UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER U.F.R …thesesups.ups-tlse.fr/112/1/Peyret-Lacombe_Alexis.pdf · Figure 15. Schéma simplifié des voies de signalisation des TLRs et des

Laboratoire de Physio-Pathologie et Thérapeutiques Bucco-dentaires, Université Paul Sabatier, Toulouse III-3 chemin des Maraîchers-31062 TOULOUSE

Département de Pharmacologie cellulaire/Institut de Recherche Pierre Fabre-Hôtel Dieu-2 rue Viguerie-BP

3071-31025 TOULOUSE Cedex 3

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER

U.F.R ODONTOLOGIE

T H E S E

EN VUE DE L’OBTENTION DU

DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE

délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier

Discipline : IMMUNOLOGIE

PRESENTEE ET SOUTENUE PAR

ALEXIS PEYRET-LACOMBE

LE 19 DECEMBRE 2007

ETUDE DE L’IMMUNO-REACTIVITE EPITHELIALE GINGIVALE

EN REPONSE A DEUX BACTERIES COMMENSALES :

IMPLICATION DU TLR2

_______

Directeur de thèse : PR. G. BRUNEL

Co-Directeur : DR. H. DUPLAN

______

JURY

PR. J.C. FARGES RAPPORTEUR PR. H. TENENBAUM RAPPORTEUR PR. D. DUFFAUT EXAMINATEUR PR. M. ROUABHIA , PRESIDENT EXAMINATEUR

TABLE DES MATIERES

1

TABLE DES MATIERES

RÉSUMÉ DES TRAVAUX ......................................................................5

ABREVIATIONS..................................................................................6

LISTE DES FIGURES ...........................................................................7

INTRODUCTION .................................................................................9

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES.................................... 11

LES MALADIES PARODONTALES............................................. 12

I) Définition et classification des maladies parodontales ...................13

A) Définition ....................................................................................13

B) Classification...............................................................................13

1) Les gingivites .............................................................................. 13

2) Les parodontites .......................................................................... 14

a) La parodontite de l’adulte........................................................... 14

b) La parodontite à début précoce ................................................... 14

c) Les parodontites associées (maladies systémiques) ....................... 15

d) La parodontite ulcéro-nécrotique................................................. 16

e) La parodontite réfractaire ........................................................... 16

II) Epidémiologie ...............................................................................16

A) Définitions et outils.....................................................................16

B) La prévalence..............................................................................17

C) Facteurs étiologiques ..................................................................18

1) Le biofilm.................................................................................... 18

2) L’hôte......................................................................................... 19

LA RELATION HOTE/BACTERIES............................................ 20

I) L’hôte ; généralités sur la cavité buccale........................................21

A) Caractéristiques d’une barrière épithéliale..................................21

1) La différenciation ......................................................................... 21

2) Les jonctions intercellulaires.......................................................... 22

3) La barrière immunitaire ................................................................ 23

B) Spécificité de la barrière épithéliale dans la cavité buccale.........24

1) Structure générale ....................................................................... 24

2) Parodonte et épithélium................................................................ 24

a) Épithélium oral gingival.............................................................. 25

b) Épithélium sulculaire.................................................................. 26

c) Épithélium jonctionnel................................................................ 26

II) Le biofilm ......................................................................................28

A) Définition ....................................................................................28

B) Formation....................................................................................28

C) Structure .....................................................................................29

D) Composition bactérienne de la plaque dentaire ..........................30

TABLE DES MATIERES

2

E) Interactions.................................................................................31

F) Trois exemples de bactéries parodontales...................................32

III) Homéostasie, Interaction hôte/bactéries ....................................35

A) L’hôte..........................................................................................35

B) Les bactéries ...............................................................................36

LA PATHOGENESE DES MALADIES PARODONTALES (MPS) ET LA

REPONSE DE L’HOTE .......................................................... 37

I) Rupture de l’homéostasie ...............................................................38

A) Anatomopathologie des lésions gingivales et parodontales ........38

1) Gencive saine (lésion initiale) ........................................................ 38

2) Gingivite et parodontite (lésions précoce, établie et avancée) ............ 38

a) Gingivites débutantes et établies................................................. 38

b) La parodontite .......................................................................... 39

c) Facteurs communs aux différentes pathologies.............................. 39

B) Pathogenèse des maladies parodontales.....................................40

1) Microbiologie des maladies parodontales......................................... 40

a) Evolution de la microflore gingivale ............................................. 40

b) Les facteurs de virulence............................................................ 41

c) Activité bactérienne directe et indirecte de destruction tissulaire ..... 41

2) Rôle des désordres systémiques .................................................... 43

3) Influences génétiques................................................................... 43

II) La réponse de l’hôte......................................................................44

A) L’inflammation ............................................................................45

1) Quelques acteurs moléculaires relargués......................................... 45

a) Les cytokines............................................................................ 45

b) Les métabolites de l’acide arachidonique ...................................... 46

c) Les MMPs ................................................................................. 46

2) Les réponses inflammatoires non contrôlées.................................... 49

a) Rôle du polymorphisme des molécules relarguées ......................... 49

b) Rôle du polymorphisme des récepteurs impliqués.......................... 50

B) La réponse immunitaire ..............................................................50

1) Les acteurs de l’immunité innée..................................................... 51

a) Les facteurs solubles.................................................................. 51

b) Les cellules............................................................................... 52

2) Les acteurs de l’immunité acquise .................................................. 54

a) Les lymphocytes B..................................................................... 54

b) Les lymphocytes T..................................................................... 55

LA REPONSE IMMUNE INNEE GINGIVALE ................................ 56

I) Le kératinocyte : une cellule immunoréactive.................................57

II) Les « Pattern Recognition Receptors » ou PRRs ...........................58

A) Les « Toll-like Receptors » ou TLRs ............................................59

1) Généralités.................................................................................. 59

TABLE DES MATIERES

3

2) TLR2 .......................................................................................... 60

a) Les ligands ............................................................................... 60

b) Les molécules adaptatrices ......................................................... 60

c) L’activation ............................................................................... 61

d) Expression au niveau gingival ..................................................... 61

3) TLR4 .......................................................................................... 61

a) Les ligands ............................................................................... 61

b) Les molécules adaptatrices ......................................................... 62

c) Activation ................................................................................. 62

d) Expression au niveau gingival ..................................................... 62

III) Les Peptides Antimicrobiens........................................................63

A) La cathélicidine LL-37 .................................................................63

1) Généralités.................................................................................. 63

2) Propriétés ................................................................................... 63

B) ß-défensines ...............................................................................64

1) HßD2 ........................................................................................65

a) Généralités............................................................................... 65

b) Régulation................................................................................ 66

c) L’activité antimicrobienne ........................................................... 68

d) Lien immunité innée et acquise ................................................... 68

2) HßD3.......................................................................................... 69

a) Localisation .............................................................................. 69

b) Régulation................................................................................ 70

c) Activité antimicrobienne ............................................................. 70

d) Lien immunité innée et acquise ................................................... 71

TRAVAIL EXPERIMENTAL............................................. 72

CHAPITRE I : Étude et mise au point de modèles cellulaires et

tissulaires...........................................................................................73

A) Introduction................................................................................74

1) Problématique de l’étude............................................................... 74

2) Objectifs de l’étude ...................................................................... 74

3) Déroulement de l’étude................................................................. 75

B) Étude de la modulation de peptides antimicrobiens dans un épithélium gingival reconstruit différencié ......................................75

1) Contexte de l’étude ...................................................................... 75

2) Méthodes et résultats ................................................................... 76

3) Discussion................................................................................... 78

C) Choix d’un modèle cellulaire .......................................................80


2) Matériel et méthodes.................................................................... 81

3) Résultats .................................................................................... 82

4) Discussion................................................................................... 83

TABLE DES MATIERES

4

D) Evaluation d’actifs, Alkyls Poly-Glucosides et stimulation de la réponse immune innée gingivale .....................................................83


2) Méthode et résultats..................................................................... 84

3) Discussion................................................................................... 85

CHAPITRE II : Étude de la reconnaissance et de la discrimination par le

récepteur TLR2 d’extraits membranaires d’une bactérie commensale S.

sanguinis et d’une bactérie commensale opportuniste F. nucleatum ..87

A) Problématique................................................................................ 88

B) Méthodes et résultats...................................................................... 88

C) Discussion ..................................................................................... 90

CHAPITRE III : Etude de la réponse immune innée de kératinocytes

gingivaux en présence de deux bactéries commensales S. sanguinis et

F. nucleatum : Discrimination par le TLR2. .........................................95

A) Introduction................................................................................... 96

B) Matériel et méthodes ...................................................................... 96

C) Résultats ..................................................................................... 100

D) Discussion ................................................................................... 105

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES................ 110

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................. 117

COMMUNICATIONS AFFICHEES.................................. 131

ABSTRACT......................................................................................133

RESUMÉ DES TRAVAUX

5

RÉSUMÉ DES TRAVAUX

ÉTUDE DE L’IMMUNO-REACTIVITE EPITHELIALE

GINGIVALE EN REPONSE A DEUX BACTERIES

COMMENSALES : IMPLICATION DU TLR2

L’épithélium gingival, exposé à la microflore buccale, protège les tissus sous-jacents en

maintenant une homéostasie parodontale. Pour ceci, les kératinocytes possèdent des

Pattern Recognition-Receptors (PRRs) capables de reconnaître spécifiquement différents

motifs bactériens. Les informations cellulaires transmises induisent la réponse immune innée

et notamment la production de peptides antimicrobiens (PAMs) et de médiateurs de

l’inflammation. Nos résultats montrent que les kératinocytes gingivaux sont capables de

reconnaître et de discriminer des bactéries commensales vraies (S. sanguinis) ou

opportunistes (F. nucleatum) par l’intermédiaire d’un PRR, le Toll-like Receptor 2 en

modulant l’expression de PAMs, les ß-défensines humaines 2 et 3 et de médiateurs de

l’inflammation. Cette activation différentielle des kératinocytes leur permet de fournir une

réponse adaptée et de maintenir l’homéostasie parodontale.

ABREVIATIONS

6

ABREVIATIONS

AP-1 : Activating protein–1

APGs : Alkyls Poly-Glucosides

CCR6 : chemokine (C-C motif) receptor 6

CMH : complexe majeur d’histocompatibilité

CPA : cellules présentatrices d’antigène

CPITN : Community Periodontal Index of

Treatment Needs

CSP : Competent Stimulating Peptide

EGF : Epidermal Growth Factor

EGFR : EGF Receptor

fMLP : récepteur du N-formylpeptide

hßD2 : ß-défensine humaine 2

hßD3 : ß-défensine humaine 3

ICAM-1 : Inter-cellular adhesion molecule-1

ieDAP : dipeptide diaminopimelic acid

IFNγ : interféron-γ

IL-1α : Interleukine-1α

IL-1ß : Interleukine-1ß

IL-8 : Interleukine-8

IP-10 : interferon-gamma inducible protein

10

JNK : c-Jun NH2 terminal kinase

Kgp : Lys-gingipaine

LB :lymphocytes B

LPS : Lipopolysaccharide

LT : lymphocytes T

LTA : Acide LipoTeichoïque

MAP Kinases : Mitogen-activated Protein

Kinases

MCP-1 : monocyte chemoattractant protein-1

MDP : muramyl dipeptide

MIP-1α : macrophage inflammatory protein-

1α

MMP : métalloprotéinases matricielles

MOI : Multiplicity Of Infection

NK : Natural Killer

NOD2 : Nucleotide-binding Oligomerization

Domain 2

p44/42 ERK kinase : p44/42 extracellular

signal-regulated kinase

PAMPs : Pathogen-Associated Molecular

Patterns

PAR2 : Protease-activated receptor 2

PGE2 : Prostaglandine E2

PGN : Peptidoglycane

PLC : Phospholipase C

PMN : Polymorphonucléaire neutrophile

PRR : Pattern Recognition Receptor

RANTES : Regulated on activation normal T

cell expressed and secreted

RgpA et RgpB : Arg-gingipaines A et B

SDS : Sodium Dodécyl Sulfate

SIDA : Syndrome d’immunodéficience

acquise

STAT1 : Signal Transducer and Activation of

Transcription 1

TIMP-I : Tissue Inhibitor of MMP

TLR : Toll Like Receptor

TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α

LISTE DES FIGURES

7

LISTE DES FIGURES Tableau 1 : les maladies gingivales. P 14

Figure 1. Prévalence des maladies parodontales en Europe selon la sévérité de la

maladie et la tranche d’âge. P 18

Figure 2. Indice Community Periodontal Index of Treatment Needs (CPITN) et utilisation.

P 17

Figure 3. Profil de la santé parodontale en Allemagne en 2005. P 19

Figure 4. Schéma de la cavité buccale. P 25

Figure 5. Coupe histologique d'une gencive vue en microscopie traditionnelle P 25

Figure 6. Coupe d'une gencive saine (porc) vue en microscopie électronique à

transmission. P 28

Figure 7. Modèle spatiotemporel de la colonisation de la surface de la dent ou de

l'épithélium gingival par les bactéries orales. P 31

Figure 8. Pourcentage des bactéries cultivables prédominantes dans des sulci gingivaux

de patients présentant des gencives saines, une gingivite modérée et dans des poches

parodontales (parodontite marginale avancée). P 31

Figure 9. Adhésion des Streptococci à l'hôte. P 33

Figure 10. Microscopie électronique à balayage de F. nucleatum et de P. gingivalis.P 39

Figure 11. Anatomie des différents stades pathologiques de la gencive. P 39

Figure 12. Différentes voies d'activation des MMPs. P 48

Figure 13. Schéma de la structure de MMP-2, MMP-9 et de MMP-8. P 48

Tableau 2. Exemples de substrats de MMP-8. P 48

Figure 14. Fonctions des différentes classes de PRRs. P 59

Figure 15. Schéma simplifié des voies de signalisation des TLRs et des ligands dérivant

des bactéries parodontales. P 60

Figure 16. Organisation génomique, "processing" et fonctions des différentes partie des

cathélicidines. P 64

Figure 17. Structure trimensionnelle des ß-défensines humaines. P 65

Figure 18. Localisation, organisation génomique et "processing" des a- et b- défensines.

P 65

Figure 19. Schéma des différentes voies de régulation d'hßD2 par les bactéries de la

microflore buccale et leurs PAMPs. P 67

Figure 20. Schéma de la régulation par les interleukines Th2 IL-4 et IL-13 de

l'expression d'hßD2 et d'hßD3 après stimulation par le TNFα et l'IFNγ. P 68

Figure 21. Mise en culture de kératinocytes gingivaux normaux. P 82

Figure 22. Étude de la modulation de l'expression génique d'hßD2 et d'hßD3 dans les

NGKs (2 donneurs) après 15h de traitement. P 82

LISTE DES FIGURES

8

Figure 23. Lignées KB et Ca9-22 : expression d'hßD2. P 82

Figure 24. Induction d'hßD3 au niveau peptidique par l'APG dans les modèles tissulaires

natifs et reconstruits. P 84

Figure 25. Régulation transcriptionnelle des ß-défensines par l'APG dans le modèle

reconstruit et dans les NGKs. P 84

Figure 26. Réponse inflammatoire et APG. P 85

Figure 27. MOI et survie cellulaire des Ca9-22. P 99

Figure 28. Microscopie confocale montrant l'adhésion de S. sanguinis et de F. nucleatum

aux Ca9-22 après 15 heures de contact. P 100

Figure 29. Modulation de l'expression génique d'hßD2 et d'hßD3 chez les Ca9-22 après

15 heures de contact avec les deux bactéries commensales S. sanguinis et F. nucleatum.

P 100

Figure 30. Modulation de l'expression génique d'IL-8 et de sa libération chez les Ca9-22

après 15 heures de contact avec les deux bactéries commensales S. sanguinis et F.

nucleatum. P 101

Figure 31. Modulation de l'expression de MMP9 et de MMP2 chez les Ca9-22 et les Ca9-

22 TLR2 après 15 heures de contact avec les deux bactéries commensales S. sanguinis

et F. nucleatum. P 101

Figure 32. Modulation de l'expression génique d'hßD2 et d'hßD3 chez les Ca9-22 et les

Ca9-22/TLR2 après 15 heures de contact avec les deux bactéries commensales S.

sanguinis et F. nucleatum. P 102

Figure 33. Modulation de l'expression de médiateurs de l'inflammation chez les Ca9-22

et les Ca9-22/TLR2 après 15 heures de contact. P 103

Figure 34. Modulation de l'expression génique d'hßD2 et d'hßD3 chez les Ca9-22 et les

Ca9-22/TLR2 après 15 heures de contact avec la bactérie commensale F. nucleatum.

P 103

Figure 35. Modulation de l'expression génique de médiateurs de l'inflammation chez les

Ca9-22 et les Ca9-22/TLR2 après 15 heures de contact avec F. nucleatum. P 105

INTRODUCTION

9

INTRODUCTION

L’épithélium gingival est en contact permanent avec le biofilm, il protège les tissus

sous-jacents des agressions extérieures physiques, chimiques ou microbiennes. Cet

épithélium, et le biofilm qu’il supporte, forment un écosystème dont l’équilibre est

maintenu grâce à la réponse de l’hôte et à la présence de bactéries commensales. La

rupture de cette homéostasie gingivale se traduit par le déclenchement de la maladie

parodontale. Celle-ci regroupe des maladies inflammatoires d’origine infectieuse

localisées au niveau du tissu de soutien de la dent, le parodonte. Les lésions qui en

résultent sont la mobilité de la dent et une alvéolyse irréversible pouvant aboutir à la

perte de la dent. Les effets de ces maladies et leur prévalence en font un problème de

santé publique.

L’homéostasie parodontale est maintenue grâce à l’état de veille instauré par l’hôte.

Pour cela, il fait intervenir divers acteurs parmi lesquels se trouvent les Pattern

Recognition Receptors (PRRs), les peptides antimicrobiens et les médiateurs de

l’inflammation. Les PRRs sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance, la

discrimination des microorganismes et dans une activation appropriée des cellules de

l’hôte. La réponse de l’hôte mise en place peut être caractérisée par la production de

peptides antimicrobiens comme les ß-défensines et de médiateurs de l’inflammation

comme l’interleukine 8 (IL-8) et les métalloprotéinases matricielles 2 et 9 (MMP-2 et

MMP-9, respectivement). Suite à la rupture de cet équilibre, un autre type de réponse

peut être déclenchée en plus de l’immunité innée, à savoir l’immunité adaptative, plus

tardive.

L’objectif de ce travail a été d’étudier l’immunité innée mise en place au niveau de

l’épithélium gingival pour maintenir cet état d’équilibre ou répondre à une colonisation

bactérienne. Plus précisément, le rôle d’un PRR, le Toll-like Receptor 2 (TLR2), dans la

reconnaissance et la discrimination de deux bactéries commensales, Streptococcus

sanguinis et Fusobacterium nucleatum, a été examiné. S. sanguinis est une bactérie

commensale « vraie » à Gram positif qui colonise précocement l’épithélium gingival et la

dent. F. nucleatum, elle, est une bactérie commensale « opportuniste » servant de lien

entre colonisateurs précoces et tardifs. La modulation de l’expression de peptides

antimicrobiens et de médiateurs de l’inflammation, ainsi que l’implication du TLR2 dans

cette modulation ont été étudiées. Les peptides antimicrobiens examinés sont les ß-

défensines humaines 2 et 3 (hßD2 et hßD3, respectivement) et parmi les médiateurs de

l’inflammation, nous avons choisi l’interleukine 8 (IL-8) et les MMP-2 et MMP-9.

Cette étude s’est déroulée en plusieurs étapes.

INTRODUCTION

10

Tout d’abord, pour pouvoir évaluer et analyser la réponse de l’hôte au niveau de

l’épithélium gingival, nous avons caractérisé et validé différents modèles d’étude

tissulaires et cellulaires. Ces modèles ont été sélectionnés afin de se rapprocher le plus

possible des conditions physiologiques gingivales, notamment en terme de différenciation

tissulaire, tout en maîtrisant les problèmes de variabilité biologique individuelle.

Une fois mis en place, ces modèles ont servi à l’évaluation de principes actifs, en

particulier, d’un actif de la famille des Alkyls Poly-Glucosides. L’évaluation de cet actif a

été réalisée en terme de capacité à moduler l’expression génique et protéique, des ß-

défensines d’une part, hßD2 et hßD3, et de l’IL-8 d’autre part.

Dans la deuxième partie de l’étude, nous avons choisi d’étudier l’implication du

récepteur TLR2 dans la reconnaissance et la discrimination d’extraits de paroi

membranaire de deux bactéries parodontales décrites comme commensales : S.

sanguinis, bactérie commensale vraie à Gram positif et F. nucleatum, bactérie

commensale opportuniste à Gram négatif. La première n’est retrouvée que sur des sites

parodontaux sains alors que la deuxième est présente sur ces sites mais également sur

des sites infectés lors de la pathologie parodontale.

Enfin dans la troisième partie de l’étude, pour nous rapprocher des conditions

physiologiques de l’interaction hôte/bactérie, en mettant en contact les kératinocytes

avec les bactéries vivantes S. sanguinis ou F. nucleatum. Le rôle du TLR2 dans la

reconnaissance et la discrimination de ces deux bactéries commensales vivantes et la

réponse cellulaire qui en découle ont été étudiés. Le but de cette étude a été de

compléter les résultats obtenus avec les extraits, c’est-à-dire d’étudier la réponse innée

cellulaire vis-à-vis des deux bactéries commensales. Ainsi nous avons examiné si,

comme avec les extraits, la cellule était capable de reconnaître et de discriminer une

bactérie commensale vraie d’une commensale opportuniste et nous nous sommes

proposés enfin d’évaluer le niveau d’implication du récepteur TLR2 dans cette

reconnaissance, cette discrimination et cette activation de la réponse immune innée

gingivale. Nous nous sommes posés la question de la « tolérance épithéliale» induite par

S. sanguinis en particulier, visant à prévenir la rupture de l’homéostasie gingivale.

DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES

11

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES : LES MALADIES PARODONTALES

12

LES MALADIES PARODONTALES


13

I) Définition et classification des maladies parodontales

A) Définition

Le terme de maladie parodontale regroupe les états inflammatoires d’origine

infectieuse, localisés au niveau des tissus de soutien de la dent, le parodonte. Les lésions

causées par ces états inflammatoires peuvent aboutir à la perte de la dent. La

composante inflammatoire résulte d’une agression microbienne modulée par la réponse

de l’hôte. La maladie parodontale regroupe donc différentes maladies. Pour définir ces

différentes maladies, des classifications ont vu le jour dès les années 1930 (la première

en 1928 par Gottlieb).

B) Classification

La classification des maladies parodontales a pour but de définir le niveau d’atteinte

parodontale et les formes cliniques qui s’y rattachent. Le diagnostic réalisé à partir des

éléments cliniques, radiographiques et biologiques d’une atteinte parodontale, sera basé

sur cette classification. De ce diagnostic découlera un plan de traitement et un pronostic

adapté à chaque patient. L’établissement du diagnostic est donc une étape très

importante dans la prise en charge de la maladie parodontale. Du point de vue de la

recherche scientifique, la classification est le seul moyen de réaliser des études

épidémiologiques ou cliniques et de rendre les résultats comparables entre eux (169).

Une nouvelle classification des maladies parodontales a été proposée en 1999 (Annals of

Periodontology, 1999) mais à l’heure actuelle la plus communément utilisée est celle du

World Workshop in Clinical Periodontics de 1989. Depuis 1982, quatre classifications ont

été réalisées (Page & Schroeder 1982, Académie américaine de parodontologie 1986,

Suzuki & Charon 1988, World workshop in clinical periodontics 1989). Toutes semblent

se recouper.

Ainsi, les maladies parodontales sont divisées en deux grands groupes. Le premier

groupe inclut les maladies limitées aux tissus parodontaux superficiels, c'est-à-dire, les

gingivites. Le deuxième groupe inclut les maladies touchant le parodonte profond qui

soutien la dent, c’est-à-dire les parodontites.

1) Les gingivites

Les gingivites provoquées par la plaque bactérienne représentent l’atteinte

gingivale la plus fréquente. Elle peut survenir à tout âge (enfants et adultes) avec une


14

prévalence pouvant atteindre 50 à 100% dans la population adulte (54, 169). En dehors

des périodes de grossesse, la femme est moins atteinte que l’homme et les lésions sont

moins importantes que celles observées chez l’homme (54). Le rôle étiologique de la

plaque bactérienne est reconnu puisque chez des patients présentant un parodonte sain,

l’arrêt du contrôle de plaque entraîne tout d’abord l’apparition d’une inflammation

discrète au niveau de la gencive marginale, puis de plus en plus marquée dans le temps.

Cette atteinte gingivale est réversible, le contrôle de la plaque permet un retour à la

normale. Elle n’atteint que le parodonte superficiel. La cause des gingivites peut être due

à des éléments autres que la plaque bactérienne comme des changements hormonaux et

la prise de médicaments (Tableau 1) (54). L’aggravation de la gingivite conduit à la

parodontite.

2) Les parodontites

Elles sont classées en quatre groupes. Il s’agit des :

- Parodontites de l’adulte

- Parodontites précoces

• Parodontite Pré pubertaire (enfants)

- généralisée

- localisée

• Parodontite juvénile

- généralisée

- localisée

• Parodontite à progression rapide

- Parodontites associées (maladies systémiques)

- Parodontites ulcéro-nécrotiques

- Parodontites réfractaires

a) La parodontite de l’adulte

C’est la forme la plus courante de ces maladies. Elle peut être la continuité des

lésions gingivales initiées pendant l’adolescence. Elle survient chez les patients de plus

de 35 ans et est caractérisée par des phases d’activité destructrice et des phases de

rémission et de réparation spontanée (54). La perte d’attache est très lente, de même

que la résorption osseuse qui sera considérée comme débutante, modérée ou sévère

selon le degré de perte d’attache (169).

b) La parodontite à début précoce


15

-Parodontite pré pubertaire

Elle touche les sujets très jeunes à la denture lactéale ou définitive. Son évolution

est très rapide. Elle peut être de forme généralisée, associée à une inflammation

gingivale importante et à une alvéolyse très rapide menant à la perte des dents. La

forme localisée est caractérisée par une inflammation beaucoup plus discrète et une

évolution plus lente (169). Ces parodontites sont caractérisées par des déficiences

d’adhésion des neutrophiles avec altérations des récepteurs membranaires. Des maladies

systémiques interviennent dans leur développement (syndrome de Papillon-Lefèvre, de

Chediak-Higashi, neutropénie, leucémie, diabète de type I, syndrome

d’immunodéficience acquise (SIDA)) (54).

-Parodontite juvénile

Elle touche des adolescents et de très jeunes adultes (de 12 à 25 ans). Elle est

également décrite sous la forme localisée ou généralisée (54, 112). La parodontite

juvénile localisée atteint les premières molaires et les incisives au niveau desquelles se

forment des poches profondes associées à une alvéolyse angulaire. On note l’absence de

relation entre la quantité de plaque et la sévérité de la maladie, une inflammation

discrète et un pourcentage élevé de Porphyromonas gingivalis d’Actinobacillus

actinomycetemcomitans (54, 170). La parodontite juvénile généralisée atteint des

individus plus âgés. Les sites touchés sont les mêmes que pour la précédente et on

retrouve des lésions sur d’autres dents. Le dépôt de plaque et l’inflammation sont

beaucoup plus marqués.

-parodontite à progression rapide

Elle affecte les sujets jeunes (20-35 ans), la plupart des dents sont touchées et les

signes cliniques comme l’inflammation et les dépôts de plaque sont faibles par rapport à

l’étendue des destructions parodontales et la vitesse d’évolution de la maladie. Cette

discordance entre l’importance des lésions et la faible quantité de plaque est

caractéristique (54). L’alvéolyse est importante (54, 169). La plupart des patients

présente une réponse ralentie des neutrophiles à l’activité chimiotactique (54).

c) Les parodontites associées (maladies

systémiques)

Il a été démontré que les parodontites pouvaient être une manifestation de

certaines maladies systémiques d’ordre hématologique (leucémies, neutropénies

acquises) ou génétique (syndrome de Down, neutropénies cycliques et familiales).

L’ostéoporose et les déficits hormonaux en œstrogènes pourraient s’ajouter à la liste de

ces maladies (48, 54).


16

d) La parodontite ulcéro-nécrotique

C’est une infection caractérisée par la nécrose des tissus gingivaux, du ligament

parodontal et de l’os alvéolaire. Elle est souvent associée à des maladies systémiques

comme le SIDA, une sévère malnutrition ou une immunodépression (169).

e) La parodontite réfractaire

Elle est caractérisée par l’absence de stabilisation de la maladie parodontale quels

que soient les traitements utilisés (chirurgicaux ou non). La perte d’attache est continue.

Cette classe de parodontite semble remise en question à cause du très grand nombre de

formes cliniques et l’absence de prévisibilité des sites répondant négativement au

traitement (169), elle pourrait être une parodontite mal soignée.

Si ces classifications ont permis de mieux définir les différents types d’atteinte

parodontale, elles ne peuvent pas répondre à un certain nombre de questions : quelle est

la prévalence de chacune de ces maladies et quels sont les facteurs contribuant à, ou

provoquant directement l’apparition des ces maladies ?

Les études épidémiologiques permettent de répondre à ces questions.

II) Epidémiologie

A) Définitions et outils

L’épidémiologie étudie la distribution et la dynamique des maladies dans une

collectivité, mais également les facteurs de risques et les déterminants qui jouent un rôle

dans le développement de la maladie (12).

La prévalence désigne le nombre d’individus présentant les symptômes d’une

maladie dans une population examinée à un moment donné. L’incidence indique le

nombre de lésions ou d’états nouveaux qui apparaissent dans une population examinée à

un moment donné. Elle permet de visualiser l’évolution de la maladie (12).

L’épidémiologie a besoin d’outils. Dans le domaine dentaire, la présence de plaque,

d’état inflammatoire, de saignement au sondage, la profondeur de poche ou le niveau

d’attache sont évalués et transformés en indices. Ces indices permettent d’exprimer

quantitativement la valeur d’un paramètre clinique (12, 48). L’indice Community

Periodontal Index of Treatment Needs (CPITN) décrit dans la Figure 2 est notamment

utilisé dans les enquêtes réalisées pour la communauté européenne.


17

B) La prévalence

La prévalence de la maladie parodontale dans la population est directement liée à

certains déterminants ou facteurs de risque qui augmentent la probabilité de contracter

la maladie. Le déterminant ne peut être modifié (age, sexe, ethnie, …) alors que le

facteur de risque peut l’être (tabac, hygiène, …) (12).

Comme il a été dit précédemment, les gingivites concernent 50 à 100% de la

population adulte, les femmes étant moins touchées que les hommes hors contexte

particulier lié à la progestérone (atteinte et gravité des lésions) (54).

Les études montrent que la prévalence et la sévérité de la parodontite augmentent

avec l’âge (Figure 1).

Des études ont montré que la prévalence des maladies parodontales au stade

précoce chez l’adolescent est généralement inférieure à 1% dans les pays industrialisés.

Cette prévalence peut être multipliée par 10 dans certains groupes ethniques (48). En ce

qui concerne les stades avancés de ces maladies, la majorité des études montrent une

prévalence de 10 à 15% allant jusqu’à 80% dans certaines régions (48).

Aux Etats Unis, la prévalence de la parodontite à un stade modéré (un ou plusieurs

sites ayant une perte d’attache ≥3 mm) est de 40% (de 16 à 80% de 16 à 64 ans). Pour

la forme avancée (un ou plusieurs sites ayant une perte d’attache ≥5 mm), la prévalence

est de 13% (variable selon l’âge du patient) (48).

Pour les parodontites pré pubertaires et juvéniles, les études montrent que le

facteur ethnique entre en jeu. Pour les premières, aux Etats Unis, la prévalence est

nettement inférieure à 1%, sauf dans la population hispanique du Texas où elle varie de

1 à 4 % (12). De même, pour les parodontites juvéniles, des études montrent une plus

forte prévalence chez les enfants d’origine africaine et d’origine asiatique, par rapport

aux enfants de type caucasien (2,9%, 0,8% et 0,09%, respectivement) (12). Pour ces

deux types de parodontites, le sexe ne semble pas influer sur la prévalence.

En Europe, les études recensées par l’OMS montrent une prévalence de la gingivite

de 80%. 10 à 69% de la population ont une poche ≥4 mm. 1,6% ont un CPITN de 4

(France)(48).

En France, une étude de 1997 portant sur 1000 personnes en Rhône-Alpes

utilisant l’indice CPITN a montré que 12% de la population était saine, 80,4% avait une

gingivite, 26,6% avait des poches de 4 à 5 mm et 1,6% des poches ≥6 mm (48).

La maladie parodontale chez l’adulte a une prévalence de 30 à 50% dans la plupart

des pays du monde (188). Les résultats de 80 études faites dans plus de 30 pays (base

de données de l’OMS) ayant pour dénominateur commun de mesure le CPITN, ont

montré que la prévalence de la parodontite sévère était inférieure ou égale à 10% avec


18

de fortes variations selon le pays étudié (de 0 à 40% pour l’Europe et de 0 à 75% pour

l’Afrique) (12). Un exemple est donné pour la France en Figure 2.

Trois études menées en Allemagne en 2005 sur les tranches d’âge 15 ans, 35-44

ans et 65-74 ans en utilisant le CPITN (Figure 3) ont montré que la prévalence des

poches ≥6 mm augmente avec l’âge (1, 21 et 40%, respectivement). La prévalence des

poches de 3 à 5 mm est d’environ 50% pour les tranches d’âge 35-44 ans et 65-74 ans

(52 et 48%, respectivement), elle est plus faible pour les adolescents (33%). Enfin, la

prévalence des scores faibles, c'est-à-dire « pas de maladie » (0) et « saignement au

sondage » (1) diminue avec l’âge (53, 13 et 5 %, respectivement).

