et des hydantoïnases sont donnés dans le

tableau ci-après.

TBD : TriazaBicycloDecène

Substrat Produit Enzyme Conditions Rdt % ee %

Ref

Lipase: CAL-B n-heptane,

tampon pH>8,5

95 97

172

Alcalase:

Subtilisin

Calsberg

NH4OAc,

pH = 8,5 92 93

173

Lipase : CAL-B

NH4OAc,

pH = 8,5 85 92

173

Cétoréductase

(Kred 102),

NADPH, glucose

Tampon

Phosphate,

pH =6,9

100

> 99

174

Réductase (Saccharomyces

montanus)

n=1 (89)

n=2 (85)

n=1 (97)

n=2 (93)

175

D-hydantoïnase

pH=9

73

100

176

67

2) Racémisation via des réactions d’addition/élimination

Des composés ayant des stéréocentres avec un proton stable, adjacent à un

hétéroatome comme l’oxygène, le soufre, ou l’azote ou à ’un groupement éléctroattracteur

comme le groupe nitrile, peuvent subir une racémisation par une réaction réversible

d’addition/élimination dans des conditions douces (Figure 21). Cette méthode a été

appliquée avec des dérivés d’alcools secondaires et d’amines comme les cyanohydrines, les

hémiaminals et les hémithioacétals. La réaction enzymatique énantiosélective transforme

généralement le groupe hydroxyle ou amine de ces dérivés, par exemple par acylation, ce

qui empêche la racémisation du produit.

Figure 21

Une stratégie générale de DCD utilisant ce type de racémisation avec des

cyanohydrines aromatiques a été mise au point177. Elle utilise une résine basique l’Amberlite

OH- pour la racémisation de la cyanohydrine acétylée. La cyanohydrine se forme in situ par

addition de l’acétone cyanohydrine sur l’aldéhyde correspondant par catalyse basique. Une

amélioration a été récemment apportée dans ce type de réaction grâce à l’utilisation

d’hydroxyde de benzyltrimethylammonium BnN+Me3OH- (BTAH) supporté sur silice et d’une

lipase immobilisée 178 (Figure 22). Les acétates de différentes cyanohydrines sont obtenus

avec des ees élevés et de très bons rendements. Contrairement à l’Amberlite OH- qui se

décompose progressivement, et qui nécessite des temps de réaction longs (2-8 jours), la

BTAH est stable et diminue le temps de réaction (15-45h). Ceci a permis de réaliser des

DCD de certains dérivés aromatiques instables, substitués par des groupes électro-

attracteurs (Cl, F, CF3), ce qui n’avait jamais été décrit auparavant.

68

Figure 22

Les zéolites acides H-Beta ont aussi prouvé leur intérêt pour la racémisation des

alcools benzyliques. Ainsi, un DCD a été accompli en présence d’acides carboxyliques comme

agents acylants et de la lipase Novozyme 435179 (Figure 23). L’encapsulation de ces zéolites

a été explorée dans des nanoréacteurs et appliquée avec succès au dédoublement du 1-

phényléthanol et du 1-indanol 180. Plus récemment, des microcomposites appelés Beta-

Silicalite ont montré leur efficacité dans le DCD du 1-phényléthanol avec la lipase Novozym

435 181. Cette silicalite microporeuse inerte enveloppant les chaines acides de zéolites,

permet l’accès de l’alcool au noyau acide pour se racémiser mais empêche l’ester formé de

l’atteindre. Cela évite l’hydrolyse indésirable de l’ester et minimise la formation de produits

secondaires, surtout ceux issus de la déshydratation de l’alcool. L’ester a été ainsi produit

avec le meilleur rendement (92%) jamais obtenu, et avec un ee de 94%.

Figure 23

Un DCD de N-acylhémiaminals a été aussi obtenu par simple acétylation avec les

lipases à une température de 60-70°C et en présence d’hexane182 (Figure 24). Des acétates

énantiomériquement purs sont formés avec des rendements quantitatifs, leur purification

consistant tout simplement à filtrer l’enzyme et éliminer le solvant.

Figure 24

69

Contrairement aux alcools secondaires, seuls quelques travaux ont été reportés avec

des amines comme substrat, probablement dû au fait que ce type de racémisation implique

la formation d’un intermédiaire imine moins stable que l’intermédiaire carbonyle.

Cependant, certains exemples sont apparus dans la littérature ces dernières

années183,184,185.

Un DCD développé avec des amines primaires a particulièrement retenu l’attention.

Il a associé pour la première fois une racémisation in situ par des radicaux avec une

transformation enzymatique 186. La racémisation se fait à l’aide d’un radical alkylsulfanyle

via une élimination réversible du proton du centre chiral en α de l’amine, le groupe amine

étant acylé énantiosélectivement avec la lipase CAL-B (Figure 25). Ce procédé s’est montré

compatible avec divers fonctionnalités, et a conduit à des amides de configuration absolue

(R) avec des rendements et des ees élevés. Les travaux ont été poursuivis pour appliquer

ce protocole avec succès sur d’autres amines aliphatiques avec une protéase alcaline 187.

Figure 25

3) Via la formation d’une base de Schiff

La racémisation via la formation d’une base de εchiff s’est montrée efficace pour le

DCD d’esters d’acides α-aminés, en utilisant des aldéhydes aromatiques comme les dérivés

du salicylaldehyde et du pyridoxal 5-phosphate188,189. Dans cette procédure, la réaction de

condensation entre l’amine et le groupe aldéhyde augmente l’acidité de l’atome d’hydrogène

du centre chiral, ce qui facilite la racémisation de l’atome de carbone. L’association de ce

protocole à une hydrolyse enzymatique avec une alcalase (Figure 26), a permis l’obtention

d’une gamme d’α-acides aminés chiraux, et en particulier la tyrosine et la phénylalanine190.

70

Figure 26

4) Via une substitution nucléophile

Une approche de DCD a été développée par racémisation in situ via une substitution

nucléophile réversible d’un α-halogène secondaire par le même halogène. Cette procédure

rarement utilisée, a été appliquée sur des α-haloesters en associant une réaction

d’hydrolyse ou d’aminolyse enzymatique 191,192. Un bon exemple a été reporté avec l’éthyl 2-

chloropropionate (Figure 27). La lipase de Candida cylindracea encapsulée catalyse

l’aminolyse énantiosélective et la présence de chlorure de triphenylphosphonium

immobilisée sur résine de Merrifield assure la racémisation193.

Figure 27

B. DCD chimio-enzymatique avec des complexes métalliques

La combinaison d’une enzyme avec un complexe métallique pour réaliser un DCD s’est

considérablement développée, depuis que la compatibilité des deux systèmes a été

démontrée. Dans cette approche, l’enzyme agit comme agent d’énantiosélectivité, et le

catalyseur métallique comme agent racémisant.

Cette méthode de racémisation utilise des catalyseurs à base de métaux de transition

(Ru, Rh, Pd, etc). Elle s’est avérée être une alternative intéressante pour les DCD d’alcools

71

secondaires et d’amines, élargissant la gamme de substrat susceptible de conduire à des

DCD. Elle utilise une réaction réversible d’oxydo-réduction, impliquant la formation d’un

intermédiaire achiral, cétone ou imine respectivement. Elle est également applicable à des

substrats ayant plus d’un stéréocentre. Plusieurs systèmes ont été reportés dans des

revues 165,166,167,168 la méthode la plus utilisée étant celle combinant une lipase à un complexe

à base de Ruthénium.

1) Alcools secondaires

Le meilleur système pour la préparation d’acétates énantiopurs, a été décrit par

Bäckvall 194. Il est basé sur l’utilisation d’une lipase catalysant la transestérification

énantiosélective de dérivés d’alcools secondaires et des analogues d’un complexe de

Ruthénium cyclopentadienyl comme agent racémisant (Figure 28).

Ce système a largement été appliqué avec des alcools fonctionnalisés variés pouvant

servir de synthons chiraux en synthèse asymétrique. Le protocole a surtout été développé

avec les catalyseurs synthétisés par Bäckvall et Shvo, qui ont été appliqués avec succès

dans le DCD des dérivés de chlorohydrines aromatiques195, chloropyridine-éthanol196,

benzoïnes197, sulfones198, -hydroxy amides199 et α-hydroxyphosphonates200 (Tableau 11).

Les conditions utilisées sont relativement douces, et compatibles à la fois avec l’activité

enzymatique et avec la fonction racémisante du catalyseur.

Figure 28

72

Tableau 11

2) Amines

La production d’amines énantiopures via cette approche de DCD s’est montrée plus

difficile que celle d’alcools. La racémisation d’amines demande généralement des conditions

plus fortes, comme par exemple des températures élevées associées à des temps de

réaction plus longs. De plus, elles peuvent interagir en tant que ligands forts avec les

intermédiaires actifs de complexes métalliques201. Cependant, un système efficace pour le

DCD d’amines primaires a été décrit en utilisant le catalyseur de Shvo combiné à la lipase

CALB, avec de l’acétate d’isopropyle comme donneur d’acyle 202. Une large gamme d’amines

énantiopures a été obtenue avec des rendements élevés (Figure 29). Une amélioration a été

apportée au système avec l’utilisation du carbonate de dibenzyle comme agent acylant,

l’intérêt résidant surtout dans le fait que les carbamates de benzyle obtenus peuvent

libérer les amines désirés dans des conditions très douces maintenant leur chiralité 203,204.

73

Figure 29 :

3) Diols

La même approche, utilisant le complexe de Bäckvall, a été également reportée pour

des DCD de 1,5-diols conduisant la formation de diacétates énantiopurs. Ainsi, un procédé

élégant a été développé avec deux lipases placées dans le même réacteur, CAL-B et PS-II.

Chacune des deux enzymes utilise le même groupe acylant pour acétyler

énantiosélectivement l’un ou l’autre des deux fonctions alcool du diol, conduisant aux

diacétates correspondants, sous formes énantiopures et avec des rendements et des

sélectivités anti très élevés (Figure 30) 205. La même méthodologie a été étendue à

l’obtention de 1,4-diols affichant des sélectivités syn élevées 206.

Figure 30

C. DCD enzymo-enzymatique avec des racémases

Le processus de racémisation lors d’un DCD peut être quelquefois effectué par des

enzymes appelées racémases. Ces racémases fonctionnent généralement dans des

conditions douces évitant la formation de sous-produits. Malheureusement, très peu de ces

enzymes sont connues jusqu’à présent. Deux groupes ont été identifiés, qui racémisent

efficacement des dérivés d’α-hydroxy carbonyles et d’α-amino-acides non racémisables par

74

les méthodes chimiques conventionnelles, et qui se sont montrés très chimiosélectifs. Leurs

applications synthétiques ayant été rapportées dans une revue par Faber207, nous ne

détaillerons ici que les exemples de racémases les plus importants, développés pour des

applications à grande échelle.

1) Racémases de dérivés de carbonyles α-hydroxylés

Le nombre d’enzymes connues capables de racémiser des carbonyles α-hydroxylés est

faible. Parmi celles-ci, la mandelate racémase est la plus connue et la mieux caractérisée

en comparaison de la lactate racémase et de l’acétoïne racémase.

Mandelate racémase

La mandelate racémase la plus utilisée est extraite de Pseudomonas putida ATCC

12633. La culture de la bactérie a été optimisée en fermenteur208, assurant la disponibilité

de l’enzyme en grande quantité. Ceci a facilité l’exploration de son profil de substrats à

l’échelle préparative, ainsi que l’étude de ses propriétés biochimiques et de sa structure.

Le mécanisme catalytique de la mandelate racémase a été proposé par Faber209 et

son site actif étudié 210. Le gamme de dérivés acceptés en dehors de son substrat naturel

le mandelate 209,211 est large, et a permis de proposer un modèle du site actif212. Son

immobilisation sur des cristaux liquides a aussi permis l’amélioration de son activité ainsi

que sa réutilisation213.

Cette enzyme a ainsi été utilisée dans un procédé de DCD bi-enzymatique efficace.

Les auteurs ont combiné in situ l’action de la mandelate racémase immobilisée et d’une lipase

extraite de Pseudomonas sp. dans la synthèse de l’acide (ε)-O-acétylmandélique214 (Figure

31). 80% du produit désiré a été obtenu avec un ee de 98%.

75

Figure 31

L’emploi de la mandélate racémase a également été reportée dans la synthèse d’un

acide α-aminé, la L-phénylglycine, grâce à un procédé de DCD tri-enzymatique (Figure 32).

Tout d’abord, l’α-hydroxy acide mandélique est oxydé par la D-mandelate déshydrogénase

(D-MDH) en α-céto acide, qui est ensuite transformé en acide α-aminé via une amination

réductive asymétrique catalysée par la L-amino-acide déshydrogénase (L-AADH). Le

cofacteur NADH/NAD+ est recyclé automatiquement dans le système, l’oxydation et la

réduction ayant lieu simultanément. Le procédé est achevé avec un rendement global de

97% en L-phénylglycine presque énantiopure.

Figure 32

2) Racémases de dérivés d’acides α aminés

Les racémases d’acides α-aminés et de leurs dérivés sont fréquentes dans la nature.

Trois d’entre elles, la N-Acylamino acide racémase (NAAR), la α-Amino- -caprolactame

racémase (ACL racémase) et l’Hydantoïne racémase ont attiré l’attention et ont été

76

appliquées dans des DCD pour la production d’acides aminés optiquement purs d’un grand

intérêt dans les domaines pharmaceutique et cosmétique.

N-acylamino acide racémase (NAAR)

Une enzyme extraite de l’actinomycète Amycolatopsis sp. TS-1-60 a montré une

activité racémase envers des N-acylamino acides. Appelée N-Acylamino acide racémase,

(NAAR), elle présente l’avantage d’être inactive envers les acides aminés libres

correspondants. Ainsi, elle a été combinée à une D-Aminoacylase (ou à une L-Aminoacylase),

pour la production industrielle de D-Méthionine (respectivement L-Methionine)215. Les deux

enzymes ont été immobilisées sur une colonne DEAE Toyopearl dans un bioréacteur

industriel alimenté en continu avec de la N-acétyl-DL-méthionine (Figure 33). En fonction

de l’enzyme choisie, la D ou la L-méthionine est produite en continu pendant plus de 25h,

sous formes énantiopure et avec des rendements de 99% et 90% respectivement. Des

traces de N-acétyl-DL-méthionine résiduelles ont pu être séparées facilement du produit

par recristallisation. La demi-vie du réacteur est de 30 jours à 30°C.

Figure 33

α-Amino- -caprolactame racémase (ACL racémase)

L’α-Amino- -caprolactame racémase extraite d’Achromobacter obae, a été utilisée

industriellement pour la synthèse de la L-lysine, un additif alimentaire produit à l’échelle

de 4000 tonnes par an. Le procédé utilise comme substrat le DL-α-amino- -caprolactame

et associe en un seul réacteur des cellules entières de Cryptococcus laurentii, produisant

une L-lactamase pour l’hydrolyse énantiosélective du L-lactame, avec des cellules entières

77

d’Achromobacter obae produisant l’ACL racémase 216 (Figure 24). La L-lysine énantiopure

est ainsi produite avec des rendements élevés.

Figure 34

Plus récemment, l’ACL racémase a été utilisée dans un DCD tri-enzymatique d’α-

aminonitriles, pour la synthèse d’acides α-aminés optiquement purs. Le procédé consiste en

trois étapes i) une hydrolyse d’α-aminonitrile racémique par une nitrile hydratase (NHase)

non énantiosélective, ii) une hydrolyse stéréosélective de l’amide d’acide α-aminé formé par

uneD- ou L-amide aminoacide hydrolase, et iii) une racémisation simultanée de l’amide

d’acide α-aminé par l’ACL racémase217 (Figure 35). Plusieurs substrats ont été testés avec

ce système, et des acides aminés (R) et (S) ont pu être obtenus avec des rendements et

des ees excellents.

Figure 35

Hydantoïne racémase

L’Hydantoïne racémase extraite d’Arthrobacter aurescens DSM 374 a trouvé son

application dans le processus de résolution d’hydantoïnes pour la production industrielle de

D- ou L-acides aminés218. Le processus consiste en trois étapes en partant d’une hydantoïne

racémique (Figure 36) : i) ouverture du cycle hydantoïne par hydrolyse avec une D- ou une

L-hydantoïnase spécifique. ii) hydrolyse du N-carbamoylamino acide formé par une

carbamoylase. iii) racémisation du substrat par l’hydantoïne racémase. La tautomérisation

78

céto-énolique à l’origine de la racémisation, ne se produit pas facilement par simple

alcalinisation, et donc l’utilisation de l’hydantoïne racémase est nécessaire.

Figure 36

Un exemple d’utilisation industrielle de ce procédé, est celui de la production de la

D-phénylglycine et de la D-p-hydroxy-phénylglycine, qui sont produits à l’échelle de milliers

de tonnes par an. Ces deux composés sont utilisés comme chaines latérales d’antibiotiques

de type -lactame, l’ampicilline et l’amoxicilline respectivement.

IV. DCD enzymatique avec des BVMOs

Comme nous l’avons introduit Chapitre I, les BVMOs présentent une régio- et/ou

énantio-sélectivité élevée envers une variété de cétones racémiques. Elles peuvent être à

la base de DCD, produisant des synthons chiraux à des hauts rendements pour la synthèse

de molécules biologiquement actives. Quelques exemples de DCD ont été décrits avec

l’oxydation de BV microbiologique, majoritairement récents. Tous les substrats

transformés possèdent des substituants en α du groupe carbonyle, ce qui a permis de les

racémiser par un équilibre céto-énolique en milieu basique. Le succès des DCD décrits ci-

dessous, revient en grande partie à l’efficacité catalytique des BVMOs utilisées, en termes

d’activité et de sélectivité, en conditions basiques. Nous présenterons les différentes

cétones transformées lors de ces travaux.

79

A. Cyclopentanones α-substituées

Le premier DCD utilisant une oxydation de BV microbiologique, a été appliquée dans

notre laboratoire, sur la 2-benzyloxyméthyl-cyclopentanone avec des cellules entières d’E.

coli recombinantes produisant la CHMO d’Acinetobacter calcoaceticus. Une faible

racémisation de cette cétone s’effectue spontanément à pH 7. Ceci a été mis à profit pour

réaliser un DCD à pH 9, conduisant à 98% de rendement en (R)-lactone correspondante (ee

96%) 219 (Tableau 12). Pourtant, la perte partielle de l’activité des cellules à ce pH, ainsi

que la concentration optimale faible du substrat utilisé (0,3 g/L) ont limité son application

à l’échelle préparative.

La recherche d’améliorations à apporter à ce procédé a conduit à l’utilisation de

résines échangeuses d’anions à des pH proches de la neutralité. Après avoir mis au point le

procédé avec plusieurs résines (fortes et faibles), la sélection de la résine Lewatit MP62 a

été l’étape clé de ce travail. Elle a assuré une racémisation rapide du substrat à pH 7,5, un

pH également optimal pour l’activité enzymatique. La concentration en substrat a été

augmentée d’un facteur trois (1 g/L) par rapport à l’exemple précédent220. Le grand

avantage de cette DCD, par rapport aux exemples que nous allons décrire, est l’utilisation

de cellules entières au lieu d’enzymes isolées, évitant d’associer une enzyme pour le

recyclage du cofacteur NADPH. De plus, elle est réalisée à l’échelle préparative

(fermenteur 1L), par comparaison aux autres exemples décrits à l’échelle analytique.

Tableau 12

B. Cétones benzyliques

Des dérivés de cétones benzyliques ont été utilisés pour des DCD, utilisant deux

BVMOs, HAPMO de Pseudomonas fluorescens ACB et un mutant de PAMO, M446G.

Plusieurs facteurs ont été étudiés, pour chercher la meilleure condition racémisante, qui

80

sera compatible avec un bon fonctionnement de l’enzyme. L’effet du pH et de la

température ainsi que le type des résines anioniques ont été testées. Egalement, l’effet du

solvant sur le déroulement de la DCD a été étudié avec la PAMO M446G, le méthanol est

finalement utilisé comme cosolvant (5% v/v).

La DCD a été mise au point avec le substrat modèle 3-phénylbutan-2-one 221,222

(Tableau 13). L’énantiosélectivité de la biotransformation de ce substrat avec l’HAPMO

dépend du pH ; la bioconversion augmente à pH élevé (10), mais l’ee du produit baisse75. Le

même phénomène a été observé avec la PAMO M446G même en présence du méthanol, qui

améliore l’activité de l’enzyme tout en maintenant l’énantiosélectivité élevée. Les deux

enzymes produisent l’ester 1-phénylethyl acétate de même configuration (S). Cependant la

racémisation de la cétone est insuffisante à pH 10 et est accompagnée d’une baisse de l’ee

du produit.

Le fait d’ajouter des résines anioniques fortes, a entrainé une racémisation forte de

la cétone, mais a affecté l’activité enzymatique des deux BVMOs. Finalement, deux résines

faibles Lewatit MP62 et Dowex MWA-1, ont donné de meilleurs résultats en termes de

rendement et d’ee du produit, avec la PAMO M446G et l’HAPMO respectivement. De façon

surprenante, ces résines ne sont pas interchangeables. La non-racémisation du produit final

isolé en présence des résines anioniques testées a confirmé que le déroulement de la DCD

est fonction de l’activité et de la sélectivité de l’enzyme, dans les conditions employées.

D’autres exemples ont été décrits et ont montré que la variation des chaines latérales et

des substitutions du groupe phénylique influencent sur la vitesse de racémisation et sur la

transformation enzymatique.

81

Tableau 13

C. 2-alkyl-1-indanones

La préparation de 3-alkyl-3,4-dihydroisocoumarines a été développée avec des

rendements et des ees élevés grâce à une DCD utilisant la PAMO M446G à partir de 2-

alkyl-1-indanones223. En effet, la régio- et énantiosélectivité de cette enzyme envers ces

indanones racémiques a conduit aux lactones chirales anormales correspondantes c’est-à-

dire aux lactones formées après insertion de l’atome d’oxygène entre le groupe carbonyle

et l’atome de carbone le moins substitué 94. La présence d’un hydrogène acide en α du

carbonyle induit une racémisation du substrat à pH élevé (10). La sélectivité de cette

enzyme avec le substrat modèle 2-methyl-1-indanone, a été étudiée dans un système

biphasique (aqueux-solvant organique), et s’est trouvée améliorée en présence de 5%

d’hexane (Tableau 14). La réaction aboutit, au bout de 6h, à une conversion de 50% avec un

ee de 92% de la lactone (R), alors qu’une prolongation du temps de la réaction (72h), permet

d’augmenter la conversion jusqu’à 78%, mais affecte l’ee du produit (88%) qui s’est

partiellement racémisé.

Enzyme

82

Les effets du pH et de la température ont été étudiés en présence d’hexane. Le fait

de baisser l’un ou l’autre des deux paramètres, température (20°C) ou pH (8), affaiblit

d’une façon remarquable le fonctionnement de l’enzyme. L’utilisation de résines anioniques

fortes a altéré également l’activité enzymatique, un meilleur résultat ayant été obtenu avec

la résine faible Lewatit MP62, présentant une conversion moyenne de 56% et un ee du

produit de 84%.

D’autres dérivés alkyles (Et, i-Pr, n-Bu) ont donné aussi les meilleurs résultats dans

les conditions initialement établies (pH=10, 40°C). Ce sont donc les propriétés de cette

enzyme, thermostable et capable de fonctionner à des pH élevés, qui ont permis d’achever

cette DCD.

Tableau 14

D. α-alkyl- -cétoesters

Une simple DCD réalisée sous l’effet du pH, a été appliquée sur des α-alkyl- -

cétoesters, utilisant la PAMO 224. Les esters correspondants ont pu être produits sous

forme énantiopure, et avec des rendements parfois quantitatifs. L’hydrolyse de celles-ci

conduit à des α-hydroxy-esters et des α-hydroxy-acides, largement utilisés en industrie

pharmaceutique 225 et cosmétique 226 respectivement.

L’oxydation de BV du 2-methyl-3-oxobutanoate avec la PAMO a montré qu’une

simple augmentation du pH de 8 à 9, permet d’augmenter le rendement en produit (S)

énantiopur de 30% à 60% (Tableau 15). L’activité de cette enzyme particulièrement forte

à pH élevée, envers l’oxydation de cétones et de sulfures, a été ainsi bien mise à profit 227.

Enzyme

83

εon efficacité catalytique est aussi démontrée, en termes d’activité et

d’énantiosélectivité, avec une variété de ces dérivés. En variant le groupe alkyl et/ou les

chaines latérales de l’ester, d’excellents DCD (99% rdt, 99% ee) ont pu être obtenues. La

conversion modérée de certains dérivés a pu aussi être améliorée par l’ajout de solvant (5%

MTBE). Cet effet du solvant a permis également d’augmenter la concentration utilisable

d’un des dérivés jusqu’à 50 mM (8,6 g/L), alors que sans solvant, elle ne dépasse pas 20 mM.

Tableau 15

Conclusion

Ces exemples montrent que les BVMOs, à côté de leurs propriétés de régio et/ou

d’énantiosélectivité élevée, peuvent s’adapter à des conditions de racémisation variées (pH

élevé, résine anionique). La gamme de cétones racémiques impliquées dans ces procédés

devrait s’élargir avec la découverte de nombreuses BVMOs capables de transformer des

cycloalcanones α-substituées racémiques.

Enzyme

84

Conclusion du chapitre

Les développements récents survenus dans le domaine des DCD enzymatiques ont

largement augmenté leur efficacité et leur champ d’application. Par exemple, la combinaison

de la catalyse enzymatique et des catalyseurs métalliques de racémisation a fait l’objet

d’un développement important, en particulier pour l’obtention d’alcools secondaires et

d’amines. Ce type de méthodologie va continuer à jouer un rôle central dans ces procédés

de DCD même si les tendances vont vers une utilisation croissante de catalyseurs non

métalliques. Ceci est dû aux coûts souvent élevés des métaux de transition et aux

problèmes liés à leurs résidus, principalement dans les produits pharmaceutiques. De

nouveaux catalyseurs de racémisation devraient être élaborés, qui seront plus efficaces,

plus écologiques et moins chers. En outre, d’autres enzymes doivent être recherchées pour

élargir le champ des transformations possibles. En particulier, grâce aux méthodes

d’évolution dirigée, combinées avec les progrès réalisés dans les technologies de criblage,

des enzymes plus robustes, plus sélectives et plus promiscuitaires doivent pouvoir être

développées.

L’utilisation de racémases, capable de catalyser une racémisation chimio-sélective

sans réactions secondaires, ont prouvé leur intérêt lors du DCD de composés non naturels

à l’échelle préparative. Cet aspect de la racémisation biocatalytique, dans des conditions

douces, répond à la demande sociétale vis à vis des enjeux environnementaux suite à la

prise de conscience des contraintes environnementales dans l’industrie chimique. Dans le

futur les procédés de DCD devraient se diriger de plus en plus vers le tout enzymatique.

85

86

87

Partie Résultats et Discussion

Notre travail s’organisera en deux chapitres :

la recherche de nouvelles BVMOs pour pouvoir élargir le champ des réactions de

Baeyer-Villiger asymétriques par des sélectivités complémentaires

l’application de Dédoublements Cinétiques Dynamiques à de nouveaux couples

BVMO/cétones par une nouvelle approche de la racémisation de cétones cycliques α-

substituées.

Dans ces deux chapitres, nous décrirons les études préliminaires que nous avons

effectuées pour développer ces deux thématiques de notre projet. Plus particulièrement,

nous détaillerons :

Les synthèses chimiques des substrats choisis et de leurs produits de

bioconversions.

L’étude des conditions de culture et de bioconversion des souches sélectionnées à

savoir six souches de E. coli recombinantes produisant de nouvelles BVMOs issues d’A.

baylyi et A. baumannii et la souche recombinante E. coli TOP10 [pQR239] produisant une

CHMO issue d’A. calcoaceticus

88

89

Chapitre III : Recherche de nouvelles Baeyer-

Villiger Monooxygénases

Le Génoscope d’Evry (ou Centre National de Séquençage), s’est dirigé vers la

génomique environnementale après avoir été l'un des acteurs du projet de déchiffrage du

génome humain. C’est ainsi que la totalité du génome de deux Acinetobacter, Acinetobacter

baylyi et Acinetobacter DP1 a été séquencée. D’autre part, notre laboratoire cherchant à

développer, dans une logique de développement durable, des solutions biologiques

applicables à la chimie de synthèse et utilisant depuis longtemps une BVMO d’A.

calcoaceticus, c’est tout naturellement que nous avons décidé d’explorer conjointement ces

génomes à la recherche de nouvelles BVMOs.

Six BVMOs putatives issues de ces deux souches d’Acinetobacter et leur profil de

substrats ont été l’objet de notre étude. Outre la sélection de nouvelles enzymes efficaces

catalysant des réactions de BV régiosélectives et/ou stéréospécifiques sur des substrats

cibles, nous voulons aussi évaluer la méthodologie utilisée ici en vue d’un futur criblage,

beaucoup plus large, sur d’autres enzymes.

I. Pourquoi s’intéresser au genre Acinetobacter ?

Le genre Acinetobacter est un groupe de bactéries ubiquitaires, trouvées dans l’eau,

le sol, les organismes vivants, et même sur la peau humaine. Elles sont classées dans l’ordre

des Pseudomonadales et dans la famille des Moraxellacées. Ce sont des bactéries Gram

négatives strictement aérobies, oxydase-négatives et catalase-positives.

Une de leurs caractéristiques la plus remarquable est la capacité de nombreuses

souches à utiliser une gamme de composés très divers comme source de carbone et

d’énergie et à croître sur des milieux relativement simples. Ce métabolisme robuste leur

confère une capacité d’adaptation élevée qui explique que ces bactéries soient retrouvées

dans des environnements variés. Pour cette raison, elles suscitent un intérêt croissant en

90

vue d’applications biotechnologiques et environnementales. Certaines souches sont en effet

capables de dégrader ou de séquestrer de nombreux composés polluants, notamment des

composés aromatiques, des hydrocarbures et des métaux lourds ce qui en fait de parfaits

agents de biorémédiation. D’autres produisent des bioémulsifiants.

Trois souches particulières appartenant à ce genre ont retenu notre attention pour

les raisons définies ci-dessous :

Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 :

A. calcoaceticus NCIMB 9871 est bien connu, car c’est de ce microorganisme qu’a été

extraite une des premières BVMOs, la Cyclohexanone 1,2-Monooxygénase (CHMO), il est

caractérisé par sa capacité à oxyder une très large gamme de substrats de manière souvent

très régiosélective et stéréospécifique. Cette souche a été isolée par culture sélective sur

cyclohexanol; en d’autres termes, elle est capable de se développer sur un milieu minéral

minimum ne contenant que du cyclohexanol comme source de carbone. La voie de

dégradation de ce xénobiotique dans A. calcoaceticus a été établie dès 1975 228 et le gène

codant pour la CHMO a été cloné et séquencé en 1988 29. Trois déshydrogénases

(cyclohexanol déshydrogénase 6-hydroxyhexanoate déshydrogénase, 6-oxohexanoate

déshydrogénase), une monooxygénase (cyclohexanone monooxygénase) et une lactone

hydrolase (Ɛ-caprolactone hydrolase) sont impliquées dans la conversion du cyclohexanol

en 6-hydroxyhexanoate qui sera lui-même transformé en acétylCoA et succinylCoA par une

succession de -oxydations comme montré dans la Figure 37. Dix ans plus tard, Iwaki et al 229 ont identifié le cluster de gènes complet intervenant dans la dégradation du

cyclohexanol, ce qui a permis de définir le contexte génomique de la CHMO. Il consiste en

3 gènes chnB, chnE et chnR organisés dans un même opéron et codant respectivement pour

la cyclohexanone monooxygénase (ChnB), la 6-oxohexanoate déshydrogénase (ChnE) et un

activateur/régulateur de la transcription (ChnR).

91

Figure 37 : Voie de dégradation du cyclohexanol par Acinetobacter NCIMB 9871. (ChnA : cyclohexanol

déshydrogénase; ChnB : cyclohexanone 1,2 monooxygénase; ChnC : Ɛ-caprolactone hydrolase; ChnD : 6-

hydroxyhexanoate déshydrogénase; ChnE : 6-oxohexanoate déshydrogénase).

Acinetobacter baumannii :

D’autres souches d’Acinetobacter ont un spectre nutritionnel plus étroit. Il s’agit de

l’espèce A. baumannii 230 , une des souches le plus souvent impliquées dans des infections

nosocomiales. C’est une bactérie uniquement trouvée sur l’homme et commensale de la peau

et du tube digestif, elle est habituellement très peu pathogène mais le devient pour des

malades immunodéprimés. Or, depuis une vingtaine d’années, on observe une multirésistance

de A. baumannii envers les agents antibactériens. Cette résistance s’exerce par

l'acquisition de plasmides. Ceux-ci portent des clusters de gènes codants pour les enzymes

qui permettent de dégrader les agents antibactériens. Le traitement de ces infections est

devenu un problème de santé publique, d’où l’intérêt porté au séquençage de génome chez

différentes espèces d’A. baumannii.

