Utilisation de sondes chimiques dans l'étude des F1-ATPases

Biochhnie, 68 (1986) 347-355 © Soci6t~ de Chimie biologique/Elsevier, Paris

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Revue

Utilisation de sondes chimiques dans l'6tude des F,-ATPases

Jo~l LUNARDI

Laboratoire de Biochimie, D~partement de Recherche Fondamentale, Centre d'Etudes Nucldaires, 85X, 38041 Grenoble, France

(Recue le 16-10-1985; acceptde le 27-11-1985)

R~sum~ - L 'appor t de l'utilisation des sondes chimiques/~ la compr6hension de la structure et de la fonction des Fi-ATPases est bri6vement r6sum6. Les informations apport6es par les r6actifs chimiques qui se fixent de mani~re covalente et leurs implications dans l'61ucidation du m6canisme r6actionnel des Fi-ATPases sont plus particuli~rement discut6es.

Ft-ATPases / modifications chimiques I photo-affinit~

S u m m a r y - Chemica l p robes fo r the s tudy o f F~-ATPases . The purpose of the present review is to discuss in brief the use of chetnical probes for the study of the structure and the fimction of FFA TPases. Special focus is brought on probes that bind covalently to the proteins.

Ft-A TPases I chemical modifications I photoaffinity

Introduction

Ces dix derni6res ann6es ont fit6 le t6moin d 'un d6veloppement consid6rable de l'utilisation des sondes chimiques, en particulier des r6actifs photo- activables et des r6actifs de groupe dans le domaine de la bio6nerg6tique. Les H+-ATPases pr6sentes dans les chloroplastes, les bact&ies et les mitochondries sont routes capables de catalyser la syntb6se et l 'hydrolyse de I 'ATP et de nombreuses analogies apparaissent lors de l '6tude de ces diff6rentes ATPases tant au niveau de la structure primaire [1] qu 'au niveau de l 'organisation structurale des enzymes ou des m6canismes r6actionnels [2-4]. Ces ATPases sont constitu6es de deux parties, un secteur membranaire hydrophobe F o qui joue le r61e

de canal/~ protons [5] et un secteur extra membranaire hydrophile F 1, form6 de 5 sous-unit6s ~,/3, y, 8 et e, qui porte les sites catalytiques de l 'enzyme [6] et auquel nous nous int6resserons plus particu- li6rement.

Les sondes uti l isables pour l '6 tude des H+-ATPases se divisent en deux grandes classes: d 'une part, les mol6cules interagissant de faqon non covalente avec l 'enzyme et d 'autre part, celles dont l ' interaction avec la prot6ine se traduit par la formation d 'une liaison covalente. Parmi les mol6cu- les appartenant au premier type de sondes, on rencontre des analogues de substrats tels que l'ad6nylyl-imidodiphosphate (AMPPNP) [7], le 2', 3'-O-(2,4,6-trinitroph6nyl)-ADP/ATP (TNP- ADP/ATP) [8], le NI,N6-6th6no-ADP/ATP [9] ....

Abrdviations: MFt: facteur de couplage F, de mitochondries; BF,: facteur de couplage F, de bact~ries; CF,: facteur de couplage F, de chloroplastes; ECF,: facteur de couplage F, d'E. coli; IF=: inhibiteur naturel de MF, ; OSCP: prot~ine conf~rant la sensibi- lit6/t l'oligomycine; Nbf: 4-chloro-7-nitrobenzofurazan ; DCCD : dicyclohexylcarbodiimide; TNM : t~tranitromfthane; EEDQ: N- fithoxy-carbonyl-2-6thoxy-l,2-dihydroquinoline; FSBA: p-fluorosulfonyl-5'-ad6nosine.