Ces études montrent que la prévalence des maladies parodontales chez l’adulte est

forte. Ces pathologies représentent un enjeu de santé publique puisqu’en effet même en

Europe de l’Ouest, la prise en charge de ces maladies n’est pas toujours suffisante. Par

exemple en France, 40% de la population nécessite des soins, et seulement 20% des

patients pourront être pris en charge.

C) Facteurs étiologiques

Les maladies parodontales sont le résultat des interactions du biofilm avec

l'épithélium gingival, et de la réponse de l’hôte.

1) Le biofilm

Des centaines de bactéries différentes colonisent la gencive, le sulcus et les poches

parodontales. Parmi elles, on retrouve des bactéries bénéfiques pour l’hôte mais

également des bactéries pathogènes (116). Les bactéries du sillon dento-gingival et de la

poche parodontale ainsi que les substances qu’elles libèrent, constituent le facteur

étiologique primaire dans le développement de la maladie parodontale. De nombreuses

recherches ont montré que certains groupes de bactéries, présents au niveau des sites

sous gingivaux, sont associés à la maladie parodontale. Les bactéries sont regroupées en

complexe selon leur degré de pathogénicité et leur localisation lors de la santé

parodontale et de la maladie. Le complexe rouge est constitué par trois bactéries

pathogènes, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia et Treponema denticola. Le

complexe orange est composé entre autre des Fusobacterium nucleatum, de Prevotella

intermedia, … et le complexe jaune est constitué par des streptococci comme

Streptococcus sanguinis (164). Une variété de microorganismes peut contribuer

différemment à la genèse dans une population ou chez un individu de cette maladie. Il


19

est également clair que ce facteur « bactéries » n’est pas le seul impliqué dans ces

maladies, l’hôte et sa réponse le sont aussi (143).

2) L’hôte

En réponse au biofilm, pour faire face à d’éventuelles agressions, l’hôte oppose

toute une série de mécanismes de défense innée, non spécifiques. Le maintien de

l’homéostasie parodontale est tributaire de ces moyens de contrôle. De leur côté les

bactéries pathogènes, pour échapper à ce contrôle, ont élaboré divers moyens de

contournement, reposant sur des systèmes de défenses spécifiques à chaque espèce.

Lorsque l’hôte ne peut contenir une invasion bactérienne par une réponse immédiate, il

met en place d’autres mécanismes de défense (immunité acquise), augmente la réponse

inflammatoire et recrute des cellules de l’immunité innée et acquise sur les lieux de

l’infection (116).

Pour l’immunité innée, les cellules recrutées sont les polymorphonucléaires

neutrophiles (PMNs), les macrophages et les cellules dendritiques. Il a été montré que les

premiers synthétisaient et libéraient des substances comme des enzymes lysosomales

incluant des protéases impliquées dans la destruction des tissus parodontaux. Les

macrophages et les cellules dendritiques sont activés par les motifs bactériens comme les

lipopolysaccharides (LPS). Cette activation induit la libération de chimiokines et de

cytokines proinflammatoires, capables d’attirer localement d’autres cellules de

l’immunité. De plus, ils sécrètent des métalloprotéinases matricielles (MMP) détruisant

les composés de la matrice extracellulaire et ces cellules sont ainsi impliquées dans la

destruction tissulaire (156).

Dans les lésions précoces, on retrouve des cellules infiltrées comme les

macrophages et les lymphocytes T (LT) alors que dans les lésions plus avancées, sont

surtout retrouvés des lymphocytes B (LB) et des plasmocytes (177). Ces cellules libèrent

des médiateurs de l’inflammation et des espèces réactives de l’oxygène qui sont

également impliqués dans la destruction tissulaire (156).

Les cellules épithéliales ou kératinocytes participent également à la réponse de

l’hôte. Nous verrons plus loin qu’elles sont capables de reconnaître et de discriminer les

microorganismes.Elles sont également capables de sécréter des cytokines et des peptides

antimicrobiens.

Ces maladies inflammatoires d’origine infectieuse sont dues à la rupture de

l’homéostasie entre le biofilm et l’hôte. L’ensemble des moyens de défense de l’hôte

permet de maîtriser l’agressivité des microorganismes vis-à-vis du parodonte. Une

faiblesse transitoire ou permanente sera à l’origine de manifestations cliniques dont

l’importance sera fonction de la gravité du déséquilibre.

DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES : LA RELATION HÔTE/BACTÉRIES

20

LA RELATION HOTE/BACTERIES


21

La cavité buccale est un écosystème composé d’une part de bactéries constituant le

biofilm et d’autre part de la muqueuse buccale et de dents, de salive et de fluide gingival.

l’équilibre du système dépend de tous les acteurs impliqués, bactéries mais également

l’hôte. Il peut y avoir passage de l’homéostasie à un état pathogène (gingivite,

parodontite), dans ce cas la rupture de l’équilibre correspondra à une modification de la

composition du biofilm et de la réponse de l’hôte.

I) L’hôte ; généralités sur la cavité buccale

A) Caractéristiques d’une barrière épithéliale

Selon leur localisation, les épithéliums ont des fonctions différentes, mais ils ont un

rôle commun qui consiste en la protection des tissus sous-jacents des influences

environnementales comme des dommages physiques, les infections bactériennes, la

déshydratation ou le dessèchement. Ils sont impliqués dans le maintien de l’homéostasie

et sont nécessaires à la survie. Ces tissus sont donc classifiés selon leur morphologie et

leur niveau de différenciation. Il existe trois grandes catégories qui sont les épithéliums

squameux stratifiés kératinisés (épiderme, tissu gingival et palatin), les épithéliums

stratifiés non-kératinisés (muqueuse buccale et de l’œsophage) et enfin les épithéliums

simples (non-stratifiés) du rein et du poumon par exemple (147). Les premiers suivent

un programme de différenciation dont le terme est la formation de cellules mortes

remplies de kératines sans noyau ou avec un noyau en dégénérescence. Autour de ces

cellules, se trouve une couche cornée constituée de protéines et de lipides imbriqués. Elle

remplace la membrane plasmique et est fortement impliquée dans la barrière épithéliale.

Les épithéliums stratifiés non-kératinisés ne devant pas supporter les mêmes contraintes

physiques que les précédents n’ont pas de couche cornée. Enfin les épithéliums simples

ont plutôt des fonctions spécialisées d’absorption ou de sécrétions (148).

Le maintien de l’homéostasie est la conséquence d’une barrière fonctionnelle. Celle-

ci se met en place grâce à différents processus biologiques parmi lesquels on retrouve

l’état de différenciation, les interactions intercellulaires et l’immunité innée.

1) La différenciation

C’est le passage des cellules d’un stade « généraliste » à un stade hautement

spécialisé. Elle met en jeu différents acteurs protéiques, lipidiques et enzymatiques.


22

Parmi les acteurs protéiques, on retrouve les kératines, protéines de structure

prédominantes du cytosquelette. Présentes dans tous les épithéliums, elles forment les

filaments intermédiaires et sont impliquées dans le maintien de l’intégrité cellulaire. Pour

les épithéliums possédant une couche cornée, les protéines constituant l’enveloppe

cornée forment une structure résistante enrobant les kératinocytes. Parmi ces acteurs

protéiques, on retrouve également la filaggrine et l’involucrine (148). Cette couche

kératinisée est constituée d’un entrelacement de protéines et de lipides assemblés lors

de l’étape terminale de la différenciation. La toute dernière étape mène à la

desquamation, donc au détachement des cornéocytes (159).

Dans cette trame, le processus de différenciation met donc en place une

réorganisation des lipides qui mène à l’accumulation de sphingolipides, d’acides gras et

de cholestérol. Ce réarrangement met en jeu des transporteurs lipidiques et des enzymes

de maturation (90).

Tous ces constituants sont souvent sous forme inactive dans les couches inférieures

de l’épithélium. Des enzymes provoquent leur maturation et contribuent à la formation

de cette couche cornée. Pour les acteurs protéiques, les transglutaminases constituent

une de ces familles enzymatiques. D’autres enzymes interviennent notamment des

enzymes de maturation des lipides.

2) Les jonctions intercellulaires

Les jonctions intercellulaires spécialisées participent aussi au maintien de l’intégrité

de la barrière épithéliale. Ces jonctions sont de trois types : les jonctions serrées

étanches, les jonctions adhérentes, les jonctions communicantes (34, 105, 145).

Les zonula occludens s'établissent entre les cellules épithéliales où elles

déterminent une barrière physiologique entre les compartiments extérieur et intérieur de

l'organisme.

Les zonula adhaerens sont des jonctions d'ancrage qui constituent des ceintures

d'adhérence. Elles réunissent entre elles des cellules épithéliales adjacentes dont elles

font tout le tour. Les desmosomes (macula adhaerens) sont également des jonctions

d'ancrage. Ils sont reliés aux filaments intermédiaires du cytosquelette intra-

cytoplasmique.

Les jonctions communicantes existent dans la plupart des tissus de l'organisme.

Elles permettent une communication directe entre les cytoplasmes des cellules

adjacentes.


23

3) La barrière immunitaire

Les tissus épithéliaux sont constamment exposés à une multitude de

microorganismes. Pour maintenir un état d’équilibre face à ces agressions, un autre type

de barrière est mis en place : c’est l’immunité. Elle peut être innée ou adaptative.

L’immunité innée est immédiate. Elle est mise en place par les cellules présentes

dans l’épithélium gingival comme les kératinocytes, les cellules dendritiques, et les

polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs). Pour établir la santé parodontale, des

molécules et des récepteurs de la réponse innée sont exprimés de manière constitutive

ou inductible par ces différents types cellulaires (41). Les kératinocytes sont majoritaires,

les cellules de Langerhans qui font partie des cellules dendritiques sont parsemées dans

les couches suprabasales de l’épithélium (9) et les PMNs sont très parsemés et présents

uniquement dans l’épithélium jonctionnel. En migrant vers la surface de l’épithélium, ils

peuvent former un mur le protégeant des bactéries (41).

Les kératinocytes constituent une barrière physique mais ils sont également

capables de synthétiser et de libérer des cytokines (TNFα, IL-1ß par exemple) et des

chimiokines (Interleukine 8 (IL-8)) (116).

Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes, elles activent

les lymphocytes T (LT) (154), elles font donc le lien entre l’immunité innée et l’immunité

adaptative. Ces cellules sont capables de synthétiser des cytokines et des chimiokines

attirant ainsi les cellules de l’immunité à proximité des microorganismes (88).

Les PMNs sont impliqués dans la phagocytose et peuvent activer les cellules

dendritiques immatures (154). Ils sont attirés vers le sulcus gingival suivant un gradient

de produits issus des bactéries (lipopolysaccharide (LPS) par exemple) mais également

de l’hôte (IL-8). Ces cellules sont également capables de libérer des cytokines comme le

TNFα et l’IL1 et des chimiokines comme l’IL-8 (156).

Toutes ces cellules sont capables d’exprimer les Pattern-Recognition Receptors

(PRRs), spécialisés dans la reconnaissance, la discrimination des microorganismes et

l’activation des cellules (41). Il existe des PRRs de signalisation qui peuvent être

membranaires ou solubles, des PRRs d’endocytose membranaires et des PRRs solubles

d’opsonification (40).

L’activation des cellules conduit à la libération de cytokines et de chimiokines

comme il a été dit précédemment mais également de peptides antimicrobiens. Les

peptides en plus d’être antimicrobiens sont également impliqués dans le recrutement de

cellules de l’immunité innée et adaptative (43, 122, 194).

L’immunité adaptative est le fruit uniquement de cellules spécialisées comme les

lymphocytes B (LB), les LT. Elle est mise en place quelques jours après le contact avec la


24

substance étrangère. Elle dépend de la reconnaissance spécifique de cette substance

étrangère. L’organisme gardera le souvenir de la rencontre.

B) Spécificité de la barrière épithéliale dans la cavité

buccale

1) Structure générale

La bouche est la cavité de la face, située en dessous des fosses nasales et

constituant la partie initiale du tube digestif. Elle est composée de deux zones distinctes

séparées par les arcades dentaires supérieure et inférieure (Figure 4) :

-le vestibule, en avant, limité sur les côtés par les joues et devant par les lèvres,

-la cavité buccale, plus en arrière, entre les dents, en avant, et les piliers du voile

du palais, en arrière.

La muqueuse qui tapisse cette cavité buccale est composée d’une couche externe

correspondant à un épithélium de revêtement et d’une couche interne correspondant à

un tissu conjonctif dense, la lamina propria ou chorion.

L’épithélium et le tissu conjonctif sont différents selon la région et les fonctions du

tissu dans la cavité orale.

Trois structures sont ainsi histologiquement reconnaissables :

-les muqueuses gingivales et palatines ont des fonctions masticatoires,

-les lèvres, la joue, le vestibule, la muqueuse alvéolaire, le voile du palais, le

plancher de la bouche et la face interne de la langue ont des fonctions de revêtement,

-la muqueuse de la face dorsale de la langue a des fonctions spécialisées

mélangeant les types de structures masticatoires et de revêtement (191).

L’épithélium de surface de la muqueuse orale est stratifié et squameux et il peut

être kératinisé (masticatoire) ou non (revêtement). Cet épithélium fournit une protection

contre les dommages physiques, chimiques et microbiens.

2) Parodonte et épithélium

Le parodonte regroupe les tissus de soutien de la dent, il est constitué de quatre

tissus qui sont le cément, le desmodonte, l’os parodontal et alvéolaire, et la gencive

(Figure 5).

Cette gencive a un rôle de maintien de la dent et un rôle protecteur. Elle peut être

libre, attachée ou inter-dentaire (159) et est constituée de différents épithéliums (17) :

-l’épithélium gingival oral ou buccal,

-l’épithélium sulculaire,


25

-l’épithélium jonctionnel et d’un tissu conjonctif qui sous-tend l’épithélium.

a) Épithélium oral gingival

Il s’étend de l’épithélium alvéolaire à l’épithélium sulculaire (Figure 5A). Il a une

épaisseur de 0,5 à 0,6 mm (158). Il est stratifié squameux kératinisé. Le tissu conjonctif

forme de longues et fines papilles qui s’imbriquent jusqu’au tiers supérieur de

l’épithélium (Figure 5B). Cet épithélium est formé de cinq couches, le stratum basale, le

stratum suprabasale, le stratum spinosum, le stratum granulosum et le stratum corneum

(54, 112, 191).

Les cellules des couches basales sont de forme ronde ou ovale et sont les plus

petites. Elles sont constituées de cellules germinales à grand potentiel prolifératif et de

cellules d’amplification qui ont un potentiel de divisions restreint avant d’entrer dans la

différenciation (54). On retrouve de nombreux ribosomes et polyribosomes distribués

dans tout le cytoplasme. Elles synthétisent les composants de la membrane basale sur

laquelle elles s’ancrent grâce à de nombreux hémidesmosomes (54). Ces cellules

produisent plus particulièrement les cytokératines 5, 6 et 14 (182). On retrouve

également le marqueur de prolifération Ki67 exprimé dans quelques cellules seulement

(141).

La couche suprabasale est formée de 4 à 8 couches cellulaires exprimant les

cytokératines K1/K10. A la surface des cellules, l’épicanne, un protéoglycanne

intercellulaire est retrouvé. Les cellules en position distale de la couche supra-basale sont

en contact avec les larges cellules de la couche épineuse inférieure (54).

Dans la couche épineuse, le noyau des cellules est allongé, leur volume augmente

et elles prennent des formes polyédriques. Ces kératinocytes forment entre eux un

réseau tridimensionnel de desmosomes (54). Les cellules en position plus superficielle

deviennent plates, mais elles ont les mêmes caractéristiques que les cellules des couches

inférieures (organelles para-nucléaires…) (104). Elles sont parallèles à la surface de

l’épithélium. Ces cellules expriment les cytokératines 1 et 10, 6 et 16 (63) et également

la cytokératine 13 mais sous forme d’îlots (111) et l’involucrine (54). Dans la partie

supérieure de cette couche, apparaissent des granules recouvrant les membranes

cellulaires appelés « membrane-coating granules » ou corps d’Odland ou kératinosomes

(54, 104, 191). Ils sont impliqués dans la synthèse de lipides et la sécrétion de

céramides dans les espaces intercellulaires des couches granulaires et de la strate cornée

(54). Ces granules seraient dus à des phénomènes de pinocytose ou de pinocytose

inverse.

La couche granuleuse est appelée ainsi à cause de la présence de grains de

kératohyaline, de filaggrine (163, 191). Elle est constituée de cellules aplaties dont le


26

noyau réduit. Le nombre de granules augmente, ce qui contribue à la formation d’une

barrière imperméable dans les couches supérieures de cette granuleuse. À la transition

entre la couche granuleuse et la couche kératinisée, les granules déjà présents dans les

couches supérieures de l’épineuse, fusionnent avec les membranes cellulaires et

déversent leur contenu dans les espaces interstitiels.

Les cellules de la couche kératinisée ont une fine membrane plasmique, peu de

desmosomes et pas d’organites. Enfin les cellules à la surface de cette strate se

détachent. Si ces cellules perdent leur noyau, l’épithélium est dit ortho-kératinisé, si les

noyaux sont présents mais sous forme pycnotique, altérée, l’épithélium est dit para-

kératinisé. La deuxième forme de kératinisation est courante dans l’épithélium gingival

(158, 191).

Les kératinocytes de cet épithélium produisent également un certain nombre de

molécules impliquées dans l’adhésion cellules-cellules comme l’acide hyaluronique,

cellules-matrice comme les intégrines (191). Ils sécrètent des collagénases (150), des

cytokines (Tumor Necrosis Factorα (TNFα), Interleukine-1α (IL-1α), IL-1ß) et des

chimiokines comme l’IL-8. L’épithélium gingival oral exprime et libère des peptides

antimicrobiens comme les ß-défensines. La ß-défensine 2 humaine (hßD2) est exprimée

dans cet épithélium a un niveau basal (34).

Des cellules de Langerhans, des cellules sensorielles de Merkel, des mélanocytes

s’intercalent entre les cellules (54).

b) Épithélium sulculaire

Il se trouve au niveau du sillon gingival, entre l’épithélium gingival oral et

l’épithélium de jonction. (Figure 5). C’est un épithélium de revêtement non-kératinisé

mais kératinisable. Cette absence de kératinisation serait due à l’absence de contrainte

mécanique comme le brossage. Sa position face interne de la gencive libre le rend

difficilement accessible.Cet épithélium exprime les cytokératines 4, 5, 13, 14, 16 et 19

(147).

Les kératinocytes de cet épithélium sécrètent de nombreuses cytokines (178)

c) Épithélium jonctionnel

Il s’étend de l’épithélium sulculaire (gencive marginale libre) à la jonction amelo-

cémentaire correspondant à la jonction entre la gencive et la dent (Figure 5). Il forme un

collet périphérique autour de la région cervicale de la dent. Cette position le rend difficile

à observer. Au niveau de la zone inter-proximale, les épithéliums jonctionnels de deux

dents voisines fusionnent pour former l’épithélium de revêtement de la papille inter-

dentaire (17).


27

Son épaisseur de 2 à 3 couches cellulaires au niveau de la jonction amelo-

cémentaire, augmente progressivement et peut atteindre 15 à 30 couches au niveau de

l’épithélium sulculaire (158) (Figure 6). C’est un épithélium stratifié squameux non-

kératinisé et non kératinisable qui est constitué de deux couches, la couche basale ou

stratum basale et d’une couche suprabasale ou stratum suprabasale. Les cellules du

stratum basale et les cellules des deux premières couches du stratum suprabasale sont

cuboïdes, légèrement fusiformes. Les cellules sont plates et parallèles à la surface de la

dent. Les cellules les plus en profondeur directement attachées à la dent forment et

maintiennent la lamina basale interne qui recouvre la dent. Les constituants matriciels de

la lame basale sont les collagènes IV et VII, la laminine, l’héparane sulfate, la

fibronectine et le perlecanne (17).

Les cellules de cet épithélium contiennent beaucoup de lysosomes dont les enzymes

sont impliquées dans la destruction des microorganismes. Elles expriment les

cytokératines 5, 8, 13, 14, 16, 18 et 19 et occasionnellement les 8, 16 et 18 (17, 147).

En ce qui concerne les jonctions entre les cellules, il y a peu de desmosomes et

occasionnellement, on retrouve des jonctions occludens. Les espaces intercellulaires sont

plus larges que dans l’épithélium gingival oral ou sulculaire ce qui signifie que cet

épithélium est plus perméable (158). Cette largeur est due à la faible densité en

jonctions intercellulaires. Ces larges espaces permettent le passage de fluides et la

migration de cellules de l’immunité pour pouvoir ainsi lutter contre la pression

microbienne (17). Dans la région centrale et à proximité de la dent, ces larges espaces

interstitiels accueillent des granulocytes neutrophiles qui traversent l’épithélium mais

également des macrophages et des lymphocytes infiltrés (159). Les lymphocytes et les

macrophages se trouvent à proximité dans la couche basale. Des cellules dendritiques

sont également présentes.

L’épithélium jonctionnel a un rôle de régénération et de protection, l’attachement

des cellules à la dent est dynamique puisqu’il y a un rapide « turn-over » cellulaire (54).

Une autre preuve de ce renouvellement cellulaire rapide est la réparation complète du

tissu en moins de 5 jours après destruction partielle (158). L’exfoliation rapide des

cellules est due au faible nombre de desmosomes et de jonctions occludens (159).

Les kératinocytes de cet épithélium produisent un certain nombre de molécules

impliquées dans l’adhésion cellules-cellules, cellules-matrice comme les intégrines, les

cadhérines. Ils sécrètent également des molécules impliquées dans l’inflammation et le

chimiotactisme (Inter-cellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), IL-8, IL-1, TNFα), des

facteurs de croissance (Epidermal Growth Factor (EGF), EGF Receptor (EGFR)), des

protéases (métalloprotéinases matricielles (MMP)), mais également des peptides

antimicrobiens comme la cathélicidine LL-37. Ces peptides sont également sécrétés par


28

les polymorphonucléaires neutrophiles (PMN) présents dans cet épithélium. On note

également la présence d’α-défensines sécrétées par les PMNs (17).

Face à l’hôte et ses barrières épithéliales, se trouvent les bactéries commensales et

pathogènes constituant le biofilm.

II) Le biofilm

A) Définition

C’est une communauté microbienne très organisée associée à une surface. On

estime que 95% des bactéries existant dans la nature vivent en biofilm. Cette vie en

communauté présente certains avantages comme une augmentation de la diversité

métabolique, une protection accrue vis-à-vis de l’hôte, des conditions écologiques et des

antimicrobiens, et une augmentation du pouvoir pathogénique notamment par transfert

de gènes. La capacité à s’attacher à une surface et à être retenu par celle-ci est une

stratégie de survie fondamentale développée par la plupart des microorganismes (121).

La plaque dentaire est le biofilm de la cavité buccale.

B) Formation

La plaque dentaire se forme par adhérence des microorganismes sur les surfaces

naturelles ou artificielles de la bouche, là où des protéines salivaires ont été adsorbées.

Quand elles se trouvent à l'état colloïdal, ces protéines métastables précipitent lentement

mais spontanément dans la salive. Ce phénomène dépend du pH : plus celui-ci est neutre

ou alcalin, plus la précipitation est lente; plus le pH est acide, plus elle est rapide.

L'adsorption des protéines salivaires aux surfaces de la cavité buccale est donc favorisée

par l'acidité du pH. Des polysaccharides d'origine bactérienne pourraient également

faciliter la production de plaque (107).

La formation de cette plaque dentaire peut être décomposée en quatre étapes :

-l’adhésion de bactéries planctoniques. Le contact, peut se produire par le jeu des

mouvements browniens, la sédimentation des bactéries, le flux des liquides ou le

transport passif par les cellules desquamées.

-L’adsorption initiale, réversible, correspondant à la mise en jeu des forces

attractives de Van der Waals et de répulsion électrostatique. Le pH et la force ionique du

milieu de suspension influent sur ces forces, qui sont déterminées par les caractères

macroscopiques et physico-chimiques des interfaces (charge de surface, énergie de


29

surface ou hydrophobie de la surface couverte de pellicule acquise ou des bactéries

adhérentes) (71).

-L’attachement devient stable grâce à des récepteurs et des interactions

intercellulaires (un ligand répondant à une adhésine) (71).

-La colonisation et la formation du biofilm se fait donc grâce à ces bactéries

pionnières. Elles créent une nouvelle surface plus propice à l’attachement d’autres

bactéries. Il y a ensuite formation de microcolonies dans une structure tridimensionnelle.

La production d’exopolymères permet de stabiliser cette architecture. Une cohésion des

microcolonies se crée (86, 99, 121). La "communauté" bactérienne, le maintien de la

diversité bactérienne se fait grâce au développement d'une chaîne alimentaire entre

espèces et d'une mise en commun des moyens d'inhiber les défenses de l'hôte. La

symbiose des différentes espèces favorise la nutrition des différentes souches présentes

(164).

La formation de la plaque dentaire suit donc un schéma précis, chaque bactérie

a une place spécifique. Ceci montre que ce biofilm est bien structuré.

C) Structure

Ce biofilm est constitué de bactéries et de matrice interbactérienne (112). La

composition et la structure de cette dernière déterminent la faculté d’adhésion du biofilm

en modifiant la nature de la surface colonisée. Elle permet de préserver les

microorganismes, du dessèchement et des agents agressifs. Cette matrice sert de

tampon, elle retient les enzymes extracellulaires et les rend plus disponibles aux

bactéries présentes. Elle permet également de capter des éléments nutritionnels. En

résumé, cette matrice crée un environnement favorable pour l’installation de bactéries

spécifiques (121).

La microscopie confocale a permis de montrer que le biofilm de la plaque supra-

gingivale avait une architecture structurée contrairement à ce que pouvait suggérer la

microscopie électronique. Ainsi, l’utilisation de marqueurs vitaux a montré que la viabilité

des bactéries variait dans l’espace (milieu de la plaque, proximité de canaux…) (121).

La structure de la plaque sous-gingivale n’a pu être observée en microscopie

confocale. La microscopie classique suggère une grande complexité structurale avec un

biofilm qui varie selon qu’il est en contact direct avec la dent ou bien avec la gencive. De

plus, la population bactérienne comprise entre les deux éléments serait moins dense

(121).


30

À l’intérieur de la plaque, il a été montré que le pH pouvait varier considérablement

sur de très courtes distances. Ceci permettrait à des bactéries très fragiles de survivre

dans la plaque et à des microorganismes de coexister alors qu’ils ne le pourraient pas

dans d’autres conditions. Ceci explique pourquoi des bactéries ayant des métabolismes et

des conditions de croissance opposés peuvent coexister dans un même site de la plaque

(121).

La composition bactérienne varie donc à l’intérieur de la plaque dentaire et selon la

nature de la plaque (supra ou sous gingivale).

D) Composition bactérienne de la plaque dentaire

De nouvelles techniques comme l’analyse de la séquence nucléotidique du gène de

la sous-unité 16S des ARN ribosomaux ont permis d’identifier de nouvelles bactéries

incapables de survivre avec les moyens de culture actuels. Ces bactéries

représenteraient environ 50% de la totalité de la population bactérienne (86). Ces

techniques ont permis de montrer que la flore sous-gingivale était très diversifiée, que la

composition des plaques supra-gingivale et sous-gingivale était différente (121). De

même, la composition de la plaque dentaire varie en fonction la pathologie (164).

Kolenbrander et ses collaborateurs ont schématisé l’agencement spatiotemporel du

biofilm (Figure 7) (99). La plaque dentaire est constituée de colonisateurs précoces

représentés à 60% par des Streptococci. Le reste est constitué par des Actinomyces, des

Veillonella et des Neisseria (86). Cette première adhésion implique la liaison entre des

composants de la salive adsorbés à la surface de la cavité buccale et les bactéries. Ces

composants qui varient selon la composition de la surface (dent ou gencive) déterminent

la composition du biofilm. La bactérie pionnière dépend donc de la nature des

composants qui sont adsorbés à la surface de la muqueuse ou de la dent (164). Or, la

structure de la plaque est elle-même dépendante de la bactérie pionnière car les

associations entre les premières colonisatrices et les autres sont spécifiques. Ainsi, les

bactéries du « complexe rouge » comme Porphyromonas gingivalis ou T. denticola,

indicateurs cliniques des maladies parodontales sont rarement détectées en absence de

bactéries d’autres complexes comme le complexe orange (Fusobacterium, Prevotella)

(121).

La composition de la plaque dentaire évolue avec l’état pathologique de la gencive

(164). La figure 8 montre qu’avec la progression de la maladie, on observe une

diminution du pourcentage des bactéries à Gram positif tels Streptococci et

Actinomycètes au profit de bactéries à Gram négatif et plus particulièrement de

bâtonnets à Gram négatif (112).


31

E) Interactions

La plaque dentaire n’est pas un ensemble figé. Environ 750 espèces bactériennes la

constituent. La distribution des espèces n’est pas un hasard. Elle est représentative des

besoins de chaque espèce. La cohabitation d’espèces différentes est possible (86, 98).

Les bactéries de la plaque dentaire sont capables de communiquer entre elles grâce

à des molécules sécrétées diffusibles. Celles-ci régulent plusieurs propriétés

physiologiques et de virulence importantes du biofilm.

Cette communication peut être synergique ou antagoniste (99). En ce qui concerne

la synergie, l’interaction peut être métabolique, elle prendra la forme d’une coopération

nutritionnelle ou/et d’une modification environnementale (détoxification de l’oxygène

pour des anaérobies strictes). Le « Quorum sensing » est une autre forme de

communication qui se fait par l’intermédiaire de petites molécules. C’est une

communication intercellulaire qui contrôle l’expression génique des bactéries en réponse

à la densité bactérienne. Ce système permet la coordination de la formation du biofilm et

l’activation de facteurs de virulence (172). Les bactéries à Gram négatif utilisent des

molécules homosérine lactone, celles à Gram positif, des peptides sécrétés comme le

Competent Stimulating Peptide (CSP) (121). Il existe une molécule commune aux deux

types bactériens, il s’agit de l’AutoInducer 2 (AI2) (99). Il peut y avoir des interactions

antagonistes. Certaines bactéries sont capables de sécréter des bactériocines qui sont

des peptides antimicrobiens générés par des bactéries contre d’autres bactéries qui y

sont sensibles (32). Des bactéries peuvent entrer en concurrence vis-à-vis des besoins

nutritionnels, d’autres génèrent du peroxyde d’hydrogène ou de l’acide lactique (180).

Certaines bactéries sont donc en concurrence. Par exemple, Streptococcus cristatus

inhibe la synthèse des ARNm de FimA codant pour une adhésine de P. gingivalis (86). Un

autre exemple est celui de S. sanguinis et de A. actinomycetemcomitans. La première,

colonisatrice précoce, gêne le développement de la deuxième, le moyen utilisé restant

encore à déterminer (180). Ces observations montrent que ce n’est pas l’adhésion elle-

même qui détermine la manière de se développer mais plutôt le contact inter-bactéries.

Différents types d’interactions peuvent exister entre les bactéries commensales et

pathogènes. Une bactérie potentiellement pathogène peut être exclue d’une communauté

si les récepteurs d’adhésion de cette dernière et les bactéries collaboratrices (coopération

métabolique) sont absents de l’environnement. Si dans le cas contraire, la bactérie

pathogène peut adhérer et s’appuyer sur des bactéries collaboratrices, alors l’infection ou

la co-infection de l’hôte sera possible.

Il a été démontré en introduisant des souches de P. gingivalis dans la bouche de

volontaires, qu’elles se fixaient préférentiellement au niveau de la plaque riche en


32

Streptococci. De même, P. gingivalis, Tannerella forsythia et Treponema denticola

capables de co-adhésion, ont tendance à se regrouper et à s’associer in vivo formant

ainsi le « complexe rouge ». il faut noter que la bactérie seule est moins virulente qu’une

association de bactéries (86).

Il faut donc retenir que le biofilm est un écosystème dont l’environnement

détermine la population bactérienne mais également le comportement de cette

population. Cet environnement est variable au sein d’un même biofilm et les bactéries

sont capables de le modifier. La plaque dentaire n’est pas un ensemble figé. Le

comportement des bactéries change quand elles passent de la forme libre planctonique à

celle de membre d’un biofilm. En s’organisant ainsi, elles se protègent, s’entraident,

échangent des informations.

F) Trois exemples de bactéries parodontales

-Streptococcus sanguinis

S. sanguinis anciennement S. sanguis est un coccus commensal « vrai » à Gram

positif. C’est un colonisateur précoce de la cavité orale (192). Sa présence est bénéfique

pour la santé parodontale mais cette bactérie peut cependant être impliquée dans les

endocardites, les pneumopathies ou les septicémies maladies fréquemment causées par

l’entrée de bactéries orales dans le système sanguin (109, 192, 193).

Cette bactérie adhère à des molécules comme les IgA et les α-amylases salivaires.

Elle adhère à des tissus comme les dents et les cellules épithéliales grâce à des

adhésines (71). La colonisation du parodonte et de la dent par cette bactérie change la

nature de la surface permettant ainsi l’adhésion d’autres bactéries (Figure 9).

Elle entre également en compétition avec des bactéries carieuses comme S. mutans

en produisant du peroxyde d’hydrogène (22, 100) ou avec des parodontopathogènes

comme A. actinomycetemcomitans (180).

