Vaisseau sanguin reconstruit par génie tissulaire : Développement d'une nouvelle approche pour la

reconstruction de la media et interaction avec les microparticules

Thèse

Jean-Michel Bourget

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiæ doctor (Ph.D.)

Québec, Canada © Jean-Michel Bourget, 2014

III

RÉSUMÉ

La media vasculaire est au cœur des processus physiopathologiques qui entraînent le développement de

l’athérosclérose. L’utilisation d’une media reconstruite par génie tissulaire permet d’étudier les cellules

musculaires lisses (CML) humaines dans un environnement plus physiologique que les cellules en culture

monocouche. Les travaux présentés dans cette thèse sont orientés autour de la media vasculaire reconstruite

par génie tissulaire comme modèle d’étude pharmacologique et prothèse vasculaire autologue.

La première partie des travaux porte sur l’étude des interactions de cette tunique avec les microparticules

(MP) circulantes. D’abord, nous avons montré que la présence de l’adventice modifie la réponse de la media

aux MP produites in vitro à partir des lymphocytes T. Ensuite, l’étude de l’effet des MP isolées du sérum de

patients en choc septique sur la media humaine a démontré que ces MP sont en mesure d’augmenter la

contraction de la media par un mécanisme impliquant une diminution du NO et une augmentation de

l’expression de l’ARN messager de l’interleukine-10. L’incubation de la media reconstruite avec cette cytokine

anti-inflammatoire bloque l’hyporéactivité induite par les lipopolysaccharides. Le même phénomène a été

reproduit in vivo, chez le rongeur. Ces résultats suggèrent que les SMP auraient un effet protecteur sur la

fonction vasculaire, en potentialisant la contraction de la media.

Ensuite, nous avons optimisé l’approche de reconstruction de prothèses vasculaires par auto-assemblage

proposée initialement pour l’adapter au contexte particulier des CML. L’objectif principal était de permettre

l’étude physiopathologique de la media à partir de toutes les lignées de CML; indépendamment de leur

capacité de synthèse de matrice extracellulaire. Pour ce faire, nous avons développé un échafaudage de

matrice extracellulaire produit par auto-assemblage à partir de fibroblastes humains. L’utilisation de cet

échafaudage génère une media plus résistante et plus contractile que la technique initiale.

Enfin, une anisotropie a été créée dans cet échafaudage pour permettre une orientation physiologique des

CML. La media reconstruite devient ainsi plus résistante et plus contractile. Ces améliorations permettent de

reconstruire des media à partir des cellules de plus de patients et mèneront à des études pharmacologiques

plus représentatives de la population. Cet échafaudage facilitera la translation clinique de ce modèle de media

reconstruite par génie tissulaire.

V

ABSTRACT

The pathological processes that result in the development of atherosclerostic lesions take place in the vascular

media layer. This condition is responsible for half of cardiovascular associated fatalities. The development of a

tissue-engineered blood vessel can contribute to the in vitro study of the human media in a 3-dimensional

environment. This blood vessel can also be used as a prosthesis for arterial bypasses. The work presented

here focus on the reconstructed vascular media as a pharmacological model and a potential vascular

substitute.

The vascular media reconstructed by self-assembly was used to study the interactions between this layer and

circulating microparticles (MPs). We demonstrated that the adventitia layer can influence the response of the

media to T-Lymphocytes derived MPs. Next, we investigated the influence of MPs isolated from whole blood of

septic shock patients (SMPs), on the human engineered media. This study demonstrated that the SMPs

decrease nitric oxide (NO) production and increase interleukin-10 (IL-10) messenger RNA in the media layer.

Incubation of reconstructed media with this anti-inflammatory cytokine blocks the hyporeactivity induced by

lipopolysaccharides. This finding was confirmed in vivo, in rodents. Therefore, the elevation of MP levels in

sepsis is potentially probeneficial to the cardiovascular function in this pathology.

We then investigated the feasibility of improving the reconstructed media in order to facilitate the

physiopathological studies of this layer and improve the potential of a smooth muscle cell (SMC)-containing

substitutes to be implanted in human. Therefore, the self-assembly approach was used to generate an

extracellular matrix (ECM) scaffold, produced in vitro by fibroblasts, in which SMCs can be seeded. After a

week of culture in a decellularised matrix scaffold, the SMC-containing sheets were rolled around a mandrel to

form a media layer. This engineered media demonstrated an increase mechanical resistance and contractility

as compared with the original technique. Finally, we created an anisotropic ECM scaffold that can direct the

orientation of SMCs to reproduce the physiological orientation of that layer. Reconstructed media produced

using those anisotropic scaffolds were more resistant and contractile than the ones reconstructed using

isotropic scaffolds.

These improvements will facilitate the reconstruction of a media layer using pathological cells from patients

and could lead to more representative pharmacological study of this layer. Moreover, this scaffold will facilitate

the clinical translation of the model from bench to bedside.

.

VII

TABLE DES MATIÈRES

Résumé ................................................................................................................................. III

Abstract .................................................................................................................................. V

Table des matières .................................................................................................................. VII

Liste des tableaux .................................................................................................................... XI

Liste des figures ..................................................................................................................... XIII

Liste des abréviations et des sigles ..........................................................................................XV

Remerciements ...................................................................................................................... XIX

Avant-Propos ........................................................................................................................XXV

............................................................................................................................... 1 CHAPITRE 1

Introduction

1.1. Problématique Générale ..................................................................................................... 2

1.2. Anatomie et Physiologie Cardiovasculaire .......................................................................... 3 1.2.1. Le système cardiovasculaire........................................................................................ 3

1.2.2. Les cellules vasculaires ................................................................................................ 5

1.3. Biologie de la Media Vasculaire .......................................................................................... 7 1.3.1. Anatomie et physiologie ............................................................................................. 7

1.3.2. Interaction avec l’endothélium ................................................................................... 8

1.3.3. Contraction ................................................................................................................ 11

1.3.4. Inflammation ............................................................................................................. 14

1.3.5. Plasticité phénotypique des cellules musculaires lisses ........................................... 16

1.3.6. Implication pathologique .......................................................................................... 16

1.4. Maladies Cardiovasculaires et Traitements ...................................................................... 17 1.4.1. L’athérosclérose ........................................................................................................ 18

1.4.2. La cardiomyopathie ischémique ............................................................................... 20

1.4.3. Les maladies vasculaires périphériques .................................................................... 21

1.4.4. Les avenues thérapeutiques ..................................................................................... 22

1.5. Les Substituts Vasculaires ................................................................................................. 25 1.5.1. Vaisseaux natifs ......................................................................................................... 25

1.5.2. Vaisseaux synthétiques ............................................................................................. 26

1.5.3. Vaisseaux reconstruits par génie tissulaire ............................................................... 27

1.6. Alignement des Cellules et de la Matrice.......................................................................... 38 1.6.1. Biologie de l’alignement des cellules ........................................................................ 38

1.6.2. Mécanismes d’alignement in vivo ............................................................................. 39

1.6.3. Méthodes d’alignement des cellules et de la matrice .............................................. 40

1.6.4. Microfabrication d’une surface de culture microstructurée .................................... 42

1.6.5. Alignement et auto-assemblage ............................................................................... 44

VIII

1.7. Les Microparticules ........................................................................................................... 45 1.7.1. Description ................................................................................................................ 45

1.7.2. Formation et structure .............................................................................................. 45

1.7.3. Fonctions ................................................................................................................... 46

1.7.4. Mécanismes d’action ................................................................................................. 47

1.7.5. Interaction avec les cellules vasculaires .................................................................... 47

1.7.6. Implication pathologique .......................................................................................... 48

1.8. Problématique, Hypothèse et Objectifs ............................................................................ 53

............................................................................................................................. 57 CHAPITRE 2

Applications of Human Tissue-Engineered Blood Vessel Models to Study the Effects of Shed Membrane Microparticles from T-Lymphocytes on Vascular Function

2.1. Résumé .............................................................................................................................. 59 2.2. Abstract ............................................................................................................................. 60 2.3. Introduction ....................................................................................................................... 61 2.4. Materials and Methods ..................................................................................................... 62 2.5. Results ............................................................................................................................... 66 2.6. Discussion .......................................................................................................................... 70 2.7. Conclusion ......................................................................................................................... 73 2.8. Acknowledgements ........................................................................................................... 73 2.9. References ......................................................................................................................... 73

............................................................................................................................. 75 CHAPITRE 3

Interleukin-10 Controls the Protective Effects of Circulating Microparticles from Septic Shock Patients on Tissue-Engineered Vascular Media

3.1. Résumé .............................................................................................................................. 77 3.2. Abstract ............................................................................................................................. 78 3.3. Introduction ....................................................................................................................... 79 3.4. Materials and Methods ..................................................................................................... 80 3.5. Results ............................................................................................................................... 84 3.6. Discussion .......................................................................................................................... 89 3.7. Conclusion ......................................................................................................................... 91 3.8. Acknowledgements ........................................................................................................... 92 3.9. References ......................................................................................................................... 92

............................................................................................................................. 95 CHAPITRE 4

Human Fibroblast-Derived ECM as a Scaffold for Vascular Tissue Engineering

4.1. Résumé .............................................................................................................................. 97 4.1. Abstract ............................................................................................................................. 98 4.2. Introduction ....................................................................................................................... 99 4.3. Materials and Methods ................................................................................................... 100 4.4. Results ............................................................................................................................. 104 4.5. Discussion ........................................................................................................................ 109 4.6. Conclusion ....................................................................................................................... 112 4.7. Acknowledgements ......................................................................................................... 112 4.8. References ....................................................................................................................... 112

IX

........................................................................................................................... 117 CHAPITRE 5

Microstructured Human Fibroblast-Derived ECM Scaffold for Vascular Media Fabrication

5.1. Résumé ............................................................................................................................ 119 5.2. Abstract ........................................................................................................................... 120 5.3. Introduction .................................................................................................................... 121 5.4. Materials and Methods ................................................................................................... 123 5.5. Results ............................................................................................................................. 129 5.6. Discussion ........................................................................................................................ 137 5.7. Conclusion ....................................................................................................................... 139 5.8. Acknowledgements ......................................................................................................... 140 5.9. Supplementary Materials ................................................................................................ 141 5.10. References ....................................................................................................................... 142

........................................................................................................................... 147 CHAPITRE 6

Discussion et Conclusion

6.1. Génie Tissulaire Cardiovasculaire ................................................................................... 148

6.2. Le vaisseau reconstruit par auto-assemblage comme modèle d’étude des microparticules ........................................................................................................................... 149

6.2.1. Les microparticules lymphocytaires ........................................................................ 150

6.2.2. Les microparticules de patients en choc septique .................................................. 151

6.2.3. Directions futures pour les microparticules ............................................................ 155

6.3. Optimisation du substitut vasculaire à des fins pharmacologique et clinique ............... 156 6.3.1. Développement d’un échafaudage de MEC ........................................................... 156

6.3.2. Alignement de l’échafaudage ................................................................................. 157

6.3.3. Directions futures pour les échafaudages alignés .................................................. 158

6.4. Conclusion Générale ....................................................................................................... 161

Références ............................................................................................................................ 163

Annexes - Contributions à des travaux soumis ou publiés .................................................... 181

XI

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1.1 - Méthodes de reconstruction de vaisseaux par génie tissulaire ................................................... 29

Tableau 1.2 - Contribution significative au génie tissulaire vasculaire .............................................................. 31

Tableau 1.3 - Principaux effets des microparticules de différentes origines sur les cellules endothéliales ....... 49

Table 3.1 - Baseline characteristics of septic patients. ...................................................................................... 80

XIII

LISTE DES FIGURES

Figure 1.1 - Composition des artères et des veines ............................................................................................ 4 Figure 1.2 - Coupe transversale de vaisseaux fémoraux canins ......................................................................... 8 Figure 1.3 - Interaction entre l’endothélium et le muscle lisse dans la contraction/relaxation vasculaire ............ 9 Figure 1.4 - Contraction de la cellule musculaire lisse ...................................................................................... 10 Figure 1.5 - Mécanismes de contraction et de relaxation des cellules musculaires lisses ................................ 12 Figure 1.6 - Prévalence de l’athérosclérose dans l’artère coronaire selon l’âge ............................................... 18 Figure 1.7 - Phases de progression d’une plaque d’athérome .......................................................................... 19 Figure 1.8 - Pontage coronaire .......................................................................................................................... 24 Figure 1.9 - Méthodes de reconstruction vasculaire par génie tissulaire .......................................................... 28 Figure 1.10 - Exemples de tissus reconstruits par la technique d’auto-assemblage ......................................... 34 Figure 1.11 - Méthodes d’alignement des cellules et de la matrice dans les vaisseaux reconstruits ................ 41 Figure 1.12 - Fabrication d’une surface de culture microstructurée .................................................................. 43 Figure 1.13 - Cellules sur une surface de culture microstructurée .................................................................... 44 Figure 1.14 - Formation des microparticules ..................................................................................................... 46 Figure 1.15 - Mécanismes d’action potentiels pour les microparticules ............................................................ 50 Figure 1.16 - Dosage par cytométrie en flux des microparticules sériques de patients en choc septique ........ 52 Figure 2.1 - Histological and immunological staining of the constructs ............................................................. 65 Figure 2.2 - Concentration-response curves to histamine of the vascular constructs ....................................... 66 Figure 2.3 - Concentration-response curves to histamine of TEVA .................................................................. 67 Figure 2.4 - Concentration-response curves to histamine of TEVM .................................................................. 68 Figure 2.5 - Concentration-response curves to histamine of TEVMA ............................................................... 68 Figure 2.6 - Production of NO and ROS of the vascular constructs .................................................................. 69 Figure 2.7 - Western blot analysis of protein expression after MP treatment .................................................... 70 Figure 3.1 - Treatment with MPs increased the reactivity of TEVM to histamine .............................................. 85 Figure 3.2 - Treatment with MPs increased COX-1 expression ........................................................................ 85 Figure 3.3 - Treatment with MPs increased mRNA expression of IL-10............................................................ 86 Figure 3.4 - IL-10 treatment restored LPS-induced hyporeactivity in TEVM ..................................................... 87 Figure 3.5 - IL-10 treatment reversed LPS-induced increase of NO in TEVM................................................... 87 Figure 3.6 - IL-10 treatment prevented LPS-induced death and hyporeactivity in aortic rings from mice ......... 88 Figure 4.1 - Schematic view and timeline of the processes ............................................................................ 102 Figure 4.2 - Masson’s trichrome staining of the vascular constructs ............................................................... 105 Figure 4.3 - Immunostaining of SMC markers ................................................................................................. 107 Figure 4.4 - Mechanical properties of TEVM ................................................................................................... 108 Figure 4.5 - Vasoreactivity of TEVM ................................................................................................................ 109 Figure 5.1 - Experimental design of the study ................................................................................................. 125 Figure 5.2 - Cell alignment as a function of time on aligned and flat TPE ....................................................... 130 Figure 5.3 - Cell alignment as a function of time on aligned and unaligned scaffolds ..................................... 131 Figure 5.4 - Visualization of cells cultured on aligned or control scaffolds ...................................................... 132 Figure 5.5 - Immunostaining of SMC markers and ECM protein in TEVM ...................................................... 133 Figure 5.6 - Histological staining of the TEVM ................................................................................................ 134 Figure 5.7 - Vasoreactivity of TEVM ................................................................................................................ 135 Figure 5.8 - Mechanical properties of TEVM ................................................................................................... 136 Figure 5.9 - Visualization of cells and ECM structure on aligned and control scaffolds. ................................. 141

XV

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET DES SIGLES

Abréviation Signification en français Signification en anglais

20-HETE Acide 20-hydroxyeicosatétraénoïque 20-Hydroxyeicosatetraenoic Acid

5-HT 5-Hydroxytryptamine (sérotonine) 5-Hydroxytryptamine (serotonin)

α-SM actin α-Actine de muscle lisse α-Smooth muscle actin

A.U. Unité arbitraire Arbitrary unit

AC Adénylate cyclase Adenylate cyclase

ADN Acide désoxyribonucléique Deoxyribonucleic acid

AMPc / cAMP Adénosine monophosphate cyclique cyclic Adenosine monophosphate

AngII Angiotensine II Angiotensin II

ANOVA Analyse de la variance Analysis of variance

ANSI/AAMI/ISO Institut américaine de standardisation/Association pour l'avancement de l'instrumentation médicale/ Organisation internationale de normalisation

American National Standards Institute/Association for the Advancement of Medical Instrumentation/ International Organization for Standardization

ATP Adénosine triphosphate Adenosine triphosphate

BSA Albumine de sérum bovin Bovine serum albumin

CABG Pontage coronaire Coronary artery bypass graft

CD Famille de différenciation Cluster of differentiation

CE / EC Cellule endothéliale Endothelial cell

cGKIα Protéine kinase dépendante du GMPc Iα cGMP dependant protein kinase Iα

CI Cardiomyopathie ischémique Ischemic cardiomyopathy

CIHR Instituts de recherche en santé du Canada Canadian Institutes of Health Research

CMH 1-Hydroxy-3-méthoxycarbonyl 2,2,5,5-tetraméthyl-pyrrolidine

1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin

CML / SMC Cellule musculaire lisse Smooth muscle cell

CO2 Dioxyde de carbone Carbon dioxide

COX (1, 2) Cyclo-oxygénase (1 et 2) Cyclooxygenase-1, -2

CSE Cystathionine gamma-lyase (cystathionase) Cystathionine γ-lyase(cystathionase)

CTL Contrôle Control

DAF-FM 4-amino-5-méthylamino-2',7'-difluorofluorescéine 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein

DAG Diacylglycérol Diacylglycerol

DETC Diéthyldithiocarbamate Diethyldithiocarbamate

DF Fibroblaste dermique Dermal fibroblast

DIC Microscopie à contraste interférentiel Differential interference contrast

DMEM Modification Dulbecco-Vogt du milieu Eagle Dulbecco-Vogt modified Eagle’s medium

dMS

dMS DF

dMS SVF

adMS

idMS

Échafaudage de matrice décellularisé

dMS de fibroblastes dermiques

dMS de fibroblastes de veine saphène

dMS anisotropique de fibroblastes dermiques

dMS isotopique de fibroblastes dermiques

decellularised-Matrix scaffold

dMS from dermal fibroblasts

dMS from saphenous vein fibroblasts

anisotropic dMS from dermal fibroblasts

isotropic dMS from dermal fibroblasts

DRDC Recherche et développement pour la défense Canada

Defence Research and Development Canada

ECE Enzyme de conversion de l'endothéline Endothelin converting enzyme

EDCF Facteur vasoconstricteur dérivé de l'endothélium Endothelium derived contracting factor

XVI

Abréviation Signification en français Signification en anglais

EDHF Facteur vasorelaxant dérivé de l'endothélium Endothelium derived hyperpolarising factor

EDTA Acide éthylène diamine tétra acétique Ethylenediaminetetraacetic acid

EET Époxyeicosatriénoïque Epoxyeicosatrienoic

EGTA Acide éthylène-diamine-tétra acétique Ethylene glycol tetraacetic acid

ELISA Méthode immuno-enzymatique Enzyme-linked immunosorbent assay

EPR Résonance paramagnétique électronique Electron paramagnetic resonance

ERK Kinase régulée par les signaux extracellulaires Extracellular signal-regulated kinase

ERO / ROS Espèces réactives de l'oxygène Reactive oxygen species

ET-1 Endotheline-1 Endothelin1

É-U / USA États-Unis d'Amérique United-States of America

FCS (FBS) Sérum de veau fœtal Fetal calf serum (fetal bovine serum)

Fe(II)-NO(DETC)2 Fe(II)NO (diéthyldithiocarbamate)2 Fe(II)NO (diethyldithiocarbamate)2

FGF-2 Facteur de croissance fibroblastique-2 Fibroblast growth factor-2

FRQS / FRSQ Fond de Recherche du Québec - Santé / Fond de Recherche en Santé du Québec

—

GC Guanylate cyclase Guanylate cyclase

GDP Guanosine di phosphate guanosine diphosphate

GFP Protéine de fluorescence verte Green fluorescent protein

GM-CSF Facteur de croissance granulocyto-monocytaire Granulocyte macrophage-colony stimulating factor

GMPc / cGMP Guanosine monophosphate cyclique cyclic Guanosine monophosphate

GPCR Récepteur couplé aux protéines G G-protein coupled receptor

GTP Guanosine triphosphate Guanosine triphosphate

H2O2 Peroxyde d'hydrogène Hydrogen peroxide

H2S Sulfure d'hydrogène Hydrogen sulfide

HUVEC Cellule endothéliale de veine de cordon ombilical Human umbilical vein endothelial cell

ICAM1 Molécule d'adhésion intercellulaire 1 Intercellular adhesion molecule 1

IFNβ Interféron bêta Interferon beta

IgG Immunoglobuline G Immunoglobulin G

IKKβ Inhibiteur de la kinase bêta de NFκ-B Inhibitor of NFκ-B kinase beta

IL Interleukine Interleukin

IMA Artère mammaire interne Internal mammary artery

INSERM Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale

—

IP3 Inositol 1,4,5-trisphosphate Inositol 1,4,5-trisphosphate

IRAK1 Kinase associée au récepteur de l’interleukine-1 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1

IRS-1 Substrat du récepteur de l'insuline-1 Insulin receptor substrate-1

LDL

oLDL

Lipoprotéine de faible densité

LDL oxydé

Low density lipoprotein

oxidized LDL LOEX Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale —

LOX Lipoxygénase Lipoxygenase

LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide

MCP-1 Protéine d'attraction des monocytes-1 Monocyte chemoattractant protein-1

MCSF Facteur de croissance monocytaire Macrophage colony-stimulating factor

XVII

Abréviation Signification en français Signification en anglais

MCV Maladie cardiovasculaire Cardiovascular disease

MEC / ECM Matrice extracellulaire Extracellular matrix

MIP Protéine inflammatoire des macrophages Macrophage inflammatory protein

MLCK Kinase de la chaîne légère de la myosine Myosin light chain kinase

MLCP Phosphatase de la chaîne légère de la myosine Myosin light chain phosphatase