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des agents activateurs comme certains anions [10, 11] ou inhibiteurs comme l 'aurovertine [12] ou l'efrapeptine [13]. Les param~tres de fixation de ces sondes sur leurs sites strat6giques ont 6t6 d6ter- min6s. Certaines de ces mol6cules ont permis de suivre les changements de conformation des H+-ATPases que ce soit dans leurs formes isol6es ou dans celles int6gr6es h la membrane. Les r6ac- tifs qui interagissent avec les enzymes en formant une liaison covalente et sur lesquels nous focalise- rons notre attention sont g6n6ralement divis6s en deux grandes cat6gories: Ies r6actifs de groupes d 'une part, et les r6actifs de sites, d 'autre part.

- Les r6actifs de groupes sont des modificateurs chimiques s61ectifs de groupements fonctionnels port ,s par certains acides amin6s. Leur fixation conduit le plus souvent ~ une inactivation et permet l 'identification des sites essentiels. Certains r6actifs n'alt~rent pas l'activit6 biologique de l 'enzyme apr6s fixation et sont ainsi utilisables comme marqueurs. L'interpr6tation des r6sultats d'expfriences de modification chimique n'est pas toujours directe. Deux remarques peuvent ~tre fai- tes : d 'une part, la s61ectivit6 d 'un r~actif envers un acide amin6 donn6 est rarement absolue et impo- sera un contr61e strict des conditions exp6rimenta- les, d 'autre part, la modification d 'un acide amin6 situ6 ~ distance du site actif peut entraTner une per- turbation de celui-ci par un changement de conformation propag6 aboutissant ~ l 'inactivation de l'enzyme. La protection contre l 'inactivation obte- hue par addition du substrat avant le r6actif chimique est une bonne indication sur le fait que la modification a eu lieu au niveau du site actif de l 'enzyme. Le nombre de r6sidus par site catalytique dont la modification est n6cessaire pour abou- tir h une inactivation compl~te de l 'enzyme est mesurable h partir des cinftiques d'inactivation si celles-ci sont de pseudo premier ordre. II est n6ces- saire de compl~ter ces donn6es par des mesures directes de fixation en utilisant des r~actifs marqu6s par un isotope radioactif ou poss6dant des propri6- t6s spectroscopiques caractfristiques.

Les agents rfticulants sont assimilables ~ des r6ac- tifs de groupes, ils se fixent sur des groupements fonctionnels port6s par deux acides amin6s voisins [14]. En faisant varier la distance s6parant les deux groupements r6actifs de l 'agent de pontage, il est possible d'6valuer les distances entre deux r6sidus localis6s dans diff6rentes sous-unit6s du complexe F I ou F 0 - F 1. Cependant l 'absence de pontage ne suffit pas pour conclure h l'61oignement de deux sous-unit6s: la formation d 'un pont n6cessite en effet, non seulement la proximit6 spatiale ties peptides mais 6galement celle de deux groupements

r6actifs sp6cifiques. - Les r6actifs de sites regroupent les marqueurs

d'affinit6 et de photo-affinit6, et sont largement uti- lis6s dans les 6tudes fonctionnelles et topographi- ques des sites catalytiques ou r6gulateurs des H ÷-ATPases. Un marqueur d'affinit6 se caract6- rise par deux parties, la premiere poss6de une structure proche de celle du substrat capable de reconnaTtre le site actif et la seconde comporte un groupement chimique pouvant r6agir avec un acide amin6 pour former une liaison covalente. Les marqueurs de photo-affinit6 poss~dent un groupement photoactivable: nitr6ne, carb6ne.. . , inerte ~ l 'obs- curit6 ce groupe est activ6 par la lumi~re pour g6n6- rer un interm6diaire capable de r6agir avec virtuellement tous les groupes chimiques voisins [15,16].