Le génome de cinq souches de cette espèce a été complètement séquencé dont celui

de A. baumannii AYE qui interviendra dans cette étude et qui est disponible sous la

référence T00667 dans la base KEGG 231. Il comprend 4 millions de paires de bases et 3700

gènes.

Acinetobacter baylyi ADP1 :

Une souche particulière d’Acinetobacter, obtenue par mutagénèse d’une souche isolée

du sol en 1969, suscite également un intérêt considérable 232. Cette souche d’abord décrite

sous le nom de BD413, a été renommée ADP1 en 1995. Elle se caractérise par une

compétence remarquable pour la transformation génomique, c’est-à-dire l’incorporation

92

spontanée d’ADN étranger; dans certaines conditions, plus d’une cellule sur cent peut être

transformée par de l’ADN présent dans le milieu, quelle qu’en soit la source, à condition

qu’il existe une région d’homologie avec le génome receveur. Cette propriété en fait un outil

prometteur pour les manipulations génétiques.

Son génome est long de 3.60 millions de paires de bases et contient

approximativement 3407 gènes.

II. Présentation des BVMOs retenues

A. BVMOs d’A. baumannii et A. baylyi

Des séquences protéiques homologues à celle de la CHMO d’A. calcoaceticus NCIMB

9871 (P12015) ont été inventoriées via le programme BLASTP* dans les génomes

d’Acinetobacter baumannii AYE et d’Acinetobacter baylyi ADP1. Cette étude a révélé la

présence respectivement de six et quatre protéines candidates (Graphiques 38 et 39)

Toutes ces protéines contiennent les deux repliements de Rossman signalés par le

motif GXGXX(G/A), caractéristiques des domaines de liaison aux cofacteurs FAD et

NADPH, et les deux signatures des BVMOs, FxGxxxHxxxW48 et

[A/G]GxWxxxx[F/Y]P[G/M]xxxD 49.

B. Choix des souches et contexte génomique

Parmi les dix protéines définies ci-dessus, un groupe de quatre, composé de ABAYE

0435, ABAYE 1825, ACIAD 2794 et ACIAD 3192, se distingue. Elles révèlent un taux de

similarité faible (environ 20%) avec CHMOAcineto et important (45 et 77%) avec une BVMO

issue d’une autre souche d’Acinetobacter, A. radioresistens (Tableau 17). Cette enzyme

serait impliquée dans la dégradation d’alcanes à longues chaines[233] et serait aussi très

proche de EtaA, dont les capacités biocatalytiques sont limitées.

Pour cette raison, nous avons finalement sélectionné les six autres enzymes pour

notre étude, deux chez A. baylyi correspondants aux gènes ACIAD 1733 et ACIAD 2339

et quatre chez A. baumannii (gènes ABAYE 2056, ABAYE 2606, ABAYE 2614, ABAYE 2617)

* Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J. Mol Biol. 1990;215(3):403-410.

93

en privilégiant la présence de contexte génomique proche de celui de CHMOAcineto pour

quatre d’entre elles. Toutes les six enzymes sont annotées comme des monooxygénases à

flavine, présentent les deux signatures des BVMOs, et ont au moins 26% d’identité de

séquence avec CHMOAcineto , 34 % avec HAPMO, 40% avec CHMORhodoRHA1 et seulement 20%

avec la BVMO d’A. radioresistens.

Les similarités de séquences de ces enzymes avec CHMO, HAPMO et entre elles sont

décrites dans le Tableau 17. Les numéros d’accession des protéines ou des gènes

correspondants sont ceux utilisés par la base de donnée « Uniprot ». Nous avons nommé

ces enzymes pour plus de commodité comme montré Tableau 17.

Figure 38 : Scores des alignements de séquences

protéiques de A. baumannii AYE avec CHMOAcineto

Figure 39 : Scores des alignements de séquences

protéiques de A. baylyi ADP1 avec CHMOAcineto

Espèces Gènes Annotation Signature

1

Signature

2

Contexte

génomique

A. baumannii

ABAYE 0435 ABAYE 1825 ABAYE 2056

ABAYE 2606 ABAYE 2614

ABAYE 2617

MO (dégradation d’alcane)Flavine MO putative Flavine MO putative

Flavine MO putative Flavine MO putative

Flavine MO putative

+ + +

+

+

+

+ + +

+

+

+

- - -

+

+

+

A. baylyi ADP1

ACIAD 1733

ACIAD 2339

ACIAD 2794

ACIAD 3192

Flavine MO putative

Flavine MO putative

Flavine MO putative

MO (dégradation d’alcane)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

Tableau 16 : BVMOs putatives de A. baumannii et A. baylyi

MO : Monooxygénase ; Signature 1 : FxGxxxHxxxW ; Siganture 2 : [A/G]GxWxxxx[F/Y]P[G/M]xxxD)

Nom Nom ou n°

d’accession CHMOAcineto ACIAD 1 ACIAD 2 ABAYE 1 ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4 BVMOAradio

Nb acides

aminés 543 509 503 502 516 507 510 496

CHMOAcineto P12015 100 28 30 30 26 26 32 22

HAPMO hapE 22 34 32 33 31 33 36 23

BVMOAradio AD7PBN2 22 24 22 22 23 24 24 100

CHMORhodoRHA1 C0STX7 55 46 36 37 45 47 40 23

ACIAD1 ACIAD 1733 28 100 36 36 74 80 36 24

ACIAD2 ACIAD 2339 30 36 100 78 35 36 43 22

ACIAD 2794 22 16 17 17 20 18 18 45

ACIAD 3192 22 20 20 19 20 20 18 77

ABAYE1 ABAYE 2056 30 36 78 100 35 36 44 22

ABAYE2 ABAYE 2606 26 74 35 35 100 82 34 23

ABAYE3 ABAYE 2614 26 80 36 36 82 100 34 24

ABAYE4 ABAYE 2617 32 36 43 44 34 34 100 24

ABAYE 0435 23 36 18 20 18 18 17 77

ABAYE 1825 23 17 17 17 16 17 17 45

Tableau 17 : Pourcentages de similarité (calculés après alignement avec le logiciel Clustal Omega en utilisant les paramètres par défaut du logiciel)

95

L’analyse des gènes de ces enzymes a révélé que ceux d’ABAYE 2, ABAYE 3 et ABAYE

4 d’A. baumannii et ACIAD 1 d’A. baylyi sont dans un contexte génomique proche de celui de

la CHMOAcineto (Figure 40). ABAYE 2, ABAYE 3 et ACIAD 1 forment un groupe présentant 80%

d’identité de séquence. Leur cluster de gènes consiste en quatre gènes, qui codent

respectivement pour un régulateur de transcription (R), une hydrolase, une déshydrogénase,

et une BVMO. Ce cluster porte en plus pour ABAYE 3 et ACIAD 1 un gène codant pour une

transférase, localisé après celui de la BVMO. ABAYE 4 a seulement environ 35% d’identité

avec les enzymes du groupe précédent; son gène est localisé directement après le gène

régulateur et est suivi successivement par trois gènes codant pour une hydrolase, une

déshydrogénase et une oxydase. ACIAD2 et ABAYE1 forment aussi un groupe avec 78% de

similarité de leur séquence protéique mais leur gène ne montre pas de contexte génomique

particulier.

Figure 40 : Co te te g o i ue d’ABAYE , ABAYE , ABAYE et d’ACIAD

Les séquences consensus caractéristiques des BVMOs ont été retrouvées chez les six

nouveaux candidats et chez CHMOAcineto, HAPMO (Pseudomonas fluorescens) et CHMORhodoRHA1

(Figure 41). Un alignement complet se trouve Annexe II.

96

Figure 41 : Alignement des séquences partielles (environ les deux cents premiers résidus) des six BVMOs des

deux souches d’Acinetobacter étudiées dans ce travail et de trois autres BVMOs, CHMORhodoRHA1, HAPMO et

CHMOAcineto u e o d’a essio P .

Un arbre phylogénétique a été tracé afin de situer les BVMOs de ces souches

d’Acinetobacter parmi les BVMOs connues. On repère facilement des similitudes entre elles

mais aussi avec d’autres BVMOs (Figure 42). Ainsi les six enzymes que nous avons

sélectionnées se situent sur la même branche que CHMORhodoRHA1 88 et que plusieurs HAPMOs,

tandis que les quatre autres, non retenues, sont plus proches de EtaA et de la BVMO d’A.

radioresistens 233, a priori moins intéressantes du point de vue de la synthèse.

Sign. 1

Sign. 2

Rossman fold

Rossman fold

97

Figure 42 : Arbre phylogénétique construit avec iTol après alignement des séquences avec Clustal Oméga.

C. Construction des souches

Les souches E. coli BL21 produisant les six BVMOs putatives ont été construites par J.L.

Petit sous la direction de V. de Bérardinis (Génoscope). La technique de « ligation independant

cloning » (LIC ) a été utilisée pour le clonage selon la procédure décrite par Vergne-Vélaire234.

Les gènes ont été clonés dans le plasmide pET(22b)+ et exprimés chez E. coli BL21(DE3) sous

le contrôle du promoteur T7 induit par l’IPTG. Ces souches seront nommées par commodité

selon la codification suivante : E. coli BL21 « nom de l’enzyme ».

III. Choix et obtention des composés testés

Nous explorerons rapidement le profil de substrats de nos six enzymes puis nous nous

focaliserons sur la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one 1, sur une série de cyclobutanones -

substituées 4a - 11a et sur une série de cycloalcanones α-substituées 12a – 16a. Les raisons

de notre choix ont été détaillées en partie bibliographique et seront brièvement rappelés ici.

98

Elles sont gouvernées par l’intérêt des lactones obtenues en ce qui concerne les

cyclobutanones et la recherche de substrats de Dédoublements Cinétiques Dynamiques pour

les autres alcanones.

A. La bicyclohepténone

Cette réaction de BV sur la bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one est importante à plusieurs

titres : i) elle donne accès à deux lactones d’intérêt qui interviennent comme intermédiaires

de synthèse de composés naturels variés, ii) elle a été le modèle d’un type de réactions

rationalisé depuis sous le nom de Dédoublement Cinétique Parallèle Regiodivergent (DCPR,

Figure 43) 83, et surtout iii) elle est devenue la réaction de référence de toute étude , chimique

ou enzymatique, de la réaction de BV asymétrique.

Figure 43 : Produits possibles de la réaction de BV sur la bicyclohepténone racémique.

Des exemples ont été rassemblés Tableau 4 p45. On y voit que tous les cas de figure

sont possibles : obtention de la lactone normale 2* (BVMOMO14 de R. jostii)88, ou de la lactone

anormale 3 (C. echinulata)87, ou des deux régioisomères 2 et 3 simultanément (CHMOAcineto)

en proportion et ee variable 21,22. Les configurations absolues généralement obtenues dans les

nombreux travaux réalisés sur ce substrat sont identiques à celles obtenues avec CHMOAcineto.

La bicyclo[3.2.0]hept-2-èn-6-one est un composé commercial que nous utiliserons après

distillation afin d’éliminer la lactone normale racémique susceptible de se former

spontanément au contact de l’air.

* identique à celle formée par voie chimique c-à-d avec insertion de l’atome d’oxygène entre le groupe carbonyle et l’atome de carbone le plus substitué

99

B. Les cyclobutanones prochirales -substituées

Des travaux précédents réalisé au laboratoire65, 107 ont montré que l’oxydation de BV

microbiologique des cyclobutanones -substituées prochirales est une voie de synthèse

efficace des ƴ-butyrolactones chirales -substituées (Tableau 3 et Tableau 9).

Nous testerons pour notre part la série de cyclobutanones -substituées représentée

ci-dessous, composée de cyclobutanones aliphatiques, phényliques et benzyliques

précédemment synthétisées dans le laboratoire.

Schéma 13 : S ie de lo uta o es β-substituées testées avec les six nouvelles BVMOs.

C. Les cyclopentanones et cyclohexanones α-substituées

Plusieurs BVMOs ont démontré leur très grande énantiosélectivité, lors de

dédoublement cinétique, avec une gamme de cyclopentanones et cyclohexanones portant en α

du groupe carbonyle des chaines diversement fonctionnalisées88, 235,236,237. Ces réactions

conduisent à des -valéro- et -caprolactones chirales qui interviennent comme synthons

chiraux dans la synthèse d’innombrables produits aux activités biologiques variées (antiviraux,

antibiotiques)238,239,240,241. Elles sont aussi à l’origine des notes aromatiques fruitées de

nombreux produits alimentaires242,243.

Ces molécules présentent l’avantage d’être racémisables via un équilibre céto-énolique

et sont potentiellement intéressantes pour des essais de DCD. En effet, parmi les différentes

méthodes de racémisation que nous venons de voir dans la partie bibliographique, la plus

appropriée aux cétones, donc la plus facilement adaptable aux réactions de BV, est sans aucun

100

doute celle impliquant un tel équilibre. Ce constat a donc orienté notre choix vers des cétones

α-substituées et plus particulièrement vers les cyclohexanones. En effet, ces cétones sont

apparues comme une cible de choix pour la mise au point de nouvelles conditions de

racémisation car elles sont plus difficiles à racémiser que les cyclopentanones, pour lesquelles

plusieurs exemples de DCD ont déjà été décrits219,220.

Choix des cycloalcanones α-substituées

Nous avons choisi comme substrats à tester la 2-benzyloxymethyl cyclopentanone 12a,

et les quatre cyclohexanones 13a-16a substituées respectivement par des groupes

benzyloxyméthyle, phényle, cyanoéthyle et allyle (Schéma 14).

Schéma 14 : S ie de loal a o es α-substituées.

Comme nous l’avons décrit dans la partie bibliographique de ce manuscrit, la

cyclopentanone 12a est racémisable soit à pH basique, soit en présence de résines anioniques

moyennement basiques. Elle a été ainsi l’objet de deux DCD réussis avec des cellules entières

de E. coli TOP10[pQR239] produisant la CHMOAcineto. Le groupe protecteur benzyle peut être

facilement enlevé par hydrogénation (réduction)244,245 et la lactone hydroxylée résultante est

un intermédiaire réactionnel potentiellement intéressant. Par exemple, la lactone de

configuration (S) (Figure 44) a été utilisée par Corey pour la synthèse totale de leucotriene

B5 246, alors que son énantiomère opposé, de configuration (R), a permis la synthèse de certains

composés tels que la constanolactone247 et des phéromones sexuelles de moustique248.

101

Figure 44 : Intérêt synthétique de la lactone hydroxylée provenant de la cyclopentanone 12.

La comparaison des cétones 12a et 13a nous donnera des informations sur l’effet de la

nature du cycle, sur la capacité de racémisation et sur l’énantiosélectivité des réactions.

La cétone 14a a été choisie pour deux raisons : sa transformation par CHMOAcineto est

très énantiosélective88 et la présence d’un groupement phényle devrait faciliter sa

racémisation, un point essentiel pour les DCD. La présence d’un groupe fonctionnel versatile

en bout de chaine pour les cyclohexanones 15a et 16a permet un accès aisé à de nouveaux

composés et fait de ces cétones des composés pivots pour la synthèse. Ainsi, la fonction nitrile

est facilement transformée en amide, amine, acide ou cétone (Figure 45).

Figure 45 : Diversité de groupes fonctionnels dérivant de la fonction nitrile de la cétone 15.

Notre objectif est d’identifier de nouveaux couples cétone/BVMO permettant des

dédoublements cinétiques efficaces, affichant si possible une énantiocomplémentarité avec

les enzymes existantes.

102

Obtention des cycloalcanones

Les cétones 14a, 15a, et 16a sont commerciales. Nous avons synthétisé les cétones 12a

et 13a en quatre étapes à partir du cétoester de Dieckmann correspondant. La fonction

cétone a été protégée par un cétal, puis l’ester a été réduit en alcool249, avant de protéger ce

dernier par un groupement benzylique. Le cétal est finalement hydrolysé avec une résine

acide250 pour donner les cétones attendues (Figure 46).

Figure 46 : Synthèse des cétones 12a et 13a.

Le rendement de chaque étape ainsi que le rendement global de synthèse de chaque

cétone sont regroupés dans le tableau ci-dessous.

Cétones Etape 1

rdt (%) Etape 2

rdt (%) Etape 3

rdt (%) Etape 4

rdt (%) Rdt global (%)

12 91 % 71 % 66 % 61 % 26 %

13 82 % 65 % 73 % 75 % 29 %

Synthèse des lactones racémiques

Les lactones racémiques correspondantes aux cétones choisies ont été synthétisées

classiquement par réaction de Baeyer-Villiger chimique avec de l’acide méta-

chloroperbenzoique (MCPBA) 2. Elles sont nécessaires comme produits de référence pour

l’analyse chirale. Certaines ont été également préparées en plus grande quantité pour étudier

leur stabilité dans les conditions de DCD. Le rendement de chaque lactone formée est indiqué

dans le Tableau 18.

103

Cétones Rdt lactone (%)

12 (n=1, R=benzyloxymethyl) 86 %

13 (n=2, R=benzyloxymethyl) 77 %

14 (n=2, R=phényl) 83 %

15 (n=2, R=cyanoéthyl) 82 %

16 (n=2, R=allyl) 71 %

Tableau 18 : Synthèse des valéro- et caprolactones racémiques

IV. Etudes des conditions de culture

Dans cette partie nous détaillerons l’étude des conditions de culture et de bioconversion

des souches utilisées et la mise au point des mesures d’activité enzymatique. Deux systèmes

de surexpression dans E. coli. ont été utilisés dans ce travail:

1) dans la souche E. coli BL21 (DE3), un système utilisant un vecteur pET(22b)(+) modifié

sous le contrôle du promoteur T7 234; l’IPTG ou le lactose servant d’inducteur et le glycerol

de source de carbone.

2) dans la souche E.coli TOP10, un système utilisant le vecteur pBad sous le contrôle du

promoteur araBAD35, l’arabinose servant d’inducteur et le glycérol comme source de carbone.

A. Tests d’activité

1) Sur un enzyme purifiée ou un extrait cellulaire

La mesure de l’activité enzymatique du biocatalyseur lorsqu’il est sous forme d’enzyme

libre consiste à suivre par spectrométrie UV à 340 nm la consommation, par une enzyme

purifiée ou un extrait cellulaire, du NADPH ajouté au milieu et en présence de la cétone. Ce

test est connu depuis longtemps mais a été adapté (en collaboration avec T. Reignier, un

étudiant en doctorat) afin de limiter des biais possibles (influence du co-solvant, réactions

parasites, etc…) et de l’étendre à une utilisation en format 96 puits pour un futur criblage

haut débit. Dans notre cas, le test se fait en cuve UV de 1 mL en utilisant de l’acétonitrile

comme co-solvant.

104

2) Sur des cellules entières

La mesure de l’activité enzymatique du biocatalyseur constitué de cellules de E. coli

TOP10 produisant la CHMOAcineto a précédemment été mise au point au laboratoire129,251. Elle

est mesurée par quantification de la biotransformation de la bicyclohepténone. Cette réaction

est parfaitement adaptée à cet usage car elle est rapide et facile à suivre par CPG. Des

prélèvements réguliers sont effectués dans des fioles de 500 mL remplies avec 10 mL du milieu

de culture et 10 mL d’une solution tampon à un pH 7. L’activité du biocatalyseur est définie par

la vitesse d’apparition des lactones en début de réaction (partie linéaire de la courbe). Ces

activités ne sont évidemment que des activités apparentes et concernent le biocatalyseur (ici

des cellules entières). Elles résultent de l’activité de l’enzyme surexprimée, mais aussi de la

vitesse de recyclage du NADPH endogène, et de la vitesse de diffusion du substrat et du produit

à travers les membranes cellulaires. On distinguera :

- l’activité volumétrique apparente ‘’Av’’, correspondante à la quantité de lactones

formées par minute par volume du milieu, exprimée en µmol/ min/ L (ou U/L).

- l’activité spécifique apparente ‘’As’’, correspondante à la quantité de lactones formées

par minute et par g de poids sec de cellules, exprimée en µmol/ min/ g p.s. (ou U/ g p.s.)

La mesure de l’activité des cellules de E. coli BL21 s’est effectuée dans un premier temps

en utilisant le substrat de référence, la bicyclohepténone. Ce composé a ensuite été remplacé

par la 2-undécanone, plus active avec les nouvelles BVMOs.

B. La souche E. coli CHMO TOP10[pQR239]

La souche E. coliTOP10 [pQR239], portant le vecteur pBad, le promoteur araBAD et le

gène de la CHMOAcineto, a été construite par Ward 35. Elle présente l’avantage d’utiliser

l’arabinose, moins onéreux que l’IPTG, et a fait preuve de son efficacité lors de plusieurs

expériences de scale up 151,148. Le biocatalyseur, formé des cellules entières de cette souche,

est remarquable car il peut se conserver à +4°C pendant plusieurs semaines avec une perte

d’activité raisonnable ce qui permet de le stocker facilement252. Il sera surtout utilisé dans la

seconde partie de ce travail, lors de la mise au point de DCD.

Dans la suite de ce manuscrit, cette souche sera nommée E. coli TOP10 CHMO.

105

1) Conditions de culture

La culture de E. coli TOP10 [pQR239] a été optimisée pour un fermenteur de 10L. Elle

est réalisée dans un milieu de culture à base de peptone de soja, d’extrait de levure et de

glycérol à 37°C. Le pH est régulé à une valeur de 7. L’inducteur utilisé est le L-(+)-arabinose à

la concentration de 0,1%. Pour avoir une activité optimale, il est nécessaire d’induire à un

moment où la biomasse cellulaire est importante. L’induction a donc lieu en cours de phase

exponentielle de croissance lorsque la DO à 590nm atteint environ la valeur de 6 (Graphique

1). La culture est alors poursuivie de 1 à 2h et les cellules sont conservées telles quelles à

+4°C.

Graphique 1 : Croissance typique de E. coli TOP10 CHMO en fermenteur (flèche en jaune indique le temps

d’i du tio .

2) Conservation de l’activité après stockage à 4°C

Les cellules stockées à +4°C conservent après deux semaines une activité BVase

considérable, avec une perte de 40-50% seulement par rapport aux cellules fraiches

(Graphique 2). Elles restent alors utilisables en fonction des substrats à étudier et de leurs

vitesses de biotransformation. Nous avons donc décidé de conserver cette souche après

culture et de l’utiliser au fur et à mesure de nos besoins. Dans certains cas, la concentration

des cellules a été augmentée afin de compenser la perte d’activité ainsi induite.

0

20

40

60

80

100

0123456789

10

0 1 2 3 4 5

PO2(%

)

DO e

t pH

temps (h)

DOpHpO2

106

Graphique 2 : Activité en fonction du temps de conservation à +4°C de la souche E. coli TOP10 CHMO.

3) Conditions de biotransformations

Le but de l’étude qui suit n’était pas une optimisation des conditions de bioconversion.

Nous nous sommes simplement attachés à vérifier l’importance de certains paramètres comme

le pH ou la température car ils sont susceptibles d’avoir une influence importante sur la

deuxième partie de notre travail, à savoir les DCD.

Milieu de culture ou milieu minéral minimal ?

Compte–tenu de certains résultats contradictoires de la littérature portant les

résultats obtenus avec des cellules au repos ou dans leur milieu de culture, nous avons comparé

l’activité de cellules dans ces deux conditions. Pour éviter tout biais du à une différence de

pH ou à la présence d’ions phosphate et Na+, nous avons dans chaque cas ajouté une solution

de tampon phosphate à pH 7. Ainsi, des cellules fraiches et leur milieu de culture ont été

diluées d’un facteur deux avec une solution de tampon phosphate à 0,5M tandis le même volume

de culture a été centrifugé et les cellules resuspendues dans une solution de tampon phosphate

à 0,25M. Le Graphique 3 montre que l’activité est plus importante dans le premier cas, lorsque

du milieu de culture est présent. De ce fait, nous procèderons à partir de cellules dans leur

milieu de culture et non en « resting cells ».

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

40

50

0 5 10 15

Act

ivité s

pécifiqu

e r

elative

(%)

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U/

g p.

s.)

durée de conservation (jours )

As

As relative

107

Graphique 3 : Activité en fonction du milieu cellulaire de la souche E. coli TOP10 CHMO.

Effet de la température :

Bien que la température de la culture soit optimale à 37°C, les cellules montrent une

meilleure activité à 30°C (Graphique 4), une température qui permet en outre de limiter l’effet

d’évaporation du substrat et du milieu, ainsi que de favoriser la solubilité du substrat.

Graphique 4 : Activité en fonction de la température de la souche E. coli TOP10 CHMO.

Effet de pH :

Lors une étude cinétique de cette enzyme avec la cyclohexanone 44, il a été montré que

l’intermédiaire réactionnel principal, la peroxyflavine, est en équilibre avec sa forme protonée

l’hydroperoxyflavine, qui elle-même n’est pas réactive avec la cyclohexanone. Cet équilibre est

contrôlé par le pH du milieu intracellulaire, l’intermédiaire actif définissant la vitesse du cycle

catalytique.

Dans notre cas, travaillant avec des cellules entières et étant incapables de contrôler le

pH du milieu intracellulaire, nous avons étudié l’effet du pH extracellulaire sur le

comportement de nos cellules. Le pH du milieu variant durant la biotransformation (formation

0

10

20

30

40

50

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U/

g p.

s.)

0

5

10

15

20

25°C 30°C 37°C

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

. s.)

108

d’acides par les cellules) et étant difficile à contrôler lors de biotransformation en fioles,

nous avons choisi d’ajouter du tampon phosphate à 0,25M dans le milieu afin de stabiliser le

pH. En effet, aucune réaction de BV n’est observée pour un pH de 6, ce qui se produit

quelquefois en fin de culture. Nous avons donc determiné le pH optimum de la transformation.

Le Graphique 5 montre que l’activité des cellules est maximale pour une valeur de pH comprise

entre 7,5 et 8.

Graphique 5 : Activité en fonction du pH du milieu de biotransformation de la souche E. coli TOP10 CHMO.

Concentration des cellules :

Il a été précédemment montré au laboratoire que l’oxygénation du milieu est un

paramètre fondamental pour la réussite des réactions de BV avec des cellules entières. En

effet, l’oxygène est utilisé en priorité pour le métabolisme cellulaire, le surplus servant alors

à la bio-oxydation par les BVMOs253. Ainsi, paradoxalement, les résultats de la

biotransformation peuvent être meilleurs avec moins de cellules et donc une plus faible

quantité d’enzymes mais avec une meilleure répartition de l’utilisation de l’oxygène, comme

nous l’avons montré sur le Graphique 6. L’oxygénation est spécifique de chaque système de

bioréacteur et dépend de la géométrie de la fiole ou du fermenteur du bioréacteur, du volume

de milieu, de l’agitation, éventuellement du débit d’air. Ainsi, dans les conditions de nos

mesures d’activité, c’est-à-dire dans des fioles de 250 mL remplies à 20 mL, agitées

longitudinalement à raison de 200cpm, le meilleur compromis, en d’autre terme la meilleure

activité volumétrique, correspond à une concentration en cellules de 2,8 g poids sec par litre

(ou une densité optique à 590 nm de 6).

0

10

20

30

40

PH=7 PH=7,5 PH=8 PH=8,5

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

. s.)

109

Graphique 6 : Activité en fonction de la concentration en cellules de la souche E. coli TOP10 CHMO.

En résumé

Typiquement, une culture de la souche E. coli CHMO TOP10 est préparée dans un

fermenteur de 5 ou 10L. Les cellules sont stockées à 4°C jusqu’à deux semaines et utilisées au

fur et à mesure des besoins. Les biotransformations sont effectuées à pH 8 et à 30°C. Les

concentrations en substrat sont inférieures ou égales à 0.5 g/L pour éviter les phénomènes

d’inhibition ou de toxicité tandis que les concentrations en cellules sont de l’ordre de 2,8 g

poids sec/L. Du milieu de culture frais et une solution tamponnée sont ajoutées une demi-

heure avant d’effectuer une biotransformation ou de tester leur activité.

C. Les souches E. coli BL21(DE3) recombinantes

Dans un premier temps, nous avons choisi la souche E. coli BL21 produisant ABAYE 3

pour étudier les conditions de culture et de bioconversion avec ce microorganisme-hôte, en

faisant l’hypothèse d’un comportement identiques des autres souches de E. coli BL21. Nous

voulions également comparer les conditions de culture des deux bactéries E. coli BL21 et E.

coli TOP10.

1) Conditions de culture

L’activité a été mesurée, à l’échelle de 20 mL, par quantification des lactones formées

à partir du substrat de référence habituel, la bicyclohepténone.

Quatre cultures ont été effectuées simultanément à 23°C. Deux ont été induites après

5h de croissance, deux après 16h pour des durées variables (Graphique 7). La meilleure

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5Act

ivité

[cellules] (g p.s./L)

Av (U/ L milieu)As (U/ g p.s.)

110

activité d’ABAYE 3 a été obtenue après une durée de culture de 5h et d’induction de 20h à

23°C.

Graphique 7 : Activité en fonction de la durée de la ultu e et d’i du tio de la souche E. coli BL21 ABAYE3 avec

la bicyclohepténone.

Le gel d’électrophorèse (Figure 47) montre que les six souches produisent les enzymes

attendues bien que ACIAD1 et ACIAD2 semblent en concentration plus faible.

Figure 47 : Electrophorèse des souches de E. coli BL21 produisant les BVMOs ABAYE et ACIAD (révélation au bleu

de Coomassie). Les souches ont été cultivées pendant 5h à 23°C avant induction au lactose pour 20h à 23°C. Les

BVMOs o t u e taille d’e vi o kD. (a) avant et (b) après induction pour la souche ABAYE4.

0

2

4

6

8

10

0

5

10

15

20

25

30

DO

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U/

g p.

s.)

As

DO

111

2) Conservation de l’activité

Contrairement à la souche E. coli TOP10 CHMO qui garde une activité importante après

deux semaines de conservation à +4°C, la souche d’E. coli BL21 a montré une baisse de 35% de

son activité après 8h de conservation dans les mêmes conditions et de 90% après 24h

(Graphique 8). Nos biotransformations seront donc systématiquement effectuées avec des

cellules fraiches, directement après l’arrêt de la culture.

Graphique 8 : Activité en fonction du temps de conservation de la souche E. coli BL21 ABAYE3 avec la

bicyclohepténone (DO=6).

3) Mise au point des conditions de biotransformation

A ce stade de notre travail nous avons changé de substrat de référence et de souche

pour mesurer l’activité enzymatique. Nous utilisons maintenant une cétone linéaire, la 2-

undécanone 17, avec l’enzyme ABAYE4. Ce substrat commercial est facilement suivi par

analyse CPG, et généralement transformable par ABAYE4 en acétate de nonyle 18 (Schéma

15) en un temps plus court que la bicyclohepténone (2h vs 4-6h). Ceci nous a permis de

contrôler les activités enzymatiques à la fin de chaque culture et de faciliter la détermination

des conditions optimales de biotransformation.

Schéma 15 : Biotransformation de la 2-undécanone par la souche BL21 ABAYE4.

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20 25 30

Act

ivité s

pécifiqu

e r

elative

(%)

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U/

g p.

s.)

Durée de conservation (heures)

AsAs relative

112

Nous avons étudié certains paramètres susceptibles de d’améliorer l’activité des cellules

et qui avaient été identifiés précédemment avec E. coli TOP10 CHMO.

Effet du pH

Le pH est contrôlé avant biotransformation par l’ajout d’une solution de tampon

phosphate (0,1 M) au milieu cellulaire. L’activité des cellules est optimale à pH 7 (Graphique

9). A noter l’écart d’activité avec le milieu en fin de culture (où le pH, non ajusté, est de 6,3).

Graphique 9 : Activité en fonction du pH des cellules entières de E. coli BL21 ABAYE4 avec la 2-undécanone

(DO=18).

Concentration en cellules

Les résultats présentés sur le Graphique 10 montrent que l’activité de E. coli BL21

produisant l’ABAYE4 sur l’undécanone, qu’elle soit volumétrique ou spécifique, est beaucoup

plus faible que celle obtenue avec les cellules de E . coli TOP10 CHMO sur la bicycloheptènone

(environ 6 U/g p.s. contre environ 35 U/g p.s.) (Graphique 6). De plus, contrairement aux

observations précédentes avec E. coli TOP10, l’activité spécifique est stable sur la plage de

concentration cellulaire considérée. Une interprétation possible est que le métabolisme de E.

coli BL21 à ce stade de croissance (phase stationnaire), n’a pas les mêmes exigences en

oxygène que E. coli TOP10 conservé à +4°C et remis sous agitation. Il n’y a donc pas pénurie

d’oxygène au détriment de la réaction de BV.