MMP Métalloprotéinase matricielle Matrix metalloproteinase

MP Microparticule Microparticle

MTT Bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

Bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

MVP Maladie vasculaire périphérique Peripheral vascular disease

NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NF Facteur nucléaire Nuclear factor

NO Oxyde nitrique ou monoxyde d'azote Nitric oxide

NOS

eNOS

iNOS

nNOS

Synthase de l'oxyde nitrique

NOS endothéliale

NOS inductible

NOS neuronale

Nitric oxide synthase

endothelial NOS

inducible NOS

neuronal NOS

NOX Oxydase de la NADPH NADPH oxidase

NSERC Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie du Canada

Natural Science and Engineering Research Council of Canada

OCT — Optimal cutting temperature®

Ost Ostéopontine Osteopontin

P450 Cytochrome P450 Cytochrome P450

PBS Tampon phosphate physiologique Phosphate-buffered saline

PCP Protéines de cellules planaires Planar cell protein

PDGF Facteur de croissance dérivé des plaquettes Platelet-derived growth factor

PDMS Polydiméthylsiloxane Polydimethylsiloxane

PECAM1 Molécule d'adhésion endothéliale des plaquettes-1 Platelet–endothelial-cell adhesion molecule 1

PFP Plasma pauvre en plaquettes Platelet-free plasma

PG Prostaglandine Prostaglandin

PGA Acide polyglycolique Polyglycolic acid

PGI2 Prostacycline (prostaglandine I2) Prostacyclin (prostaglandin I2)

PI3K Phosphatidylinositide 3-kinases Phosphatidylinositide 3-kinases

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-disphosphate Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

PIPAAm poly (N-iso-propylacrylamide) poly (N-iso-propylacrylamide)

pIκB IκBα phosphorylé Phosphorylated IκBα

PKA Protéine kinase A (dépendante de l'AMPc) cAMP-dependent protein kinase

PLC Phospholipase C Phospholipase C

PTFE

ePTFE

Polytétrafluoroéthylène

PTFE expansé

Polytetrafluoroethylene

expended PTFE

qRT-PCR Réaction en chaîne de la polymérase quantitative (transcriptase inverse)

Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction

RE Réticulum endoplasmique Endoplasmic reticulum

RGD Peptide RGD (GLY-ARG-GLY-ASP-ASN-SER) RGD peptide (GLY-ARG-GLY-ASP-ASN-SER)

XVIII

Abréviation Signification en français Signification en anglais

RH Humidité relative Relative humidity

RTK Récepteur à activité tyrosine kinase Tyrosine kinase receptor

SD Écart-type Standard deviation

SDF Facteur dérivé des cellules stromales Stromal-cell-derived factor

SDS-PAGE Électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (sodium dodécyl sulfate)

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

SEBS Styrène(éthylène-butyrène)styrène Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer

SEM / S.E.M. Erreur standard de la moyenne Standard error of the mean

SEMS Échafaudage de matrice extracellulaire décellularisé Self-assembled extracellular matrix scaffold

Shh Sonic hedgehog Sonic hedgehog

SIDA Syndrome d’immunodéficience acquise Acquired immunodeficiency syndrome

SMP MP isolée du sérum d’un patient en choc septique Septic MP

SNP Nitroprussiate de sodium Sodium nitroprusside

SOD Superoxyde dismutase Superoxide dismutase

SV Veine saphène Saphenous vein

SVF Fibroblaste de veine saphène Saphenous vein fibroblast

TEBV

TEVM

TEVA

TEVMA

Vaisseau sanguin reconstruit par génie tissulaire

media reconstruite

adventice reconstruite

media et adventice reconstruite

Tissue-engineered blood vessel

tissue-engineered vascular media

tissue-engineered vascular adventitia

tissue-engineered vascular media-adventitia

TEVM

sTEVM

nTEVM

nTEVM DF

nTEVM SVF

adMS-TEVM

idMS-TEVM

Media vasculaire reconstruite par génie tissulaire

TEVM standard

nouveau TEVM (avec dMS)

nTEVM avec des fibroblastes dermiques

nTEVM avec des fibroblastes de veine saphène

nTEVM reconstruit avec un dMS anisotropique

nTEVM reconstruit avec un dMS isotropique

Tissue-engineered vascular media

standard TEVM

new TEVM (with dMS)

nTEVM from dermal fibroblasts

nTEVM from saphenous vein fibroblasts

anisotropic dMS-derived nTEVM

isotropic dMS-derived nTEVM

TGF-β Facteur de croissance de transformation-β Transforming growth factor-β

TGT — Tissue growth technology®

THETA Acide trihydroxy eicosatriénoïque Trihydroxyeicosatrienoic acid

TNF-α Facteur de nécrose tumorale-α Tumor necrosis factor-α

TPE Élastomère thermoplastique Thermoplastic elastomer

TRITC Tétraméthylrhodamine isothiocyanate Tetramethylrhodamine isothiocyanate

TXA2 Thromboxane A2 Thromboxane A2

UTP Uridine triphosphate Uridine triphosphate

UTS Résistance à la rupture Ultimate tensile strength

UV Ultraviolet Ultraviolet

VCAM1 Molécule d'adhésion des cellules vasculaires 1 Vascular-cell adhesion molecule 1

VEGF Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire Vascular endothelial growth factor

VF Fibroblaste veineux Vein fibroblast

VIH Virus de l'immunodéficience humaine Human immunodeficiency virus

XO Xanthine oxydase Xanthine oxidase

XIX

REMERCIEMENTS

Tout d’abord, j’aimerais remercier Dre Germain de m’avoir accueilli dans son laboratoire, comme stagiaire,

puis comme étudiant gradué. Merci également de m’avoir permis de faire des stages à l’étranger et surtout de

m’avoir donné une grande latitude dans la poursuite de mes projets et d’être restée ouverte aux nouvelles

idées proposées. Je la remercie aussi d’avoir cru en moi au cours de ce parcours et de m’avoir permis de

découvrir le monde grâce aux nombreux congrès auxquels j’ai pu participer.

Merci au Dr Veres, mon codirecteur, de m’avoir ouvert les portes de la salle blanche du CNRC et de m’avoir

fourni les équipements, l’expertise et le savoir-faire de votre équipe. Je remercie également le Dr Auger,

directeur du laboratoire et du groupe vasculaire, de m’avoir accueilli dans le groupe même si je n’étais pas son

étudiant. Merci également pour les congrès que vous avez financés.

Merci à mes premières superviseures de stage au LOEX, Dre Claudie Paquet et Dre Stéphanie Proulx, j’ai

beaucoup apprécié travailler avec vous. Merci également au Dr Andriantsitohaina, Dre Martinez et tous les

gens que j’ai côtoyés à Angers : Lucie Duluc, Chiara Porro, Raffaella Soletti, Ahmed Mostefai, Abdel Agouni et

tous les autres. J’ai particulièrement apprécié mon dernier stage en votre compagnie; j’espère vous revoir

avant longtemps.

Merci aux évaluateurs, Dr Huot, Dr D’Orléans-Juste et Dre Moulin d’avoir accepté de réviser cette thèse. Une

évaluation de thèse demande beaucoup de temps et d'énergie et je vous en suis très reconnaissant. Merci

pour votre intérêt, vos commentaires et vos critiques qui permettront d'améliorer et de compléter le contenu

scientifique de ce document.

Merci au Dr Robert Gauvin dit « Bob », d’avoir vu le potentiel de mes projets, d’avoir toujours été de bon

conseil et d’avoir corrigé savamment mes articles. J’ai beaucoup appris et apprécié travailler et aller en

congrès avec toi. Merci à Danielle Larouche, pour les conseils, discussions et corrections. Merci également au

Dr Guillemette d’avoir préparé le terrain en ayant mis au point la technique d’alignement utilisée au cours de

mes travaux. Merci à nos ingénieurs, en particulier Catherine Tremblay et Véronique Laterreur; le génie

tissulaire est un domaine multidisciplinaire et votre contribution à nos travaux est particulièrement appréciée.

Merci à tous les membres de l’équipe vasculaire et de l’équipe cellules souches pour les commentaires et

discussions qui font avancer les projets.

Je voudrais remercier tous les assistants de recherche qui préparent nos milieux, sérums, additifs et autres; la

tâche serait beaucoup plus ardue sans vous. Un merci tout spécial à Cindy Perron, Todd Galbraith et Kathleen

Baker qui ont été mes deuxièmes paires de mains pour rouler des vaisseaux ou pour monter des bioréacteurs.

XX

Merci à Sébastien Larochelle et Dre Véronique Moulin pour l’aide avec les vecteurs viraux et la cytométrie.

Merci à l’équipe d’histologie, à l’équipe patient et à tous les employés administratifs. Sans oublier les

assistants de recherche de Dr Veres au CNRC, Maxence Mounier et Caroline Miville-Godin qui m’ont accueilli

chaleureusement dans leur équipe et m’ont fait confiance dans l’utilisation des appareils. Merci également à

Sarah-Anne Têtu d’avoir révisé l’orthographe de cette thèse.

Merci également à tous les autres étudiants, assistants de recherche et chercheurs du LOEX, après plus de 7

ans à vos côtés, c’est avec le cœur gros que je vais vous quitter. Je remercie particulièrement ceux qui

m’étaient les plus proches : Rémi Parenteau Bareil, Mathieu Blais, Caroline Audet, Audrey Laforce-Lavoie,

Marie-Christine Fiola et ceux que j’oublie. Les dernières années n’auraient pas été les mêmes sans la

présence de mon amie Marie-Ève Ouellette, une personnalité incroyable, mais surtout une personne et une

amie extraordinaire.

Merci à mes parents, Georges et Cécile, de m’avoir encouragé dans tout ce que je faisais. Merci à mes amis,

présents et passés, même si je ne suis pas très bon pour garder le contact. Merci également à tous ceux qui

m’ont encouragé au cours des années, qui ont cru en moi quand je doutais, qui m’ont donné un coup de

pouce au bon moment. Merci aux professeurs qui m’ont motivé à poursuivre mes études toujours plus loin.

Finalement, merci à ma famille, Amélie et Julia. Amélie, tu es toujours là pour moi, pour m’aider

professionnellement et personnellement. Je suis un homme comblé à tes côtés. Merci d’avoir donné un côté

artistique à certaines de mes figures, un talent que je suis loin de posséder et de m’avoir supporté durant la

rédaction de cette thèse. Tu mérites définitivement une part de mon succès. Finalement, Julia, mon bébé, ma

grande fille, en plus d’être la plus belle d’entre toutes, tu es la plus intelligente et celle qui compte le plus dans

ma vie. Merci d’avoir été un bébé facile, souriant. Tu mets de la joie dans mon cœur et un sourire sur mes

lèvres. Je te dédie ce travail, à toi et à tes contemporains. Je souhaite que tu trouves ta passion dans la vie,

quoi que ce soit, car c’est ce qui importe le plus.

XXI

Imagination is more important than knowledge.

For knowledge is limited, whereas imagination embraces the entire world,

stimulating progress, giving birth to evolution.

- Albert Einstein, 1929 -

XXIII

À ma Julia

et aux générations futures,

parce que les découvertes d’aujourd’hui

seront la médecine de demain

XXV

AVANT-PROPOS

Cette thèse comporte l’insertion de quatre articles. Les trois premiers (chapitres 2 à 4) ont été publiés dans

des revues scientifiques (Tissue Engineering, Clinical Science et Biomaterials) et les versions manuscrites de

ces articles sont présentées en version intégrale. Seules des modifications du format et de la mise en page

ont été apportées pour se conformer au style de l’ouvrage déposé. Le dernier article (chapitre 5) sera soumis

prochainement à la revue Biomaterials. Ma contribution à chacun des articles est détaillée dans la section

Avant-propos qui débute chacun des articles.

1

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

2

1.1. Problématique Générale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) représentent la première cause de mortalité dans les pays

industrialisés. La moitié des décès associés aux MCV est causée par l’obstruction d’une ou de plusieurs

artères coronaires, entraînant une cardiomyopathie ischémique et conduisant à un infarctus du myocarde

[Go et al., 2013]. Cette condition est souvent la conséquence de la présence de plaques d’athérome au niveau

de la media de ces artères de petits calibres. Pour traiter cette pathologie, il existe plusieurs approches

incluant : la modification des habitudes de vie, la médication, l’angioplastie percutanée, l’apposition d’un tuteur

vasculaire et le pontage artériel. Pour cette dernière approche, la plus efficace, mais également la plus

invasive, le choix du greffon est de la plus haute importance afin de maximiser la perméabilité du pontage et

d’éviter de réopérer le patient précocement. L’utilisation d’un vaisseau autologue tel que l’artère mammaire

interne ou la veine saphène comme greffon est à privilégier pour ce type de pontage (<6 mm de diamètre).

Bien que ces vaisseaux donnent des résultats satisfaisants au niveau de la perméabilité [Johnson et al.,

2000], ils présentent plusieurs problèmes au niveau de la disponibilité, de la constance (taille, collatérales,

propriétés mécaniques) et de la présence de pathologies vasculaires. Il s’avère donc crucial de développer un

vaisseau reconstruit par génie tissulaire pour ce type de greffe.

Plusieurs équipes de recherche se sont penchées sur le développement d’une telle prothèse vasculaire.

Depuis le gel de collagène de Weinberg et Bell [Weinberg et al., 1986], plusieurs approches se sont révélées

prometteuses pour la translation clinique. En effet, le modèle de vaisseaux reconstruits par auto-assemblage

[L'Heureux et al., 1998] démontre des résultats très encourageants en essai clinique [McAllister et al., 2009].

Ce vaisseau reconstruit permet également la réalisation d’études in vitro.

Les microparticules (MP) circulantes sont un sujet d’actualité, en effet, leur implication au cours des processus

pathologiques ne fait plus de doute. Ces vésicules membranaires, libérées dans le milieu extracellulaire par

les cellules activées notamment par un stress ou une blessure, sont en mesure d’agir comme vecteurs de

messages. Elles sont présentes dans le plasma et les autres liquides biologiques des individus sains; par

contre, leur provenance et leur quantité varient en réponse à certaines conditions pathologiques. Les

pathologies impliquant une modulation des taux de MP circulantes sont nombreuses (athérosclérose, diabète,

pré-éclampsie, syndrome cardiométabolique, choc septique) et elles ont comme point commun une atteinte

vasculaire, inflammatoire ou un état prothrombotique [Burnier et al., 2009]. Cependant, les MP peuvent avoir

des effets bénéfiques ou délétères sur la fonction vasculaire en fonction de la pathologie [Hugel et al., 2005].

Malgré le nombre grandissant de publications sur l’implication pathologique des MP sur la fonction vasculaire,

un nombre limité d’entre elles étudient les MP isolées de patients dans un vaisseau contenant des cellules

humaines.

3

En plus de sa finalité clinique comme prothèse vasculaire, le vaisseau reconstruit par génie tissulaire peut

servir de modèle d’études pharmacologiques [L'Heureux et al., 2001]. Actuellement, ces études sont réalisées

sur des animaux modèles qui ne permettent pas de reproduire fidèlement les réactions physiologiques des

cellules humaines. Alternativement, les cellules humaines peuvent être isolées et mises en culture, mais elles

se retrouvent alors dans un environnement non physiologique ce qui rend leurs réactions peu prédictives du

comportement des vaisseaux natifs. L’utilisation de vaisseaux humains explantés est l’approche la plus

valable, mais ceux-ci sont disponibles en quantité limitée, sont souvent pathologiques et la variabilité

interindividuelle rend l’interprétation des résultats difficile [Stoclet et al., 1996]. Pour être utilisé comme modèle

pharmacologique, le vaisseau reconstruit doit présenter certaines caractéristiques essentielles. Il doit être

composé de cellules musculaires lisses (CML) différenciées et contractiles, il doit pouvoir être endothélialisé et

être suffisamment résistant pour être manipulé sans l’endommager.

Le modèle de vaisseau reconstruit par auto-assemblage présente plusieurs de ces caractéristiques. En effet,

les CML sont contractiles et le modèle peut être endothélialisé par une méthode simple. Par contre, la

résistance mécanique de la media et les contractions enregistrées sont faibles par rapport à celles des

vaisseaux humains ex vivo. De plus, la capacité à former des feuillets manipulables varie d’une population de

CML à l’autre. Il est donc primordial d’améliorer le modèle de vaisseau reconstruit par auto-assemblage en

augmentant la résistance mécanique, la capacité contractile et la reproductibilité des résultats obtenus d’une

population à l’autre. Cette optimisation sera bénéfique à la fois pour l’utilisation du vaisseau reconstruit comme

modèle d’études pharmacologiques et pour le développement d’une prothèse vasculaire à partir des cellules

de n’importe quel patient.

1.2. Anatomie et Physiologie Cardiovasculaire

1.2.1. Le système cardiovasculaire

Le système cardiovasculaire regroupe l’ensemble des structures anatomiques responsables du transport et de

la distribution des éléments biochimiques nécessaires au fonctionnement des autres systèmes. Il se compose

des artères, des veines, du cœur et du sang. Ce système, essentiel au maintien de l’homéostasie, est

intimement lié à tous les autres systèmes de l’organisme par son rôle de transporteur de nutriments,

d’oxygène, d’hormones, de déchets métaboliques et de dioxyde de carbone (CO2) [Marieb, 2005].

Les artères et les veines constituent le réseau de distribution à travers l’organisme. Les artères sont capables

de modifier leur diamètre afin de réguler l’apport sanguin aux différents organes en fonction des besoins de

l’organisme. Les vaisseaux sont classés en différentes catégories selon leurs fonctions et leur composition :

artères élastiques, artères musculaires, artérioles, veines, veinules et capillaires (Fig. 1.1). Tous ces types de

vaisseaux sont constitués d’une ou de plusieurs des trois tuniques vasculaires mais le sont en différentes

4

proportions selon les vaisseaux. De l’intérieur vers l’extérieur, on distingue l’intima, la media et l’adventice. Les

artères transportent le sang du cœur vers les capillaires tandis que les veines transportent ce fluide et son

contenue en sens opposé. Leur fonction différente explique leur composition spécifique. Les artères doivent

résister à des pressions importantes sans fatigue ni rupture; elles possèdent par conséquent des couches

musculaire et élastique prédominante. Les veines font un travail plus passif qui demande moins de capacité

élastique et contractile; elles contiennent donc une plus grande proportion de tissu conjonctif. Les valvules

présentes au niveau des veines des membres inférieurs permettent le retour veineux unidirectionnel. Les

capillaires sont composés d’une monocouche de cellules endothéliales (CE) reposant sur une membrane

basale. Ils sont entourés de péricytes, des CML spécialisées qui possèdent un potentiel régénérateur [Caplan,

2008]. Le faible diamètre des capillaires maximise le rapport de la surface sur le volume, assurant des

échanges optimaux entre le sang et les tissus à travers l’endothélium.

Figure 1.1 - Composition des artères et des veines

Composition et abondance relative des différentes tuniques dans les vaisseaux sanguins humains. L’abondance du tissu musculaire

dans les artères est en accord avec le rôle de ce type de vaisseau qui doit absorber les pulsations cardiaques et créer un flux continu

au niveau des artérioles et des capillaires. Le besoin en vaisseaux reconstruits est associé principalement à des artères musculaires

(<6 mm de diamètre) comme les coronaires et les fémorales. (Adaptée de [Tortora et al., 2003, Marieb, 2005])

Dans tous les vaisseaux, une monocouche de CE forme l’intima. Elle empêche la coagulation et régule la

contraction des CML par la sécrétion de différents facteurs en réponse aux variations de l’environnement

intraluminal (pression, débit, hormones). La media est séparée de l’endothélium par la membrane basale et la

limitante élastique interne. Cette tunique est composée principalement de CML et de fibres d’élastine. Son

abondance est variable entre les différents types de vaisseaux. L’adventice est composée de fibroblastes qui

sécrètent une matrice extracellulaire (MEC) riche en collagène, capable de prévenir l’expansion pathologique

des vaisseaux, particulièrement au niveau veineux (Fig. 1.1).

5

Le sang est composé du sérum et des éléments figurés. Parmi ceux-ci, on distingue les érythrocytes, les

leucocytes (monocytes, lymphocytes, granulocytes) et les thrombocytes. Chacun des éléments du sang

possède une ou des fonctions particulières incluant le transport de l’oxygène et du CO2, la réponse

immunitaire, la coagulation et le transport hormonal.

Le système cardiovasculaire est une circuiterie bien construite qui repose sur un équilibre homéostatique

précaire. En effet, il est constamment soumis à différents stress : pression, radicaux libres, lipoprotéines de

basse densité (LDL de l’anglais low density lipoproteins) et force de cisaillement. Pour cette raison, ce

système est souvent la cible du développement de pathologies comme l’hypertension, le diabète et

l’athérosclérose. Ces conditions pathologiques entraînent le développement des MCV, la première cause de

décès aux États-Unis (É-U) [Go et al., 2014].

1.2.2. Les cellules vasculaires

1.2.2.1. Les cellules endothéliales

Les CE forment un épithélium simple pavimenteux appelé endothélium qui sépare le sang du reste de

l’organisme. Les CE adoptent une forme allongée dans la direction du flux grâce à la mince couche de

glycocalyx qui recouvre la surface luminale de l’endothélium. Cette couche de molécules chargées

négativement (protéoglycanes, glycosaminoglycanes, glycoprotéines et protéines plasmiques) joue le rôle de

mécanotransducteur entre les stimuli provenant du lumen et le cytosquelette d’actine des CE [Bai et al., 2014].