S. sanguinis possède des facteurs de virulence parmi lesquels, les adhésines, les

lipoprotéines, les protéines ancrées à la paroi et les fibrilles (192).

L’implication de cette bactérie dans l’établissement de la réponse immune innée au

niveau buccal n’a pas été étudiée.

-Fusobacterium nucleatum

C’est un bacille fusiforme anaérobie à Gram négatif (Figure 10A). Cette espèce est

hétérogène puisqu’elle comporte quatre sous-espèces qui sont nucleatum, polymorphum,

fusiforme et vincentii. Cette bactérie est retrouvée au niveau des tissus oraux sains ou

pathologiques. Elle est également retrouvée lors d’infection dans d’autres parties du


33

corps (15). Elle est en fait considérée comme une bactérie commensale « opportuniste ».

Cette bactérie joue un rôle majeur dans l’établissement du biofilm puisqu’elle sert de lien

entre les colonisateurs précoces commensaux comme S. sanguinis et les colonisateurs

tardifs pathogènes comme P. gingivalis ou A. actinomycetemcomitans (99, 152).

F. nucleatum est considérée comme une bactérie commensale car elle est présente

dans les tissus sains. Elle est impliquée dans la stimulation dans la réponse basale de

l’hôte. En effet cette bactérie induit des acteurs de l’immunité innée comme l’interleukine

8 (IL-8) via NF-κB, p38 Mitogen Activated Protein (MAP) Kinase et Mitogen-

activated/Extracellular signal regulated kinase, MAP kinase kinase (MEK) MAP Kinase,

comme le TNFα et également les peptides antimicrobiens ß-défensine humaine (hßD)2

via les voies des MAP Kinases p38 et c-Jun NH2 terminal Kinase (JNK) et NF-κB et hßD3

(77, 93, 102, 189).

F. nucleatum est également une bactérie opportuniste, elle est présente dans le

sulcus gingival lors de la gingivite et de la parodontite (164). Cette bactérie peut adhérer

aux kératinocytes et les envahir en utilisant son hémagglutinine, son LPS (15), des

interactions lectin-like (67). Elle profite également de la présence de neuraminidases et

de protéases de l’hôte (hygiène mauvaise) ayant la capacité de découvrir des sites

d’adhésion cachés, les « cryptitopes » (62). L’adhésion et l’invasion de la bactérie

nécessite par ailleurs l’intervention de l’hôte. F. nucleatum utilise en effet l’actine, les

microtubules (67) et également des enzymes comme la MMP-9 de l’hôte pour augmenter

ce pouvoir invasif. En se liant à la pro-MMP-9, elle l’active et acquiert son activité

enzymatique ce qui lui permet de dégrader des composants de la matrice extracellulaire

mais également d’activer le précurseur de l’IL-1ß, cette cytokine jouant un rôle central

dans l’inflammation (60). Cette bactérie ne possède pas uniquement le LPS comme

facteur de virulence. La porine composant de la membrane externe (176), les ions

butyrate, propionate et ammonium font partie de ces facteurs. La bactérie interfère avec

le processus de cicatrisation par l’intermédiaire des trois ions en bloquant la prolifération

des fibroblastes gingivaux. Elle est également impliquée dans la survie de cellules

infectées grâce à l’induction chez l’hôte de régulateurs de la survie cellulaire comme la

caséine kinase 2 (185). F. nucleatum induit la collagénase 3 retrouvée en grande

quantité lors de la maladie parodontale. En plus de son activité collagénase, cette MMP

induit la migration cellulaire par l’intermédiaire du clivage de la laminine 5 et de sa

conversion en une forme favorisant cette migration (185).

Cette bactérie est sensible aux ß-défensines 2 et 3 (87, 138).

Porphyromonas gingivalis


34

C’est un bacille anaérobie strict à Gram négatif, agent étiologique majeur du

développement et de la progression de la parodontite et plus précisément de la forme

chronique (Figure 10B) (4). La couleur des colonies est noire.

P. gingivalis produit un grand nombre de facteurs de virulence participant à

l’adhésion, la colonisation, la perturbation de la réponse de l’hôte et à la destruction

tissulaire (37, 50, 76).

L’adhésion de P. gingivalis à l’épithélium gingival et la sévérité de l’inflammation

sont étroitement corrélées. Elle est rendue possible grâce à différents facteurs qui sont

les fimbriae (66, 110), les gingipaines (27) et leur domaine adhésine/hémagglutimines,

et le LPS (4).

Les fimbriae sont des composés filamenteux disposés tout autour de la

bactérie. Ils peuvent être courts ou longs et ces deux types sont impliqués dans

l’adhésion par l’intermédiaire des intégrines (4, 110).

Les gingipaines participent également à l’adhésion : soit elles se lient à

un récepteur connu, soit leur activité protéinase dégage des « cryptitopes ». Elles

utilisent leur domaine hémagglutimine/adhésine (4, 27).

Après l’adhésion, P. gingivalis peut être internalisé dans la cellule (11, 75) lui

permettant d’échapper aux défenses mises en place par l’hôte. Une fois à l’intérieur de la

cellule, P. gingivalis sécrète de nouvelles variétés de protéines détoxifiant les espèces

réactives à l’oxygène émises par l’hôte (74). Cette bactérie peut également remanier le

cytosquelette de la cellule infectée (4 , 140). P. gingivalis contourne également les

défenses de l’hôte en inhibant l’expression d’IL-8 évitant ainsi la migration des

monocytes/macrophages vers le lieu de l’infection (37, 76).

P. gingivalis est impliqué dans la dégradation des protéines de l’hôte. Quand il est

internalisé, il peut libérer des vésicules ayant des propriétés protéolytiques (75). Il induit

de fortes réponses inflammatoires (4) et déclenche la sécrétion et l’activation des MMPs

comme MMP-2, MMP-9 ou MMP-8 fortement impliquées dans la maladie parodontale (5,

165). Il dégrade également des inhibiteurs de ces protéinases comme l’α2-

macroglobuline, l’α1-antitrypsine, l’antichémotrypsine et TIMP-I (Tissue Inhibitor of MMP)

provoquant une augmentation de l’activité de ces MMPs (5).

L’immunité innée mise en place par l’hôte inclut la production de peptides

antimicrobiens comme les ß-défensines par les cellules épithéliales. P. gingivalis est

sensible à ces peptides (87, 118, 138). Cette action de défense semble limitée par une

dégradation des peptides attribuée aux gingipaines (118). Cependant, P. gingivalis induit

l’expression d’hßD2 par l’intermédiaire des gingipaines et du récepteur Protease-

Activated Receptor (PAR)2 porté par les kératinocytes. A l’inverse, le LPS et les fimbriae

semblent peu impliqués dans l’induction de ce peptide (29, 43).


35

III) Homéostasie, Interaction hôte/bactéries

La caractéristique principale d’un système biologique est sa capacité de s’adapter à

différents environnements afin de pouvoir vivre. Pour cela, il est nécessaire qu’il mette

en place différentes stratégies. Elles consistent à maintenir un état stable appelé

homéostasie. L’homéostasie parodontale est un équilibre fragile qui se crée entre l’hôte

et la microflore buccale. Elle est donc mise en place d’une part par l’hôte et d’autre part

par les microorganismes. De nombreuses études ont été menées pour connaître la

réponse cellulaire face à des bactéries pathogènes. Or, les infections bactériennes sont

relativement rares et opportunistes et la plupart du temps, l’épithélium gingival est

confronté à des microorganismes bénins ou commensaux (123). L’épithélium et les

bactéries commensales ont évolués ensemble. Ceci signifie que contrairement aux

microorganismes pathogènes, les commensaux ont un rôle dans le développement, la

fonction physiologique et la santé de l’épithélium gingival. Cette homéostasie met en jeu

l’hôte et les microorganismes, mais une question se pose : comment l’hôte permet à ces

bactéries commensales de coexister ?

A) L’hôte

Pour maintenir l’homéostasie, l’hôte exprime de façon basale et constitutive des

molécules et des récepteurs de l’immunité innée. Les récepteurs permettent de

reconnaître les microorganismes, il s’établit alors un dialogue entre les deux acteurs

(41). De ce dialogue découle la régulation du niveau d’expression des molécules et des

récepteurs de l’immunité innée. C’est une forme d’immunorégulation innée qui assure

des réponses appropriées.

Parmi les récepteurs, on retrouve les« Pattern-Recognition Receptors » comme les

TLRs, les récepteurs Scavenger, les récepteurs au Mannose, le CD14. Tous ces

récepteurs sont impliqués dans la reconnaissance de motifs conservés des

microorganismes appelés « Pathogen-Associated Molecular Patterns » (PAMP). Bien qu’ils

soient appelés ainsi, ces motifs n’existent pas exclusivement chez les microorganismes

pathogènes, on les retrouve aussi chez les commensaux (40). Ce sont par exemple des

peptidoglycanes (PGN) communs à presque toutes les bactéries, des acides

lipoteichoïques (LTA) présents uniquement chez les bactéries à Gram positif, des

lipoprotéines ou des LPS caractéristiques des bactéries à Gram négatif, des fimbriae, des

protéases, du mannose (41, 116, 171). Les kératinocytes gingivaux n’expriment pas tous

ces récepteurs. mais ils sont activables par les bactéries par l’intermédiaire de TLRs

fonctionnels par exemple (41). Les PRRs en reconnaissant et en discriminant un de ces


36

motifs, activent différentes voies et induisent ainsi la synthèse de molécules par les

kératinocytes gingivaux qui permettent d’établir un dialogue moléculaire avec les

microorganismes de la flore gingivale. Les cytokines, les chimiokines et les peptides

antimicrobiens (PAMs) participent à ce dialogue. Il a été montré qu’outre leurs propriétés

antimicrobiennes, certains PAMs sont impliqués dans le chimiotactisme de cellules de

l’immunité et la neutralisation de PAMPs (194). Ils sont importants dans l’initiation de la

réponse immune adaptative (116).

Il a été montré que les cellules de Langerhans présentes dans l’épithélium gingival

étaient des actrices de la mise en place d’une tolérance de la muqueuse vis-à-vis des

bactéries commensales. Ces cellules dendritiques une fois activées induisent la

différenciation de LT naïfs en LT régulateurs (Treg) qui produisent la cytokine

immunosuppressive IL-10 (31). Les cellules épithéliales seraient à l’origine de l’activation

des cellules dendritiques qui elles-mêmes activeraient les Treg (33).

B) Les bactéries

L’homéostasie est également due aux bactéries commensales présentes au niveau

de l’épithélium gingival. Les microorganismes commensaux fournissent des nutriments

essentiels, régulent le développement épithélial et contribuent à la maturation du

système immunitaire (70, 123).

Les bactéries commensales sont également capables d’interférer avec des bactéries

pathogènes. Il a été montré que S. sanguinis, colonisateur précoce du parodonte, était

capable de limiter la colonisation de l’épithélium par A. actinomycetemcomitans (180).

L’implication des bactéries commensales dans l’homéostasie gingivale est prouvée,

mais les moyens qu’elles utilisent sont encore mal connus. Sur d’autres épithéliums

comme la peau, une bactérie commensale opportuniste à Gram positif, Staphylococcus

epidermidis est capable de détecter la présence d’un peptide antimicrobien, hßD3, et

déclencher des systèmes de résistance à ce peptide (108).

DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES: LA PATHOGENIE DES MPS ET LA REPONSE DE L’HOTE.

37

LA PATHOGENESE DES MALADIES PARODONTALES (MPS)

ET LA REPONSE DE L’HOTE


38

I) Rupture de l’homéostasie

A) Anatomopathologie des lésions gingivales et

parodontales

L’évolution vers la rupture de l’homéostasie parodontale peut être divisée en quatre

étapes, on parle de lésion initiale (gencive saine), de lésion précoce et établie (gingivite)

et de lésion avancée (parodontite) (Figure 11) (139).

1) Gencive saine (lésion initiale)

La lésion initiale apparaît sur la gencive saine après 2 à 4 jours de dépôt de plaque

, la gencive saine est dite (Figure 11A). Le dépôt bactérien provoque une légère

inflammation. Celle-ci se traduit par l’augmentation de l’apport sanguin et une légère

sécrétion de fluide gingival sulculaire. Ce fluide contient des marqueurs de

l’inflammation. Les leucocytes polynucléaires migrent des vaisseaux vers le sulcus à

travers l’épithélium jonctionnel et s’y accumulent empêchant ainsi la formation de la

plaque bactérienne. Les cellules sont attirées par des produits bactériens comme le LPS,

des peptides formyles et par des substances émises par l’hôte comme l’IL-8 ou des

protéines plasmatiques du complément. Les lymphocytes restent confinés dans les tissus

gingivaux (112).

La protection est assurée par l’immunité innée sécrétoire et les immunoglobulines

(Ig) A sécrétées. Ces deux moyens de défense agissent contre la colonisation

bactérienne et la formation de la plaque sous-gingivale. Ces IgA sécrétées peuvent

neutraliser des antigènes. Elles pourraient agir en synergie avec d’autres facteurs de

l’immunité innée (157).

2) Gingivite et parodontite (lésions précoce, établie

et avancée)

a) Gingivites débutantes et établies

La lésion précoce (Figure 11B) survient environ une semaine après le dépôt de

plaque c’est la gingivite débutante. Il est à noter une augmentation de la vascularisation

de la zone. Les épithéliums jonctionnel et sulculaire forment des invaginations devenant

de plus en plus profondes. La perméabilité de l’épithélium jonctionnel est augmentée


39

permettant aux neutrophiles de plus en plus nombreux de se diriger vers le sulcus

gingival. Ils sont attirés par les produits bactériens et de l’hôte. Leur rôle protecteur est

dû à la phagocytose qui est facilitée par l’opsonification des bactéries. La population

lympho-plasmocytaire est faible à ces stades réversibles de la maladie parodontale et

dominée par les LT. L’infiltrat inflammatoire augmente. Certains fibroblastes commencent

à dégénérer et des fibres de collagène sont détruites sans qu’il y ait pour autant de perte

d’attache ou d’os. L’augmentation de la stimulation antigénique est due à l’augmentation

de la population bactérienne. La flore pathogène se met en place et la profondeur du

sillon gingivo-dentaire augmente (fausse poche) (112).

La lésion établie correspond à la gingivite établie (Figure 11C). L’exposition plus

longue des tissus aux microorganismes augmente l’état inflammatoire. L’épithélium

devient de plus en plus perméable. L’exsudation du fluide gingival sulculaire et la

migration des PMNs dans les tissus et le sulcus augmentent. La formation d’un œdème

entraîne l’augmentation de la profondeur de la fausse poche. La destruction du collagène

se poursuit, et on note également une forte présence de plasmocytes dans le tissu

conjonctif. Ce type de lésion peut être stable pendant plusieurs mois ou années (112).

b) La parodontite

L’évolution conduit à la lésion avancée correspondant à la parodontite (Figure 11D).

La migration apicale de l’épithélium jonctionnel provoque l’approfondissement de la

poche parodontale. La plaque migre également dans cette poche et les bactéries

pathogènes trouvent un terrain idéal pour se développer. La perméabilité de l’épithélium

jonctionnel augmente encore permettant ainsi le passage d’antigènes bactériens dans le

tissu conjonctif et l’arrivée de PMNs vers ce tissu. Des neutrophiles meurent et entraînent

le relargage de leur contenu dans ce tissu conjonctif. Les radicaux libres, les enzymes

protéolytiques et la chute d’expression leurs inhibiteurs entraînent la destruction

tissulaire. Il y a atteinte du parodonte profond entraînant la résorption de l’os alvéolaire

(alvéolyse).

La population lymphocytaire évolue : les LT jusqu’alors majoritaires deviennent

minoritaires et ce sont les LB et les plasmocytes qui deviennent prédominants.

c) Facteurs communs aux différentes

pathologies

Le type de cellules mis en jeu pour la phagocytose et la présentation de l’antigène

(cellule de Langerhans ou macrophage) permet de déterminer la localisation systémique

ou gingivale de l’infection. La réponse anticorps peut être analysée par différents

paramètres qui sont le taux, la spécificité, l’isotype et l’avidité. Le taux d’anticorps


40

augmente normalement avec la sévérité de la maladie, mais la réponse est dépendante

de l’individu. La spécificité dépend des bactéries présentes dans la poche parodontale et

donc du type de parodontite. L’isotype correspond aux différentes sortes

d’immunoglobulines. Chaque bactérie induit des isotypes différents, par exemple A.

actinomicetemcomittans induit la production d’IgG2a en majorité et P. gingivalis, d’IgG2

et d’IgG3. La prédominance de certaines classes d’anticorps peut favoriser

l’opsonification par exemple IgG2 (177). L’avidité des immunoglobulines peut varier au

cours de la maladie parodontale, elle aurait tendance à diminuer avec la sévérité de la

maladie. C’est un des paramètres de l’évolution de celle-ci.

Pendant la maladie parodontale en général, il y a une diminution du nombre de LT

CD4+ et une augmentation du nombre de LT CD8+ dans les tissus gingivaux infectés

et/ou le sang. Ces cellules sont retrouvées à proximité des fibroblastes au niveau des

zones de destruction tissulaire. Ils font partie intégrale des réponses immunes et

inflammatoires pendant les infections parodontales (177).

Les LB peuvent être activés de manière aspécifique par des motifs bactériens

comme le LPS (177). Cette activation polyclonale peut entraîner la synthèse d’auto-

anticorps et d’IL-1.

B) Pathogenèse des maladies parodontales

L’altération des événements immuno-régulateurs et la prolifération, la migration

apicale de l’épithélium jonctionnel provoquent la formation de la poche parodontale.

1) Microbiologie des maladies parodontales

a) Evolution de la microflore gingivale

Sur le parodonte sain, on trouve quelques bactéries le long du rebord gingival. La

plupart d’entre elles sont des aérobies-anaérobies facultatives. Ce sont des cocci et des

bâtonnets à Gram positif comme S. sanguinis ou Streptococcus mitis pour le premier

groupe et Actinomyces viscosus pour le deuxième groupe (164). Ces bactéries

empêchent le développement des anaérobies strictes présentes, mais minoritaires (70,

164, 180).

La gingivite est induite par des bactéries non spécifiques d’un parodonte sain, elles

sont en quantité plus importante. L’accumulation de ces microorganismes le long du

rebord gingival pendant trois à quatre jours provoque l’apparition de la gingivite. Cette

flore microbienne évolue dans le temps (164). Au départ composée de cocci à Gram

positif, à Gram négatif et de bâtonnets à Gram positif, elle est ensuite caractérisée par la


41

présence de bactéries filamenteuses. Enfin quand la gingivite est installée, il est à noter

une augmentation des bactéries anaérobies à Gram négatif (112).

La flore de la poche parodontale est beaucoup plus dense que celle de la gingivite.

Sa composition varie en fonction de la localisation (86). La plaque supra-gingivale est

similaire à celle de la gingivite, la zone intermédiaire est caractérisée par la présence de

bactéries anaérobies et mobiles. La plaque sous-gingivale est caractérisée par des

bactéries anaérobies à Gram négatif et des bactéries mobiles (112).

b) Les facteurs de virulence

Bien que le biofilm soit composé d’un grand nombre d’espèces bactériennes,

seulement un petit nombre est considéré comme des agents étiologiques de ces

maladies. Pour faire partie de ces agents, ces bactéries doivent présenter des facteurs de

virulence. Ce sont des constituants ou des métabolites bactériens capables soit de

rompre l’homéostasie ou de perturber les mécanismes de protection de l’hôte et

finalement d’initier ou de faire progresser la maladie. Ces facteurs de virulence peuvent

être des LPS, des PGN, l’acide lipoteichoïque, des fimbriae, des protéases, des protéines

de stress comme les heat shock proteins (HSP), les formyl methionyl peptides (fMLP) et

les toxines (hémolysines, leucotoxines) (116).

Au moins trois caractéristiques contribuent au caractère pathogène de ces

bactéries. Il s’agit de leur capacité à coloniser et à se multiplier dans l’espace gingivo-

dentaire, à contourner les mécanismes de défenses de l’hôte et enfin à produire des

substances contribuant à la destruction tissulaire. La pathogénie des lésions parodontales

est dépendante des facteurs de virulence, de la présence de microorganismes capables

d’induire la maladie, mais également de leur concentration. Un même facteur de

virulence peut participer à plusieurs mécanismes de la pathogénie. Plusieurs d’entre eux

peuvent également avoir un effet synergique (149).

c) Activité bactérienne directe et indirecte de

destruction tissulaire

La connaissance des mécanismes d’initiation et de progression des maladies

parodontales est importante pour comprendre la genèse de cette maladie. Il est bien

établi que les bactéries des plaques supra et sous-gingivales et leurs métabolites sont

essentiels pour le développement et le maintien des gingivites et des parodontites. Les

bactéries peuvent avoir des effets directs ou indirects. Elles sont susceptibles d’entraîner

la lyse tissulaire du parodonte par trois mécanismes (25) :

-directement, en libérant leur propres enzymes lytiques et de substances

cytotoxiques.


42

-indirectement, en déclenchant la synthèse d’enzymes lytiques chez certaines

cellules de l’hôte ;

-indirectement, en activant certaines cellules de la lignée myéloïde. La réponse

immunitaire déclenchée aboutit à la libération de cytokines pro-inflammatoires entraînant

des mécanismes de dégradation tissulaire.

L’activité lytique des bactéries pathogènes se fait par l’intermédiaire d’enzymes

sécrétées ou provenant d’autolyse (25). Ce sont des enzymes protéolytiques qui

s’attaquent au parodonte. Les protéases participent à la lyse tissulaire mais également à

l’adhésion bactéries cellules eucaryotes et des bactéries entre elles. Ces enzymes

peuvent également révéler des cryptitopes (4). Beaucoup de bactéries

parodontopathogènes ont des besoins énergétiques couverts notamment par

l’assimilation de peptides courts et d’acides aminés. Ainsi, les débris tissulaires provenant

de la destruction tissulaire et les protéines du fluide gingival, favorisent le

développement de bactéries protéolytiques comme P. gingivalis (4).

Certaines bactéries ont une activité toxique. Elles libèrent des toxines comme la

leucotoxine (Actinobacillus actinomicetemcomittans, Campylobacter rectus) qui détruit

les PMNs, les monocytes et certaines sous populations de lymphocytes en créant des

pores dans leur membrane. Le LPS, endotoxine des bactéries à Gram négatif et les

hémolysines font également partie de ces toxines (25).

Les effets indirects des bactéries sur la lyse tissulaire sont provoqués par le LPS par

exemple ou d’autres molécules de l’enveloppe. Elles ont la capacité d’induire chez les

macrophages, les fibroblastes ou les kératinocytes de l’hôte la production d’enzymes

lytiques appartenant à la famille des MMPs et des endopeptidases. Ces enzymes sont

impliquées dans le clivage des constituants de la matrice extracellulaire (13).

Enfin, les bactéries sont capables d’activer les cellules de la lignée myéloïde de

l’hôte qui produisent alors des médiateurs de l’inflammation comme des cytokines. L’IL-

1ß et le TNF-α, par exemple, activeront à leur tour chez d’autres cellules cibles des

mécanismes de dégradation. Ces mécanismes de dégradation endogènes font appel à

des molécules dont les MMPs (13). D’autres voies de dégradation sont comme la

phagocytose et la résorption osseuse ostéoclastique peuvent être induites. Les

fibroblastes, les macrophages et les cellules épithéliales sont capables de phagocyter des

fragment de fibres de collagène et de les dégrader sous l’influence de cathepsines (25).

Les prostaglandines, produites lors de processus inflammatoires, jouent un rôle clé dans

l’alvéolyse par activité ostéoclastique (25, 45).

Certaines bactéries, comme P. gingivalis, sont également capables de pénétrer

dans les tissus gingivaux, on les retrouvera dans les espaces intercellulaires mais


43

également dans les cellules où elles seront à l’abri des défenses immunitaires de l’hôte

(4).

La présence ou l’absence de certains groupes bactériens favorise ou non la rupture

de l’homéostasie parodontale, mais l’hôte joue également un rôle important.

2) Rôle des désordres systémiques

Les conditions et les désordres systémiques sont maintenant considérés comme

secondaires dans la modulation de l’initiation ou la progression de la maladie

parodontale.

Les conditions systémiques de l’hôte correspondent aux états naturels ou induits

qui ont la capacité d’avoir des effets sur tout le corps. Ces états peuvent être dus à des

problèmes hormonaux (grossesse, ostéoporose), de nutrition (catégorie socio-

économique), à l’âge, à la prise de drogues, au tabagisme (59, 181).

Les désordres systémiques sont des anomalies « vraies » ou des maladies ayant

des signes et des symptômes déviants de la normale. Les diabètes sucrés de type I et II

en sont des exemples.

3) Influences génétiques

Chaque individu répond différemment à son environnement, en fonction des gènes

qui influencent la structure tissulaire, la sécrétion d’anticorps ou de médiateurs de

l’inflammation.

Les généticiens sont pratiquement certains que la génétique joue un rôle dans la

survenue de la maladie parodontale. Des études faites auprès de jumeaux et de familles

dont plus d’un membre souffrent de maladie parodontale étayent cette affirmation. Pour

les jumeaux monozygotes, une discordance face à la maladie provient de facteurs

environnementaux. Pour les jumeaux dizygotes, cette différence est due aux facteurs

environnementaux et aux facteurs génétiques. Une étude a montré que la profondeur

moyenne des poches et le résultat de perte d’attache, variaient moins chez les vrais

jumeaux que chez les jumeaux dizygotes (125).

De nombreuses données suggèrent qu’un facteur familial est impliqué dans la

transmission de la parodontite à début précoce (19).

Les facteurs génétiques influençant la réponse de l’hôte sont de deux sortes :


44

-la première comporte les facteurs génétiques évidents qui entraînent des

maladies génétiques déclarées (syndrome de Papillon-Lefèvre, déficit d’adhésion

leucocytaire) au cours desquelles apparaissent des manifestations parodontales. Par

exemple, le syndrome de Papillon-Lefèvre est transmis par un chromosome autosomique

récessif. Il est caractérisé par un défaut de l’épithélium, des fonctions lymphocytaires et

phagocytaires. Ces défauts entraînent une kératose palmo-plantaire associée à une

parodontite sévère et généralisée survenant en général avant la puberté. Cette

parodontite s’accompagne de la perte prématurée des dents temporaires et permanentes

(79).

-la deuxième est constituée par des facteurs génétiques plus discrets qui

n’affectent pas de façon perceptible l’état général du sujet mais le prédispose néanmoins

à la maladie parodontale. Le syndrome de Ehlers-Danlos et celui de Down en sont des

exemples. Le premier syndrome touche la synthèse du collagène et la fonction

lymphocytaire. Le deuxième lui touche la synthèse du collagène et la longueur (faible)

des racines dentaires (94).

II) La réponse de l’hôte

La réponse de l’hôte face aux agressions microbiennes est un facteur clé dans le

maintien ou la rupture de l’homéostasie parodontale. Elle met en jeu un grand nombre

d’acteurs de l’inflammation et de l’immunité.

Bien que ces maladies soient d’origine infectieuse, il apparaît que la genèse de ces

parodontopathies est liée à la réponse de l’hôte. Les lésions inflammatoires de la gencive

ne sont pas différentes de celles des autres tissus de l’organisme. La localisation,

l’extension et la composition de ces lésions sont cependant influencées par la

morphologie et la physiologie particulière du sillon dento-gingival. L’inflammation se situe

au premier rang de l’immunité non spécifique et elle est assurée par les cellules de

l’immunité comme les macrophages et les PMNs mais également par des cellules comme

les fibroblastes ou les kératinocytes.

Les individus ne réagissent pas de la même façon à l’accumulation de la plaque

dentaire. Certains semblent plus sensibles et développent des parodontites agressives à

un âge relativement jeune. D’autres au contraire sont plus résistants et ne développeront

jamais de parodontite. Dans certains cas, le développement de la maladie est lent et le

risque de perte de dent sera faible sur toute une vie. Pour d’autres, la tendance sera

inverse. La réponse de l’hôte est au départ essentiellement protectrice, mais une réponse

inflammatoire incontrôlée, trop forte ou trop faible, peut conduire à la destruction du

parodonte (143).


45

A) L’inflammation

1) Quelques acteurs moléculaires relargués

Une grande variété de médiateurs chimiques endogènes régulent la réponse de

l’hôte et la réponse inflammatoire. Parmi eux se trouvent les cytokines, leurs récepteurs,

les dérivés de l’acide arachidonique et les MMPs.

a) Les cytokines

Les cytokines sont des polypeptides de faible poids moléculaire. Elles sont produites

par des cellules immunitaires et non-immunitaires et permettent à ces cellules de

communiquer entre elles. Les cytokines agissent comme des hormones autocrines ou

paracrines extrêmement puissantes puisqu’elles agissent à des concentrations de l’ordre

de la picomole. Dans cette famille, on retrouve les interleukines, les interférons, des

facteurs de croissance, des facteurs cytotoxiques, etc. Elles sont impliquées dans un

grand nombre de processus biologiques comme la prolifération, le développement, la

différenciation, l’homéostasie, la régénération, la cicatrisation et l’inflammation (136). IL-

1, IL-6, IL-8, TNFα sont des cytokines pro-inflammatoires sécrétées par des cellules

immuno-compétentes comme les lymphocytes T et les monocytes au niveau des sites

enflammés mais elles sont également produites par les cellules endothéliales, les

fibroblastes et les kératinocytes (136, 137).

L’interleukine-1

L’IL-1 a de nombreuses fonctions notamment dans l’immunité, l’inflammation et le

maintien ou la rupture de l’homéostasie parodontale. Elle peut être sous deux formes, IL-

1α restant associée à la cellule et IL-1ß qui est sécrétée. Elle est liée à l’endommagement

des tissus (perte osseuse et inhibition de la formation de l’os) et à la perte d’attache

(136). En effet, elle agit sur les PMNs en stimulant leur dégranulation. Ces derniers

libèrent leur contenu lysosomial dans le milieu extracellulaire ce qui facilite la bactéricidie

et la phagocytose. En contrepartie, des granules cytotoxiques et des protéases vont

provoquer des destructions tissulaires importantes. Cette cytokine induit et active les

MMPs par l’intermédiaire de la prostaglandine E2 (PGE2) et de la plasmine. Son

expression est induite par S. sanguinis, F. nucleatum et P. gingivalis (4, 8, 15), par des

produits bactériens comme le LPS, les fimbriae de P. gingivalis, par le TNFα et par elle-

même (25). Elle est dégradée par les gingipaines de P. gingivalis (4).

L’interleukine-6


46

L’IL-6 influence la réponse immunitaire et l’inflammation. Sa concentration

augmente lors de la maladie parodontale. Sa production est induite par le LPS, le TNFα et

par P. gingivalis et ses gingipaines. Ces dernières peuvent également la dégrader (4,

73). Elle est impliquée dans la maturation des lymphocytes B en plasmocytes capables

de sécréter des anticorps. Cette cytokine stimule la formation d’ostéoclastes participant

ainsi au « turnover » de l’os et à sa résorption (73, 136).

L’interleukine-8

L’IL-8 est une chimiokine. Son expression est induite par le TNFα et également par

des bactéries comme F. nucleatum et A. actinomicetemcomittans (76). Son expression

kératinocytaire est inhibée par P. gingivalis après un contact de celle-ci avec les

kératinocytes (37, 76, 189). L’IL-8 attire les neutrophiles du tissu conjonctif vers le

sulcus, lieu de l’inflammation et les active (37). Dans un épithélium sain, l’IL-8 forme un

gradient d’expression qui est plus fort au niveau du contact kératinocyte-bactérie. Ce

gradient permet d’attirer les neutrophiles au niveau de la colonisation bactérienne,

évitant ainsi des dommages aux tissus sains environnants (37). Une trop forte

concentration provoque la destruction tissulaire (136).

Le Tumor Necrosis Factor α

Le TNFα est induit par F. nucleatum, P. gingivalis (4, 185), par le LPS (10), le PMA

et par lui-même (103). Il induit l’expression de la collagénase 3 chez les fibroblastes et

participe à la résorption osseuse en activant les ostéoclastes. Il induit également l’IL-1

avec laquelle il agit en synergie (10) et stimule l’expression de PGE2 (136).

b) Les métabolites de l’acide arachidonique

L’acide arachidonique est un acide gras polyinsaturé constituant de la membrane

phospholipidique de la plupart des cellules. Les phospholipides sont clivés par les

phospholipases A2 et relargués sous forme d’acide arachidonique. Celui-ci subira une

maturation par la cyclo-oxygénase et donnera le thromboxane, la prostacycline et les

prostaglandines (PG). La maturation de l’acide arachidonique par la lipoxygénase

donnera elle naissance aux leucotriènes (25). Ces métabolites sont impliqués dans la

réponse inflammatoire. Parmi les PG, PGE2 a une activité pro-inflammatoire incluant la

genèse des ostéoclastes par induction de l’expression de récepteurs activateurs de la

voie NF-κB. Elle est impliquée dans la résorption osseuse et la destruction tissulaire (81,

198). Elle inhibe la production de certaines cytokines comme le TNFα. Elle serait capable

d’empêcher une inflammation trop forte conduisant à l’alvéolyse et stimulerait la

cicatrisation (81). Cette prostaglandine est induite par l’IL-1 et le TNFα (136).

c) Les MMPs


47

Ce sont des endopeptidases Zinc et Calcium-dépendantes capables de digérer

spécifiquement les composants de la matrice extracellulaire. Elles peuvent être

synthétisées par plusieurs types cellulaires comme les cellules infiltrées mais également

par des cellules résidentes du parodonte et en particulier par les cellules épithéliales (5,

184).