0

2

4

6

8

10

12

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

.s.)

113

Graphique 10 : Activité en fonction de la concentration en cellules des cellules entières de E. coli BL21 ABAYE4

avec la 2-undécanone.

Effet d’inhibition par le substrat

Une baisse d’activité des cellules est observée lorsque la concentration du substrat est

augmentée. Le phénomène d’inhibition par le substrat se fait sentir nettement entre 0,5 et 1

g/L A 3 g/L, l’activité a diminué de 70% (Graphique 11).

Graphique 11 : Activité en fonction de la concentration en substrat des cellules entières de E. coli BL21 ABAYE4

avec la 2-undécanone (DO=18).

En résumé

Nous avons finalement retenu les conditions standard suivantes qui seront utilisées

pendant une grande partie de notre travail en conditions analytiques : la culture des souches

de E. coli BL21 durera 24h à 23°C et sera induite après 5h avec du lactose à la concentration

de 2,5%. Les cellules seront directement utilisées en bioconversion à la même température

après l’ajout de 10% (v/v) d’une solution de tampon phosphate pH 7 en concentration finale de

0,1 M, cette solution étant destinée à maintenir le pH du milieu. Leur activité sera contrôlée

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20Act

ivité

DO

Av (U/ L milieu)As (U/ g p.s.)

02468

101214

0 1 2 3 4

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

.s.)

[2-undécanone] (g/L)

114

avec la 2-undécanone, en parallèle avec les biotransformations étudiées. La concentration en

substrat sera de 0,5 g/L.

V. Expression du gène de ABAYE 4 dans E. coli TOP10 [pBAD]

La production des BVMOs par E. coli BL21 est plutôt faible et l’activité ne peut être

conservée. Nous avons voulu exprimer le gène d’ABAYE4 dans E. coli TOP10 afin de voir si

l’expression serait meilleure et si la stabilité du biocatalyseur E. coli TOP10 CHMO provenait

de la souche choisie et de son système d’expression ou dépendait de l’enzyme elle-même.

Nous avons tenté d’augmenter son niveau d’expression en utilisant le nouveau E.

coliTOP10 [pBAD/Myc-His B], inductible par le L-arabinose. Nous avons construit le vecteur

avec succès et nous avons ainsi étudié avec la nouvelle souche ses conditions optimales de

culture et de bioconversion.

A. Construction du vecteur

Nous avons inséré le gène d’ABAYE 4 directement dans le plasmide pBAD/Myc-His B.

L’ADN plasmidique d’ABAYE 4 est extrait d’E. coli BL21 et une PCR est réalisée avec deux

amorces digérables par les enzymes de restriction SacI et KpnI. Par double digestion du

produit de PCR et du plasmide pBAD natif (au niveau de son site de clonage), les deux

fragments digérés forment le plasmide ligué qui est ensuite transformé dans E. coli TOP10.

La présence de l’insert a été vérifiée sur les bactéries transformées par séquençage du nouvel

ADN plasmidique ABAYE 4 – pBAD obtenu.

B. Mise au point des conditions de culture

Les deux souches ont été cultivées sur milieu Terrific Broth (TB) à 30°C jusqu’à une DO

de 5, la température a alors été abaissée à 23°C et l’induction effectuée. Les suivis de DO et

pH sont reportés sur le Graphique 12. L’évolution de ces deux paramètres est semblable avec

les deux cultures. Le pH du milieu est généralement un indice de survie des cellules, et son

contrôle est nécessaire pour le bon fonctionnement cellulaire. Le pH se maintient à environ

7,2 puis augmente légèrement jusqu’à 8 en fin de culture. La DO augmente régulièrement pour

atteindre une valeur de 20 à l’arrêt de la culture, indiquant une bonne croissance des cellules.

115

Graphique 12 : Suivis (DO et pH) des deux cultures produisant ABAYE4, chez E. coli BL21 et E. coli TOP10 (la

flèche jaune indique le moment de l’i du tio .

Nous avons étudié l’influence de la durée après induction sur la production d’enzyme et

l’activité des deux biocatalyseurs.

Des prélèvements dans les cultures de E. coli TOP10 et BL21 effectués régulierement

après l’induction ont permis d’estimer par la technique du Western-Blot la production relative

de l’enzyme au cours du temps. Dans le cas de E. coli TOP 10, on voit qu’elle est produite avec

un maximum aux alentours de 1h30 – 2h après induction puis se dégrade rapidement (Figure

48). Dans le cas de BL21, la quantité d’enzyme est maximale à partir de 2h puis reste stable

dans le temps pendant 20h environ (Figure 49).

L’activité a été mesurée directement sur des prélèvements de cellules avec le substrat-

test, la 2-undécanone à 0,5 g/L. La densité cellulaire étant très élevée, nous avons dilué par

un facteur deux certains de ces prélèvements afin de vérifier si les cellules étaient

suffisamment aérées pour permettre la réaction de BV. Nous observons que l’activité des

cellules augmente chez les deux souches d’une façon remarquable en diluant le milieu cellulaire

(en violet Graphique 13) et atteint des valeurs comparables contrairement à ce qui avait été

observé avec E. coli ABAYE3. L’activité d’E. coli TOP10 devient très faible à la 19ème heure,

contrairement à celle de E. coli BL21 qui est la meilleure à ce moment-là. Les meilleures

activités de E. coli TOP10 ont été obtenues dans cette expérience pour une DO de 5 entre 4

et 6 h après induction.

0

2

4

6

8

10

12

14

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

pHDO

temps (h)

DO TOP10 DO BL21

pH TOP10 pH BL21

116

Figure 48: Production de ABAYE 4 chez E. coli TOP10 ap s diff e tes du es d’i du tio . Analyse Western

Blot avec révélation par chimioluminescence pour une quantité de cellules équivalente dans chaque

échantillon.

Figure 49 : Production de ABAYE 4 chez E. coli BL21 ap s diff e tes du es d’i du tio . Analyse Western Blot

avec révélation au DABA/H2O2 pour une quantité de cellules équivalente dans chaque échantillon.

L’influence de l’âge de la culture au moment de l’induction a aussi été examinée pour E.

coli TOP10 (Graphique 13 et Graphique 14). L’activité est mesurée après dilution de chaque

échantillon de manière à obtenir une DO de 5. Elle est maximale pour des cellules prélevées

au milieu de la phase exponentielle de croissance et pour une durée d’induction courte (2h)

tandis qu’elle chute rapidement si la durée d’induction est longue (19h) ou si les cellules ont

été prélevées en fin de phase exponentielle.

117

E. coli TOP10 ABAYE4 E. coli BL21 ABAYE4

Graphique 13 : Effet de la du e d’i du tio et de la dilutio su l’a tivit des deux souches produisant ABAYE

4 : E. coli TOP10 (à gauche), E. coli BL21 (à droite).

E. coli TOP10 ABAYE4

Graphique 14 : Activité de la souche TOP10 produisant ABAYE4. Effet de la durée de la culture avant induction

(à gauche) pour des cellules ayant été soumises à une induction de 2h. Effet de la du e d’i du tio à droite)

pour des cellules ayant poussé 6h avant induction

Nous avons comparé la capacité des deux souches à conserver leur activité lorsqu’elles

sont stockées à + 4°C (voir ci-dessous). Leurs conditions de culture sont identiques, seules les

durées d’induction varient : deux heures pour E. coli TOP10 ABAYE 4 et seize heures pour E.

coli BL21 ABAYE 4. Dans les deux cas, nous observons une bonne conservation de l’activité,

mesurée avec la 2-undécanone, après 24 heures.

0

5

10

15

20

25

0

1

2

3

4

5

6

1 2 4 6 19

DO

Act

ivit

é vo

lum

. / D

O

Durée d'induction (h)

Activité sans dilutionActivité après dilutionDO avant dilutionDO après dilution

0

5

10

15

20

25

0

1

2

3

4

5

6

1 2 4 6 19

DO

Act

ivit

é vo

lum

. / D

O

Durée d'induction (h)

Activité avant dilutionActivité après dilutionDO avant dilutionDO après dilution

0

5

10

15

20

25

0

1

2

3

4

5

6

4 6 18

DO

Act

ivit

é vo

lum

. / D

O

Durée de la culture (h)

Activité sans dilutionActivité après dilutionDO avant dilutionDO après dilution

0

5

10

15

20

25

0

1

2

3

4

5

6

+ 2h + 19h

DO

Act

ivit

é vo

lum

. / D

O

Durée d'induction (h)

Activité sans dilutionActivité avec dilutionDO avant dilutionDO après dilution

118

Co pa aiso des a tivit s des sou hes E. oli TOP et E. oli BL p oduisa t ABAYE . Les esu es d’a tivit sont effectuées à une DO ramenée à 5 pour les deux souches.

Conclusion

Le clonage du gène d’ABAYE4 dans E. coli TOP10[pBAD] a été effectué avec succès.

Nous disposons donc de deux microorganismes recombinants produisant cette enzyme, E. coli

TOP10 ABAYE4 et E. coli BL21 ABAYE4. Des différences notables ont été observées dans les

durées d’induction optimales à appliquer à chaque souche mais les activités mesurées sur les

cellules entières sont du même ordre, à la fin de la culture comme après stockage à +4°C. Ceci

ne permet donc pas de privilégier pour l’instant l’une ou l’autre souche. La contradiction

observée avec la souche E. coli BL21 ABAYE3, inactive après 24h à +4°C, vient probablement

d’une instabilité de l’enzyme plutôt que de la souche elle-même. Dans la suite de ce travail,

nous utiliserons les souches E. coli BL21 immédiatement après l’arrêt de leur culture.

0

20

40

60

80

100

0 24Act

ivité s

pécifiqu

e

relative

(%

)durée de conservation (heures)

E. coli BL21E. coli TOP10

119

VI. Etude des six nouvelles BVMOs d’Acinetobacter

Nous allons aborder maintenant la partie Résultats des bioconversions destinées à

tester les six nouvelles BVMOs putatives d’Acinetobacter. Dans un premier temps sera

présenté le profil de substrat de chaque enzyme obtenu à partir de tests d’activité réalisés

sur des extraits cellulaires (« tests UV »), puis les résultats des biotransformations

analytiques seront exposés en mettant l’accent sur la régio, énantio- ou énantiotoposélectivité

des réactions. Les biotransformations réalisées avec E. coli Top10 produisant CHMOAcineto

serviront de référence car elles ont déjà été décrites. Les configurations absolues seront

établies par comparaison des temps de rétention (analyse en CPG sur colonne chirale) avec

ceux des composés obtenus par ces mêmes biotransformations.

A. Profil général de substrats

Une série de substrats de différente nature, linéaires ou cycliques, substitués ou non,

ont été testés. Les résultats sont montrés Figure 50 et Figure 51.

ABAYE4 est de loin l’enzyme la plus réactive, particulièrement envers les cétones

linéaires. Une activité conséquente est aussi visible sur les butanones cycliques ou bicycliques,

les cyclopentanones et les cyclohexanones substituées en α du carbonyle par des substituants

aryliques alors que les cycloalcanones non substituées ne sont pas substrats.

ABAYE2 et ABAYE3 présentent toutes les deux un profil de substrats presque

identique et proche aussi, bien que de moindre intensité, de celui d’ABAYE4. Les composés les

plus facilement transformés sont les cyclopentanones et les cyclohexanones α-aryliques ainsi

que les butanones, cyclique ou bicyclique, et les tetralones. En revanche, les cétones linéaires

sont très peu transformées alors qu’elles sont parmi les substrats les plus rapidement oxydés

d’ABAYE4. L’acétophénone et l’indanone ne sont pas substrats.

.

120

Figure 50 : Tests UV sur des cétones bicycliques, aromatiques et linéaires.

Figure 51 : Tests d’a tivit d’e t aits ellulai es sur des cétones cycliques par suivi de la dispartion du NADPH

(CP : cyclopentanone, CH : cyclohexanone).

ACIAD 1ACIAD 2

ABAYE 1ABAYE 2

ABAYE 3ABAYE 40

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

Vitess

e d

e t

rans

form

ation

en

µmol/

min

Titre de l'axe

ACIAD 1

ACIAD 2

ABAYE 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

ACIAD 1ACIAD 2

ABAYE 1ABAYE 2ABAYE 3ABAYE 4

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

Vitess

e d

e t

rans

form

ation

en

µmol/

min

ACIAD 1

ACIAD 2

ABAYE 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

121

Les trois autres enzymes, ABAYE1, ACIAD1 et ACIAD2, ne montrent aucune activité

décelable dans les conditions du test. ACIAD1 et ACIAD2 paraissent être produites en plus

faible quantité par la souche de E. coli BL21 comme on peut le voir sur le gel d’électrophorèse

présenté Figure 47. Cela pourrait éventuellement expliquer leur absence de réactivité mais

ABAYE1, qui n’est pas non plus active, est produite de manière équivalente aux autres enzymes.

Il semble donc que les substrats de ces enzymes ne figurent pas dans les composés testés

B. Biotransformations de la bicyclohepténone

1) Biotransformations à l’échelle analytique

Les lactones régioisomères racémiques 2 et 3 ont été obtenues grâce à une réaction de

BV chimique (MCPBA) et les lactones optiquement actives, (-)-(1S, 5R)-2 et (-)-(1R, 5S)-3,

grâce à une biotransformation de la bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one 1 racémique par E. coli

TOP10 produisant la CHMOAcineto.

Les biotransformations de la bicyclohepténone par les cellules de E. coli BL21 produisant

les six nouvelles enzymes ont été réalisées dans les conditions définies précédemment. Les

activités des cellules sont reportées sur le Graphique 15, le rendement, le temps de réaction,

les configurations absolues et les ees des deux lactones formées sont regroupés dans le

Tableau 19.

Schéma 16 : Les différentes lactones et leurs configurations absolues pouvant être formées à partir de la

bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one 1.

122

Graphique 15 : Activité des cellules entières de E. coli BL21 produisant les différentes enzymes ABAYE et ACIAD

envers la bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one 1.

Tableau 19 : Lactones obtenues par biotransformations de la bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one 1 par des cellules

entières de E. coli BL21 produisant les différentes enzymes ABAYE et ACIAD.

Les résultats observés avec le test UV sont en partie confirmés. Les cellules produisant

ABAYE 1 et ACIAD 2 ne transforment pas la bicyclohepténone, même après 20h de

bioconversion. En revanche, les cellules produisant ACIAD1 ont finalement montré une activité

même si elle reste très modérée (Graphique 15).

Les souches produisant ACIAD1, ABAYE2 et ABAYE3 ont un profil de réaction très

proche en ce qui concerne la régio et l’énantiosélectivité. Les deux lactones régioisomères,

normales et anormales sont formées et ont les mêmes configurations absolues que lors des

transformations avec CHMOAcineto. Cependant, les proportions lactone normale:lactone

anormale sont différentes (entre 80:20 et 90:10 au lieu de 51 :49) et les ees modérés. Il ne

0

2

4

6

8

10

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U/

g p.

s.)

Activité souches / bicyclohepténone

123

s’agit donc pas d’un DCPδ. Ces trois enzymes déjà liées par une similarité de séquence élevée

(80)% ont logiquement tendance à réagir de la même manière.

L’ABAYE4 donne d’excellents résultats; la bicyclohepténone est totalement

transformée au bout de 3h, conduisant aux deux lactones régioisomères 2 et 3 en proportion

équivalente. Elles sont quasi énantiopures (93 et 99% ee) et de configuration absolue (1R,5S)

et (1S,5R) respectivement. Le point intéressant est que ces configurations sont opposées à

celles obtenues lors de biotransformations de ce substrat par d’autres enzymes décrites dans

la littérature 22,82,86,254 et dont quelques exemples sont rassemblés Tableau 4. Les seules

enzymes conduisant à des lactones de même configuration absolue que ABAYE4 sont la 2,5-

DKCMO et la 3,6-DKCMO, deux BVMO de type II. Cependant ces enzymes sont peu

appropriées pour des biotransformations préparatives du fait de la complexité de leur

structure (deux sous-unités oxygénases et une réductase). De plus les ees des lactones sont

moins élevés que ceux obtenus ici.

2) Biotransformation préparative avec E. coli ABAYE4

Compte-tenu de l’originalité des résultats précédents, nous avons effectué la

biotransformation de la bicyclohepténone par ABAYE 4 à l’échelle préparative afin d’en isoler

les produits finaux et de les caractériser précisément, notamment en déterminant leurs

configurations absolues sans ambiguïté. Les conditions de transformation à l’échelle

préparative ont été préalablement étudiées comme illustré ci-dessous :

Concentration maximale utilisable

Nous avons testé l’activité des cellules en présence de différentes concentrations en

bicyclohepténone à l’échelle analytique (20mL). L’effet de l’inhibition se faisant sentir à partir

de 1 g/L de substrat dans le milieu (Graphique 1), nous avons utilisé la bicyclohepténone à une

concentration de 0,5g/L. Les autres paramètres (pH et concentration des cellules) sont ceux

optimisés avec la 2-undécanone.

124

Graphique 16 : Activité en fonction de la concentration en bicyclohepténone des cellules entières de E. coli

BL21 ABAYE4 (DO=14).

Biotransformation en fermenteur de 1L

Nous avons réalisé cette biotransformation en fermenteur de 1L. La réaction est lente

et, surtout, les concentrations de lactones formées sont bien inférieures aux concentrations

observées dans une fiole de 250 mL remplie avec 20mL de milieu effectuée en parallèle. Ces

résultats peuvent être expliqués par une aération trop forte du fermenteur, qui entrainerait

une évaporation des produits, et une agitation élevée, qui gênerait le fonctionnement des

cellules. Nous avons donc décidé de changer de réacteur.

Graphique 17 : Suivi cinétique de la biotransformation en fermenteur de 1L (à gauche), effectué en parallèle

dans une fiole de 250 mL remplie avec 20 mL de milieu (à droite).

Biotransformation en fioles de 2L

La biotransformation a finalement été effectuée dans 5 fioles de 2L non bafflées

contenant chacune 200 mL de milieu réactionnel et agitées à 200 rpm dans un incubateur

Infors.

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

. s.)

[bicyclohepténone] (g/L)

0

25

50

75

100

0 1 2 3 4 5 6

Rdt

(%)

temps (h)

Fermenteur 1L

cétonelactone

0

25

50

75

100

0 1 2 3 4 5 6temps (h)

Fiole

125

La bioconversion est toujours plus lente qu’en fioles de 20 mL mais elle est totale au

bout de 10 heures. Les ees des lactones 2 et 3 sont de 97 % et 99 % respectivement, et

restent constants au cours du temps. L’analyse cinétique (c.-à-d. le suivi en CPG des composés

présents dans le milieu) montre que la vitesse de réaction de l’énantiomère (+)-(1R,5S)-1 de

la cétone, dans la première partie de la réaction, est plus grande que celle de l’énantiomère (-

)-(1S,5R)-1. La lactone anormale 3 est ainsi produite en quantité un peu plus importante que

la lactone normale 2. Les deux courbes s’inversent ensuite ce qui pourrait être due à une

concentration plus faible de la cétone (+)-(1R,5S)-1 qui conduirait à un ralentissement de sa

vitesse de réaction.

Schéma 17 : Biotransformation de la bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one 1 par des cellules produisant ABAYE4.

Graphique 18 : Suivi cinétique de la biotransformation préparative de la bicyclohepténone avec des cellules

entières de E. coli BL21 ABAYE4. Rendement (à gauche), mesure des ees (àdroite).

Le milieu de bioconversion est extrait en continu au dichlorométhane. Les analyses CPG

des lactones dans l’extrait organique indiquent des rendements de 41% en lactone normale 2

et 34% en lactone anormale 3. La lactone 2 étant très volatile*, nous avons eu recours à une

distillation de l’extrait organique à pression atmosphérique, afin de limiter les pertes de

produit. Comme les deux lactones sont structurellement très proches, leur séparation par

* Son point de fusion est élevé mais sa pression de vapeur saturante est faible.

0

25

50

75

100

0 2 4 6 8 10

Rdt

(%)

temps (h)

cétone 1 lactone 2lactone totale lactone 3

0

25

50

75

100

0 2 4 6 8 10

ee (%)

temps (h)

cétone 1lactone 2lactone 3

126

purification classique sur silice a été délicate et a demandé plusieurs chromatographies sur

colonne*. Malgré des pertes importantes, nous avons isolé finalement une quantité suffisante

de chacune de ces lactones pour pouvoir les caractériser avec précision.

Au final, la lactone normale 2 de configuration absolue (+)-(1R,5S) est obtenue avec un

ee de 97% et une pureté optique de 95%† ; la lactone anormale 3 de configuration absolue

(+)-(1S,5R) est obtenue avec un ee supérieur à 99% et une pureté optique de 100%‡

C. Biotransformations des cyclobutanones prochirales -substituées

Les bio-oxydations ont été réalisées dans les conditions définies précédemment pour

les essais analytiques. Les -butyrolactones obtenues après environ 5 h de bioconversion ont

été analysées par CPG. Les excès énantiomériques ont été mesurés par des analyses sur

colonnes chirales et les configurations absolues ont été déterminées par comparaison des

temps de rétention avec ceux de produits authentiques issus de la bio-oxydation par la

CHMOAcineto (dans notre cas par E. coli CHMO TOP10 CHMO), et dont la plupart ont été isolés

et identifiés dans notre laboratoire lors de travaux publiés précédemment.

Les enzymes ABAYE 1 et ACIAD 2 ainsi qu’ACIAD 1 se sont montrées inactives avec

l’ensemble des cyclobutanones testées. Les résultats obtenus avec les enzymes ABAYE 2,

ABAYE 3 et ABAYE 4 sont rassemblés dans le Tableau 20.

Les vitesses de biotransformation et les rendements des biotransformation avec

ABAYE 2, ABAYE 3 et ABAYE 4 sont modérés , un rendement d’environ 50% est généralement

obtenu après 5h de bioconversion.

* Lors de la mise au point de la bioconversion de cette cétone par E. coli TOP10[pQR239] à l’échelle de 1 kg, un système de chromatographie liquide complexe de douze colonnes mises en sèrie a été utilisé (Simulated Moving Bed ref ) pour l’isolement des deux lactones. † [α]20

589 = +97 (c=0.78, CH3OH) ; litt [255] [α]20589 = +104, po = 99%

‡ [α]20589 = +69 (c=0.96, CHCl3); litt. [256] [α]20

589 = + 67,4 )

127

Nouvelles souches Littérature

Cétone R :

Enzyme

Durée

Réaction

(h)

Rdt % ee lactone %

(conf. abs.) Biocatalyseur

ee lactone %

(conf. abs.)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

6h 6h 15h

51 79 0

99 (R) 99 (R)

--

CHMO Acineto

C. echinulata CHMO Brevi 1

HAPMO

43 (R)

98 (R)

98 (R)

92 (S)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

5h 5h

24h

53 61 0

98 (ent) 99 (ent)

--

CHMO Acineto

C. echinulata 19

98 (ent)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

6h 6h 15h

42 47 0

96 (R) 96 (R)

--

CHMO Acineto

C. echinulata

CHMO Rhodo 2

85 (S)

98 (R)

95 (S)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

5h 5h 15h

55 51 0

98 (R) 99 (R)

--

CHMO Acineto

91 (S)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

15h 15h 15h

0 0 0

-- -- --

CHMO Acineto

C. echinulata nd (nd)

nd (nd)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

5h 5h 5h

69 63 45

18 (S) 8 (S) 99 (R)

CHMO Acineto

C. echinulata

CHMO Arthro

87 (S)

80 (S)

93 (S)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

5h 5h

24h

30 34 29

9 (R) 12 (R) 99 (R)

CHMO Acineto

C. Echinulata

CHMO Rhodo 1

CHMO Xantho

99 (S)

77 (S)

98 (S)

97 (S)

ABAYE 2 ABAYE 3 ABAYE 4

22h 22h 22h

0 0 0

-- -- --

CHMO Acineto

C. echinulata

CHMO Xantho

99 (S)

91 (S)

99 (S)

Tableau 20: Biot a sfo atio s de lo uta o es p o hi ales β-substituées par ABAYE2, ABAYE 3 et ABAYE4.

(ent- : les configurations absolues ne sont pas connues mais on peut distinger les deux énantiomères, ici

l’ a tio e nommé ent- est elui ui ’est pas fo ave CHMOAcineto)

128

Sans surprise, les deux enzymes ABAYE 2 et ABAYE 3 réagissent de façon très

similaire. Elles transforment les dérivés phényliques para-substitués 4a, 5a, 6a et 7a avec une

très forte énantiotoposélectivité ; les lactones correspondantes sont toutes de configuration

absolue (R) et ont des ees supérieurs à 96%. Les dérivés benzyliques les plus petits (9a et

10a) sont transformés plus lentement et avec une très faible énantiotoposélectivité tandis

que le dérivé pipéronyle 11a, plus substitué, et le dérivé non-aromatique 8a ne sont pas

substrats de ces enzymes. La présence d’un noyau aromatique proche du cycle cétonique

semble donc essentielle ce qui pourrait suggèrer l’existence d’interactions électroniques de

type « stacking » avec des acides aminés du site actif ou avec le FAD.

ABAYE 4 n’accepte ni les dérivés phényliques ni les dérivés piperonyle et hexyle mais

elle accepte les deux dérivés benzyliques 9a et 10a et les convertit avec une

énantiotoposélectivité élevée en donnant des lactones quasi énantiopures de configuration

absolue (R). Il est intéressant de noter que l’on retrouve ici l’inversion de configuration

observée entre ABAYE2 et 3 d’un côté et ABAYE4 de l’autre lors de la biotransformation de

la bicycloheptanone, cette inversion étant masquée par une inversion de l’ordre des priorités

pour les groupements phényle et benzyle (cf. ci-dessous).

Enzymes ABAYE2 et ABAYE3 ABAYE4

Lactones

Afin de mettre en valeur les propriétés d’énantiotoposélectivité de ces trois nouvelles

enzymes, nous avons comparé leurs résultats aux résultats publiés dans la littérature avec

d’autres microorganismes (Tableau 20)65,85,107,108,111,257. En ce qui concerne les dérivés

phényliques, ABAYE 2 et ABAYE 3 affichent des résultats très proches pour ce qui est des

ees et des configurations absolues, de ceux du champignon C. echinulata* mais, au contraire

*Malgré de nombreuses tentatives de purification, l’enzyme responsable de l’activité BVase chez ce champignon n’a jamais été isolée [258].

129

des deux ABAYE, celui-ci reste actif sur les dérivés benzylique. On peut souligner le fait

qu’une biotransformation avec une souche recombinante de E. coli, comme ici, est plus facile à

mettre en œuvre et surtout plus rapide qu’avec des champignons, ce qui la rend

particulièrement attractive. D’autre part, on observe une énantiocomplémentarité d’ABAYE4

sur les dérivés benzyliques par rapport à tous les exemples répertoriés, ce qui semble

confirmer l’originalité de cette enzyme déjà notée sur la bicyclohepténone.

D. Biotransformations avec les cétones cycliques α-alkylées

Nous avons réalisé le Dédoublement Cinétique d’une série de cycloalcanones et

déterminé le coefficient d’énantiosélectivité de ces réactions (E). Celui-ci est calculé à partir

des ees de la cétone résiduelle et de la lactone formée. Les réactions de racémisation des

cétones sont considérées comme négligeables dans les conditions de transformation utilisées

(pH7) à l’exception de la benzyloxyméthylcyclopentanone (voir Chapitre IV). Les

configurations absolues sont attribuées par comparaison avec les résultats obtenus lors de

conversion avec les cellules de E. coli TOP10 CHMO, résultats qui seront détaillés Chapitre IV

pour les cétones 12a, 13a, 14a et en partie expérimentale pour les cétones 15a et 16a.

Les résultats de ces biotransformations sont reportés Tableau 21.

ABAYE1 et ACIAD2 n’acceptent pas plus les cétones cycliques α-alkylées comme

substrat que les précédents composés.

Les autres enzymes sont actives sur plusieurs substrats qu’elles transforment toujours

avec la régiochimie de la réaction chimique.

ACIAD1, de façon très surprenante puisqu’elle ne réagissait avec aucun composé jusqu’à

présent (alors qu’elle est très proche en séquence de ABAYE2 et ABAYE3), transforme deux

substrats de la série, le phénylcyclohexanone 14 et l’allylcyclohexanone 16. Elle est inactive

sur les autres cétones sans que l’on puisse véritablement distinguer un schéma directeur. La

vitesse de ces réactions est plutôt faible par rapport à celle de ABAYE2 et ABAYE3. Dans

ces deux derniers cas les configurations absolues sont identiques à celles obtenues avec

CHMOAcineto et les coefficients d’énantiosélectivité sont modérés. Ces résultats ne valident

130

donc pas l’hypothèse précédente d’une absence de réactivité due à une mauvaise expression

de l’enzyme mais vont plutôt dans le sens d’une spécificité de substrat particulière.

Au contraire, ABAYE2 et ABAYE3 réagissent très rapidement avec les cétones

aryliques ou allylique, les bioconversions sont complètes en moins de 2h mais les

énantiosélectivités sont faibles (2 < E < 11).

ABAYE4 réagit elle aussi avec seulement trois substrats : rapidement avec la

benzyloxyméthylcyclopentanone 12a et plus lentement avec phénylcyclohexanone 14a et la

benzyloxyméthylcyclohexanone 13a. L’énantiosélectivité de ces réactions est également

faible (1 < E < 12) mais on observe toujours une inversion des configurations absolues par

rapport à celles obtenues avec la CHMOAcineto.

131

Cétone Enzyme Temps R°

(h)

Cétone Lactone E a

Rdt % ee %

(conf. abs.) Rdt %

ee %

(conf. abs.

CHMO TOP10

ACIAD 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

9 h

20 h

1 h

1 h

1 h

54

62

13

6

17

38 (S)

-

99 (S)

99 (S)

24 (R)

33

0

67

70

52

96 (R)

-

26 (R)

14 (R)

80 (S)

ndb

-

6

5

12

CHMO TOP10

ACIAD 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

4,5 h

20 h

1 h

1 h

6 h

36

71

13

9

90

88 (S)

-

-

-

-

49

0

55

56

6

99 (R)

-

6 (R)

14 (R)

-

>100

-

2 c

3 c

-

CHMO TOP10

ACIAD 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

1,5 h

3 h

1 h

0,5 h

8 h

43

40

18

20

16

98 (S)

33 (S)

95 (R)

97 (R)

25 (R)

52

28

57

67

64

99 (R)

94 (R)

45 (S)

33 (S)

1 (S)

>100

45

9

11

1

CHMO TOP10

ACIAD 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

4 h

15 h

15 h

15 h

15 h

47

64

58

61

54

98 (S)

-

-

-

-

42

0

0

0

0

99 (R)

-

-

-

-

>100

-

-

-

-

CHMO TOP10

ACIAD 1

ABAYE 2

ABAYE 3

ABAYE 4

1 h

3 h

1,5 h

1,5 h

6 h

13

50

8

17

50

98 (S)

6 (S)

82 (S)

63 (S)

-

58

13

67

79

3

83 (R)

89 (R)

37 (R)

57 (R)

-

49

18

6

8

-

a E a été calculé soit en fonction de (c, eeP), soit de (eeS, eeP). b E n’est pas déterminé car dans ce cas, la racémisation de la cétone 12a n’est pas négligeable à pH 7. C E a été calculé en utilisant plusieurs points.

Tableau 21 : Biotransfo atio s de loal a o es α-substituées par des cellules entières de E. coli TOP10

CHMO et de E. coli BL21 produisant ACIAD 1, ABAYE2, ABAYE 3 et ABAYE4.

132

VII. Discussion

Les activités et les sélectivités des différentes BVMOs vis-à-vis des substrats testés

reflètent parfaitement les similarités de séquences et donc le classement phylogénétique

représenté ci-dessous. On retrouve bien les trois groupes d’enzymes : le groupe que l’on

appellera A, qui comprend ABAYE 1 et ACIAD2 et pour lequel nous n’avons pas trouvé de

substrats. Le groupe B constitué de la seule ABAYE4 et le groupe C qui se subdivise en C1 avec

ABAYE2 et ABAYE3 d’un côté et C2 avec ACIAD1 de l’autre.