Modificateurs de groupes des F~-ATPases

Modificateurs des groupes carboxyles

Les travaux r6alis6s avec de nombreux carbodiimides, et en particulier le dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) [17], ont permis de montrer le r61e essentiel jou6 par un groupe carboxyle dans le m6canisme catalytique des H+-ATPases. Lors de la r6action du DCCD avec un groupe carboxyle il y a tout d 'abord formation d 'un d6riv6 de type O-acylur6e transitoire qui se stabilise ensuite en un complexe N-acylur6e; une alternative est celle qui conduit ~t la formation et ~ la lib6ration de dicyclohexylur6e (DCU) en pr6sence d 'un nucl6ophile [18]. A pH alcalin, le DCCD se fixe sur le secteur F 0 du complexe ATPasique au niveau de la ~< DCCD Binding Protein~> et entra~ne alors une inhibition totale de la synth6se d 'ATP par le complexe F o - F l [19]. La <~ DCCD Binding Protein >>, pr~sente dans la partie F o des diff6rentes H+-ATPases, est un complexe multim6rique dont le nombre de copies varie de 6

12 suivant le syst6me consid6r6. Cependant la fixation d 'une seule mole de DCCD par mole de complexe ATPase au niveau d 'un r6sidu glutamique est suffisante pour inhiber compl6tement la synth6se d 'A TP [20]. A pH neutre ou 16g~rement acide, le DCCD se fixe 6galement sur la partie soluble F~ des diff6rents complexes enzymatiques [21-26]. Les mesures de fixations r~alis6es h l'aide de DCCD[14C] sur F 1 isol6 ont montr6 que la fixation de 1 mole de DCCD par mole F 1 suffisait inactiver les enzymes bact6riens d'Escherichia coli [22] et Rhodospirilh#n rubrunl [24]. Dans le cas de

Sondes chhniques dans l'dtude des FI-A TPases 349

la mitochondrie et du chloroplaste, l'inactivation complete de l'enzyme correspond h la fixation de 2 moles de DCCD par mole de F 1 [25,23] ou de 1 mole de DCCD [26]. Cependant, on note 6gale- ment la prfsence d'un carboxyle essentiel dans l'enzyme mitochondrial comme l'ont montr6 les expfriences de d6placement du DCCD[14C] par rester 6thylique de la glycine, un r6actif r6agissant de faqon s61ective avec les groupements carboxyli- ques activ6s par les carbodiimides [25]. Dans tous les cas, la fixation se fait au niveau des sous-unitfs /3, le groupe carboxyle impliqu6 appartenant hun rfsidu glutamique identifi6 en position 199 dans la sfquence de la sous-unit6/3 mitochondriale [27] et 192 dans celle d'E. coli [28].

La modification d'un groupement carboxyle alt6re de mani6re sensible la charge de Ia sous-unit6 t3, cette diminution de charge n6gative due h la modification par le DCCD a 6t6 mise en 6vidence par isofocalisation sur gel de polyacrylamide en pr~- sence d'ur6e les sous-unit6s/3 ayant r6agi avec le DCCD [22]. La quantification des sous-unit6s modifi6es par le DCCD corr61fe aux valeurs d'inactivation de l'enzyme a ainsi permis de d6finir une stoechiom6trie de 3 sous-unit6s/3 dans ECF~ [22]. Les 6tudes de protection montrent que le MgCI 2 augmente de mani~re indiscutable les temps de demi-inactivation des diverses ATPases par le DCCD, sugg6rant ainsi une interaction entre les sites reconnaissant le DCCD et ceux reconnaissant le Mg 2+ [25].

Un autre r6actif s61ectif des groupes carboxyles, le N-&hoxycarbonyl-2-6thoxy-1,2 dihydroquinoline (EEDQ) est capable d'inactiver l'enzyme mitochondrial F~ [29] ainsi que les enzymes bact~riens iso- l~s ~t partir d'E. coli et Micrococcus lysodeikticus [30,311. La fixation de 1 mole d'EEDQ au niveau de la sous-unit6/3 entra~ne une inactivation compl~te de ces enzymes. Sur la base de r6sultats impli- quant I'EEDQ et le site de fixation du Mg 2+, le carboxyle r6agissant avec rEEDQ a 6t6 d6crit comme 6tant diff6rent de celui reconnaissant le DCCD [32]. A l'encontre de cette observation il faut mentionner l'identification du rfsidu Glu 199 de la sous-unit6/3 comme site de fixation de I'EEDQ dans MF~ [33], ce rfsidu 6tant celui qui fixe le DCCD [271.

