Utilisation et besoins en phylogénie Utilisation et besoins en phylogénie en microbiologie clinique en microbiologie clinique

Pierre-Edouard FournierPierre-Edouard FournierUnité des RickettsiesUnité des Rickettsies

CNRS UMR6020CNRS UMR6020Faculté de Médecine - MarseilleFaculté de Médecine - Marseille

Phylogénie en microbiologie cliniquePhylogénie en microbiologie cliniquepourquoi?pourquoi?

• Nécessaire pour la taxonomie et l’identificationNécessaire pour la taxonomie et l’identification

• Mise au point de méthodes de détectionMise au point de méthodes de détection

• Genomique: origine des genes (LGT)Genomique: origine des genes (LGT)

• Traitement: prédiction de la sensibilité aux anti-Traitement: prédiction de la sensibilité aux anti--microbiens-microbiens

Phylogénie phénotypiquePhylogénie phénotypique

Limites = peu discriminant, convergencesLimites = peu discriminant, convergences

• Zuckerland and Pauling. Molecules as documents of Zuckerland and Pauling. Molecules as documents of evolutionary history. J Theor Biol. 1965;8:357-66.evolutionary history. J Theor Biol. 1965;8:357-66.

• Fox Fox et al. et al. The phylogeny of prokaryotes. Science. The phylogeny of prokaryotes. Science. 1980;209:457-63.1980;209:457-63.

Renouveau de la phylogénie des Renouveau de la phylogénie des BacteriaBacteria

Découverte des Découverte des ArchaeArchae

Plus discriminantPlus discriminant

Plus fiablePlus fiable

Phylogénie moléculairePhylogénie moléculaire

Familles

 Rickettsiaceae

Bartonellaceae

 

Anaplasmataceae

Tribus 

Rickettsieae

Ehrlichieae

Wolbachieae

Genres 

Rickettsia

Rochalimaea

Coxiella

Ehrlichia

Cowdria

Neorickettsia

Wolbachia

Bartonella

 

Anaplasma

Haemobartonella sp.

Eperythrozoon sp.

Espèces 

tsutsugamushi

prowazekii

rickettsii

quintana

burnetii

sennetsu

canis

phagocytophila

ruminantium

helminthoeca

pipientis

persica

bacilliformis

 

marginale 

Protéobactéries

Orientia tsutsugamushi

Rickettsia prowazekii

Rickettsia rickettsii

Ehrlichia sennetsu

Neorickettsia helminthoeca

Wolbachia pipientis

Anaplasma phagocytophilum

Anaplasma marginale

Ehrlichia chaffeensis

Ehrlichia canis

Cowdria ruminantium

Bartonella quintana

Bartonella bacilliformis

Brucella melitensis

Coxiella burnetii

Wolbachia persica

Legionella pneumophila

Bacilles à gram positif à G+C% faible

1

2

• ARNr 16SARNr 16S

• gltAgltA, , rpoB, …rpoB, …

• Core genesCore genes

Cibles moléculairesCibles moléculaires

Les outilsLes outils

• AlignementAlignement ClustalW, T-CoffeeClustalW, T-Coffee

• Distance matrixDistance matrix DNADIST, PROTDISTDNADIST, PROTDIST

• NJ treeNJ tree NEIGHBOR, ClustalWNEIGHBOR, ClustalW

• MP treeMP tree DNAPARS, PROTPARSDNAPARS, PROTPARS

• ML treeML tree DNAML, PROTML, DNAML, PROTML, fastDNAmlfastDNAml

• BootstrapingBootstraping SEQBOOT, CONSENSESEQBOOT, CONSENSE

• Software packages: MEGA, PHYLIP, PAUP...Software packages: MEGA, PHYLIP, PAUP...

Quand croire les arbres?Quand croire les arbres?