La perturbation du flux cause une altération de leur alignement qui contribue à la dysfonction endothéliale. Ce

phénomène se produit principalement dans les zones de branchement, près des valves cardiaques ou en

présence de plaques d’athérome [Tricot et al., 2000]. La dysfonction endothéliale est une condition

pathologique qui réduit la capacité de l’endothélium à produire des métabolites vasodilatateurs,

majoritairement le monoxyde d’azote (NO). Une altération du flux entraîne également une augmentation de

l’expression du récepteur de type 1 de l’angiotensine [Ramkhelawon et al., 2009]. Cette condition augmente

l’adhésion des plaquettes et des leucocytes ainsi que la perméabilité de l’endothélium aux cellules et aux

molécules présentent dans le sérum [Lehoux et al., 2003]. Cette dysfonction est l’étape qui initie la formation

des plaques d’athérome [Ross, 1999, Lacolley, 2007]. Les CE jouent plusieurs rôles importants dans le

système circulatoire : 1) Hémocompatibilité : l’endothélium n’active pas la coagulation sanguine grâce à la

libération de facteurs anticoagulants comme la prostacycline (PGI2) et le NO. Les protéoglycanes tapissant la

surface luminale de l’endothélium interviennent aussi à ce niveau; 2) Barrière semi-perméable : il est capable

de laisser passer des cellules, mais de bloquer de petites molécules; 3) Angiogenèse : les nouveaux

capillaires seront formés à partir de l’endothélium de vaisseaux préexistants, majoritairement des capillaires;

4) Régulation du tonus myogénique : la sécrétion de facteurs vasoactifs en réponse à différents stimuli

hormonaux et mécaniques modifie le niveau de contraction des CML de la media.

6

Au niveau des capillaires, la barrière sélective favorise les échanges entre le sang et les tissus et permet ainsi

d’approvisionner les cellules en nutriments et en oxygène tout en récupérant les déchets métaboliques comme

le CO2. Lorsque l’endothélium est activé par un signal inflammatoire provenant d’un tissu, c’est au niveau des

capillaires que les leucocytes peuvent s’infiltrer dans celui-ci. Dans les artères, la communication entre les CE

de l’intima et les CML de la media prend une importance capitale. En effet, plusieurs facteurs

vasoconstricteurs et vasodilatateurs sont libérés par l’endothélium et agissent sur la media afin de réguler son

niveau de contraction. Ces facteurs seront discutés dans la section 1.3.2 Interaction avec l’endothélium.

L’intima et la media sont séparées par la limitante élastique interne, une couche de fibres élastiques d’environ

70 à 100 nm d’épaisseur. Cependant, une communication directe entre les deux types cellulaires se fait via

une série de jonctions myo-endothéliales formées à travers des ouvertures dans la limitante élastique interne

[Ledoux et al., 2008].

1.2.2.2. Cellules musculaires lisses

Les CML qui forment la media sont liées entre elles par de nombreuses jonctions serrées et elles échangent

leur contenu cytoplasmique via des jonctions ouvertes. Elles sont organisées en faisceaux de cellules alignées

parallèlement. L’interaction dynamique entre l’intima et la media est au cœur de la régulation des processus

physiologiques du système circulatoire. Elle intervient également dans le développement et la progression des

pathologies vasculaires. Étant donné l’importance particulière qu’occupe la media dans cette thèse, la section

1.3 Biologie de la Media Vasculaire lui sera consacrée.

1.2.2.3. Les fibroblastes et adipocytes

Les fibroblastes qui composent l’adventice des plus gros vaisseaux possèdent avant tout un rôle de soutien

dans la résistance mécanique des vaisseaux, particulièrement au niveau des veines. Néanmoins, il a été

suggéré que cette tunique aurait une contribution dans la contraction [Laflamme et al., 2006b]. On retrouve

également au niveau de l’adventice des adipocytes formant le tissu adipeux périvasculaire. Celui-ci peut

modifier le niveau de contraction de la media via la libération d’adipokines. Les facteurs libérés chez les sujets

sains ont un effet vasorelaxant alors que, en situation d’obésité, ces facteurs changent et causent une

vasoconstriction, ce qui contribue au développement de pathologies comme l’hypertension [Eringa et al.,

2012]. De plus, l’implication des tissus adipeux sous-cutané et viscéral dans le développement et la

progression des MCV est bien démontrée. Il produit un état d’inflammation modéré mais systémique qui

contribue à la dysfonction endothéliale et donc au développement de l’athérosclérose [Meyers et al., 2007].

1.2.2.4. Les cellules immunitaires

Le rôle principal des leucocytes est de participer aux processus de défense de l’hôte contre les pathogènes.

Les cellules immunitaires regroupent les granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles), les monocytes

7

et les lymphocytes (B et T). Ces cellules utilisent les réseaux vasculaire et lymphatique pour patrouiller

l’organisme afin de trouver et de détruire les pathogènes ou corps étrangers. L’interaction des cellules

immunitaires avec la paroi vasculaire joue un rôle important dans plusieurs processus pathologiques. Dans les

réactions allergiques cutanées, les basophiles libèrent de l’histamine qui cause la dilatation des capillaires,

favorise l’extravasation des monocytes et produit une rougeur caractéristique. En effet, les monocytes ont la

capacité de traverser l’endothélium vasculaire par un processus appelé diapédèse leur permettant d’atteindre

le tissu en inflammation et de se transformer en macrophage [Goldsby et al., 2001]. Ce processus

d’extravasation des monocytes est fortement impliqué dans le développement de l’athérosclérose. Le choc

septique est, quant à lui, un état d’hypotension vasculaire systémique causé par une réponse incontrôlée du

système immunitaire à une infection bactérienne. Les cellules immunitaires ont la capacité de libérer dans la

circulation des MP [Martin et al., 2004]. Leurs interactions avec le système vasculaire seront détaillées dans la

section 1.7 Les Microparticules. Le rôle de ces MP sur les différentes tuniques vasculaires est encore mal

compris, c’est pourquoi leur étude présente un intérêt particulier.

1.3. Biologie de la Media Vasculaire

1.3.1. Anatomie et physiologie

La media est présente dans tous les vaisseaux à l’exception des capillaires, entourés seulement par les

péricytes (Fig. 1.1). La composition et les propriétés de la media des artères sont bien différentes de celles

des veines. La media des artères est épaisse et peut supporter des pressions élevées tandis qu’au niveau des

veines, elle est plus mince et son rôle est limité à contrer l’évasement de la paroi vasculaire (Fig. 1.2). La

media joue plusieurs rôles majeurs dans la physiologie du système cardiovasculaire, particulièrement au

niveau artériel. D’abord, elle absorbe les variations de pression produites par les battements du cœur, rendant

le débit presque continu au niveau des capillaires. Ensuite, elle modifie l’apport sanguin aux différents organes

selon leurs besoins, par la modulation locale du diamètre des artères de résistance. Le système nerveux

autonome intervient dans le contrôle de cette contraction. Enfin, elle régule la pression sanguine sous la

gouverne de l’endothélium. Ces fonctions sont possibles grâce à la capacité contractile des CML qui permet à

la media d’adapter le diamètre de la lumière en fonction de la situation. Cette tunique est impliquée dans le

développement de plusieurs pathologies vasculaires, notamment l’athérosclérose et l’hypertension.

L’organisation tridimensionnelle des faisceaux de CML de la media est particulière. Dans la partie la plus

luminale de la media, une couche de faisceaux longitudinaux est présente, alors que les faisceaux sous-

jacents sont organisés circonférentiellement et hélicoïdalement. Cette organisation circonférentielle de la

majorité des faisceaux de CML permet d’optimiser la dépense énergétique nécessaire à la contraction. Cette

organisation sera discutée dans la section 1.6 Alignement des Cellules et de la Matrice.

8

Figure 1.2 - Coupe transversale de vaisseaux fémoraux canins

L’artère (A et C) et la veine (B et D) sont composées des trois tuniques fondamentales. L’endothélium (e) sépare le lumen (l) de la

paroi du vaisseau et forme, avec la limitante élastique interne, l’intima (i). La media (m) artérielle contient principalement des cellules et

peu de collagène, elle apparaît rouge avec ce type de coloration. Dans la veine, elle est plus mince et contient plus de matrice

extracellulaire. L’adventice (a) est composée de collagène et de fibroblastes. Les vasa-vasorum (non visible sur ces coupes) sont

retrouvés dans cette tunique, ces capillaires alimentent la paroi du vaisseau. (Coloration trichrome de Masson, barres de mesure : A-B

= 500 µm, C-D = 250 µm) (© Bourget, 2014)

1.3.2. Interaction avec l’endothélium

L’endothélium maintient la balance (inhibition/stimulation) de la prolifération et de la migration des CML ainsi

qu’entre la contraction et la relaxation de la media (Fig. 1.3). Le débalancement de cet équilibre fragile

entraîne la dysfonction endothéliale [Feletou et al., 2006]. L’endothélium produit plusieurs facteurs

vasodilatateurs : 1) Le monoxyde d’azote (NO) : ce gaz est produit majoritairement par la NO synthase

endothéliale (eNOS de l’anglais endothelial nitric oxide synthase), une enzyme dépendante du calcium

[Palmer et al., 1987]; 2) PGI2 : un lipide de la famille des eicosanoïdes produit par la cyclo-oxygénase (COX)

constitutive (COX-1) et inductible (COX-2), il agit également comme agent antiagrégant plaquettaire

[Gryglewski et al., 1988]; 3) Les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF de l’anglais

Endothelium-derived hyperpolarizing factors)

9

Figure 1.3 - Interaction entre l’endothélium et le muscle lisse dans la contraction/relaxation vasculaire

L’endothélium produit plusieurs facteurs qui influencent la contraction de la media. Certains facteurs causent la relaxation du muscle

lisse vasculaire. C’est le cas de la PGI2, du NO et des membres de la famille des EDHF (l’H2O2, l’EET, THETA, K+, H2S). Inversement,

d’autres facteurs entraînent la contraction de la media. L’ET-1 est le plus puissant de ces facteurs. On retrouve également le 20-HETE

et les ROS. Lors du vieillissement ou en situation pathologique, certaines prostaglandines modifiées peuvent se lier aux récepteurs des

thromboxanes/endoperoxydes. Plusieurs agonistes sont vasorelaxants lorsqu’ils se lient aux CE, mais produisent l’effet inverse quand

ils atteignent directement les CML. C’est le cas de l’acétylcholine, de la sérotonine, de l’histamine et de la bradykinine.

(Adaptée de [Feletou et al., 2009])

Abréviations de l’anglais : PGI2, prostacyclin; NO, nitric oxide; EDHF, endothelium-derived hyperpolarizing factors; H202 , hydrogen

peroxide; EET, epoxyeicosatrienoic acid; THETA, trihydroxyeicosatrienoic acid; K+, potassium ion; H2S, hydrogen sulfide; ET-1,

endothelin-1; CSE, cystathionine γ-lyase; 20-HETE, 20-hydroxyeicosatetraenoic acid; ROS, reactive oxygen species; LOX,

lipoxygenase; SOD, superoxide dismutase; P450, cytochrome P450; NOX, NADPH oxidase; XO, xanthine oxidase; ECE, endothelin

converting enzyme; cGMP, cyclic guanosine monophosphate; cAMP, cyclic adenosine monophosphate; MLCP, myosin light chain

phosphatase; MLCK, myosin light chain kinase; COX, cyclooxygenase; PG, prostaglandin.

(acide époxyeicosatriénoïque (EET de l’anglais epoxyeicosatrienoic), peroxyde d’hydrogène (H2O2),

monoxyde de carbone, sulfure d’hydrogène [H2S], peptide C natriurétique, ions potassiums [K+]). Ces facteurs

vasodilatateurs (NO, PGI2, EDHF) sont produits par les CE lorsqu’un composé vasoactif comme la

bradykinine, l’histamine ou la sérotonine se lie à son récepteur couplé aux protéines G (GPCR de l’anglais G-

10

protein coupled receptor) spécifique. Inversement, l’angiotensine II et la thrombine stimulent la production

d’endothéline (ET), un puissant agent vasoconstricteur agissant sur les CML ou des facteurs vasoconstricteurs

dérivés de l’endothélium (EDCF de l’anglais endothelium-derived contracting factor) produits par la COX1 à

partir de l’acide arachidonique (endoperoxydes, prostaglandines (PG) et thromboxane A2 (TXA2)

[Feletou et al., 2009].

Figure 1.4 - Contraction de la cellule musculaire lisse

Le mouvement des filaments fins sur les filaments épais entraîne le rapprochement des corps denses. Cette figure représente la

contraction anisotropique de la cellule, c’est-à-dire que l’axe le plus long de la cellule se contracte alors que le plus court s’allonge

légèrement. (Adaptée de [Tortora et al., 2003])

Les composés vasoactifs retrouvés dans la circulation exercent leurs actions sur la fonction vasculaire en

interagissant avec l’endothélium. Lorsque l’endothélium est altéré, dans le cas d’une dysfonction endothéliale

ou d’un bris de l’endothélium, ces composés entrent directement en contact avec les CML. Dans cette

situation, l’effet de plusieurs de ces facteurs vasoactifs sur le niveau de contraction de la media est inversé.

Alors qu’une augmentation de calcium dans les CE entraîne la libération de composés vasodilatateurs,

l’augmentation de calcium dans les CML cause plutôt la contraction. La formation du clou plaquettaire fait

intervenir ce phénomène pour limiter la perte sanguine suite à une blessure [Virdis et al., 2010, Feletou et al.,

2011, Rubanyi, 2011, Feletou et al., 2012].

11

1.3.3. Contraction

La media contrôle le tonus vasculaire grâce à la capacité des CML à modifier l’état de contraction de leur

cytosquelette d’actine en réponse à des agents vasocontractiles et vasorelaxants. En effet, c’est la sommation

des agonistes aux effets opposés qui détermine le niveau de contraction des cellules et, par conséquent, de la

media (Fig. 1.4). La présence des jonctions ouvertes et des jonctions serrées entre les CML est essentielle à

leur fonctionnement. Lors d’une situation nécessitant un rétrécissement de la lumière artérielle, la contraction

de chacune des cellules se traduit par la contraction de tout le vaisseau. En effet, l’augmentation de calcium

dans une cellule est en mesure de se répandre aux cellules adjacentes via les jonctions ouvertes. De plus,

comme les cellules sont attachées les unes aux autres via les jonctions serrées et que ces jonctions sont

ancrées au cytosquelette d’actine, la contraction de chacune des cellules ne les éloigne pas l’une de l’autre,

mais rétrécit plutôt la lumière du vaisseau.

1.3.3.1. Régulation du tonus vasculaire

Il est important pour le fonctionnement de l’organisme que le système artériel soit maintenu sous pression.

Cette pression joue un rôle important pour permettre les échanges au niveau des capillaires. La pression et le

débit à ce niveau sont pratiquement continus grâce à l’élasticité et à la contractilité de la media artérielle. La

pression est certes nécessaire, mais son excès est délétère. En effet, l’hypertension artérielle représente un

facteur de risque important de développement de MCV.

Plusieurs mécanismes sont impliqués dans le contrôle de la pression sanguine. En plus des facteurs dérivés

de l’endothélium (NO, PGI2, EDRF, EDCF, ET), les stimuli qui influencent le tonus myogénique sont les

médiateurs de la voie rénine-angiotensine [Dostal et al., 1997, Kurtz, 2012], les hormones (adrénaline,

noradrénaline, aldostérone), les médiateurs de l’inflammation (chronique ou aiguë), le débit sanguin [Markos

et al., 2013], le système nerveux autonome [Zeng et al., 2007], ainsi que l’oxygène et le gaz carbonique

[Marieb, 2005]. Ces médiateurs régulent la quantité de métabolites vasocontractiles et vasodilatateurs que

l’endothélium libère vers le muscle lisse sous-jacent (Fig. 1.3). Les CML modifient le diamètre de la media par

leurs contraction et relaxation en réponse à ces stimuli provenant de l’endothélium ou d’autres sources

(inflammatoire, canaux calciques mécanosensitifs).

1.3.3.2. Mécanisme moléculaire de la contraction et relaxation des CML

Le niveau de contraction des CML est influencé par une panoplie de facteurs qui se répercutent sur le niveau

de calcium intracellulaire. En effet, ce second messager intègre les signaux pour générer une contraction

proportionnelle à son niveau. Cette action est cependant antagonisée par les nucléotides monophosphates

cycliques comme l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et la guanosine monophosphate cyclique

(GMPc).

12

Figure 1.5 - Mécanismes de contraction et de relaxation des cellules musculaires lisses

A) Contraction : 1. Liaison d’une molécule vasoactive à son GPCR spécifique; 2. Liaison de la protéine G à un GTP, dissociation des

sous-unités alpha (Gαi ou Gαq) et beta-gamma (β-γ); 3a. Gαi demeure à la membrane plasmique, inhibe l’AC, cause la diminution de

l’AMPc (antagonise le mécanisme présenté en (B)); 3b. Gαq demeure à la membrane plasmique, active la PLC, catalyse la

transformation du PIP2 en DAG et IP3; 3c. β-γ demeurent à la membrane plasmique et activent la PLC; 4. IP3 entraîne l’ouverture des

canaux calciques de la membrane du RE, libère la réserve de calcium ; 5. Ca2+ entraîne l’ouverture des canaux calciques dépendants

du Ca2+ présents sur la membrane plasmique, entrée de calcium 6. Formation du complexe Ca2+-calmoduline, activation de la MLCK;

7. MLCK phosphoryle les têtes de la myosine, interaction avec l’actine, glissement actine-myosine, contraction.

B) Relaxation : 1. Liaison d’une molécule vasorelaxante à son GPCR; 2. Liaison de la protéine G à un GTP entraîne la dissociation

des sous-unités alpha (Gαs) et beta-gamma (β-γ); 3. Gαs active l’AC, augmentation d’AMPc; 4. AMPc active la PKA, qui active

(phosphorylation) la MLCP, qui déphosphoryle la myosine; 5. Perte d’interaction actine-myosine, relaxation.

C) Relaxation dépendante du NO : 1. Le NO traverse la membrane et active la GC; 2. augmentation du GMPc; 3. GMPc active la

cGKIα; 4. cGKIα active la MLCP; 5. Activation des canaux potassiques dépendants du calcium, hyperpolarisation de la membrane

plasmique; 6. Fermeture des canaux calciques dépendants du voltage, diminution du Ca2+; 7. Relaxation. (© Lavoie, Bourget, 2014)

Abréviations de l’anglais : GPCR, G-protein coupled receptor; GMPc/cGMP, guanosine monophosphate cyclique; GDP, guanosine

diphosphate; GTP, guanosine triphosphate; GC, guanylate cylcase; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; DAG, diacylglycerol;

IP3, inositol 1,4,5-trisphosphate; AMPc, adénosine monophosphate cyclique; ATP, adenosine triphosphate; AC, adenylate cyclase;

PKA, cAMP-dependent protein kinase; cGKIα, cGMP-dependent protein kinase type I; MLCP, myosin light chain phosphatase; MLCK,

myosin light chain kinase; PLC, phospholipase C; RE, réticulum endoplasmique; NO, nitric oxide; P, phosphate.

13

La contraction des CML vasculaires débute par la liaison d’une molécule vasoactive à son récepteur

transmembranaire spécifique, le plus souvent un GPCR. Cette liaison permet l’hydrolyse d’une guanosine

triphosphate (GTP) par la protéine G, entraînant la dissociation des sous-unités alpha (Gαi, Gαq) et beta-

gamma (β-γ). Les sous-unités β-γ demeurent à la membrane plasmique et activent la phospholipase C (PLC)

qui catalyse la transformation du phosphatidylinositol 4,5-disphosphate (PIP2) en diacylglycérol (DAG) et

inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). La sous-unité α demeure également accrochée au feuillet interne de la

membrane plasmique et elle peut soit activer (Gαs) ou inhiber (Gαi) l’adénylate cyclase, modulant le niveau

d’AMPc. Elle peut également activer la PLC (Gαq), augmentant le niveau d’IP3. Ce dernier entraîne l’ouverture

des canaux calciques de la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et libère la réserve de calcium.

L’ouverture subséquente des canaux calciques dépendants du calcium sur la membrane plasmique augmente

le niveau de calcium intracellulaire. La formation du complexe calcium-calmoduline permet l’activation de la

kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCK de l’anglais myosin light chain kinase). Cette kinase

phosphoryle les têtes de la chaîne légère de la myosine, leur permettant d’interagir avec les filaments d’actine

et de causer le glissement actine-myosine. La phosphatase de la chaîne légère de la myosine (MLCP de

l’anglais myosin light chain phosphatase) antagonise l’action de la kinase de ce mécanisme. L’activité de la

MLCP est régulée par le niveau de GMPc et d’AMPc (Fig. 1.5). Le mécanisme de relaxation est décrit en

détails à la figure 1.5. Celui-ci implique la liaison d’un facteur vasoactif à son GPCR (Gαs) ou la diffusion du

NO à travers la membrane plasmique (Fig. 1.5) [Stull et al., 1991, Marieb, 2005].

1.3.3.3. Agents vasoactifs utilisés in vitro

1.3.3.3.1. Histamine

L’histamine est une molécule vasoactive impliquée dans plusieurs processus liés à l’inflammation. L'histamine

est synthétisée à partir de la L-histidine, un acide aminé essentiel, par l'enzyme histidine décarboxylase. Tel

que mentionné dans les sections précédentes, elle agit de manière opposée si elle entre en contact avec

l’endothélium ou directement avec les CML. On retrouve 4 isoformes de récepteurs de type GPCR (H1, H2,

H3, H4) pour cette petite amine de 111 g/mol (C5H9N3). Les CE peuvent porter les récepteurs H1 et H3, mais

le récepteur H1 est le plus commun. La liaison de l’histamine au récepteur H1 (Gαq) sur la CE entraîne

l’augmentation du calcium intracellulaire qui résulte en une augmentation de la perméabilité via la contraction

de la CE et en la sécrétion du facteur d’activation des plaquettes, du facteur Von Willebrand, de PGI2 et de

NO. Ces deux derniers entraînent, entre autres, la relaxation de la media. Le récepteur H3 (Gαi) cause

également l’augmentation de la perméabilité via l’inhibition de l’adénylate cyclase, diminuant le taux d’AMPc.

Les CML portent les récepteurs H1 et H2 (Gαs). Le récepteur H1 cause la contraction du muscle lisse via une

augmentation de calcium intracellulaire. Inversement, le récepteur H2 cause sa relaxation via la libération de

AMPc par l’adénylate cyclase [Hill et al., 1997]. In vitro, la media reconstruite se contracte lors de l’ajout

14

d’histamine. La réponse du muscle lisse à l’histamine dépendra du nombre de récepteurs et de leur affinité

spécifique pour l’histamine. Cette action opposée des récepteurs H1 et H2 permet à la cellule de moduler sa

réponse à l’histamine en fonction d’autres facteurs pouvant agir sur l’expression génique des récepteurs

[Falus, 2003, Wang et al., 2010b, Ohtsu, 2012].