Modificateurs des groupes tyrosyles

Les ATPases isol6es h partir de mitochondries, de chloroplastes ou de bact6ries sont inhib6es apr6s traitement par le 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NbO ~ pH neutre, l'inhibition r~sultant de la modi-

fication d'un r6sidu tyrosyle dans une sous-unit6 /3 [34-37]. L'activit6 du complexe F i - 0 - N b f peut etre restaurfe par addition d'un thiol comme le dithiothr6itol, la r6activation est li6e h un d6place- ment du Nbf fix6 sur la tyrosine. Lorsque le pH du milieu est alcalinis6, le Nbf fix6 sur la tyrosine est transf6r6 intramol6culairement sur un groupe -NH 2 port6 par une lysine pour former un d6riv6 stable de type F i - N - N b f [38]. Ce transfert au sein m~me de la sous-unit6 t3 est nettement moins efficient dans l'ATPase isolfe h partir d'E. coli que dans l'ATPase mitochondriale [36], cette variation refl~te vraisemblablement une distribution diff6- rente des acides amin6s dans ces ATPases. La loca- lisation des tyrosines et des lysines impliqu6es dans la fixation du Nbf a 6t6 ~tudi6e par diff~rents labo- ratoires, les r6sultats publi6s pour l'enzyme mitochondrial de cceur de boeuf laissent apparaTtre quelques discordances; ainsi deux tyrosines, Tyr-197 [39] et Tyr-311 [40], et deux lysines, Lys-162 [41] et Lys-401 [42], ont 6t6 d6cdtes comme r6agissant avec le Nbf. Le fait que le Nbf se fixe sur une tyrosine impliqu6e scion toute vraisem- blance avec le site reconnaissant les ad6nine- nucl6otides est support6 par l'observation que la fixation du Nbf sur MF I diminue la fixation d'un analogue photo-activable de I'ADP, le 3'-arylazido- ADP, au niveau des sous-unitfs t3 [43]. D'autre part, l'extinction de fluorescence du complexe Fraurovertine induite par I'ATP est emp~ch6e apr~s modification de l'enzyme bact6rien d'E. coli par le Nbf h pH neutre. L'effet de I'ATP est restaur6 en d6plagant le Nbf par addition de dithiothr6itol [36].

La nitration des r6sidus tyrosyles par le t6trani- trom6thane (TNM) aboutit h la formation d'.un d~riv6 de type 3-nitrotyrosine [44-46]. Les stoe- chiom6tries d'inactivation sont 61ev~es et extr~me- ment variables suivant le type d'enzyme utilis6; le r6sidu tyrosyle r6agissant pr6f6rentiellement avec le Nbf n'6tant d'ailleurs pas modifi6 apr6s traitement par le TNM [47].

Modificateurs des groupes arginyles

Les r6sidus arginyles sont r6guli~rement d6crits comme participant au site actif des enzymes reconnaissant les ad6nine-nucl6otides. La charge positive du groupe guanidinium du r6sidu arginyle permet une interaction avec les nucl6otides et la formation de liaisons hydrog6nes avec la cha~ne polyphosphate de ces derniers. Le ph6nylglyoxal et la 2,3-butane- dione en pr6sence de borate ont 6t6 utilis6s avec les enzymes de mitochondrie [481, de R. rubrum [49],

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de la bactfrie thermophile PS3 [50] et de chloroplaste [51]. L'inactivation de ces diff6rents enzymes r6sulte de la modification pr6f6rentielle d'un r6sidu arginyle comme ont pule dfmontrer les expfriences r6alis6es ~ l'aide de ph6nylglyoxal[t4C].

Modificateurs des groupes lysyles

Le groupement e-NH 2 des r6sidus lysyles est capable de r6agir avec le pyridoxal phosphate pour former une base de Schiff stabilis6e par r6duction par le borohydrure de sodium. L'inactivation des enzymes d'origine mitochondriale [52, 53], bact6- rienne [54] ou chloroplastique [55] n6cessite la substitution d'un hombre important de r6sidus lysyles. Le fait que le traitement par le pyridoxaI phosphate occulte un site nucl6otidique 6changeable et que I'ADP et I'ATP exercent une certaine protection envers l'inactivation par le pyridoxal phosphate sugg~re cependant la pr6sence d'une lysine dans le site actif. Le transfert intramol6culaire du Nbf d'une tyrosine essentielle ~ l'activit6 vers une lysine lors du passage du pH de 7,5 b. 9 vient 6galement 6tayer cette supposition [38].