Groupe Bicyclohepténone Cétones B-substituées Cyclopentanone a-

substituées

Cyclohexanones a-

substituées

A Pas de réaction

B DCPR Conf. abs. inversées

Benzyliques uniquement Ee élevés, Conf. abs. inversées

E très faible Conf abs. inversée

Phénylcyclohexanone Conf abs. inversée

C DC avec formation notable de lactone anormale (10-20%) Conf. abs. identiques

C1 - Ee élevés sur phényliques - Ee faibles sur benzyliques - pas de réaction avec aliphatique - Conf abs. identiques

E moyen Conf abs. inversée

Aryliques et allylique E faibles Conf. abs. identiques

C2 Pas de réaction

E moyen Conf. abs. identique

Allylcyclohexanone E faible Conf. abs. identiques

Note : la mention « configurations absolues identiques » ou « inversées » se réfère aux configurations absolues obtenues avec CHMOAcineto

133

Figure 52

De façon très schématique, car il n’existe pas pour l’instant de structure

cristallographique de CHMOAcineto, le DCPR observé lors de la réaction de cette enzyme avec

la bicyclohepténone avait été expliqué par l’impossibilité pour certaines conformations de

l’intermédiaire de Criegee d’être adoptées (Schéma 18). En effet, ces conformations, dans

lesquelles la liaison migrante est antiparallèle à la liaison peroxydique, sont fondamentales

pour la poursuite de la réaction à savoir le réarrangement de l’intermédiaire et la libération

de la lactone (Schéma 3). On peut donc imaginer une situation en miroir pour ABAYE4 (Schéma

19).

Figure 2

Un alignement de séquences protéiques de nos six enzymes et de plusieurs autres

Schéma 1880: Modèle empirique justifiant la sélectivité de la réaction de CHMOAcineto avec la bicyclohepténone.

Formation favorisée

de (1S, 5R)-3 Formation défavorisée

de (1S, 5R)-3 Formation favorisée

de (1R, 5S)-2 Formation défavorisée

de (1R, 5S)-2

134

Schéma 19 : Mod le e pi i ue justifia t la s le tivit de la a tio d’ABAYE ave la i lohept o e.

Les conformations des intermédiaires de Criegee potentiels sont représentées au centre du schéma, les flèches

rouges désignant les deux conformations probablement adoptées car conduisant aux deux lactones formées.

Les formes en gris representent le site actif.

Un alignement de séquences protéiques de nos six enzymes et de plusieurs autres

BVMOs connues a été effectué avec le logiciel Clustal Oméga (Annexe 1). Il montre des points

communs aux enzymes d’A. baumannii et de A. baylyi qui ne sont pas forcément traduit par

leur pourcentage de similarité. Ces enzymes sont parmi les plus courtes des BVMOs. En

particulier, plusieurs courtes séquences et une plus longue, composée de 25 acides aminés

organisés en partie en hélice, sont manquantes pour l’ensemble des BVMOs de ces deux

souches lorsqu’on les compare à HAPMO, PAMO ou CHMOAcineto. Lorsqu’on aligne les séquences

complètes des BVMOs avec celle de PAMO et qu’on recherche sur la structure 3D de celle-ci

les fragments manquants (en jaune Figure 53), on s’aperçoit que la plupart d’entre eux sont

situés dans le domaine hélicoïdal de l’enzyme (en bleu), qui est le domaine le moins conservé

chez les BVMOs et situé à distance du site actif.

Par ailleurs, l’arginine, dont plusieurs études ont montré le rôle essentiel dans le

mécanisme catalytique (R337 chez PAMO), est conservé pour toutes ces BVMOs.

135

Figure 53 : Structure 3D de PAMO (2YLS) contenant le FAD et leNADPH.

Fragment en bleu (à droite) : domaine hélicoïdal ; en jaune : f ag e ts a ua ts hez les BVMOs d’A.

baumannii et baylyi ; en rouge et rose : les deux signatures ; en vert : les deux cofacteurs.

Nous avons collaboré avec A. de Brevern et J. Rehbemed du laboratoire DSIMB (Inserm,

Paris) pour tenter de comprendre l’énantiosélectivité de l’ABAYE 4. Du fait du nombre très

limité de structures disponibles, les études ont été basées sur la structure de la

CHMORhodoHI31. Des simulations de dynamique moléculaire et de modes normaux de ces

protéines ont été effectuées sans succès. En effet, l’insertion des deux seuls cofacteurs est

déjà très complexe et a nécessité des temps de calculs élevés sans que les résultats soient

probants. Les études complémentaires concernant l’intermédiaire de Criegee,

vraisemblablement responsable de la sélectivité, n’ont pas pu être réalisées car des incidents

techniques ont retardé l’accès au centre de calcul.

Nous avons donc essayé d’appliquer des méthodes plus simples en utilisant le logiciel de

modélisation moléculaire Yasara. La structure proposée par le logiciel comme « template » de

ABAYE4 est basée sur celle de la PAMO (1W4X) cristallisée avec le FAD. Evidemment les

observations ci-dessous sont à relativiser car les enzymes dont les structures 3D ont servi

de « templates » affichent des similarités faibles avec les BVMOs étudiées alors que le

mécanisme de la réaction de BV enzymatique est particulièrement complexe. Ainsi la

conformation de l’enzyme qui serait responsable de la sélectivité, comme nous l’avons vu en

partie bibliographique, peut être notablement différente de celles des structures cristallines

retenues par le logiciel.

136

Dans un premier temps, nous avons recherché des résidus aromatiques qui pourraient

faciliter les interactions avec les substrats aromatiques et justifier les préférences de

ABAYE 4. Nous n’en avons pas trouvé dans le voisinage du noyau isoalloxazine du FAD qui

pourrait remplir ce rôle. En revanche, une observation du volume « ouvert » permettant l’accès

au site actif et un « docking » manuel de la benzyl et de la phénylcyclobutanone montrent que

l’encombrement stérique pourrait éventuellement expliquer que seule la cétone benzylique est

susceptible d’accéder à l’hydroxyflavine (dans l’hypothèse d’un déplacement de l’arginine R299

et du NADP+ qui en libèrerait l’accès). Le positionnement de la bicyclohepténone est plus

complexe et n’a pas permis de conclure de manière satisfaisante.

Figure 54 : Site actif de ABAYE 4 proposé par le logiciel YASARA.

En bleu, le noyau aromatique de la benzylcyclobutanone.

De façon surprenante, la même expérience réalisée avec ABAYE1 (Groupe A) a montré

un site actif beaucoup plus ouvert que celui de ABAYE4 ou de PAMO (Figure 55). Peut-être

faut-il en conclure que le substrat naturel de cette enzyme est plus volumineux ou plus

fonctionnalisé que ceux testés. A la différence du modèle de la clé et de la serrure basés sur

les seules interactions stériques, on peut imaginer qu’un tel substrat permettrait des liaisons

avec des résidus particuliers qui auraient pour conséquence une modification subtile du

positionnement des cofacteurs ce qui rendrait le groupe peroxy accessible et donc la réaction

possible. Inversement, des composés plus petits ne pourraient pas se fixer ou ne pourraient

pas atteindre ce groupe toujours masqué par le NADPH et l’arginine R294.

137

Figure 55 : Site actif de ABAYE 1 proposé par le logiciel YASARA. En bleu, le noyau isoalloxazine de la flavine ; en

rouge, l’a gi i e R .

Conclusion

Nous avons effectué les biotransformations de quatorze composés avec six BVMOs

putatives.

Aucun substrat n’a été identifié pour celles d’entre elles qui ne possèdent pas de

contexte génomique analogue à celui de CHMOAcineto. Il est possible aussi qu’elles nécessitent

des conditions expérimentales très éloignées de celles que nous avons employées. En revanche,

les quatre enzymes possédant un contexte génomique proche de celui de la CHMOAcineto, sont

bien des BVMOs. Elles ont généralement montré une spécificité de substrats similaire avec la

plupart des cétones testées, mais avec une régio et/ou énantiosélectivité pouvant être

différente. L’énantiocomplémentarité est observée d’une façon remarquable entre la

CHMOAcineto et ABAYE4 avec le Dédoublement Cinétique Parallèle Régiodivergent de la

bicyclohepténone et avec les oxydations énantiotoposélectives des cyclobutanones -

substituées. A ce stade de notre travail nous n’avons cependant pas trouvé d’explications

convaincantes à cette sélectivité en nous basant sur des modèles d’enzymes mais cette étude

devra être poursuivie et approfondie.

Nous avons néanmoins pu synthétiser la (+)-(1R,5S)-2-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-3-one

2 et la (+)-(1S,5R)- 3-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-2-one 3 ainsi que plusieurs butyrolactones

-aryliques avec des ees extrêmement élevés.

Malheureusement, les six nouvelles enzymes n’autorisent pas des Dédoublements

Cinétiques efficaces avec l’ensemble de cycloalcanones α-alkylées testées. Ainsi, le chemin est

coupé vers des études de Dédoublement Cinétique Dynamique avec ces couples d’enzyme et de

cétone. C’est donc finalement CHMOAcineto, sous forme de cellules entières de E. coli

TOP10[pQR239], que nous utiliserons pour la partie de ce travail concernant les DCD.

138

139

Chapitre IV : Dédoublements Cinétiques Dynamiques

Cette partie de notre travail a consisté à mettre en place des Dédoublements Cinétiques

Dynamiques (DCD) à partir de réactions de Baeyer-Villiger biocatalysées, afin d’obtenir des

lactones énantiopures avec un rendement élevé. Trois cycloalcanones α-substituées et le

biocatalyseur E. coli TOP10[pQR239] produisant la CHMOAcineto ont été choisis, les réactions

cinétiques correspondantes s’effectuant avec des énantiosélectivités élevées (E>100), une

condition indispensable à la réussite de nos projets.

Comme nous l’avons décrit en partie bibliographique, deux exemples de DCD ont été

précédemment appliqués à la benzyloxyméthylcyclopentanone 12a avec des cellules entières

du même biocatalyseur selon deux approches différentes : à pH basique et en présence d’une

résine adsorbante. Ces deux approches étant peu efficaces sur les cyclohexanones, nous en

avons cherché une troisième. Nous souhaitons maintenant étendre ces Dédoublements

Dynamiques à des cyclohexanones α-substituées en nous appuyant sur une nouvelle méthode

de racémisation, l’utilisation de solutions tampons fortement concentrées.

II. Biotransformations préparatives

Un Dédoublement Cinétique classique de chaque cétone avec le biocatalyseur E. coli

CHMO * a été effectuée à l’échelle préparative. Les cétones et les lactones ont été isolées

afin de caractériser la bioconversion. De plus, les cétones obtenues sous forme optiquement

active ont été utilisées pour les études de racémisation.

Bien que nous ayons vu précédemment que les cellules présentaient une meilleure activité

à pH 8, nous avons choisi de travailler à pH 7 pour deux raisons : d’une part, la racémisation in

situ des cétones est possible à pH basique, ce qui gênerait les mesures d’énantiosélectivité et

réduirait les quantités de cétones optiquement actives. D’autre part, les caprolactones

* L’écriture de E. coli TOP10[pQR239] produisant la CHMOAcineto est simplifié en E. coli TOP10 CHMO.

140

formées sont stables à ce pH, ce qui permet de les quantifier précisément lors des études

cinétiques par simple analyse en CPG.

A. Biotransformation de la 2-benzyloxyméthyl cyclopentanone 12a

Plusieurs biotransformations de cette cétone par E. coli TOP10 CHMO ont été réalisées

précédemment 219 dans les conditions classiques (0,5 g/L substrat ; pH=7,2). Dans notre étude,

nous avons observé également la formation de la lactone 12b quasi énantiopure. Au bout de

24h, un rendement de 55% en lactone (R) et de 32% en cétone résiduelle (S) sont obtenus

analytiquement (Graphique 19). L’ee de la cétone atteint un maximum de 38 % avant de

diminuer alors que les ees élevés attendus lors d’un dédoublement cinétique ne sont pas

observés. Ceci résulte vraisemblablement d’une racémisation spontanée de la cétone à pH

neutre dans les conditions de réactions. Le coefficient d’énantiosélectivité E ne peut donc

être déterminé précisément bien que les ees élevés atteints par la lactone sont le signe d’une

forte énantiosélectivité.

Graphique 19: Suivi cinétique de la biotransformation de la cétone 12a par E. coli CHMO.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20

Rdt

et e

e (%

)

temps (h)

Rdt cétone 12aee cétone 12aRdt lactone 12bee lactone 12b

141

Il a été montré précédemment que les effets inhibiteurs de la cétone 12a se font sentir

dès 0,5 g/L. C’est pourquoi de faibles concentrations en cétone (0,3 g/L) avaient été utilisées

lors des DCD précédents.

La biotransformation préparative a été effectuée dans deux fioles de 3L (2x 300 mL).

Une concentration maximale de cellules et une concentration réduite en substrat à 0,3 g/L

ont été utilisées afin de limiter la racémisation et obtenir la cétone avec un excès élevé. Nous

avons obtenu finalement 36% de cétone (S)-12a avec un ee de 58% et 33% de lactone (R)-

12b avec un ee de 96%.

B. Biotransformation de la 2-benzyloxyméthyl cyclohexanone 13a

L’oxydation de du composé 13a permet l’obtention de la cétone de configuration (S) avec

un rendement de 40% et un ee de 90% et de la lactone énantiopure de configuration absolue

(R) avec 49% de rendement. Le coefficient d’énantiosélectivité mesuré est élevé (> 100).

Graphique 20 : Suivi cinétique de la biotransformation de 13a par E. coli CHMO.

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

Rdt

et e

e (%

)

temps (h)

Rdt cétone 13aee cétone 13aRdt lactone 13bee lactone 13b

142

Des biotransformations à diverses concentrations de cétone montrent un effet sensible

dès 1 g/L. L’inhibition * est totale à 2 g/L, aucune lactone n’est formée.

Graphique 21 : Etude de la concentration utilisable de la cétone 13a avec E. coli CHMO

La biotransformation préparative a été effectuée dans un fermenteur de 1L à une

concentration en cétone de 0,5 g/L. Après 20h de réaction, nous avons pu récupérer 36% de

cétone (S)-13a avec un ee de 88% et 41% de lactone (R)-13b avec un ee de 99%.

C. Biotransformation de la 2-phénylcyclohexanone 14a

La biotransformation de la cétone commerciale 14a s’effectue selon le schéma d’un

dédoublement cinétique classique (Graphique 22) ; nous obtenons 43% de cétone résiduelle

(S)-14a et 52% de lactone (R)-14b quasi énantiopures. Aucun régioisomère de la lactone n’est

observé, le seul énantiomère réagissant de la cétone est totalement transformé en environ

1,5 h, l’autre énantiomère restant stable les 3 heures suivantes au moins. Le coefficient

d’énantiosélectivité caractérisant cette réaction est très élevé (E > 100).

* Cette inhibition peut venir de la limitation de transfert de la cétone à travers la membrane cellulaire, d’une inhibition de l’enzyme causée par la cétone ou de la toxicité de la cétone pour les cellules .

0

25

50

75

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Rdt

(%)

temps (h)

cétone 13a 0,5 g/Llactone 13b 0,5 g/Lcétone 13a 1 g/Llactone 13b 1 g/Lcétone 13a 2 g/Llactone 13b 2 g/L

143

Graphique 22 : Suivi cinétique de la biotransformation de la cétone 14a par E. coli CHMO

L’effet d’inhibition par le substrat est observé dès que la concentration en cétone

atteint 0,75 g/L. L’inhibition de l’activité est totale à 1 g/L de cétone.

Graphique 23 : Suivi cinétique de la biotransformation de la cétone 14a par E. coli CHMO en fonction de

différentes concentrations initiales de cétone

La biotransformation préparative est réalisée dans un fermenteur de 10L rempli à 50%,

avec une concentration en cétone de 0,5 g/L. Après 10h de réaction, extraction et

purification, nous avons obtenu 40% de cétone (S)-14a avec un ee de 78% et 51% de lactone

0

20

40

60

80

100

0 2 4

Rdt

et e

e (%

)

temps (h)

Rdt cétone 14aee cétone 14aRdt lactone 14bee lactone 14b

0

25

50

75

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Rdt

(%)

temps (h)

cétone 14a 0,5 g/Llactone 14b 0,5 g/Lcétone 14a 0,75 g/Llactone 14b 0,75 g/Lcétone 14a 1 g/Llactone 14b 1 g/L

144

(R)-14b avec un ee de 99%. L’ee de la cétone atteignait une valeur de 96% à l’arrêt du

fermenteur, mais une légère racémisation s’est probablement produite lors de sa purification.

D. Autres biotransformations

La cyanoéthylcyclohexanone 15a et l’allylcyclohexanone 16a ont été soumises à des

Dédoublements Cinétiques afin de fournir les échantillons authentiques de cétones et de

lactones. Les résultats sont seulement reportés en partie expérimentale et résumés dans le

Tableau 21 car ces composés n’ont pas été utilisés pour les études de DCD.

E. Résumé des résultats

Nous avons étudié à l’échelle préparative les bioconversions de cinq cycloalcanones avec

des cellules de E. coli TOP10 CHMO. Le coefficient d’énantiosélectivité E et la concentration

maximale en cétone utilisable, déterminés analytiquement pour chaque couple, ainsi que les

précisions apportées des cétones et des lactones purifiées (configurations absolues, ee et

rendements) sont réunies dans le Tableau 22.

Toutes les cétones présentées sont substrats d’E. coli TOP10 CHMO et les réactions

sont fortement énantiosélectives (E > 100). Les cétones sont récupérées sous formes

optiquement pures avec des ees importants, qui vont permettre d’étudier leur vitesse de

racémisation. Celle-ci est négligeable à pH 7, à l’exception de celle de la cétone 12a. Les

lactones sont de configuration absolue (R) et obtenues avec des ees élevés (ee > 96%) et des

rendements relativement importants. La concentration maximale utilisable en cétone est en

général de 0,5g/L.

145

Tableau 22 : Bilan des résultats de biotransformations préparatives des cycloalcanones avec E. coli CHMO.

III. Racémisation

A. Agents racémisants

Racémisation à pH fortement basique

Des études précédentes dans notre laboratoire 219 ont montré la possibilité de

racémisation de la cétone 12a à pH basique, mettant à profit l’équilibre céto-énolique. La

racémisation a été étudiée en fonction du pH ; elle s’est effectuée à pH 9, en un temps

compatible à celui d’une biotransformation classique.

146

Résines anioniques

Les résines échangeuses d’anions qui ont montré un effet accélérateur de la

racémisation sont toutes des résines faiblement ou moyennement anioniques et portent des

fonctions amines (secondaires et tertiaires). Leur intérêt provient du fait qu’elles peuvent

agir à des pH proches de la neutralité (pH 7,5) et donc préserver la forme fermée de la lactone 220. En revanche, leur présence dans un fermenteur avec une forte agitation peut réduire la

durée de vie des cellules. Elles sont peu actives sur les cyclohexanones (résultats non publiés).

Tampons fortement concentrés

Les études précédentes ont fait apparaitre une influence possible des tampons utilisés

pour stabiliser le pH sur la racémisation. Comme nous étions à la recherche d’une autre voie

pour la racémisation, qui permette de contourner la restriction de substrats mise en évidence

lors des deux approches précédentes, nous avons exploré cette nouvelle approche.

B. Mesure de la racémisation

Pour déterminer les vitesses de racémisation, nous avons fait l’hypothèse d’une réaction

réversible du premier ordre.

De l’intégration de l’équation des vitesses, on déduit que �� = ��0�−����� avec ee0, l’ee initial de la cétone krac, la constante de vitesse de la racémisation Des prélèvements seront donc effectués tout au long de la racémisation, extraits à

l’acétate d’éthyle et les ees des cétones seront analysés en CPG chirale. Les constantes de

vitesse krac seront déterminées par une régression aux moindres carrés avec le logiciel Exel.

C. Recherche de tampons « racémisants »

Des études préliminaires avec la cyclopentanone 12a ont montré l’effet racémisant de

certains tampons fortement concentrés. Plusieurs tampons ont été explorés (Graphique 24),

147

le phosphate et l’imidazole ont été sélectionnés comme de bons agents racémisants, avec un

effet plus important pour l’imidazole.

Graphique 24 : Effets de diférents tampons (pH8) sur la racémisation de 12a.

L’étude a été poursuivie avec les cyclohexanones. Les racémisations de la

benzyloxyméthylcyclohexanone 13a et de la phénylcyclohexanone 14a ont été étudiées dans

un premier temps avec des solutions de tampon phosphate et imidazole. Les difficultés

rencontrées dans la mise en place des DCD, que nous détaillerons ultérieurement, nous ont

incités dans un deuxième temps à rechercher d’autres tampons, notamment à base de glycine

et de borate. Pour des raisons de facilité de lecture, nous présentons l’ensemble des résultats

dans le Graphique 25. Ils montrent que :

Les deux cyclohexanones, contrairement à la cyclopentanone, se racémisent très

faiblement dans l’eau à pH 8,5.

L’imidazole contribue davantage à la racémisation des les deux cyclohexanones que le

phosphate. Chacune des deux cétones se comporte différemment selon le tampon ; la

vitesse de racémisation de 14a est plus grande que celle de 13a avec l’imidazole, alors

que l’inverse est observé avec le phosphate, Cette observation pourrait indiquer

l’existence d’un mécanisme de racémisation différent.

La glycine a un effet équivalent sur les deux cyclohexanones, les constantes de

racémisation sont proches de celles obtenues avec l’imidazole.

Le borate a peu d’effet

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Bes

Mes

Collidine

Triéthanolamine

Tris

Mops

Hepes

K Phosphate

Imidazole

krac (h-1)

148

Graphique 25 : Co pa aiso de l’effet racémisant du pH, de tampons et de la résine Lewatit MP62 avec les

cétones 12a, 13a et 14a. (concentration en tampon 0,5 M et pH 8,5).

L’effet racémisant de l’imidazole et de la glycine avec les deux cyclohexanones est du

même ordre que celui de la résine anionique Lewatit MP 62 avec la cyclopentanone 12a et

semble donc suffisant pour réaliser des DCD.

D. Etude des conditions de racémisation

Nous avons identifié trois paramètres importants pour la racémisation : la nature de la

cétone, le pH, la nature et la concentration en tampon. Quelques exemples sont reportés dans

les graphes ci-dessous :

Graphique 26: Effet de la nature de la cétone et du tampon. Racémisation des cétones 13a et 14a avec le

phosphate et l’i idazole (pH 8,5 ; 0,5 g/L de cétone, 0,25 M imidazole et 0,5 M phosphate).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

krac

(h-1

)

12a 13a 14a

149

Graphique 27 : Effet du pH. Racémisation des cétones 13a et 14a avec la glycine ( 0,5 g/L cétone, 0,5 M

glycine).

Graphique 28 : Effet de la concentration en tampon. . Racémisation des cétones 13a et 14a avec l’i idazole (

0,5 g/L cétone, pH 8,5).

La taille du cycle a clairement une influence sur la racémisation (Graphique 29). La

constante de vitesse de racémisation de la cyclopentanone est environ huit fois plus

importante que celle de la cyclohexanone à pH 7 comme à pH 8.

Graphique 29 : Effet de la taille du cycle cétonique et du pH. Racémisation des cétones 12a et 13a avec la

glycine ( 0,5 g/L cétone, 0,5 M glycine).

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16

ee (%)

temps (h)

13a pH 813a pH 712a pH 8

krac=0,17

krac=0,02

krac=1,42krac=0,15

150

Les trois tampons retenus sont le phosphate, l’imidazole et la glycine. εans surprise, la

racémisation est accélérée avec l’augmentation du pH et de la concentration en substrat.

Il s’agit maintenant de trouver un compromis entre les conditions optimales de

racémisation et de biocatalyse.

IV. Dédoublement dynamique avec le tampon phosphate

Nous avons commencé nos essais de DCD après avoir identifié les tampons imidazole et

phosphate comme agents racémisants potentiels. C’est pour cette raison que nous ne

discuterons du tampon glycine que dans un second temps et que nous testerons le tampon

phosphate bien qu’il soit un agent racémisant de force modérée.

A. Concentration de tampon supportée par les cellules

Tout d’abord, nous avons cherché la concentration maximale de tampon supportée par

les cellules (culture fraiche), dans des conditions optimales d’activité cellulaire (pH=8 ; 30°C).

L’activité est mesurée en ajoutant le substrat-test (la bicyclohepténone), après 15 minutes

de suspension des cellules avec le tampon à trois concentrations (0,25 ; 0,5 et 0,75 M). Nous

voyons dans le Graphique 30 qu’à la concentration de 0,5M de tampon, l’activité résiduelle des

cellules est à moitié de celle observée avec le phosphate, et qu’elle est complétement inhibée

avec l’imidazole.

Nous avons étudié la stabilité de l’activité dans le temps dans les conditions proposées

ci-dessus. L’étude consiste à laisser les cellules en suspension avec le tampon (en agitation),

et évaluer l’activité de prélèvements effectués au cours du temps. Le Graphique 30 montre

une perte complète de l’activité avec l’imidazole à partir de la 5ème heure, alors qu’avec le

phosphate 20% d’activité est encore visible après 8h.

L’imidazole est plus racémisante que le phosphate mais malheureusement sa forte

toxicité envers les cellules représente un obstacle à son utilisation pour les DCD. La présence

de phosphate à 0,5M et à pH 8,5 est mieux supporté par les cellules, son effet racémisant est

modéré avec les deux cétones, mais le tampon phosphate restait à ce stade de notre travail

le seul tampon candidat.

151

Graphique 30 : Activité des cellules en présence de tampons à différentes concentrations.

Graphique 31 : Activité des cellules en fonction de leur durée de suspension dans des tampon phosphate 0,5M

et imidazole 0,25M respectivement.

B. Etude préliminaire du DCD

Nous avons soumis la cétone 14a à des biotransformations à petite échelle avec le

tampon phosphate, dans les conditions choisies précédemment. Ces essais préliminaires ont

été réalisés dans des fermenteurs de 0,5 L. En effet, nous avons remarqué une différence

d’activité des cellules entre fioles et fermenteurs. De plus, le pH du milieu est plus facile à

contrôler en fermenteur.

0

20

40

60

80

100

0

5

10

15

20

25

30

35

0 0,25 0,5 0,75

Act

ivité s

pécifiqu

e

relative

(%

)

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p

. s)

[tampon] (mol/L)

phosphateimidazole

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

40

t=0 t=15' t=2h t=5h t=8hAct

ivité s

pécifiqu

e

relative

(%)

Act

ivité s

pécifiqu

e

(U /

g p.

s)

Durée de suspension

phosphate 0,5 Mimidazole 0,25 M

152

1) Biotransformation de 14a à 0,5 g/L

Le premier essai est effectué avec 0,5 g/L de 14a. La réaction est très lente (seulement

10% de cétone transformée en 5h) mais s’accélère après un ajout de cellules fraiches (flèche

jaune). Le suivi analytique montre à la 9ème heure, une disparition de la moitié de la cétone, son

excès énantiomérique atteignant sa valeur maximale de 95%, et une formation de la lactone

avec 45% de rendement. La réaction parait ralentie par l’effet de phosphate sur l’activité

cellulaire. Nous avons vérifié qu’au bout de 25 h les cellules ne sont plus actives sur la

bicyclohepténone. La disparition de la lactone à partir de 9h montre qu’elle n’est pas stable

dans ces condition de réaction, ce qui était attendue. Plus surprenant l’ee de la cétone reste

stable malgré les conditions racémisantes. Ceci pourrait provenir d’une consommation

éventuelle du phosphate par les cellules, ce qui réduirait sa concentration dans le milieu et

affaiblirait son effet racémisant.

Graphique 32 : Biotransformation de la phénylcyclohenanone 14a (0,5 g/L) à pH 8,5 ap s ajout d’u e solutio tampon de phosphate (concentration finale en tampon 0,5M) . La fl he jau e ep se te l’ajout de cellules

fraiches.

2) Biotransformation de 14a à 0,25 g/L

Nous avons vérifié que l’amélioration de la vitesse de réaction observée lors de l’ajout

de cellules fraiches provient d’une diminution de la concentration en substrat due à la dilution.

Ainsi à 0,25 g/L de cétone 14a et à pH 8,5, la transformation a lieu presque aussi rapidement

qu’en absence de tampon phosphate (Graphique 33). Dans les deux cas, l’ee de la cétone atteint

un palier de 90%, et environ 50% de lactone se forment en environ une heure (Graphique 33).

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 14a, phosphate (0,5 M; pH 8,5)

Rdt cétoneRdt lactoneee cétoneee lactone

153

Les courbes ont l’allure d’une résolution cinétique classique jusqu’à ce moment puis divergent

légèrement. Dans la réaction sans phosphate l’ee de la cétone atteint rapidement 92%, une

valeur qui ne sera atteinte que lentement avec le phosphate. Le rendement de la lactone

augmente jusqu’à 55 % en présence de phosphate puis chute dans les deux cas tandis que son

ee reste supérieur à 99%. La cétone en revanche disparait continuellement en présence de

phosphate et reste stable en son absence.

Graphique 33 : Biotransformation de la phénylcyclohenanone 14a à pH8,5 avec et sans tampon phosphate

(concentration en substrat est de 0,25 g/L) .

Ces résultats semblent indiquer l’existence d’une DCD en présence de phosphate qui

serait masquée par l’instabilité de la lactone dans les conditions de la réaction et aussi un

ralentissement de la racémisation au cours du temps. Ils montrent aussi d’autre part que les

phénomènes de toxicité induits par le substrats dépendentde la composition du milieu de

biotransformation.

3) Stabilité des substrats et produits dans les conditions de réaction

Nous avons étudié la stabilité de la cétone 14a et de sa lactone 14b dans les conditions

précédentes en absence de cellules.

Stabilité de la cétone 14a :

Nous avons retenu de l’expérience effectuée précédemment à pH 8,5 (sans phosphate)

que la cétone est stable dans le milieu de réaction. Cette cétone a été suivie dans un milieu

aqueux, en présence de phosphate (0,5M ; pH 8,5; 30°C), et s’est montrée également stable

durant 20h. Ces deux observations éliminent l’hypothèse d’une dégradation de la cétone par

voie microbiologique, et confirme sa stabilité lors de la bioconversion.

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 14a, phosphate (0,5M; pH 8,5)

Rdt cétoneRdt lactoneee cétoneee lactone

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

temps (h)

Bioconversion 14a, pH 8,5

154

Stabilité de la lactone 14b :

Les lactones sont connues pour leur instabilité à pH très basique. Cependant les -

valérolactones se recyclisent très facilement à pH acide, c’est-à-dire dans les conditions

d’analyse utilisées, ce qui ne parait pas être le cas des -caprolactones.

Nous avons ainsi étudié la stabilité de la lactone 14b dans l’eau à pH 8,5 et en conditions

neutres où elle devrait être plus stable. Comme prévu, nous avons observé après 20h une perte

de 80% de la lactone dosée au départ (Graphique 34), ce qui indique son ouverture en hydroxy-

acide et l’absence de recyclisation dans les conditions d’analyse et qui explique les faibles

quantités mesurées lors de la biotransformation.

Graphique 34 : Stabilité de la lactone 14b à pH=7 et pH=8,5.

4) Quantification de l’hydroxy-acide en fin de biotransformation

Pour bien identifier une DCD, il est indispensable de connaitre la quantité de produit

formé avec précision. Nous avons donc décidé de quantifier la forme ouverte de la lactone

14b. L’hydroxy-acide est extrait par un solvant après acidification du milieu et méthylé pour

être facile à doser par CPG. La mise au point a été faite sur la lactone 14b racémique obtenue

par synthèse chimique et préalablement solubilisée dans l’eau.

Pour être sûr des résultats du dosage lors des biotransformations, nous avons choisi de

basifier le milieu cellulaire avec de la soude concentrée afin d’assurer une ouverture complète

de la lactone restante. Elle est ainsi en totalité sous une seule forme, l’hydroxy-carboxylate,

qui est transformé en hydroxy-acide 14c par acidification du milieu à pH 2. Celui-ci est ensuite

extrait en continue par le dichlorométhane, puis réagit avec le diazométhane pour former

l’ester méthylique hydroxylé 14d.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

% lact

one 1

4b

temps (h)

eau pH 7eau pH 8,5

155

Schéma 20

Nous avons appliqué cette méthode à la mesure de la lactone dans les deux

biotransformations précédentes (sans et avec phosphate à pH 8,5). L’analyse a donné un

rendement de 38% en absence de phosphate et de 67% dans en présence du phosphate, donc

notablement supérieur aux 50% d’un simple dédoublement cinétique, suggérant que le DCD a

bien eu lieu.

C. DCD préparatives avec le tampon phosphate

Ces résultats étant encourageants, nous avons procédé aux DCD des deux cétones 13a

et 14a à l’échelle préparative et à la concentration de 0,5 g/L.

1) Cétone 14a

L’essai précèdent de DCD analytique avec 14a à 0,5 g/L (§ B1), a montré que le rajout

de cellules centrifugées permet de relancer la réaction une fois le premier lot de cellules

épuisé. Cette fois, nous avons décidé d’ajouter le tampon phosphate après avoir obtenu un ee

élevé de la cétone c’est-à-dire après un dédoublement cinétique simple. Cela a permis d’avancer

la réaction, d’éviter de charger le milieu en biomasse réduisant ainsi une consommation

éventuelle de phosphate par les cellules et surtout de travailler à une concentration

supérieure en substrat..