La plupart des MMPs sont sécrétées sous forme de pro-enzymes inactives qui ont

besoin d’être activées pour exercer leurs fonctions. Les MMPs contiennent un pro-

domaine en NH2 terminal avec un résidu cystéine qui interagit avec l’ion Zn2+ présent sur

la partie active de ces enzymes. Cette interaction bloque l’activité protéolytique et sa

rupture activera l’enzyme (187). Elles sont activées dans l’environnement péricellulaire et

extracellulaire par d’autres MMPs comme les MMPs de type membranaire , les MT-MMPs,

par la plasmine ou par différents composés oxydatifs (5, 13) (Figure 12).

Elles sont induites par des bactéries comme F. nucleatum et P. gingivalis (5, 184)

et par des médiateurs de l’inflammation comme la PGE2, le TNFα ou l’IL-1. L’IL-1 agit par

l’intermédiaire du plasminogène et de la plasmine (136). Les ostéoclastes synthétisent

ces MMPs et provoquent ainsi la dégradation osseuse. L’activité des MMPs est contrôlée

par les TIMPs qui les bloquent ou par blocage de l’activation autolytique de ces

endopeptidases (5), mais les phases actives successives observées lors de la maladie

parodontale (destruction tissulaire) sont le résultat d’un déséquilibre, d’une perturbation

de la balance MMP/TIMP. En effet, lors de la phase active, la quantité et l’activité des

MMPs augmentent et la concentration des TIMPs diminue (151, 166).

En présence de parodontite, les niveaux d’expression des MMP-2, MMP-9 et MMP-8

sont plus élevés que pour un parodonte sain (5, 166, 179). Ces métalloprotéinases sont

associées à des destructions tissulaires irréversibles et à la progression de la parodontite.

MMP2 et MMP9 peuvent dégrader le collagène de type IV de la lame basale et

d’autres protéines matricielles comme les collagènes natifs de type V et VII, la

fibronectine, la laminine, l’élastine et également des collagènes dénaturés (Figure 13A)

(5). Ces deux MMPs peuvent être activées par des protéinases bactériennes.

MMP-8 a de nombreux substrats collagéniques ou non. Elle clive notamment les

collagènes de type I, II, III, VII et X (Tableau 2) (179, 187).

MMP-2

Cette MMP est également nommée gélatinase A (Figure 13A), le poids moléculaire

de sa forme inactive ou proforme est de 72 kDa (13). Elle est contrôlée par TIMP-2. Ses

transcrits sont exprimés par les kératinocytes gingivaux dans les tissus parodontaux

enflammés. Elle est principalement excrétée par les fibroblastes gingivaux et ceux du

ligament parodontal lors d’une infection par des bactéries parodontopathogènes. Lors

d’une infection avec P. gingivalis, ses transcrits sont induits mais pas sa forme protéique.


48

Ceci pourrait s’expliquer par une dégradation par les gingipaines produites par la bactérie

(5). Cette MMP est faiblement exprimée dans l’épithélium oral non enflammé, par contre

quand il y a inflammation lors de parodontite de l’adulte et de parodontite juvénile

localisée, son expression est induite dans l’épithélium sulculaire (179).

MMP2 est associée à la migration kératinocytaire et est exprimée dans l’épithélium

migrant apicalement dans le tissu conjonctif lors de la parodontite (119). Son expression

est modulée lors d’une blessure et de la cicatrisation, elle est impliquée dans le

remodelage de la matrice lors de cette cicatrisation (85).

MMP-9

Elle est également nommée gélatinase B (Figure 13A). Le poids moléculaire de sa

proforme est de 92 kDa. Elle peut s’associer en dimère, avec d’autres protéines,

également avec la MMP-8 et des protéases bactériennes (65, 95, 135). L’expression

génique de MMP-9 peut être régulée par des cytokines pro-inflammatoires endogènes

comme le TNFα ou l’IL-1ß, et des facteurs de croissance, ceci en passant en partie par

l’activation de la voie NF-κB. Cette MMP est contrôlée par son inhibiteur TIMP-I.

Le LPS de bactéries comme Tannerella forsythia, Treponema denticola et P.

gingivalis augmente la production de MMP-9 dans des cellules épithéliales et des

macrophages en coculture (5). Lors d’une infection par P. gingivalis, MMP-9 est induite

sur le plan génique et protéique. P. gingivalis régule directement cette induction en

dégradant des inhibiteurs de MMPs comme TIMP-1 grâce aux gingipaines. Cette induction

peut également être due à la libération de cytokines endogènes (5).

Contrairement à MMP-2, MMP-9 ne serait pas associée à la migration des

kératinocytes gingivaux que l’on peut retrouver lors de la migration apicale de

l’épithélium jonctionnel lors de la parodontite (119).

MMP-8

C’est la collagénase-2 ou collagénase neutrophile (Figure 13B). Elle est exprimée

dans plusieurs types cellulaires comme les PMNs, les fibroblastes et les kératinocytes

oraux le cas de processus inflammatoires (91, 144). Elle est associée aux processus de

remodelage tissulaire intervenant lors de l’inflammation et à la cicatrisation (65). Elle est

retrouvée dans l’épithélium sulculaire oral lors de la parodontite de l’adulte et de la

parodontite juvénile localisée (179). Sa forme active est présente dans le fluide gingival

en cas de parodontite et est associée à la dégradation des tissus parodontaux (151).

Cette enzyme est activée par les MMP-3, 7, 10 et 14 mais également par des protéases

bactériennes (187). Selon le type cellulaire qui l’exprime, MMP-8 aura des poids

moléculaires différents. Pour les PMNs, le poids moléculaire varie de 80 à 60 kDa, pour

les fibroblastes, il est de 38 et 43 kDa (91).


49

2) Les réponses inflammatoires non contrôlées

Il y a plusieurs exemples de réponse inflammatoire non contrôlée.

a) Rôle du polymorphisme des molécules

relarguées

Une corrélation existe entre la libération en médiateurs inflammatoires comme le

TNF-α, l’IL-1 et la PGE2 et la destruction parodontale. Ces médiateurs sont capables

d’aggraver la réponse inflammatoire. En effet, il a été montré que leur concentration

dans le fluide gingival sulculaire et la gravité de la maladie sont associées (198). Certains

individus ont une réponse inflammatoire plus forte suite à une infection parodontale.

La variabilité individuelle de production de cytokines au niveau du sillon dento-

gingival pourrait avoir plusieurs explications.

Des études ont été menées pour déterminer s’il existait une association entre la

variabilité génétique et la réponse inflammatoire induite par une infection parodontale.

La comparaison des études polymorphiques et diagnostiques suggèrent que la production

de médiateurs inflammatoires par des cellules de l’inflammation est affectée par

différentes caractéristiques génétiques.

Des études de polymorphismes des gènes codants pour des médiateurs de

l’inflammation (IL-1, TNF-α, IL-4) ont été réalisées. La comparaison de la variabilité

génétique et des outils diagnostiques couramment utilisés pour déterminer le niveau

inflammatoire gingival a donc été faite.

la profondeur de la poche et le niveau d’attachement sont en

corrélation avec la concentration en IL-1ß dans le fluide gingival du sillon gingivo-

dentaire (52).

la variabilité génétique d’individus atteints de maladie parodontale a un

effet sur les niveaux systémiques en médiateurs de l’inflammation (162).

Le niveau de réponse de chaque individu serait déterminé génétiquement. Ces

résultats tendent à montrer que le niveau de réponse en médiateurs de l’inflammation

serait lié à la variabilité génétique (162).


50

b) Rôle du polymorphisme des récepteurs

impliqués

Les récepteurs de cytokines, d’immunoglobulines (Fc) et de motifs microbiens

(PRRs) ont fait l’objet d’un nombre d’études limité. Ainsi, il existerait une relation entre la

maladie parodontale et les polymorphismes des récepteurs d’immunoglobulines et de

fMLP (récepteur du N-formylpeptide impliqué dans le chimiotactisme des PMNs) (186).

Il a été montré que suivant les individus, des différences de réponse des monocytes

au LPS pouvaient apparaître. Alors que certains répondent par une forte production de

TNF-α et d’IL-1, d’autres non. La réponse au LPS de monocytes et de macrophages

provenant d’un individu sain ne sera pas la même que celle obtenue chez un individu

atteint de parodontite. Comme pour les récepteurs aux immunoglobulines et aux fMLP, il

y a une relation entre maladie parodontale et polymorphismes génétiques des TLRs, mais

le nombre d’études est également limité (162).

B) La réponse immunitaire

L'immunité peut être définie comme l'ensemble des mécanismes biologiques

permettant à un organisme de reconnaître et soit de tolérer ce qui lui appartient en

propre (le soi) soit de rejeter ce qui lui est étranger (le non soi), comme les substances

étrangères ou les agents infectieux auxquels il est exposé, mais aussi ses propres

constituants altérés (cellules tumorales).

Le parodonte possède les moyens de défense communs à l'ensemble de

l'organisme. Les défenses immunitaires revêtent deux composantes :

l’immunité innée non spécifique immédiate mise en jeu par les tissus

de revêtement et des cellules comme les phagocytes et les plaquettes capables de libérer

des facteurs solubles,

l’immunité adaptative mise en jeu au niveau de cellules immunitaires

spécialisées. Cette défense se développe en quelques jours et dépend de la

reconnaissance spécifique d’une substance étrangère.

L'immunité non spécifique et l'immunité spécifique sont étroitement imbriquées.

Lors de la réponse immune les cellules comme les neutrophiles, les

monocytes/macrophages, les cellules dendritiques, les fibroblastes et les kératinocytes

reconnaissent les bactéries et leurs facteurs de virulence par l’intermédiaire de PRRs.

Cette reconnaissance active et module diverses voies dans ces cellules qui répondent par

la libération de médiateurs de l’inflammation. Cette activation peut provoquer d’une part

la phagocytose des intrus et d’autre part la destruction tissulaire locale. Ces différentes


51

cellules activent à leur tour les lymphocytes B et T naïfs ce qui déclenche l’immunité

adaptative (177).

1) Les acteurs de l’immunité innée

Les surfaces épithéliales sont les premières lignes de défense contre l’infection. Les

kératinocytes sont maintenus par des jonctions serrées qui forment une protection

efficace contre les influences extérieures telles que le dessèchement, les

microorganismes (84). Ils sont représentés au niveau du parodonte par les divers

épithéliums décrits précédemment, l’épithélium de jonction, l’épithélium gingival

sulculaire et l’épithélium gingival oral. Les épithéliums du palais, de la langue et de la

zone alvéolaire font également partie de ces tissus de revêtement.

Cette barrière épithéliale représente plus qu’une barrière physique, en effet, elle

produit également des substances microbicides qui inhibent la croissance bactérienne

(84). En effet, une défense efficace contre les microorganismes est assurée par la

surface intacte des membranes muqueuses, la desquamation des cellules épithéliales, le

flux salivaire et les divers composants des sécrétions salivaires (112). Lorsque la surface

de la muqueuse est altérée, la protection est alors assurée par les divers composants des

sécrétions salivaires et par les cellules phagocytaires. Au niveau buccal, on retrouve le

lysozyme, la lactoferrine, les cystatines, le complément et les peptides antimicrobiens

par exemple. Les kératinocytes qui composent la barrière épithéliale jouent également un

rôle primordial dans l’immunité innée. Ce rôle sera détaillé plus loin.

a) Les facteurs solubles

Parmi ces facteurs, on retrouve le lysozyme également appelé muramidase (157), il

est stocké dans les glandes salivaires, après sa synthèse par les neutrophiles. Le coccus

A. actinomycetemcomitans y est sensible (78). Il a également un rôle bactériostatique

sur Streptococcus mutans (54). Il existe une relation entre la sévérité des parodontites

et la diminution de la quantité de lysozyme salivaire (157).

La lactoferrine est un autre facteur soluble. C’est un compétiteur. Elle est surtout

présente dans la salive et est connue pour inhiber la croissance des bactéries à Gram

négatif en fixant le fer (84).

Les cystatines sont des protéines inhibitrices des cystéine protéinases présentes

dans le fluide gingival et la salive (157). Elles protègent les tissus en inhibant certaines

enzymes bactériennes ou lysosomales libérées dans des circonstances pathologiques

(54).


52

Le complément est composé de protéines plasmatiques auxquelles on attribue trois

activités biologiques majeures. Elles attirent et activent les phagocytes (neutrophiles et

macrophages), détruisent les microorganismes et les opsonisent. Ces protéines

opsonisent également les complexes immuns. Le complément est également impliqué

dans des phénomènes en relation avec la coagulation, les kinines et la fibrinolyse (84). Il

intervient dans la libération d'amines vaso-actives. Son activation est à l'origine de

dommages tissulaires, résultants en particulier de son effet chimiotactique sur les

neutrophiles, de son rôle de médiateur de la lyse cellulaire, et de son intervention dans le

processus de dégranulation des mastocytes (84, 120).

Les interférons (IFN) sont produits par divers types de cellules, dont les

lymphocytes T "helper" et Natural Killer (NK). Ils constituent un groupe de protéines

immunomodulatrices (IFNα, ß et γ) limitant les infections virales. L’IFNγ active les

macrophages, inhibe les LB. En activant les NK, il favorise la destruction des cellules

infectées par des pathogènes intracellulaires (84).

Les peptides antimicrobiens sont des effecteurs de l’immunité innée synthétisés par

différents types cellulaires dont les cellules épithéliales. Ces peptides sont donc

antimicrobiens, mais ils sont également impliqués dans l’inflammation, dans la liaison

entre immunité innée et immunité adaptative. Ils peuvent également être

chimiotactiques. Parmi ces nombreuses molécules, se trouvent les histatines, les α et ß-

défensines et la cathélicidine LL-37 (161).

b) Les cellules

Ce sont des cellules comme les cellules dendritiques, les phagocytes (monocytes et

macrophages, polynucléaires), les mastocytes, les cellules NK.

Les monocytes et les macrophages

Si un microorganisme pénètre dans les tissus et s’y réplique, il sera dans la plupart

des cas reconnu par les phagocytes mononucléaires résidant dans ces tissus (84). Ils

contiennent de grosses granulations cytoplasmiques, les lysosomes qui renferment de

nombreuses enzymes. Leur fonction est la phagocytose et lorsqu’ils sont activés, ils

sécrètent des protéines plasmatiques (complément) et des glycoprotéines (IFNα/ß, IL-1

et TNFα). Ces macrophages font le lien entre l’immunité innée et l’immunité acquise

puisque ce sont des cellules présentatrices d’antigènes aux cellules immunocompétentes

(120).

Les cellules dendritiques

La cellule de Langerhans localisée dans les parties moyenne et profonde de

l'épiderme et de l’épithélium gingival, dérive de la lignée monocytaire et possède de

nombreuses caractéristiques du macrophage. Son rôle principal est de présenter les

antigènes aux LT naïfs et LB naïfs. Les lymphocytes subissent alors la différenciation et la


53

maturation (106). Ces cellules sont donc l’interface entre l’immunité innée et l’immunité

acquise en transmettant l’information (antigène) aux lymphocytes.

Les polynucléaires

Les polynucléaires sont synthétisés dans la moelle osseuse où ils sont stockés avant

de passer dans le sang en se répartissant dans deux secteurs à peu près égaux : le

secteur marginal, dans lequel ils sont collés à l'endothélium vasculaire et remis en

circulation en fonction des besoins, et le secteur circulant, dans lequel ils ne séjournent

que très peu de temps, leur passage dans les tissus étant continu. Ils effectuent dans les

tissus leur fonction de phagocytose et sont détruits par les macrophages, sur place ou

dans les ganglions.

Leur durée de vie est de 24 heures et ils ne peuvent se diviser. Ils ont un noyau

segmenté en 2 à 5 lobes et possèdent des granulations caractéristiques qui permettent

de les séparer en polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles. Ces

granulations contiennent des enzymes lytiques. Le polynucléaire neutrophile a pour

fonction principale la phagocytose, le polynucléaire éosinophile a la même physiologie et

il agit également au niveau des tissus. Il a des capacités de phagocytose réduites par

rapport aux neutrophiles et il est spécialisé dans la destruction des parasites

intracellulaires. Il peut neutraliser les effets nocifs d'une dégranulation importante des

mastocytes. Le polynucléaire basophile est le précurseur sanguin du mastocyte tissulaire.

Après son activation, il sécrète, comme le mastocyte, des médiateurs de l'inflammation

(145).

Les mastocytes

Les mastocytes sont présents à proximité des LT dans le tissu conjonctif et au

niveau de l’épithélium. Ils peuvent phagocyter et maturer les antigènes avant de les

présenter aux LT. Dans son cytoplasme, on retrouve également des granulations

contenant des médiateurs de l’inflammation. Cette cellule est impliquée dans l’initiation

et l’amplification de la réponse inflammatoire (histamine, des prostaglandines et des

leucotriènes).

Les cellules NK (Natural Killer)

Les cellules NK peuvent détruire, sans reconnaissance spécifique, des cellules

infectées par des bactéries ou des virus et également des cellules cancéreuses. Ce sont

des lymphocytes de grande taille dont le cytoplasme contient des granulations contenant

des enzymes (perforines…). La cellule-cible meurt par déséquilibre osmotique ou par

apoptose (déclenchée prématurément).

Les cellules présentatrices d’antigène (CPA) digèrent l'antigène afin de bien le

présenter aux cellules effectrices de l'immunité cellulaire ou humorale. Plusieurs types

cellulaires composent cette famille. Elle inclut les cellules de Langerhans (rôle principal),


54

les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B mais également les cellules

endothéliales et épithéliales après stimulation par l'IFNγ.

2) Les acteurs de l’immunité acquise

Il existe plusieurs types cellulaires qui participent au développement des réactions

immunitaires spécifiques, il s’agit des lymphocytes et des cellules présentatrices

d’antigène. Les lymphocytes sont présents dans le sang, la lymphe et les organes

lymphoïdes. Deux types de lymphocytes représentent cette famille, les lymphocytes T

(LT) et les lymphocytes B (LB). Ce sont des cellules effectrices de l’immunité. Chaque

famille lymphocytaire possède un récepteur spécifique d’un antigène.

Lors de la maladie parodontale, la population lymphocytaire évolue. Dans les stades

précoces de la maladie, les LT sont majoritaires, dans le cas de la parodontite, ce sont

plutôt les LB qui dominent (177).

a) Les lymphocytes B

Les LB sont les acteurs de l’immunité humorale. Lorsque les LB naïfs rencontrent

une bactérie ou un agent pathogène, ils subissent une maturation et synthétisent une

immunoglobuline spécifiquement dirigée contre un épitope précis (84). Cette

immunoglobuline est membranaire. Ces lymphocytes reconnaissent directement les

antigènes qu’ils soient circulants, solubles ou particulaires (bactérie par exemple).

Les LB se différencieront soit en LB mémoire soit en LB effecteur (plasmocyte)

capables de produire des anticorps et de présenter des antigènes. Ces cellules peuvent

être activées de manière non spécifique par des motifs bactériens comme le LPS (177).

Ces LB peuvent neutraliser les toxines bactériennes, déclencher la cytotoxicité liée

aux anticorps et empêcher les bactéries d’entrer et de coloniser les muqueuses (177).

Les LB et les anticorps contribuent au contrôle de la maladie parodontale, mais face

à des assauts répétés des bactéries du biofilm, la protection apportée par ces cellules

peut devenir inefficace et inadéquate. Cela peut mener au déclenchement de réponses

immunes et inflammatoires associées à la destruction tissulaire (IL-1ß, RANK-L, TNFα,

IL-6, MIP1α et MCP3) (177) qui sont impliquées dans l’activation de la production

d’ostéoclastes. Les LB parodontaux peuvent également produire l’IL-1ß. Sachant que

cette cytokine est impliquée dans la perte osseuse, ces lymphocytes pourraient eux-

mêmes jouer un rôle important dans cette destruction tissulaire. Certaines bactéries

contournent la protection apportée par ces LB et ces anticorps en faisant varier leur

antigène et en produisant des protéases détruisant les anticorps.


55

b) Les lymphocytes T

Les LT sont les acteurs de l’immunité cellulaire. Ils ne reconnaissent que des

antigènes peptidiques associés au CMH à la surface de cellules présentatrices d’antigène

(84). Ils sont recrutés dans la gencive en suivant un gradient de cytokines et de

molécules d’adhésion.

Ces LT sont séparés en deux populations principales d'après la présence de

protéines membranaires spécifiques, les LT CD8 et les LT CD4.

Les lymphocytes T CD8+

Les LT CD8 sont cytotoxiques, leur rôle dans les maladies parodontales est mal

connu (177). La pénétration de bactéries pathogènes comme A. actinomicetemcomittans

et P. gingivalis dans les kératinocytes gingivaux induit la génération des LT CD8+ (177).

Il a été montré que ces lymphocytes n’étaient pas impliqués dans la perte osseuse

malgré des sécrétions de RANK-L, de TNFα et de CD40L lorsqu’ils sont activés. Un LT CD8

naïf peut donner deux types cellulaires, les LT cytotoxiques de type 1 sécrétant des

cytokines de type 1 (TNFα/ß, IFNγ, IL-2) et des LT cytotoxiques de type 2 sécrétant des

cytokines de type 2 (IL-4/5/6 et IL-10). Lors des infections parodontales, c’est la

deuxième classe de LT qui est retrouvée en majorité (177). Pour conclure, ces LT CD8+ ne

participent pas directement à la destruction des tissus lors d’infections parodontales, ils

sont plutôt impliqués dans la protection des tissus parodontaux.

Les lymphocytes T CD4+

Les LT CD4+ sont des LT mémoire ou lymphocytes helpers (lymphocytes Th). Ils ont

pour rôle d'activer les macrophages, les LB mais aussi les LT CD8+. Ils complétent la

réponse immune à médiation humorale en activant également les cellules de l’immunité

innée.

Comme les LT CD8+, les LT CD4

+ se différencient soit vers la voie Th1, soit vers la

voie Th2.

Le rôle des LT CD4+ est à la fois protecteur et destructeur, protecteur en induisant

la réponse immune à médiation humorale et la réponse CD8+ et destructeur en

produisant des cytokines pro-inflammatoires et inflammatoires qui favorisent la genèse

des ostéoclastes (177).

DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES_IMMUNITE INNEE

56

LA REPONSE IMMUNE INNEE GINGIVALE


57

L’immunité innée repose sur la reconnaissance de motifs microbiens, les PAMPs par

les PRRs. Les motifs microbiens reconnus par ces récepteurs sont conservés et présents

dans une grande variété de microorganismes différents. Ce sont les premières cibles

détectées par l’immunité innée (142). L’identification la nature de l’agression et les

risques encourus permet d’induire la réponse pour protéger l’hôte.

L’activation des PRRs déclenche des cascades de signalisation intracellulaire

aboutissant à l’induction de cytokines, de chimiokines inflammatoires, d’interférons et de

peptides antimicrobiens. Les peptides antimicrobiens, partie intégrante de l’immunité

innée, ont des fonctions bactéricides ou bactériostatiques et sont impliqués dans le

chimiotactisme et dans l’activation de cellules de l’immunité. Ils servent d’interface entre

l’immunité innée et l’immunité adaptative.

La partie suivante portera sur les kératinocytes gingivaux au niveau desquels se

met en place tout ce dispositif de réponse de l’hôte. Les TLRs, PRRs impliqués dans la

reconnaissance et la discrimination de microorganismes et des peptides antimicrobiens

sécrétés seront étudiés au niveau des kératinocytes gingivaux.

I) Le kératinocyte : une cellule immunoréactive

L’épithélium parodontal a longtemps été considéré comme un revêtement passif,

mais les perspectives ont changé. En plus de fournir une barrière physique aux

infections, ce tissu a un rôle actif dans la réponse de l’hôte. Le kératinocyte qui constitue

cet épithélium est constamment en contact avec les microorganismes. Des antigènes

bactériens sont relargués en permanence des plaques supra et sous gingivale. Les

kératinocytes répondent activement à ces sollicitations. Cette participation à la réponse

de l’hôte est possible grâce à l’expression par cette cellule de différents acteurs de

l’immunité innée.

Le kératinocyte peut reconnaître et discriminer les microorganismes et leurs

produits par l’intermédiaire des PRRs (40). Il en exprime plusieurs comme les récepteurs

membranaires TLR2 et TLR4 ou les récepteurs intracellulaires Nucleotide-binding

Oligomerization Domain (NOD)1 et 2 (171). Le récepteur Protease-activated Receptor

(PAR)2 impliqué dans la modulation de l’inflammation est exprimé par les kératinocytes

gingivaux. Il est activé par des protéases bactériennes comme les gingipaines de P.

gingivalis (29).

L’activation kératinocytaire par l’intermédiaire de ces récepteurs entraîne diverses

réponses comme la synthèse de cytokines (TNFα, IL-1ß, IL-6) et de chimiokines (IL-8,

monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, macrophage inflammatory protein (MIP)-1α)


58

impliquées dans la médiation de l’inflammation et le recrutement de cellules de

l’immunité (29, 58, 116).

Une autre conséquence de l’activation kératinocytaire est la synthèse de protéases

comme les MMPs impliquées dans la cicatrisation et le remodelage de la matrice (85,

179). Ces MMPs sont également impliquées dans l’inflammation et la destruction

tissulaire (166).

Les kératinocytes gingivaux synthétisent également des peptides antimicrobiens

comme l’adrénomédulline, la calprotectine, la cathélicidine LL-37, les ß-défensines (35).

Certains de ces peptides ont d’autres propriétés que la bactéricidie. Ils sont

chimiotactiques pour des cellules de l’immunité comme monocytes/macrophages, les LT

et les cellules dendritiques (194). Ils sont capables d’activer des cellules comme les

mastocytes et les kératinocytes eux-mêmes (35). Il apparaît que les cellules épithéliales

seraient également à l’origine de l’activation des cellules dendritiques qui elles-mêmes

activeraient les Treg (33) favorisant ainsi la mise en place d’une tolérance de la

muqueuse vis-à-vis des bactéries commensales (31).

Toutes ces propriétés prouvent que le kératinocyte est une cellule immunoréactive

et n’est pas un acteur passif face à la microflore buccale. Sa position en première ligne

face au challenge microbien en fait un acteur important de la réponse de l’hôte et de

l’homéostasie parodontale. Cette cellule épithéliale met en place une immunité innée et

sert d’interface entre cette immunité et l’immunité acquise.

II) Les « Pattern Recognition Receptors » ou PRRs

Ces récepteurs sont exprimés dans un grand nombre de types cellulaires. Ils

peuvent être divisés en trois familles : les récepteurs solubles (opsonines), les récepteurs

d’endocytose et les récepteurs de signalisation (Figure 14) (40).

Les PRRs de la première famille se fixent aux microorganismes et facilitent leur

élimination par les cellules phagocytaires. Ce sont des facteurs du complément et des

pentraxines (molécules de la phase aiguë de l’inflammation).

La deuxième famille est impliquée dans la reconnaissance et l’internalisation des

microorganismes, elle est constituée des récepteurs « Scavengers » et des lectines de

type C. Ces molécules sont exprimées sur des cellules à forte activité d’endocytose

comme les monocytes et les macrophages.

La troisième famille représente les récepteurs de signalisation comme les TLRs, les

NODs et les Hélicases. Les TLRs se trouvent à la surface des cellules ou dans les

endosomes et les lysosomes alors que les NODs et les Hélicases sont des récepteurs

cytosoliques (40).


59

Les récepteurs TLR2 et TLR4 jouent un rôle prépondérant dans la reconnaissance,

la discrimination des microorganismes et l’activation différentielle des cellules de

l’immunité innée (cellules épithéliales, neutrophiles, monocytes/macrophages, cellules

NK et cellules dendritiques). Ils constituent les interfaces moléculaires entre immunité

innée et immunité acquise.

A) Les « Toll-like Receptors » ou TLRs

1) Généralités

La molécule Toll a été découverte chez la drosophile. Elle est composée de

séquences riches en leucine appelées « Leucin Rich Repeats » ou LRR semblables à celles

retrouvées sur le CD14, récepteur du LPS . Elle est également composée d’un domaine

intracellulaire « Toll/IL-1 receptor » ou TIR proche de celui du récepteur à l’IL-1. Toll

active une molécule analogue de NF-κB. Les drosophiles déficientes en cette molécule

montrent une sensibilité plus forte aux attaques fongiques. Ces données ont suggéré

qu’elle avait un rôle dans l’immunité. La recherche de molécules similaires chez les

mammifères a permis d’en découvrir avec les mêmes spécificités structurales : les

récepteurs Toll-like (40).

En tout, onze TLRs humains ont été découverts à ce jour, chacun reconnaissant des

motifs microbiens différents (Figure 14). Ces motifs proviennent de bactéries, de virus,

de protozoaires et de champignons. Les TLRs sont classés selon la nature de PAMPs qu’ils

reconnaissent. Ces récepteurs peuvent être divisés en trois classes. La première classe

composée des TLR1, 2, 4, 6 et 10 reconnaissant les lipides. La deuxième classe

contenant TLR5 et 11, reconnaît les protéines. La troisième classe composée des TLR3, 7,

8 et 9 reconnaît les acides nucléiques. Les TLRs des deux premiers groupes sont

membranaires, externes, ceux du troisième groupe sont intracellulaires, dans les

endosomes et les lysosomes par exemple (89).

Ces protéines membranaires de type I sont caractérisées par un ectodomaine

composé par des LRRs. Le domaine cytoplasmique TIR est activé par ce domaine LRR

(89). L’homologie du domaine TIR des TLRs et du récepteur à l’IL-1 entraîne une relative

similitude entre les cascades de signalisation des deux sortes de récepteurs (142).

La reconnaissance du motif microbien ou du microorganisme lui-même stimule le

recrutement d’un jeu de molécules s’adaptant au domaine TIR du TLR (Figure 15). Il

s’agit du MyD88 (Myeloid Differentiation factor 88), TIRAP (Toll-Interleukin Receptor

Adapter Protein), TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN) et TRAM (TRIF-


60

related adapter molecule). MyD88 est un adaptateur universel utilisé par tous les TLRs

sauf le TLR3. Il contrôle les voies inflammatoires par l’intermédiaire des MAPK et de NF-

κB. TIRAP module l’activation de TLR2 et de TLR4 par le biais d’une voie dépendante de

MyD88. Trif est recruté par TLR3 et TLR4 et active une voie alternative TRIF-dépendante

(MyD88-indépendante) modulant les voies NF-κB, MAP Kinases et le facteur de

transcription IRF3. TRAM participe à l’activation de TLR4 avant la voie Trif-dépendante

(89).

TLR2 et TLR4 sont fortement impliqués dans le maintien de l’homéostasie

parodontale. Leur expression augmente lorsque les tissus sont enflammés. Cette

augmentation d’expression confèrerait une meilleure réponse immune innée lors de la

rupture de l’homéostasie parodontale (171).

2) TLR2

a) Les ligands

Ce récepteur est impliqué dans la reconnaissance des protéoglycanes, des

lipopeptides et des lipoprotéines des bactéries à Gram positif, des lipopeptides des

mycoplasmes et du zymosan des champignons ou levures (142). Des PAMPs des

bactéries à Gram négatif sont cependant reconnues par ce récepteur, comme les LPS de

P. gingivalis, de Capnocytophaga ochracea et de Bacteroides fragilis (53, 117). La

reconnaissance du PAMP dépend de sa structure. Par exemple, le LPS d’Escherichia coli

ne sera pas reconnu comme celui du P. gingivalis. De même, un LPS reconnu par le TLR2

n’activera pas les mêmes voies. Le LPS est composé de trois parties liées, le lipide A, le

noyau et l’antigène O. Le lipide A est responsable de la cytotoxicité du LPS. Il est

composé de lipopeptide diacylé ou triacylé. La longueur des ponts esters de ces chaînes

acyles peut être différente et la composition en acides aminés également. Tous ces

critères font que chaque LPS déclenchera une voie plutôt qu’une autre (127). De même,

les différents PAMPs d’un microorganisme, n’induisent pas les mêmes réponses chez

l’hôte lorsqu’ils interagissent avec le TLR2 (117).

Le TLR2 peut reconnaître des ligands endogènes et de ce fait être activé. Les Heat

Shock Proteins (HSP), le biglycane et le hyaluronane, tous deux composants de la

matrice extracellulaire, peuvent être reconnus par ce récepteur (127).

b) Les molécules adaptatrices

La reconnaissance de certains PAMPs par le TLR2 nécessite l’intervention de

molécules adaptatrices. Le CD14 est un PRR soluble ou membranaire. Le complexe formé

par le CD14 et le PAMP va activer le récepteur TLR2. Par exemple, les fimbriae de P.


61

gingivalis fixées au CD14 activent le TLR2, il en résulte une production d’IL-8. L’absence

du CD14 provoque une forte diminution de cette production (53). Le CD14 optimise la

reconnaissance de certains motifs microbiens et l’activation du TLR2. Il apparaît que la

forme membranaire du CD14 n’est pas exprimée par les kératinocytes, d’où la faiblesse

ou même l’absence de réponse à certains PAMPs (53). Le CD36 est un autre exemple de

molécule adaptatrice du TLR2, c’est un PRR de la famille des récepteurs scavengers

(reconnaissance et internalisation des microorganismes). Il est exprimé par les

kératinocytes oraux et comme le CD14, il reconnaît le lipopeptide diacylé et le LTA (127).

c) L’activation

La reconnaissance d’un microorganisme ou d’un de ses motifs entraîne

l’hétérodimérisation du TLR2 avec le TLR1 ou le TLR6 (Figure 15). La composition de ce

dimère est dépendante du ligand. Le nombre de groupement acyle du PAMP détermine la

forme de la dimérisation. Un lipide A diacylé entraînera la formation d’un dimère

TLR2/TLR6, un lipide A triacylé celle d’un dimère TLR2/TLR1. La composition en acide

aminés, la longueur des ponts diesters peuvent avoir un rôle dans le choix de

dimérisation (127). Cette discrimination explique la différence de réponse cellulaire aux

différents microorganismes.