R6actifs de pontage des H+-ATPases

L'arrangement des peptides composant les diff6- rents complexes ATPasiques a ~t6 6tudi6 grace l'utilisation de r6actifs de pontage interagissant essentieUement avec les groupes ~-NH 2 des r6sidus lysyles ou les groupes -COOH des r6sidus asparti- ques ou glutamiques. Les agents de pontage se dis- tinguent (I) par la nature des groupes r6actifs qui vont ~tre impliqu6s dans les r6actions de r6ticula- tion, (2) par la distance s6parant les deux parties r6actives de la mol6cule, et (3) par la pr6sence d'un site de clivage au sein de la mol6cule permettant le clivage de la mol6cule et l'analyse ult6rieure des produits de r6ticulation.

L'utilisation du dim6thylsub6rimidate, un agent de pontage de 12 A de longeur, a permis de montrer la formation de complexes ~ , c~/3, c~- et/3y dans le cas du F l mitochondrial de coeur de beeuf [56, 57]. Une 6tude d6taill6e des interactions entre les peptides du complexe ATPasique de chloroplastes, utilisant deux r6actifs de pontage diff6- rents: le dim6thylsub6rimidate et l'hexam6thyl6ne diisocyanate et des anticorps sp6cifiques des diff6- rentes sous-unit6s du complexe, a permis l'61abo- ration d'un module d'arrangement des diff6rentes sous-unit6s. Ce module se caract6rise essentielle- ment par une distribution altern6e des sous-unit~s

et 13 ainsi que par des interactions privilfgi6es entre

les sous-unit6s mineures ~, e et les peptides du secteur F 0 [58]. D'autres travaux font cependant men- tion d'une possible r6ticulation entre deux sous-unit6s 13 [59]. Dans le cas de ECF 1, l'utilisation d'un agent de r&iculation ~ bras court (6~) a permis de mettre en 6vidence des associations pr6- f6rentielles ~ et 13t3 [60]. L'arrangement des sous- unit6s du complexe ATPasique de la levure Saccha- romyces cerevisiae a 6t6 6tudi6 ~ l'aide de m6thyl-4-mercaptobutyrimidate [61] et du d6riv6 clivable dithiobis(succinimidyl) propionate [62]. En plus des complexes form6s entre les diverses sous- unit6s de la partie F l, des associations concernant deux peptides de la partie F 0 ont fit6 observ6es: la sous-unit6 6 et la sous-unit6 9 (DCCD Binding Protein).

Des exp6riences de r6ticulation ont 6galement permis l'identification des sous-unit6s du F t mitochondrial de ceeur de boeuf qui interagissent avec deux peptides du complexe ATPasique mitochondrial • l'inhibiteur naturel IF let la prot6ine conf6- rant la sensibilit6 ~t l'oligomycine (OSCP). La strat6gie d'identification des produits de r6ticula- tion est bas6e sur l'utilisation de peptides biologi- quement actifs et marqu6s ~ l'aide d'un isotope radioactif, et sur l'utilisation d'anticorps sp6cifiques dirig6s contre ces diff6rents peptides. L'utilisation de r6actifs de pontage ~ bras nul tels que I'EEDQ et I'EDAC a permis de mettre en 6vidence les associations correspondant aux sites de contact entre peptides. L'inhibiteur naturel IF 1 se fixe au niveau de la sous-unit6/3 [63] tandis que I'OSCP interagit avec les deux sous-unit6s ~ et/3 [64,65].