• > 2 méthodes congruentes: distance + MP + > 2 méthodes congruentes: distance + MP + MLML

• Valeurs de bootstrap élévéesValeurs de bootstrap élévées• Comparaison du ratio de noeuds validés par Comparaison du ratio de noeuds validés par

des bootstraps > 90%des bootstraps > 90%• Comparaison des phylogénies obtenues à Comparaison des phylogénies obtenues à

partir de plusieurs gènespartir de plusieurs gènes• Concaténation de gènesConcaténation de gènes

Utilisation en microbiologie cliniqueUtilisation en microbiologie clinique• Description de nouveaux taxons Description de nouveaux taxons

(organisation, distance phylogénique)(organisation, distance phylogénique)

• Nouvelles espèces, nouveaux genresNouvelles espèces, nouveaux genresR. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

R. akari (AF123707)

R. typhi (L04661)

R. prowazekii (AF123718)

79

79

60

87

8050

95

79

100

99

100

100

100

100

100

100

Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

R. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

R. akari (AF123707)

R. typhi (L04661)

R. prowazekii (AF123718)

79

79

60

87

8050

95

79

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99

100

100

100

100

100

100

Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

Bactéries isolées et/ou caractérisées dans l’UMR6020 et maladies découvertes

ABC

AB

AB

Description de nouvelles bactériesDescription de nouvelles bactéries

Utilisation en microbiologie cliniqueUtilisation en microbiologie clinique• Mise au point de nouveaux outils Mise au point de nouveaux outils

diagnostiquesdiagnostiques• Amorces spécifiques de clusters de Amorces spécifiques de clusters de

bactériesbactéries R. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

R. akari (AF123707)

R. typhi (L04661)

R. prowazekii (AF123718)

79

79

60

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8050

95

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99

100

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100

Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

R. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

R. akari (AF123707)

R. typhi (L04661)

R. prowazekii (AF123718)

79

79

60

87

8050

95

79

100

99

100

100

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100

100

100

Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

Utilisation en microbiologie cliniqueUtilisation en microbiologie clinique• Genomique: origine des genesGenomique: origine des genes

3’ partialATPase

tniA Transpositionhelper

trkAputative

monooxygenase

trxBthioredoxinreductase

arsH arsB arsC arsR arsC

Arsenic resistance operon

uspA pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase strA

trbI sulI 5’-partialATPase

pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase

1_59

recG

1_718

1_467 1_465 1_376 1_377 1_386 1_442 1_434

1_837

Transposase Résolvase IS15 IS26 aphA1IS15InsB (Tn1)

1_287 1_562 1_555 1_314 1_318 1_528 1_319 1_522

aac3 aadDA1intIintégrase

qacE1tnpM

1_516 1_513 1_339 1_348 1_352

orfX

1_343

orfX’

1_344

Résolvase

1_36

5

1_366

1_16 1_17 1_821 1_819 1_817 1_816 1_814 1_813 1_812 1_811 1_808 1_43 1_44 1_52

strB

1_62

intIintegrase

dfrI sulI cmlA tetR tetA lysR Transposase-like protein

GroEL-integrasefusion protein

qacE1

1_779 1_73 1_78 1_81 1_88 1_748 1_103 1_107 1_732 1_724

Transposase

1-710

aac6’

1_126

Pseudomonassp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match

merE merC merP merT merR

Mercury

pecM cat InsA (Tn1)merD merA tetR tetA TnpATnpA

1_213

urf2y

1_6121_6151_6211_6221_6241_627 1_2441_609

ybjA

1_598 1_258 1_588 1_275 1_277 1_569 1_285

IS1999 blaVEB-1 aadB arr-2 cmlA5 blaOXA-10 aadA1 TransposaseORF513

orf5qacE1 sulI dfrX sulIqacE1

1_2071_2031_1991_1961_1941_1871_1831_1791_1761_1661_1651_1631_699 1_173

IS6100

1_633

1_780

tnpM

intIintegrase

1-703

IS26

1_326

sulI

1_356

orf5

1_360

orfX

1_341

ISPpu12 – like transposon

ISPpu12-like transposon

Tn21 - like transposon truncatedTn1721 - like transposon

truncatedTn5393 -liketransposon

IS1 - like transposon

’ partialATPase

Transpositionhelper

trkAputative

monooxygenase

trxBthioredoxinreductase

arsH arsB arsC arsR arsC uspA pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase strA