L’activation de TLR2 entraîne le déclenchement de différentes voies, notamment la

voie des Mitogen-activated Protein (MAP) Kinases (p38 MAP Kinase, c-Jun NH2 terminal

kinase (JNK), ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase)). Cette voie régule les

facteurs de transcription AP1. La voie NF-κB et le facteur de transcription Interferon

Regulatory Factor (IRF) 5 peuvent être également activées (89). Toutes ces différentes

voies de signalisation sont dépendantes du facteur MyD88 (134).

d) Expression au niveau gingival

L’expression de ce récepteur dans l’épithélium gingival est variable. Il est exprimé

dans les tissus sains et enflammés. Cependant sa localisation en surface cellulaire,

proche de l’interaction hôte/microorganisme est plus visible lorsque l’épithélium est

enflammé. Les kératinocytes gingivaux expriment les transcrits et le récepteur. Son

expression n’est pas seulement membranaire, elle peut être intracellulaire (171).

3) TLR4

a) Les ligands


62

Ce récepteur est impliqué dans la reconnaissance du LPS, il est donc spécifique des

bactéries à Gram négatif. Comme le TLR2, il reconnaît des molécules endogènes comme

les HSPs, le biglycane, le hyaluronane (127). Ce récepteur est activé par les LPS de F.

nucleatum et de A. actinomicetemcomittans (117).

b) Les molécules adaptatrices

Comme pour le TLR2, une signalisation fonctionnelle via le TLR4 est synonyme de

collaboration avec d’autres molécules. Le LPS-Binding Protein (LBP), le MD2 et le CD14

font partie de ces adaptateurs (142). Le LBP soluble et le CD14 (soluble ou

membranaire) se lient au LPS. Ces molécules transfèrent et lient le LPS au complexe

TLR4/MD2. Cette liaison provoque l’oligomérisation du complexe avec un second

complexe TLR4/MD2, déclenchant la signalisation cellulaire. Certains LPS (P. gingivalis,

C. Ochracea) sont des antagonistes de TLR4 et empêchent son activation. Ils inhibent

l’action d’autres LPS qui normalement sont reconnus par le TLR4 et l’activent (196). Ils

se fixent au complexe et empêchent ce dernier de former un dimère (127). Comme le

TLR2, le TLR4 est lui aussi capable de discriminer des PAMPs. Le complexe TLR4/MD2 est

capable d’être activé par le LPS sans le concours du LBP et du CD14, la réponse sera plus

faible car les voies de signalisation utilisées sont différentes (127).

c) Activation

En terme de déclenchement de la signalisation cellulaire, TLR4 est beaucoup plus

complexe que TLR2. La reconnaissance d’un PAMP par le TLR4 peut déclencher deux

voies d’activation principales, la voie MyD88-dépendante et la voie MyD88-indépendante

(Figure 15). La première voie de signalisation active la voie des MAP Kinases (p38 et

JNK) et la voie NF-κB. La seconde, utilise le facteur TRAM. Elle active les facteurs de

transcription IRF3, IRF7, ceux de NF-κB et de l’apoptose (134). L’utilisation du CD14 et

du LBP induit une activation passant par une voie MyD88 indépendante. En absence de

ces deux molécules adaptatrices, l’activation empruntera une voie MyD88-dépendante

(127).

d) Expression au niveau gingival

Tout comme TLR2, il est exprimé dans l’épithélium gingival de manière variable,

dans les tissus sains et enflammés. Il est également localisé en surface cellulaire lors de

l’inflammation. En culture in vitro, les kératinocytes gingivaux expriment les transcrits et

le récepteur. Son expression est membranaire mais contrairement à TLR2, elle est faible

au niveau intracellulaire (171).


63

Il peut y avoir des modulations entre différents PRRs. TLR2, TLR4 et NOD2,

interagissent entre eux, TLR2 et NOD2 agissent en synergie et augmentent la synthèse

d’IL10, de TNFα et d’IL-1ß (174). Au contraire NOD2 inhiberait la production d’IL-12

engendrée par l’activation de TLR2 (190).

III) Les Peptides Antimicrobiens

A) La cathélicidine LL-37

1) Généralités

Les cathélicidines sont une famille de peptides antimicrobiens cationiques que l’on

retrouve chez les mammifères. Elles sont constituées de trois domaines distincts, la

partie NH2-terminale constituée par le peptide signal (20 à 30 acides aminés), le

domaine cathelin-like (94 à 114 acides aminés) et le domaine antimicrobien COOH-

terminal (Figure 16) (194).

A ce jour, il n’en existe qu’une seule chez l’humain nommée LL-37/hCAP18 (human

Cationic Peptide 18 (18 kDa)). Elle a une structure en hélice α. LL-37 est le domaine

antimicrobien constitué de 37 acides aminés. Il comprend deux résidus leucine en NH2-

terminal et a un poids moléculaire d’environ 4,5 kDa (38).

Les cathélicidines sont en général stockées sous une forme inactive comprenant le

domaine cathelin-like et le domaine antimicrobien. Elles sont ensuite maturées durant ou

après leur sécrétion par des protéases spécifiques qui peuvent être l’élastase ou la

protéinase 3. Le domaine antimicrobien LL-37 COOH-terminal est alors clivé et libéré

sous forme active (51, 160, 194).

La cathélicidine est exprimée par de nombreuses cellules épithéliales, les

kératinocytes, mais aussi par les monocytes, les cellules NK, les LB. Au niveau de la

cavité buccale, LL-37 est retrouvée dans les kératinocytes, le fluide gingival et la salive

(35). L’expression de la cathélicidine est induite par des stimuli pro-inflammatoires et

lors de la cicatrisation (44, 160). Des facteurs de croissance impliqués dans la

cicatrisation comme l’Insulin Growth Factor (IGF) -I par exemple induisent également

son expression (167).

2) Propriétés


64

C’est tout d’abord un peptide antimicrobien à large spectre d’activité. Les bactéries

parodontale F. nucleatum et A. actinomycetemcomitans y sont sensibles, à l’inverse de P.

gingivalis, S. sanguinis et les levures Candida (64). Par ailleurs, il a été montré que les

espèces se développant au niveau de blessures, telles que les streptocoques de type A, y

étaient sensibles (44). LL-37 se lie et neutralise le LPS des bactéries empêchant une

stimulation trop forte des cellules comme les macrophages et ainsi un choc

endotoxémique provoqué par une réponse trop forte de ces macrophages (82 567, 130,

160). Le domaine cathelin-like de hCAP18 confère des propriétés antiprotéasiques à ce

peptide inhibant la croissance bactérienne et limitant les dommages tissulaires (197)

De plus, LL-37 stimule la libération de médiateurs de l’inflammation comme l’IL-8,

le MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein 1), l’IL-1ß et le TNFα (51, 129, 160).

L’implication de ce peptide dans les processus de cicatrisation a par ailleurs été

démontrée (72, 167). LL-37 induit l’angiogénèse et l’artériogénèse par l’intermédiaire

d’un récepteur le Formyl Peptide Receptor-Like 1 (FPRL1) se trouvant sur les cellules

endothéliales (96).

Par ailleurs, la cathélicidine est une interface entre l’immunité innée et l’immunité

acquise puisqu’elle recrute par chimiotactisme (via FPRL1), les monocytes, les

neutrophiles et les LT (38).

B) ß-défensines

Les ß-défensines sont des peptides antimicrobiens. Plus d’une vingtaine ont été

mises en évidence au niveau génomique, mais trois ont été étudiées plus en détail.

HßD1, hßD2 et hßD3 sont exprimées dans la plupart des épithéliums humains (35). Leur

gène se trouve sur le chromosome 8 locus Pr-23. Elles sont transcrites et traduites en

une préprodéfensine qui subira une maturation et donnera le peptide fonctionnel (Figure

18) (194).Ces peptides cationiques d’environ 4 à 5 kDa, présentes une structure en triple

feuillet ß, due à la présence de six résidus cystéine à l’origine de trois ponts disulfure

(Figure 17) (131).

Leur activité antimicrobienne provient de leur charge positive (due à une forte

proportion en acides aminés basiques) et de leur capacité à s’agréger à la membrane du

microorganisme formant ainsi des pores. La formation de ces pores crée ainsi des

déséquilibres ioniques menant à un choc osmotique (42, 87). Leur spectre d’activité est

large puisqu’elles ont pour cibles les bactéries à Gram négatif et positif, les levures et les

virus.

En ce qui concerne la cavité buccale, hßD1, hßD2 et hßD3 sont retrouvées dans les

épithéliums gingivaux, la salive et le fluide gingivo-dentaire (36). Ces peptides sont


65

exprimés dans le cas d’inflammation et de carcinomes oraux (1). Alors qu’hßD1 est

produite de manière constitutive par les kératinocytes, les deux autres sont inductibles

par des cytokines pro-inflammatoires et des motifs bactériens (LPS) (35). En plus de leur

activité antimicrobienne directe, toutes les deux présentent des propriétés de

chimiotactisme et d’activation de cellules de l’immunité.

1) HßD2

HßD2 a été découverte et isolée à partir de squames provenant de lésions dues au

psoriasis (46). C’est le premier peptide antimicrobien inductible identifié chez l’homme.

a) Généralités

HßD2 est localisée dans les couches supérieures de l’épithélium, son expression

augmente avec le niveau de différenciation cellulaire (87, 101). L’expression d’hßD2 n’est

retrouvée ni dans l’épithélium jonctionnel très peu différencié ni au niveau du tissu

conjonctif (122).

Contrairement aux épithéliums cutanés ou trachéaux, la gencive saine non

enflammée et d’autres compartiments de la cavité buccale expriment hßD2 (114).

Cependant, ce niveau basal n’est pas accompagnée de l’expression de marqueurs de

l’inflammation comme l’IL-8. Au niveau gingival, cela caractérise une fonction barrière

normale, l’hypothèse étant que l’interaction des bactéries commensales avec le tissu

gingival augmenterait la production d’hßD2, permettant ainsi de se protéger des

bactéries potentiellement pathogènes (35).

Au plan cellulaire, hßD2 est exprimée dans le cytoplasme et stockée dans les corps

lamellaires des kératinocytes des couches épineuses. Dans les kératinocytes gingivaux

normaux, on le retrouve sous forme de « points » en région périnucléaire ce qui suggère

une localisation au niveau de l’appareil de Golgi et dans le réticulum endoplasmique pour

une sécrétion ultérieure typique d’un produit sécrété avec un peptide signal (103).

Chez les sujets sains, les ARNm d’hßD2 sont plus fortement exprimés dans la

couche épineuse de l’épithélium gingival quand le peptide est détecté dans la partie

supérieure de cette même couche épineuse et dans les couches granuleuse et cornée. La

plus forte expression est localisée à la marge gingivale, à proximité de la plaque dentaire

(35). Les cellules de la couche basale expriment quand même modérément hßD2 ce qui

montre que le niveau de différenciation n’est pas le seul paramètre impliqué dans la

régulation de cette défensine. Des cytokines proinflammatoires comme le TNFα, l’IL-1ß

sont également impliquées dans la régulation de son expression (35, 114).


66

Chez les sujets atteints de parodontite, la localisation du peptide est identique.

L’expression d’hßD2 est plus forte dans l’épithélium d’un sujet sain que dans l’épithélium

sain d’un sujet atteint de parodontite. La constante interaction du tissu sain avec des

bactéries commensales et la prédisposition de certains individus à la maladie parodontale

expliquerait ce phénomène. Les derniers exprimeraient moins hßD2 (114).

Des études portant sur un nombre de sujets assez restreint ont montré que

l’expression génique d’hßD2 et la maladie parodontale étaient liées (14, 42).

Pour la première étude, l’expression des ARNm d’hßD2 est plus élevée chez les

sujets sains que chez les sujets malades (14). D’après les auteurs, la différence

d’expression entre les deux tissus pourrait provenir des cytokines présentes également

dans les tissus sains (167), et également de la dégradation des ß-défensines par des

protéases de l’hôte (175).

Pour la deuxième étude, l’expression des messagers d’hßD2 ne varie pas entre

chaque état inflammatoire (gencive saine, gingivite, parodontite), la variation est

significative quand on compare hßD2 et hßD3. Chez les sujets sains, l’expression relative

de ces deux peptides n’est pas significativement différente. Par contre dans le cas de la

gingivite, l’expression d’hßD2 est significativement plus élevée que celle d’hßD3. Dans le

cas des parodontites, l’expression des peptides n’est plus significativement différente

(42).

HßD2 n’est pas exprimée dans l’épithélium jonctionnel mais dans le cas de la

parodontite, on le retrouve dans l’épithélium des poches (114). Ceci montre que ces

deux épithéliums ont des activités différentes. Les populations bactériennes interagissant

avec ces deux types de tissus ne sont pas les mêmes (commensales et pathogènes).

Elles ne régulent pas l’immunité innée locale de la même manière (114).

Ces différentes études montrent que l’expression d’hßD2 est dépendante de l’état

pathologique de la gencive mais également de la variabilité biologique individuelle.

b) Régulation

L’expression d’hßD2 peut être régulée par différentes voies de signalisation. La

région promotrice du gène possède des sites potentiels de liaison pour des facteurs de

transcription de la voie NF-κB mais également AP1, AP2, NF-IL-6 et du Signal Transducer

and Activation of Transcription 1 (STAT1) (Figure 19) (2, 194).

L’expression d’hßD2 est induite par les bactéries et par leurs PAMPs. Sa régulation

est fonction de chaque microorganisme. En règle générale, les bactéries commensales

induisent cette défensine par l’intermédiaire des voies MAP kinases et d’une voie calcium-

dépendante (101). Par exemple, il a été montré que la bactérie orale commensale

Streptococcus gordonii induit hßD2 par l’intermédiaire de la voie MAP Kinases (29). Les

bactéries pathogènes comme P. gingivalis ou A. actinomycetemcomitans induisent ce


67

peptide par l’intermédiaire des voies MAP Kinases et NF-κB (28, 43). Les bactéries

pathogènes et les protéases qu’elles émettent (gingipaines de P. gingivalis) sont aussi

impliquées dans la modulation de ce peptide (43, 103, 124, 137). Cette induction par les

gingipaines de P. gingivalis passe par le récepteur appelé Proteinase-activated receptor 2

(PAR2) (43). Les protéases clivent la partie extracellulaire N-terminale de ce récepteur

libérant ainsi un ligand qui se liera à une partie conservée de ce même récepteur et

induira l’activation de la voie des MAP kinases (ERK1/2) (30).

L’expression d’hßD2 est induite par des extraits de paroi de F. nucleatum par le

biais la voie MAP Kinases et des facteurs de transcription d’AP1. L’utilisation d’inhibiteurs

de la voie NF-κB n’inhibe pas l’expression du peptide après exposition des cellules aux

extraits. Ce sont en fait les voies des p38 kinase et JNK kinase qui sont impliquées (102).

Des extraits de paroi externe d’A. actinomycetemcomitans induisent l’expression de cette

ß-défensine en se liant à la fibronectine exprimée par les kératinocytes. L’activation de la

voie MAP Kinase induit directement hßD2 mais également des cytokines (TNFα et IL-8)

qui induisent secondairement l’expression du peptide (137).

L’expression d’hßD2 est également induite par des PAMPs tel que le LPS, l’acide

lipoteichoïque (LTA), les lipopeptides Pam3CSSNA et FSL1 (synthétiques), le lipide A et le

MDP. Le mécanisme d’induction de l’expression d’hßD2 par les PAMPs est complexe. Ils

se lient aux PRRs membranaires comme les TLRs ou intracellulaires comme les

récepteurs NOD. Le LTA, reconnu par le récepteur TLR2 active la voie des MAP Kinases

(phosphorylation de p38) et la voie NF-κB (124). Des ligands spécifiques comme le

lipopeptide Pam3CSSNA, le lipide A et le MDP sont reconnus par le TLR2, le TLR4 et

NOD2 respectivement, entraînant la production d’hßD2 par les kératinocytes gingivaux

(171, 183).

L’expression d’hßD2 est induite par des cytokines comme le TNFα et l’IFNγ (réponse

Th1). Il a été montré au contraire que, des cytokines de la réponse Th2 comme IL-4 et

IL-13 inhibent la production d’hßD2 après une stimulation au TNF-α ou à l’IFNγ dans des

kératinocytes cutanés (2). La signalisation utilisée par le TNF-α et à l’IFNγ est la voie NF-

κB et la voie Janus Tyrosine Kinases (JAK). Dans ce cas, plusieurs acteurs inhibent la

voie JAK/STAT. Les deux interleukines IL-4 et IL-13 activent STAT6 (autre acteur de

cette voie de signalisation) qui empêche la liaison de NF-κB à son site sur le promoteur.

D’autre part, ce facteur, une fois activé induit et active deux autres acteurs, SOCS1 et

SOCS3 (Suppressor Of Cell Signalling 1 et 3) inhibant la voie STAT1 et par conséquent,

l’expression génique d’hßD2 induite par le TNFα et l’IFNγ (Figure 20) (2).

Le phorbol myristate acétate (PMA) régule l’expression d’hßD2 par la voie NF-κB et

par celle des MAP Kinases via la voie p44/42-ERK kinase (102).


68

Ceci montre que la régulation d’hßD2 est très complexe et qu’elle passe par

plusieurs voies. Le niveau d’induction de l’expression du peptide dépend de chaque

stimulus.

c) L’activité antimicrobienne

HßD2 a un fort potentiel antifongique, une activité antimicrobienne essentiellement

dirigée contre les bactéries à Gram négatif et il n’a pas d’effet contre certaines bactéries

à Gram positif comme Staphylococcus aureus et est seulement bactériostatique contre

d’autres comme Streptococcus pyogenes. En ce qui concerne la microflore buccale, hßD2

possède une activité antimicrobienne contre les bactéries aérobies à Gram positif (87).

HßD2 a une forte activité antimicrobienne face à Streptococcus sanguinis,

Actinomyces naeslundi, Actinomyces israelii, colonisateurs précoces des tissus gingivaux

lorsqu’ils sont sous forme planctonique (87). Une destruction de l’environnement

interromprait la colonisation et le développement du biofilm. Ceci empêcherait la

colonisation tardive par F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans et P. gingivalis.

Certaines bactéries de la cavité buccale, pathogènes anaérobies sont résistantes

aux ß-défensines. Cette résistance viendrait de la modification ou de l’absence des cibles

des peptides antimicrobiens sur les bactéries en question. HßD2 se lie faiblement à T.

denticola parce qu’il ne possède pas de LPS traditionnel. Ce déficit de liaison est corrélé à

la résistance de cette bactérie vis-à-vis d’hßD2 (21). La variabilité du LPS d’une souche à

l’autre dans une même espèce expliquerait la différence de résistance ou de vulnérabilité

face à hßD2 (87).

Un autre moyen de défense est la production par la bactérie d’une grande variété

d’enzymes protéolytiques pouvant contribuer à dégrader et à inactiver les peptides. C’est

le cas des gingipaines sécrétées par P. gingivalis

d) Lien immunité innée et acquise

Outre sa fonction antimicrobienne, hßD2 s’est révélée être un agent chimio-

attracteur (194). En attirant des cellules de l’immunité comme les cellules dendritiques

immatures, les mastocytes, les LT CD4/CD45RO (mémoires) et les LT CD8 cytotoxiques

vers les sites infectés et enflammés, il fait le lien entre l’immunité innée et l’immunité

acquise (122). Cette attraction se fait par l’intermédiaire du récepteur à chimiokine (C-C

motif) receptor 6 (CCR6) couplé à une protéine G. HßD2 et la chimiokine « CC-

Chemokine Ligand 20 » (CCL20) possèdent des régions analogues. Le récepteur CCR6

présent sur ces cellules immunitaires est également celui de CCL20 (43, 195).


69

HßD2 peut activer les mastocytes et provoquer leur dégranulation. Les cellules

libèrent ainsi des molécules allergisantes comme l’histamine ou la prostaglandine D2

(122). Cette libération de substances va à son tour attirer des phagocytes vers le lieu

d’activation des mastocytes. HßD2 est ici indirectement impliqué dans le recrutement de

ces autres cellules (194).

HßD2 active également les kératinocytes puisqu’il induit l’expression génique et la

production de cytokines et chimiokines modulant l’inflammation IL-6, IL-10, IP-10, MCP-

1 MIP-3α et RANTES, par l’intermédiaire de récepteurs couplés aux protéines G et de la

voie PLC. Ce peptide induit également l’expression génique d’IL-18 (131).

Une autre propriété de ce peptide est l’induction de la migration et la prolifération

kératinocytaire par l’intermédiaire de la phosphorylation de l’EGFR, de STAT1 et STAT3.

Ces trois éléments sont impliqués dans la migration et la prolifération cellulaires et donc

dans la cicatrisation et la régénération épithéliale (131).

2) HßD3

La ß-défensine hßD3 a également été isolée à partir de squames de lésions

psoriatiques. Dans ces lésions, l’expression génique d’hßD3 est multipliée 10 à 30 fois en

comparaison à un épithélium sain (69).

a) Localisation

Les transcrits d’hßD3 sont localisés dans les couches basales et suprabasales de

l’épithélium, quel que soit l’état pathologique de la gencive, (115). Leur expression est

plus élevée dans les tissus provenant de sujets sains (14). D’autres études plus récentes

ont montré qu’il n’y avait pas de différence d’expression entre le tissu sain et le tissu

pathologique (42, 115).

HßD3 est exprimée dans la plupart des tissus épithéliaux gingivaux sains mais

également au niveau de l’épithélium pathologique, l’épithélium de poche et de

l’épithélium cliniquement sain entourant cette poche. Elle a une localisation

cytoplasmique (115). Elle n’est pas exprimée dans le tissu conjonctif sous-jacent.

L’étude de Lu et coll. a également montré des différences de localisation du peptide

entre le tissu sain, le tissu sain provenant d’un individu atteint de parodontite et le tissu

de poche (115). Chez les individus sains, contrairement à hßD2, hßD3 est plus exprimée

dans les couches basales que dans les couches épineuses superficielles. Chez les sujets

atteints de parodontite, la localisation d’hßD3 dans l’épithélium sain est étendue de la

couche basale aux cellules profondes de la couche épineuse. En ce qui concerne


70

l’épithélium de poche et de l’épithélium cliniquement sain entourant cette poche, ce

peptide est retrouvé jusque dans les cellules superficielles de la couche épineuse (115).

Les études faites sur les transcrits d’hßD3 ont montré des différences de

localisation de ces derniers. La variabilité individuelle est apparemment très présente, ce

qui rend l’analyse des résultats assez difficile. Ceci montre également les différences de

réponse de chaque individu face à la maladie, au départ face à la plaque dentaire.

En plus des kératinocytes, L’épithélium gingival contient des cellules dendritiques

(cellules de Langerhans), des cellules de Merkel, neuro-endocrines (exprimant des

marqueurs neuronaux comme les neuropeptides) et des mélanocytes. Ces cellules

impliquées dans l’immunité innée expriment également hßD3. (46, 115).

Les localisations d’hßD3 différentes et d’hßD2 impliquent que ces ß-défensines se

complètent et agissent de concert pour améliorer la défense de l’hôte (115).

b) Régulation

HßD3 est régulée par différentes voies, cette régulation est beaucoup moins bien

connue que celle d’hßD2. Sur son promoteur, se trouvent des sites de liaison des

facteurs de transcription d’AP1, de l’élément de réponse à l’IFNγ, de NF-IL-6 et de STAT1.

Les sites de liaison de facteurs de transcription de la voie NF-κB n’auraient pas été

retrouvés alors que cette voie serait impliquée dans la régulation d’hßD3 (2, 124).

L’expression d’hßD3 est induite par les bactéries et par leurs PAMPs. Sa régulation

est fonction de chaque microorganisme. La modulation de cette ß-défensine par la

microflore buccale n’a pas été étudiée en détail. De même les relations entre induction de

l’expression d’hßD3 et PRRs sont encore mal connues

Il a été montré que lors d’une infection avec Helicobacter pylori, hßD3 était induite

par l’intermédiaire des deux voies MAP kinases, ERK et JNK. La voie ERK est activée par

l’intermédiaire du récepteur à l’EGF (Epidermal Growth Factor). Il a également été

montré que la régulation d’hßD2 par cette même bactérie, n’utilisait pas les mêmes

voies. HßD2 est induit après activation de la voie NF-κB par l’intermédiaire du PRR NOD1

et de la voie JNK (18).

L’expression d’hßD3 est induite par Staphyloccus aureus après activation du TLR2

par cette bactérie (155).

Une autre étude a montré que le LTA reconnu par le TLR2, activait les voies MAP

Kinases (p38 et JNK MAPK) et NF-κB, et induisait ainsi l’expression d’hßD3 (124)

Comme il a été décrit précédemment pour hßD2, une stimulation par le TNFα ou

l’IFNγ induit l’expression de ce peptide par le biais de la voie NF-κB et STAT1 (2, 133).

Elle est inhibée par les interleukines IL4 et IL13 (Figure 20) (2).

c) Activité antimicrobienne


71

Son activité antimicrobienne est plus forte et son spectre d’action est plus large que

ceux d’hßD2. Ces différences pourraient être dues à une charge cationique plus forte

mais également à la possibilité pour ce peptide de se dimériser (87). Contrairement à

hßD2, hßD3 est bactéricide vis-à-vis de S. aureus. Les bactéries à Gram négatif et à

Gram positif y sont plus sensibles même à faible concentration (69, 138).

Les propriétés antimicrobiennes de ce peptide cationique ne proviennent pas

uniquement de ses capacités de liaison aux charges négatives de la paroi bactérienne, un

autre système doit être mis en place (87).

Il a été montré que les deux ß-défensines n’avaient pas les mêmes cibles. En effet,

la mutation une protéine membranaire de Haemophilus influenzae le lipooligosaccharide

entraîne une forte baisse du pouvoir antimicrobien d’hßD2 et aucun changement pour

hßD3 (168).

Comme pour hßD2, certaines bactéries sont moins sensibles que d’autres à hßD3.

Cette résistance peut provenir de protéases produites par les bactéries, de propriétés

spécifiques de leur paroi externe comme la modification de leur LPS, de T. denticola. Par

ailleurs, pour résister à hßD3, cette bactérie utilise des pompes membranaires qui lui

permettent de rejeter les peptides entrés dans son cytoplasme (21).

d) Lien immunité innée et acquise

Comme hßD2, hßD3 possède des propriétés chimiotactiques spécifiques. Ainsi, elle

attire monocytes/macrophages, LT CD4/CD45RA et cellules dendritiques immatures sur

les sites enflammés ou infectés. Ce pouvoir d’attraction a lieu grâce au récepteur à

cytokines CCR6. Cependant il a été suggéré qu’un autre récepteur pourrait intervenir car

les monocytes n’expriment pas de CCR6 fonctionnel en leur surface (57, 194).

TRAVAIL EXPERIMENTAL

72

TRAVAIL EXPERIMENTAL

TRAVAIL EXPERIMENTAL_1ERE PARTIE

73

CHAPITRE I : ÉTUDE ET MISE AU POINT DE MODELES

CELLULAIRES ET TISSULAIRES


74

A) Introduction

1) Problématique de l’étude

L’épithélium gingival constitue une barrière physique, chimique et immunologique

protégeant les tissus sous-jacents des agressions extérieures. Il est constamment exposé

à une grande variété de microorganismes. Ces derniers forment avec l’épithélium un

écosystème dont l’équilibre est fragile. De récentes études ont montré que le maintien de

cette homéostasie gingivale résultait en partie de la réponse de l’hôte et plus

précisément de l’immunité innée mise en place au niveau de cet épithélium. La sécrétion

de peptides antimicrobiens cationiques à large spectre d’activité ainsi que la réponse

inflammatoire contrôlée font partie intégrante de cette réponse de l’hôte.

L’étude de la régulation de la réponse de l’hôte au niveau épithélial et l’évaluation

de principes actifs impliqués dans cette modulation nécessitent l’emploi de modèles aussi

proches que possible de l’in vivo permettant d’obtenir des résultats fiables et

reproductibles.

2) Objectifs de l’étude

Les objectifs de cette première partie ont été de caractériser et de valider différents

modèles d’étude tissulaires et cellulaires afin de pouvoir évaluer et analyser la réponse

de l’hôte au niveau de l’épithélium gingival, en particulier la modulation de l’expression

des peptides antimicrobiens et de la réponse inflammatoire.

Ces modèles ont été sélectionnés afin de se rapprocher le plus possible des

conditions physiologiques gingivales, notamment en terme de différenciation tissulaire,

tout en maîtrisant les problèmes de variabilité biologique individuelle. De même, ils ont

été choisis pour leur facilité et leur rapidité de mise en œuvre. La reproductibilité des

résultats a également été prise en compte.

Une fois mis en place, ces modèles ont servi à l’évaluation de principes actifs, en

particulier un actif de la famille des Alkyls Poly-Glucosides (26). L’évaluation de cet actif

a été réalisée en terme de capacité à moduler l’expression génique et protéique, des ß-

défensines d’une part, hßD2 et hßD3, et de l’IL-8 d’autre part, dans les modèles

cellulaires et tissulaires mis en place.


75

3) Déroulement de l’étude

Dans un premier temps, nous nous sommes proposés d’utiliser un modèle

d’épithélium reconstruit. Mais avant de pouvoir l’employer, sa caractérisation et sa

fonctionnalité ont été étudiées. Pour ce faire, nous l’avons comparé à l’épithélium

gingival natif en terme d’expression et de localisation de marqueurs de la différenciation

cellulaire, protéique et lipidique et de marqueurs de la cohésion épithéliale, les jonctions

serrées. Tous ces acteurs moléculaires sont autant d’éléments d’une barrière épithéliale

intègre et efficace. Une fois cette étape achevée, nous avons étudié la fonctionnalité de

cet équivalent reconstruit en terme de réponse de l’hôte et plus précisément, de

modulation d’expression de peptides antimicrobiens et de l’IL-8, acteurs importants de

l’immunité innée gingivale.

Dans un deuxième temps, nous avons mis au point et optimisé la culture de

kératinocytes gingivaux normaux à partir d’explants provenant d’actes chirurgicaux

effectués à la faculté de chirurgie dentaire et chez des praticiens.

Dans un troisième temps, deux lignées cellulaires orales ont été évaluées.

L’expression des ß-défensines a été étudiée dans les lignées KB et Ca9-22.

Pour finir, les modèles testés et validés ont été utilisés comme outils pour évaluer

la capacité d’actifs, en particulier les Alkyls Poly-Glucosides (APGs), à réguler l’expression

des ß-défensines (ARNms et peptides). Leur effet sur la réponse inflammatoire épithéliale

a parallèlement été étudié.

B) Étude de la modulation de peptides antimicrobiens

dans un épithélium gingival reconstruit différencié

1) Contexte de l’étude

L’étude de la réponse immune innée a tout d’abord débuté par l’utilisation

d’explants gingivaux provenant d’actes de chirurgie dentaire. Mais ce modèle a montré

certaines limites en évidence comme celle de la variabilité biologique. Les prélèvements

des explants sont de 2 origines : ils proviennent

soit d’interventions implantaires, auquel cas nous pouvons considérer qu’il

s’agit de muqueuse normale, sachant que l’appréciation de cet état non inflammatoire

est purement clinique;

soit de la chirurgie parodontale (lambeau d’assainissement) ; dans ce cas, il

s’agit d’une muqueuse qui présentait une inflammation dans le cadre d’une parodontite

de l’adulte, mais le traitement étiologique a contribué à réduire l’inflammation pour


76

permettre ce traitement chirurgical symptomatique. Ceci veut dire qu’il est très difficile

d’apprécier exactement cette réduction, même en utilisant des indices (gingival index)

dont le relevé garde une part de subjectivité.

En résumé, outre les variations individuelles qui sont vraisemblables, la variabilité

est aussi imputable au degré d’inflammation résiduelle difficilement appréciable

concernant surtout les prélèvements provenant de la chirurgie parodontale.

L’autre problème rencontré est d’ordre technique. En effet, la taille des biopsies ne

permet pas de mener des expérimentations par traitement topique. D’un côté, les

biopsies sont intéressantes à utiliser pour comparer l’expression de différents marqueurs

de tissus sains et pathologiques, d’un autre coté, elles sont difficiles à employer pour

réaliser des expérimentations in vitro. Le développement de cette étude n’aurait pas pu

se faire sans la collaboration de dentistes praticiens et hospitaliers.

2) Méthodes et résultats

Pour effectuer cette étude, nous avons comparé le niveau de différenciation

d’explants gingivaux natifs et d’épithéliums reconstruits ainsi que la modulation de

l’expression des peptides antimicrobiens hßD2, hßD3 et LL-37 après stimulation par des

PAMPs ou des cytokines pro-inflammatoires. Les explants sont des prélèvements

gingivaux obtenus après opération chirurgicale. En effet, ils peuvent provenir de chirurgie

implantaire ou de chirurgie parodontale incluant la chirurgie pré-prothétique et la

chirurgie d’assainissement. L’épithélium gingival reconstruit est produit par les

laboratoires Skinethic (Nice).

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’expression et la

localisation de marqueurs de prolifération cellulaire et de marqueurs de différenciation

protéique et lipidique.

Nous avons ensuite étudié l’expression de protéines des jonctions serrées ou « tight

junctions » dans les deux épithéliums.