Nous observons au début de la réaction une transformation rapide de la cétone, son ee

atteignant 92% au bout d’une heure (graphique 22). Après l’ajout de phosphate (0,5 M), la

disparition de la cétone progresse lentement, indiquant que la racémisation in situ a lieu. Cette

156

racémisation est confirmée par l’existence d’un plateau à 90% pour l’ee puis une chute à 70%

au moment où la racémisation l’emporte sur l’activité cellulaire, celle-ci ayant commencé à

baisser du fait de la mort des cellules. La lactone ne dépasse pas les 50% mais l’hydroxyacide

(forme ouverte de la lactone) n’a pas été mesuré à ce stade.

Graphique 35

Après l’arrêt du fermenteur et traitement du milieu comme décrit précédemment, nous

avons pu récupérer après purification 497 mg (78%) d’ester méthylique hydroxylé 14d, de

configuration absolue (R) et avec un excellent ee de 99%, qui découlent directement de ceux

de la lactone 14b formée, de configuration (R) et d’ee égal à 99%. Le DCD a donc réussi avec

un rendement de 78% en au bout de 28h de réaction.

2) Cétone 13a

Nous avons précédemment observé que la cétone 13a se racémise plus vite que 14a en

présence de tampon phosphate. Nous avons tenté d’effectuer le DCD en ajoutant directement

le phosphate avec des cellules fraichement préparées. Au bout de 5h, la cétone est

transformée à 50%, son ee atteint 88% et se stabilise. Ce plateau est caractéristique des

DCD car il signale l’existence d’un équilibre entre la consommation de l’énantiomère réactif du

fait de la biotransformation enzymatique et la racémisation in situ. Le rendement en lactone

plus faible qu’attendu parait signaler une ouverture partielle de la lactone. Puis comme avec

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 14a préparative, phosphate (0,5M; pH 8,5)

Rdt cétoneRdt lactoneee cétoneee lactone

157

14a une baisse de l’ee de la cétone indique la mort des cellules et un maintien de la

racémisation.

En partant de 400 mg de 13a, nous avons obtenu après purification 346 mg (71%)

d’ester méthylique hydroxylé (R)-13d avec un excellent excès énantiomérique de 99%.

Graphique 36

Conclusion

Nous avons donc réussi à réaliser pour la première fois un Dédoublement Cinétique

Dynamique avec les cyclohexanones. Les lactones correspondantes étant ouvertes

partiellement dans le milieu basique (pH 8,5), nous avons choisi de les isoler sous forme de

méthyl esters hydroxylés. Nous avons ainsi synthétisé respectivement 78% d’hydroxy-ester

méthylique 14d et 71% de 13d avec des ee supérieurs à 99%.

V. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon glycine

Au vu des résultats obtenus avec le tampon phosphate, moins encourageants que nous

l’aurions souhaité, nous avons étudié l’effet du tampon glycine.

A. Concentration de tampon supportée par les cellules

L’activité des cellules a été testée en présence d’un tampon glycine 0,5 M à pH 8, et

nous l’avons comparé avec les autres tampons (Graphique 37). Heureusement, nous n’avons pas

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 13a préparative, phosphate (0,5M; pH 8,5)

rdt cétonerdt lactoneee cétoneee lactone

158

revu avec ce tampon un effet de toxicité induite, comme avec l’imidazole. Les cellules

conservent 50% de leur activité initiale après 15 min de suspension, c’est-à-dire autant

qu’avec le phosphate. Mais ce qui était encore plus encourageant, est la persistance d’une

activité importante après 6h (40%), et surtout après 19h ce qui correspond à la durée d’un

DCD.

Graphique 37

B. Essais analytiques préliminaires

1) Biotransformation de 14a à 0,5 g/L

Nous avons suivi analytiquement à l’échelle de 20 mL, le DCD de la cétone 14a avec la

glycine à 0,5 M et pH 8. Le Graphique 27 montre que la transformation commence comme

attendu, la disparition de la cétone et l’évolution de son ee sont en cohérence. La racémisation

in situ a bien lieu, la moitié de la cétone est transformée et affiche un ee d’environ 50% au

bout de 3h. L’activité cellulaire reste constante tout au long de la réaction et permet la

transformation de 80% de la cétone en environ 8h.

0

20

40

60

80

100

Act

ivité r

elative

(%)

Activité cellules (+ tampons), 0,5M pH 8 Activité cellules (+glycine) /

temps de suspension

159

Graphique 38

Du fait de l’ouverture de la lactone à pH basique, il est difficile de dire si nous sommes

en présence d’une DCD. Nous avons donc décidé de rechercher une méthode, rapide et facile

à réaliser, pour suivre la quantité d’hydroxy-acide formé au cours de la réaction plutôt que de

devoir attendre d’avoir effectuer l’analyse complète de la biotransformation.

2) εuivi cinétique de l’hydroxy-acide au TMSH :

L’emploi d’hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH) a été décrit pour l’étude des acides

gras présents dans différentes huiles 259, 260. Utilisé en solution méthanolique à 0,2 M, le

TMεH est un agent alkylant basique conduisant à la formation d’esters méthyliques d’acides

gras par transestérification de triacylglycérols et d’acides gras libres. Il est utilisé en routine

pour les analyses en CPG car il ne laisse pas de résidu même s’il est utilisé en excès.

Nous l’avons utilisé pour transformer à la fois la lactone et l’hydroxy-acide

correspondant en ester méthylique hydroxylé selon le schéma suivant :

Schéma 21

0

25

50

75

100

0 2 4 6 8 10

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 14a analytique, glycine (0,5M; pH 8)

Rdt cétoneRdt lactoneee cétoneee lactone

160

Par comparaison au diazométhane, cette méthode évite de préparer ce dernier et d’avoir

à ouvrir la lactone au préalable. Le prix du TMSH le réserve cependant à des usages

analytiques.

C. DCD préparatives avec le tampon glycine

1) 2-phénylcyclohexanone 14a

La DCD préparative de 14a est réalisée à 0,5 g/L, dans un volume de 200 mL (fiole 3L).

La quantité réelle de la lactone formée est analysée au cours de la réaction par méthylation

au TMSH. Nous observons sur le Graphique 39 que la cétone disparait et que la lactone (sous

forme ouverte ou fermée) augmente en parallèle. Au bout de 24h elle a atteint à 80% de

rendement alors qu’il ne reste plus que 10% de cétone résiduelle. Il y a clairement un écart

qui augmente pendant la réaction entre le dosage direct de la lactone et celui de l’ester

méthylique représentant la quantité réelle de la lactone formée dans le milieu.

Graphique 39 : Suivi analytique de la biotransformation du composé 14a avec le tampon glycine (0,5M ; pH 8). A

gauche, la lactone est analysée directement par CPG, à droite la lactone est analysée après dérivatisation en

ester méthylique.

L’évolution de la réaction parait lente, par rapport à ce qui était observé lors d’essai

analytique. L’ee de la cétone monte progressivement pour atteindre un niveau élevé à la fin de

la réaction. Il semble que l’effet racémisant de la glycine, à partir de la 7ème heure, devient

plus faible. Mais finalement, en partant de 100 mg de cétone racémique, nous avons récupéré

105 mg (83%) d’ester méthylique hydroxylé (R)-14d énantiopur, découlant de la lactone (R)-

14b.

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

Rdt cétone

ee cétone

Rdt lactone

ee lactone

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

Rdt esterméthylic

161

Nous avons montré que le tampon glycine à pH 8 permet aussi de réaliser un DCD de la

cyclohexanone 14a. Le rendement est légèrement amélioré par rapport à celui obtenu avec le

tampon phosphate à pH 8,5 (83% versus 78%). La méthode de suivi de lactone au TMSH a

montré son efficacité et permet une quantification de la lactone au cours du temps plus proche

de la réalité.

2) 2-benzyloxyméthyl-cyclohexanone 13a

Nous avons procédé avec 13a de la même façon qu’avec 14a. Au bout de 7 heures, l’ee

de la cétone se stabilise vers 80% tandis que la cétone continue à disparaitre. Le rendement

en lactone (mesurée après méthylation) augmente continuellement jusqu’à atteindre 85% de

rendement après 22h de réaction.

Graphique 40 : Suivi analytique de la biotransformation du composé 13a avec le tampon glycine (0,5M ; pH 8). A

gauche, la lactone est analysée directement par CPG, à droite la lactone est analysée après dérivatisation en

ester méthylique..

Après extraction et purification, nous avons isolé 97 mg (80%) d’ester méthylique

hydroxylé 13d avec un excellent excès énantiomérique de 99%, provenant de la lactone (R)-

13b énantiopure.

3) 2-benzyloxyméthyl-cyclopentanone 12a

Contrairement aux -caprolactones, les -valérolactones se recyclisent facilement en

milieu acide après ouverture en milieu basique. La cyclisation de l’hydroxy-acide s’effectue en

acidifiant le milieu aqueux à un pH inférieur à 3 et en ajoutant une résine acide (Amberlite IR

120) dans la phase organique lors de l’extraction en continu au dichlorométhane. Ce traitement

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

Rdt cétone

ee cétone

Rdt lactone

ee lactone

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

Rdt estermethylic

162

a permis de quantifier la lactone 12b en fin de biotransformation, et de la suivre

cinétiquement par des prélèvements à des intervalles de temps déterminés.

Puisque la cyclopentanone 12a est facilement racémisée (voir paragraphe IID), nous

avons voulu voir s’il était possible de réaliser un DCD à pH neutre en présence de tampon

glycine (Graphique 41). Malgré le maintien de l’ee de la cétone inférieur à 20%, nous

n’observons pas de disparition totale de la cétone et le rendement en lactone ne dépasse pas

les 50%. Il s’agit donc plutôt d’un dédoublement cinétique simple. En revanche, à pH 8, la

cétone est complètement transformée au bout de 22 heures et la lactone est formée avec

80% de rendement.

Graphique 41

La DCD préparative de 12a a été réalisée dans une fiole de 2L (200 mL de milieu) en

présence d’une solution tampon à base de glycine de 0,5M. En partant de 100 mg de cétone,

nous avons récupéré 86 mg (80%) de la lactone (R)-12b avec un excès énantiomérique de 96%.

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20

Rdt

ou e

e (%)

temps (h)

DCD 12a, Glycine (0,5M; pH 7)

Rdt cétoneee cétoneRdt lactoneee lactone

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20temps (h)

DCD 12a, Glycine (0,5M; pH 8)

163

VI. Conclusion

Résumé des résultats

Les résultats des différentes expériences de DCD que nous avons réalisées avec des

cellules entières de E. coli TOP10 produisant la CHMOAcineto comme biocatalyseur et des

tampons concentrés comme agent de racémisation sont reportés dans le tableau récapitulatif

ci-dessous.

Tableau 23 : Tableau récapitulatif des Dédoublements Cinétiques Dynamique.

Conclusion

Le suivi des lactones tout au long de la réaction a été mis au point par méthylation

directe au TMSH qui permet d’estimer rapidement s’il y a mise en place d’un DCD.

164

Nous avons finalement réalisé des Dédoublements Cinétiques Dynamiques sur trois

cétones cycliques α-substituées en présence de tampons phosphate ou glycine à la

concentration de 0,5M. Cette approche a pu être appliquée avec succès pour la première fois

sur des cyclohexanones. Les cétones racémiques ont été transformées en une vingtaine

d’heures et ont conduit aux lactones ou aux esters méthyliques hydroxylés correspondants

quasi énantiopurs avec des rendements compris entre 70 et 83%.

165

Conclusion générale

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes attachés à mettre au point des synthèses

de lactones sous forme énantiomériquement pure en utilisant des catalyseurs biologiques. Ces

biocatalyseurs sont des bactéries E. coli recombinantes, produisant des Baeyer-Villiger

Monooxygénases.

Nous nous sommes particulièrement intéressés aux enzymes de deux souches

d’Acinetobacter, A. baylyi ADP1 et A. baumannii AYE, dans le cadre d’une collaboration avec

le Génoscope d’Evry. En effet, la CycloHexanone MonoOxygénase d’un autre microorganisme

appartenant au même genre, A. calcoaceticus, est une des BVMOs de référence de réactions

de BV microbiologiques du fait de sa très large gamme de substrats et de sa stéréospécificité.

Il était donc tentant d’explorer le génome maintenant complètement séquencé de ces deux

souches. Les gènes de dix BVMOs putatives ont été identifiés et six d’entre eux, deux

provenant de la souche A. baylyi et quatre de la souche A. baumannii, ont été clonés dans E.

coli BL21 pour notre étude.

Quatorze cycloalcanones α- ou -substituées choisies en fonction de l’intérêt des

lactones correspondantes ont été testées comme substrats potentiels. Nous avons montré

que quatre de ces protéines sont des BVMOs avérées. Elles possèdent par ailleurs un contexte

génomique proche de celui de la CHMO d’A. calcoaceticus à la différence des deux autres

protéines, non actives. Ces quatre BVMOs affichent une spécificité de substrats similaire,

avec une préférence pour les petits cycles cétoniques (de 4 à 6 membres) et les substituants

aryliques. En revanche leurs régio-, énantio- et/ou énantiotoposélectivités sont parfois

différentes. La sélectivité de certaines de ces enzymes les rend complémentaires aux

enzymes connues. Ainsi une enzyme en particulier, ABAYE 2617, se distingue car elle a permis

la réalisation d’un Dédoublement Cinétique Parallèle δégiodivergent qui a abouti à la synthèse

de deux lactones bicycliques, la (+)-(1R,5S)-2-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-3-one et la (+)-

(1S,5R)-3-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-2-one, sous forme quasi énantiopure et avec des

configurations absolues rarement obtenues. L’énantiocomplémentarité de cette enzyme a

également été précisée sur des cyclobutanones benzyliques. Nos ’études préliminaires de

modélisation moléculaire pour comprendre les raisons de cette inversion de sélectivité n’ont

166

pas donné de résultats concluants du fait de l’absence de modèle cristallographique de qualité

suffisante et demandent donc à être poursuivies.

L’autre partie de ce travail concerne la mise en place de Dédoublements Cinétiques

Dynamiques. Les cyclohexanones α-substituées, plus difficiles à racémiser que les

cyclopentanones qui ont déjà donné lieu à des DCD, ont été plus particulièrement ciblées. Nous

avons utilisé pour cela des cellules entières de E. coli TOP10 produisant la CHMO d’A.

calcoaceticus, un biocatalyseur qui a déjà largement fait ses preuves vis-à-vis de cette famille

de substrats. Des DCD ont ainsi été réalisés avec plusieurs cyclohexenones en utilisant une

nouvelle technique de racémisation. Celle-ci consiste à favoriser la racémisation par

l’utilisation de solutions tampons concentrées à base de phosphate ou de glycine. Les lactones

correspondantes ont été isolées sous forme d’esters méthyliques hydroxylés quasi

énantiopurs avec des rendements compris entre 70 et 80%.

Cette nouvelle approche impliquant des agents racémisants solubles, à la différence des

résines anioniques par exemple, ouvre la possibilité d’associer DCD et in situ SFPR. Cette

dernière technique est destinée à surmonter les limitations en concentration dues aux

phénomènes d’inhibition fréquemment rencontrés avec ces enzymes et est basée sur l’emploi

de résines adsorbantes comme réservoir à substrat et piège à produit. Une amélioration

conséquente de la productivité des DCD grâce à une augmentation des concentrations en

substrats serait alors envisageable qui ne pourrait que favoriser le développement de tels

procédés biocatalytiques à une large échelle.

167

Partie expérimentale

168

169

I. Généralités

A. Techniques d’analyse

Techniques de chromatographie et de purification

Les chromatographies en phase gazeuse (CPG) ont été réalisées sur un appareil Shimadzu GC-14A équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (H2/air) et d’un intégrateur Shimadzu CR-5A, le gaz vecteur utilisé est l’hydrogène. Les conditions générales utilisées :

Débit de gaz vecteur P = 1.2 bars. Injecteur en mode split (60 mL/min), T=250°C. Détecteur T=250°C. Les dosages quantitatifs ont été effectués sur une colonne capillaire Equity 5 (Supelco,

0.25 mm, 30 m) ou Optima 5 (Macherey-Nagel, 0.25 mm, 30 m) en utilisant la méthode de l’étalon interne.

La détermination des excès énantiomériques (ee) a été réalisée sur des colonnes capillaires chirales à cyclodextrine modifiée (0.22 mm, 25 m). Les colonnes chirales utilisées sont numérotées pour plus de commodité:

Colonne 1 : -TBDAc (Macherey-Nagel) Colonne 2: Lipodex E (Macherey-Nagel) Colonne 3 : Lipodex G (Macherey-Nagel) Colonne 4 : Chirasildex CB (VARIAN) Colonne 5 : DAcTBuSIlGammaCDX (OV1701) (MEGA) Colonne 6 : Hydrodex -DiMOM (Macherey-Nagel)

Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur des plaques de gel de silice (Merck Gel 60 F254). Le solvant d’élution varie suivant les produits et sera indiqué dans chaque cas. La révélation des plaques est effectuée à l’aide d’une solution de paranisaldehyde ou de permanganate de potassium KMnO4.

Les séparations par chromatographie sur colonne sont réalisées sur gel de silice 0,063-0,2 mm (Roth Gel 60). Dans certains cas qui seront précisés, la séparation a été effectuée sur des verres frittés sur silice fine 5-40 µm (Fluka gel H). Le solvant d’élution varie suivant les produits à séparer et sera indiqué pour chaque composé.

Les distillations à pression réduite dans un four à boules sont réalisées à l’aide d’un appareil Buchi GKR-50.

Techniques spectroscopiques et d’analyse

Les pouvoirs rotatoires des produits sont déterminés après purification au four à boules, sur un polarimètre Perkin Elmer 241C pour la raie D du sodium (λ=589 nm). Les solvants

170

utilisés et les concentrations seront précisés pour chaque composé. La concentration c étant exprimée en % (g/100 mL).

Les analyses par RMN sont effectuées sur les produits en solution dans CDCl3. Les spectres de RMN 1H (300 MHz) et 13C (75 MHz) ont été enregistrés sur un spectromètre BRUKER Avance III nanobay - 300MHz (aimant de 7,05 teslas). Les déplacements chimiques , sont reportés en parties par million (ppm) par rapport au tetramethylsilane (TMε), utilisé

comme référence interne. Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz et les symboles s, d, t, dd, dt, m signifient respectivement singulet, doublet, triplet, doublet de doublet, doublet de triplet et multiplet.

La microanalyse élémentaire est réalisée sur un analyseur élémentaire Thermo Finnigan EA 1112. Les résultats sont fournis avec une précision absolue de ± 0,3 % et sont validés pour deux essais minimum.

Techniques d’alignement de séquences protéiques

Les scores des alignements de séquences protéiques ont été calculés avec le logiciel « pBLAST » en effectuant une recherche sur la banque « Non-redundant protein sequences ». Les paramètres d’algorithme utilisés sont les paramètres par défaut du logiciel :

Paramètres généraux : Max target sequences : 100. Short queries : automatically Expect threshold : 10 Word size : 3 Max matches in a query range : 0

Paramètres de scoring : Matrix : BLOSUM62 Gap Costs : Existence 11, Extension 1 Compositional adjustements : conditional score matrix

Les pourcentages de similarité ont été calculés après alignement avec le logiciel Clustal Omega en utilisant ses paramètres par défaut.

B. Matériels

Des fermenteurs de taille variable ont été utilisés : 1L (Sartorius BiostatQ), 2L (Setric Génie Industriel), 11L (New Brunswick Scientific) ainsi que des incubateurs Infors ou des bains thermostatés et agités

C. Solvants et composés chimiques

Le pentane et l’acétate d’éthyle ont été utilisés après distillation. L’éther éthylique et le THF ont été pré-séchés sur CaCl2 (préalablement séché à l’étuve pendant 24h) puis distillés sur sodium avec benzophénone. Le dichlorométhane et le chloroforme ont été directement utilisés pour l’extraction en continue.

171

Les produits chimiques et biologiques ont été commandés chez Sigma Aldrich, Fischer Scientific et Roth.

II. Synthèses

A. Synthèse de la 2-benzyloxymethyl-cyclopentanone 12a :

Acétal de l’éthyl 2-cyclopentane carboxylate 19

On mélange 10 g d’éthyl 2-cyclopentane carboxylate (0,06 mol) et 11 g d’acide paratoluène sulfonique préalablement dissous dans 35 mL d’éthylène glycol. Le mélange est agité à température ambiante pendant 15 heures sous argon. Le milieu réactionnel est alors hydrolysé avec 50 mL d’une solution de KOH 1M, lavé avec 200 mL d’une solution saturée de NaCl puis extrait avec (4x50 mL) d’éther éthylique. La phase organique est séchée sur MgSO4. Après évaporation de l’éther, on obtient 11,5 g d’éthyl carboxylate protégé pur 19 (0,057 mol) sous forme d’huile jaune. Le rendement est de 91%.

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 0,95 (m, 3H, 0CH2CH3) ; 1.6-2.1 [m, 6H, (CH2)3 cycle] ;

2.6 (m, 1H, CH cycle) ; 3.9 (m, 4H, acétal) ; 4.16 (m, 2H, 0CH2CH3). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 14.3 ; 22.1 ; 26.9 ; 36.8 ; 52.3 ; 61.7 ; 64.5 ; 65.2 ; 110.3 ;

173.4. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 140°C / tR: 3.8 mn Eluant pour la chromatographie colonne : Pentane /AcOEt : 90 / 10

Ethyl 1,4-dioxaspiro[4.4]nonane-6-carboxylate 20

A une solution de 2,8 g (0,07 mol) de LiAlH4 dans 50 mL de THF anhydre, on ajoute goutte à goutte 11,5 g (0,057 mol) de 8 dissous dans 10 mL de THF anhydre. Le milieu réactionnel est agité vigoureusement à 0°C pendant deux heures, puis il est hydrolysé par ajout goutte à goutte de successivement 2,8 mL d’H2O, 3x2,8 mL d’une solution de NaOH à 15%, 2,8 mL d’H2O jusqu’à la formation d’un précipité blanc. La phase organique est filtrée, séchée sur MgSO4 et concentrée sous vide. Après purification sur colonne de gel de silice (éluant : Pentane/AcOEt : 1/1), 9,3 g de l’acétal réduit 20 pur sont récupérés (Rendement = 71%).

172

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.5-1.9 [m, 6H, (CH2)3 cycle] ; 2.1 (m, 1H, CH cycle) ; 2.7 (s, 1H, OH) ; 3.6 (m, 2H, CH2OH) ; 3.9 (m, 4H, acétal). RMN 13C (CDCl3, MHz) : 21.7 ; 26.1 ; 36.1 ; 47.4 ; 62.9 ; 64.4 ; 64.9 ; 119.4. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 140°C / tR: 2.6 mn Eluant pour la chromatographie colonne : Pentane / AcOEt 50 / 50

6-benzyloxymethyl-1,4-dioxaspiro[4.4]nonane 21

Dans un ballon, on introduit 3,6 g (0,023 mmol) d’alcool 20 pur obtenu de l’étape précédente dans 40 mL de THF anhydre. On ajoute par petites portions 1,1 g (0,045 mmol) d’hydrure de sodium prélavé avec du pentane. On laisse agiter pendant 30 minutes avant d’y ajouter goutte à goutte une solution de 2,7 mL (22,7 mmol) de bromure de benzyle dans 10 mL de THF anhydre. On porte ensuite le mélange réactionnel à reflux pendant 24 heures. On arrête la réaction en ajoutant doucement de l’eau salée (solution saturée) jusqu’à ce que les sels durcissent. Après extraction à l’AcOEt, la phase organique est filtrée et séchée sur MgSO4. Une fois le solvant évaporé, on purifie par chromatographie sur silice fine en utilisant le gradiant d’éluant suivant : pentane (x5) ; Pentane / AcOEt 99:1 (x2) ; p / A 95:5 (x4) ; p / A 90:10 (x4) ; p / A 80:20 (x4)]. Après concentration du solvant, 3,6 g de cétone protégée 21 sont obtenus avec un rendement de 66 %.

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.5-2 [m, 6H, (CH2)3 cycle] ; 2.3 (m, 1H, CH cycle) ; 3.4 (m, 1H, CH2O) ; 3.6 (m, 2H, CH2O) ; 3.9 (m, 4H, acétal) ; 4.5 (s, 2H, OCH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 22.2 ; 26.5 ; 37.6 ; 45.2 ; 64.6 ; 64.9 ; 69.8 ; 73.5 ; 113.1 ; [ 126.7 ; 128.6 ; 138.2 (6C, ArC) ]. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 180°C / tR: 6.9 mn

2-(benzyloxymethyl)-cyclopentanone 12a

3 g (0,012 mol) de cétone protégée pure sont solubilisés dans 10 mL d’EtOH absolu. On ajoute 1,5 g d’Amberlite 15 et on laisse agiter à température ambiante pendant 4h. Le mélange est filtré sur célite pour enlever la résine et rincée à l’AcOEt. La phase organique est lavée avec de l’eau et mise à sécher sur MgSO4. Après évaporation du solvant, le résidu est purifié

173

sur colonne de gel de silice (éluant : Pentane / AcOEt 95:5). 1,5 g de produit final 12a pur sont récupérés (Rendement = 61%).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.7-2.5 (m, 7H, cycle) ; 3.7 (m, 2H, CH2O) ; 4.5 (s, 2H, CH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 20.9 ; 27.2 ; 38.6 ; 49.4 ; 69.2 ; 73.2 ; [ 127.5 ; 128.3 ; 138.2 (6C, Arc) ]. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 180°C / tR: 3.8 mn Eluant pour la chromatographie colonne : Pentane / AcOEt : 70 / 30

B. Synthèse de la 2-benzyloxyméthyl-cyclohexanone 13a

Acétal de l’éthyl 2-cyclohexane carboxylate 22

Le mode opératoire est identique à celui suivi pour le composé 19 (Rendement : 82%). RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1,2 (m, 3H, 0CH2CH3) ; 1.5-2 [m, 6H, (CH2)4 cycle] ; 2.66 (m, 1H, CH cycle) ; 3.9 (m, 4H, acétal) ; 4.15 (m, 2H, 0CH2CH3). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 14.2 ; 22.9 ; 23.3 ; 27.3 ; 34.6 ; 49.9 ; 60.1 ; 64.5 ; 64.9 ; 108.6 ; 172.2. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 140°C / tR: 5.2 mn CCM : Ether éthylique / Ether de pétrole 40/60 (Rf = 0,4).

Ethyl 1,4-dioxaspiro[4.5]decane-6-carboxylate 23

Le mode opératoire est identique à celui suivi pour la synthèse du composé 20 (Rendement : 65%).

174

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.2-1.9 [ 3m, 9H, cycle] ; 2.8 (S, 1H, OH) ; 3.6-3.8 (2m, 2H, CH2OH) ; 4.05 [ m, 4H, (CH2)2 acétal ]. RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 23.9 ; 24.7 ; 27.3 ; 34.4 ; 46.01 ; 63.8 ; 64.4 ; 64.8 ; 112.03. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 140°C / tR: 3.6 mn Eluant pour la chromatographie colonne : Pentane / AcOEt 80 / 20

6-benzyloxymethyl-1,4-dioxaspiro[4.5]décane 24

Le mode opératoire est identique à celui suivi pour la synthèse du composé 21 (Rendement : 73%). RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.3-1.8 [ m, 8H, (CH2)4 cycle] ; 2.1 (m, 1H, CH cycle) ; 3.4 (t, J=8.6 Hz, 1H, CH2OBn) ; 3.7 (dd, J=3.3 Hz, J=9.1 Hz, 1H, CH2OBn) ; 3.9 [ m, 4H, (CH2)2 acétal ] ; 4.6 (q, J=12 Hz, 2H, OCH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 24.2 ; 24.5 ; 28.2 ; 35.2 ; 45.2 ; 64.9 ; 65 ; 70.2 ; 73.5 ; 110.3 ; [ 127.8 ; 128.7 ; 139.1 (6C, ArC) ]. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 180°C / tR: 10.4 mn

2-(benzyloxymethyl)-cyclohexanone 13a

Le mode opératoire est identique à celui suivi pour la synthèse du composé 3a (Rendement : 75%). RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.7-2.0 [3m, 6H, (CH2)3 cycle] ; 2.3 (m, 2H, -CH2CO- cycle) ; 2.7 (m, 1H, -CH cycle) ; 3.45-3.8 [ (dd, J=7.3 Hz, J=9.5 Hz, 1H) ; (dd, J=5,1 Hz, J=9,5 Hz 1H) ; -CH2OBn) ; 4.6 (q, J=12 Hz, 2H, OCH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 24.6 ; 27.7 ; 31.4 ; 42.1 ; 50.9 ; 69.4 ; 73.3 ; [ 127.5 ; 128.3 ; 138.4 (6C, ArC) ] ; 213. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 180°C / tR: 5.7 mn Eluant pour la chromatographie colonne : Pentane / AcOEt 90 / 10

175

C. Synthèse des lactones racémiques par réaction de BV chimique

On mélange 1 équivalent de cétone, 1,3 équivalent de MCPBA (pur à 75% dans l’eau) et 3 équivalents de Na2HPO4 dans CH2Cl2 à température ambiante. La réaction est suivie par CPG. A l’arrêt de la réaction, le peracide restant est neutralisé par NaHSO3 à 10% (suivi au papier KI). Le milieu est ensuite alcalinisé avec une solution saturée de NaHCO3 (suivi au papier pH), rincé avec une solution saturée de NaCl et extrait par du CH2Cl2. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le mélange brut est purifié sur colonne de silice.

III. Gènes et enzymes

Numéros d’accession des protéines et les noms de gènes correspondants (Uniprot)

Nom Nom de gène ° d’a essio

CHMOAcineto Chnb P12015

HAPMO hapE Q93TJ5

BVMOAradio D7PBN2

CHMORhodoRHA1 Q0SFK1

ACIAD1 ACIAD 1733 Q6FBI8

ACIAD2 ACIAD 2339 Q6F9Z5

ACIAD 2794 Q6F8T2

ACIAD 3192 Q6F7T9

ABAYE1 ABAYE 2056 B0VD38

ABAYE2 ABAYE 2606 B0VAJ2

ABAYE3 ABAYE 2614 B0VAH6

ABAYE4 ABAYE 2617 B0VAH9

ABAYE 0435 B0V6U9

ABAYE 1825 B0V4F8

IV. Culture des microorganismes

A. Mesure du poids sec

25 mL de milieu de culture sont prélevés et centrifugés (30 min à 13 000g ). Le culot est lavé 3 fois par resuspension dans un tampon phosphate à pH 7. Il est ensuite mis à l’étuve à 80°C pour 48h et pesé. Le poids sec calculé est de 0,54 mg de cellules / unité DO.

B. Culture d’E. coli Top10[pQR239]

Milieu de culture spécifique à base de peptone de soja (Msoja) :

10 g/L soybean peptone (Fluka n° 87972)

176

10 g/L extrait de levure 10 g/L glycerol 10 g/L NaCl

Antibiotique : L’ampicilline est ajoutée au milieu stérile de manière à obtenir une concentration finale

de 50 mg/L. Elle est préparée initialement à une concentration de 50 g/L eau distillée et filtrée à travers un filtre de 0.2 µm dans un tube stérile.

Conservation de la souche :

Les échantillons sont préparés à partir d’un inoculum congelé à -80°C (ou à partir d’une boite de pétri) avec lequel on ensemence une fiole de 50 mL de milieu contenant l’ampicilline. On laisse la croissance se poursuivre à 37°C pour une nuit (DO > 10). On partage le contenu de la fiole dans des eppendorfs stériles et on leur ajoute v/v (1:1) d’une solution stérile du glycérol à 80% dans l’eau. On congèle ainsi certains échantillons à -20°C (pour l’utilisation directe : ensemencement des fioles) et d’autres à -80°C (stockage longue durée).

Culture (fermenteur 10L) :

Pré inoculum : On ensemence un tube de culture stérile rempli à 5 mL de milieu de culture contenant de l’ampicilline et de 200 µl d’un congélat conservé à -20°C et on le laisse sous agitation à 37°C pour une nuit.

Culture en fiole ou inoculum pour fermenteur : on ensemence une fiole de 500mL contenant 100 mL de milieu et de l’ampicilline avec 300 µl du pré-inoculum et on la met à l’incubateur (200 rpm ; T=37°C) pour une nuit.

Culture du fermenteur : après stérilisation du fermenteur contenant 5L du milieu et ajout d’ampicilline, les paramètres sont fixés à:

Température : 37°C Agitation mécanique : 500 rpm Aération : 300 l/h – 1.2 vvm (l’air est stérilisé grâce à un filtre 0.2 µm). Le fermenteur est inoculé avec le contenu de 4 fioles et la croissance des cellules est

suivie par mesure de la densité optique à 590 nm et par mesure du pourcentage d’oxygène dissous mesuré par une sonde à oxygène. Après 2 ou 3h de culture, la DO atteint généralement une valeur comprise entre 6 et 8. La production de la CHMO est induite par ajout de L-(+)-Arabinose à 0,1%. La culture est arrêtée 1h après l’induction (en fin de phase exponentielle). 20 mL de la culture sont prises pour la mesure d’activité et la culture est ensuite stockée à +4°C. Il est important que les récipients de stockage ne soient pas étanches à l’air.