trbI sulI ’-partialATPase

pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase

1_59

recG

1_718

1_467 1_465 1_376 1_377 1_386 1_442 1_434

1_837

Transposase Résolvase aphA1IS15InsB

1_287 1_562

IS26

1_5551_555 1_314 1_318 1_528 1_319 1_522

aac3 aadDA1intIintégrase

qacE1

1_516 1_513 1_339 1_348 1_352

orfX

1_343

orfX’

1_344

Résolvase

1_36

5

1_366

1_16 1_17 1_821 1_819 1_817 1_816 1_814 1_813 1_812 1_811 1_808 1_43 1_44 1_52

strB

1_621_62

intIintegrase

sulI cmlA tetR tetA lysR Transposase-like protein

qacE1

1_779 1_73 1_78 1_81 1_88 1_748 1_103 1_107 1_732 1_724

Transposase

1-710

Transposase

1-710

aac6’

1_126

Pseudomonassp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match

Pseudomonas sp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match with

merE merC merP merT merR

Mercury resistance operon

pecM cat InsAmerD merA tetR tetA TnpATnpA

1_213

urf2y

1_6121_6151_6211_6221_6241_627 1_2441_609

ybjA

1_598 1_258 1_588 1_275 1_277 1_569 1_285

IS1999 blaVEB-1 aadB arr-2 cmlA5 blaOXA-10 aadA1 TransposaseORF513

orf5qacE1 sulI sulIqacE1

1_2071_2031_1991_1961_1941_1871_1831_1791_1761_1661_1651_1631_699 1_173 1_6331_633

1_780

tnpM

intIintegrase

1-703

1_326

sulI

1_356

orf5

1_360

orfX

1_341

-like transposon

truncated

truncatedtransposon

3’ partialATPase

tniA Transpositionhelper

trkAputative

monooxygenase

trxBthioredoxinreductase

arsH arsB arsC arsR arsC

Arsenic resistance operon

uspA pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase strA

trbI sulI 5’-partialATPase

pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase

1_59

recG

1_718

1_467 1_465 1_376 1_377 1_386 1_442 1_434

1_837

Transposase Résolvase IS15 IS26 aphA1IS15InsB (Tn1)

1_287 1_562 1_555 1_314 1_318 1_528 1_319 1_522

aac3 aadDA1intIintégrase

qacE1tnpM

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orfX

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Résolvase

1_36

5

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strB

1_62

intIintegrase

dfrI sulI cmlA tetR tetA lysR Transposase-like protein

GroEL-integrasefusion protein

qacE1

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Transposase

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Pseudomonassp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match

merE merC merP merT merR

Mercury

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1_213

urf2y

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ybjA

1_598 1_258 1_588 1_275 1_277 1_569 1_285

IS1999 blaVEB-1 aadB arr-2 cmlA5 blaOXA-10 aadA1 TransposaseORF513

orf5qacE1 sulI dfrX sulIqacE1

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tnpM

intIintegrase

1-703

IS26

1_326

sulI

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orf5

1_360

orfX

1_341

ISPpu12 – like transposon

ISPpu12-like transposon

Tn21 - like transposon truncatedTn1721 - like transposon

truncatedTn5393 -liketransposon

IS1 - like transposon

’ partialATPase

Transpositionhelper

trkAputative

monooxygenase

trxBthioredoxinreductase

arsH arsB arsC arsR arsC uspA pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase strA