En dernier lieu, nous nous sommes intéressés à la modulation de l’expression des

peptides antimicrobiens hßD2, hßD3 et LL-37 après stimulation des épithéliums par

différentes cytokines pro-inflammatoires et par le LPS. Pour effectuer ces études, des

méthodes de PCR quantitative en temps réel (qPCR) et d’immuno-histochimie ont été

utilisées.

Les résultats montrent que le modèle reconstruit, constitué à partir d’un pool de

kératinocytes gingivaux normaux, exprime différents marqueurs de prolifération, de

différenciation et des jonctions serrés. Leur expression et leur localisation sont proches

de celles du tissu gingival natif. Les deux tissus expriment les peptides antimicrobiens


77

hßD2, hßD3 et LL-37. Leur expression peut être modulée par des cytokines pro-

inflammatoires (IFNγ, IL-1ß, TNFα)et des PAMPs (LPS).

L’ensemble des résultats de cette première étude est développé dans la

publication : « Antimicrobial peptide modulation in a differentiated reconstructed

gingival epithelium » (Cell Tissue Res, 2007 Jan 10, 328:85-95).


78

3) Discussion

Le but de cette étude a été de caractériser le niveau de différenciation d’un modèle

reconstruit et de l’évaluer en tant qu’outil fonctionnel pour l’étude in vitro de la réponse

immune innée gingivale.

L’utilisation de biopsies de gencives comporte plusieurs inconvénients. Vue leur

faible dimension, elles ne sont pas utilisables pour réaliser des études utilisant des

stimulations topiques. La volonté d’obtenir une certaine reproductibilité lors des études in

vitro soulève un autre problème. Les explants présentent des phénomènes de variabilité

biologique individuelle influençant de manière significative l’immunité innée (55). Elle

peut provenir de l’environnement buccal et du profil inflammatoire de la gencive (biopsie

provenant de chirurgie implantaire, d’assainissement ou pré-prothétique). Il a été montré

dans la littérature que l’expression des peptides antimicrobiens était régulée par

l’environnement microbiologique propre à chaque individu (3).

Nous avons donc étudié les caractéristiques d’un modèle tissulaire reconstruit

produit à partir d’un pool de kératinocytes gingivaux normaux de plusieurs donneurs.

Nous avons vérifié que cet épithélium n’exprimait pas la cytokératine 19, présente

uniquement dans les épithéliums simples non kératinisés tels que l’épithélium alvéolaire

(147, 182).

L’état de différenciation tissulaire et le niveau d’expression des ß-défensines sont

étroitement liés (24, 36). C’est pourquoi nous avons étudié et comparé les

caractéristiques morphologiques et biochimiques du tissu reconstruit à celles d’explants

gingivaux provenant de sujets sains.

Le modèle reconstruit est formé de quatre couches distinctes retrouvées également

dans l’épithélium gingival natif (147). Il s’agit des couches basale, épineuse granuleuse

et cornée. Nous avons montré que, dans ce modèle, les cellules étaient capables d’une

part de proliférer et d’autre part de se différencier jusqu’à atteindre avec une

différenciation terminale complète. Ainsi, l’expression de Ki67, marqueur de prolifération

présent dans les cellules en phase G1, S, G2 et en mitose et absent dans les cellules en

phase G0, est similaire dans les deux tissus. De même, K6, cytokératine présente dans

les cellules activées en prolifération (56) et K14 présente dans les couches basales de

l’épithélium (68), sont localisées dans l’épithélium reconstruit comme dans le tissu natif.

Les observations en immuno-histochimie et le profil d’expression des transcrits des

marqueurs de la différenciation montrent que le modèle est capable d’exprimer les

acteurs protéiques d’une barrière épithéliale gingivale fonctionnelle. Lors de notre

analyse sur tissu natif et tissu reconstruit, nous avons pu observer que la cytokératine

K13 était exprimée, mais localisée de manière irrégulière. Ce marqueur de différenciation

des épithéliums non kératinisés peut également être exprimé et localisé de cette façon


79

dans l’épithélium du palais dur et de la gencive (111). La cytokératine K10 est retrouvée

dans les couches suprabasales différenciées et absente des couches basales du tissu natif

et du modèle reconstruit. Ce type de localisation est retrouvée pour ce marqueur précoce

de la différenciation protéique des kératinocytes gingivaux (63). Les localisations

immunologiques de la filaggrine et de l’involucrine dans le tissu reconstruit sont en

corrélation avec la kératinisation (163). La TgI est impliquée dans l’assemblage et la

stabilisation de protéines solubles comme l’involucrine par des liaisons covalentes pour

former la couche cornée (173). Elle est également retrouvée dans le modèle.

Parallèlement, le programme de la différenciation terminale aboutit à une

réorganisation complète de la composition lipidique des kératinocytes dans le but de

fournir une barrière épithéliale fonctionnelle (90). Pour contrôler et comparer cette

différenciation au niveau lipidique dans le modèle reconstruit et natif, nous avons analysé

l’expression des transporteurs lipidiques ABCA7, E-FABP et FATP4. Ces acteurs,

respectivement impliqués dans la régulation de l’homéostasie cellulaire des céramides,

dans le transport des acides gras et dans la translocation du cholestérol (90), présentent

des profils d’expression proches de ceux du tissu natif. De même, la sphingolipide ∆4

désaturase (hDES2), une des enzymes de la régulation de la synthèse des céramides

(128), est exprimée dans les deux types de tissus.

Dans des modèles de tissus reconstruits précédemment décrits, les kératinocytes

étaient cultivés soit sur une matrice de collagène contenant des fibroblastes (39, 111,

182) soit sur des dermes provenant de cadavre (83). Le modèle Skinethic est obtenu

après sept jours de culture dans du milieu sans sérum sur une membrane de

polycarbonate. Les données obtenues sur ce modèle nous prouvent qu’il est

correctement différencié et que la reproductibilité de sa production est de niveau

satisfaisant. De plus, ceci témoigne du potentiel de renouvellement tissulaire de ce

modèle reconstruit qui, associé à une différenciation proche de la physiologie, sont

garants d’une partie de l’homéostasie tissulaire.

La claudine-I et l’occludine, protéines des jonctions serrées, sont également

exprimées dans ce modèle. Elles sont impliquées dans la formation de la barrière

paracellulaire épithéliale séparant la lumière des cavités corporelles du reste du corps

(20, 105). La localisation du marquage de ces protéines est similaire dans les deux

tissus, démontrant ainsi que les éléments constitutifs des jonctions serrées sont

correctement exprimés.

Les tissus de la cavité orale présentent des structures (kératinisés ou non) et des

fonctions différentes suivant leur localisation (153). La différence de niveaux de

différenciation qu’ils présentent influe sur l’expression des peptides antimicrobiens (36).

Dans notre cas, le modèle reconstruit a les mêmes caractéristiques qu’un épithélium

gingival kératinisé natif. L’utilisation de cet équivalent peut donc être très instructive


80

pour étudier la modulation de l’expression des peptides antimicrobiens. En effet ce tissu

exprime une grande variété d’acteurs moléculaires impliqués dans le développement de

la barrière épithéliale. Pour contrôler la modulation de l’expression des ß-défensines et de

LL-37 dans ce modèle, nous avons effectué des expériences de stimulation par des

cytokines pro-inflammatoires et un motif bactérien, le LPS. Les résultats obtenus

montrent que l’expression des peptides antimicrobiens est modulée par des cytokines

pro-inflammatoires et des PAMPs après un court temps d’exposition. La comparaison de

l’expression de ces peptides dans les deux tissus nous a montré une localisation dans la

couche basale du non traité et une modification de la localisation et de l’intensité de

celle-ci après stimulation par du LPS. Ces variations de localisation après différents

stimuli ont d’ailleurs été mises en évidence dans d’autres études (115). Nous avons

également montré que l’IL-1ß était l’inducteur le plus efficace des peptides hßD2 et LL-

37. Une stimulation topique du modèle reconstruit par du LPS induit rapidement

l’expression d’hßD2. Au contraire, une incubation plus longue est nécessaire au mélange

IFNγ et TNFα pour induire hßD2 et LL-37. Tous ces résultats montrent que chaque

peptide antimicrobien a sa propre régulation quel que soit le modèle utilisé (natif ou

reconstruit) comme cela a été décrit précédemment dans différents modèles cellulaires et

tissulaires natifs (36, 55, 113).

Nos résultats montrent que la modulation de l’expression des ß-défensines et de

LL-37 peut être étudiée in vitro à partir d’un modèle reconstruit dont les réponses

peuvent être considérées comme équivalentes à un explant natif. Ce tissu reconstruit

peut servir d’outil d’analyse des différents mécanismes permettant le maintien de

l’homéostasie parodontale.

C) Choix d’un modèle cellulaire


Nous avons précédemment montré que l’épithélium gingival reconstruit était un

outil fonctionnel pour étudier l’immunité innée au niveau de l’épithélium gingival. C’est

un tissu correctement différencié et des stimulations topiques sont réalisables sur ce

modèle. Il se rapproche de l’épithélium gingival natif et permet d’étudier des

phénomènes de régulation au sein d’une architecture tissulaire (environnement

tridimensionnel stratifié). Cependant il reste un outil coûteux dont l’utilisation sera

destinée à la confirmation de données obtenues sur modèles monodimensionnels. La

culture cellulaire en monocouche est un outil très versatile pour étudier des mécanismes


81

moléculaires au niveau cellulaire. Elle donne la possibilité de multiplier différentes

expérimentations et de les reproduire un nombre de fois élevé.

L’utilisation de kératinocytes gingivaux normaux (NGKs) issus de primoculture

d’explants gingivaux est un passage obligé pour étudier la réponse de l’hôte. Même si

l’emploi de cellules immortalisées est plus pratique, il a clairement été démontré que ces

cellules comportent un certains nombre d’altérations (80). L’emploi des NGKs peut servir

à valider certains résultats obtenus sur des lignées immortalisées qui ne nécessitent pas

leur confirmation dans un modèle tissulaire tridimensionnel. Nous verrons que la limite

de ces cellules se situe au niveau des densités cellulaires que l’on peut obtenir. De plus,

nous heurtons à nouveau à un problème rencontré lors de l’utilisation d’explants : la

variabilité biologique individuelle.

Les lignées cellulaires immortalisées sont alors utilisées pour pallier ces difficultés.

2) Matériel et méthodes

Culture cellulaire

Les cultures primaires de kératinocytes gingivaux normaux humains sont obtenues

à partir d’explants gingivaux de tissu sain. Brièvement, les explants sont lavés dans du

PBS et incubés dans de la trypsine une nuit à 4°C ou une heure à 37°C. Après

incubation, l’épithélium est détaché du tissu conjonctif et les kératinocytes sont repris

par 5 à 10 mL de PBS/SVF et centrifugés 5’ à 1500 g. Le culot est repris dans du KSFM

complet avec de la primocine (2 µL/mL) et les cellules sont ensemencées dans des boites

de diamètre 35 mm. Après trois passages permettant la sélection et l’amplification

cellulaire, les kératinocytes sont utilisés pour les expérimentations.

En ce qui concerne les lignées immortalisées, nous avons testé deux modèles, la

lignée de kératinocytes oraux KB et la lignée de kératinocytes gingivaux Ca9-22. La

lignée KB (réf. CCL17, ATCC), dériverait d’un carcinome épidermique de la bouche, mais

après analyses elle aurait été établie via une contamination HeLa. Ces cellules

contiennent des séquences de papillomavirus humain 18 (HPV-18)

(http://www.lgcpromochem-

atcc.com/common/catalog/numSearch/numResults.cfm?atccNum=CCL-17).

Les cellules Ca9-22 proviennent du « Japanese Cancer Research Resources Bank »

(réf. JCRB0625, JCRB). Ce sont des cellules épithéliales issues d’un carcinome gingival.

Les cellules sont cultivées dans du DMEM (Gibco Invitrogen) 10% de sérum de veau

fœtal (SVF).

Traitements


82

En ce qui concerne les lignées, elles sont privées en SVF 15 à 24h avant le début

du traitement. Le TNFα et l’IL-1ß (R&D Systems) sont utilisés à 20 ng/mL, le FSL1 et le

LPS de P. gingivalis (Invivogen) à 100 et 1000 ng/mL respectivement et le mélange

TNFα/IFNγ (R&D Systems) à 10 ng/mL pour chacun.

PCR quantitative en temps réel

La méthode utilisée est la même que dans la première partie.

3) Résultats

Les NGKs (figure 21C) et les Ca9-22 (Figure 23B) sont de forme tétraédrique de

taille pratiquement identique. Les KB (Figure 23A) sont de taille inférieure, de forme

polyédrique, elles supportent mal la confluence contrairement aux deux premiers types

cellulaires. Les kératinocytes primaires se multiplient plus lentement que les deux

lignées. Dans nos conditions expérimentales, le nombre de passage atteint pour les NGKs

avant différenciation et diminution de la prolifération, est de quatre à cinq.

Les transcrits d’hßD2 et d’hßD3 sont exprimés dans les NGKs et leur expression est

modulable.

Pour examiner la régulation d’hßD2 et d’hßD3 in vitro, les NGKs ont été isolés à

partir de deux biopsies gingivales provenant de deux donneurs différents. Elles ont été

stimulées par du TNFα et du FSL1 pendant 15 heures (Figure 22). L’échantillon non

stimulé est pris pour référence et les facteurs d’induction d’expression ou quantité

relative (QR) sont calculés par rapport à cet échantillon.

Nous pouvons observer une forte induction de l’expression génique d’hßD2 chez les

deux donneurs après stimulation par le TNFα (x18.4 et x55.7). Le FSL1 induit également

cette expression mais beaucoup moins fortement (x8 et x2.8).

En ce qui concerne hßD3, ses transcrits ne sont induits que chez un donneur avec

des quantités relatives proches pour les deux traitements, 5.7 pour le TNFα et 4.8 pour le

FSL1.

La lignée Ca9-22 exprime les transcrits d’hßD2, pas la lignée KB.

L’analyse des Ct après qPCR (Figure 23) nous montre que, dans nos conditions

expérimentales, l’expression génique d’hßD2 ne peut être détectée dans la lignée KB à

un niveau basal sans stimulation. Après un traitement de 3 heures par l’IL-1ß, une faible

induction des transcrits d’hßD2 est observée (Figure 23A).

A l’opposé, la lignée Ca9-22, exprime les ARNm d’hßD2 à un niveau basal et cette

expression est induite par un court traitement à l’IL-1ß (Figure 23B).


83

4) Discussion

Dans nos conditions expérimentales, la culture des kératinocytes gingivaux

normaux a été réalisable même à partir de petites biopsies. Ces NGKs expriment les

ARNm d’hßD2 et d’hßD3 à un niveau basal et les expressions peuvent être modulées par

des PAMPs et cytokines. Le TNFα est connu au niveau dentaire pour être induit par des

bactéries comme F. nucleatum ou P. gingivalis et pour participer à la résorption osseuse

(4, 10), or dans nos cultures de NGKs, il induit une réponse immune innée assez forte

sous la forme d’hßD2. Le FSL1, un ligand spécifique du TLR2 induit les deux ß-

défensines. Ceci prouve que les NGKs expriment normalement le récepteur TLR2. En

effet, le FSL1 active l’expression de ces deux peptides spécifiquement par l’intermédiaire

de l’hétérodimère TLR2/TLR6. Nos résultats montrent également des différences de

niveau de réponse des deux donneurs aux deux stimulants (TNFα, FSL1). Ceci soulève le

problème de variabilité individuelle cité précédemment pour les explants gingivaux (3,

55).

La lignée Ca9-22 et les NGKs contrairement à la lignée KB expriment hßD2 au

niveau basal, ce peptide est fortement induit par l’IL-1ß.

La lignée KB n’exprime pas hßD2 à un niveau basal comme il est décrit pour les

kératinocytes gingivaux (114). Elle se différencie des NGKs et des Ca9-22 non seulement

par son aspect morphologique mais aussi par sa capacité de réponse en matière

d’immunité innée. Au contraire, les deux autres types cellulaires expriment ce peptide au

niveau basal et les Ca9-22 ressemblent morphologiquement aux NGKs. Finalement, la

lignée Ca9-22 a donc été choisie comme modèle pour réaliser nos études.

D) Evaluation d’actifs, Alkyls Poly-Glucosides et

stimulation de la réponse immune innée gingivale


Les maladies parodontales sont des maladies inflammatoires d’origine infectieuse

extrêmement invalidantes qui touchent un grand nombre de personnes. Elles peuvent

entraîner une destruction irréversible du parodonte profond menant à la perte

progressive des dents. Les traitements mis en œuvre peuvent être lourds (actes

chirurgicaux) et sont quelquefois inefficaces. C’est pourquoi, la prévention de ces

maladies est primordiale. Cette prévention peut passer par l’utilisation de principes actifs

stimulant la réponse immune innée sans pour autant entraîner une réponse


84

inflammatoire pouvant être destructrice. Les différents modèles mis au point et décrits

précédemment, permettent d’étudier la réponse de l’hôte en terme de sécrétion de

peptides antimicrobiens ou de cytokines proinflammatoires en réponse à l’action

modulatrice de principes actifs. Dans cette partie, le principe actif étudié fait partie de la

famille des Alkyls Poly-glucosides et il est appelé APG.

2) Méthode et résultats

Les différents modèles ont été mis en contact avec des concentrations croissantes

d’APG, en application topique ou en stimulation systémique selon la spécificité du

modèle. Les modèles utilisés ont été : l’épithélium gingival natif, le modèle reconstruit,

les NGKs et la lignée Ca9-22. Les conditions sont identiques à celles utilisées dans les

parties précédentes. Seules les NGKs ont subi une différenciation préalable par une forte

variation de la concentration en Ca2+ (CaCl2) de 0.1 à 1.2 mM final.

Après différents temps de traitement par l’APG ou des contrôles positifs, la réponse

immune innée cellulaire ou tissulaire a été analysée. L’expression de trois acteurs de

cette réponse, les peptides antimicrobiens hßD2 et hßD3 et la chimiokine IL-8, a été

analysée. Pour l’étude de la réponse antimicrobienne, la qPCR et l’immuno-histochimie

ont été utilisées. La réponse inflammatoire a été quantifiée en dosant la libération et

l’accumulation d’IL-8 dans les surnageants de culture par la méthode ELISA.

Un traitement systémique de 5h de l’épithélium gingival natif par l’APG, entraîne

l’induction de l’expression du peptide hßD3 (Figure 24A). Le marquage est localisé au

niveau des couches basales et des couches supérieures de l’épithélium. Il est plus

accentué dans la couche granuleuse et la couche cornée.

Comme le tissu natif, l’épithélium reconstruit exprime hßD3 (Figure 24B). Le

marquage est localisé dans les couches basales de l’épithélium et dans la couche cornée.

À partir de l’immunorévélation des coupes histologiques nous pouvons observer que

l’expression et la distribution du peptide hßD3 sont proches dans les deux tissus. Ces

résultats montrent également que l’APG induit rapidement le peptide antimicrobien, que

ce soit après un traitement topique (1h) ou systémique (5h) du tissu.

Dans l’épithélium reconstruit, les ARNm d’hßD2 et d’hßD3 sont exprimés et sont

inductibles par l’APG (3 µg/mL) (Figure 25A). Ceux d’hßD2 sont induits significativement

dès une heure de traitement (x 2,3) et cette induction augmente avec le temps de

traitement (x 2.3, 2.1 et 3.1 pour 1h, 3h et 19h respectivement). L’expression des

transcrits d’hßD3 est induite très précocement (x 2,9 au bout de 30 minutes). Elle

disparaît ensuite et réapparaît au bout d’une nuit (19h) de traitement avec application

topique de l’APG (x 6.3).


85

Sur le plan cellulaire, les primocultures (NGKs) ont subi la différenciation en

présence de calcium dans le milieu de culture ([Ca2+]=1.2 mM au lieu de 0.1 mM). Celle-

ci permet d’augmenter l’expression basale des ß-défensines et d’amplifier la réponse

cellulaire (113). Le principe actif induit l’expression des messagers d’hßD3 (x 2.9 pour

une concentration de 10 µg/mL) dans des NGKs différenciés après 3h de traitement

(Figure 25B). Nous pouvons observer qu’à une concentration plus faible (3 µg/mL), l’APG

a déjà tendance à induire cette expression.

La figure 26 représente la libération et l’accumulation d’IL-8 en pg/mL par les

différents types cellulaires après plusieurs traitements. Les primocultures (NGKs) (Figure

26A) ont subi ou non la différenciation. Lorsque les kératinocytes gingivaux sont

différenciés et ont été traités par l’APG pendant 3h, nous pouvons observer une très

faible augmentation du niveau global de libération d’IL-8. En l’absence de pré-

différenciation, dans les deux cas, en comparaison à l’APG, le TNFα et le FSL1 induisent

une très forte augmentation de la libération d’IL-8 ; le TNFα étant l’inducteur le plus

efficace.

La lignée Ca9-22 a subi des traitements de 3h et de 15h (Figure 26B). Quelque soit

le temps de traitement de ces cellules et la concentration d’APG utilisée, le principe actif,

n’induit pas de libération d’IL-8. Seul le TNFα a une action stimulante sur la synthèse

d’IL-8.

L’ensemble des résultats de cette étude a fait l’objet d’une communication affichée

sous forme de poster sous le titre : Laurate Butyl Glucoside enhances oral innate

immunity without increasing inflammation (IADR CONFERENCE, Thessaloniki 2007)

3) Discussion

L’objectif de cette étude était d’évaluer l’action potentielle de l’APG sur la réponse

immune innée gingivale et plus précisément sur la réponse antimicrobienne (hßD2 et

hßD3). Nous devions parallèlement vérifier que la réponse inflammatoire (IL-8)

demeurait contrôlée.

Nos résultats montrent que ce principe actif entraîne une induction précoce de la

production du peptide d’hßD3 dans les deux modèles tissulaires, natif (5h) ou reconstruit

(1h) après traitement systémique ou topique. Cette induction est donc relativement

rapide et la localisation des marquages est très proche dans les deux tissus. On peut

penser qu’il ne s’agit pas d’une néosynthèse. Dans le tissu reconstruit, l’APG induit les

expressions géniques d’hßD2 et d’hßD3, avec des profils d’induction différents.

L’expression des transcrits d’hßD2 augmente régulièrement au cours du temps et celle

d’hßD3 est divisée en deux phases distinctes, une induction précoce et une induction

tardive. Au niveau cellulaire, l’APG entraîne l’augmentation précoce de l’expression


86

génique d’hßD3. La réponse inflammatoire des modèles cellulaires face au principe actif

est faible, voire inexistante. Les concentrations en principe actif et le temps d’incubation

n’ont pas d’effet sur la libération d’IL-8.

Un brevet a été précédemment déposé sur ce principe actif, couvrant son utilisation

potentielle comme inducteur des ß-défensines dans différents épithéliums cutanés,

vaginal et gingival. les résultats que nous avons obtenus sur les modèles gingivaux,

complètent ces données et coïncident avec ceux obtenus sur les modèles cutanés, à

savoir, une induction précoce des ß-défensines quelque soit le traitement (systémique ou

topique) (26). Par ailleurs, l’absence de réponse inflammatoire comme la libération de

métabolites de l’acide arachidonique, avait précédemment été démontrée au niveau

cutané (26). De plus, des expériences d’adhésion microbienne sur épithélium cutané

suite à la stimulation des peptides antimicrobiens par l’APG, ont montré que ce principe

actif pouvait réguler la flore cutanée en favorisant la rééquilibration de l’écosystème vers

une flore commensale (26).

Au final, ces résultats suggèrent que cet actif pourrait intervenir en rééquilibrant la

microflore gingivale au profit de bactéries commensales en stimulant la synthèse de

peptides antimicrobiens endogènes. Ils préviendraient les affections microbiennes et

favoriseraient ainsi l’homéostasie gingivale.

Enfin, concernant la mise en place et l’utilisation de nos modèles, nos données

montrent qu’ils permettent dans tous les cas d’apporter une réponse particulière en

terme d’évaluation : niveau d’expression, effet dose pour les modèles

monodimensionnels et localisation d’expression dans les modèles tridimensionnels. Ce

sont des outils d’évaluation fonctionnels pour la recherche dentaire.

TRAVAIL EXPERIMENTAL_2EME PARTIE

87

CHAPITRE II : ÉTUDE DE LA RECONNAISSANCE ET DE LA

DISCRIMINATION PAR LE RECEPTEUR TLR2 D’EXTRAITS

MEMBRANAIRES D’UNE BACTERIE COMMENSALE S. SANGUINIS

ET D’UNE BACTERIE COMMENSALE OPPORTUNISTE F.

NUCLEATUM


88

A) Problématique

L’épithélium gingival, constamment exposé aux microorganismes, fonctionne

comme une barrière antimicrobienne. C’est un acteur de la réponse de l’hôte dont un des

nombreux rôles est de reconnaître et de différencier les microorganismes commensaux

des microorganismes pathogènes, afin de maintenir l’homéostasie gingivale. Ces

fonctions sont remplies par des récepteurs spécialisés, membranaires, solubles ou

intracellulaires, les PRRs. Le TLR2 est un de ces récepteurs et il semblerait fortement

impliqué dans le maintien de cette homéostasie.

Dans cette deuxième partie, nous avons choisi d’étudier l’implication du récepteur

TLR2 dans la reconnaissance et la discrimination d’extraits de paroi membranaire de

deux bactéries parodontales décrites comme commensales : S. sanguinis, une bactérie

commensale vraie à Gram positif et F. nucleatum, une bactérie commensale opportuniste

à Gram négatif. La première n’est retrouvée que sur des sites parodontaux sains alors

que la deuxième est également présente sur ces sites mais aussi sur des sites infectés

lors de la pathologie parodontale.

B) Méthodes et résultats

Pour l’ensemble de ce travail, des NGKs et la lignée Ca9-22 ont été utilisés. Les

cellules été mises en présence d’extraits de paroi membranaire de trois bactéries

parodontales, S. sanguinis, F. nucleatum et P. gingivalis. S. sanguinis représente la

bactérie commensale à Gram positif colonisateur précoce, P. gingivalis la bactérie

pathogène à Gram négatif et F. nucleatum la bactérie commensale opportuniste aussi

bien retrouvé sur une gencive saine que dans une poche parodontale. Elle joue le rôle de

passerelle entre les colonisateurs précoces commensaux et les pathogènes.

La réponse cellulaire a été étudiée en analysant l’expression d’acteurs de

l’immunité innée, les ß-défensines hßD2 et hßD3 et un marqueur de l’inflammation, l’IL-

8. L’expression des transcrits de ces trois marqueurs a été analysée par qPCR et la

libération d’IL-8 par ELISA.

Le choix d’un clone Ca9-22/TLR2 surexprimant le récepteur TLR2 et son utilisation

avec ou sans siRNA dirigés contre ce récepteur TLR2, ont permis d’étudier la spécificité

de réponse aux extraits, dépendante de TLR2.

En ce qui concerne les NGKs, les extraits de paroi membranaire de la bactérie

commensale opportuniste F. nucleatum induisent l’expression des ß-défensines et d’IL-8.

Au contraire, des extraits de S. sanguinis n’entraînent aucune réponse de la part de


89

l’hôte. De leur côté, des extraits de la bactérie pathogène P. gingivalis induisent une

réponse cellulaire cependant moins forte que F. nucleatum. L’utilisation de la lignée Ca9-

22/TLR2, qui surexprime le récepteur TLR2, ainsi que des RNA silencer dirigés contre ce

récepteur a permis de montrer l’implication majoritaire du TLR2 dans la reconnaissance

des extraits de F. nucleatum. En effet, en bloquant l’expression du récepteur, nous avons

pu observer une forte inhibition de la réponse. Au contraire pour les extraits de S.

sanguinis, l’extinction du TLR2 provoque une augmentation de la réponse cellulaire sous

la forme d’une expression accrue d’hßD3 et d’IL-8. En ce qui concerne les extraits de la

bactérie pathogène peu de variation est observée, la réponse demeure faible.

L’ensemble des résultats de cette deuxième étude est développé dans un article

soumis à publication dans le journal « Infection and Immunity » sous le titre : « TLR2

sensing of F. nucleatum and S. sanguinis distinctly triggered gingival innate

response ».


90

C) Discussion

L’épithélium gingival forme une barrière entre l’hôte et le biofilm. Ce biofilm est

composé d’une multitude de microorganismes qui peuvent être commensaux ou

pathogènes. Parmi les bactéries parodontales commensales, nous avons choisi d’étudier

S. sanguinis, une bactérie commensale vraie en comparaison de F. nucleatum qui est une

bactérie commensale opportuniste. P. gingivalis fait partie des bactéries pathogènes. Le

rôle des deux premiers microorganismes dans le biofilm et leur action dans le maintien

ou non de l’homéostasie épithéliale sont différents. S. sanguinis est un colonisateur

précoce commensal qui entre en compétition avec des bactéries carieuses comme S.

mutans (22, 100) ou avec des parodontopathogènes comme A. actinomycetemcomitans

(180). F. nucleatum fait le lien entre les colonisateurs précoces et les pathogènes tardifs

comme P. gingivalis.

Des études ont montré que les récepteurs TLRs étaient impliqués dans la

reconnaissance des bactéries orales par les cellules orales. Ces récepteurs participent au

maintien de l’homéostasie parodontale en régulant la libération de peptides

antimicrobiens et de médiateurs de l’inflammation (7, 171).

Au niveau basal, le récepteur TLR2 est mieux exprimé par les kératinocytes

gingivaux que le TLR4 (7). Dans ces kératinocytes, il peut donc être considéré comme un

récepteur important dans la reconnaissance précoce et la discrimination des

microorganismes parodontaux.

Malgré la connaissance des fonctions, des ligands, des cascades de signalisation

des TLRs dans différents épithéliums (40, 61, 89, 171), la reconnaissance des bactéries

parodontales par le récepteur TLR2 et la signalisation qui en découle dans les

kératinocytes gingivaux sont mal connues.

Nous avons montré que dans les NGKs, les extraits de F. nucleatum induisent

l’expression génique d’hßD2, hßD3 et d’IL-8. Ils induisent également la libération de

cette chimiokine. Nos résultats corroborent ceux d’études antérieures dans lesquelles les

extraits de F. nucleatum et la bactérie F. nucleatum vivante étaient de puissants

inducteurs de la réponse immune innée capables d’induire fortement l’expression de ces

trois acteurs (77, 189).

Les extraits de P. gingivalis provoquent des effets discrets sur la réponse de l’hôte

comme cela a déjà été suggéré (37, 76). Il induit principalement l’expression d’hßD3

comme cela a déjà été montré dans le cadre d’infections (189). Quant à la libération

d’IL-8, elle demeure faiblement induite. D’autres études réalisées à partir de P. gingivalis

tué par la chaleur ou des protéases ont également montré une faible accumulation de la

chimiokine (4). De même, dans le cas d’infection, la libération d’IL-8 et son accumulation


91

ne sont pas détectables (37, 76). Il est possible que la production de protéases comme

les gingipaines capables de dégrader les molécules protectrices de l’hôte (complément)

mais également les cytokines (IL-6, IL-8, TNFα) et leurs récepteurs (126, 156) permette

à P. gingivalis d’échapper aux défenses de l’hôte. Ainsi, la faible accumulation d’IL-8 dans

nos expériences pourrait provenir de la présence de gingipaines actives dans les extraits

membranaires.

La réponse de l’hôte face à la bactérie pathogène P. gingivalis a souvent été

étudiée. Les résultats obtenus dans nos conditions corroborent ceux de ces études. Les

résultats obtenus avec P. gingivalis permettent donc de valider notre modèle d’étude

pour l’utiliser dans l’analyse comparée originale de la réponse cellulaire aux extraits de S.

sanguinis et de F. nucleatum. En effet, d’après la littérature, la réponse immune innée

gingivale occasionnée par des bactéries commensales à Gram positif a été peu étudiée

(70).

En ce qui concerne les extraits de S. sanguinis, commensale vraie, à Gram positif,

la réponse inflammatoire et l’expression des ß-défensines ne sont pas induites dans les

NGKs. Pour un donneur, la stimulation du peptide hßD3 est du même ordre que P.

gingivalis et deux fois inférieure à celle de F. nucleatum. Des travaux ont montré qu’à

l’inverse de F. nucleatum, un autre commensal, Streptococcus gordonii, inhibait la

libération d’IL-6 et IL-8 dans une lignée épithéliale gingivale immortalisée (70). Aucune

étude n’a été publiée sur l’action de ces colonisateurs précoces sur la régulation des ß-

défensines exprimées par l’hôte.

Bien que les résultats obtenus avec les extraits de F. nucleatum et P. gingivalis

rejoignent ceux décrits par d’autres études, nous avons été confrontés à la variabilité

biologique entre les cultures de NGKs issues de différents donneurs. Cette variabilité

évoquée par d’autres équipes, (55) demeure un inconvénient. Nous avons donc décidé

d’utiliser la lignée Ca9-22 décrite dans le chapitre 1 (Résultats).

Nos résultats ont confirmé que cette lignée exprimait hßD2 et hßD3 à l’état basal et

après des stimuli inflammatoires. Lorsque nous avons stimulé les deux types cellulaires

par les extraits bactériens de S. sanguinis, F. nucleatum et P. gingivalis, nous avons

observé des différences de réponse antimicrobienne et inflammatoire selon les cellules.