C. Culture des souches d’E. coli BL21 produisant les nouvelles BVMOs

Typiquement, à partir de congélats glycérolés à -80°C, on inocule un tube de culture de 5 mL de milieu TB et on le place sous agitation orbitalaire (une nuit à 37°C ) après avoir ajouté de l’ampicilline à 50 mg/L. On ensemence 100 mL de milieu TB contenus dans une fiole de 500 mL avec environ 2 mL de pré-culture pour obtenir une DO initiale de 0.1. On laisse sous agitation (200 rpm) à 23°C pendant 5h. Du lactose (2,5%) est ajouté et la culture continuée

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pendant encore 16h. La valeur de la DO est en moyenne de 10 à 12 à 590nm. La culture est directement utilisée en bioconversion.

D. Mesure d’activité

Calcul d’activité

Activité apparente :

Au début de la transformation, la formation du produit en fonction du temps suit une loi linéaire. La pente de la droite représente l’activité volumétrique apparente des cellules en quantité de produit(s) formé(s) par minute de réaction rapportée au volume de milieu. L’activité est exprimée en µmol /min /L milieu.

Activité spécifique :

L’activité spécifique apparente est la valeur de l’activité volumétrique apparente divisée par la masse (en g de poids sec) de cellules utilisées pour la biotransformation. On obtient ainsi la valeur de l’activité spécifique des cellules étudiées en µmol /min /g p.s.

Avec des cellules entières

Les mesures sont réalisées avec 20 mL du milieu après croissance des cellules dans une fiole de 250 mL non bafflée dans un agitateur thermostaté à agitation longitudinale (250 rpm) en. Le substrat-test (solution à 5% dans EtOH) est généralement ajouté de manière à obtenir une concentration finale de 0,5 g/L. Des prélèvements sont effectués à des temps réguliers dans des tubes eppendorf de 2 mL, extraits avec un volume équivalent d’une solution d’étalon interne (0,5 g/L dans AcOEt). Le tube est agité, centrifugé (6000 rpm ; 20 s) puis la phase organique est directement analysé par CPG.

E. coli TOP10 (30°C) :

9 mL de cellules en fin de culture sont dilués avec 9mL de tampon phosphate 0,5M pH 7 et 2 mL de milieu de culture frais. Le milieu est mis sous agitation pour 15 min avant d’ajouter la bicyclohepténone.

E. coli BL21 (23°C) :

16 mL de cellules sont suspendus avec 2 mL de phosphate 1M pH 7 et 2mL de milieu de culture frais. Le milieu est mis sous agitation pour 15 min avant d’ajouter la 2-undécanone.

Comparaison E. coli TOP10 CHMO et E. coli BL21ABAYE 4

Dans une fiole de 100mL, le volume de cellules nécessaire à l’obtention d’une DO finale de 5 est dilué dans 2 mL de phosphate 1M pH 7 et 2mL de milieu de culture frais. Le volume

178

est ajusté à 10 mL par de l’eau permutée. La fiole est mise sous agitation pendant 15 min avant l’ajout de la 2-undécanone.

Avec l’extrait enzymatique

5 mL de biomasse (DO finale = 6-8) sont centrifugés à 5000 rpm pendant 10 minutes. Le culot de cellules est resuspendu dans 4 mL d’un tampon Tris/HCl (50 mM ; pH=7,5) et placé dans de la glace. Les cellules sont lysées par sonication (pulse on 2s, pulse off 8s ; 50s de sonication). Le lysat est centrifugé dans des eppendorfs (1 minute à 13000 rpm) et remis dans la glace, le surnageant constitue l’extrait enzymatique.

Dans une cuve de 1 mL d’un spectrophotomètre sont ajoutés 100µl d’extrait enzymatique, puis 890µL de la solution de NADPH (90 µM dans le tampon Tris/HCl 50mM pH8.5) et enfin 10µl de la solution de substrat à 1M (10mM concentration finale dans la cuve). La température est maintenue à 30°C pour la CHMO et à 23°C pour les autres BVMOs.

Pour le blanc : 100µL de surnageant et 900µl de la solution de NADPH.

On enregistre l’absorbance à 340 nm pendant 30 minutes environ. L’intervalle de temps pour le calcul des pentes sera choisi sur la portion de courbe linéaire. La pente obtenue pour le blanc sera soustraite à celle de l’échantillon.

V. Expression de ABAYE4 dans E. coli TOP10[pBAD/MycHis B]

PCR :

Nous utilisons le kit Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) et les solutions fournies avec ce kit. La PCR est réalisée avec deux amorces digérables par SacI et KpnI dans un volume final de 50 μl, en mélangeant 5 μl d'ADN génomique (1 colonie dans 100 µl eau) avec 0,2 µl de Taq DNA Polymerase, 5 µl de tampon 10x approprié à l'enzyme, 2 µl de la solution de MgSO4, 5 µl de la solution d’amorces et 5 µl de dNTPs. Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes :

L'amplification est assurée à l'aide de l’appareil « Master Cycler gradient » (Eppendorf)

en appliquant le programme suivant: une étape de dénaturation est réalisée pendant 1 min à 94°C, suivie d’une série de 30 cycles constitués d'une phase de dénaturation d’une durée de 20 sec à 94°C, d'une phase d'hybridation des amorces avec la séquence cible d’une durée de 30 sec à 55°C et d'une phase d'élongation pendant 1 min 30 sec à 68°C. À la fin des 30 cycles, une phase d'élongation finale pendant 5 min à 68°C et les échantillons sont amenés à 4°C pour arrêter la réaction.

179

Digestion : la double digestion du plasmide p-BAD/Myc-His B (4 µl) et du fragment ABAYE 4 purifié obtenu par PCR (10 µl) est effectuée en ajoutant à chacun: 1 µl SacI, 1 µl KpnI, 2 µl de tampon n°4 10x (Biolabs) et 2 µl de BSA pour obtenir un volume final de 20 µl . Le tout est incubé à 37°C pendant une heure. Les deux fragments digérés sont ensuite purifiés par tips (Sigma).

Ligation : 3 µl de plasmide pBAD digéré sont mélangés à 6 µl du fragment ABAYE4. 1 µl de T4 DNA Ligase (Invitrogen) et 4 µl de son tampon approprié (5x) sont ajoutés dans un volume final 20µl. Le mélange est placé à température ambiante pour une demi-heure. La ligation est contrôlée par ajout de PstI (0,5 µl) qui coupe le plasmide natif et donc ne seront transformés que les plasmides ligués.

Transformation : Le produit de ligation est transformé par choc thermique dans 100µl d’une solution de bactéries E. coli TOP10 (Invitrogen) préalablement rendues thermocompétentes. Pour cela, les bactéries sont mélangées à 10 μl du produit de la ligature et incubées pendant 30 minutes à 4°C. Un choc thermique à 42°C est appliqué pendant 1 min puis les échantillons sont remis dans la glace pendant 2 minutes. 900 µl de milieu LB liquide sans ampicilline est ajouté et les échantillons sont mis en culture à 37°C pendant 1h sans agitation. La suspension de bactéries est étalée sur milieu solide LB-agar additionné d’ampicilline (50 mg/L) et incubée à 37°C pendant la nuit. Seulement les bactéries qui ont intégré un plasmide portant un insert vont pousser (le plasmide p-BAD B porte un gène de résistance à l’ampicilline).

La présence de l’insert est vérifiée aussi par PCδ sur les bactéries transformées en utilisant les amorces universelles SacI-ATG / KpnI stop. L’ADN plasmidique obtenu après extraction est séquencé par la société Cogenics (http://www.cogenics.com).

Extraction d’ADN plasmidique :

Les extractions d’ADN plasmidique sont réalisées à partir de 10 mL de culture réalisée pendant une nuit à 37°C dans un milieu TB additionné d’ampicilline (50 mg/L). On utilise le kit SV minipreps DNA purification System (Promega), à partir de 3 mL de cette culture.

Séparation de l’ADN par électrophorèse : L’ADN est analysé après séparation par électrophorèse horizontale en utilisant un gel

contenant de 0,8 à 2 % (p/v) d’agarose selon la taille attendue des fragments. La migration des échantillons d’ADN s’effectue en présence de tampon TAE 0,5X à un voltage constant (de 50 à 100 V). Un marqueur de taille migrant en parallèle (1Kb DNA Ladder (Invitrogen)) permet de déterminer la taille des acides nucléiques. La visualisation se fait grâce au colorant SYBR® Safe DNA Gel Stain, un intercalant les acides nucléiques qui fluoresce sous une excitation UV. Il est additionné directement dans la cuve d’électrophorèse avec l’agarose (1 µl pour 50 mL gel).

Purification de l'ADN à partir du produit PCR :

L’ADN produit par PCδ est purifié par tips (Diffinity δapidTip®2, sigma) Purification de l'ADN à partir du gel d’agarose :

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Après avoir découpé sous rayonnement ultraviolet les bandes d’intérêt sur le gel, le fragment d’ADN est extrait de l’agarose conformément au protocole décrit dans la notice du kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System commercialisé par Promega.

B. Western Blot His-tag : Les extraits protéiques (0,75 unité DO) sont traités par 30 µl d’une solution de DTT à

50 mM dans du LBS et dénaturés à 100°C pendant 5 minutes avant d’être déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12%. Après migration électrophorétique (150 V ; 1h), le gel de séparation est incubé dans du tampon de transfert (25 mM Trisbase, 192 mM glycine et 20% éthanol (v/v), pH 8,3) pendant 10min. Le transfert des protéines est réalisé sur une membrane de nitrocellulose (Hybond ECL C-EXTRA Amersham) dans le tampon de transfert à un voltage constant (100V) pendant 1h à 4°C.

A la fin du transfert, la membrane a été saturée dans 50mL de tampon de blocage (PBS, 0,05% Tween 20 et 5% BSA) pendant 30min à température ambiante et soumise à une légère agitation. La nitrocellulose a été ensuite lavée cinq fois 5min dans du tampon de lavage (PBS et 0,05% Tween 20), puis incubée pour une 1h avec un anticorps (anti-His-(c-term)-HRP, Novex) dilué au 1 :5000 dans du tampon de lavage. Après plusieurs lavages, les protéines d’intérêt sont révélées par chimioluminescence (Kit Pierce ‘’supersignal west pico’’) en suivant les instructions du fabriquant et finalement détectées par une caméra CCD. La membrane relavée avec du PBS, peut aussi être traité au DABA/H2O2.

VI. Bioconversions

A. Bioconversions à l’échelle analytique

Les bioconversions analytiques sont réalisées en fioles (non bafflées), sur agitateur longitudinal en bain-marie. Les études sont effectuées sur 20 mL de milieu de culture directement après croissance des cellules. Lors de biotransformations à pH 7, la solution de tampon phosphate est ajouté de manière à obtenir une concentration finale de 0,1 M (2 mL d’une solution de phosphate 1 M ; pH 7). Une solution aqueuse de glycérol (0,5g/mL) est ajoutée de manière à obtenir au final 0,5 % en masse.

Le suivi cinétique est assuré par des prélèvements du milieu extraits parun volume équivalent soit d’une solution d’étalon interne pour le dosage quantitatif, soit d’AcOEt pour la mesure des excès énantiomériques. La phase organique est directement analysée par CPG.

B. Biotransformation de cycloalcanones α-substituées

1) 2-benzyloxymethyl-cyclopentanone 12a :

Deux fioles bafflées de 3L sont remplies de 300 mL de milieu de culture contenant des cellules (DO=9 ; pH=6,5). Le pH est ajusté à 7 et contrôlé tout au long de la biotransformation. 90 mg de cétone 12a dans l’EtOH (5%) sont ajoutés et la réaction est suivie de la façon

181

habituelle en utilisant l’eîcosane comme étalon interne. Le fermenteur est arrêté après 6h par acidification du milieu jusqu’à pH 5 avec une solution aqueuse d’H2SO4 à 50%.

Le milieu est traité, extrait et purifié de façon analogue à celle de 13a (éluant : pentane/AcOEt 70/30).

Cétone 12a Lactone 12b

Config. Abs. S R ee (%) 58 96

Masse isolée (mg) 65 67 Rdt (%) 36 33

(S)-2-benzyloxyméthyl-cyclopentanone 12a

[α]25D = -54.7 (c = 0.85 ; CHCl3). CPG normale : Colonne Optima 5 / Température du four : 185°C / tR: 5.8 mn CPG chirale : Colonne Chirasildex CB / Température du four : 150°C / tR: 11.2 mn.

(R)- 6-benzyloxymethyl-tetrahydro-2H-pyran-2-one 12b :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.7-2.0 [m, 4H, (CH2)2 cycle] ; 2.5 (m, 2H, -CH2COO- cycle) ; 3.6 (dd, J=3.3 Hz, J=5 Hz, 2H, -CH2OBn) ; 4.4 (m, 1H, -CH cycle) ; 4.6 (s, 2H, OCH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 18.2 ; 24.5 ; 29.6 ; 71.8 ; 73.5 ; 79.1 ; [ 127.6 ; 128.3 ; 137.8 (6C, ArC) ] ; 171.2. [α]25D = - 7.9 (c = 1,2 ; CHCl3) ; Litt. 219 : [α]25D = - 8 (CHCl3) ; po = 96%. CPG normale : Colonne Optima 5 / Température du four : 185°C / tR: 12.4 mn CPG chirale : Colonne Lipodex E (Version 5) / Température du four : 160°C / tR: 26.6 mn.

2) 2-benzyloxymethyl-cyclohexanone 13a :

Dans un fermenteur de 1L, on place : 750 mL de milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] conservé à

+4°C (3,8 g poids sec ; durée conservation=20 jours) ; 50 mL milieu de culture Msoja frais ;

182

100 mg d’ampicilline ; 20 µl de pluriol. Les paramètres du fermenteur sont réglés sur les valeurs suivantes :

Aération : 0,5 l/min (0.5 vvm); Agitation : 350 rpm T=30°C ; pH=7,2 (contrôlé par ajout de NaOH à 2N).

500 mg de cétone 13a dans EtOH (5%) sont ensuite ajoutés et la réaction est suivie à la CPG par dosage quantitatif des produits (eïcosane comme étalon interne) et par mesure des ees. le fermenteur est arrêté après 21h par acidification du milieu jusqu’à pH=5 avec H2SO4

50%. La phase aqueuse est saturée avec 300 g de NaCl et extraite en continue au

dichlorométhane (100 mL). La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. Le brut est purifié sur gel de silice (éluant : pentane/AcOEt : 80/20) et la fraction pure de la lactone est passée au four à boules.

Cétone 13a Lactone 13b

Config. Abs. S R ee (%) 88 99

Masse isolée (mg) 180 220 Rdt (%) 36 41

(S)-2-benzyloxyméthyl-cyclohexanone 13a :

[α]25D = -15.2 (c = 0.8 ; CHCl3). CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 190°C / tR: 4.7 mn CPG chirale : Colonne Chirasildex CB / Température du four : 150°C / tR: 20.3 mn.

(R)-7-benzyloxyméthyl-oxépan-2-one 13b :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.4-1.6 (m, 2H, -CH2CH- cycle) ; 1.8-2.1 [2m, 4H, (CH2)2 cycle] ; 2.5-2.7 (m, 2H, -CH2CO2 cycle) ; 3.4-3.6 (2m, 2H, -CH2OBn) ; 4.3 (m, 1H, CH cycle) ; 4.6 (q, J=12 Hz, 2H, OCH2Ph) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH).

183

RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 23 ; 28 ; 31.4 ; 34.8 ; 72.3 ; 73.6 ; 78.9 ; [ 127 ; 128.4; 137.8 (6C, ArC) ] ; 175. [α]25D = - 7.9 (c = 1,6 ; CHCl3) ; Litt. 261 [(S)-13b] : [α]25

D = + 6 (CHCl3). Analyse élémentaire % C % H

Calculé 71,77 7,74

Trouvé 71,74 8,08

CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 190°C / tR: 10.06 mn CPG chirale : Colonne DAcTBuSI1GammaCHX (OV1701) / Température du four : 80°C / tR: 37.23 mn.

3) 2-phénylcyclohexanone 14a :

Dans un fermenteur de 10L, on place: 2,5L de milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] conservé à

+4°C (12,5 g poids sec ; durée conservation =13 jours) ; 2,5L de milieu de culture Msoja frais 100 mg d’ampicilline ; 20 µl de Pluriol (BASF).

Les paramètres du fermenteur sont réglés sur les valeurs suivantes : Aération=3 l/min (0,6 vvm); agitation=300 rpm. T=30°C ; pH=7,2 (contrôle automatisé par addition simultanée de solution de

NaOH 2N et de H3PO4 1N). 2,5 g de la cétone 14a (5 % dans l’EtOH) sont ensuite ajoutés au milieu. La réaction est

suivie de la même manière que lors des essais analytiques (eïcosane comme étalon interne). Après l’arrêt du fermenteur, le milieu est centrifugé et les phases aqueuses collectées

sont passées à travers une colonne à résine Dowex Optipore (50g), utilisée pour retenir les produits du milieu qui sont ensuite récupérés par élution avec l’AcOEt. Après concentration sous vide, l’extrait brut est finalement purifié par flash chromatographie (éluant : pentane/AcOEt 9/1) et les produits sont distillés au four à boules. Les différents résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Caractérisations Cétone 14a Lactone 14b

Config. Abs. S R ee (%) 78 99

Masse isolée (g) 1,0 1,4 Rdt (%) 40 51

184

(S)-2-phénylcyclohexanone 14a :

[α]25D = -86.7 (c = 1.13 ; CHCl3) ; Litt. (262) : [α]25

D = - 107.5 (CHCl3), ee > 99%. Colonne Equity 5 : 170°C / tR: 3.65 mn Colonne DAcTBuSI1GammaCHX (OV1701) : 150°C /tR 12.6 mn.

(R)-7-phényloxépan-2-one 14b :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.5-2.2 [m, 3H, (-CH2-)3 cycle] ; 2.7 (m, 2H, -CH2CO2

cycle) ; 5.3 (d, 1H, J=9.2 Hz, CH cycle) ; 7.2-7.4 (m, 5H, ArH). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 22.8 ; 28.5 ; 34.9 ; 37.4 ; 82 ; [ 125.8 ; 128 ; 128.5 ;

140.8 (6C, ArC) ] ; 174.9. [α]25D = +36 (c = 1.96 ; CHCl3) ; Litt. 88 : [α]25D = + 39.5 (CHCl3) Analyse élémentaire % C % H Calculé 75,76 7,42 Trouvé 76,79 8,52 CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 170°C / tR: 7.5 mn CPG chirale : Colonne Chirasildex CB / Température du four : 140°C / tR: 30.1 mn.

4) 2-cyanoethylcyclohexanone 15a :

Nous avons effectué une transformation analytique de ce composé car les configurations absolues ont été déjà déterminées dans notre laboratoire 252. Nous obtenons 47% de la cétone (S)-4a et 42% de la lactone (R)-4b énantiopures. Le coefficient d’énantiosélectivité caractérisant cette biotransformation est très élevé (E>100).

185

5) 2-allylcyclohexanone 16a :

Dans un fermenteur de 1L, on place : 1 L de milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] conservé à +4°C

(4,1 g poids sec ; durée conservation=35 jours) ; 5 g glycérol 100 mg d’ampicilline ; 20 µl de pluriol.

Les paramètres du fermenteur sont réglés sur les valeurs suivantes : Aération : 0,5 l/min (0,5 vvm) ; Agitation : 400 rpm T=30°C ; pH=7,2 (contrôlé par ajout de d’une solution de NaOH 2N).

500 mg de cétone 16a dans EtOH (5%) sont ensuite ajoutés au fermenteur et la réaction est suivie par analyse en CPG en utilisant le dodécane comme étalon interne. Le fermenteur est arrêté après 2h par acidification du milieu à pH=5 avec une solution aqueuse d’H2SO4 à 50%. Le milieu est traité, extrait et purifié comme décrit précédemment (éluant : pentane).

s Cétone 16a Lactone 16b

Config. Abs. nd R ee (%) nd 97

Masse isolée (mg) 20 300 Rdt (%) 4 54

(R)- 7-allyloxepan-2-one 16b :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.4-1.7 [m, 2H, -CH2-CH (cycle)] ; 1.8-2 [ m, 4H, -(CH2)2- (cycle) ] ; 2.2-2.5 (2m, 2H, -CH2-CHO) ; 2.6 (m, 2H, -CH2COO) ; 4.3 (m, 1H, -CHO cycle) ; 5.1 (m, 2H, -CH=CH2) ; 5.8 (m, 1H, -CH=CH2). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 22.9 ; 28.2 ; 33.8 ; 34.9 ; 40.6 ; 79.9 ; 118.2 ; 133.4 ; 175.5. [α]25D = -18 (c =0,6 ; CHCl3) ; Litt. 30 : [α]25D = -22 (CHCl3) ; po = 81%. CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 110°C / tR: 8.7 mn CPG chirale : Colonne Lipodex E / Température du four : 115°C / tR: 15 mn.

C. Transformation de la bicyclohepténone 1 par la souche E. coli BL21 produisantABAYE 4

1) Préparation d’inoculum :

186

A partir de stock congelé (-80°C) de la souche E. coli BL21 ABAYE 4, un tube de culture contenant 5 mL du milieu TB et l’ampicilline est ensemencé à l’aide d’une anse en plastique stérile (10 µl) et est placé dans un incubateur à agitation orbitalaire pour 15h à 37°C.

2) Culture de la souche ABAYE 4 : 5 fioles de 2L contenant chacune 200 mL de milieu TB et l’ampicilline sont ensemencées

avec 3 mL d’inoculum. La DO initiale est de 0,1. Les fioles sont incubées pendant 5h (23°C, 200 rpm). L’induction est faite avec du lactose (2,5%) à une DO d’environ 0,6. La culture est poursuivie pendant 18h à 23°C.

3) Bioconversion : A la fin de la culture, le pH du milieu est à 6,5 et la DO des cellules à 16. Le pH est

ajusté à pH 7 par ajout d’une solution de NaOH à 5% et ainsi contrôlé tout au long de la bioconversion. 100 mg de bicyclohepténone dans EtOH (5%) sont ajoutés immédiatement dans chaque fiole. Des prélèvements sont effectués pour suivre la cinétique de la réaction par analyse en CPG en utilisant l’undécane comme étalon interne.

4) Extraction et purification : Le contenu des 5 fioles est collecté et centrifugé (5000 rpm ; 20 min ; 10°C). Le

surnageant est acidifié jusqu’à pH 5 avec une solution aqueuse d’H2SO4 à 50%, saturé avec 300 g de NaCl puis extrait en continu au dichlorométhane pendant 24 heures. L’extrait organique (100 mL) est analysé quantitativement par CPG (500 µl sont mélangés avec 1 mL de la solution d’undécane). Des rendements de 41% de lactone normale et de 34% lactone anormale sont obtenus. L’extrait est séché sur MgεO4, filtré et le CH2Cl2 est ensuite éliminé par distillation.

Le mélange brut est purifié par flash chromatographie avec un système automatisé (CombiFlash Company) sur colonne de silice ‘’δedisep 12g’’ (182 mL, 19 min, pentane/AcOEt de 95 :5 pendant 5min jusqu’à 80 :20). Les fractions récupérées sont distillées au four à boules. Le récapitulatif est dans le tableau suivant :

Lactone normale 2 Lactone anormale

3 Lactones 2 + 3

Config. Abs. (+)-(1R,5S) (+)-(1S,5R) ee (%) 97 100

Masse isolée (mg) 38 98 136 Rdt (%) 7 17 24

(+)-(1R,5S)-2-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-3-one 2 :

187

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 2.3-2.4 (2d, J=1,6 Hz, 2H, -CH2COO-) ; 2.6-2.8 (m, 2H, -CH2-alcène) ; 3.5 (m, 1H, -CH-alcène) ; 5.1 (m, 1H, -CHOCO) ; 5.5-5.7 (2m, 2H, alcène). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 33.27 ; 39.52 ; 45.57 ; 83.04 ; 129.71 ; 131.29 ; 176.72. [α]20D = + 97 (c = 0.78, CH3OH) ; ee = 97% ; Litt 255 : [α]20

D= + 104 (CH3OH) Analyse élémentaire % C % H % O

Calculé 67,7 6,5 25,7

Trouvé 68,2 6,5 26,6 CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 90°C / tR: 7.5 mn CPG chirale : Colonne DAcTBuSI1GammaCHX (OV1701) / Température du four : 130°C / tR: 29.4 mn.

(+)-(1S,5R)- 3-oxa-bicyclo[3.3.0]oct-6-en-2-one -3 :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 2.6-2.7 (m, 2H, -CH2-alcène) ; 3.1 (td, J=2.7 Hz, J=7.7 Hz, 1H, -CHCOO) ; 3.5 (m, 1H, -CH-alcène) ; 4.1 (dd, J=1.5, J=9.2 Hz, 1H, -CH2OCO) ; 4.3 (dd, J=7 Hz, J=9.2 Hz, 1H, -CH2OCO) ; 5.5-5.7 (2m, 2H, -CH=CH-). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 36.52 ; 41.67 ; 46.43 ; 71.52 ; 130.65 ; 132.36 ; 180.94. [α]20D = +69 (c = 0.96 , CHCl3) ; ee > 99% ; Litt. 256 : [α]20D = + 67,4 (CHCl3) Analyse élémentaire % C % H % O

Calculé 67,0 6,5 25,7

Trouvé 66,7 6,49 24,9 CPG normale : Colonne Equity 5 / T° du four : 90°C / tR: 7.3 mn

CPG chirale : Colonne Chiraldex CB / T° du four : 85°C / tR: 21.35 mn

VII. Dédoublement cinétique dynamique

A. Etudes de racémisation

Les différentes études de racémisation ont été effectuées en tubes Eppendorfs de 2 mL, contenant 0,5g/L de cétone optiquement active (obtenue par bioconversion) dissoute dans EtOH (5%) et 1,8 mL de tampon. Ces tubes sont placés sous agitation magnétique dans un bain thermostaté.

Le suivi cinétique est assuré par des prélèvements réguliers de 100 µl de milieu, extraits avec 100 µl d’acétate d’éthyle. Les échantillons sont gardés au congélateur à -20°C jusqu’à leur analyse par CPG chirale.

188

Préparation des tampons

Plusieurs solutions de tampons ont été préparées à différentes concentrations et différents pH. La méthode générale de préparation est la suivante.

Tampon Phosphate 1,5M pH 8,5 : Dans une fiole jaugée de 500 mL, 133g de Na2HPO4.2H2O sont solubilisés dans de l’eau distillée (1,5M, pH Α10). Le pH est ajusté à 8,5 avec Α15 mL d’une solution de NaH2PO4.H2O à 1,5M (21 g dans 100 mL d’eau).

Tampon Glycine 2M pH 8 : 37,5 g de glycine sont solubilisés dans une fiole jaugée de 250 mL (2M, pH de la solution Α 6). Le pH est ajusté à 8 avec une solution de NaOH (5N).

Tampon Imidazole 1M pH 8,5 : 3,4 g d’imidazole sont solubilisés dans une fiole jaugée de 50 mL (1M). Le pH est ajusté à 8,5 avec une solution de HCl (3N).

Tampon Borate 1M pH 8,5 : 19 g de Na2B4O7.10H2O sont solubilisés dans une fiole jaugée de 50 mL (1M). Le pH est ajusté à 8,5 avec une solution de HCl (10N).

B. Méthylation des lactones et des hydroxyacides

Préparation du diazométhane

Nous avons utilisé un générateur de diazométhane Mini-diazald® (Sigma-Aldrich ref Z108898) spécifique pour la préparation de 1 à 50 mmol. Le diazométhane est généralement produit au fur et à mesure de nos besoins. Si nécessaire, il est conservé à +4°C.

Dans la cuve réactionnelle placée dans un bain d’huile à 65°C, de l’EtOH à 95% est ajouté à une solution de KOH (5g) dans 8 mL d’eau. Le condensateur est rempli de d’un mélange de carboglace et d’isopropanol ainsi que le bain dans lequel est mis le piège lié au système. Une ampoule à décanter chargée d’une solution de 5g (23 mmol) de diazaldehyde dans 45 mL d’éther éthylique est mise en place et la solution est ajoutée goutte à goutte dans la cuve sur une période de 20 min. De l’éther éthylique est ajouté dans l’ampoule tant que le distillat est coloré en jaune.

Réaction avec le TMSH

Dans un tube Eppendorf, 800 µl du milieu centrifugé sont saturés avec 200 mg de NaCl, puis acidifiés jusqu’à pH 2 avec 30 µl d’une solution aqueuse de H2SO4 à 50% et finalement extraits avec 800 µl d’AcOEt. Après agitation et centrifugation, 500 µl de mélange brut sont concentrés sous vide dans un tube en verre et resolubilisés dans 30 µl chloroforme. 15 µl de TMSH (0,2M dans MeOH) sont ajoutés et laissés pendant 30 min . Cette opération est répétée une fois. Enfin 500 µl d’une solution d’étalon interne sont ajoutés et 2 µl sont directement injectés dans le chromatographe.

189

C. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon phosphate

1) Cétone 14a (2-phénylcyclohexanone) :

Dans un fermenteur de 1L, on place : 500 mL de milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] conservé à

+4°C (2,3 g poids sec ; durée de conservation=15 jours) ; 170 mL de milieu Ms 50 mg d’ampicilline ; 20 µl pluriol (BASF)

Les paramètres du fermenteur sont réglés sur les valeurs suivantes : Aération : 1 l/min ; Agitation : 400 rpm ; T=30°C ; Le pH est régulé à 8 par ajout de solution de NaOH 2N.

500 mg de cétone 14a dans EtOH (5%) sont ensuite ajoutés et la réaction est suivie par analyse en CPG (eïcosane comme étalon interne). Au bout d’1h30, lorsque l’ee de la cétone atteint 93%, 300 mL de tampon phosphate (1,5M pH 8,5) sont ajoutés au milieu de biotransformation. Le fermenteur est arrêté après 28h. Le milieu est centrifugé, son surnageant est basifié avec une solution de soude 5N jusqu’à pH 12 et laissé sous agitation pendant 1h. Il est ensuite acidifié avec une solution d’H2SO4 à 50% jusqu’à pH 2 et agité pendant 10 min.

La phase aqueuse est saturée avec 300 g de NaCl et extraite en continue au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée sous vide. 3 mmol de diazométhane fraichement préparé, sont additionnés au mélange brut à l’aide d’une pipette en plastique et laissés à température ambiante pendant 1h. Après élimination de l’éther, le mélange est purifié sur gel de silice (éluant : pentane/AcOEt 80/20) et la fraction de hydroxyphényl methylester 14d est distillée au four à boules.

Hydroxyphényl méthylester 14d

Config. Abs. R ee (%) 99

Masse isolée (mg) 497 Rdt (%) 78

(R)-methyl 6-hydroxy-6-phenylhexanoate (R)-14d :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.15-1.44 [(m, 4H, (CH2)2 chaine] ; 1.54-1.67 (m, 2H, CH2CH); 2.2 (t, 2H, J =7,6 Hz, CH2COO) ; 3.6 (s, 3H, OCH3); 4.6 (dd, J=5.8 Hz, J =7,5 Hz, 1H, CHPh) ; 7.2 (m, 5H, ArH). Le spectre est identique à celui décrit précédemment dans la littérature263.

190

RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 24.7, 25.3, 33.9, 38.6, 51.4, 74.2, [125.8, 127.5, 128.4, 144.7, (6C, ArC)], 174.1. [α]25D = + 22 (c = 1,06 ; CHCl3). Analyse élémentaire % C % H

Calculé 70,24 8,16 Trouvé 70,29 8,44 CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 180°C / tR: 5.7 mn CPG chirale : Colonne Chirasildex CB / Température du four : 150°C (10 min) /tR: 32.1 mn.

2) Cétone 13a (2-benzyloxyméthyl-cyclohexanone) :

Dans un fermenteur de 1L, on place : 530 mL milieu contenant des cellules de E. coli TOP10 pQR[239] fraiches (2,3

g poids sec) ; 270 mL phosphate 1,5M pH 8,5 50 mg d’ampicilline ; 20 µl Pluriol

Les paramètres du fermenteur sont réglés sur les valeurs suivantes : Aération : 1,2 l/min ; Agitation : 400 rpm ; T=30°C ; pH=8,5 (contrôlé par ajout de NaOH à 2N).