Rdactifs de sites des Fi-ATPases

Au contraire des modificateurs chimiques qui se fixent potentiellement sur tout groupement r6actif accessible, les r6actifs de sites sont dirig6s sp6cifi- quement vers les sites actifs des enzymes. Ce type de r6actif doit r6pondre aux crit6res suivants: (1) l'inactivation totale correspond ~ une saturation de fixation, (2) le substrat protege contre l'inactivation, (3) l'inactivation est proportionnelle ~ la quantit6 de r6actif incorpor6.

Marqueurs d'affinitd

Un analogue de I'ADP et de I'ATP, le p- fluorosulfonyl-5'-ad6nosine (FSBA), dont le groupement sulfonyl prfsente une forte r6activit6 vis-h- vis des r6sidus lysyle, tyrosyle, histidyle et s6ryle [66] a 6t6 tr6s utilis6 dans l'~tude du site actif des

Sondes chbniques clans l'~tude des FI-A TPases 351

ATPases [67-69]. Dans le cas de l 'enzyme mitochondrial de c~eur de boeuf, le FSBA est incorpor6 dans les deux sous-unit& majeures ~ et/3 avec une forte pr6dominance pour la sous-unit6/3 [67], la fixation ayant lieu au niveau du r6sidu Tyr-368.

Les d6rivfs diald6hydes de I 'ADP et de I 'ATP (dial-ADP et dial-ATP) ont 6galement 6t6 employ6s comme marqueurs d 'affinit6 de la pattie F~ [70-73]. Les dial-nucl6otides forment une base de Schiff stable en r6agissant avec les groupements ~- NH 2 des lysines. Le dial-ATP se fixe sur les sous- unit6s aet /3 , la fixation d 'une mole de r6actif par mole de F 1 entra~nant 50°70 d'inactivation de l 'enzyme [72]. Le fait que le dial-ATP soit hydrolys6 en dial-ADP en pr6sence de Mg 2+ sug- g&e que cet analogue est capable de reconna~tre le site catalytique de l'enzyme. Deux autres marqueurs d'affinit6, d 'une part, l 'anhydride mixte form6 par condensation de I 'ATP et de l 'acide m6sityl~ne- carboxylique [74] et d 'autre part, I 'ATP y-4-(N-2 chloro&hyl-N-m&hyl-N-m&hylamino)benzylami- date [75] se fixent au niveau de la sous-unit6/3 du F~ mitochondrial de c~eur de boeuf, l ' inactivation compl&e de l 'enzyme r&ultant de la fixation de 1

2 moles de d6riv6 par mole d'enzyme.

Marqueurs de photo-affinitd

Les analogues photo-activables ont 6t6 largement utilis6s pour localiser et cartographier les sites de fixation des nucl6otides et du phosphate dans les diff&entes ATPases. Les dfriv& de nucl6otides uti- lis6s comportent un groupement nitr~ne photo- activable fix6 directement soit en position 2, soit en position 8 sur le noyau ad6nine ou greff6 en position 3' sur le ribose"

La substitution directe sur le noyau d 'adfnine assure en th~orie une meilleure pr&ision dans l 'identification des r6sidus impliqu6s dans la fixation des ad6nine-nucl6otides. Cependant la modification de la base peut alt6rer de mani6re sensible la capacit6 de reconnaissance des sites nucl6otides

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Fig. 1. Points d'insertion des groupements photo-activables dans la molecule d'adfinine nucl6otide.

envers ces ddriv6s. Ainsi, les d6riv6s 8-azido- nucldotides sont dans une conformation syn diff6- rente de la configuration anti des nucl6otides naturels [76], ce qui se traduit par une diminution de l'affinit6 de l'enzyme envers ces analogues. En ddpit ndanmoins des risques possibles de fixation non spd- cifique, le 8-azido-ATP a 6t~ utilis6 pour cartographier les r&idus impliqu6s dans la reconnaissance des nuclfotides dans la sous-unit6 fl de MF 1 [77]. Deux r6gions de la sous-unit6 fl sont marqu6es, la premi&e correspondant aux r&idus 1 -12 n'appara~t pas essentielle h l'activit6 catalytique. Dans le second domaine, le 8-azido-ATP se fixe au niveau des r6sidus Lys-301, Ile-304 et Tyr-311, cette fixation est emp&h& par addition d 'ATP avant la photo-activation du d6riv6.