Alors que les extraits de S. sanguinis n’induisent pas de réponse de la part des NGKs, ils

sont capables de stimuler l’expression des deux ß-défensines et d’induire une réponse

inflammatoire dans les Ca9-22. A l’inverse, les extraits de F. nucleatum n’induisent pas

de fortes réponses de la part de la lignée alors qu’ils stimulent l’expression des ß-

défensines et de l’IL-8 chez les NGKs. Nous avons également observé que le traitement

par le FSL1, le ligand spécifique de TLR2, ne conduisait pas à une augmentation de

l’expression d’hßD2 et d’IL-8 dans la lignée Ca9-22, contrairement à l’induction

provoquée chez les NGKs. Nous avons vérifié l’expression génique de TLR2 au niveau des


92

deux types cellulaires. Nos résultats ont mis en évidence que ce récepteur était

faiblement exprimé dans la lignée en comparaison des NGKs. Ceci suggérait son

implication dans l’élaboration ou le déclenchement de réponses spécifiques vis-à-vis des

différents extraits. Ces résultats ont également suggéré l’importance du récepteur dans

la régulation de la réponse de l’hôte vis-à-vis de bactéries commensales à Gram positif

ou à Gram négatif.

Pour étudier plus précisément l’implication spécifique du TLR2 dans la modulation

de ces réponses, nous avons transfecté la lignée par un plasmide contenant le gène de

ce récepteur. Parmi les nombreux clones obtenus, nous avons choisi celui surexprimant

un récepteur TLR2 fonctionnel.

L’objectif de la suite de l’étude a été de démontrer l’implication du TLR2 dans la

reconnaissance et la discrimination des extraits des trois bactéries. Les résultats ont

montré que, comme dans les NGKs, les extraits de F. nucleatum et P. gingivalis

induisaient l’expression des ß-défensines et d’IL-8 dans ce clone Ca9-22/TLR2. Au

contraire, ceux de S. sanguinis n’étaient plus capables de provoquer l’induction d’hßD3 et

d’IL-8 comme c’était le cas dans la lignée non transfectée. Pour démontrer l’implication

spécifique du TLR2, des siRNA ou RNA silencer dirigés contre le gène de ce récepteur et

bloquant son expression ont été utilisés. L’extinction du TLR2 dans le clone Ca9-22/TLR2

a provoqué une perte de la réponse cellulaire vis-à-vis des extraits de F. nucleatum et de

P. gingivalis. A l’inverse, l’induction de l’expression d’hßD3 et d’IL-8 par les extraits de S.

sanguinis réapparaît dans le clone transfecté avec les siRNA. Ces données prouvent

l’implication spécifique du TLR2 dans la modulation de la réponse innée de l’hôte après

discrimination des extraits des trois bactéries.

Les différents TLRs connus jouent un rôle clé dans l’initiation de l’immunité innée

non seulement face aux pathogènes mais aussi dans le maintien de l’homéostasie

parodontale (134). L’épithélium gingival exprime les TLR2, 3, 4, 5, 6 et 9 dont les TLR2,

6 et 9 constitutivement (117). L’activation cellulaire via ces récepteurs déclenche les

voies NF-κB, MAP Kinases ; l’activation d’AP-1, et l’activation des IRF (Interferon

Regulatory Factors) (89, 92). De précédentes études ont montré l’implication de TLR2

dans la reconnaissance de bactéries parodontales telles que F. nucleatum, P. gingivalis et

A. actinomycetemcomitans dans l’activation de la réponse innée par celles-ci (53, 92,

171). Les bactéries à Gram négatif stimulent préférentiellement TLR2 (92). L’activation

de TLR2 passe par son hétérodimérisation avec TLR1 ou TLR6, qui permet la

discrimination de différents microorganismes (134). TLR2 est impliqué dans la

modulation des ß-défensines par les PAMPs (124, 171) et il a été montré que l’activation

cellulaire à travers le dimère TLR2/TLR1 déclenchait l’induction d’hßD2 (171). Nos

résultats montrent que l’expression du peptide peut également être induite par le FSL1,

ligand spécifique du dimère TLR2/TLR6.


93

La plupart des données publiées concerne la détection de P. gingivalis par TLR2 et

l’activation cellulaire qui en découle (4, 7, 53, 117). Les fimbriae sont connues pour

induire IL-8 par l’intermédiaire de TLR2 avec l’aide du CD14 (53). Elles utilisent

indifféremment les deux hétérodimères, alors que le LPS utilise le couple TLR2/TLR1.

Contrairement à P. gingivalis, l’implication du TLR2 dans la reconnaissance et la

discrimination de F. nucleatum a peu été étudiée. Nos résultats montrent que les extraits

de F. nucleatum sont capables d’entraîner une forte activation cellulaire par

l’intermédiaire du TLR2 sous forme d’une stimulation des ß-défensines et d’IL-8. Une

partie de ces résultats est corroborée par une étude montrant que des HEK (cellules

embryonnaires du rein) surexprimant TLR2/CD14 répondent à des extraits de F.

nucleatum par une forte libération de cytokines inflammatoires (92). Cependant, nos

données suggèrent également que les extraits de F. nucleatum sont détectés par un ou

plusieurs autres récepteurs. En effet, alors que la lignée Ca9-22 n’exprime pas de TLR2

fonctionnel, elle se trouve cependant activée par ces extraits.

A notre connaissance, aucune étude impliquant des extraits de S. sanguinis et le

récepteur TLR2 n’a été publiée à ce jour. Il est intéressant de noter que la présence du

TLR2 prévient l’induction des ß-défensines et d’IL-8 par ces extraits. ce récepteur

pourrait donc être spécifiquement impliqué dans ce blocage. Ceci met également en

avant une différence de signalisation notable entre réponse aux deux bactéries

commensales S. sanguinis et F. nucleatum avec cependant le même récepteur au départ,

TLR2. Par ailleurs, l’expression d’hßD3 et de l’IL-8 est induite par les extraits de S.

sanguinis dans des cellules n’ayant pas de TLR2 fonctionnel (Ca9-22 et Ca9-

22/TLR2+siRNA). Les extraits de S. sanguinis pourraient donc être également détectés

par d’autres PRRs.

Cette étude a montré que d’une part, les extraits utilisés pouvaient être reconnus

et discriminés par le récepteur TLR2. De plus, elle a mis en avant que différentes voies

de signalisation pouvaient être activées à partir du même récepteur et qu’elles

engendraient la modulation de l’expression des peptides antimicrobiens et de cytokines

inflammatoires dans les kératinocytes gingivaux. Nos résultats suggèrent que le TLR2

pourrait reconnaître et distinguer des bactéries commensales vraies de bactéries

commensales opportunistes. De cette discrimination, résulterait un profil d’expression

particulier des ß-défensines et d’IL-8 pouvant jouer sur la colonisation du parodonte par

les microorganismes. Cette propriété du TLR2 de discriminer commensales vraies et

commensales opportunistes pourrait conférer à la cellule la capacité d’élaborer une

réponse appropriée. F. nucleatum est retrouvé sur une gencive saine mais également

dans la poche parodontale. Dans le cas de cette bactérie, le récepteur TLR2 pourrait être

impliqué dans la transition d’un profil commensal opportuniste à pathogène, donc dans la


94

transition d’une situation d’homéostasie à pathologique. Dans le cas de S. sanguinis, le

récepteur TLR2 maintiendrait cet équilibre en limitant la réponse inflammatoire face à

cette bactérie. Ainsi, nos résultats prouvent que le maintien de l’homéostasie parodontale

et sa rupture pourraient impliquer le TLR2 et sa reconnaissance des bactéries

parodontales.

Pour la suite de nos travaux, présentés dans le chapitre 3 nous avons réalisé des

infections de kératinocytes gingivaux par ces mêmes bactéries parodontales afin de

fournir des données supplémentaires sur l’implication du TLR2 dans la reconnaissance et

la discrimination de bactéries vivantes parodontales considérées commensales.


95

CHAPITRE III : ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE INNEE DE

KERATINOCYTES GINGIVAUX EN PRESENCE DE DEUX BACTERIES

COMMENSALES S. SANGUINIS ET F. NUCLEATUM :

DISCRIMINATION PAR LE TLR2.


96

A) Introduction

Les études menées sur les effets d’extraits membranaires des bactéries

parodontales S. sanguinis, F. nucleatum et P. gingivalis ont montré que la cellule

épithéliale gingivale était capable de distinguer non seulement les bactéries commensales

des bactéries pathogènes mais également deux bactéries commensales, via le TLR2.

Cette discrimination permettrait l’activation de voies différentes pour ces deux

protagonistes bactériens. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques de

l’interaction hôte/bactérie, nous avons mis en contact les kératinocytes avec les bactéries

vivantes S. sanguinis ou F. nucleatum. Contrairement aux extraits utilisés dans la

deuxième partie, les bactéries vivantes sont capables de communiquer avec l’hôte.

L’instauration de ce dialogue plus complexe que la simple reconnaissance des extraits par

des PRRs devrait induire chez l’hôte des réponses plus proches de la « réalité

physiologique ». L’interaction de S. sanguinis et de F. nucleatum avec la lignée Ca9-22 et

la lignée surexprimant le TLR2, Ca9-22/TLR2, déterminera le rôle du TLR2 dans la

reconnaissance et la discrimination de ces deux bactéries commensales et la réponse

cellulaire qui en découle. Le but de cette étude est de compléter les résultats obtenus

avec les extraits, c’est-à-dire d’étudier la réponse innée cellulaire face aux deux bactéries

commensales, de voir si, comme avec les extraits, la cellule est capable de reconnaître et

de discriminer une bactérie commensale vraie d’une commensale opportuniste et enfin

d’évaluer le niveau d’implication du récepteur TLR2 dans cette reconnaissance, cette

discrimination et cette activation de la réponse immune innée gingivale.

Les expérimentations d’infection ont été effectuées au sein du laboratoire de

bactériologie de la faculté de chirurgie dentaire dirigé par le Pr D. Duffaut dans le cadre

de travaux de recherche collaboratifs. Ces mises au point ont été faites avec B. Signat et

le Dr P.P. Poulet dans le laboratoire de microbiologie parodontale et régénération du

parodonte. Les analyses concernant l’observation des interactions par microscopie

confocale et l’étude de la réponse de l’hôte ont été effectuées au laboratoire de

pharmacologie cellulaire du CERPER.

B) Matériel et méthodes

Dans cette étude, les cellules Ca9-22 et Ca9-22/TLR2 ont été mises en présence

des bactéries S. sanguinis et F. nucleatum. Les souches sont identiques à celles utilisées

pour préparer les extraits de paroi membranaire ayant servi lors des expérimentations

présentées dans le chapitre 2. Différents taux d’inoculation ont été utilisés. Ces taux

correspondent à la « Multiplicity Of Infection » (MOI), c’est-à-dire au nombre de


97

bactéries par kératinocyte mises en présence. Les MOI utilisées ont été 50, 100 et 150.

Les kératinocytes ont été incubés pendant 3h avec les bactéries à différentes MOI pour

permettre à celles-ci d’adhérer à la monocouche cellulaire.

Cultures bactériennes

Streptococcus sanguinis (Collection de l’Institut Pasteur, CIP 55128)

Les bactéries sont ensemencées dans une boîte de Pétri Gélose Colombia au sang

de mouton et cultivées en aérobiose à 37°C (J0). Le lendemain, 4 mL de bouillon TGY est

inoculé avec cette boîte et incubé en aérobiose à 37°C.

Fusobacterium nucleatum nucleatum et Porphyromonas gingivalis (Collection

d’Anaérobies de l’Institut Pasteur AIP 101130T et 103683, respectivement)

Les bactéries sont ensemencées dans une boîte de Brucella Agar enrichie à l’hémine

métadione et hématie de mouton et incubées en anaérobiose à 37°C (J-3). A J1, les

bactéries sont inoculées dans 4 mL de bouillon TGY à partir de cette boîte.

Traitements des kératinocytes, qPCR et dosage d’IL-8 par méthode ELISA

Les cellules Ca9-22 ou Ca9-22/TLR2 sont ensemencées en boite 6 puits à 350000

cellules par puits dans du DMEM/10 % SVF (J0). Le lendemain (J1), les cellules sont

privées en SVF. Le surlendemain, jour de l’infection (J2), la concentration cellulaire est

déterminée avant de commencer l’infection. Les bactéries sont également comptées

(lame Neubauer), pour pouvoir infecter les cellules à des MOI déterminées. Les bactéries,

préalablement reprises dans du DMEM, sont inoculées sur cellules adhérentes. L’adhésion

bactéries/cellules épithéliales se déroule à 37°C pendant 3h. Ensuite, le milieu d’infection

est éliminé et les cellules lavées avec du PBS. Le début de la stimulation débute au

moment où le DMEM est rajouté. Les trois puits contrôle sont le « non stimulé », et les

contrôles positifs stimulés au TNFα (20 ng/mL) (R&D Systems) ou au FSL1 (100 ng/mL)

(Invivogen). Après 15 à 18h l’incubation est stoppée. Les surnageants de culture sont

récupérés et l’IL-8 libéré est dosé par la méthode ELISA avec le kit « human CXCL8/IL-8

duoset » (R&D Systems) en suivant les instructions du fabricant.

L’ARN total est extrait des kératinocytes en utilisant le kit Rneasy Mini Kit (Qiagen) en

suivant les instructions du fabricant. Les protocoles du dosage des ARN totaux, de la

transcription inverse et de la qPCR sont décrits dans les articles compris dans les

chapitres 1 et 2.

Survie cellulaire et bactérienne

La survie des bactéries S. sanguinis et F. nucleatum a été testée dans différents

milieux dont le DMEM. Les bactéries ont été ensemencées dans ce milieu et incubées

pendant 15 à 18 heures dans une atmosphère contenant de 5 à 9,5% de CO2. Après


98

cette incubation, elles ont été réensemencées dans des conditions optimales pour leur

développement, aérobiose pour S. sanguinis et anaérobiose pour F. nucleatum, puis elles

ont été dénombrées.

Afin de pouvoir infecter les kératinocytes par F. nucleatum, des conditions de

culture particulières ont été utilisées. Les cultures sont mises à incuber en atmosphère

saturée en CO2 (5 à 9.5%). Nous nous sommes assurés que les cellules d’une part et les

bactéries d’autre part supportaient ces conditions. Pour le vérifier, des tests de

cytotoxicité complémentaires (pourcentages de survie et de nécrose) ont été effectués.

Le test Cytotox One (Promega) permet de doser la lactate déhydrogénase libérée dans le

surnageant de culture par des cellules nécrotiques dont la membrane est lésée. Le test a

été utilisé lors des manipulations d’interaction bactéries/cellules ou sur le surnageant de

cellules seules. Ce kit a été utilisé en suivant les instructions du fabriquant. Le test au

rouge neutre a également été utilisé sur cellules en conditions de culture classique ou

d’interaction. Le rouge neutre est un colorant vital faiblement cationique qui pénètre

dans les cellules par diffusion non ionique. Il s'accumule dans les lysosomes des cellules

vivantes par un mécanisme actif ou passif (16). Brièvement, les cellules sont

ensemencées en plaque 96 puits à 2.104 cellules par puits et incubées à 37°C, 5% de

CO2 pendant 18 heures. Les cellules sont ensuite rincées et mises à incuber de 15 à 18

heures en atmosphère riche en CO2 (5 à 9.5%) ou non (5%). Les cellules sont rincées au

PBS. La solution au rouge neutre est ensuite déposée et incubée pendant 3h. Les cellules

sont rincées avec une solution contenant 4% de formaldéhyde et 1% de CaCl2. Après

rinçage, le rouge neutre est extrait des cellules après 20 minutes d’incubation avec une

solution contenant 1% d’acide acétique et 50% d’éthanol absolu. La DO est lue à 540

nm.

Observation microscopique des infections des kératinocytes

Les kératinocytes sont ensemencés et cultivés comme précédemment décrit. Seule

une lamelle couvre-objet stérile a été préalablement déposée au fond de chaque puit. Le

jour de l’infection, les bactéries sont préalablement incubées, pendant 1 heure à 37°C

sous agitation, avec du CFDA (10 µM final) (Invitrogen) (vert en fluorescence) ou du

syto17 (5 µM final) (Invitrogen) (rouge en fluorescence) qui sont deux colorants vitaux.

La suite de l’infection est identique à la première partie. A la fin de l’infection, le milieu

est aspiré, les cellules adhérentes à la lame porte-objet sont rincées avec du PBS et

fixées avec du para-formaldéhyde (4% dans du PBS) pendant 10’ à température

ambiante. Le para-formaldéhyde est aspiré, les cellules rincées au PBS, séchées et

conservées à -20°C.


99

Immuno-cytochimie

L’immuno-marquage des kératinocytes à la phalloïdine488 permet de visualiser le

cytosquelette d’actine en vert, alors que de leur coté, les bactéries, sont colorées

préalablement au syto17 (rouge). L’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre

l’actine et d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’alexa555 permet de visualiser

le cytosquelette d’actine (rouge), lorsque les bactéries sont colorées préalablement au

CFDA (vert).

Les cellules sont perméabilisées par une solution de Triton X100 à 0.2% dans du

PBS pendant 15 min, lavées avec du PBS puis traitées 30 minutes avec du « image iT-FX

signal enhancer » (Invitrogen) pour éviter le bruit de fond. Les lamelles sont lavées et les

sites aspécifiques saturés pendant 15 minutes avec une solution de BSA 1%. Les cellules

sont incubées 1 heure avec la phalloïdine488 (Invitrogen) (1/50ème) ou l’anticorps anti-

actine (Millipore Chemicon) (1/100ème) dans une solution de BSA 0.1% dans du PBS.

Après incubation, elles sont lavées avec du PBS. Pour le marquage Phalloïdine-Alexa488,

les cellules sont lavées à l’eau distillée et les lamelles sont ensuite montées avec le

Prolong Gold antifade with DAPI (Invitrogen).

Pour le marquage avec l’anticorps anti-actine, les cellules sont mises à incuber 1

heure avec l’anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa555 (Molecular Probes

Invitrogen) (1/3000ème). Pour la suite, les lamelles sont traitées comme précédemment.

Zymographie ; activité gélatinase

Cette technique permet de visualiser les proenzymes et les formes maturées

actives des enzymes MMP-2 et MMP-9 présentes dans les surnageants de culture

cellulaire. Une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 7,5% copolymérisé avec de

la gélatine (0,1% final) est réalisée, en présence de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS)

(conditions dénaturantes). La gélatine substrat spécifique des enzymes gélatinase MMP-2

et MMP-9. Le SDS conduit à une activation des formes proenzymes dans le gel sans

provoquer un clivage de la partie N-terminale de l’enzyme. Ces formes « pro » peuvent

donc être visualisées sur le gel comme les formes actives, grâce à la dégradation de la

gélatine au niveau de la distance de migration correspondant à leur poids moléculaire.

Les surnageants de culture cellulaire et le contrôle positif (Hacat surexprimant NF-

κB stimulées avec du TNFα sont mélangés à un tampon Laemmli non réducteur. Après

migration, les gels sont incubés 2 fois 30 min à température ambiante dans une solution

de dénaturation (2.5% Triton X-100), rincés brièvement dans de l’eau distillée pour

éliminer le SDS puis incubés pendant 24 h à 37°C dans un tampon Tris-HCl pH 7.5

contenant 5 mM de CaCl2. Les gels sont alors colorés pendant 30 min avec du bleu de

Coomassie R-250 0.1% dans une solution contenant 20% d’iso-propanol et 10% d’acide


100

acétique. Ils sont ensuite décolorés dans cette même solution en l’absence de colorant

afin de révéler l’activité gélatinolytique

C) Résultats

Mise en place du modèle d’interaction bactéries / cellules épithéliales

- Viabilité des protagonistes -

L’étude des interactions bactéries/kératinocytes a impliqué la mise en place de

conditions de culture adaptées à la survie des cellules eucaryotes et bactériennes. En ce

qui concerne les premières, nous avons comparé leur survie en conditions d’interactions

(DMEM, 5 à 9.5% CO2, 37°C) et en conditions de culture contrôlée classique (DMEM, 5 %

CO2, 37°C , sous atmosphère humide). Les phénomènes de nécrose cellulaire sont eux

suivis après 15h.

Les cellules Ca9-22 et Ca9-22/TLR2 survivent de manière équivalente en jarre, en

présence de bactéries (5 à 9.5% CO2) et en conditions régulées (5% CO2) dans l’étuve

en l’absence de bactéries, à condition que les MOIs ne dépassent pas 150.

Par ailleurs, nous avons vérifié par dénombrement après réensemencement, que

S. sanguinis et F. nucleatum survivaient après 15 heures d’incubation avec les cellules

dans ces mêmes conditions. En particulier, pour F. nucleatum, les conditions de

saturation en CO2 permettent à la bactérie anaérobie de survivre sur cette période.

- Choix de la fenêtre des MOIs -

Plusieurs MOIs ont été testés lors des expériences d’interaction entre bactéries

commensales et kératinocytes. Afin de déterminer la MOI la plus appropriée pour nos

expériences, différents paramètres ont été analysés.

Ainsi, après 3 heures d’adhésion préliminaire des bactéries S. sanguinis ou F.

nucleatum à différentes MOIs, les cellules ont été observées en contraste de phase en

microscopie classique (Figure 27A). A partir d’une MOI de 200 et surtout à une MOI de

300, F. nucleatum entraîne un début de souffrance cellulaire, visible dès la fin de l’étape

d’adhésion (Figure 27A). Dans le cas de S. sanguinis, l’effet est visible à ces mêmes

MOIs mais à des temps plus long (après 15h) (Figure 27A).

Par ailleurs, nous avons suivi la stimulation de l’expression des peptides

antimicrobiens, en fonction de MOIs croissantes. Dans le cas de F. nucleatum, la quantité

relative (QR) de mRNA d’hßD2 et hßD3 augmente en fonction des MOIs jusqu’à atteindre

un effet plateau et une chute à partir d’une MOIs de 200. En ce qui concerne l’infection


101

par S. sanguinis, nous verrons plus loin que celle ci entraîne une inhibition de

l’expression d’ hßD3 de plus en plus importante en fonction de la MOI. A partir d’une MOI

de 200, nous observons un effet plateau lié à l’impossibilité d’exploiter quantitativement

l’expression des ARNms (Figure 27B).

Au final, l’ensemble de ces résultats nous conduit à adopter une fenêtre de MOIs

entre 50 et 150 pour les deux bactéries commensales.

- Observation en microscopie confocale -

En ce qui concerne S. sanguinis, un faible nombre de bactéries viables marquées

au CFDA adhérant à la surface cellulaire a pu être observé par microscopie confocale

(Figure 28A). D’après l’observation de plans sériés au niveau cellulaire, aucune bactérie

n’est détectée en intracellulaire. Le cytosquelette des kératinocytes est visualisé par le

marquage des filaments d’actine (rouge). Les cellules demeurent de forme polyédrique.

F. nucleatum adhère également à la surface des kératinocytes (Figure 28B).

Cependant elles se regroupent en amas et paraissent plus nombreuses à la surface des

cellules épithéliales que S. sanguinis. Comme pour S. sanguinis l’observation de plans

sériés en microscopie confocale ne permet pas de mettre en évidence la pénétration des

bactéries F. nucleatum à l’intérieur des kératinocytes. Le marquage des microfilaments

d’actine, montre un cytosquelette de forme arrondie.

Les bactéries commensales S. sanguinis et F. nucleatum modulent l’expression

génique des ß-défensines de manière distincte.

Pour déterminer l’expression et la régulation des transcrits des peptides hßD2 et

hßD3 dans la lignée Ca9-22, les kératinocytes ont été mis en présence de différentes

MOIs de S. sanguinis et de F. nucleatum, pendant 15h. En comparaison, un traitement

avec du TNFα et du FSL1 a été réalisé (Figure 29).

Les transcrits d’hßD2 sont significativement induits par F. nucleatum par rapport au

contrôle avec des quantités relatives de 5.8, 19.5 et 25.7 pour les MOIs de 50, 100 et

150 respectivement (Figure 29A). Ceci met en évidence un « effet dose » de la MOI sur

l’induction d’hßD2. Le TNFα induit également l’expression des transcrits de ce peptide

(x12.8 et 5.3). En revanche, S. sanguinis tout comme le FSL1 n’ont pas d’effet sur

l’expression du peptide. En ce qui concerne les transcrits du peptide hßD3 (Figure 29B),

les mêmes acteurs induisent la synthèse de ses ARNms : F. nucleatum stimule 3.7, 8.2

et 14.8 fois son expression pour les MOI de 50, 100 et 150, respectivement. Le contrôle

TNFα induit 12 à 14 fois la quantité d’ARNm hßD3 par rapport aux cellules non traitées.

Comme pour hßD2, nous avons pu mettre en évidence un effet dose de la MOI sur


102

l’induction d’hßD3 dans le cas de F. nucleatum. Au contraire, S. sanguinis inhibe

significativement l’expression des ARNms de ce peptide (x0.3 pour les MOI de 100 et

150).

En l’absence de TLR2, S. sanguinis n’induit de réponse inflammatoire à l’inverse

de F. nuclatum

Pour étudier la régulation de l’expression et de la libération d’IL-8 par les Ca9-22,

les cellules ont été mises en présence de S. sanguinis et F. nucleatum à différentes MOIs

pendant 15 heures, en comparaison d’un traitement au TNFα (Figure 30).

En ce qui concerne la régulation des transcrits d’IL-8 (Figure 30A), F. nucleatum

induit leur expression par rapport au contrôle non traité, de 12.3, 13.3 et 20.4 fois aux

MOIs de 50, 10 et 150, respectivement, selon un « effet dose » de la MOI. En

comparaison, l’effet du témoin positif proinflammatoire, le TNFα, sur l’expression des

ARNm d’IL-8 est de 24 et 79 fois. A l’inverse, S. sanguinis n’induit pas significativement

une augmentation de la quantité d’ARNm d’IL-8. De plus, la libération et l’accumulation

d’IL-8 a également été étudiée (Figure 30B). F. nucleatum entraîne une très forte

libération d’IL-8 (3600, 3200 et 2800 pg/mL pour les MOIs de 50, 100 et 150,

respectivement). Dans ce cas, on ne rencontre pas d’effet dose mais un effet plateau. En

comparaison, le TNFα induit une libération environ trois fois moins importante d’IL-8

(entre 1000 et 1500 pg/mL). Les résultats obtenus avec S. sanguinis confirment

l’absence de modulation de l’expression des ARNms IL-8. Cette bactérie n’induit pas

significativement la libération d’IL-8.

En l’absence de TLR2, S. sanguinis n’a pas d’effet sur la réponse MMP-2 et MMP-

9 en comparaison de F. nucleatum.

Après mise en contact des cellules Ca9-22 avec S. sanguinis et F. nucleatum à

différentes MOIs, la régulation de l’expression génique et protéique des enzymes MMP-2

et MMP-9 a été étudiée. Le TNFα a été utilisé comme contrôle positif (Figure 31).

Par rapport au contrôle non traité, l’expression génique de MMP-9 (Figure 31 A) est

induite par F. nucleatum à toutes les MOIs (x30 environ) sans que l’on puisse mettre en

évidence un effet dose. L’expression de cette MMP est fortement induite par le TNFα

(x140-150). S. sanguinis n’a pas d’effet sur l’expression des transcrits de MMP-9 dans la

lignée Ca9-22.

En ce qui concerne MMP-2 (Figure 31B), son expression génique est

significativement inhibée par F. nucleatum à toutes les MOIs (x 0.2 environ) et par le


103

TNFα (x0.1-0.2). A l’inverse, S. sanguinis induit très légèrement mais significativement

l’expression de cette MMP à une MOI de 150.

L’analyse qualitative de l’activité gélatinase retrouvée dans différents surnageants

de culture a été réalisée par zymographie-gélatine en gel de polyacrylamide (Figure

31C). Le contrôle positif montre des activités gélatinases correspondant aux proformes

de MMP-9 (92 kDa) et de MMP-2 (72 kDa). Dans les surnageants provenant des

infections (S. sanguinis et F. nucleatum), aucune activité gélatinase n’est retrouvée au

poids moléculaire correspondant à la proforme de MMP-2. En ce qui concerne MMP-9, une

activité est retrouvée dans les surnageants de culture de Ca9-22 après stimulation par le

TNFα ou infection par F. nucleatum à une MOI de 100. L’activité correspond à la

proforme (≈92 kDa). Dans le contrôle non traité, cette bande active n’apparaît pas. En ce

qui concerne les surnageants de S. sanguinis, des activités gélatinases sont retrouvées à

des tailles de l’ordre de 150 kDa et à plus de 250 kDa. Ces bandes ne correspondent ni à

l’activité gélatinase des proMMP-2 ou MMP-2 ni à celle des proMMP-9 ou MMP-9 seules.

Des bandes sont également retrouvées en dessous de 50 kDa, pour la plupart des

échantillons.

TLR2 est impliqué dans la reconnaissance de S. sanguinis et dans l’induction

des ß-défensines.

Afin de compléter les résultats obtenus avec les extraits bactériens, mettant en

évidence l’implication du TLR2 dans la reconnaissance de S. sanguinis et dans l’activation

cellulaire qui en découle, nous avons comparé l’expression génique des deux ß-

défensines dans les Ca9-22 et les Ca9-22/TLR2 après infection par S. sanguinis (Figure

32).

S. sanguinis n’induit pas l’expression d’hßD2 dans la lignée Ca9-22, en revanche,

dans le clone Ca9-22/TLR2, la bactérie stimule l’expression des ARNm d’hßD2 à toutes

les MOIs testées (x 26.4, 34.3 et 52.9 pour les MOI de 50, 100 et 150 respectivement)

(Figure 32A). Ces résultats mettent en évidence un effet dose de la quantité de bactéries

sur l’expression d’hßD2. En comparaison, le TNFα induit l’expression des transcrits du

peptide dans les deux types cellulaires, FSL1 l’induit fortement, uniquement dans le clone

Ca9-22/TLR2 (x 34).

En ce qui concerne l’expression des transcrits d’hßD3 (Figure 32B), l’inhibition

significative provoquée par S. sanguinis dans la lignée (jusqu’à x0.3 environ) à des MOIs

de 100 et 150, disparaît au niveau du clone Ca9-22/TLR2. Les ARNm d’hßD3 sont induits

de manière significative mais moins importante par le TNFα (x 2.6) dans le clone Ca9-

22/TLR2 en comparaison de la lignée (≈x 12). Le FSL1 n’a pas d’effet sur l’expression

génique de ce peptide dans les deux types cellulaire.


104

TLR2 est impliqué dans la modulation de médiateurs de l’inflammation par S.

sanguinis.

Afin de connaître le rôle de TLR2 dans la modulation de l’inflammation par S.

sanguinis, les Ca9-22 et les Ca9-22/TLR2 ont été mises en présence pendant 15 heures

avec cette bactérie à différentes MOIs. Les acteurs moléculaires étudiés sont IL-8, MMP-2

et MMP-9 (Figure 33).

En ce qui concerne IL-8, la production de transcrits (Figure 33A) est induite par S.

sanguinis uniquement dans les Ca9-22/TLR2 (x14-19). Le TNFα induit significativement

l’expression génique de la chimiokine dans les deux types cellulaires, de manière 5 fois

plus élevé pour la lignée parentale (≈ x80) par rapport à la lignée transfectée (≈ x17).

La libération d’IL-8 est augmentée significativement par la bactérie à des MOIs de 100 et

150 uniquement dans le clone Ca9-22/TLR2 (Figure 33B).

S. sanguinis inhibe significativement l’expression des messagers de MMP-2

uniquement dans les cellules Ca9-22/TLR2 (x0.4-0.2) (Figure 33C). Dans la lignée

parentale, seule une tendance à l’induction de cette endopeptidase (x1.5) a pu être mise

en évidence à une MOI de 150. L’expression des messagers de MMP-2 sont inhibés par le

TNFα dans les deux types cellulaires.

En ce qui concerne les transcripts MMP9, S. sanguinis induit leur expression dans

les Ca9-22/TLR2 (x 6 environ) alors que la bactérie est sans effet sur leur expression

dans la lignée Ca9-22. Comme l’IL-8, les ARNm de MMP-9 (Figure 33D) sont également

fortement induits par le TNFα dans la lignée et le clone (x110 et 140 respectivement).

F. nucleatum module l’expression des ß-défensines par l’intermédiaire du TLR2 :

implication d’un autre récepteur ?

Afin de connaître l’implication du TLR2 dans la modulation de l’expression des ß-

défensines lors d’une infection par F. nucleatum, la lignée Ca9-22 et le clone Ca9-

22/TLR2 ont été mis en contact avec cette bactérie (MOI 100) pendant 15 heures.

L’expression génique de ces deux peptides a été étudiée (Figure 34).

En ce qui concerne la modulation d’hßD2 par F. nucleatum (Figure 34A),

l’expression des transcrits est induite dans les deux types cellulaires. Cependant, cette

induction est beaucoup plus forte dans le clone Ca9-22/TLR2. À une MOI de 100, la

quantité relative par rapport au contrôle non traité, d’environ 20 pour la lignée parentale,

s’élève à 120 pour les kératinocytes surexprimant le TLR2.

La bactérie induit également l’expression génique d’hßD3 dans les deux types

cellulaires (Figure 34B). Contrairement à ce qui a été observé pour hßD2, l’induction est


105

plus forte dans la lignée Ca9-22 et chute dans le clone Ca9-22/TLR2 . (x8.3 et 1.3,

respectivement).

La présence d’un TLR2 fonctionnel augmente la réponse inflammatoire des

cellules face à F. nucleatum.

Comme pour les ß-défensines, l’expression génique d’IL-8, de MMP-9 et de MMP-2

a été étudiée après infection des deux types cellulaires par F. nucleatum à une MOI de

100 (Figure 35).

La bactérie induit l’expression des transcrits d’IL-8 dans les deux types cellulaires

(Figure 35A). Cette stimulation est nettement plus forte dans le clone Ca9-22/TLR2 avec

une QR de transcrits par rapport au contrôle de 320 contre 13 pour la lignée Ca9-22.