1.3.3.3.2. Thromboxane A2

Le TXA2 est un lipide de la famille des eicosanoïdes produit principalement dans les plaquettes par la TXA2

synthase à partir de la prostaglandine H2 qui, elle, est produite par la cyclo-oxygénase 1 (COX1). L’aspirine,

inhibant de manière irréversible la COX1, bloque la production de TXA2. Le TXA2 possède des propriétés

vasocontractiles et pro-thrombogéniques. Cet agent vasoconstricteur est particulièrement important dans les

processus inflammatoires et dans la réponse aux blessures. Le récepteur du TXA2 est un GPCR (Gαq) dont

deux isoformes sont connues (α et β). Le TXA2 étant très instable en solution, l’utilisation d’un analogue de cet

agent, le 9,11-didéoxy-11α,9α-époxyméthanoprostaglandine F2α (U46619), est préférable en recherche

[Huang et al., 2004].

1.3.3.3.3. Sérotonine

La sérotonine ou 5-hydroxytryptamine (5-HT) est une monoamine dérivée du tryptophane et est à la fois

neurotransmetteur et hormone. Dans le système vasculaire, la sérotonine est stockée dans les plaquettes.

Lorsqu’elle se lie à son récepteur situé sur une CE, un GPCR (Gαi), elle active la eNOS entraînant la libération

de NO par l’endothélium. En situation d’hémostase, la libération massive de sérotonine par les plaquettes lors

de la formation du clou plaquettaire permet à cette molécule d’entrer en contact avec la media et de causer la

contraction des CML [Vanhoutte, 2010].

1.3.3.3.4. Nitroprussiate de sodium

Le nitroprussiate de sodium (SNP de l’anglais sodium nitroprusside) est un composé inorganique agissant

comme vasodilatateur en libérant en solution des anions divalents [Fe(CN)5NO]2-, relâchant progressivement

du NO. Ce composé est utilisé en clinique pour traiter une hypertension aiguë. En recherche, le SNP sert à

démontrer la capacité d’un vaisseau à se dilater de manière indépendante de l’endothélium. La demi-vie du

SNP étant de 1 à 2 minutes seulement, le sel doit être dissous juste avant son utilisation [Murad, 1986,

Friederich et al., 1995].

1.3.4. Inflammation

L’inflammation est définie comme une réaction de protection d’un tissu à une irritation, une blessure ou une

infection. Elle se caractérise par de la douleur, de la chaleur, de la rougeur, de l’enflure et peut éventuellement

15

mener à une perte de fonction. Le rôle physiologique de l’inflammation est de résoudre une situation de

déséquilibre homéostatique qui demande une réparation ou une défense particulière. Elle peut être de type

aigu ou chronique. L’inflammation aiguë, retrouvée dans le cas d’une blessure ou d’une infection, est

normalement résolue sans perte de fonction du tissu. Cette inflammation est généralement bénéfique

puisqu’elle contribue à la guérison de la plaie. Par contre, l’inflammation chronique est souvent associée à des

situations pathologiques délétères. C’est le cas de l’obésité, de l’arthrite rhumatoïde, des bronchites

chroniques, de l’emphysème, de l’asthme et de certaines maladies auto-immunes [Mocsai, 2013].

L’inflammation influence le tonus vasculaire. Certains médiateurs inflammatoires induisent une vasorelaxation

locale de la media pour permettre un apport sanguin plus important dans la région en situation d’inflammation.

De plus, ils entraînent l’activation de l’endothélium, le rendant plus favorable à l’adhésion et au passage des

leucocytes, particulièrement au niveau des capillaires, grâce à l’expression des sélectines à la surface des CE.

Enfin, des facteurs chimioattractants libérés par le tissu en inflammation, comme la protéine d'attraction des

monocytes-1 (MCP-1 de l’anglais monocyte chemoattractant protein-1), attirent les cellules immunitaires dans

ce tissu [Rautou et al., 2011].

L’obésité est un état pathologique qui cause une situation d’inflammation chronique modérée et entraîne de

nombreux effets indésirables. Le tissu adipeux est un organe endocrinien et la présence de macrophages

infiltrés dans ce tissu contribue à la sécrétion de médiateurs de l’inflammation [Wellen et al., 2003, Fain et al.,

2004, Bouloumie et al., 2005]. La surabondance de ce tissu cause un déséquilibre hormonal entre autres par

la sécrétion du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α de l’anglais tumor necrosis factor-alpha). Cette cytokine

joue un rôle important dans le maintien de l’état d’inflammation chronique associé à cette pathologie. Elle

contribue au développement de la résistance à l’insuline par plusieurs mécanismes, dont la phosphorylation et

la réduction de l’expression du substrat du récepteur de l'insuline-1 (IRS-1 de l’anglais insulin receptor

substrate-1). Le TNF-α réduit également la capture des acides gras par les adipocytes et augmente la lipolyse,

contribuant ainsi au désordre lipidique impliqué dans le développement de l’athérosclérose

[Ntaios et al., 2013].

Le choc septique est un état pathologique dans lequel l’inflammation est aiguë, mais systémique et

incontrôlée. Cette condition débute généralement par une infection bactérienne hors de contrôle qui se

propage au niveau de la circulation sanguine. Le système immunitaire entre en état d’alerte et entraîne

notamment une libération massive d’histamine par les granulocytes. Cette molécule cause une vasodilatation

généralisée qui déclenche une cascade d’évènements : chute de la pression sanguine, défaillance de la

microcirculation, hypoxie des tissus, puis dysfonction des organes. La prise en charge des patients vise le

rétablissement d'un volume sanguin circulant normal par l’administration de produits sanguins enrichis en

globules rouges et de médicaments vasopresseurs comme la norépinéphrine, l’épinéphrine, la vasopressine,

16

la dopamine et la phényléphrine [Dellinger et al., 2013]. On qualifie l’état du patient de choc septique lorsque

plusieurs organes sont en défaillance et que les traitements vasopresseurs sont inefficaces [Levy et al., 2003].

1.3.5. Plasticité phénotypique des cellules musculaires lisses

Les CML possèdent la capacité de modifier leur phénotype en réponse à l’environnement [Johnson et al.,

2001, House et al., 2008]. Elles sont en mesure de passer d’un état quiescent et contractile normal à un état

prolifératif et migratoire associé à un déséquilibre homéostatique. Cette caractéristique est bénéfique lors

d’une blessure ou du développement de nouveaux vaisseaux. Dans ces situations, les CML adoptent une

capacité régénératrice suite à leur activation par les facteurs de croissance du sérum. Par contre, dans une

situation de blessure chronique telle qu’une plaque d’athérome, la media devient hyperproliférative et forme

une néointima qui envahit progressivement la lumière du vaisseau. Cette condition est appelée sténose ou

resténose si elle survient suite à une opération comme l’angioplastie [Gomez et al., 2012, Liu, 2012, McDonald

et al., 2012]. In vitro, cette capacité de prolifération et de migration permet l’isolement et la culture de

populations de CML afin de reconstruire des tissus ou d’étudier leurs comportements. Dans la media

reconstruite par auto-assemblage, elles réexpriment les protéines de la machinerie de contraction (actine

alpha du muscle lisse, calponine, desmine, chaîne légère de la myosine, caldesmone et smootheline) et

redeviennent contractiles [Grenier et al., 2003, Grenier et al., 2006].

1.3.6. Implication pathologique

La media vasculaire est impliquée dans le développement de plusieurs pathologies et états pathologiques

cardiovasculaires dont l’athérosclérose, l’hypertension, la calcification artérielle ainsi que le choc septique.

L’athérosclérose fait l’objet de la section 1.4.1 Athérosclérose.

L’hypertension affecte plus du quart de la population et se caractérise par un rapport de la tension systolique

sur la tension diastolique de plus de 140/90 [Kearney et al., 2005]. Plusieurs facteurs peuvent contribuer au

développement de l’hypertension artérielle, notamment l’obésité, la sédentarité, l’excès de sodium, le

tabagisme, l’abus d’alcool et de drogues ainsi que certaines conditions pathologiques comme l’insuffisance

rénale et l’apnée du sommeil. Ces facteurs créent principalement une dysfonction endothéliale, limitant la

sécrétion de facteurs vasodilatateurs par l’endothélium. La tension supraphysiologique retrouvée chez un

patient hypertendu est délétère pour l’endothélium et forme une boucle d’induction entre dysfonction

endothéliale et hypertension. Ce phénomène favorise la progression des autres maladies cardiovasculaires

comme l’athérosclérose. L’hypertension est un des symptômes du syndrome cardiométabolique [Giles et al.,

2012].

17

Le contrôle pharmacologique de l’hypertension peut se faire par différentes approches. Les diurétiques

diminuent la quantité de sang en circulation, les β-bloquants ralentissent le rythme cardiaque tandis que les

α-bloquants réduisent les influx nerveux vers la media. Certaines substances ont un effet vasorelaxant direct

sur le muscle lisse vasculaire alors que d’autres bloquent l’entrée de calcium dans les CML. Finalement, la

voie rénine-angiotensine peut être ciblée à plusieurs niveaux pour diminuer la tension artérielle.

La calcification artérielle est une autre pathologie affectant la media. Elle se développe notamment suite à une

insuffisance rénale en phase terminale. La calcification cause une rigidité artérielle pouvant entraîner

l’hypertension ainsi que l’hypertrophie ventriculaire gauche. En condition physiologique, la compliance des

artères élastiques de gros calibres comme l’aorte ou l’artère pulmonaire est essentielle au fonctionnement

adéquat du cœur. En effet, la capacité de ces vaisseaux à se dilater en systole permet de minimiser la force

que le myocarde doit déployer pour éjecter le sang des ventricules. En situation pathologique, l’augmentation

de la rigidité de l’aorte entraîne une fatigue progressive du myocarde qui s’hypertrophie pour répondre à la

demande ce qui réduit la lumière et donc la fraction d’éjection. De plus, la capacité contractile de ces

vaisseaux permet au flux sanguin d’être de plus en plus continu à mesure que le sang progresse vers les

capillaires. Le mécanisme pathologique implique l’apoptose des CML causée par une surabondance de

calcium. Les cristaux d’hydroxyapatite qui se forment ensuite dans la media contribuent à promouvoir

l’apoptose. Ce processus s’apparente à une ossification de la tunique vasculaire [Jablonski et al., 2013].

La media joue donc un rôle prépondérant dans le développement de pathologies ayant de graves

conséquences sur le fonctionnement d’organes vitaux comme le cœur et les reins. L’altération des fonctions

de la media est souvent la conséquence d’une dysfonction endothéliale. En effet, ces deux tuniques sont en

étroite collaboration : c’est généralement l’endothélium qui prend les décisions, mais c’est la media qui agit en

modulant son état de contraction. Un état pathologique de l’endothélium a donc des répercussions directes sur

la physiologie de la media et contribue au développement de l’athérosclérose. Cette pathologie est la source

de plus de la moitié des décès associés aux MCV [Go et al., 2013].

1.4. Maladies Cardiovasculaires et Traitements

Les statistiques publiées en 2013 par l’American Heart Association [Go et al., 2013] démontrent une

diminution de l’incidence et de la mortalité associée aux MCV aux É-U. Ce recul est attribuable aux avancées

pharmacologiques et chirurgicales, mais surtout à la prévention du développement de l’athérosclérose par la

modification des habitudes de vie [Ford et al., 2007, Ford et al., 2011]. En effet, l’obésité,

l’hypercholestérolémie, l’hypertension artérielle, le tabagisme, l’alcool, le diabète et la sédentarité constituent

les principaux facteurs de risque de développement de l’athérosclérose. La diminution de l’incidence du

tabagisme n’est pas étrangère à ce recul (25% en 1999 contre 16% en 2012, de la population de plus de 15

ans) [Santé_Canada].

18

Les MCV regroupent plusieurs pathologies de l’appareil circulatoire. L’agence de la santé publique du Canada

les classe en 6 types : la cardiomyopathie ischémique (CI), la maladie cérébrovasculaire, la maladie vasculaire

périphérique (MVP), l’insuffisance cardiaque, le rhumatisme cardiaque et la cardiopathie congénitale. Chacun

de ces types regroupe également plusieurs maladies précises. Malgré les progrès, la maladie cardiovasculaire

reste la première cause de décès chez les Canadiens d'âge adulte. Les patients atteints de CI ou de MVP

risquent d’avoir recours à la chirurgie par pontage artériel de vaisseaux de près de

6 mm de diamètre.

1.4.1. L’athérosclérose

L’athérosclérose n’est pas citée comme une cause de mortalité en soi, mais la présence de plaques

d’athérome est à l’origine de plusieurs des MCV. En effet, cette pathologie est le point de convergence entre

les facteurs de risques et les MCV. Elle joue un rôle prédominant dans le développement de la CI et de la

MVP. L’athérosclérose est une maladie à développement progressif et l’apparition des premières plaques

asymptomatiques survient dès la vingtaine. Elle est causée à la fois par des prédispositions génétiques et par

des habitudes de vie néfastes. Une étude de l’armée américaine révèle la présence de plaques d’athérome

coronariennes chez 12% de la population (3 000 sujets en bonne santé de 18 à 59 ans, 98% d’hommes, 26

ans en moyenne). Plus inquiétant encore, 6,6% des jeunes de moins de 25 ans présentaient des signes

d’athérosclérose (Fig. 1.6) [Webber et al., 2012].

Figure 1.6 - Prévalence de l’athérosclérose dans l’artère coronaire selon l’âge

Cette étude, réalisée sur une population de soldats américains, démontre une apparition précoce des plaques d’athérome au niveau

de l’artère coronaire. La prévalence de cette maladie augmente avec l’âge. (Adapté des résultats de [Webber et al., 2012])

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire qui se développe au niveau de la media vasculaire et qui

cause une hyperplasie et une calcification de l’artère. L’obstruction progressive de la lumière du vaisseau est

souvent asymptomatique jusqu’à la formation spontanée d’un thrombus obstruant complètement l’artère. En

1973, Ross et Glomset formulent l’hypothèse de la réponse à la blessure de l’endothélium pour expliquer

19

Figure 1.7 - Phases de progression d’une plaque d’athérome

A) La dysfonction endothéliale est la première étape de la formation d’une plaque d’athérome. Elle est entre autres causée par les

attaques des oLDL qui activent l’endothélium, un processus médié par NO, PGI2, PDGF, AngII et ET-1. L’endothélium activé permet le

passage des leucocytes, des facteurs de croissance et des oLDL vers la media. Le passage des leucocytes est facilité par

l’augmentation de l’expression des facteurs d’adhésion sur les cellules endothéliales (L-sélectine, intégrines, PECAM1) et sur les

leucocytes (E-sélectine, P-sélectine, ICAM1, VCAM1). Leur migration vers la media est favorisée par oLDL, MCP-1, IL-8, PDGF,

MCSF et Ost. Les facteurs de croissance stimulent la dédifférenciation des CML vers un phénotype prolifératif. B) La formation de

stries lipidiques au niveau de la media débute par la transformation des macrophages infiltrés en cellules spumeuses. Les facteurs pro-

inflammatoires sécrétés par ces cellules et ceux déjà présents entraînent la migration des CML (PDGF, FGF2, TGF-β), l’activation des

lymphocytes-T (TNF-α, IL-2, GM-CSF), la formation de nouvelles cellules spumeuses (oLDL, MCSF, TNFα IL-1) et l’augmentation de

l’adhérence et de l’agrégation de l’endothélium (intégrines, P-sélectine, fibrine, TXA2, facteur tissulaire). C) La formation d’une capsule

fibreuse entre la lésion et le lumen survient lorsque les stries lipidiques progressent vers des stades plus avancés. Ce processus de

réparation en réponse à la blessure isole la lésion du côté de la circulation et entraîne la formation d’un centre nécrotique. D) La

capsule fibreuse devient instable et sa rupture ou son ulcération entraîne rapidement la thrombose. (Adaptée de [Ross, 1999])

Abréviations de l’anglais : oLDL, oxidised low density lipoprotein; NO, nitric oxide; PGI2, prostacyclin; PDGF, platelet-derived growth

factor; AngII, angiotensin II; ET-1, endothelin-1; PECAM1, platelet-endothelial-cell adhesion molecule 1; ICAM1, intercellular adhesion

molecule 1; VCAM1, vascular-cell adhesion molecule 1; MCP1, monocyte chemoattractant protein 1; IL, interleukin; MCSF,

macrophage colony-stimulating factor; Ost, osteopontin; FGF2, fibroblast growth factor 2; TGF-β, transforming growth factor β; TNF-α,

tumor necrosis factor α, GM-CSF, granulocyte–macrophage colony-stimulating factor; TXA2, thromboxane A2.

20

l’initiation de la pathologie [Ross et al., 1973]. Cette théorie est toujours valable et elle est supportée par

plusieurs résultats plus récents. Le Dr Ross et d’autres chercheurs ont complété la théorie originale suite à

l’identification d’un processus inflammatoire impliqué dans l’initiation et l’évolution de la pathologie [Ross,

1999]. Plusieurs aspects mécanistiques de la progression de cette pathologie sont complexes et n’ont pas

encore été élucidés. Les grandes étapes du processus sont décrites à la figure 1.7.

Brièvement, l’excès de LDL sériques entraîne une dysfonction endothéliale, ce qui cause le recrutement de

cellules immunitaires inflammatoires au niveau de la media. Une capsule fibreuse se forme causant

l’augmentation de l’épaisseur de la paroi artérielle et un rétrécissement progressif de la lumière de l’artère. La

plaque peut rester asymptomatique jusqu’à l’obstruction quasi totale de la lumière. Deux évènements peuvent

se produire. Le premier est la rupture de la plaque qui relâche des caillots dans la circulation. Ceux-ci peuvent

mener à l’occlusion d’autres artères de plus faible dimension, comme les artérioles du cerveau. Le deuxième

évènement est la formation d’un thrombus au niveau de la plaque d’athérome. Celui-ci obture totalement

l’ouverture et entraîne une ischémie des zones en aval. S’il s’agit d’une artère coronaire, l’infarctus du

myocarde est alors imminent.

Aucune médication ne parvient actuellement à soigner cette pathologie. La modification des habitudes de vie

néfastes est la recommandation de base pour ralentir la progression de l’athérosclérose. Lorsqu’elle devient

symptomatique, une médication visant à diminuer le taux de LDL peut être nécessaire pour contrôler la

progression des plaques et limiter les dommages. Ces thérapies seront discutées dans la section 1.4.4.1

Traitements pharmacologiques.

1.4.2. La cardiomyopathie ischémique

Cette pathologie est probablement l’une des MCV les plus connue, et pour cause : aux É-U, un décès sur six

est attribuable à une CI et le tiers des personnes qui subissent un infarctus du myocarde en mourront [Go et

al., 2013]. Par définition, la cardiopathie ischémique est un manque d’oxygénation du muscle cardiaque qui

entraîne une nécrose d’une partie du myocarde. Cette ischémie est le plus souvent causée par la formation

d’un thrombus dans une des artères coronaires. La présence de plaques d’athérome et l’activation de

l’endothélium contribuent à la formation de ce thrombus. Une ischémie partielle du myocarde peut

l’endommager, particulièrement à l’effort, même si la douleur est supportable pour le patient. Non traitée, cette

ischémie partielle risque d’entraîner une altération de la fonction cardiaque à long terme. Un mécanisme

compensatoire de prolifération des cardiomyocytes crée une hypertrophie progressive du myocarde, réduisant

sa fraction d’éjection. Lorsque l’obstruction des coronaires est aiguë, le muscle cardiaque entre rapidement en

ischémie causant un infarctus du myocarde. Cet infarctus entraîne la nécrose des cardiomyocytes et la

défibrillation du cœur. Suite à une prise en charge rapide et au succès de la revascularisation du cœur,

certains patients survivront à leur infarctus. Néanmoins, ces survivants risquent de voir leur qualité de vie

21

fortement compromise, car la morbidité associée à cet évènement est généralement très importante. En effet,

la partie du cœur nécrosée reste non fonctionnelle et la compensation par le ventricule droit cause

progressivement son hypertrophie.

Étant donné la sévérité et la fulgurance de la CI, les cardiologues préfèrent prévenir que guérir. La médication

se concentre sur le blocage de l’agrégation plaquettaire par la consommation régulière de faibles doses

d'acide acétylsalicylique (Aspirine®), un inhibiteur irréversible des COX (affecte particulièrement la COX1).

Lors de la manifestation des symptômes de l’infarctus, le patient peut également prendre de la trinitrine

(nitroglycérine). Ce produit est transformé par les mitochondries en NO, un vasodilatateur puissant pouvant

déloger le thrombus ou du moins, augmenter les chances de survie du patient avant sa prise en charge. Par

contre, les médecins préfèrent opérer avant l’infarctus plutôt qu’en situation d’urgence. Suite à la

détermination des coronaires problématiques, deux options sont privilégiées pour traiter les plaques

d’athéromes : l’angioplastie (avec ou sans tuteur) et le pontage coronarien (CABG de l’anglais coronary artery

bypass graft). Ces traitements et chirurgies seront détaillés dans la section 1.4.4 Les avenues thérapeutiques.

Le génie tissulaire et la médecine régénératrice s’attaquent à la CI principalement de deux manières. D’abord,

par le développement d’un substitut vasculaire reconstruit par génie tissulaire (TEBV de l’anglais tissue-

engineered blood vessel) comme greffon pour les CABG. Les différentes avancées concernant le

développement d’un tel substitut seront détaillées dans la section 1.5.3 Vaisseaux reconstruits par génie

tissulaire. La deuxième approche concerne la régénération du muscle cardiaque après l’infarctus,

principalement par l’utilisation des cellules souches [Sanganalmath et al., 2013]. Cette approche, très

intéressante et prometteuse, ne sera malheureusement pas discutée dans le cadre de cet ouvrage.