Les d6riv6s 2-azido-nucl6otides qui adoptent en solution une configuration anti, similaire ~t celle des dfriv6s naturels [78,79], apparaissent comme des r6actifs riches de promesses dans l '&ude des sites reconnaissant les nucl6otides. Cependant ces d6ri- v6s sont le si~ge d 'une isom&isation spontanfe et

l'6quilibre en solution aqueuse, 50°7o du d&iv6 se trouve sous une forme t6trazole non photo- activable [79, 80].

Le troisi~me type de d6rivfs photo-activables, les analogues modifi6s en 3' au niveau du ribose, ont l 'avantage de conserver un noyau d'ad6nine non modifi~ et pr~sentent une affinit6 comparable celle des nucl6otides naturels. La contrepartie est un 61oignement du groupement photo-activable par rapport au noyau d'ad6nine et ~t la chaTne polyphosphate impliqu6s darts les interactions des nucl6oti- des avec le site actif. Cet 61oignement peut &re la source de difficult6s d'interpr6tation des r6sultats de fixation obtenus avec de tels analogues.

Les r6sultats obtenus avec ces diff6rents analogues et r6sum6s dans le Tableau I laissent appara~- tre un certain nombre de d&accords dO ~ la nature diff6rente des sondes et des conditions exp&imen- tales utilis&s. Nfanmoins, on peut remarquer que seules les sous-unit& majeures aet/3 sont impliqu6es dans les fixations. D'autre part, en d6pit de la pr6- sence en trois exemplaires de chacune de ces sous- unit6s, l ' inactivation compl&e des diff&ents enzymes est toujours atteinte avec des stoechiom&ries de fixation 6gales ~t 1 ou 2 moles de dfriv6 par mole d'enzyme. L'utilisation de 3'-arylazido-8-azido- ATP, un r6actif photo-activable poss6dant deux groupements nitr6nes, a permis de mettre en 6vi- dence une r&iculation entre les sous-unit6s a e t / 3 de MF l [97].

Un analogue photo-activable du phosphate, le 4-azido-2-nitroph6nyl phosphate (ANPP), se fixe 6galement au niveau des sous-unit6s/3 des diff&ents

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Tableau I. Distribution des marqueurs de photo-affinit6 et stoechiom6tries de fixation.

Sondes F~ Sous-unit6s Stoechiomdtries Refs. marqu6es d'inactivation

8-Azido-ATP (EDTA) MF~ /3 2 [89] 8-Azido-ATP (Mg 2+) MFt a + /3 2 [90] 8-Azido-ADP (EDTA) MF~ a + /3 2 [90] 8-Azido-ADP (Mg 2+) MF~ ~ > fl 2 [90] 8-Azido-ATP (EDTA) ECF, a 1 [911 8-Azido-ATP (Mg z÷) BF t PS3 fl 1 [92] 8-Azido-ATP (Mg ~+) BF~ M. htteus /3 > a 1 [93] 8-Azido-ADP (Ca z+) CF~ a + /3 2 [941

NAP4-ADP (EDTA) NAP4-ADP (EDTA) NAP4-AMPPNP (Mg 2÷)

MFI g + t3 2 [821 ECF I a + /3 2 [831 MF t ~ + /3 2 [84]

ANA-ADP (Mg 2+) MF I a + /3 2 [851

2-Azido-ADP (Mg 2+) CF, 13 1 195] 2-Azido-ADP (Mg 2+) MFI t3 2 [96]

Bz-ATP (Mg 2+) MF l ~ + 13 [861 Bz-ATP MF t /3 [86] Bz-ATP (Mg 2+) CF I ~ + /3 [871 Bz-ADP (Mg 2+) BF~ PS3 t3 2 [88]

ANPP (Mg 2+) MF~ fl 1 [981 ANPP (Mg 2+) ECF t, BF l PS3 t3 1 [99] ANPP (Ca 2÷) CF t /3 1 11001

NAP4-ADP/AMPPNP, 3"-O-(N-(4-azido-2-nitrophenyl)amlno)butyryl-ADP ou AMPPNP; ANA-ADP, 3'-0-(5-azidonaphtoyl(I))- ADP; Bz-ADP/ATP, 3'-0-(4-benzoyl) ADP ou ATP; ANPP, 4-azido-2-nitrophenyl phosphate.

enzymes 6tudi6s, l ' inactivation totale des enzymes rfsultant de la fixation d 'une mole d ' A N P P par mole de F l [98-100].