trbI sulI ’-partialATPase

pbrR Heavymetaldetoxificationprotein

lspA Transposase

1_59

recG

1_718

1_467 1_465 1_376 1_377 1_386 1_442 1_434

1_837

Transposase Résolvase aphA1IS15InsB

1_287 1_562

IS26

1_5551_555 1_314 1_318 1_528 1_319 1_522

aac3 aadDA1intIintégrase

qacE1

1_516 1_513 1_339 1_348 1_352

orfX

1_343

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1_344

Résolvase

1_36

5

1_366

1_16 1_17 1_821 1_819 1_817 1_816 1_814 1_813 1_812 1_811 1_808 1_43 1_44 1_52

strB

1_621_62

intIintegrase

sulI cmlA tetR tetA lysR Transposase-like protein

qacE1

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Transposase

1-710

Transposase

1-710

aac6’

1_126

Pseudomonassp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match

Pseudomonas sp.

Salmonella sp.

E. coli

Other bacteria

Best Blast match with

merE merC merP merT merR

Mercury resistance operon

pecM cat InsAmerD merA tetR tetA TnpATnpA

1_213

urf2y

1_6121_6151_6211_6221_6241_627 1_2441_609

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IS1999 blaVEB-1 aadB arr-2 cmlA5 blaOXA-10 aadA1 TransposaseORF513

orf5qacE1 sulI sulIqacE1

1_2071_2031_1991_1961_1941_1871_1831_1791_1761_1661_1651_1631_699 1_173 1_6331_633

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tnpM

intIintegrase

1-703

1_326

sulI

1_356

orf5

1_360

orfX

1_341

-like transposon

truncated

truncatedtransposon

Utilisation en microbiologie cliniqueUtilisation en microbiologie clinique• Prédiction de la sensibilité aux Prédiction de la sensibilité aux

antibiotiquesantibiotiquesR. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

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R. typhi (L04661)

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79

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60

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Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

R. conorii (AF123721)

R. rickettsii (X16353)

R. honei (AF123724)

R. africae (AF123706)

R. parkeri (AF123717)

R. sibirica (AF123722)

R. slovaca (AF123723)

R. japonica (AF123713)

R. aeschlimannii (AF123705)

R. massiliae (AF123714)

R. rhipicephali (AF123719)

R. montanensis (AF123716)

R. helvetica (AF123725)

Rickettsia sp. strain IO-1 (DQ110870)

R. felis (AF210695)

R. australis (AF123709)

R. akari (AF123707)

R. typhi (L04661)

R. prowazekii (AF123718)

79

79

60

87

8050

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Rickettsia sp. strain AT-1 (DQ113910)

93

Sensibilité Sensibilité aux macrolidesaux macrolides

Résistance Résistance À la rifampicineÀ la rifampicine

Limites - ProblèmesLimites - Problèmes

• Pas d`outil integrePas d`outil integre• Difficultés d’alignement, surtout en cas de Difficultés d’alignement, surtout en cas de

séquences répétées => vérification manuelleséquences répétées => vérification manuelle• Difficulté de réaliser des analyses phylogéniques Difficulté de réaliser des analyses phylogéniques

sur de grands nombres de séquences et/ou des sur de grands nombres de séquences et/ou des séquences de grande taille, surtout si séquences de grande taille, surtout si bootstrapingbootstraping

Besoins en phylogénieBesoins en phylogénie

• Ideal = outil omnipotentIdeal = outil omnipotent

• Alignement fiable => analyses multiples Alignement fiable => analyses multiples => arbre=> arbre

Besoins en phylogénieBesoins en phylogénie

• Outils d’alignement performantsOutils d’alignement performants

• Serveurs pouvant analyser rapidement Serveurs pouvant analyser rapidement des nombres élévés de séquences (> 100) des nombres élévés de séquences (> 100) de grande taille (> 4000 bp), notamment de grande taille (> 4000 bp), notamment en MLen ML