1.4.3. Les maladies vasculaires périphériques

La MVP touche principalement les membres inférieurs. Elle est causée par l’obstruction de la circulation

artérielle dans un membre, généralement par la présence d’une plaque d’athérome. Les symptômes

chroniques de la MVP sont la douleur musculaire et la claudication. Une obstruction sévère de la circulation

peut amener une ischémie critique du membre pouvant entraîner de la nécrose et nécessiter l’amputation de

l’extrémité touchée [Raval et al., 2013]. L’incidence de cette condition est de 500 à 1000 cas par millions dont

plus de 30% nécessitent une amputation dans l’année suivant le diagnostic [Norgren et al., 2007]. Même si la

mortalité associée à la MVP est relativement faible, cette pathologie est source d’une sévère morbidité

associée à l’amputation d’un membre.

Le traitement des MVP vise à revasculariser le membre touché pour redonner au patient sa mobilité normale.

La première approche devrait viser le changement des habitudes de vie, un programme d’exercices structuré

ainsi que le traitement de la douleur par analgésiques et narcotiques. Pour les cas plus sévères, certains

22

traitements pharmacologiques peuvent être utiles (voir section 1.4.4 Les avenues thérapeutiques). Cependant,

la médication est souvent inefficace et des approches plus invasives sont nécessaires pour revasculariser le

membre, diminuer les symptômes et éviter l’amputation. Suite à la localisation de la ou des zones de sténose,

le chirurgien vasculaire pratique soit une angioplastie percutanée, avec ou sans apposition d’un tuteur (stent),

ou un pontage artériel. L’angioplastie reste une mesure le plus souvent temporaire, avec une perméabilité à 5

ans d’environ 50%. Dans le cas d’un pontage pour contourner le blocage sur l’artère fémorale, l’utilisation d’un

vaisseau autologue comme la veine saphène est préférable à l’utilisation d’un vaisseau synthétique en

polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pour des vaisseaux de moins de 6 mm, un vaisseau allogénique, comme la

veine de cordon ombilical peut également être utilisé. Le taux de perméabilité primaire à 5 ans pour le PTFE

pour un pontage fémoro-poplité en haut du genou est de 73% pour la veine saphène autologue, 53% pour la

veine de cordon humaine allogénique et de 39% pour le PTFE [Johnson et al., 2000]. Ces résultats sont

similaires à ceux obtenus dans d’autres études [Aalders et al., 1992]. La thérapie cellulaire est une avenue

prometteuse pour traiter les MVP. L’injection de cellules souches mononucléaires autologues, dérivées de la

moelle osseuse ou du sang périphérique, dans le membre atteint permettrait une amélioration de la condition

du patient [Kalka et al., 2008, Menasche, 2010, Raval et al., 2013].

Un vaisseau reconstruit par génie tissulaire pourrait également être très utile dans plusieurs cas de MVP.

Cette pathologie est souvent associée à d’autres MCV qui nécessitent des pontages prioritaires. Les

vaisseaux autologues étant disponibles en quantité limitée, cette maladie demeure souvent non traitée en

raison d’un manque de greffons autologues disponibles. De plus, comme cette condition n’est généralement

pas létale, le médecin préfère parfois conserver les vaisseaux autologues pour des pontages coronaires

éventuels. Un avantage significatif du TEBV pour cette application est qu’il peut être fabriqué en quantité

suffisante, à la longueur voulue, jusqu’à plusieurs dizaines de centimètres.

1.4.4. Les avenues thérapeutiques

Le développement et la progression des MCV artérielles restent en grande partie tributaires de notre mode de

vie. Il n’existe pas actuellement de médication permettant de faire régresser les plaques d’athérome établies.

Les traitements pharmacologiques disponibles tentent de diminuer les facteurs de risques (cholestérol,

tension, inflammation, surpoids) et de soulager les symptômes. Une opération percutanée ou chirurgicale est

requise lorsque les plaques d’athérome deviennent symptomatiques. En 2010, près d’un million

d’angioplasties percutanées et près de 400 000 pontages ont été effectués aux É-U [Go et al., 2013].

1.4.4.1. Traitements pharmacologiques

Le traitement des MCV artérielles doit s’attaquer au dénominateur commun : l’athérosclérose. La médication

tente de diminuer la progression des plaques, d’éviter la formation de nouvelles plaques ainsi que de diminuer

23

les risques de thrombose et d’ischémie. La thérapie principale pour le traitement de l’athérosclérose vise la

diminution du taux de LDL sanguins par l’administration d’inhibiteurs de la hydroxyméthylglutaryl-CoA

réductase, les statines [Gotto et al., 2005]. Plusieurs autres cibles thérapeutiques ont été visées par divers

médicaments comme la diminution de l’activation plaquettaire par l’acide acétylsalicylique (Aspirine®), la

diminution de la tension artérielle en ciblant l’axe rénine-angiotensine, l’augmentation de la disponibilité du NO

et le traitement de la dysfonction endothéliale. L’inflammation, le stress oxydatif et la prolifération cellulaire

sont des cibles potentielles actuellement à l’étude [Briasoulis et al., 2012]. Lors de la formation d’un thrombus,

l’utilisation d’agents vasodilatateurs comme la nitroglycérine permet de déloger le thrombus ou, du moins, de

fournir une revascularisation temporaire pour diminuer les dommages résultant de l’ischémie avant

l’intervention chirurgicale.

Pour les MVP, certains traitements novateurs ont été mis sur le marché. Le Cilostazol®, un inhibiteur de la

phosphodiestérase III, présente une activité vasodilatatrice et antiplaquettaire [Regensteiner et al., 2002]. Le

Naftidrofuryl® est quant à lui un antagoniste du récepteur de type 2 de la 5-HT qui pourrait améliorer le

métabolisme musculaire et réduire l’agrégation plaquettaire et érythrocytaire [Lehert et al., 1994]. La

Carnitine® interagit plutôt avec le métabolisme oxydatif du muscle [Brevetti et al., 1999]. La diminution des LDL

sanguins par les statines aurait également un impact positif sur les MVP [Mohler et al., 2003]. Lorsque ces

traitements ne sont pas en mesure de ralentir la progression des plaques de manière satisfaisante, des

approches chirurgicales peuvent être nécessaires.

1.4.4.2. Traitement percutané

Parmi les approches percutanées, on retrouve l’angioplastie, l’insertion de tuteurs et l’artériectomie. Le

développement de l’angioplastie percutanée dans les années 70 a permis de diminuer l’impact de la chirurgie

à cœur ouvert sur la santé des patients [Gruntzig et al., 1979]. En effet, cette opération percutanée

transluminale est beaucoup moins invasive. Elle consiste à introduire un ballonnet dans une artère

périphérique, pour l’amener vers l’artère pathologique, puis à le gonfler pour compresser la plaque d’athérome

et redonner à l’artère sa lumière d’origine. Cette opération s’accompagne généralement de l’apposition d’un

tuteur qui permet de maintenir l’ouverture de la lumière du vaisseau. L’ajout de ce tuteur améliore la

perméabilité précoce, mais prédispose à une resténose tardive causée par l’hyperprolifération des CML en

réponse à la blessure et au corps étranger qu’est le tuteur. Les risques de thrombose augmentent également

avec la mise en place de ce dispositif. L’utilisation d’un tuteur actif permet de limiter ce type de réponse en

libérant progressivement différents facteurs avec une action antiproliférative ou immunosuppressive

(Tacrolimus®, Siromus®, Paclitaxel®). Cette opération se pratique aussi bien au niveau des coronaires qu’au

niveau des artères périphériques [Schillinger et al., 2012].

24

Finalement, l’artériectomie est une procédure percutanée moins courante, qui consiste à retirer la plaque

d’athérome plutôt que de l’écraser contre la paroi du vaisseau. Trois dispositifs différents ont été développés

pour réaliser cette procédure par une approche transluminale : rotationnelle, directionnelle et transluminale. Il

est également possible de retirer la plaque chirurgicalement, par une ouverture longitudinale de l’artère. Cette

approche est moins populaire que l’angioplastie [Schillinger et al., 2012].

1.4.4.3. Les traitements chirurgicaux (pontages coronaires)

Le premier CABG a été réalisé par le Dr Goetz en 1960 [Goetz et al., 1961]. Cette opération consiste à

revasculariser la zone en aval du blocage en créant une dérivation, soit entre l’amont et l’aval du blocage ou

entre une autre artère et l’aval du blocage (Fig. 1.8). Cette procédure peut être pratiquée de deux façons

différentes, soit à cœur battant [Tashiro et al., 2013] ou, plus classiquement, en arrêtant le cœur et en utilisant

une circulation extracorporelle. Les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, mais leur

taux de succès est semblable [Kobayashi et al., 2005]. Par contre, la conversion en urgence d’une opération à

cœur battant vers une opération à cœur arrêté présente des risques supplémentaires [Reeves et al., 2006].

Figure 1.8 - Pontage coronaire

Deux types de pontage sont représentés. Un greffon veineux autologue (bleu) est anastomosé entre l’aorte et l’artère coronaire droite

en aval du site de sténose. Le deuxième pontage utilise un greffon artériel (rouge), comme l’artère mammaire interne, pouvant être

dévié vers la coronaire gauche ou encore prélevé et anastomosé entre l’artère sous-clavière et la coronaire en aval du site de blocage.

(Adaptée de [Mount_Sinai_Hospital, 2014])

Malgré que cette opération soit lourde pour le patient, la faible mortalité associée à cette procédure (1%)

résulte vraisemblablement de l’expérience des chirurgiens pour cette procédure de routine (400 000/ans, É-U).

25

Pour les vaisseaux de moyens et gros calibres, avec un débit sanguin important, des matériaux synthétiques

peuvent être utilisés. Pour les artères de petits calibres (<6 mm) comme les coronaires ou les artères fémoro-

poplités, en bas du genou, l’utilisation de vaisseaux natifs autologues est préférable. Pour les pontages

coronaires, le meilleur choix est l’artère mammaire interne, qui est anastomosée sur la coronaire en aval de la

sténose. En second choix, la veine saphène est prélevée et utilisée pour contourner la zone d’étranglement.

Finalement, le génie tissulaire proposera incessamment de nouveaux greffons présentant plusieurs

avantages, ils seront discutés dans la section 1.5.3 Vaisseaux reconstruits par génie tissulaire.

1.5. Les Substituts Vasculaires

Le choix du type de greffon est primordial dans la pratique d’un pontage par le cardiologue ou le chirurgien

vasculaire. Ce choix repose principalement sur le diamètre et le débit de l’artère obstruée. Parmi les

alternatives disponibles, deux groupes se distinguent : les vaisseaux natifs et les vaisseaux synthétiques.

Prochainement, les vaisseaux reconstruits par génie tissulaire deviendront une alternative aux vaisseaux

autologues natifs.

1.5.1. Vaisseaux natifs

Les vaisseaux natifs autologues sont des vaisseaux du patient prélevés ou dérivés de leur site normal pour

revasculariser une zone ischémique. Généralement, les veines sont prélevées de leur site pour effectuer un

contournement. Les artères peuvent être déviées de leur site d’origine pour revasculariser la zone ischémique

ou prélevées puis anastomosées autre part à l’instar des vaisseaux veineux. L’utilisation des vaisseaux natifs

est recommandée dans le cas de vaisseaux de moins de 6 mm de diamètre interne et de débit modéré. On

retrouve ce calibre de vaisseaux au niveau des artères coronaires et fémorales. Ce type de greffon s’intègre

dans l’organisme, puisqu’il s’agit d’un tissu autologue et cause une réaction inflammatoire minimale inhérente

à la chirurgie. Les artères donnent généralement de meilleurs résultats, vraisemblablement en raison de leurs

propriétés mécaniques (résistance et élasticité) adaptées au réseau artériel. Lorsqu’une veine est utilisée, les

valvules doivent être détruites, ce qui endommage l’endothélium. L’utilisation des veines et des artères

autologues pour la revascularisation est restreinte par la limitation en nombre et par l’état souvent

pathologique de ces vaisseaux.

L’utilisation de vaisseaux allogéniques et possiblement xénogéniques comme conduits de dérivation semblait

à priori une solution intéressante à la problématique de limitation du nombre de greffons disponibles.

Cependant, les vaisseaux allogéniques n’ont pas donné les résultats escomptés [Barner et al., 1966, Laub et

al., 1992]. Pour les vaisseaux xénogéniques, les groupements N-acétylglucosamine en α(1,3) retrouvés sur

plusieurs protéines des membranes cellulaires et sur certaines protéines de la MEC causent un rejet

hyperaigu de ces greffons, car cet épitope est absent chez l’humain. Les traitements de décellularisation et

26

surtout de fixation des tissus au glutaraldéhyde limitent ce phénomène, mais ils entraînent la calcification du

greffon [Grabenwoger et al., 1996, Chanda et al., 1998, Rao et al., 1999].

1.5.2. Vaisseaux synthétiques

Les vaisseaux synthétiques sont fabriqués à partir de PTFE expansé (ePTFE de l’anglais expanded PTFE,

Teflon®, Gore-Tex®) ou de fibres de poly(téréphtalate d'éthylène) (Dacron®). Pour des vaisseaux de petits

calibres, le taux de perméabilité de ce type de greffon est faible [Greisler, 1990]. Ils sont par contre

recommandés pour le remplacement de vaisseaux de gros calibres, comme l’aorte par exemple. Ils

démontrent une grande résistance mécanique à la pression, sont disponibles à grande échelle et peuvent

adopter toutes les formes possibles. Par contre, leur nature synthétique les rend pro-thrombogéniques et

favorise la sténose, l’encapsulation et l’infection du greffon. De plus, ils présentent une compliance beaucoup

plus faible que les vaisseaux natifs, ce qui cause un stress important au point d’attachement.

L’endothélialisation des prothèses vasculaires avec des cellules autologues est un concept initié il y a plus de

30 ans [Herring et al., 1978, Graham et al., 1980]. L’intérêt de cette procédure était de pouvoir diminuer la

thrombogénicité des prothèses de Dacron afin de permettre leur utilisation pour des vaisseaux de faibles

diamètres. Malgré les promesses de cette nouvelle approche, les premiers essais chez l’humain furent

décevants [Fasol et al., 1989, Herring et al., 1994]. L’utilisation d’une technique d’ensemencement en deux

étapes s’est révélée plus satisfaisante. Elle implique : 1) l’expansion des CE veineuses autologues in vitro et

2) le recouvrement de la surface avec du plasma autologue, puis l’ensemencement des cellules à haute

densité à l’intérieur de la prothèse de PTFE. Ces modifications permettent d’améliorer les résultats cliniques

[Leseche et al., 1995]. Dans cette étude, un pontage fémoro-poplité en haut du genou a été effectué à l’aide

de prothèses de PTFE (7 mm) endothélialisées, sur 21 patients. Le taux de perméabilité primaire était de 89%

à 48 mois et de 67% à 76 mois. Dans une étude randomisée, Zilla et al. démontrent que l’endothélialisation

des prothèses améliore leur perméabilité. Après 32 mois, la perméabilité des greffons était de 55% pour les

prothèses contrôles et de 85% pour les prothèses endothélialisées [Zilla et al., 1994a]. Dans cette étude, une

colle de fibrine a été utilisée pour recouvrir la surface de la prothèse avant l’endothélialisation au lieu du

plasma autologue. Plus récemment, des résultats similaires ont été rapportés pour une cohorte de plus de 300

patients pour des pontages fémoro-poplités en haut (153) et en bas (155) du genou. Le taux de perméabilité

primaire rapporté était de 69% à 5 ans et de 61% à 10 ans [Deutsch et al., 2009]. La surface des prothèses

peut également être modifiée par l’ajout de groupements retrouvés in vivo comme la fibrine [Zilla et al., 1994a],

les peptides RGD [Krijgsman et al., 2002], la fibronectine [Nishibe et al., 2001] ou des facteurs d’adhésion

semblables à la fibronectine [Mazzucotelli et al., 1994]. Ces approches tentent d’améliorer la rétention des CE

dans un environnement de débit physiologique. Malgré ces améliorations, les matériaux synthétiques ne

peuvent pas se remodeler, éliminant la possibilité de croissance et de vasoréactivité de la prothèse.

27

1.5.3. Vaisseaux reconstruits par génie tissulaire

1.5.3.1. Principes de base

Le génie tissulaire est un domaine de recherche multidisciplinaire qui vise à fabriquer des tissus biologiques à

partir de cellules et de biomatériaux [Langer et al., 1993]. Le paradigme du génie tissulaire consiste à

combiner cellules et échafaudage de biomatériaux pour ensuite implanter cette construction chez le receveur

(Fig. 1.9). Différentes méthodes ont été développées pour reconstruire des tissus comme l’épiderme [Green et

al., 1979, Germain et al., 1993, Rouabhia et al., 1995], le tissu osseux [Caplan, 2005, McMahon et al., 2013]

ou le tissu adipeux [Alhadlaq et al., 2005, Vermette et al., 2007] jusqu’aux organes (assemblage de tissus)

complexes comme la peau endothélialisée [Black et al., 1998], les vaisseaux sanguins [L'Heureux et al., 1998]

ou les reins [Guimaraes-Souza et al., 2012].

Au niveau vasculaire, les techniques de reconstruction de substituts artériels de petits calibres (<6 mm) sont

nombreuses. Elles font varier les types cellulaires et les biomatériaux utilisés, ainsi que la technique de

production de l’échafaudage [Naito et al., 2011, Cleary et al., 2012]. D’autres se distinguent par une absence

de cellules [Song et al., 2010, Quint et al., 2011, Wu et al., 2012, Wystrychowski et al., 2013] ou une absence

de biomatériaux exogènes [L'Heureux et al., 1998]. L’approche d’auto-assemblage fait partie de la dernière

catégorie. La structure tridimensionnelle de la construction repose sur la production de MEC par les cellules in

vitro. En effet, les cellules mésenchymateuses peuvent produire et assembler les principaux constituants de la

MEC en présence d’acide ascorbique et de sérum dans le milieu de culture [L'Heureux et al., 1998].

Le développement d’un substitut artériel de petit calibre reconstruit par génie tissulaire représente une étape

charnière en chirurgie cardiovasculaire afin de combler le manque de vaisseaux autologues valables pour les

greffes coronaires et périphériques [Zhang et al., 2007, Seifu et al., 2013]. Avant de tenter une translation

clinique du TEBV, différentes propriétés doivent être évaluées et les substituts doivent répondre à certaines

caractéristiques minimales afin de résister à l’environnement vasculaire. La norme standard ANSI 7198

(ANSI/AAMI/ISO 7198) décrit la méthodologie pour valider les prothèses vasculaires. Les paramètres évalués

comprennent les caractéristiques structurelles de la paroi (épaisseur, composition, porosité, perméabilité,

diamètre), les propriétés mécaniques (contrainte à la rupture, rétention de suture, compliance, rayon de

flexion) et la biocompatibilité. Cette norme a été établie pour les prothèses vasculaires synthétiques. Elle

néglige cependant l’aspect immunologique et d’intégration du greffon chez l’hôte, particulièrement importante

pour les tissus reconstruits par génie tissulaire et les prothèses biodégradables. Elle ne précise pas non plus

les caractéristiques minimales pour chacun des paramètres en évaluation. Konig et al. proposent certains

paramètres minimaux pour la validation de leurs prothèses. Ces propriétés incluent une résistance mécanique

de 2000 mm Hg et une rétention de suture de 50 gmf [Konig et al., 2009]. Comme il s’agit d’une approche

autologue, ces paramètres doivent être évalués pour chaque population de cellules [McAllister et al., 2009].

28

Figure 1.9 - Méthodes de reconstruction vasculaire par génie tissulaire

A) L’approche standard en génie tissulaire propose de combiner des cellules autologues avec des biomatériaux exogènes dans

l’optique de former un tissu reconstruit. Pour les substituts vasculaires, une étape de maturation dans un bioréacteur permet

d’améliorer les propriétés mécaniques des vaisseaux par l’imposition d’une contrainte mécanique et de tester la construction dans des

conditions partiellement physiologiques. (Adaptée de [Zhang et al., 2007]) B) L’approche d’auto-assemblage, développée au LOEX, ne

fait pas appel aux biomatériaux. C’est plutôt les cellules qui produisent la matrice extracellulaire nécessaire à l’assemblage de la

construction. Le feuillet ainsi formé est ensuite roulé autour d’un mandrin pour former une structure tubulaire. Des cellules

endothéliales peuvent être ensemencées à l’intérieur à l’aide d’un bioréacteur. (Adaptée de Science et Vie, No 973, 1998)

29

1.5.3.1. Méthodes de reconstruction par génie tissulaire

De nombreuses méthodes de fabrication de TEBV ont été mises au point au cours des 20-30 dernières

années [Nemeno-Guanzon et al., 2012]. La majorité de ces techniques peut être classée en quatre grandes

catégories selon le type d’échafaudage utilisé ou l’absence de celui-ci (Tableau 1.1) [Zhang et al., 2007, Seifu

et al., 2013].

I) Vaisseaux décellularisés : Un vaisseau sanguin prélevé chez un animal ou chez un humain post-mortem

est traité par différentes méthodes dans le but de tuer les cellules et d’éliminer les composantes antigéniques.

Ces processus combinent des méthodes pouvant inclure une agitation mécanique, des détergents et une

digestion enzymatique pour éliminer les protéines, lipides et nucléotides dérivés des cellules allogéniques ou

xénogéniques [Tamura et al., 2003, Uchimura et al., 2003]. Ces vaisseaux peuvent ensuite être recellularisés

in vitro avec des cellules autologues ou être greffés sans cellules. Dans les deux cas, la recellularisation de la

construction reste problématique, car les cellules pénètrent difficilement dans la MEC native plutôt dense.

Cette dernière confère certains avantages au niveau des propriétés mécaniques et de la biocompatibilité à ce

substitut [Schmidt et al., 2000]. Cependant, la décellularisation peut affecter la compliance et la force à la

rupture. Si le vaisseau est d’origine xénogénique, en plus du danger de rejet hyperaigu, les risques de

thrombose, d’anévrisme et d’infection sont augmentés [Teebken et al., 2002]. Les vaisseaux reconstruits par

génie tissulaire peuvent également être décellularisés pour permettre l’utilisation de cellules allogéniques sans

risque de rejet [Dahl et al., 2003].