L’expression des transcrits de MMP-9 suit le même profil qu’IL-8 dans les deux

types cellulaires (Figure 35B) avec une induction plus forte pour le clone Ca9-22/TLR2.

Le facteur d’induction passe de 30 pour la lignée parentale Ca9-22 à 100 pour le clone

Ca9-22/TLR2.

A l’inverse, l’expression génique de MMP-2 est significativement inhibée par la

bactérie à un niveau relativement proche quel que soit le modèle cellulaire (x 0.2, 0.3

pour les Ca9-22 et les Ca9-22/TLR2 , respectivement).

D) Discussion

La microscopie confocale a montré que les deux types bactériens adhèrent à la

surface des kératinocytes et qu’elles survivent. F. nucleatum semble avoir une plus

grande capacité d’adhésion que S. sanguinis sur la lignée épithéliale Ca9-22. Des

résultats similaires ont été décrits montrant que F. nucleatum avait un pouvoir

d’adhésion plus fort qu’un autre streptococcus commensal, Streptococcus cristatus, un

colonisateur précoce (49). Dans cette même étude il a été montré que la co-incubation

de F. nucleatum et de S. cristatus avec les cellules épithéliales gingivales KB contribuait à

améliorer l’attachement du streptoccoque de l’ordre de 10 fois (49).

Contrairement à S. sanguinis qui reste dispersé, la tendance de F. nucleatum à se

regrouper en amas pourrait expliquer une meilleure protection de cette bactérie. En ce

qui concerne S. sanguinis, aucun changement morphologique des cellules Ca9-22 n’a été

observé, comme cela a été décrit pour les cellules Hep-2 après adhésion de S. gordonii

(132). À l’inverse, l’adhésion de F. nucleatum induit des changements morphologiques

des cellules Ca9-22. Celles-ci semblent se dé-différencier et modifier leur adhésion sur le

support de culture en s’arrondissant. Cette observation semble coïncider avec le fait la


106

signalisation cellulaire qui découle de l’interaction de F. nucleatum et de cellules

épithéliales HaCat entraîne une augmentation de la migration cellulaire (185).

Par ailleurs, dans nos conditions expérimentales, nous n’avons pas pu mettre en

évidence de pénétration de l’une ou l’autre des bactéries. D’après la littérature

cependant, des bactéries commensales comme S. gordonii sont capables d’être

internalisées à faible taux par des cellules épithéliales (132). L’utilisation de test de

survie des bactéries, à des antibiotiques, basé sur la protection des bactéries

internalisées par la cellule devrait nous permettre de répondre plus précisément à cette

question (132).

Le kératinocyte gingival est constamment en contact avec une microflore buccale

très variée. Il répond activement aux sollicitations des microorganismes et de cette

réponse dépend l’homéostasie gingivale. Cette réponse cellulaire met en jeu un certain

nombre d’acteurs de l’immunité innée comme les récepteurs TLRs, exprimés par les

kératinocytes gingivaux (6, 171). Parmi ceux-ci, le TLR2, récepteur membranaire

externe, est impliqué dans la reconnaissance des microorganismes. Il reconnaît par

exemple les PAMPs des bactéries à Gram négatif comme le LPS de P. gingivalis (53) mais

aussi le LTA des bactéries à Gram positif (47). Chacun de ces motifs microbiens est

capable d’activer ce récepteur de façon différente (127). Ce récepteur pourrait donc être

fortement impliqué dans la distinction des différents microorganismes.

Dans le chapitre précédent, nous avons montré que le récepteur TLR2 reconnaissait

et discriminait les extraits de paroi membranaire de bactéries pathogènes, comme P.

gingivalis et de bactéries commensales. De plus, d’après nos premières données, ce

récepteur tient un rôle spécifique dans l’élaboration d’une signalisation permettant à

l’hôte de fournir une réponse immune innée, appropriée à différentes bactéries

commensales. Il permet ainsi à l’hôte de détecter et discriminer les extraits de paroi

membranaire d’une bactérie commensale « vraie » à Gram positif, comme S. sanguinis

et d’une bactérie commensale « opportuniste » à Gram négatif, comme F. nucleatum. Au

final, nos résultats suggèrent que l’interaction de PAMPs spécifiques et du récepteur TLR2

permet à la cellule épithéliale de distinguer les microorganismes et d’activer des

mécanismes de réponse cellulaire adaptés aussi bien à un phénomène de colonisation,

pathogène ou non, qu’à une situation d’équilibre entre le biofilm et l’hôte.

Dans ce troisième chapitre, nous nous sommes intéressés à l’implication

potentielle du récepteur TLR2 dans la régulation de la réponse immune innée épithéliale

gingivale vis-à-vis des bactéries vivantes, S. sanguinis et F. nucleatum.

Nous avons mis précédemment en évidence que la lignée Ca9-22 n’exprime pas

de TLR2 fonctionnel.


107

Dans ce chapitre, nous avons tout d’abord montré que dans cette lignée, F.

nucleatum, la bactérie commensale opportuniste à Gram négatif était capable d’induire

une réponse immune innée épithéliale assez forte, en stimulant l’expression des ß-

défensines, hßD2 et hßD3, et des médiateurs de l’inflammation, IL-8 et MMP-9. Au

contraire, nos résultats ont montré que l’expression de MMP-2 était inhibée par F.

nucleatum, comme par la cytokine pro-infammatoire, TNF-αααα. Il a été rapporté dans

d’autres études que l’infection de cellules épithéliales gingivales par cette bactérie

induisait l’expression des ß-défensines et de l’IL-8, supportant ainsi une partie de nos

résultats (77, 189).

Dans la lignée Ca9-22, S. sanguinis, la bactérie commensale vraie à Gram positif,

quant à elle, n’induit l’expression d’aucun de ces acteurs. Au contraire, la seule donnée à

noter est la tendance de cette bactérie à inhiber l’expression d’hßD3.

Les résultats obtenus après infection de Ca9-22 par ces deux bactéries nous

amènent à conclure, qu’à l’inverse de S. sanguinis, et en absence d’un TLR2 fonctionnel,

F. nucleatum est capable d’induire une réponse immune innée importante. Cela signifie

que la réponse cellulaire induite par F. nucleatum, détectée ici chez les Ca9-22, ne

résulte pas d’une reconnaissance directe de la bactérie par le récepteur TLR2. En ce qui

concerne S. sanguinis, l’inhibition de l’expression d’hßD3 ne serait pas, de même,

modulée via le TLR2. Un ou plusieurs autres récepteurs pourraient donc être impliqués

dans l’activation des kératinocytes gingivaux par ces bactéries.

Pour s’enquérir du rôle spécifique du TLR2 dans l’élaboration de cette réponse

spécifique, nous avons exposé le clone Ca9-22/TLR2, sur-exprimant le récepteur, aux

deux bactéries commensales.

La réponse cellulaire des kératinocytes gingivaux vis-à-vis de la bactérie

commensale « vraie », S. sanguinis s’est avérée tout à fait différente. En effet, S.

sanguinis est alors devenu capable d’induire une réponse antimicrobienne conséquente,

sous la forme du peptide hßD2, ainsi qu’une réponse inflammatoire, notamment par

l’intermédiaire de la libération d’IL-8. Cette dernière demeure cependant « contrôlée »

par rapport à celle, très forte, induite par F. nucleatum, chez les cellules Ca9-22/TLR2.

De plus, l’expression d’hßD3 qui était inhibée en absence d’un TLR2 fonctionnel, ne l’est

plus, c’est-à-dire que le niveau d’expression basal est conservé. Enfin, S. sanguinis qui

n’avait pas la propriété d’inhiber l’expression de MMP-2 en l’absence d’un TLR2

fonctionnel devient apte à restreindre l’expression de cette protéase matricielle, chez les

cellules Ca9-22/TLR2.

En ce qui concerne, F. nucleatum, la réponse cellulaire des kératinocytes gingivaux

n’est pas foncièrement différente, mais plutôt amplifiée en présence d’un TLR2

fonctionnel. Ainsi la bactérie induit une réponse antimicrobienne plus robuste pour hßD2.

Il est à noter cependant que l’expression du peptide hßD3 devient à l’inverse plus


108

faiblement induite. De son côté, la réponse inflammatoire épithéliale est, elle, très

fortement augmentée, que ce soit l’IL8 ou MMP-9, alors qu’elle l’était de manière

seulement modérée pour la bactérie commensale « vraie » S. sanguinis.

Le récepteur TLR2 module l’expression de MMP-2 uniquement dans le cas de la

bactérie S. sanguinis. En effet, son expression est significativement inhibée par les

infections S. sanguinis surtout dans la lignée Ca9-22/TLR2 exprimant le TLR2 fonctionnel.

A l’inverse, les infections par F. nucleatum inhibent l’expression de MMP-2 en présence

(Ca9-22/TLR2) ou non (Ca9-22) du TLR2 fonctionnel, comme c’est le cas pour la

stimulation au TNFα. Des résultats non montrés ici obtenus après exposition de KGNs

aux extraits de F. nucleatum révèlent que l’expression génique de cette enzyme peut

être inhibée. Les extraits de S. sanguinis n’ont pas d’effet sur l’expression de MMP-2. Ces

résultats corroborent ceux obtenus sur le clone Ca9-22/TLR2 avec les bactéries vivantes.

L’analyse de l’activité gélatinase retrouvée dans les surnageants de culture des

expériences d’interaction bactéries/cellules hôtes, par zymographie sur gel nous a

montré qu’il n’y avait pas d’expression protéique de l’enzyme MMP-2 quel que soit le

traitement ou l’infection effectuée. Ceci confirme donc nos résultats obtenus concernant

les transcrits MMP-2.

En ce qui concerne MMP-9, F. nucleatum induit son expression en présence ou en

absence d’un TLR2 fonctionnel. Cependant, en présence du récepteur l’induction obtenue

est beaucoup plus élevée. Ainsi, même avec la lignée Ca9-22, une activité gélatinase est

retrouvée dans le surnageant de culture des cellules exposées à F. nucleatum à un poids

moléculaire correspondant à celui de la pro-forme de MMP-9. Ce résultat est identique à

celui obtenu avec les surnageants de cellules stimulées par le TNF-αααα, notre contrôle pro-

inflammatoire. Dans les deux cas, cela pourrait signifier que la bactérie induit

l’expression protéique de cette MMP sans que sa forme active ne puisse être détectée

dans nos conditions expérimentales. Ainsi des études ont montré que F. nucleatum

pouvait se lier à la pro-forme de cette endopeptidase, pour améliorer son pouvoir invasif

en utilisant cette enzyme protéolytique, activée par d’autres enzymes de l’hôte (60). En

revanche pour S. sanguinis, la présence d’un récepteur TLR2 fonctionnel est

indispensable pour qu’une induction des transcrits de l’enzyme MMP-9 puissent avoir lieu.

Or, les données de zymographie suggèrent l’apparition d’activités gélatinase identiques

que ce soit dans les surnageants de culture des cellules Ca9-22 ou Ca9-22/TLR2,

infectées par cette bactérie. Cependant, ces activités sont portées par des protéines ou

des complexes protéiques migrant à plus de 150 kDa et 250 kDa, suggérant qu’il ne

s’agisse ni de MMP-9, ni de MMP-2, seules. D’après la littérature, plusieurs hypothèses

sont possibles pour expliquer l’apparition de bandes à de tels poids moléculaires. Ainsi, il

a été décrit que MMP-9 pouvait s’associer en homodimère (23) ou avec d’autres

protéines, comme son inhibiteur TIMP1 (23), mais également avec MMP-1 et MMP-8 (23,


109

65) ou des protéases bactériennes (135). Par ailleurs, il a été montré que S. sanguinis

synthétise l’IgA1 protéase, clivant spécifiquement les IgA salivaires et facilitant la

colonisation du tissu par cette bactérie (146). Or, il a également été décrit que MMP-9

pouvait se dimériser avec cette enzyme bactérienne (135).

Ces résultats suggèrent que le récepteur TLR2 est fortement impliqué dans la

reconnaissance de S. sanguinis et de F. nucleatum. L’activation cellulaire par la bactérie

commensale « vraie » à Gram positif est beaucoup plus dépendante de la présence de ce

récepteur. S. sanguinis est un colonisateur précoce très impliqué dans le maintien de

l’homéostasie gingivale (180). En l’absence du récepteur, les cellules ne réagissent pas, il

n’y a donc pas d’instauration d’un état de veille. En ce qui concerne F. nucleatum, TLR2

est impliqué dans sa reconnaissance et la réponse cellulaire qui en découle, mais il n’est

pas le seul. D’autres PRRs doivent intervenir (TLR4 par exemple).

L’activation cellulaire résultant des infections n’est pas identique pour les deux

bactéries. Cette discrimination pourrait provenir du TLR2 lui-même qui a la propriété de

se coupler soit au TLR1 soit au TLR6 (127) selon le motif bactérien qu’il reconnaît.

Les travaux de recherche du troisième chapitre de la partie expérimentale font

l’objet d’un manuscrit en cours d’écriture.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

110



111

Les résultats présentés dans la première partie des travaux expérimentaux ont

permis de s’assurer que la réponse immune innée, mise en place au niveau de

l’épithélium gingival, pouvait être étudiée in vitro, grâce à l’utilisation de différents

modèles fonctionnels, d’une part tissulaire et d’autre part cellulaire.

Ces outils biologiques devaient être développés afin non seulement d’être utilisés

dans le cadre de la recherche appliquée et l’évaluation d’actifs pour Pierre Fabre Oral

Care, mais aussi pour l’étude et la compréhension de l’immunité innée épithéliale

spécifique de la sphère buccale.

En ce qui concerne les modèles tissulaires, nous avons montré que l’épithélium

gingival reconstruit, modèle tissulaire tridimensionnel, était un tissu correctement

différencié en comparaison d’un épithélium gingival natif. En effet, il exprime un grand

nombre d’acteurs moléculaires témoignant d’une barrière épithéliale intègre, en terme de

cohésion tissulaire, d’imperméabilité et de protection vis-à-vis de l’extérieur (cavité

buccale). De plus, nos résultats ont prouvé qu’il était fonctionnel en terme de réponse

immune innée antimicrobienne. En effet, le contact de motifs bactériens ou de cytokines

pro-inflammatoires induit l’expression d’acteurs de l’immunité innée que sont les ß-

défensines humaines 2 et 3 et la cathélicidine LL-37 chez les kératinocytes de

l’épithélium reconstruit. Ainsi, le modèle reconstruit arbore des caractéristiques proches

du tissu natif sans présenter les problèmes de variabilité biologique individuelle lié à

l’historique de chaque donneur. Un intérêt supplémentaire de ce modèle consiste en la

possibilité d’effectuer des stimulations topiques, à l’inverse du tissu natif, dont les

explants sont petits et difficilement orientables.

En ce qui concerne les modèles cellulaires, les résultats ont montré que la culture

de NGKs à partir d’explants gingivaux était possible. Cette approche a comporté

cependant un certain nombre d’inconvénients, comme la faible quantité de kératinocytes

récupérée au final, conditionné en partie par un niveau d’expansion cellulaire bas

(nombre de passages en culture limité) ainsi que la variabilité biologique déjà décrite

pour les explants. Nous avons donc décidé d’utiliser la lignée Ca9-22 pour pallier ces

difficultés. Notre choix a été motivé par la capacité de cette lignée à exprimer les ß-

défensines de manière basale et après induction par des cytokines pro-inflammatoires ou

des motifs bactériens.

Néanmoins, chaque type de modèles peut avoir des spécificités d’utilisation et

présenter un intérêt. Le modèle cellulaire permet d’établir un nombre d’expérimentations

différentes pratiquement illimité et de reproduire une même expérience un plus grand

nombre de fois. Ces cellules permettent d’évaluer des niveaux d’expression et des effets

doses. Cependant il faut tenir compte du fait que cette lignée issue d’un carcinome est

mutée en p53 (97), ce qui pourrait avoir un impact sur leur immuno-réactivité. C’est en

partie pour cela que le modèle tissulaire représente un modèle de seconde intention


112

intéressant permettant la confirmation de données obtenues sur lignée. De plus par

rapport à la culture monocouche en général, le modèle tri-dimensionnel permet d’étudier

les variations de localisation d’expression des cibles d’intérêt au sein du tissu.

En terme de recherche appliquée, l’utilisation de ces modèles cellulaires et

tissulaires a permis d’évaluer l’action d’un principe actif du groupe Pierre Fabre, l’APG,

sur la modulation de l’immunité innée gingivale épithéliale. Nos résultats ont montré que

cet actif d’origine chimique permet l’induction de l’expression des peptides

antimicrobiens, hßD2, hßD3 et LL37. De plus, cette induction n’est pas accompagnée

d’une réponse inflammatoire de type IL8 pouvant se révéler nocive pour la cellule. Tous

les modèles utilisés ont confirmé ce résultat. Grâce à la stimulation de la synthèse des

peptides antimicrobiens endogènes, ce principe actif pourrait être positionné comme

régulateur de la microflore gingivale permettant de maintenir un état d’homéostasie.

Nous verrons plus loin les perspectives expérimentales pour définitivement défendre ces

propriétés.

Cette première partie a donc montré que les modèles mis en place sont des outils

d’évaluation fonctionnels pour la recherche dentaire.

Les données présentées dans la deuxième et la troisième partie de cette étude

sont focalisés sur la réponse de l’hôte vis-à-vis de microorganismes oraux commensaux,

acteurs importants de l’homéostasie parodontale. En particulier, nous avons étudié les

effets de S. sanguinis, bactérie commensale « vraie » à Gram positif non pathogène et

de F. nucleatum, bactérie commensale « opportuniste » à Gram négatif, pouvant être

impliquée dans le déclenchement de la maladie parodontale.

Nos résultats ont permis de mettre en évidence la forte implication du récepteur

TLR2 dans la reconnaissance et la discrimination d’extraits de paroi membranaire des

deux bactéries commensales. En effet, ce récepteur présent à la surface des

kératinocytes gingivaux permet aux cellules de discriminer des extraits membranaires de

la bactérie commensale vraie, S. sanguinis de ceux de la bactérie commensale

opportuniste, F. nucleatum, et ainsi de moduler leur réponse de manière distincte et

adaptée.

Lorsque le récepteur TLR2 est fonctionnel, les extraits de S. sanguinis n’induisent

pratiquement aucune réponse antimicrobienne et inflammatoire : ils semblent comme

« tolérés » par l’hôte. Au contraire, les extraits de F. nucleatum induisent des réponses

antimicrobiennes et inflammatoires encore plus forte. Ces résultats suggèrent

premièrement que S. sanguinis, par l’intermédiaire de ses extraits, aurait un rôle

important dans le maintien de l’homéostasie épithéliale gingivale et qu’un des acteurs de

cette régulation serait le récepteur TLR2. Deuxièmement, ces données soulignent le fait


113

que ce PRR pourrait être impliqué dans la transition bactérie commensale opportuniste

vers un caractère pathogène, opérable par F. nucleatum.

Pour appuyer ces premières conclusions et se rapprocher de conditions

physiologiques, les kératinocytes ont été exposés aux bactéries vivante, S. sanguinis et

F. nucleatum. Nos résultats ont montré tout d’abord que dans nos conditions

expérimentales, les deux types bactériens étaient capables d’adhérer à la surface des

cellules, avec une capacité d’adhésion plus forte pour F. nucleatum que S. sanguinis. La

morphologie des kératinocytes infectés qui résulte des deux infections est différente

entre les deux types bactériens. Avec F. nucleatum, les kératinocytes semblent adopter

une phénotype moins différencié. Nos expériences d’interaction bactéries vivantes –

kératinocytes ont permis par ailleurs de mettre en évidence un effet dose des bactéries

sur l’expression des peptides antimicrobiens, suggérant la spécificité de leur effet sur ce

paramètre dans notre modèle.

En ce qui concerne la réponse innée épithéliale proprement dite, nous avons pu

montrer que F. nucleatum pouvait induire une forte réponse antimicrobienne et

inflammatoire sans le concours du récepteur TLR2 (Ca9-22). Cependant la présence du

récepteur (Ca9-22/TLR2) joue un rôle important puisqu’elle permet d’amplifier cette

réponse, jusqu’à mener à la destruction tissulaire. Ce résultat suggère qu’un ou plusieurs

autres récepteurs seraient impliqués dans la reconnaissance de F. nucleatum. Les voies

d’activation résultant de l’interaction de la bactérie et de ces différents récepteurs

pourraient être indépendantes ou combinées.

La modulation de la réponse cellulaire épithéliale par la bactérie commensale

« vrai », S. sanguinis est, quant à elle, très liée à la présence du TLR2, sans pour autant

exclure l’intervention d’autres récepteurs. La présence d’un TLR2 fonctionnel, permet

d’une part de lever l’inhibition de la réponse antimicrobienne hßD3 provoquée par la

bactérie, et d’autre part d’augmenter la réponse hßD2. De plus, l’expression de l’IL-8 et

de MMP-9 n’est que légèrement induite par rapport à la stimulation par F. nucleatum. De

plus, on retrouve une inhibition de l’expression de MMP-2 par S. sanguinis en présence

du TLR2. Ces résultats prouvent que la bactérie commensale « vraie » induit une réponse

kératinocytaire contrôlée conduisant à l’instauration d’un état de veille de la part de

l’hôte.

Il contribue largement à la reconnaissance et à la discrimination des deux

bactéries commensales, vraie et opportuniste. Cette propriété du TLR2 de discriminer

commensales vraies et commensales opportunistes pourrait conférer à la cellule la

capacité d’élaborer une réponse appropriée. À ce stade de l’avancée de nos travaux, ce

récepteur pourrait être impliqué d’une part dans la transition d’un profil commensal

« opportuniste » à pathogène pour F. nucleatum, et d’autre part dans la reconnaissance

d’un profil commensal « vrai ».


114

Cette double compétence, à savoir le maintien de l’équilibre de l’écosystème ou la

transition d’une situation homéostatique à pathologique en terme de défense cellulaire,

pourrait différemment s’exercer par le récepteur TLR2, selon l’environnement bactérien

et l’état de réactivité de l’hôte. Il permettrait ainsi à l’hôte, et en particulier à la cellule

épithéliale gingivale, d’adapter son niveau d’immuno-réactivité afin soit de prévenir le

danger, soit d’y répondre de manière plus agressive, en contribuant secondairement à la

mise en place de l’immunité adaptative.

L’ensemble de ce travail ouvre des perspectives multiples d’un point de vue

fondamental mais aussi appliqué.

Le modèle tissulaire reconstruit, obtenu à partir de kératinocytes gingivaux

primaires poolés, a été caractérisé de manière poussée en terme de différenciation

cellulaire et partiellement en terme de réponse immune innée et inflammatoire. Notre

perspective immédiate serait de compléter l’étude de cet épithélium quant à sa capacité

à exprimer des acteurs d’immuno-réactivité et de régénération tissulaire fonctionnels

(Différents PRRs solubles ou membranaires, autres récepteurs comme les PAR, autres

peptides antimicrobiens, régulateurs de la réponse inflammatoire, chimiokines immuno-

stimulantes ou immuno-suppressives, enzymes…).

Un modèle tissulaire épithélial comprenant des cellules dendritiques pourrait nous

permettre d’aborder la notion d’éducation de ces dernières par le kératinocyte en terme

de signaux de tolérance et d’homéostasie. Cette propriété des cellules épithéliales

permettrait aux bactéries commensales d’être supportées au niveau de l’épithélium leur

permettant en retour de participer à l’homéostasie (notion de coopération dans

l’écosystème).

L’interaction de différentes bactéries commensales et pathogènes, de manière

séparée, concomitante ou séquentielle avec le tissu épithélial reconstruit devrait apporter

des informations sur :

- l’importance du rôle du récepteur TLR2 dans la discrimination et

l’établissement d’une réponse distincte entre les différents

microorganismes (primocultures transfectées par un siRNA TLR2) ;

- l’interférence et la compétition entre différents micro-organismes

commensaux, et entre commensaux et pathogènes (microscopie confocale

en temps réel);


115

- la notion d’éducation de l’épithélium par des colonisateurs précoces et

son effet sur l’immunoréactivité du kératinocyte puis sur l’adhésion et la

pénétration de bactéries commensales opportunistes ou pathogènes ;

- d’autres aspects de l’action des bactéries sur le tissu pourraient être

abordés comme l’intégrité de la barrière épithéliale (relocalisation des

jonctions serrées, relargage de molécules bactériennes comme des

protéases, relargage de MMP par l’hôte).

D’un côté, pourraient être étudiés les paramètres de la réponse de l’hôte et d’un

autre côté, les conséquences sur le pouvoir invasif des différentes bactéries qui nécessite

l’adhésion sur le tissu et éventuellement la pénétration.

En ce qui concerne l’approfondissement de l’étude du rôle du TLR2, nous étudierons

quel dimère (TLR2/TLR1 ou TLR2/TLR6) est impliqué pour la discrimination des 2

bactéries, S. sanguinis et F. nucleatum, en fonction du motif bactérien reconnu.

L’utilisation d’anticorps bloquants ou de siRNA dirigés contre ces récepteurs pourrait

préciser lequel des deux hétérodimères est impliqué dans l’induction d’une tolérance

épithéliale face à la bactérie SS.

Par ailleurs, l’utilisation de souches bactériennes sauvages issues d’échantillons

cliniques pourrait nous indiquer quelles espèces ou sous-espèces induisent des signaux

homéostatiques plus ou moins efficaces, dans le cas de bactéries commensales

« vraies ». De même, pour F. nucleatum nous pourrions obtenir des informations sur la

capacité des différentes sous-espèces à promouvoir plus spécifiquement ou non une

rupture de l’homéostasie épithéliale.

En ce qui concerne la recherche appliquée à l’évaluation d’actifs dans le domaine

dentaire, les premiers résultats obtenus avec les APGs ouvrent plusieurs perspectives en

terme de développement.

Le modèle tissulaire pré-traité par cet actif donc stimulé en terme de réponse

antimicrobienne sera mis en contact avec différentes bactéries afin de confirmer son

potentiel en terme d’action préventive sur l’invasion bactérienne. Nous tenterons de

montrer que cet actif peut être impliqué dans la ré-équilibration de la microflore gingivale

permettant de maintenir un état d’homéostasie. Dans la sphère buccale, l’objectif est de

promouvoir des actifs formulés capables de favoriser le développement de bactéries

commensales et ainsi de faire basculer la balance vers la santé gingivale en prévenant la

maladie parodontale. Parmi les actifs développés par les Laboratoires Pierre Fabre, une

large gamme d’extraits végétaux proposés par la phytofilière pourraient être évalués

grâce aux modèles d’étude mis en place dans ce travail expérimental.


116

Un autre axe qui se développe beaucoup dans le domaine du dentaire est

l’utilisation de microorganismes probiotiques qui prépareraient l’épithélium et

permettraient de prévenir la maladie parodontale. Ils pourraient également servir à la ré-

équilibration de la microflore gingivale en interférant avec l’adhésion de la microflore

pathogène ou en s’attaquant à celle-ci.

COMMUNICATIONS AFFICHEES

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131


IADR AMSTERDAM 2005 RECONSTRUCTED GINGIVAL EPITHELIUM CHARACTERIZATION FOR FURTHER STUDY IN

INNATE IMMUNITY 1,2Peyret-Lacombe A., 1Duplan H., 2Brunel G., 3Watts M., 1Charveron M. 1CERPER/IRPF Hotel Dieu, 2 rue Viguerie, 31025 Toulouse ; France ; 2Laboratoire de

Biologie Buccale Faculté de Chirurgie Dentaire, 3, chemin des Maraichers 31062

Toulouse, France ; 3Oral Care, PFM, 29 avenue du Sidobre 81106 Castres, France.

ESDR PARIS 2006 GINGIVAL INNATE IMMUNITY : INDUCTION OF β-DEFENSINS BY COMPONENTS OF

PARODONTAL BACTERIA THROUGH TOLL-LIKE RECEPTORS

A. Peyret-Lacombe1,2, H. Duplan1, G. Brunel2, M. Watts3 and M. Charveron1 1 CERPER/IRPF Hôtel Dieu, 2 rue Viguerie, 31025 Toulouse, France, 2 Laboratoire de Physio-

Pathologie et Thérapeutiques Bucco-Dentaires, Université Paul Sabatier, Toulouse III, France, 3 Oral

Care, PFM, 29 avenue du Sidobre 81106 Castres, France

SFPIO LA BAULE 2007 RÉGULATION DIFFÉRENCIELLE DE LA DÉFENSE INNÉE GINGIVALE

PAR DIFFÉRENTS EXTRAITS BACTÉRIENS

Peyret Lacombe A1, 2., Brunel G2., Watts M3., Charveron M1. et H. Duplan1 1 Institut de Recherche Pierre Fabre, Laboratoire de Biologie Cellulaire, 2 rue Viguerie,

BP3071, 31025 Toulouse Cedex 3, 2 Laboratoire de Physio-Pathologie et Thérapeutiques

Bucco-Dentaires, Université Paul Sabatier, Toulouse III, 3 Oral Care, PFM, 29 avenue du

Sidobre 81106 Castres, France.

COMPARAISON EXTRAITS BACTÉRIENS-BACTÉRIES VIVANTES DANS LA RÉPONSE

IMMUNITAIRE INNÉE ÉPITHÉLIALE ET SANTÉ PARODONTALE.

Peyret-Lacombe A.2, Poulet P.P.1, Duplan H.2, Signat B.1, Duffaut D.1, Roques C.3,

Charveron M.2, Watts M.2 et Brunel G.1 1 Faculté de Chirugie dentaire de Toulouse, 2 Institut de Recherche Pierre Fabre et Pierre

Fabre Oral Care, 3 Faculté des Sciences Pharmaceutiques de Toulouse.


132

IADR THESSALONIK 2007 TWO COMMENSAL BACTERIA INDUCED DIFFERENTIAL GINGIVAL

INNATE IMMUNE RESPONSE

A. PEYRET LACOMBE1,2, B. SIGNAT2, P.P. POULET2, M. WATTS3, D. DUFFAUT2, G.

BRUNEL2, and H. DUPLAN1, 1 Pierre Fabre Research Institute, Toulouse, France, 2 Université Paul Sabatier Toulouse

III, France, 3 Pierre Fabre MEDICAMENT, Castres, France.

LAURATE BUTYL GLUCOSIDE ENHANCES ORAL INNATE IMMUNITY WITHOUT

INCREASING INFLAMMATION

PEYRET LACOMBE1, 3, M. WATTS2, M. CHARVERON1, G. BRUNEL3, and H. DUPLAN1 1 Pierre Fabre Research Institute, Toulouse, France, 2 Pierre Fabre MEDICAMENT, Castres,

France, 3 Université Paul Sabatier Toulouse III, France

ABSTRACT

133

ABSTRACT

STUDY OF GINGIVAL EPITHELIAL IMMUNO-REACTIVITY

IN RESPONSE TO TWO COMMENSAL BACTERIA :

TLR2 INVOLVEMENT

Gingival epithelium, exposed to oral microflora, protects underlying tissues in

maintaining periodontal homeostasis. To do this, keratinocytes possess Pattern

Recognition-Receptors (PRRs) that are able to recognize specifically various bacterial

patterns. Communicated cellular informations induce innate immune response, in

particular antimicrobial peptides (AMPs) production and inflammation mediators. Our

results show that gingival keratinocytes are able to recognize and discriminate true

commensal bacteria (S. sanguinis) or opportunistic bacteria (F. nucleatum) through a

PRR, the Toll-like Receptor 2 in modulating AMP expression, the human ß-defensins 2

and 3 and this of inflammation mediators. This keratinocyte differential activation allow

them to provide an adapted response and to maintain periodontal homeostasis.

PEYRET-LACOMBE ALEXIS

ETUDE DE L’IMMUNO-REACTIVITE EPITHELIALE GINGIVALE EN REPONSE A

DEUX BACTERIES COMMENSALES : IMPLICATION DU TLR2 Directeur de thèse : PR G. BRUNEL Co-directeur : DR H. DUPLAN Salle des Actes, Faculté de Chirurgie Dentaire, Université Paul Sabatier, Toulouse III, le 19 décembre 2007 à 14h00 RESUME

L’épithélium gingival, exposé à la microflore buccale, protège les tissus sous-jacents en

maintenant une homéostasie parodontale. Pour ceci, les kératinocytes possèdent des

Pattern Recognition-Receptors (PRRs) capables de reconnaître spécifiquement différents

motifs bactériens. Les informations cellulaires transmises induisent la réponse immune

innée et notamment la production de peptides antimicrobiens (PAMs) et de médiateurs

de l’inflammation. Nos résultats montrent que les kératinocytes gingivaux sont capables

de reconnaître et de discriminer des bactéries commensales vraies (S. sanguinis) ou

opportunistes (F. nucleatum) par l’intermédiaire d’un PRR, le Toll-like Receptor 2 en

modulant l’expression de PAMs, les ß-défensines humaines 2 et 3 et de médiateurs de

l’inflammation. Cette activation différentielle des kératinocytes leur permet de fournir une

réponse adaptée et de maintenir l’homéostasie parodontale.

MOTS CLES : épithélium gingival, bactéries parodontales, immunité innée, Toll-like

Receptors, discrimination bactérienne, β-défensines, cytokines pro-inflammatoires

DISCIPLINE : Immunologie

Laboratoire de Physio-Pathologie et Thérapeutiques Bucco-dentaires, Université Paul

Sabatier, Toulouse III

Département de Pharmacologie cellulaire/Institut de Recherche Pierre Fabre-Hôtel

Dieu, Toulouse

Documents

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER U.F.R …thesesups.ups-tlse.fr/112/1/Peyret-Lacombe_Alexis.pdf · Figure 15. Schéma simplifié des voies de signalisation des TLRs et des