400 mg de cétone 13a sont ensuite ajoutés et la réaction est suivie par CPG (eïcosane comme étalon interne). Le fermenteur est arrêté après 22h. Le milieu est traité de la même manière que dans l’expérience précédente (DCD sur 14a) et l’hydroxybenzyl méthylester 13d est finalement isolé.

Hydroxybenzyl méthylester 13d

Config. Abs. R ee (%) 99

Masse isolée (mg) 346 Rdt (%) 71

(R)-methyl 7-(benzyloxy)-6-hydroxyheptanoate 13d :

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) : 1.2-1.7 [(3m, 6H, (CH2)3 chaine] ; 2.3 (t, 2H, J =7.4 Hz, CH2COO); 3.3 (dd, J =7.8 Hz, J =9.2 Hz, 1H, -CHOH) ; 3.45 (dd, J =3 Hz, J=9.3 Hz, 2H, CH2OBn) ; 3.6 (s, 3H, OCH3); 4.6 (s, 2H, OCH2Ph); 7.2 (m, 5H, ArH).

191

RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) : 24.8, 25, 32.7, 33.9, 51.4, 70.1, 73.3, 74.5, [127.7, 128.4, 137.9 (6C, ArC)], 174. [α]25D = - 2.4 (c = 0,99 ; CHCl3). Analyse élémentaire % C % H Calculé 67,64 8,33

Trouvé 67,57 8,53 CPG normale : Colonne Equity 5 / Température du four : 190°C / tR: 10.06 mn CPG chirale : Colonne DAcTBuSI1GammaCHX (OV1701) / Température du four : 180°C / tR: 46.4 min.

D. Dédoublement cinétique dynamique avec le tampon glycine

1) 2-phénylcyclohexanone 14a :

Dans une fiole bafflée de 2L, on ajoute: 110 mL milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] fraiches, 40 mL d’eau distillée (DO final est à 4). 50 mL de tampon glycine 2M pH=8.

La fiole est mise en agitation à l’incubateur (200 rpm ; 30°C). Le pH est essentiellement maintenu à 8 par le tampon glycine mais est légèrement ajusté au cours de la réaction par ajout manuel de solution de NaOH 2N.

100 mg de cétone 14a dans EtOH (5%) sont ajoutés et le suivi cinétique est assuré de la même façon habituelle. Cette fois, l’hydroxyphényl-methylester 14d est analysé à la CPG au cours de la réaction, par traitement au TMεH de l’échantillon prélevé, comme décrit précedemment.

La réaction est arrêtée après 24h. Le milieu est traité de la même manière que dans l’expérience précédente (DCD sur 14a) et l’hydroxybenzyl-méthylester 14d est finalement isolé.

Hydroxy-phényl éthylester 14d

Config. Abs. R ee (%) 99

Masse isolée (mg) 105 Rdt (%) 83

2) 2-benzyloxymethyl-cyclohexanone 13a :

Dans une fiole baflée de 2L, on ajoute: 88 mL milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] fraiches,

192

62 mL d’eau distillée (DO final est à 7). 50 mL de tampon glycine à 2M pH 8.

La réaction est arrêtée après 22h. Le milieu est traité de la même manière que dans l’expérience de DCD sur 14a et l’hydroxybenzyl-méthylester 13d est finalement isolé.

Hydroxy-benzyl méthylester 13d

Config. Abs. R ee (%) 99

Masse isolée (mg) 97 Rdt (%) 80

3) 2-benzyloxymethyl-cyclopentanone 12a :

Dans une fiole bafflée de 2L, on place : 110 mL de milieu contenant les cellules de E. coli TOP10 pQR[239] fraiches 40 mL d’eau distillée (DO final est à 7). 50 mL de tampon glycine à 2M pH=8.

100 mg de cétone 12a sont ensuite ajoutés et la réaction est suivie à la CPG (eïcosane comme étalon interne). Des prélèvements de 5 mL sont effectués, acidifiés jusqu’à pH 2, saturés avec du NaCl, et extraits en continue au dichlorométhane avec ajout de résine acide Amberlite IRA 120 (activée préalablement par rinçage par une solution d’HCl) dans le ballon récepteur. Un échantillon de l’extrait est ensuite dosé avec l’eïcosane.

La réaction est arrêtée après 23h. Le milieu réactionnel est traité de la même manière que les prélèvements de 5 mL (quantité de résine utilisée est catalytique). L’extrait organique est séché sur MgSO4, filtré et concentré sous vide. Il est ensuite purifié sur gel de silice (éluant : pentane/AcOEt : 70/30) et la lactone 12b est caractérisée.

Lactone 12b

Config. Abs. R ee (%) 96

Masse isolée (mg) 86 Rdt (%) 80

VIII. Conditions d’analyses des produits en CPG sur phase chirale

L’analyse chirale des produits a été effectuée par CPG sur phase chirale. Les colonnes utilisées, les conditions des gaz vecteurs, du mode d’injection et de détection sont celles présentées paragraphe IA.

. Les colonnes utilisées sont numérotées par souci de simplification : Colonne 1 : -TBDAc (Macherey-Nagel) Colonne 2: Lipodex E (Macherey-Nagel)

193

Colonne 3 : Lipodex G (Macherey-Nagel) Colonne 4 : Chirasildex CB (VARIAN) Colonne 5 : DAcTBuSIlGammaCDX (OV1701) (MEGA)

ƴ-Butyrolactones :

Cycloalcanones α-substituées, lactones et hydroxymethyesters corresondant)

Bicyclohepténone 1 et lactones correspondantes:

Les chromatogrammes des analyses sur colonnes chirales des composés racémiques et optiquement actifs sont présentés ci-dessous

194

195

196

g) Lactone 2 et 3 obtenues par bioconversion de la bicyclohepténone 1 avec ABAYE4.

197

Annexes

198

Annexe I : Carte de restriction de plasmide pBAD/Myc-His B

Le plasmide pBAD His B (4092 pb) (invitrogen) possède le gène de résistance à

l’ampicilline, le promoteur araBAD régulant l’expression du gène, une région polyhistidine

permettant de détecter la protéine recombinante et un multisite de clonage. Il a été utilisé

pour le clonage des produits d’amplification par PCδ (gène ABAYE 2617) dans E. coli TOP10.

Des amorces pBAD Forward - pBAD Reverse encadrent la cassette de clonage et permettent

d’amplifier le fragment d’ADN cloné dans ce vecteur pour vérifier son insertion.

199

Annexe II

Alignements de diverses BVMOS

ABAYE1825 ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD2794 ------------------------------------------------------------ 0

AtaHMycotuberculosis ------------------------------------------------------------ 0

BVMOAcinetoradio ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE0435 ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD3192 ------------------------------------------------------------ 0

HAPMOPsfluo MSAFNTTLPSLDYDDDTLREHLQGADIPTLLLTVAHLTGDLQILKPNWKPSIAMGVARSG 60

HAPMOPsputida MRTYNTTLASLECDDETLRAHLQGADIPTLLLTVAHLTGDLNVLKPAWKPVVAMGVAHSG 60

CHMORhodoRHA1(MO6) ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD1733(ACIAD1) ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE2606(ABAYE2) ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE2614(ABAYE3) ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE2617(ABAYE4) ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE2056(ABAYE1) ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD2339(ACIAD2) ------------------------------------------------------------ 0

CDDMORhodococcus ----------------------------------------------------------MT 2

CPDMOPseudomonas -------------------------------------------MSQLIQEPAEAGVTSQK 17

CHMOAcineto ------------------------------------------------------------ 0

CHMORhodoHI-31 ------------------------------------------------------------ 0

CPMO ------------------------------------------------------------ 0

OTEMO ------------------------------------------------------------ 0

STMO ------------------------------------------------------------ 0

PAMO ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE1825 ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD2794 ------------------------------------------------------------ 0

AtaHMycotuberculosis ------------------------------------------------------------ 0

BVMOAcinetoradio ------------------------------------------------------------ 0

ABAYE0435 ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD3192 ------------------------------------------------------------ 0

HAPMOPsfluo MDLETEAQVREFCLQRLIDFRDSGQPAPGRPTSDQLHILGTWLMGPVIEPYLPLIAEEAV 120

HAPMOPsputida MTPEVEAEVREDCLQKLLAFRDSGLPVPARPSSEQLHALGTWLMGPVIEPYLPLVAEELV 120

CHMORhodoRHA1(MO6) ------------------------------------------------------------ 0

ACIAD1733(ACIAD1) -----------------------------------------------------MTAQAKK 7

ABAYE2606(ABAYE2) -----------------------------------------------------MVTKPIT 7

ABAYE2614(ABAYE3) -----------------------------------------------------MTAQMKT 7

ABAYE2617(ABAYE4) -------------------------------------------MRFFRSLFLRILEQPMF 17

ABAYE2056(ABAYE1) ----------------------------------------------------------ML 2

ACIAD2339(ACIAD2) ----------------------------------------------------------MQ 2

CDDMORhodococcus TSIDREALRRKYAEERDKRIRPDG--------NDQYIRLD-HVDGWSHDPYMPIT----- 48

CPDMOPseudomonas VSFDHVALREKYRQERDKRLRQDG--------QEQYLEVAVTCDEYLKDPYADPI----- 64

CHMOAcineto ------------------------------------------------------------ 0

CHMORhodoHI-31 ------------------------------------------------------------ 0

CPMO ------------------------------------------MTTMTTMTTEQLG----- 13

OTEMO ------------------------------------------------------M----- 1

STMO ------------------------------------------MNGQHPRSVVTAP----- 13

PAMO ------------------------------------------MAGQTTVD---------- 8

(Clustal Omega avec les paramètres par défaut du logiciel)

ABAYE1825 ------------MNTSEQVTTTDVLIIGAGIAGISAAYHLKKHRPNTTFIILEARDTFGG 48

ACIAD2794 ------------MSTSDQIASFDVLIIGAGISGISAAYHLKKNRPNDTFAILEGRNAIGG 48

AtaHMycotuberculosis -----------------MTEHLDVVIVGAGISGVSAAWHLQDRCPTKSYAILEKRESMGG 43

BVMOAcinetoradio -----------------MDKHIDVLIVGAGISGLGLAAHLSKNCPQRSFEIVERREGIGG 43

ABAYE0435 -----------------MEKQVDVLIIGAGISGIGVAAHLSKNSPQRQFEILERRESFGG 43

ACIAD3192 -----------------MEKHIDILIVGAGISGIGIAAHLSKDAPQRQFEIIERRENIGG 43

HAPMOPsfluo TAEEDLRAPRWHKDHVASGRDFKVVIIGAGESGMIAALRFKQ-AGV-PFVIYEKGNDVGG 178

HAPMOPsputida TAEEDPRAPRWHKDHVAAGREFKVVIIGAGVSGMIAALRFKQ-AGV-PFVVYEKGTDVGG 178

CHMORhodoRHA1(MO6) ------------------MTHYDILIVGAGISGIGAAIRLKQ-SGIDNFAILEKGDALGG 41

ACIAD1733(ACIAD1) L--------DSADRKALPSHIYDSFIVGAGISGIAAAIRLDQ-VGYANYKIIEKASRVGG 58

ABAYE2606(ABAYE2) N--------TRTRKTQEVAHIYDTFIVGAGISGLAAAIKLNE-AGLTNFKIIEKASRVGG 58

ABAYE2614(ABAYE3) NA-------SAKKAVNSPSHIYDTFIVGAGISGIAAAIRLDQ-VGYTNYKIIEKAERVGG 59

ABAYE2617(ABAYE4) NS-------S-----SNSNKNVRIAIIGTGFGGLGLAIRLKQ-AGFEQFTLFEKAADVGG 64

ABAYE2056(ABAYE1) NA-------K-----QHAIQKTKIAIIGAGFGGLAMAIRLLQ-SQQSDFFILEKSNDVGG 49

ACIAD2339(ACIAD2) QA-------T-----INATQTTKIAIIGAGFGGLAMAIRLLQ-HHIRDFVIFEKAQDIGG 49

CDDMORhodococcus -------------PREPKLDHVTFAFIGGGFSGLVTAARLRE-SGVESVRIIDKAGDFGG 94

CPDMOPseudomonas -------------VRDPVVRETDVFIIGGGFGGLLAAVRLQQ-AGVSDYVMVERAGDYGG 110

CHMOAcineto ---------------MSQKMDFDAIVIGGGFGGLYAVKKLRD-ELELKVQAFDKATDVAG 44

CHMORhodoHI-31 -------------MTAQTTHTVDAVVIGAGFGGIYAVHKLHH-ELGLTTVGFDKADGPGG 46

CPMO -------------MNNSVNDKLDVLLIGAGFTGLYQLYHLR--KLGYKVHLVDAGADIGG 58

OTEMO -------------SNRAKSPALDAVVIGAGVTGIYQAFLIN--QAGMKVLGIEAGEDVGG 46

STMO -------------DATTGTTSYDVVVVGAGIAGLYAIHRFR--SQGLTVRAFEAASGVGG 58

PAMO -------------SRRQPPEEVDVLVVGAGFSGLYALYRLR--ELGRSVHVIETAGDVGG 53

.:* * *: : : .*

ABAYE1825 TWSQFKYPGIRSDSDMPSFGFGFKP-----WTHQKAIAQANVICDYLQETIQENKINAHI 103

ACIAD2794 TWSQFKYPGIRSDSDMPSFGFGFKP-----WTHKKAIAQASVICDYLQETIQENDISKHI 103

AtaHMycotuberculosis TWDLFRYPGIRSDSDMYTLGFRFRP-----WTGRQAIADGKPILEYVKSTAAMYGIDRHI 98

BVMOAcinetoradio TWDLFRYPGIRSDSDMSTFGYNFKP-----WRKAKILADGASIRQYLHEVVDEFHLDRKI 98

ABAYE0435 TWDLFRYPGIRSDSDMSTFGFNFKP-----WRKANVLADGASIKGYLGEVIDEFKLKEKI 98

ACIAD3192 TWDLFRYPGIRSDSDMSTFGFNFKP-----WQSPNVLASGSSIKGYLSEVVDEYDLKKKI 98

HAPMOPsfluo TWRENTYPGCRVDINSFWYSFSFAR----G-IWDDCFAPAPQVFAYMQAVAREHGLYEHI 233

HAPMOPsputida TWRENTYPGCRIDINSFFYSFSFAR----S-TWDDCFAPGPQVFSYMQAVARDKGLYDHI 233

CHMORhodoRHA1(MO6) TWRDNTYPGCACDVPSALYSYSFAP----NREWSRLFAGQDEIRRYIERTAAEHGVPAHV 97

ACIAD1733(ACIAD1) TWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAQWSHLFARQPEILNYLEDVSHKFNINEKI 114

ABAYE2606(ABAYE2) TWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAKWSHLFARQPEILSYLEDVSREFDIESLI 114

ABAYE2614(ABAYE3) TWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAKWSHLFARQPEILSYLEDVSNEFNITSKI 115

ABAYE2617(ABAYE4) VWRDNTYPGAACDVPSHLYSFSFEQ----ELGWKNRYGTSQEIYQYLRHCADKYDLRPHI 120

ABAYE2056(ABAYE1) TWRENRYPGAACDVQSHMYSLSFAP----KTDWSKRYAEAPEIFDYIQDITDQYQIKNYC 105

ACIAD2339(ACIAD2) TWRENQYPGAACDVQSHMYSLSFAP----KTNWSKRYAEAGEIFSYIQDISEQFQLRQYC 105

CDDMORhodococcus VWYWNRYPGAMCDTAAMVYMPLLEE---TGYMPTEKYAHGPEILEHCQRIGKHYDLYDDA 151

CPDMOPseudomonas TWYWNRYPGAQCDIESYVYMPLLEE---MGYIPTEKYAFGTEILEYSRSIGRKFGLYERT 167

CHMOAcineto TWYWNRYPGALTDTETHLYCYSWDKELLQSLEIKKKYVQGPDVRKYLQQVAEKHDLKKSY 104

CHMORhodoHI-31 TWYWNRYPGALSDTESHLYRFSFDRDLLQESTWKTTYITQPEILEYLEDVVDRFDLRRHF 106

CPMO IWHWNCYPGARVDTHCQIYQYSI-PELWQEFNWKELFPNWAQMREYFHFADKKLDLSKDI 117

OTEMO TWYWNRYPGCRLDTESYAYGYFALKGIIPEWEWSENFASQPEMLRYVNRAADAMDVRKHY 106

STMO VWYWNRYPGARCDVESIDYSYSFSPELEQEWNWSEKYATQPEILAYLEHVADRFDLRRDI 118

PAMO VWYWNRYPGARCDIESIEYCYSFSEEVLQEWNWTERYASQPEILRYINFVADKFDLRSGI 113

* *** * : : :

200

ABAYE1825 NYGYKVNKAEFSSDEQLWTITAENLASKALVNFKARFLLLNTGYYDYQKGFTPEFEGIES 163

ACIAD2794 CFGYHVNQAEFSSEEQLWTITAVKLEDKSIVSFKARFLLLNTGYYDYQEGFSPKFEGTEK 163

AtaHMycotuberculosis RFHHKVISADWSTAENRWTVHIQSHG--TLSALTCEFLFLCSGYYNYDEGYSPRFAGSED 156

BVMOAcinetoradio HFKHRVISANYDTALKLWIVEIEDQQ-GQNQTWYANFLLGCTGYYNYDEGFMPEYPGQHQ 157

ABAYE0435 HFGHRVLSANYDSASKKWHVIVEDNK-KKQQTWVANFVVGCTGYYNYDQGYAPTFPNQEA 157

ACIAD3192 HFKHRVLAANYDTASKKWYVEIEDAA-QKKQTWIANFIVGCTGYYNYDQGFEPDFPNKDA 157

HAPMOPsfluo RFNTEVSDAHWDESTQRWQLLYRDSE--GQTQVDSNVVVFAVGQLNR--PMIPAIPGIET 289

HAPMOPsputida QFNTEVTDAHWDEDRQRWQLLCRDSA--GQTRVDSNVVVFAVGQLNR--PMIPAIPGKET 289

CHMORhodoRHA1(MO6) KFGTEMQRAQWSEQSRRWTVDT---S--AG-TFTANAVIAAAGPWNE--PLVPTVPGLDT 149

ACIAD1733(ACIAD1) EFETELNKAAWDNERNLWVLDT---N--KG-QFLSRTVVFATGPITE--AQIPKLDGLDS 166

ABAYE2606(ABAYE2) EFNTELLKAEWDNVKNVWKLET---S--SG-LYITKTVLFATGPITE--AQIPRLEGLDT 166

ABAYE2614(ABAYE3) EFNNELLNAAWDESRHLWVLDT---T--TG-QYLSRTVIFATGPITE--AQIPRLEGLDT 167

ABAYE2617(ABAYE4) KFNTEIASAEFDALQGVWHIQS---T--TGEQFEAEFLVGAVGQLNR--PAYPKLKGIEN 173

ABAYE2056(ABAYE1) KFNHEVTHVQYDEMRHIWTLNF---A--NQPSLEAQFVVFASGPLHI--PQIPHIQGIEK 158

ACIAD2339(ACIAD2) KFEHEVTRAEYDEQNFIWNLEF---K--NHPAVQAQFVIFASGPLHV--PQIPHIKGIEN 158

CDDMORhodococcus LFHTEVTDLVWQEHDQRWRIST---N--RGDHFTAQFVGMGTGPLHV--AQLPGIPGIES 204

CPDMOPseudomonas YFQTEVKDLSWDDEAARWRITT---D--RGDKFSARFVCMSTGPLQR--PKLPGIPGITS 220

CHMOAcineto QFNTAVQSAHYNEADALWEVTT---E--YGDKYTARFLITALGLLSA--PNLPNIKGINQ 157

CHMORhodoHI-31 KFGTEVTSALYLDDENLWEVTT---D--HGEVYRAKYVVNAVGLLSA--INFPNLPGLDT 159

CPMO SFNTRVQSAVFDEGTREWTVRS---I--GHQPIQARFVIANLGFGAS--PSTPNVDGIET 170

OTEMO RFNTRVTAARYVENDRLWEVTL---D--NEEVVTCRFLISATGPLSA--SRMPDIKGIDS 159

STMO RFDTRVTSAVLDEEGLRWTVRT---D--RGDEVSARFLVVAAGPLSN--ANTPAFDGLDR 171

PAMO TFHTTVTAAAFDEATNTWTVDT---N--HGDRIRARYLIMASGQLSV--PQLPNFPGLKD 166

: : * : . : * *

ABAYE1825 FKGKVIHPQHWPVG-----------FDYTKKRVIVIGSGATAVTLLPSMAD-KAEHVTML 211

ACIAD2794 FKGQIIHPQHWPEN-----------LDYSNKKVVVIGSGATAVTLLPSMAG-KAQHVTML 211

AtaHMycotuberculosis FVGPIIHPQHWPED-----------LDYDAKNIVVIGSGATAVTLVPALADSGAKHVTML 205

BVMOAcinetoradio FKGTLVHPQHWPEK-----------LDYTGKRVIVIGSGATAITLVPSMVKGGAAHVTML 206

ABAYE0435 FKGQLIHPQHWPEN-----------LDYKGKKVVIIGSGATAITLVPAMSKGGAGHVTML 206

ACIAD3192 FKGQFIHPQHWPEN-----------LDYVGKKVVIIGSGATAITLVPAMSKGGAEHVTML 206

HAPMOPsfluo FKGPMFHSAQWDHD-----------VDWSGKRVGVIGTGASATQFIPQLAQ-TAAELKVF 337

HAPMOPsputida FQGPAFHSAQWDHN-----------VDWSGKRVAVIGTGASAAQFIPQLAK-TAADLKVF 337

CHMORhodoRHA1(MO6) FTGEVFHSSRWNHT-----------YDLTGKRVAVVGTGASAVQFVPAIQP-TVESLHLY 197

ACIAD1733(ACIAD1) FKGEMFHSARWNHD-----------YDLSGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQP-LAKELFVF 214

ABAYE2606(ABAYE2) FTGEMFHSAKWNHD-----------YDLTGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQP-KAKELFLF 214

ABAYE2614(ABAYE3) FTGEMFHSAKWNHD-----------YDLTGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQP-KAKELFVF 215

ABAYE2617(ABAYE4) FKGKAFHSARWDHD-----------YELTGKRVAVIGTGASAIQFVPEIAK-QVAHLDVY 221

ABAYE2056(ABAYE1) FKGKVFHSSQWEHD-----------YSLEGKSVASIGTGGSAIQYIPEIAK-DVKQLYVF 206

ACIAD2339(ACIAD2) FKGKVFHSSQWDHG-----------YDLSNKVVASIGTGGSAIQYIPEIAQ-QVKQLYVL 206

CDDMORhodococcus FRGKSFHTSRWDYDYTGGDALGAPMDKLADKRVAVIGTGATAVQCVPELAK-YCRELYVV 263

CPDMOPseudomonas FKGHSFHTSRWDYSYTGGDQTGN-LEGLKDKRVAIIGTGATSIQAVPHLAA-YAQELYVI 278

CHMOAcineto FKGELHHTSRWPDD-----------VSFEGKRVGVIGTGSTGVQVITAVAP-LAKHLTVF 205

CHMORhodoHI-31 FEGETIHTAAWPEG-----------KSLAGRRVGVIGTGSTGQQVITSLAP-EVEHLTVF 207

CPMO FKGQWYHTALWPQE----------GVNMAGKRVAIIGTGSSGVQVAQEAAL-DAKQVTVY 219

OTEMO FKGESFHSSRWPTDAEGAPK----GVDFTGKRVGVIGTGATGVQIIPIAAE-TAKELYVF 214

STMO FTGDIVHTARWPHD----------GVDFTGKRVGVIGTGSSGIQSIPIIAE-QAEQLFVF 220

PAMO FAGNLYHTGNWPHE----------PVDFSGQRVGVIGTGSSGIQVSPQIAK-QAAELFVF 215

* * * * : : :*:*.:. : :

ABAYE1825 QRSPTYMVSFPAVDPIAGMLNKILGYE--RAYPIIRKKNISMN------RAL-------- 255

ACIAD2794 QRSPTYMVSFPAVDPIACMLNKLLGYE--KAYPIIRKKNIALN------RAL-------- 255

AtaHMycotuberculosis QRSPTYIVSQPDRDGIAEKLNRWLPET--MAYTAVRWKNVLRQ------AAV-------- 249

BVMOAcinetoradio QRSPTYIASIPSIDFVYQKMRGFLSEE--MAYKLTRARNIGMQ------RAV-------- 250

ABAYE0435 QRSPTYIASVPSIDFIYEKTRRFMSEE--AAYKFTRARNIGMQ------RAI-------- 250

ACIAD3192 QRSPTYIASIPSIDFVYDKMRKVLPED--LAYKLTRARNIGVQ------RGI-------- 250

HAPMOPsfluo ARTTNWLLPTPDLHEKISDSCKWLLA-HVPHYSLWYRVAMAMPQSVGFLEDV-------- 388

HAPMOPsputida ARTTNWLLPTPDLHEKISDSCKWLLA-NLPNYSLWYRATKVMPQSVGFLEDV-------- 388

CHMORhodoRHA1(MO6) QRTAQWVLPKPDHT--LPGVERAILR-RVPGAIRALRRVEYAI-----MESL-------- 241

ACIAD1733(ACIAD1) QRTAPWVVPKPDME--LGDFSKSVIA-KLPIIQSTWRKAVAQS-----LNAI-------- 258

ABAYE2606(ABAYE2) QRTAPWVLPKPDTD--LGEFSKSIIA-KYPAIQAGWRQTVAGT-----LNVI-------- 258

ABAYE2614(ABAYE3) QRTAPWVLPKPDTD--LGEFSKSIIA-KYPAIQASWRKSVALT-----LNAI-------- 259

ABAYE2617(ABAYE4) QRSAPYVIPKPDRV--YQPLEKKAFR-KLPILQSLDRALQYGH-----HEIR-------- 265

ABAYE2056(ABAYE1) QRTAAWVIPRDERK--YSNLSKALFK-KSNFYRQIHRSRLYWS-----NESR-------- 250

ACIAD2339(ACIAD2) QRTAAWVIPRDERA--YSGLSKLLFK-KSDFYRQIHRIRLYWS-----NESR-------- 250

CDDMORhodococcus QRTPSAVDERGNHP--IDEK--WFAQIATPGWQKRWL---DSFTAIWD-GVLTDPSEL-A 314

CPDMOPseudomonas QRTPISVGFRGNKP--TDPE--WAKS-LQPGWQQARM---DNFNAITH-GMPVD------ 323

CHMOAcineto QRSAQYSVPIGNDP--LSEE--DVKKIK-DNYDKSLGWCMNSALAFALNESTVPAMSVSA 260

CHMORhodoHI-31 VRTPQYSVPVGNRP--VNPE--QIAEIK-ADYDRIWERAKNSAVAFGFEESTLPAMSVSE 262

CPMO QRTPNLALPMHQKQ--LSAE--DNLRMK-PELPAAFERRGKCFAGFDFDFIAKNATELSA 274

OTEMO QRTPNWCTPLGNSP--MSKE--KMDSLR-NRYPTILEYVKSTDTAFPYHRDPRKGTDVSE 269

STMO QRSANYSIPAGNVP--LDDA--TRAEQK-ANYAERRRLSRESGGGSPHRPHPKSALEVSE 275

PAMO QRTPHFAVPARNAP--LDPE--FLADLK-KRYAEFREESRNTPGGTHRYQGPKSALEVSD 270

*:

ABAYE1825 ------------------------YKACRNYPQI------------MKKLLIADVRRRLP 279

ACIAD2794 ------------------------YKACRNYPQV------------MKKLLLADVRRRLP 279

AtaHMycotuberculosis ------------------------YSACQKWPRR------------MRKMFLSLIQRQLP 273

BVMOAcinetoradio ------------------------YALSQKQPKL------------VRKLLLKSIEMQLK 274

ABAYE0435 ------------------------YALSQKHPKT------------VRRLLLKAIEMQLK 274

ACIAD3192 ------------------------YTLSQKQPKL------------VRKFLLKSIEMQLK 274

HAPMOPsfluo ------------------------MVDVGYPPTE--LAVSARNDRLRQD-ISAWMEPQFA 421

HAPMOPsputida ------------------------VVDVDYPPTE--VAVSARNDQLRRD-ICAWMEPQFA 421

CHMORhodoRHA1(MO6) ------------------------GLGFRHP-WI--LRV-------IQQ-VGKAQLRAQV 266

ACIAD1733(ACIAD1) ------------------------NFGLRNP-AV--LKP-------VGE-LFKQVLKSQV 283

ABAYE2606(ABAYE2) ------------------------NFGLRNP-KA--LKP-------VNF-AAKQLLKLQI 283

ABAYE2614(ABAYE3) ------------------------NFGLRNP-LA--LKP-------VNV-LGKQLLKLQI 284

ABAYE2617(ABAYE4) ------------------------LLAFTTSLNE--MPL-------VEY-IFQRHIRKVV 291

ABAYE2056(ABAYE1) ------------------------VVPIVQP-QI--MKY-------GQK-LAEAFIRFQV 275

ACIAD2339(ACIAD2) ------------------------VVPIVQP-QI--MKY-------GQK-LAEAFIRFQV 275

CDDMORhodococcus IEHEDLVQDGWTALGQRMRAAVGSVPIEQYSPENVQRALEEADDE-QME-RIRARVDEIV 372

CPDMOPseudomonas ---VDLVQDSWTKIFGEIGVFLGSDGS----------RAQMVDFQ-LME-QIRARVDQEV 368

CHMOAcineto EERKAVFEKAWQTGGG-FRFMFETFGDI--------ATNMEANIE-AQN-FIKGKIAEIV 309

CHMORhodoHI-31 EERNRIFQEAWDHGGG-FRFMFGTFGDI--------ATDEAANEA-AAS-FIRAKVAEII 311

CPMO AERTEILEELWNAG-G-FRYWLANFQDY--------LFDDKANDY-VYE-FWRDKVRARI 322

OTEMO SERDAFFEELYRQP-G-YGIWLSGFRDL--------LLNKESNKF-LAD-FVAKKIRQRV 317

STMO EERRAVYEERWKLG-G--VLFSKAFPDQ--------LTDPAANDT-ARA-FWEEKIRAVV 322

PAMO EELVETLERYWQEG-G--PDILAAYRDI--------LRDRDANER-VAE-FIRNKIRNTV 317

201

ABAYE1825 KGFDVETHFTP---KYNPWDERLCLVPDGDLFKSISEGKASVVT---DRIKKFTENGILL 333

ACIAD2794 KGYDVDTHFTP---RYNPWDERLCLVPDGDLFKSISEGKASVVT---DRIKQFTQDGILL 333

AtaHMycotuberculosis EGYDVRKHFGP---HYNPWDQRLCLVPNGDLFRAIRHGKVEVVT---DTIERFTATGIRL 327

BVMOAcinetoradio GKVD-MKHFTP---SYNPWDQRLCVVPDGDLFKALREGHASVET---DHIEKFTETGIQL 327

ABAYE0435 GKVD-MKHFTP---SYNPWDQRLCVVPDGDLFKILREGKASVET---DQIEKFTETGIQL 327

ACIAD3192 GKVD-MKHFTP---SYNPWDQRLCVVPDGDLFKILRSGQASVET---DQIEKFTETGIQL 327

HAPMOPsfluo DRPDLREVLIP---DSPVGGKRIV-RDNGTWISTLKRDNVSMIR---QPIEVITPKGICC 474

HAPMOPsputida DRPDLRNVLIP---DSPVGSKRII-RDNGTWISTLKRDNVSMIR---QPIEAIRPTGICC 474

CHMORhodoRHA1(MO6) RDPKLRKALTP---DYTLGCKRLL-LSN-TYYPALTRPNVEVHA---NAVESVRGNVVVG 318

ACIAD1733(ACIAD1) KDPELLKAVIP---DFTIGCKRLL-FAN-NYYPALQASNTKLIP---HGLVKVEGNTVIA 335

ABAYE2606(ABAYE2) KDPVLRKNVTP---NFDIGCKRIL-FAN-NYYPALQASNTTLIP---HGLVKVEGNTVIA 335

ABAYE2614(ABAYE3) ADPELRKNVTP---NFDIGCKRIL-FAN-NYYPALQAPNTTLIP---HGLVKVEGNTVIA 336

ABAYE2617(ABAYE4) KDGKLRHRLMP---DYPIGCKRIL-ISN-HWYETLTQPHVDVIN---TGIQEITEHGILD 343

ABAYE2056(ABAYE1) KDKDLAKKLTP---DFVMGCKRIL-ISN-KYFPTFNRKNVELVT---EGIQEIKENSIIT 327

ACIAD2339(ACIAD2) KDKTLAKKLTP---DFVMGCKRIL-ISN-KYFPTFNRKNVELVT---DGIQEITENAIVT 327

CDDMORhodococcus TDPATAAQLKAW---FRQMCKRPC-FHD-DYLPAFNRPNTHLVDTGGKGVERITENGVVV 427

CPDMOPseudomonas KDPATAESLKPY---YNIMCKRPG-FHD-SYLPSFNKPNVTLVDTQGAGVERITEKGLVV 423

CHMOAcineto KDPAIAQKLMP----QDLYAKRPL-CDS-GYYNTFNRDNVRLEDVKANPIVEITENGVKL 363

CHMORhodoHI-31 EDPETARKLMP----KGLFAKRPL-CDS-GYYEVYNRPNVEAVAIKENPIREVTAKGVVT 365

CPMO KDPKVAEKLAPMKKPHPYGAKRPS-LEQ-WYYEIFNQNNVTLVDVNETPVLRITEKGIVT 380

OTEMO KDPVVAEKLIP--KDHPFGAKRVP-MET-NYYETYNRDNVHLVDIREAPIQEVTPEGIKT 373

STMO DDPAVAELLTP--KDHAIGAKRIV-TDS-GYYETYNRDNVELVDLRSTPIVGMDETGIVT 378

PAMO RDPEVAERLVP--KGYPFGTKRLI-LEI-DYYEMFNRDNVHLVDTLSAPIETITPRGVRT 373

. :* .. : . :