C o n c l u s i o n

En d6pit des variations observ6es dans les r6sultats d6crits avec les diff6rents marqueurs d 'affinit6 et de photo-affinit6, deux faits majeurs se d6gagent. Le premier est que seules les deux sous-unit6s majeures des diff~rentes ATPases sont capables de reconna~tre les diff6rents substrats. Le deuxi~me point est que bien que les diffdrentes ATPases pos- s6dent trois copies de ces sous-unit6s, un consen- sus g~ndral s '~tant ddgag~ en faveur d 'une stoechiom6trie de type ~3,/33, Y, 3, e ; l ' inactivation compl6te des difffrents enzymes est toujours atteinte pour des stoechiom6tries de fixation 6ga- les/t 1 ou 2 moles de d6riv6 par mole d 'enzyme. Ces r6sultats, joints / l ceux obtenus lots de l 'utili-

sation des modificateurs chimiques, laissent claire- merit appara~tre une r6activit6 partieUe de sites des H+-ATPases [101,102]. Ces r6sultats confortent l'existence d 'une coop6rativit6 entre des sites catalytiques alternatifs, la fixation de substrats sur un site induisant l '6v6nement catalytique dans ce site et le relfichement des produits de r6action dans les autres sites [103].

A la suite d 'observat ions de microscopie ~lectro- nique, de mesures de diffraction des rayons X et d'6tudes de r6ticulation [104-107, 56-60] il appara~t que les sous-unit6s majeures, a et/3, sont arran- g6es suivant une disposition hexagonale et forment des h6t6ro-dim~res. D 'au t re part, il semble exister une interaction particuli~re entre un h6t6ro-dim6re ~/3 et les sous-unit6s mineures y, 8 ete. Cette observation signifierait que l 'h6t6ro-dim6re h leur contact n 'est pas 6qulvalent aux deux autres dim6res. Deux modules sont envisag6s: le premier, que nous appeUerons mod61e statique, est bas6 sur l'existence d 'un contact permanent entre un h6t6ro-dim~re et

Sondes chimiques clans l'#tude des Fi-ATPases 353

les petites sous-unit6s. Ce contact est suppos6 induire une asym6trie structurale et fonctionnelle entre les trois h6t6ro-dim~res. On pense que dans ce cas l'h6t6ro-dim~re en contact aurait une r6acti- vit6 particuli~re, diff6rente de celle des deux autres h6t6ro-dim~res, plus r6actif vis-a-vis des modificateurs chimiques et qu'il jouerait un r61e r6gulateur dans la fonction catalytique. Dans le second module, appel6 module dynamique, chaque h6t6ro- dim~re est suppos6 jouer alternativement un r61e catalytique, les petites sous-unit6s entrant alors en contact tour A tour avee chacun des h6t6ro-dim~res.

Remerciements

Cette revue a b6n6fici6 des travaux de recherche effec- tu6s dans le Laboratoire de Biochimie par M. Bof, F. Boulay, P. Dalbon, D.F. De Melo, A.C. Dianoux, A. Dupuis, J.P. Issartel, G. Klein, G.J.M. Lauquin, R. Pou- geois et M. Satre sous la direction de M. le Professeur P.V. Vignais et grace aux aides fournies par le Centre National de ia Recherche Scientifique (ERA 903), l'Ins- titut National de la Sant6 et de la Recherche M6dicale (U 191) et la Facult6 de M~decine de Grenoble.

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Documents

Utilisation de sondes chimiques dans l'étude des F1-ATPases