Tableau 1.1 - Méthodes de reconstruction de vaisseaux par génie tissulaire

Type Avantages Inconvénients Pression d’éclatement Étude clinique? I) Vaisseaux

décellularisés Architecture 3D,

composition et propriétés mécaniques des vaisseaux natifs

Rejet immunitaire si décellularisation non adéquate

Calcification

1 500 mmHg [Quint et al., 2011]

Oui [Birchall et al., 2012, Olausson et al., 2012]

II) Polymères naturels biodégradables

Facilement disponible

Non-immunogénique

Transmission de maladies possible

Propriétés mécaniques inférieures

Collagène : 120 mmHg [L'Heureux et al., 1993] Fibrine : 1 500 mmHg [Yao et al., 2005, Peng et al., 2011] Élastine : 900-2000 mmHg [Smith et al., 2008]

Oui [Yao et al., 2005, Peng et al., 2011, Marelli et al., 2012]

III) Biopolymères synthétiques

Reproductible

Résistance mécanique élevée

Faible perméabilité dans les vaisseaux de petits calibres

Réponse inflammatoire

Incompatibilité de compliance

2 000 mmHg [Shin'oka et al., 2001]

Oui [Patterson et al., 2012]

IV) Feuillet tissulaire produit par auto-assemblage

Résistance mécanique élevée

Non immunogénique

Temps de fabrication

Variabilité des propriétés mécaniques en fonction de la population de cellules

2 000 mmHg [Black et al., 1998, L'Heureux et al., 2006]

Oui [McAllister et al., 2009]

(Adapté de [Seifu et al., 2013])

30

II) Échafaudage de polymères synthétiques biodégradables : Les cellules sont ensemencées dans une

matrice biodégradable permettant la croissance des cellules et le remodelage du tissu avant ou après

l’implantation. Le biomatériau fournit une architecture tridimensionnelle pouvant adopter la géométrie

souhaitée. L’avantage de cette méthode est que les paramètres de la microstructure, les propriétés

mécaniques et la vitesse de dégradation peuvent théoriquement être finement régulés. La composition du

polymère utilisé pour former la matrice ainsi que la taille des pores et les connexions entre eux modifient les

caractéristiques du substitut final. L’acide polyglycolique (PGA, de l’anglais polyglycolic acid) est le polymère

le plus largement utilisé pour ce type d’approche [Zund et al., 1998, Kim et al., 1999, Niklason et al., 1999]. Il

est parfois couplé à d’autres copolymères tels que l’acide poly-L-lactique [Kim et al., 1999, Telemeco et al.,

2005], le polyhydroxyalkanoate [Shum-Tim et al., 1999] ou le polycaprolactone [Iwasaki et al., 2008].

Niklason et al., du laboratoire de Dr Langer, ont proposé l’utilisation de ce type de biomatériau biodégradable

(PGA) pour la reconstruction d’un substitut vasculaire [Niklason et al., 1999]. Des CML porcines ensemencées

dans un échafaudage de PGA à l’aide d’un bioréacteur sont cultivées in vitro durant plusieurs semaines. La

construction résultante est contractile et possède une résistance mécanique de plus de

2000 mmHg. La présence de sérum et d’acide ascorbique dans le milieu permet aux CML de produire le

collagène qui remplace graduellement le PGA [Niklason et al., 1999, Niklason et al., 2001]. Plus récemment,

l’équipe de la Dre Niklason s’est tournée vers une approche allogénique, grâce à l’utilisation d’une technique

de décellularisation [Dahl et al., 2003]. Un échafaudage de PGA ensemencé de CML porcines [Quint et al.,

2011] ou humaines [Quint et al., 2012] est cultivé pour dix semaines en conditions dynamiques, toujours en

présence de sérum et d’acide ascorbique. Ce vaisseau est ensuite décellularisé pour être utilisé dès que le

besoin est présent, avec la même disponibilité que les prothèses synthétiques [Dahl et al., 2011a]. La

compagnie Humacyte® a lancé trois études cliniques (NCT01744418, NCT01840956 et NCT01872208) avec

ce modèle. Les deux premières pour l’accès à l’hémodialyse chez les patients en insuffisance rénale au stade

terminal et la troisième pour le remplacement de l’artère fémorale en haut du genou chez des patients

présentant une MVP.

L’utilisation des matériaux biodégradables pose certains problèmes lorsque ces biomatériaux ne sont pas

complètement dégradés in vitro. En effet, la dégradation du polymère par les cellules de l’hôte acidifie le milieu

environnant. De plus, au niveau vasculaire, cette dégradation entraîne une fragilisation du greffon, augmentant

les risques de rupture à moyen terme. Finalement, la distribution des cellules à travers la construction est

souvent problématique, car les cellules doivent migrer à l’intérieur des pores du biomatériau.

III) Échafaudage en biopolymère : Cette catégorie se distingue de la précédente par l’utilisation de

polymères naturels, c’est-à-dire retrouvés in vivo, comme le collagène et la fibrine. Cependant, le collagène

est généralement utilisé sous forme de gel plutôt que de fibre.

31

Tableau 1.2 - Contribution significative au génie tissulaire vasculaire

Cellule animale Cellule humaine

Approche Chercheur Principal In vitro

In vivo (modèle animal) In vitro

In vivo (modèle animal) Usage en clinique

CE ensemencées et cultivées sur un polymère synthétique

Zilla [Zilla et al., 1989] Après les essais cliniques

[Zilla et al., 1989] Après les essais cliniques

[Kadletz et al., 1987] Cellules adultes

Non [Zilla et al., 1987, Deutsch et al., 2009] (Pontage périphérique au niveau des membres inférieurs, adultes)

Gel de collagène Bell/ Matsuda/ Auger

Ajout d'un treillis de Dacron [Weinberg et al., 1986] Cellules bovines

Ajout d'un treillis de Dacron [Hirai et al., 1994] Veine cave, cellules bovines chez le lapin [Matsuda et al., 1995] 26 sem., carotide chien

[L'Heureux et al., 1993] Cellules de nouveau-né

Non Non

Échafaudage de biomatériaux résorbables (basse pression)

Shin'oka [Shin'oka et al., 1998] 24 sem., artère pulmonaire de mouton

Non [Mirensky et al., 2009] Après les essais cliniques

[Shin'oka et al., 2001] [Hibino et al., 2010] Artère pulmonaire (pédiatrique)

Feuillet tissulaire produit par auto-assemblage

Auger/ L'Heureux

Non Non [L'Heureux et al., 1998] Cellules adultes

[L'Heureux et al., 2006] 7,5 mois, aorte de souris, 8 sem., aorte de primate

[L'Heureux et al., 2007, McAllister et al., 2009] Accès à l'hémodialyse (Adultes)

Échafaudage de biomatériaux résorbables (haute pression)

Niklason [Niklason et al., 1999] 24 jours, artère saphène, cellules bovines et de primate, chez le primate

[McKee et al., 2003] Cell. de nouveau-né [Poh et al., 2005] Cell. adultes

[Dahl et al., 2011b] Décellularisé, 6 mois, court-circuit artério-veineux, primate

Étude clinique en cours

Vorp [Nieponice et al., 2008] Cellules murines

[Nieponice et al., 2010] 8 sem., cellules murine chez la souris

[He et al., 2010] 8 sem., cellules adultes, aorte de souris,

Non

Bioréacteur in vivo Campbell Non [Campbell et al., 1999] 4 mois, aorte murine 4 mois, carotide lapin

Non Non Non

Gel de fibrine + cellules (haute pression)

Tranquillo [Grassl et al., 2003] Cellules de rat chez le rat (en cours)

[Syedain et al., 2011] Cellules de nouveau-né

Chez le rat nu, (en cours)

Non

Gel de fibrine +cellules (basse pression)

Andreadis [Swartz et al., 2005] 15 sem., veine cave, mouton

Non Non Non

Fibrine et biomatériaux Jokenhoevel [Tschoeke et al., 2009] Cellules de mouton

[Koch et al., 2010] 6 mois, carotide, mouton

Non Non Non

(Adapté de [Peck et al., 2012])

32

Weinberg et Bell ont été les premiers à développer un vaisseau reconstruit par génie tissulaire

[Weinberg et al., 1986]. Le modèle optimal proposé à l’époque comporte trois couches de gel de collagène

contenant des CML ou des fibroblastes, séparées par deux treillis de Dacron. Le temps de maturation optimal

in vitro était de 1 mois. Ce modèle présentait une pression d’éclatement de 323 ± 31 mmHg. Cette résistance

est principalement due au support de Dacron car, sans celui-ci, le vaisseau reconstruit éclate à moins de

10 mmHg. Bien que légèrement supraphysiologique, cette faible résistance mécanique ne permet

vraisemblablement pas de supporter l’implantation au niveau artériel. La pression d’éclatement du modèle est

optimale à un mois in vitro, mais diminue graduellement par la suite, potentiellement dû à la production de

collagénase par les cellules. Des CE ensemencées à l’intérieur du lumen forment un endothélium confluent.

Cet endothélium produit du facteur Von Willebrand ainsi que de la prostacycline et il est imperméable aux

grosses molécules comme l’albumine.

L’Heureux et al. proposent par la suite l’utilisation d’un mandrin central autour duquel le gel de collagène

contenant des CML est polymérisé. Ce mandrin crée une contrainte mécanique qui entraîne l’alignement

circonférentiel des cellules. Une deuxième couche de gel contenant des fibroblastes dermiques est ensuite

ajoutée autour de la première. Ainsi, la résistance mécanique du gel de collagène (sans ajout de matériaux

synthétiques) passe de 10 mmHg pour Dr Weinberg à 120 mmHg pour Dr Auger [L'Heureux et al., 1993].

D’autres équipes ont proposé diverses modifications pour améliorer la résistance mécanique de ce type de

construction dont la stimulation mécanique [Seliktar et al., 2003] et le pontage aux ultraviolets [Rajan et al.,

2008].

La fibrine est également utilisée comme protéine d’échafaudage [Ye et al., 2000, Grassl et al., 2003]. Les

premiers modèles étaient cependant trop fragiles pour supporter la manipulation par les chirurgiens

[Jockenhoevel et al., 2001]. L’utilisation d’un mandrin central et la culture in vitro pour plusieurs semaines

permettent d’améliorer la résistance du modèle. Après ensemencement de CE, la construction a été greffée

chez l’animal sur la veine jugulaire. Ce vaisseau est resté fonctionnel pour 15 semaines [Swartz et al., 2005].

La culture en condition dynamique, dans un bioréacteur créant une dilatation circonférentielle cyclique des

vaisseaux, a également amélioré la résistance de ce type de construction [Syedain et al., 2011]. Récemment,

l’effet de l’ajout d’insuline et de la culture en condition hypoxique sur l’assemblage du collagène et sur les

propriétés mécaniques a été analysé. La combinaison de l’ajout de 2 µg/ml d’insuline et de 2% d’oxygène

permet d’augmenter la force à la rupture de 100 à 550 kPa et la densité du collagène de 5 à 35 mg/ml

[Bjork et al., 2012].

Dans les constructions cylindriques en biopolymère, il est possible d’aligner les cellules circonférentiellement

en appliquant une compression longitudinale sur le gel [Girton et al., 2002] ou une contrainte circonférentielle

[L'Heureux et al., 1993], ou encore, en utilisant un champ électromagnétique [Barocas et al., 1998] ou une

33

stimulation mécanique [Seliktar et al., 2000]. De plus, les cellules sont distribuées uniformément à l’intérieur de

la construction, car elles sont présentes avant la polymérisation. Comme ces molécules sont naturelles, les

cellules sont en mesure de s’étaler et de se lier facilement aux composantes de la matrice. Par contre, la faible

résistance de ces modèles limite leur utilisation en clinique.

IV) Feuillets tissulaires ou auto-assemblage : Cette approche permet la production d’un vaisseau

complètement biologique, où la MEC est produite et organisée par les cellules [L'Heureux et al., 1998]. Le

vaisseau reconstruit avec cette technique possède des propriétés mécaniques (résistance circonférentielle et

compliance) et contractiles (contraction et relaxation) impressionnantes. Le vaisseau reconstruit par auto-

assemblage a été utilisé comme modèle d’étude pharmacologique et physiologique [L'Heureux et al., 2001,

Diebolt et al., 2005, Laflamme et al., 2006a, Laflamme et al., 2006b, Diebolt et al., 2007]. Ce type de vaisseau

est actuellement en étude clinique [McAllister et al., 2009].

1.5.3.2. L’auto-assemblage

L’approche d’auto-assemblage, aussi appelée ingénierie de feuillet cellulaire ou tissulaire, tire avantage de la

capacité intrinsèque des cellules mésenchymateuses à sécréter, assembler et organiser une MEC en

présence du milieu de culture approprié contenant du sérum et de l’acide ascorbique (vitamine C). Cette

vitamine essentielle est un cofacteur des enzymes proline et lysine hydroxylase [Cardinale et al., 1974].

L’hydroxylation de ces acides aminés pour former les hydroxyprolines et hydroxylysines, retrouvées

uniquement dans le collagène, est essentielle à la fibrillogenèse [Pinnell, 1985]. Lorsque les fibroblastes sont

cultivés en présence d’acide ascorbique pour quelques semaines, le collagène produit est déposé par les

cellules et les unit entre elles, formant un feuillet tissulaire. Ce feuillet devient résistant et peut être empilé pour

former des tissus plans comme le stroma cornéen [Carrier et al., 2009] (Fig. 1.10 A), la portion dermique de la

peau [Michel et al., 1999] (Fig. 1.10 A), le tissu adipeux [Vermette et al., 2007] (Fig. 1.10 B) ou être roulé

autour d’un mandrin pour former une structure tubulaire pouvant devenir un substitut vasculaire [L'Heureux et

al., 1998] (Fig. 1.10 C) ou urétral [Ouellet et al., 2011].

Cette technique est également utilisée dans le laboratoire du Dr Okano au Japon. Son laboratoire a mis au

point une surface de culture recouverte d’un polymère thermosensible, le poly (N-iso-propylacrylamide)

(PIPAAm) [Okano et al., 1995] permettant de faire décoller le feuillet cellulaire spontanément lorsque la

température diminue [Kwon et al., 2000, Okano, 2006]. Ainsi, il devient possible de fabriquer des feuillets à

partir de nombreux types cellulaires. Ils ont exploité le potentiel des CML [Hobo et al., 2008], des

cardiomyocytes [Shimizu et al., 2003, Masuda et al., 2008], des cellules épithéliales cornéenne

[Yang et al., 2006], du tissu parodontal [Flores et al., 2008] ainsi que des cellules de la glande thyroïde

[Arauchi et al., 2009].

34

Figure 1.10 - Exemples de tissus reconstruits par la technique d’auto-assemblage

A) La production de stroma cornéen reconstruit à partir des cellules fibroblastiques et épithéliales de la cornée est comparée avec un

substitut reconstruit à partir de fibroblastes dermiques et de kératinocytes. Le substitut de cornée antérieur est plus transparent que la

peau reconstruite. La coloration trichrome de Masson permet de voir que les cellules épithéliales de cornée et de peau ensemencées

sur ces tissus conjonctifs récapitulent les différentes couches de différenciation épithéliale propre à leur tissu d’origine. La jonction

dermo-épidermique permet de maintenir la couche de cellules basales et de récapituler la niche des cellules souches épithéliales, ce

qui assure le renouvellement de l’épithélium post-greffe. (Adaptée de [Carrier et al., 2009]) B) Les cellules souches

mésenchymateuses isolées du tissu adipeux peuvent être utilisées pour reconstruire des tissus conjonctifs. Elles peuvent ensuite être

différenciées en tissu adipeux par l’utilisation du cocktail approprié. La coupe histologique colorée au trichrome de Masson montre les

vacuoles des adipocytes dans le tissu adipeux reconstruit. (Adaptée de [Vermette et al., 2007]) C) Les différentes tuniques d’une artère

peuvent être reproduites avec cette technique. Sur la coloration trichrome de Masson, on remarque que la media (M) reconstruite à

partir des CML, donne un tissu beaucoup moins dense en matrice extracellulaire que l’adventice (A) reconstruite à partir des

fibroblastes dermiques. (Adaptée de [L'Heureux et al., 1998])

35

L’auto-assemblage est utilisé par la compagnie Cytograft® pour produire des vaisseaux autologues destinés à

permettre l’accès à l’hémodialyse pour les patients en insuffisance rénale au stade terminal [L'Heureux et al.,

1998, L'Heureux et al., 2006]. Cette compagnie termine actuellement le premier essai clinique avec cette

prothèse (Lifeline®) [McAllister et al., 2009] (numéro sur ClinicalTrial.gov NCT00850252). Il est intéressant de

noter que le substitut à l’étude ne contient pas de media, ce qui limite la capacité vasoréactive de ces

prothèses.

Cette technique présente plusieurs avantages sur les autres techniques de reconstruction par génie tissulaire.

D’abord, la matrice qui est produite par les cellules est très similaire à celle du tissu normal. Cette matrice

pourra donc vraisemblablement être intégrée à l’hôte plutôt que dégradée, remplacée ou calcifiée. La MEC

produite par les fibroblastes présente une composition [Lake et al., 2013], des propriétés mécaniques

(résistance, compliance) [Gauvin et al., 2011a] et l’expression de certains récepteurs [Laflamme et al., 2006b]

comparable à leur tissu d’origine. Dans ce modèle, les cellules sont distribuées uniformément à travers la

construction. Finalement, cette technique peut également servir à assembler des tissus non conjonctifs,

comme le muscle lisse vasculaire, pour former une media reconstruite vasoréactive [L'Heureux et al., 2001].

Toutefois, l’auto-assemblage n’est pas dénué d’inconvénients ou de limitations. Le temps de production des

feuillets tissulaires est généralement supérieur à celui des approches utilisant des échafaudages de

biomatériaux. Comme il n’y a pas de matériaux de remplissage, le feuillet est plutôt mince, ce qui peut être un

problème pour certaines applications. Cet inconvénient peut être contourné en empilant plusieurs feuillets,

mais les coûts de production augmentent proportionnellement au nombre de feuillets empilés. Pour

reconstruire la media, l’utilisation des CML présente plusieurs limitations inhérentes à leur faible niveau de

sécrétion de collagène [Thie et al., 1991, Redecker-Beuke et al., 1993]. Le feuillet produit avec ce type

cellulaire possède une faible résistance mécanique, est difficile à manipuler et a tendance à se contracter

spontanément avant d’être manipulable. De plus, certaines populations de CML sont réfractaires à la

formation de feuillet, ce qui rend la technique actuelle avec ce type cellulaire difficilement applicable

cliniquement pour tous les patients. En effet, il sera difficile de prédire le comportement des cellules

autologues utilisées.

1.5.3.3. Importance des CML dans les vaisseaux reconstruits

L’ajout d’une media dans un vaisseau reconstruit destiné à la greffe est préférable pour plusieurs raisons.

D’abord, les CML partiellement contractées absorbent les variations de pression sans endommager ou

fatiguer le tissu conjonctif. Cette caractéristique est très importante pour une perméabilité à long terme du

greffon. Cette vasoréactivité peut également intervenir pour dilater la lumière du vaisseau si un caillot vient

obstruer partiellement la lumière; cette capacité se nomme la dilatation au flux. La plasticité phénotypique des

CML et leur capacité contractile leur permettent de réparer les blessures éventuelles à la paroi du vaisseau

36

plus rapidement et plus efficacement que les fibroblastes [Wang et al., 2010a]. Finalement, à long terme,

plusieurs complications liées à l’utilisation de la veine saphène comme substitut artériel sont potentiellement

causées par la faible abondance de la media [Sabik et al., 2005].

Dans la mise au point d’un modèle pharmacologique vasculaire in vitro, il est essentiel de recréer la media, car

cette tunique est le siège de la principale pathologie vasculaire : l’athérosclérose. De plus, l’étude de

l’architecture et de la fonctionnalité de la media est possible dans un modèle reconstruit par génie tissulaire.

Cette architecture est particulièrement importante in vivo, car elle participe à potentialiser les dépenses

énergétiques pour le bon fonctionnement et le maintien de l’intégrité du système vasculaire.

1.5.3.4. La media reconstruite comme modèle pharmacologique

Les méthodes actuelles de développement de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement de

l’athérosclérose utilisent principalement des segments de vaisseaux placés en bains d’organes isolés et leur

capacité contractile est ainsi évaluée dans différentes conditions. Les vaisseaux qui sont utilisés proviennent

soit de la veine de cordon ombilical ou sont prélevés chez l’animal [Marceau et al., 2010]. L’emploi d’animaux

transgéniques rend versatile l’utilisation de ce type de vaisseau. Bien qu’efficaces, ces méthodes sont

coûteuses et la variabilité interindividuelle chez l’humain peut amener des biais. Comme la media est le siège

du développement de l’athérosclérose, la reconstruction de cette tunique à partir de cellules humaines pourrait

servir de modèle pharmacologique pour le développement de nouveaux traitements. Le vaisseau reconstruit

est évidemment une simplification des vaisseaux natifs. Il est possible de tirer profit de cette caractéristique en

ajoutant progressivement différents types cellulaires à la media reconstruite à partir des CML humaines, soit

les CE, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Les possibilités qu’offre un tel outil sont remarquables.

1.5.3.5. Mesure des propriétés mécaniques des vaisseaux reconstruits

Les propriétés mécaniques des vaisseaux sanguins sont souvent comparées à celles des matériaux

déformables. Le processus de déformation des matériaux viscoélastiques comporte deux phases. Au cours de

la phase élastique, le matériau peut être déformé dans une certaine plage de tension, mais reprendra sa

position initiale après chaque cycle. Lorsque la tension excède cette plage, la déformation subite par le

matériau n’est pas réversible, c’est la zone de déformation plastique. Il est probable que des cycles répétés de

déformation plastique amplifient la déformation et résultent en un bris dû à la fatigue.

Ces paramètres sont très utiles dans la modélisation des propriétés mécaniques des reconstructions par génie

tissulaire. Par contre, la media artérielle n’agit pas comme un matériau qui subit l’augmentation de tension,

mais plutôt comme une entité qui répond à cette variation. C’est ainsi que les artères sont en mesure de faire

leur travail dans différentes plages de tension, au repos et à l’effort, sans entraîner de déformation plastique à

la paroi du vaisseau. Les CML sont appuyées dans leur travail par la présence des fibres d’élastine ainsi que

37

par la résistance de l’adventice. Cette résistance, en condition non pathologique, est bien supérieure aux

pressions qui peuvent être retrouvées dans la circulation sanguine. Cette tunique entre donc en jeu lorsque la

pression excède la capacité que les CML peuvent supporter.