ABAYE1825 ESGKLLEADVIVTATGLNMLAFSR---IQLTV---DDKNIQ----YPDTTIFKSMMLSDV 383

ACIAD2794 ESGKNLDADIIVTATGLNMLAFSR---IQLSV---DGKEVQ----YPDTTIFKSMMLSDV 383

AtaHMycotuberculosis NSGRELPADIIITATGLNLQLFGG---ATATI---DGQQVD----ITTTMAYKGMMLSGI 377

BVMOAcinetoradio KSGKHLEADIIISATGLQIQIMGG---IQGTV---DGQPID----TSEHMLYNGILISDV 377

ABAYE0435 KSGKHLDADIIVSATGLQVQIMGG---VQATI---DGEPVK----SSEHMLYNGVMLSDV 377

ACIAD3192 KSGKHLDADIVVSATGLEIQILGG---IKGTI---DGQPLD----TSKSMLYQGVMVSDV 377

HAPMOPsfluo VDGTEHEFDLIVYGTGFHASK--FL--MPINVTGRDGVALHDVWKGDDARAYLGMTVPQF 530

HAPMOPsputida IDGTVHEFDLIVYGTGFHASK--FL--MPINITGRDGLALREVWKDDDARAYMGMTVPGF 530

CHMORhodoRHA1(MO6) SDGAEREVDAIIFGTGFHILDMP----IGSKVFDGDGRSLDDHWKG-SPQAYLGTTVAGF 373

ACIAD1733(ACIAD1) ANGERHEVDVIIWGTGFEVSHPP----IGRRVYNDKGECLNDLWKQSSPEAYLGTNIENV 391

ABAYE2606(ABAYE2) ANGERHEVDVIIWGTGFEVSHPP----IGKRVHNEKGECLAELWKDSSPEAYLGTNIENV 391

ABAYE2614(ABAYE3) ANGERHEVDVIIWGTGFEVSHPP----IGKRVFNEKGQRLNDLWKNSSPEAYLGTNIENV 392

ABAYE2617(ABAYE4) TEGKLREVDAIIYGTGFTATE--FM--APMQITGLDGRTLKDTWKD-GAEAYLGLTVNGF 398

ABAYE2056(ABAYE1) KDGKERPIDCLIYGTGFVTDPRIYL--KHFTCVGRNQIELKQAWKN-GAESYYGIMTKNF 384

ACIAD2339(ACIAD2) KDGKQRHIDCLIYGTGFITDPRIYL--KHFECFGKNHQELKEAWKN-GPESYYGITTAGF 384

CDDMORhodococcus AGVE-YEVDCIVYASGFEFLGTGYTDRAGFDPTGRDGVKLSEHWAQ-GTRTLHGMHTYGF 485

CPDMOPseudomonas NGRE-YEVDCLIYATGFEYQ-TKLSRRNGYEIHGRNGQPLSDKWKD-GLSTLWGYHIRDF 480

CHMOAcineto ENGDFVELDMLICATGFDAVDGNYV---RMDIQGKNGLAMKDYWKE-GPSSYMGVTVNNY 419

CHMORhodoHI-31 EDGVLHELDVLVFATGFDAVDGNYR---RIEIRGRDGLHINDHWDG-QPTSYLGVSTANF 421

CPMO AEGE-AEFDLIVFATGFDAVTGGLT---SIDFRNNQGQSFKDVWSD-GIRTQLGVATAGF 435

OTEMO ADAA-YDLDVIIYATGFDAVTGSLD---RIDIRGKDNVRLIDAWAE-GPSTYLGLQARGF 428

STMO TGAH-YDLDMIVLATGFDAMTGSLD---KLEIVGRGGRTLKETWAA-GPRTYLGLGIDGF 433

PAMO SERE-YELDSLVLATGFDALTGALF---KIDIRGVGNVALKEKWAA-GPRTYLGLSTAGF 428

* :: .:*: . .

ABAYE1825 PNLAFAFGYTNIAW-----TLKVDLVWEHFCRMLDYMDENGYGTFKPFIQNKKMERVPFI 438

ACIAD2794 PNLAFAFGYTNIAW-----TLKVDLAWEHFCRLLDYMDANGYSIFKPVVHNPAMKRVPFI 438

AtaHMycotuberculosis PNMAYTVGYTNASW-----TLKADLVSEFVCRLLNYMDDNGFDTVVVERPGSDVEERPFM 432

BVMOAcinetoradio PNMAMIIGYINASW-----TLKVDVAAEYICRLLNYMDKHHYDEVIAPTDHSEIEQDTVM 432

ABAYE0435 PNMAMIIGYVNASW-----TLKVDIAADYICRLLNYMDKNNYDEVIPSGDKSVMEEDTVM 432

ACIAD3192 PNMAMIIGYINASW-----TLKVDVAADYICRLLNYMDKQGYDEVIPEGDQTELMEDTVM 432

HAPMOPsfluo PNMFCMYGPNTGLVVYSTVIQFSEMTASYIVDAVRLLLEGGHQSMEVKTPVFESYNQRVD 590

HAPMOPsputida PNMFCMYGPNTGLVVYSTIIQFSEFTATYIVDAVRLLLEGGHQSMEIKAQVFESYNQRVD 590

CHMORhodoRHA1(MO6) PNAFVLLGPALGTGH-TSAFMILEAQLDYLIQAVTAARSNGWTRMEPRREVQDAFNAQVQ 432

ACIAD1733(ACIAD1) PNAFLVLGPNVLVY--DSFIGLAEAQLDYIVDGLQKIKKHNISKLTIKPQVIHAHNERVQ 449

ABAYE2606(ABAYE2) PNAFLMLGPNVLVY--DSFIGLAEAQLQYIVDGLLQMKAKGIAKLSVKSEIIKKHNELVQ 449

ABAYE2614(ABAYE3) PNAFLVLGPNVLVY--DSFIGLAEAQLDYIVDGLLKIKNKGISKLNVKADVIKKHNDLVQ 450

ABAYE2617(ABAYE4) PNFFMLYGPNTNLGH-NSIVYMIESQVNYILDALRTTLKNNLLFTNIRAEIQHEFNQNIQ 457

ABAYE2056(ABAYE1) PNLFQLVGPNTVLGH-NSIIFMIESQVNYILQLIDLVEKSGQHAIEIKPEVQDTFNERIQ 443

ACIAD2339(ACIAD2) PNLFQLLGPNTVLGH-NSVIFMIESQVNYILQLIKLVDTTKTQAVEVKVQVQNNFNETIQ 443

CDDMORhodococcus PNLFVLQLMQGAALG-SNIPHNFVEAARVVAAIVDHVLSTGTSSVETTKEAEQAWVQLLL 544

CPDMOPseudomonas PNCFILGNGQS-AVT-PNFTHMLNEAGKHVAYVVKHCLDERVDVFEPTAEAEQAWVDHVM 538

CHMOAcineto PNMFMVLGPNGP--F-TNLPPSIESQVEWISDTIQYTVENNVESIEATKEAEEQWTQTCA 476

CHMORhodoHI-31 PNWFMVLGPNGP--F-TNLPPSIETQVEWISDTIGYAERNGVRAIEPTPEAEAEWTETCT 478

CPMO PNLLFGYGPQSPAGF-CNGPSSAEYQGDLLIQLMNYLRDNNISRIEAQSEAQEEWSKLIA 494

OTEMO PNFFTLVGPHNGSTF-CNVGVCGGLQAEWVLRMISYMKDNGFTYSEPTQAAENRWTEEVY 487

STMO PNFFNLTGPGSPSVL-ANMVLHSELHVDWVADAIAYLDARGAAGIEGTPEAVADWVEECR 492

PAMO PNLFFIAGPGSPSAL-SNMLVSIEQHVEWVTDHIAYMFKNGLTRSEAVLEKEDEWVEHVN 487

** . :

ABAYE1825 -DLSPGYVQRGLAQFPKAGTEGPWTLQHAYEHDFERLRKGP-VNDPELLFIKRLSKKKL- 495

ACIAD2794 -DLSPGYVQRGLAQFPMAGTEGPWTLQHAYEHDFERLRNGP-VFDKELQFTNIAQKNKL- 495

AtaHMycotuberculosis -EFTPGYVLRSLDELPKQGSRTPWRLNQNYLRDIRLIRRGK-IDDEGLRFAKRPAPVGV- 489

BVMOAcinetoradio GSLSAGYIRRAADVIPKQGKHAPWQVTNNYLADRKALKQAG-FEDGILQFTKRDKQLER- 490

ABAYE0435 GSLSSGYISRAADVIPKQGKQAPWQVTNNYLEDRKSLKNAK-FDDGVLRFHKHSEVTTR- 490

ACIAD3192 GSLTSGYIARAANVMPKQGKHAPWKVTNNYLADRKALKNAR-FDDGVLHFDKKTDTVER- 490

HAPMOPsfluo EG-------NALRAWGFSKV-NSWYKNSKG-------RVTQNFPFTAVEFWQRTHSVEPT 635

HAPMOPsputida QA-------NGLRAWGFSRV-NSWYKNSKG-------RVTQNFPFNAVEFWHRTHEVQAT 635

CHMORhodoRHA1(MO6) EA-------LATTVYNAGGC-QSYFLDVNG-------RNSFNWPWSTDRMRQRLGRFDEA 477

ACIAD1733(ACIAD1) KH-------LKTTVFNAGGC-KSYYLDANG-------RNFAAWPWSLKKLRQRLKSLNIR 494

ABAYE2606(ABAYE2) KH-------LQTTVFNSGGC-KSYYLDANG-------RNFAAWPWSLKKLKQRLHHLNLE 494

ABAYE2614(ABAYE3) KH-------LQTTVFNSGGC-KSYYLDANG-------RNFAAWPWSLKKLKQRLKKLDLK 495

ABAYE2617(ABAYE4) EK-------MKKTVWA-QGC-TSWYQTADG-------KNTNNWPGFTLEYRQRTRRFDIE 501

ABAYE2056(ABAYE1) TQ-------LQGTVWQAGGC-SSWYQAADG-------KNFSLWPTYTWKYWLDTRKVNPK 488

ACIAD2339(ACIAD2) KQ-------LQGTVWQAGGC-VSWYQTSEG-------KNFSLWPTYTWKYWLETRKINVS 488

CDDMORhodococcus DH-------G--RPLGNPECTPGYYNNEGKPA-ELKDRLNVGYPAGSAAFFRMMDHWLAA 594

CPDMOPseudomonas SF-------AGIKQQYDRECTPSYYNNEGQVN-DVALTRNNFYPGGAVAFINILREWREK 590

CHMOAcineto NI-------AEMTLFPK---AQSWIFGANIPGKK---NTVYFYLGGLKEYRTCASNCKNH 523

CHMORhodoHI-31 EI-------ANATLFTK---GDSWIFGANIPGKK---PSVLFYLGGLRNYRAVMAEVAAD 525

CPMO DF-------WDSSLFPR---AKSWYQGSNIPGKK---VESLNFPLGLPTYISKFNESAEK 541

OTEMO AD-------FSRTLLAE---ANAWWVKTTTKPDGSVVRRTLVHVSGGPEYRKRCEQVAYN 537

STMO NR-------AEASLLNS---ANSWYLGANIPGRP---RVFMPFLGGFGVYREIITEVAES 539

PAMO EI-------ADETLYPM---TASWYTGANVPGKP---RVFMLYVGGFHRYRQICDEVAAK 534

:

202

ABAYE1825 --------------SVMNEPSTKQIKAQA 510

ACIAD2794 --------------TVVKGTCAKPLKAQA 510

AtaHMycotuberculosis ----------------------------- 489

BVMOAcinetoradio --------------K--PK----LVS--- 496

ABAYE0435 --------------K--PK----LVS--- 496

ACIAD3192 --------------KTKPK----LVS--- 498

HAPMOPsfluo D-YQLG----------------------- 640

HAPMOPsputida D-YCLS----------------------- 640

CHMORhodoRHA1(MO6) A-YDVSREPASATATSR------------ 493

ACIAD1733(ACIAD1) D-YDVTYQTTTNKIDA------------- 509

ABAYE2606(ABAYE2) E-YEVIYEADLVKVKPKVEEVAG------ 516

ABAYE2614(ABAYE3) D-YEVTYQMSKTH---------------- 507

ABAYE2617(ABAYE4) N-YTQVSAIS------------------- 510

ABAYE2056(ABAYE1) D-YLLLNKCSQSYAA-------------- 502

ACIAD2339(ACIAD2) D-YHFLGDIQAKKIAV------------- 503

CDDMORhodococcus GSFDGLTFR-------------------- 603

CPDMOPseudomonas GDFAQFQQRKR------------------ 601

CHMOAcineto A-YEGFDIQLQRSDIKQPANA-------- 543

CHMORhodoHI-31 G-YRGFEVKSAEMVTV------------- 540

CPMO G-YAGFSLAS------------------- 550

OTEMO N-YNGFELA-------------------- 545

STMO G-YKGFAILEG------------------ 549

PAMO G-YEGFVLT-------------------- 542

En vert, les deux signatures

En rouge, l’Arginine conservée du site actif (R337 chez PAMO)

Pourcentage d’identité de séquences

203

Alignements de séquences des dix BVMOs putatives d’A. baumannii et

d’A. baylyi avec PAMO

ABAYE1825 ----------------------MNTSEQVTTTDVLIIGAGIAGISAAYHLKKHRPNTTFI 38

ACIAD2794 ----------------------MSTSDQIASFDVLIIGAGISGISAAYHLKKNRPNDTFA 38

ABAYE0435 ---------------------------MEKQVDVLIIGAGISGIGVAAHLSKNSPQRQFE 33

ACIAD3192 ---------------------------MEKHIDILIVGAGISGIGIAAHLSKDAPQRQFE 33

PAMO ---------------MAGQTTVDSRRQPPEEVDVLVVGAGFSGLYALYRLREL-GRS-VH 43

ACIAD1733(ACIAD1) ----------MTAQAKKL-DSADRKALPSHIYDSFIVGAGISGIAAAIRLDQV-GYANYK 48

ABAYE2606(ABAYE2) ----------MVTKPITN-TRTRKTQEVAHIYDTFIVGAGISGLAAAIKLNEA-GLTNFK 48

ABAYE2614(ABAYE3) ----------MTAQMKTNASAKKAVNSPSHIYDTFIVGAGISGIAAAIRLDQV-GYTNYK 49

ABAYE2617(ABAYE4) MRFFRSLFLRILEQPMFNSSS-----NSNKNVRIAIIGTGFGGLGLAIRLKQA-GFEQFT 54

ABAYE2056(ABAYE1) ---------------MLNAKQ-----HAIQKTKIAIIGAGFGGLAMAIRLLQS-QQSDFF 39

ACIAD2339(ACIAD2) ---------------MQQATI-----NATQTTKIAIIGAGFGGLAMAIRLLQH-HIRDFV 39

::*:*:.*: :* :

ABAYE1825 ILEARDTFGGTWSQFKYPGIRSDSDMPSFGFGFKP-----WTHQKAIAQANVICDYLQET 93

ACIAD2794 ILEGRNAIGGTWSQFKYPGIRSDSDMPSFGFGFKP-----WTHKKAIAQASVICDYLQET 93

ABAYE0435 ILERRESFGGTWDLFRYPGIRSDSDMSTFGFNFKP-----WRKANVLADGASIKGYLGEV 88

ACIAD3192 IIERRENIGGTWDLFRYPGIRSDSDMSTFGFNFKP-----WQSPNVLASGSSIKGYLSEV 88

PAMO VIETAGDVGGVWYWNRYPGARCDIESIEYCYSFSEEVLQEWNWTERYASQPEILRYINFV 103

ACIAD1733(ACIAD1) IIEKASRVGGTWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAQWSHLFARQPEILNYLEDV 104

ABAYE2606(ABAYE2) IIEKASRVGGTWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAKWSHLFARQPEILSYLEDV 104

ABAYE2614(ABAYE3) IIEKAERVGGTWRENTYPGCGCDVPSALYSYSFAP----SAKWSHLFARQPEILSYLEDV 105

ABAYE2617(ABAYE4) LFEKAADVGGVWRDNTYPGAACDVPSHLYSFSFEQ----ELGWKNRYGTSQEIYQYLRHC 110

ABAYE2056(ABAYE1) ILEKSNDVGGTWRENRYPGAACDVQSHMYSLSFAP----KTDWSKRYAEAPEIFDYIQDI 95

ACIAD2339(ACIAD2) IFEKAQDIGGTWRENQYPGAACDVQSHMYSLSFAP----KTNWSKRYAEAGEIFSYIQDI 95

::* .**.* *** .* : * . . * *:

ABAYE1825 IQENKINAHINYGYKVNKAEFSSDEQLWTITAENLASKALVNFKARFLLLNTGYYDYQKG 153

ACIAD2794 IQENDISKHICFGYHVNQAEFSSEEQLWTITAVKLEDKSIVSFKARFLLLNTGYYDYQEG 153

ABAYE0435 IDEFKLKEKIHFGHRVLSANYDSASKKWHVIVEDNKKK-QQTWVANFVVGCTGYYNYDQG 147

ACIAD3192 VDEYDLKKKIHFKHRVLAANYDTASKKWYVEIEDAAQK-KQTWIANFIVGCTGYYNYDQG 147

PAMO ADKFDLRSGITFHTTVTAAAFDEATNTWTVDTNH-----GDRIRARYLIMASGQLSVP-- 156

ACIAD1733(ACIAD1) SHKFNINEKIEFETELNKAAWDNERNLWVLDTNK-----GQ-FLSRTVVFATGPITEA-- 156

ABAYE2606(ABAYE2) SREFDIESLIEFNTELLKAEWDNVKNVWKLETSS-----GL-YITKTVLFATGPITEA-- 156

ABAYE2614(ABAYE3) SNEFNITSKIEFNNELLNAAWDESRHLWVLDTTT-----GQ-YLSRTVIFATGPITEA-- 157

ABAYE2617(ABAYE4) ADKYDLRPHIKFNTEIASAEFDALQGVWHIQSTT-----GEQFEAEFLVGAVGQLNRP-- 163

ABAYE2056(ABAYE1) TDQYQIKNYCKFNHEVTHVQYDEMRHIWTLNFAN-----QPSLEAQFVVFASGPLHIP-- 148

ACIAD2339(ACIAD2) SEQFQLRQYCKFEHEVTRAEYDEQNFIWNLEFKN-----HPAVQAQFVIFASGPLHVP-- 148

: .: : : . :. * : :. :: *

ABAYE1825 FTPEFEGIESFKGKVIHPQHWPVG-FDYTKKRVIVIGSGATAVTLLPSMA-DKAEHVTML 211

ACIAD2794 FSPKFEGTEKFKGQIIHPQHWPEN-LDYSNKKVVVIGSGATAVTLLPSMA-GKAQHVTML 211

ABAYE0435 YAPTFPNQEAFKGQLIHPQHWPEN-LDYKGKKVVIIGSGATAITLVPAMSKGGAGHVTML 206

ACIAD3192 FEPDFPNKDAFKGQFIHPQHWPEN-LDYVGKKVVIIGSGATAITLVPAMSKGGAEHVTML 206

PAMO QLPNFPGLKDFAGNLYHTGNWPHEPVDFSGQRVGVIGTGSSGIQVSPQIA-KQAAELFVF 215

ACIAD1733(ACIAD1) QIPKLDGLDSFKGEMFHSARWNHD-YDLSGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQ-PLAKELFVF 214

ABAYE2606(ABAYE2) QIPRLEGLDTFTGEMFHSAKWNHD-YDLTGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQ-PKAKELFLF 214

ABAYE2614(ABAYE3) QIPRLEGLDTFTGEMFHSAKWNHD-YDLTGKRIAVIGTGASAIQFVPQIQ-PKAKELFVF 215

ABAYE2617(ABAYE4) AYPKLKGIENFKGKAFHSARWDHD-YELTGKRVAVIGTGASAIQFVPEIA-KQVAHLDVY 221

ABAYE2056(ABAYE1) QIPHIQGIEKFKGKVFHSSQWEHD-YSLEGKSVASIGTGGSAIQYIPEIA-KDVKQLYVF 206

ACIAD2339(ACIAD2) QIPHIKGIENFKGKVFHSSQWDHG-YDLSNKVVASIGTGGSAIQYIPEIA-QQVKQLYVL 206

* : . * *: * .* . : : **:*.:.: * : . .: :

(CLUSTAL Oméga (1.2.1) avec les paramètres par défaut du logiciel)

ABAYE1825 QRSPTYMVSFPAVDPIAGMLNKILGYERAYPIIRKKNISMN------------------- 252

ACIAD2794 QRSPTYMVSFPAVDPIACMLNKLLGYEKAYPIIRKKNIALN------------------- 252

ABAYE0435 QRSPTYIASVPSIDFIYEKTRRFMSEEAAYKFTRARNIGMQ------------------- 247

ACIAD3192 QRSPTYIASIPSIDFVYDKMRKVLPEDLAYKLTRARNIGVQ------------------- 247

PAMO QRTPHFAVPARNAPLDPEFLADLK---KRYAEFREESRNTPGGTHRYQGPKSALEVSDEE 272

ACIAD1733(ACIAD1) QRTAPWVVPKPDMELGDFS-KSVI---AKLPIIQSTWRKAV------------------- 251

ABAYE2606(ABAYE2) QRTAPWVLPKPDTDLGEFS-KSII---AKYPAIQAGWRQTV------------------- 251

ABAYE2614(ABAYE3) QRTAPWVLPKPDTDLGEFS-KSII---AKYPAIQASWRKSV------------------- 252

ABAYE2617(ABAYE4) QRSAPYVIPKPDRVYQPLE-KKAF---RKLPILQSLDRALQ------------------- 258

ABAYE2056(ABAYE1) QRTAAWVIPRDERKYSNLS-KALF---KKSNFYRQIHRSRL------------------- 243

ACIAD2339(ACIAD2) QRTAAWVIPRDERAYSGLS-KLLF---KKSDFYRQIHRIRL------------------- 243

**: : :

ABAYE1825 -----------R---ALYKA-----CRNYPQIMKKLLIADVRRRLPKGFDVETHFTP-KY 292

ACIAD2794 -----------R---ALYKA-----CRNYPQVMKKLLLADVRRRLPKGYDVDTHFTP-RY 292

ABAYE0435 -----------R---AIYAL-----SQKHPKTVRRLLLKAIEMQLKGKV-DMKHFTP-SY 286

ACIAD3192 -----------R---GIYTL-----SQKQPKLVRKFLLKSIEMQLKGKV-DMKHFTP-SY 286

PAMO LVETLERYWQEGGPDILAAYRDILRDRDANERVAEFIRNKIRNTVRDPE-VAERLVPKGY 331

ACIAD1733(ACIAD1) -------AQSLNA--INFGLRN---P-AVLKPVGELFKQVLKSQVKDPE-LLKAVIP-DF 296

ABAYE2606(ABAYE2) -------AGTLNV--INFGLRN---P-KALKPVNFAAKQLLKLQIKDPV-LRKNVTP-NF 296

ABAYE2614(ABAYE3) -------ALTLNA--INFGLRN---P-LALKPVNVLGKQLLKLQIADPE-LRKNVTP-NF 297

ABAYE2617(ABAYE4) -------YGHHEI--RLLAFTT---SLNEMPLVEYIFQRHIRKVVKDGK-LRHRLMP-DY 304

ABAYE2056(ABAYE1) -------YWSNES--RVVPIVQ---P-QIMKYGQKLAEAFIRFQVKDKD-LAKKLTP-DF 288

ACIAD2339(ACIAD2) -------YWSNES--RVVPIVQ---P-QIMKYGQKLAEAFIRFQVKDKT-LAKKLTP-DF 288

:. : . * :

ABAYE1825 NPWDERLCLVPDGDLFKSISEGKASVVTDRIKK---FTENGILLESGKLLEADVIVTATG 349

ACIAD2794 NPWDERLCLVPDGDLFKSISEGKASVVTDRIKQ---FTQDGILLESGKNLDADIIVTATG 349

ABAYE0435 NPWDQRLCVVPDGDLFKILREGKASVETDQIEK---FTETGIQLKSGKHLDADIIVSATG 343

ACIAD3192 NPWDQRLCVVPDGDLFKILRSGQASVETDQIEK---FTETGIQLKSGKHLDADIVVSATG 343

PAMO PFGTKRLI--LEIDYYEMFNRDNVHLVDTLSAPIETITPRGV-RTSEREYELDSLVLATG 388

ACIAD1733(ACIAD1) TIGCKRLL--FANNYYPALQASNTKLIPHGLVKVE---GNTVIAANGERHEVDVIIWGTG 351

ABAYE2606(ABAYE2) DIGCKRIL--FANNYYPALQASNTTLIPHGLVKVE---GNTVIAANGERHEVDVIIWGTG 351

ABAYE2614(ABAYE3) DIGCKRIL--FANNYYPALQAPNTTLIPHGLVKVE---GNTVIAANGERHEVDVIIWGTG 352

ABAYE2617(ABAYE4) PIGCKRIL--ISNHWYETLTQPHVDVINTGIQEIT---EHGILDTEGKLREVDAIIYGTG 359

ABAYE2056(ABAYE1) VMGCKRIL--ISNKYFPTFNRKNVELVTEGIQEIK---ENSIITKDGKERPIDCLIYGTG 343

ACIAD2339(ACIAD2) VMGCKRIL--ISNKYFPTFNRKNVELVTDGIQEIT---ENAIVTKDGKQRHIDCLIYGTG 343

:*: . : : .. : : . . * :: .**

ABAYE1825 LNMLA---FSRIQLT-VDDK----NIQYPDTTIFKSMMLSDVPNLAFAFGYTNI----AW 397

ACIAD2794 LNMLA---FSRIQLS-VDGK----EVQYPDTTIFKSMMLSDVPNLAFAFGYTNI----AW 397

ABAYE0435 LQVQI---MGGVQAT-IDGE----PVKSSEHMLYNGVMLSDVPNMAMIIGYVNA----SW 391

ACIAD3192 LEIQI---LGGIKGT-IDGQ----PLDTSKSMLYQGVMVSDVPNMAMIIGYINA----SW 391

PAMO FDALTGAL -KIDIRGVGNVALKEKWAA-GPRTYLGLSTAGFPNLFFIAGPGSPSALSNM 446

ACIAD1733(ACIAD1) FEVSHPPI--GRRVYNDKGECLNDLWKQSSPEAYLGTNIENVPNAFLVLGPNVL-VYDSF 408

ABAYE2606(ABAYE2) FEVSHPPI--GKRVHNEKGECLAELWKDSSPEAYLGTNIENVPNAFLMLGPNVL-VYDSF 408

ABAYE2614(ABAYE3) FEVSHPPI--GKRVFNEKGQRLNDLWKNSSPEAYLGTNIENVPNAFLVLGPNVL-VYDSF 409

ABAYE2617(ABAYE4) FTATE--FMAPMQITGLDGRTLKDTWKD-GAEAYLGLTVNGFPNFFMLYGPNTNLGHNSI 416

ABAYE2056(ABAYE1) FVTDPRIYLKHFTCVGRNQIELKQAWKN-GAESYYGIMTKNFPNLFQLVGPNTVLGHNSI 402

ACIAD2339(ACIAD2) FITDPRIYLKHFECFGKNHQELKEAWKN-GPESYYGITTAGFPNLFQLLGPNTVLGHNSV 402

: : . .** *

204

ABAYE1825 TLKVDLVWEHFCRMLDYMDENGYGTFK--PFIQNKKM-------ERVPFI--DLSPGYVQ 446

ACIAD2794 TLKVDLAWEHFCRLLDYMDANGYSIFK--PVVHNPAM-------KRVPFI--DLSPGYVQ 446

ABAYE0435 TLKVDIAADYICRLLNYMDKNNYDEVI--PSGDKSVM------EEDTVMG--SLSSGYIS 441

ACIAD3192 TLKVDVAADYICRLLNYMDKQGYDEVI--PEGDQTEL------MEDTVMG--SLTSGYIA 441

PAMO LVSIEQHVEWVTDHIAYMFKNGLTRSEAVLEKEDEWVEHVNEIADETLYP--MTASWYTG 504

ACIAD1733(ACIAD1) IGLAEAQLDYIVDGLQKIKKHNISKLTIKPQVIHAHNERVQKHLKTTVFNAGGCKSYYLD 468

ABAYE2606(ABAYE2) IGLAEAQLQYIVDGLLQMKAKGIAKLSVKSEIIKKHNELVQKHLQTTVFNSGGCKSYYLD 468

ABAYE2614(ABAYE3) IGLAEAQLDYIVDGLLKIKNKGISKLNVKADVIKKHNDLVQKHLQTTVFNSGGCKSYYLD 469

ABAYE2617(ABAYE4) VYMIESQVNYILDALRTTLKNNLLFTNIRAEIQHEFNQNIQEKMKKTVWA-QGCTSWYQT 475

ABAYE2056(ABAYE1) IFMIESQVNYILQLIDLVEKSGQHAIEIKPEVQDTFNERIQTQLQGTVWQAGGCSSWYQA 462

ACIAD2339(ACIAD2) IFMIESQVNYILQLIKLVDTTKTQAVEVKVQVQNNFNETIQKQLQGTVWQAGGCVSWYQT 462

: : . : . . . *

ABAYE1825 RGLAQFPKAGTEGPWTLQHAYEHDFERLRKGPVNDPELLFIKRLSKKKLSVMNEPSTKQI 506

ACIAD2794 RGLAQFPMAGTEGPWTLQHAYEHDFERLRNGPVFDKELQFTNIAQKNKLTVVKGTCAKPL 506

ABAYE0435 RAADVIPKQGKQAPWQVTNNYLEDRKSLKNAKFDDGVLRFHKHSEVTTRK------PKLV 495

ACIAD3192 RAANVMPKQGKHAPWKVTNNYLADRKALKNARFDDGVLHFDKKTDTVERK----TKPKLV 497

PAMO ANVPGKPRVFMLYVGGFH-RYR-----QICDEVAAKGYEGFVLT---------------- 542

ACIAD1733(ACIAD1) ANG----RNFAAWPWSLK-KLR-----QRLKSLNIRDYDVTYQTTTNKIDA--------- 509

ABAYE2606(ABAYE2) ANG----RNFAAWPWSLK-KLK-----QRLHHLNLEEYEVIYEADLVKVKPKVEEVAG-- 516

ABAYE2614(ABAYE3) ANG----RNFAAWPWSLK-KLK-----QRLKKLDLKDYEVTYQMSKTH------------ 507

ABAYE2617(ABAYE4) ADG----KNTNNWPGFTL-EYR-----QRTRRFDIENYTQVSAIS--------------- 510

ABAYE2056(ABAYE1) ADG----KNFSLWPTYTW-KYW-----LDTRKVNPKDYLLLNKCSQSYAA---------- 502

ACIAD2339(ACIAD2) SEG----KNFSLWPTYTW-KYW-----LETRKINVSDYHFLGDIQAKKIAV--------- 503

.

ABAYE1825 KAQA 510

ACIAD2794 KAQA 510

ABAYE0435 S--- 496

ACIAD3192 S--- 498

PAMO ---- 542

ACIAD1733(ACIAD1) ---- 509

ABAYE2606(ABAYE2) ---- 516

ABAYE2614(ABAYE3) ---- 507

ABAYE2617(ABAYE4) ---- 510

ABAYE2056(ABAYE1) ---- 502

ACIAD2339(ACIAD2) ---- 503

En rouge, les séquences de PAMO qui ne se trouvent pas chez

les dix BVMOs putatives d’Acinetobacter.

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