• Outils permettant d’identifier dans un Outils permettant d’identifier dans un alignement à partir d’un arbre des alignement à partir d’un arbre des séquences spécifiques d’un taxon ou d’un séquences spécifiques d’un taxon ou d’un cluster cluster

A

B

C

D

E

F

G

H

I

Besoins en phylogénieBesoins en phylogénie

Shigella

Escherichia

Salmonella

Klebsiella

Serratia

Yersinia

Vibrio

Haemophilus

Acinetobacter

Pseudomonas

Legionella

Stenotrophomonas

Minibacterium

Neisseria

Bordetella

Burkholderia

Ralstonia

Rickettsia

Ehrlichia

Brucella

Sphingomonas

Desulfovibrio

Campylobacter

Helicobacter

Wolinella

Chlorobium

Pelobacter

Chlamydia

Parachlamydia

Leptospira

Borrelia

Treponema

Anabaena

Prochlorococcus

Deferribacterales

Fibrobacter

Dehalococcoides

Bacteroides

Porphyromonas

Fusobacterium

Mycoplasma

Streptococcus

Enterococcus

Lactobacillus

Listeria

Bacillus

Staphylococcus

Tropheryma

Propionibacterium

Corynebacterium

Nocardia

Mycobacterium

Nitrospira

Acidobacter

Verrucomicrobium

Rhodopirulella

Dictyoglomus

Thermus

Aquifex

Thermotoga

100

100

100

100

90

99

88

75

100

99

87

99

81

58

100

100

100

84

100

87

100

91

94

42

100

51

100

100

63

94

86

54

64

87

71

99

99

100

63

63

29

82

18

43

66

39

22

39

9

21

26

22

7

13

9

4

16

0.05

Thermotoga

Aquificae

Deinococcus-Thermus

Dictyoglomi

Planctomycetes

Verrucomicrobia

Acidobacteria

Nitrospirae

Actinobacteria

Firmicutes

Fusobacteria

Bacteroidetes

Chloroflexi

Fibrobacteres

Deferribacteres

Cyanobacteria

Spirochaetes

Chlamydiae

Proteobacteria

Chlorobi

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Number of genomes

60

18

30

5

6

1

10

6

11

0

0

2

4

1

67

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0

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0

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Number of species

44

16

25

5

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45

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1

1

Shigella

Escherichia

Salmonella

Klebsiella

Serratia

Yersinia

Vibrio

Haemophilus

Acinetobacter

Pseudomonas

Legionella

Stenotrophomonas

Minibacterium

Neisseria

Bordetella

Burkholderia

Ralstonia

Rickettsia

Ehrlichia

Brucella

Sphingomonas

Desulfovibrio

Campylobacter

Helicobacter

Wolinella

Chlorobium

Pelobacter

Chlamydia

Parachlamydia

Leptospira

Borrelia

Treponema

Anabaena

Prochlorococcus

Deferribacterales

Fibrobacter

Dehalococcoides

Bacteroides

Porphyromonas

Fusobacterium

Mycoplasma

Streptococcus

Enterococcus

Lactobacillus

Listeria

Bacillus

Staphylococcus

Tropheryma

Propionibacterium

Corynebacterium

Nocardia

Mycobacterium

Nitrospira

Acidobacter

Verrucomicrobium

Rhodopirulella

Dictyoglomus

Thermus

Aquifex

Thermotoga

100

100

100

100

90

99

88

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Thermotoga

Aquificae

Deinococcus-Thermus

Dictyoglomi

Planctomycetes

Verrucomicrobia

Acidobacteria

Nitrospirae

Actinobacteria

Firmicutes

Fusobacteria

Bacteroidetes

Chloroflexi

Fibrobacteres

Deferribacteres

Cyanobacteria

Spirochaetes

Chlamydiae

Proteobacteria

Chlorobi

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Proteobacteria

Number of genomes

60

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Number of species

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Number of species

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Et la Et la phylogénomique ?phylogénomique ?