Il est important d’évaluer les propriétés mécaniques des substituts vasculaires in vitro, car ceux-ci seront

soumis à d’importantes contraintes mécaniques dès leur implantation. Ces substituts doivent donc à la fois

présenter une résistance mécanique comparable ou supérieure à celle des vaisseaux natifs et une compliance

suffisamment importante pour éviter les complications liées au mésappariement des propriétés du greffon

avec le vaisseau hôte. Parmi les propriétés mécaniques évaluées, la résistance à la rupture (UTS de l’anglais

ultimate tensile strength) et la déformation à la rupture représentent respectivement la contrainte nécessaire

pour briser le vaisseau et sa déformation lorsque la rupture survient. Le module d’élasticité est quant à lui la

valeur de la pente de la courbe de la contrainte en fonction de la déformation, alors que la compliance

correspond à l’inverse du module d’élasticité et est généralement évaluée dans la plage des pressions

physiologiques. Toutes ces propriétés peuvent être mesurées grâce à un test de tension sur une section de

vaisseau de quelques millimètres (anneau). Elles peuvent également être évaluées en pressurisant un

segment plus long du vaisseau avec une solution physiologique jusqu’à sa rupture, en mesurant la pression

interne et la variation de diamètre du spécimen. Ces tests permettent donc de caractériser le comportement

mécanique des substituts. Il est important d’évaluer les propriétés mécaniques d’un substitut avant

l’implantation de même qu’à moyen et long terme.

1.5.3.6. Tests pré-cliniques

Le développement d’un substitut vasculaire destiné au traitement des patients passe obligatoirement par des

essais chez des modèles animaux. Le choix du bon modèle animal est important pour faire la validation du

substitut [Rashid et al., 2004]. Le plus petit animal sur lequel il est raisonnable de faire des greffes vasculaires

est le rat, au niveau de l’aorte infra rénale (~2 mm). La souche athymique permet l’implantation de cellules

humaines sans réaction immunitaire. Par contre, ces rats sont particulièrement sensibles à l’anesthésie. Leur

petite taille rend les chirurgies laborieuses et demande une expertise en microchirurgie [L'Heureux et al.,

2006, Nieponice et al., 2010, Assmann et al., 2012]. Le lapin est un modèle un peu plus gros et peut être

opéré au niveau de la carotide (3 mm) [Tsukagoshi et al., 1999, Sparks et al., 2002]. Dans les animaux de

grande taille, on retrouve le chien [L'Heureux et al., 1998, Watanabe et al., 2001], le porc [Robotin-Johnson et

al., 1998, Panetta et al., 2002], la chèvre [Shum-Tim et al., 1999] et le mouton [Dohmen et al., 2001, Elkins et

al., 2001]. Le chien est le modèle de grande taille le plus populaire. Sa taille moyenne, son accessibilité, son

caractère docile et sa croissance lente par rapport à d’autres modèles en font un choix à privilégier.

Finalement, le modèle le plus proche de l’humain reste les primates non-humains [Clowes et al., 1986, Zilla et

al., 1994b]. En plus des coûts élevés, l’utilisation des primates soulève des préoccupations éthiques

38

importantes [Wolfensohn et al., 2013]. Ainsi, ce type d’animal doit être réservé à la phase finale des études

précliniques [Swartz et al., 2013].

Le choix du modèle à privilégier est donc difficile à faire, mais il reste encore un point à considérer : la greffe

xénogénique (tissu humain chez le modèle) ou autologue/syngénique. La greffe xénogénique entraîne un rejet

à court terme si l’animal est immunocompétent et une calcification à plus long terme si l’animal est

immunovulnérable. La greffe autologue implique la culture des cellules animales et donc une nouvelle

optimisation des méthodes d’isolement, des milieux de culture utilisés et des périodes de maturation des

tissus reconstruits. De plus, il n’y a pas de preuves que les résultats obtenus seront les mêmes qu’avec la

construction d’origine humaine. L’approche à privilégier serait donc l’utilisation de petits animaux athymiques

pour la greffe de tissus humains à court, puis à long terme. Par la suite, l’utilisation de plus gros animaux avec

des tissus autologues (long terme) ou des tissus humains (court terme) est à préconiser.

Finalement, les essais chez les animaux modèles présentent plusieurs lacunes au point de vue du design

expérimental qui les rendent peu prédictifs de la réalité de la greffe chez l’humain. En effet, les segments

greffés sont trop courts, les anastomoses sont faites en termino-terminale plutôt qu’en terminolatérale, le

diamètre du greffon est plus petit qu’en clinique et la réendothélialisation des prothèses se fait généralement

bien chez les animaux, mais ne se produit pas chez l’humain [Zilla et al., 2007]. Malgré ces inconvénients, il

reste essentiel d’évaluer in vivo la sécurité de la prothèse et l’évolution de sa résistance mécanique à travers

le temps avant de la greffer chez l’humain.

En conclusion, les propriétés mécaniques des vaisseaux reconstruits à l’aide d’échafaudage peuvent aisément

être modifiées par des changements au niveau du polymère utilisé. Avec la technique d’auto-assemblage, le

vaisseau produit est résistant, mais comme la matrice est produite par les cellules, il est difficile d’améliorer la

résistance mécanique des vaisseaux produits avec une population cellulaire donnée. Certaines approches,

telles que l’ajout de molécules pouvant augmenter l’assemblage des fibres d’élastines, sont actuellement à

l’étude. Une autre façon de le faire consiste à introduire un alignement préférentiel des cellules et de la matrice

dans la direction où la force sera appliquée [Guillemette et al., 2009].

1.6. Alignement des Cellules et de la Matrice

1.6.1. Biologie de l’alignement des cellules

Les cellules des organismes multicellulaires possèdent la capacité de s’adapter selon la position qu’elles

occupent dans leur environnement. Cette faculté se traduit par la présence de nombreuses cellules polarisées;

par exemple, les cellules épithéliales formant les glandes possèdent un pôle apical et un pôle basal leur

permettant une sécrétion unidirectionnelle dans le conduit présent à cet effet. Pour d’autres types de cellules,

39

cette réponse à l’environnement se traduit par une élongation dans un certain axe afin de maximiser la

résistance ou la capacité contractile du tissu, optimisant ainsi l’utilisation des ressources énergétiques.

De tels alignements cellulaires caractérisent certains tissus. Les os, les tendons, les muscles lisses et

squelettiques ainsi que la cornée sont quelques exemples de tissus où les cellules et/ou les protéines de la

matrice extracellulaire sont alignées. Cet alignement procure un avantage certain au niveau de leur capacité à

répondre à des fonctions précises.

Le tissu ainsi organisé est dit anisotropique, c’est-à-dire que ses propriétés sont différentes en fonction de

l’axe dans lequel la mesure est effectuée. C’est de cette façon qu’un muscle squelettique peut se contracter

en longueur et générer une force substantielle dans une direction. L’alignement de la matrice extracellulaire

qui compose les tendons leur permet de résister à la tension générée par le muscle et de la transférer aux os.

L’alignement et l’organisation des fibres de la matrice trouvent une application différente au niveau du stroma

cornéen. La transparence de ce tissu est assurée par un espacement constant des fibrilles de collagène qui

laisse passer les longueurs d’onde visibles [Maurice, 1957]. La perte de cet espacement entraîne des troubles

de la vision [Kao et al., 2002]. Dans ce tissu, les fibrilles de collagène d’une lamelle sont parallèles entre elles

et avec la surface de la cornée. Ces structures d’environ deux microns d’épaisseur et 200 µm de large

peuvent traverser toute la cornée et se perdre dans la sclère. Les lamelles sont tissées entre elles et se

croisent de manière orthogonale dans le but d’offrir une résistance maximale. La structure est ensuite étagée

avec une rotation d’environ un à deux degrés par étage [Meek et al., 2009]. Lorsque des tissus reconstruits à

partir des fibroblastes cornéens (kératocytes) sont produits, on obtient un tissu transparent alors que les

feuillets de fibroblastes dermiques quant à eux, sont translucides, mais blanchâtres (Fig. 1.10) [Carrier et al.,

2009]. L’alignement des feuillets tissulaires de kératocytes rend le tissu encore plus transparent [Guillemette et

al., 2009].

1.6.2. Mécanismes d’alignement in vivo

Lors de l’embryogenèse, les cellules des différents feuillets primordiaux migrent selon un patron prédéfini pour

former les différents tissus de l’embryon. Ces cellules adoptent ainsi un comportement appelé mouvement

cellulaire collectif en extension convergente. Ce type de comportement se retrouve notamment au niveau du

mésoderme.

Un groupe de protéines est connu pour son rôle dans les phénomènes de migration directionnelle lors de la

formation de l’embryon. Celles-ci sont appelées protéines de cellules planaires (PCP de l’anglais planar cell

proteins) [Bayly et al., 2011]. Ce groupe renferme plusieurs protéines qui sont conservées à travers l’évolution

des vertébrés. On retrouve, entre autres, Frizzled, Dishevelled, Rho/Rac, Rho kinase, Fuzzy, Diego et Scribble

[Wallingford, 2012].

40

Les cellules possèdent donc des mécanismes qui déterminent leurs mouvements dans l’embryon dans le but

de créer une organisation complexe. Ces mécanismes régissent également le mouvement et la forme des

cellules dans l’organisme adulte. Les cellules sont en mesure de s’ancrer dans un environnement

tridimensionnel grâce à des récepteurs transmembranaires spécifiques pour la matrice extracellulaire, les

intégrines.

Le rôle des cellules fibroblastiques est d’entretenir la MEC de leur tissu. Pour ce faire, elles doivent parcourir,

à l’échelle de la cellule, un immense réseau de fibrilles de collagène. Elles utilisent les fibrilles existantes et se

déplacent préférentiellement le long de celles-ci. Ainsi, lorsque ces fibrilles sont parallèles entre elles, les

cellules se déplacent préférentiellement dans cette direction. Les intégrines permettent aux cellules d’ancrer

leur cytosquelette d’actine aux fibres de la MEC. Les cellules deviennent donc allongées dans le sens de

l’extension des fibres. La signalisation par les intégrines est connue pour son action bidirectionnelle. En effet,

les intégrines renseignent la cellule sur l’organisation de son environnement, mais elles lui permettent

également de modeler la MEC [Hynes, 2002, Delon et al., 2007]. Ainsi, dans un tissu reconstruit par auto-

assemblage, la matrice est déposée par les cellules et les fibrilles de collagènes se forment dans la direction

de l’axe le plus long des cellules. In vivo, c’est la matrice et les cellules préexistantes qui dictent l’orientation

des nouvelles cellules après une division.

En résumé, au cours de l’embryogenèse, les cellules migrent et s’alignent suivant plusieurs facteurs incluant

les PCP, les forces mécaniques et possiblement d’autres stimuli encore non identifiés. Les schémas de

migration sont hautement régulés pour donner une configuration adéquate aux tissus et aux organes. Après la

naissance, la matrice préexistante dirige l’alignement des cellules et celles-ci maintiennent l’anisotropie de la

MEC. Les forces mécaniques peuvent contribuer à conserver l’alignement ou encore à modifier l’alignement

existant pour répondre à un nouveau besoin.

Le génie tissulaire est une discipline qui s’efforce de créer des tissus et des organes les plus fonctionnels

possibles. Pour ce faire, l’approche logique est de s’inspirer des structures physiologiques présentes in vivo.

Étant donné les avantages liés à l’organisation anisotropique des tissus, il est intéressant de recréer ces

alignements in vitro pour obtenir des tissus plus résistants, plus contractiles ou plus transparents.

1.6.3. Méthodes d’alignement des cellules et de la matrice

Plusieurs méthodes ont été développées au cours des dernières années pour reproduire l’alignement

physiologique des cellules et de la matrice (Fig. 1.11). La majorité de celles-ci repose sur le guidage

topographique, c’est-à-dire la capacité des cellules à migrer et à s’allonger dans la direction de la MEC ou, de

manière générale, en fonction de la topographie de la surface. Pour reproduire cet alignement, l’échafaudage

peut être produit de manière dirigée : par électrofilage (electrospinning) [Zhong et al., 2006, Murugan et al.,

41

2007, Kumar et al., 2012], par polymérisation d’un gel de collagène en présence d’une contrainte

unidirectionnelle [Grinnell et al., 1984, Lopez Valle et al., 1992, L'Heureux et al., 1993, Thomopoulos et al.,

2005, Bowles et al., 2010] ou sous l’influence d’un champ électromagnétique [Tranquillo et al., 1996, Kotani et

al., 2002, Tsai et al., 2007, Builles et al., 2010].

Figure 1.11 - Méthodes d’alignement des cellules et de la matrice dans les vaisseaux reconstruits

A) L’électrofilage (electrospining) : La solution de polymère est chargée positivement et le mandrin rotatif est chargé négativement. La

solution est poussée à travers l’embout à une vitesse constante. Le solvant s’évapore durant la course du jet et résulte en la formation

d’une fibre. Les vitesses de rotation circulaire et de déplacement latéral du mandrin déterminent le degré d’alignement de

l’échafaudage. (Adaptée de [Bourget et al., 2013]) B) La stimulation mécanique du substitut permet de réorganiser la matrice

circonférentiellement. La déformation peut-être statique ou dynamique et être appliquée sur le vaisseau reconstruit dans un

bioréacteur. Pour l’auto-assemblage, il est possible de stimuler le feuillet avant de le rouler [Grenier et al., 2005] de manière statique

ou dynamique. (Adaptée de [Grenier et al., 2005, Gauvin et al., 2011b, Bourget et al., 2013]) C) Lorsqu’ils sont soumis à une contrainte

unidirectionnelle, les gels de collagène contenant des cellules se réorganisent de manière anisotropique. Appliquée aux vaisseaux, la

présence d’un mandrin central autour duquel le gel est polymérisé entraîne une réorganisation circonférentielle de la matrice

[L'Heureux et al., 1993]. (Adaptée de [Costa et al., 2003])

42

Le guidage topographique peut être appliqué à la technique d’auto-assemblage en cultivant les cellules sur

une surface microstructurée [Guillemette et al., 2011]. En présence d’acide ascorbique, les cellules

assemblent les fibrilles de collagène parallèlement à l’axe de leur élongation produisant un tissu aux propriétés

anisotropiques [Guillemette et al., 2009]. La contrainte mécanique unidirectionnelle peut également être

appliquée à l’auto-assemblage [Grenier et al., 2005, Gauvin et al., 2011b]. Dans ce cas, l’alignement du tissu

reconstruit passe par un assemblage aléatoire de la MEC avant sa réorganisation.

Comme expliqué précédemment, le guidage topographique est le processus par lequel les cellules répondent

à la disposition particulière de leur environnement en modifiant leur forme et leur vecteur de migration

[Harrison, 1914, Weiss, 1934, Weiss, 1945, Curtis et al., 1990, Nelson et al., 2006]. In vivo, l'environnement de

la cellule est composé principalement de molécules de collagène et des protéoglycanes constituant la MEC. In

vitro, les chercheurs tentent d'imiter les signaux donnés par les protéines afin d'influencer l’organisation des

cellules. Ces signaux peuvent provenir de différentes structures ressemblant ou non aux molécules de

collagène et produites par les méthodes citées plus haut. Dans le guidage topographique sur une surface de

culture microstructurée, c'est la structure même de la plaque de culture qui dicte l'organisation des cellules.

Pour ce faire, des créneaux et sillons de différentes dimensions et formes sont créés sur la surface de culture

par diverses méthodes.

1.6.4. Microfabrication d’une surface de culture microstructurée

Des approches très intéressantes et polyvalentes, dérivées des procédés de microfabrication destinés à

l’industrie microélectronique, ont été développées pour créer des motifs variés dans des matériaux

compatibles avec la culture cellulaire [Clark et al., 1987, Kumar et al., 1993]. Des structures de quelques

nanomètres jusqu’à plusieurs dizaines de micromètres peuvent ainsi être créées de manière à simuler les

composantes de la MEC ou à enfermer les cellules dans des canaux préétablis. Ces techniques utilisent la

réticulation de polymère, le micro-usinage ou l’embossage à chaud et peuvent être adaptées à différents

polymères pour des applications variées.

Le procédé décrit à la figure 1.12 est un des plus communs et utilise la photolithographie et l’embossage à

chaud. Brièvement, un motif en chrome imprimé sur une plaque de quartz forme le masque de

photolithographie. Une fine couche de résine photopolymérisante est appliquée sur une plaque de silicium et

celle-ci est exposée à la lumière UV sous le masque. La plaque est ensuite développée dans un solvant

organique pour dissoudre la résine non exposée, donc non réticulée, pour ainsi révéler le motif et obtenir le

premier moule (maître). Ce moule sert de gabarit pour la fabrication d’un deuxième moule fait de

polydiméthylsiloxane (PDMS). Le PDMS peut être directement utilisé pour la culture cellulaire, mais dans notre

cas, il servira d’intermédiaire pour la fabrication d’un moule rigide et résistant fait de résine époxy. Ce moule

servira à l’embossage à chaud du thermoplastique qui sera utilisé pour la culture des cellules (Fig. 1.12). De

43

nombreux matériaux peuvent être utilisés comme substrat de culture. Le polystyrène est un matériel

intéressant en raison de sa grande biocompatibilité. Il est régulièrement utilisé en culture cellulaire

[Walboomers et al., 2000]; il est par contre très rigide. L’utilisation d’un élastomère thermoplastique (TPE de

l’anglais thermoplastic elastomer) flexible, le styrène(ethylène-butyrène)styrène (SEBS), permet l’embossage

à l’aide d’un moule en époxy, qui est plus résistant et durable qu’un moule en PDMS. Ce TPE est également

compatible avec la culture cellulaire [Guillemette et al., 2011].

Figure 1.12 - Fabrication d’une surface de culture microstructurée

A) Une mince couche de résine SU8 est déposée sur une plaque de silicium, puis exposée à la lumière UV sous le masque de

chrome. B) Suite à cette étape de photolithographie, la dissolution de la résine non réticulée permet de révéler le motif qui peut ensuite

être répliqué dans un moule de PDMS (C), puis dans un moule en résine époxyde (époxy) (D). E) L’élastomère thermoplastique

(SEBS) est ensuite embossé à chaud avec le moule en époxy. F) L’étape finale consiste à traiter la surface au plasma d’oxygène pour

permettre l’attachement des cellules. G) Suite à sa stérilisation, les cellules sont ensemencées à la surface et s’allongent dans la

direction des motifs. (© Lavoie, Bourget, 2014)

Abréviations de l’anglais : UV, ultraviolet; PDMS, polydimethylsiloxane; SEBS, Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer

44

Figure 1.13 - Cellules sur une surface de culture microstructurée

A) Image d’une section de plaque de culture microstructurée en microscopie à force atomique. B) CML sur une surface de culture

microstructurée aux créneaux et aux sillons de 1 µm représentées en (A). Après 24 heures, les cellules sont allongées dans la

direction des motifs embossés. C-D) Fibroblastes dermiques humains (GFP+) cultivés sur le même type de surface microstructurée (C)

ou sur plastique (D) après 1 jour. (Adaptée de [Bourget et al., 2013])

1.6.5. Alignement et auto-assemblage

Les travaux de Guillemette et al. démontrent que le SEBS permet l’attachement et la croissance de plusieurs

types cellulaires [Guillemette et al., 2009]. Un patron de créneaux et sillons de 2 µm de périodicité et de

500 nm de profondeur permet l’alignement des CML, des fibroblastes dermiques (Fig. 1.13) et des fibroblastes

du stroma cornéen (les kératocytes) [Guillemette et al., 2011]. Les propriétés physiologiques des tissus

produits avec des feuillets alignés sont améliorées. De plus, ces travaux mettent en évidence la capacité des

cellules des couches suprabasales à adopter un angle préférentiel par rapport à la première couche. Cet angle

varie selon le type cellulaire utilisé. Cependant, le mécanisme de régulation cellulaire de ce phénomène reste

toujours indéterminé.

Isenberg et al. utilisent également une combinaison de photolithographie et d’embossage à chaud [Sarkar et

al., 2005] pour produire un motif dans un polystyrène recouvert de polymère thermosensible (PIPAAm). À

température ambiante, la couche de cellules se détache spontanément du substrat de culture et forme un

45

feuillet cellulaire manipulable. La culture des CML de l’aorte humaine sur ce motif de créneaux et de sillons de

50 µm de large et de cinq microns de profondeur induit l’allongement et la migration des cellules dans le sens

des motifs [Isenberg et al., 2008]. Ces feuillets cellulaires présentent des propriétés mécaniques

anisotropiques [Isenberg et al., 2012].

En conclusion, l’alignement de la structure d’un tissu reconstruit par auto-assemblage permet de potentialiser

ses propriétés mécaniques. La structure de la media alignée circonférentiellement est plus physiologique et sa

résistance à la traction est supérieure.

1.7. Les Microparticules

1.7.1. Description

Les MP sont des vésicules membranaires d’une taille inférieure à 1 µm libérées dans le milieu extracellulaire

par les cellules en condition de stress ou de blessure. Ces vésicules ne doivent pas être confondues avec

d’autres types de vésicules extracellulaires comme les exosomes ou les corps apoptotiques, car leur

dimension, leur contenu, leur mécanisme de formation ainsi que leur rôle sont entièrement différents. Elles

sont présentes dans le plasma et les autres liquides biologiques des individus sains; par contre, leur

provenance et leur quantité varient en réponse à certaines conditions pathologiques. Cette caractéristique en

fait des marqueurs diagnostiques potentiels. Identifiées dans les années 40 dans le plasma sanguin, les MP

furent alors considérées comme des débris cellulaires sans autre importance qu’au niveau de la coagulation

[Chargaff et al., 1946, Wolf, 1967]. Ce n’est que récemment qu’une attention plus particulière fut accordée à

ces vésicules et que certains de leurs rôles biologiques complexes furent identifiés. En effet, les MP peuvent

participer activement aux processus pathologiques et avoir des effets positifs ou négatifs sur ceux-ci [Hugel et

al., 2005]. Elles sont ainsi considérées comme des vecteurs de messages intercellulaires.

1.7.2. Formation et structure

Les MP sont des vésicules membranaires qui résultent du bourgeonnement de la membrane plasmique en

réponse à un signal (Fig. 1.14). Le processus implique l’augmentation locale du calcium intracellulaire, puis un

changement de l’activité de la flippase, de la floppase et de la scramblase, causant l’externalisation des

phosphatidylsérines. Il s’ensuit le désassemblage local du cytosquelette d’actine et le bourgeonnement de la

membrane plasmique libérant dans l’espace extracellulaire une vésicule membranaire de 0,1 à 1 µm de

diamètre [Meziani et al., 2008]. La composition des MP varie en fonction de la cellule de laquelle elles

proviennent [Tesse et al., 2006]. Elles contiennent les protéines transmembranaires exprimées par leur cellule

mère au moment de leur formation [Hugel et al., 2005, Martinez et al., 2005]. Dans la lumière de la vésicule,

se retrouvent des enzymes, de l’ARN (microARN) [Laffont et al., 2013] et possiblement de l’ADN [Dignat-

George et al., 2011, Morel et al., 2011].

46

Figure 1.14 - Formation des microparticules

Au repos, la membrane cellulaire présente une asymétrie entre le feuillet intérieur et extérieur au niveau des phospholipides

membranaires comme la phosphatidylsérine. Suite à l’activation de la cellule, l’activité de la floppase, de la flippase et de la scramblase

change et les phosphatidylsérines sont externalisées. L’augmentation de calcium intracellulaire et la déstabilisation locale du

cytosquelette causent le bourgeonnement de la membrane plasmique et la libération d’une microparticule. La présence de radeaux

lipidiques au niveau de la membrane permet aux microparticules d’inclure certains groupements de récepteurs pouvant interagir

ensemble. (Adaptée de [Hugel et al., 2005])

1.7.3. Fonctions

Les MP sont en mesure d’interagir avec des cellules cibles et donc, d’agir comme vecteurs de messages. Ils

interviennent dans plusieurs processus physiopathologiques comme la coagulation, le stress oxydatif,

l’inflammation, l’angiogenèse et l’apoptose [Burger et al., 2013]. La plupart des MP ont des effets

procoagulants [Leroyer et al., 2008b] qui s’expliquent d’abord par la présence de phosphatidylsérines

(chargées négativement) sur le feuillet externe de la membrane permettant l’interaction avec les protéines de

la coagulation [Owens et al., 2011]. Ensuite, certaines populations de MP provenant des monocytes et des

cellules endothéliales portent le facteur tissulaire (tissue factor) à leur surface. En interaction avec le facteur

47

VII/VIIa, il enclenche la cascade de coagulation [Shet et al., 2003, Kasthuri et al., 2012]. Les MP, de manière

générale, ont tendance à promouvoir le stress oxydatif, particulièrement au niveau de l’endothélium, par

différents processus impliquant notamment la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase

(NOX) et les mitochondries. L’inflammation est à la fois une cause et une conséquence de la présence des

MP et les mécanismes qui la produisent varient en fonction de la provenance des MP. Les MP produisent

généralement des effets proangiogéniques [Martinez et al., 2011a] et stimulent l’apoptose.

1.7.4. Mécanismes d’action

Les mécanismes par lesquels les MP agissent sur leurs cellules cibles ou sur leur environnement sont

nombreux et la compréhension de leurs spécificités reste nébuleuse. Ces mécanismes peuvent impliquer les

propriétés de surface des MP qui jouent un rôle important au niveau : de la coagulation [Simoncini et al.,

2009], de la séquestration du NO [Donadee et al., 2011], de la production d’espèces réactives de l’oxygène

(ERO) directement par les MP [Brodsky et al., 2004, Mostefai et al., 2008a], de l’interaction physique avec la

cellule cible via des récepteurs de surface [Montezano et al., 2008, Terrisse et al., 2010, Burger et al., 2011],

de l’interaction avec la MEC [Canault et al., 2007, Lozito et al., 2012], ainsi que de la fusion et du transfert du

matériel contenu dans la MP vers la cellule cible [Bebawy et al., 2009, Diehl et al., 2012] (Fig. 1.15).

1.7.5. Interaction avec les cellules vasculaires

Les MP vasculaires sont en contact direct avec les cellules circulantes, mais c’est avec l’endothélium que

survient la majorité des interactions cellules-MP [Martinez et al., 2005]. Pour cette raison, ce sont les CE qui

ont reçu le plus d’attention, autant au niveau de la production et des effets des MP d’origine endothéliale, que

de la réponse de l’endothélium aux MP. Certains effets sont présentés dans le tableau 1.3 [Dignat-George et

al., 2011, Yong et al., 2013].

Au niveau de l’endothélium, les MP causent généralement une augmentation du stress oxydant, des

marqueurs inflammatoires et de l’angiogenèse, ainsi qu’une dysfonction endothéliale. Les MP d’origine

endothéliale peuvent initier la coagulation, activer les neutrophiles, favoriser l’adhésion des monocytes et

stimuler l’angiogenèse. Elles peuvent également affecter la vasodilatation et être impliquées dans la régulation

de la perméabilité vasculaire et la prolifération des CML. Les lymphocytes-T sont en mesure de produire des

MP qui peuvent stimuler les CE, transférer du facteur tissulaire aux plaquettes, et causer une dysfonction

endothéliale.

Bien que les MP circulantes soient séparées de la media par l’intima, elles sont en mesure de traverser cette

barrière et d’agir directement sur la media, particulièrement en condition pathologique impliquant une

dysfonction endothéliale [Martinez et al., 2005]. Dans un contexte expérimental, la plupart des études sur la

fonction des MP sur la media consistent à dénuder mécaniquement l’endothélium d’un vaisseau explanté

48

avant de l’incuber en présence de MP. Ce dénudement ainsi que la chirurgie pour explanter le vaisseau

entraînent une blessure qui cause une inflammation pouvant modifier la réponse observée. Inversement, les

CML peuvent également produire des MP. En effet, le facteur tissulaire extracellulaire activé retrouvé dans la

paroi artérielle endommagée et dans les plaques d’athérome dériverait, en partie, des MP produites par les

CML [Schecter et al., 2000]. De plus, la capacité de ces MP apoptotiques à former des thrombus corrèle avec

la présence du facteur tissulaire fonctionnel à leur surface [Brisset et al., 2003].

Ces interactions entre les MP et la fonction vasculaire sont certainement un processus important dans le

maintien d’une homéostasie vasculaire finement régulée. Lorsque cet état d’équilibre est perturbé, le profil de

MP est modulé et ces changements jouent vraisemblablement un rôle dans de nombreuses conditions

pathologiques. Leur rôle bénéfique sur la condition du patient ou leur contribution à la progression de la

pathologie demeure cependant toujours des questions débattues [Dignat-George et al., 2011].

1.7.6. Implication pathologique

Les MP sont un sujet qui suscite un intérêt grandissant autant pour leur utilisation comme outil diagnostique,

que parce qu’elles sont de plus en plus reconnues comme prenant activement part aux processus

pathologiques. Dépendamment de la condition pathologique étudiée, l’intervention des MP peut être bénéfique

ou délétère [Hugel et al., 2005]. Les pathologies impliquant une modulation des taux de MP circulantes sont

nombreuses et elles ont comme point commun une atteinte vasculaire, inflammatoire ou un état

prothrombotique [Burnier et al., 2009]. Les plus citées sont le diabète [Omoto et al., 2002, Ogata et al., 2005],

la pré-éclampsie [Tesse et al., 2007, Redman et al., 2008, Marques et al., 2013], le syndrome

cardiométabolique [Agouni et al., 2008, Agouni et al., 2011], l’infection au virus d’immunodéficience humain

(VIH) [Gris et al., 1996], le choc septique [Reid et al., 2012], l’athérosclérose [Leroyer et al., 2007] et

l’hypertension [Preston et al., 2003].

Cette modulation du taux de microparticules en fait un marqueur pathologique potentiel. De nouveaux outils

diagnostiques verront certainement le jour au cours des prochaines années. Même s’il est difficile de conclure

sur le rôle général des MP dans la progression pathologique, leur utilisation en thérapie a été proposée. En

effet, il est envisageable de produire des MP autologues in vitro et de les utiliser chez le patient. Ces MP

pourraient être transduites pour exprimer une protéine d’intérêt qui serait transférée aux cellules cibles

[Benameur et al., 2010].

49

Tableau 1.3 - Principaux effets des microparticules de différentes origines sur les cellules endothéliales

Fonction Provenance

cellulaire Tissu, cellule, ou

animal testés Effets Mécanisme Références

Coagulation Toutes NA Procoagulant Phosphatidylsérine externalisée

Facteur tissulaire (MP endothéliales et monocytaires)

[Shet et al., 2003, Owens et al., 2011]

[Kasthuri et al., 2012]

Stress oxydatif

Endothéliales Aortes de rats

(ex vivo) Dysfonction endothéliale Augmente O2

-, diminue NO [Brodsky et al., 2004]

Endothéliales Endothéliales Augmente les ERO NADPH oxydase

XO

[Terrisse et al., 2010, Burger et al., 2011, Burger

et al., 2012]

Lymphocytes Endothéliales Augmente les ERO NADPH oxydase ou XO (Augmentation O2-)

[Yang et al., 2008, Mostefai et al., 2008a]

Monocytes Endothéliales Augmente les ERO NADPH oxydase et XO COX

Découplage de NOS [Essayagh et al., 2007]

Lymphocytes T Endothéliales Diminue les ERO Augmente le NO

Augmentation et activation de eNOS Implication de ERK et PI3K

[Agouni et al., 2007]

Monocytes Endothéliales Augmente les ERO

Augmente le NO Implication de PI3K, ERK1/2 et Caveolin-1 [Mastronardi et al., 2011a]

Inflammation

Leucocytes (polymorpho.)

Endothéliales Inflammatoire IL-6 et MCP [Mesri et al., 1999]

Lymphocytes T Monocytes Inflammatoire TNFα, IL-1β [Scanu et al., 2008]

Monocytes Épithéliales bronchiques

Inflammatoire IL-8 et MCP-1 [Cerri et al., 2006] [Neri et al., 2011]

Monocytes, endothéliales

Podocytes Inflammatoire IL-6 et MCP-1 [Eyre et al., 2011]

Endothéliale Rat Lésion pulmonaire aiguë TNFα, IL-1β [Buesing et al., 2011]

[Densmore et al., 2006]

Sang patient septique

Souris Inflammation cœur et poumons Augmentation de iNOS

COX-2 et NF-κB [Mastronardi et al., 2011b]

Angiogenèse

Plaquettes HUVEC Prolifération, survie, migration et

formation de tubes Voie liée à un GPCR et un RTK [Kim et al., 2004]

Plaquettes Rat Augmentation des capillaires après

ischémie du myocarde VEGF, FGF-2, PDGF [Brill et al., 2005]

Plaque d'athérome HUVEC (in vitro)

Augmentation de la prolifération Dépendant du ligand CD40 [Leroyer et al., 2008a]

Plaque d'athérome Souris

Balb/C (nue) Augmentation de l'angiogenèse Dépendant du ligand CD40 [Leroyer et al., 2008a]

Lymphocytes T (Shh +)

Endothéliales (Eahy 926)

Formation de structures capillaires (in vitro)

Augmentation de facteurs proangiogéniques Dépendant de Shh

[Soleti et al., 2009]

Lymphocytes T (Shh +)

Souris post ischémie Augmentation de la circulation

après 21 jours Activation de la voie Shh [Benameur et al., 2010]

Lymphocytes T CEM

Aorte (ex vivo) cornée (in vivo)

Inhibition de l'angiogenèse Production de ERO [Yang et al., 2008]

Lymphocytes T CEM

Souris Lewis (modèle cancer du poumon)

Inhibition de l'angiogenèse Réduction de la densité capillaire, du niveau

de VEGF et de la taille de la tumeur [Yang et al., 2010, Yang et

al., 2012]

Apoptose

Sang patient hypertension

Cellules endothéliales progénitrices

H2O2 production, sénescence et apoptose

NA [Huang et al., 2010]

Sang patient sclérodermique

Cellules endothéliales progénitrices

Apoptose Phagocytose des MP riche en acide

arachidonique cause l’apoptose [Distler et al., 2011]

Lymphocytes T Macrophages Apoptose ERK1/2 activation [Huber et al., 2007]

Adapté des résultats de [Burger et al., 2013]

Abréviations de l’anglais : O2-, anion superoxyde; NO, nitric oxide; ERO, espèces réactives de l’oxygène; NADPH, nicotinamide

adenine dinucleotide phosphate; XO, xanthine oxidase; COX, cyclooxygenase; NOS, nitric oxide synthase; ERK, extracellular signal-

regulated kinase; PI3K, phosphatidylinositide 3-kinases; IL, interleukin; MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1; TNF-α, tumor

necrosis factor-α; NF, nuclear factor; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell; GPCR, G-protein coupled receptor; RTK,

récepteur à activité tyrosine kinase; VEGF, vascular endothelial growth factor; FGF-2, fibroblast growth factor-2; PDGF, platelet-derived

growth factor; CD, cluster of differentiation; Shh, sonic hedgehog; H2O2, oxygen peroxide.

50

Figure 1.15 - Mécanismes d’action potentiels pour les microparticules

Il existe plusieurs modes d’interaction potentiels entre les MP et leurs cibles. A) Les MP sont reconnues pour leurs propriétés

procoagulantes. B) Les MP érythrocytaires sont en mesure de capturer le NO produit par les CE, diminuant sa disponibilité pour les

CML. C) La production de ERO par les MP peut influencer l’état de contraction du muscle lisse. D) La présence de MMP à la surface

de certains types de MP les associe à un rôle au niveau du remodelage de la MEC. E) Les MP peuvent interagir avec des récepteurs

de surface sur certaines cellules. Ce mode d’interaction MP-cellule cible est le plus documenté. F) Finalement, la fusion et le transfert

de matériel représentent un mode d’interaction mis en évidence récemment. Le transfert d’ARN et de microARN pourrait influencer

l’expression de certaines protéines. (Adaptée de [Burger et al., 2013])

Abréviations de l’anglais : ERO, espèces réactives de l’oxygène ; MMP, matrix metalloproteinase ; eNOS, endothelial nitric oxide

synthase, MEC, matrice extracellulaire.

Les patients infectés par le VIH ont une prédisposition à souffrir d’athérosclérose et d’autres maladies

cardiovasculaires. Cependant, le mécanisme responsable de cet effet reste mal compris. Mayne et al. ont

étudié l’état d’activation des plaquettes et des MP dérivées des plaquettes chez les patients séropositifs. Ils

ont montré que l’augmentation de l’activation des plaquettes et des MP plaquettaires contribue à

l’augmentation des risques cardiovasculaires et de thrombose chez les patients séropositifs

[Mayne et al., 2012].

Martin et al. montrent que les MP dérivées des lymphocytes T in vitro causent une induction de la dysfonction

endothéliale dans les artères de conductance et de résistance par l’altération de la signalisation du NO et des

prostacyclines. Ces résultats ont été obtenus in vitro suite à l’incubation d’aorte de souris avec des MP

d’origine humaine. Ces résultats montrent des effets délétères de l’augmentation du niveau des MP

circulantes impliquées dans différentes pathologies cardiovasculaires et immunitaires [Martin et al., 2004].

51

Inversement, d’autres travaux montrent que des MP de la même origine cellulaire expriment la protéine Sonic

hedgehog (Shh) à leur surface [Martinez et al., 2006], puis que l’injection de ces MP chez des souris améliore

la capacité de l’endothélium à produire du NO et renverse la dysfonction endothéliale après une ischémie-

reperfusion [Agouni et al., 2007]. Ces effets ont pu être bloqués par la présence de la cyclopamine, un

inhibiteur spécifique de Shh et par une interférence ARN du récepteur Patched. Ces MP pourraient

représenter une nouvelle avenue thérapeutique pour le traitement des dysfonctions endothéliales [Agouni et

al., 2007]. Ces résultats contradictoires montrent l'importance des modèles utilisés. Ils sont probablement la

conséquence des différences de procédures (in vitro ou in vivo) ainsi que de la façon de produire les MP

(phytohémagglutinine ou actinomycine D dans le cas de Martin et al. et phytohémagglutinine, phorbol-12-

myristate-13-acetate et actinomycine D dans le cas de Martinez et al.).

Le choc septique est une pathologie impliquant une augmentation du taux de MP, principalement d’origine

plaquettaire. Cette pathologie résulte généralement d’une infection bactérienne incontrôlée et entraîne une

réponse immunitaire systémique impliquant la relâche massive d’agents vasodilatateurs, notamment le NO

[Stoclet et al., 1999, Marik, 2003, Assreuy, 2006]. Cette condition pathologique entraîne donc un état

d’hypotension généralisé, réfractaire aux traitements vasopresseurs et qui met en péril l’irrigation des

différents organes. Cette condition sévère et aiguë résulte en un taux de mortalité de l’ordre de 40 à 60% lors

de l’atteinte de l’état le plus grave, soit le choc septique [Galley et al., 1996, Balk, 2000, Levy et al., 2003,

Cauwels et al., 2011]. Le taux de MP circulantes retrouvé dans le sang des patients en choc septique est plus

élevé que chez les personnes saines, particulièrement en raison de l’augmentation des MP plaquettaires

[Nieuwland et al., 2000, Aras et al., 2004, Mostefai et al., 2008b]. Soriano et al. démontrent une corrélation

positive entre le niveau de MP circulantes et la survie des patients en choc septique [Soriano et al., 2005]. Tel

que mentionné précédemment, ces MP sont en mesure d’interagir avec le système vasculaire et d’influencer

la balance des agents vasoactifs par une action directe sur le NO, mais aussi via leurs interactions avec

l’endothélium et les CML.

Mostefai et al. ont réalisé des études chez le rat traité avec des MP isolées du plasma de sujets humains en

choc septique [Mostefai et al., 2008b] (Fig. 1.16). Ils montrent que les MP ont un effet protecteur sur la

fonction vasculaire en cas de choc septique via l’augmentation de la sensibilité à certains agonistes

vasocontractiles, dont la sérotonine. Cet effet a été démontré à la fois en condition normale et sur des rats

traités aux lipopolysaccharides pour simuler un choc endotoxinique [Mostefai et al., 2008b].

52

Figure 1.16 - Dosage par cytométrie en flux des microparticules sériques de patients en choc septique

L’augmentation du taux de MP observée en condition de choc septique est principalement attribuable à l’augmentation des MP

d’origine plaquettaire (CD41+). On observe également une augmentation des MP provenant des cellules endothéliales (CD146+), des

lymphocytes (L-sélectine, CD62L+) et des plaquettes activées (P-sélectine, CD62P+) tandis que les MP dérivé des leucocytes

(CD45+) diminuent. (Adaptée de [Mostefai et al., 2008b])

Abréviations de l’anglais : SMPs, septic microparticles

Mortaza et al. ont inoculé des rats sains avec des MP provenant du sérum de rats en péritonite ou non. Ils

observent une diminution de la tension artérielle, une augmentation des ERO, de l’activité du facteur nucléaire

(NF de l’anglais nuclear factor)-κB et une induction de la NO synthase inductible (iNOS de l’anglais inducible

nitric oxide synthase) associée à une augmentation de la production de NO. L’activation de la eNOS était

quant à elle diminuée [Mortaza et al., 2009].

Mastronardi et al. ont analysé l’effet de l’injection de MP de patients, septiques ou non, chez des souris pour

une période de 24 heures. Le cœur, les poumons, le foie et les reins ont été analysés pour l’expression de la

COX-2, iNOS et eNOS ainsi que la mesure du NO et du O2-. Les résultats rapportés sont très variables d’un

organe à l’autre, rendant leur interprétation difficile. Globalement, les résultats suggèrent que les MP exercent

des effets différents en fonction des tissus et que ces MP pourraient contribuer à la dysfonction des organes

observée au cours du choc septique [Mastronardi et al., 2011b].

La disparité des résultats présents dans la littérature quant à la réponse des vaisseaux aux MP de patients en

choc septique et isolées de lymphocytes T est attribuable à plusieurs causes. La diversité des protocoles

expérimentaux de production (stimulation des cellules avec différents produits) ou de récolte de MP (condition

des patients) ainsi que le choix du modèle (cellules en monocouche, animaux modèles) et des paramètres

d’incubation (temps, température) sont des facteurs pouvant influencer les résultats obtenus. En raison de ces

différences dans les résultats, il est difficile de trancher quant aux rôles précis des MP sur la fonction

53

vasculaire en condition pathologique et de leur attribuer un rôle bénéfique ou délétère

[Perez-Casal et al., 2009, Perez-Casal et al., 2011].

De plus, de nombreuses études sur les MP ont été réalisées dans un contexte xénogénique, c’est-à-dire que

des MP humaines sont injectées chez un animal modèle. Ces études ne représentent donc pas fidèlement la

réalité d’un contexte de tissu humain physiologique. La rareté des vaisseaux humains pour la recherche, la

variabilité interindividuelle et les conditions pathologiques omniprésentes rendent l’étude des MP laborieuse.

Toujours est-il que les MP représentent un phénomène complexe encore mal compris. Comment réagiraient-

elles dans un contexte entièrement humain? De nouvelles expériences sont nécessaires pour le déterminer.

1.8. Problématique, Hypothèse et Objectifs

L’athérosclérose est une pathologie qui se développe graduellement au cours de la vie avec l’apparition de

plaques d’athéromes dès la vingtaine [Webber et al., 2012]. Elle précède souvent le développement de

pathologies aux conséquences dévastatrices comme la CI et la MVP. Les pontages artériels sur des

vaisseaux de diamètre inférieur à 6 mm nécessitent l’utilisation d’un vaisseau autologue. Cependant, leur

disponibilité limitée cause rapidement une pénurie de ces vaisseaux notamment chez les patients souffrants

d’athérosclérose sévère associée à des comorbidités comme l’hypertension et le diabète. Les substituts

synthétiques actuels sont malheureusement inefficaces dans ces circonstances qui nécessitent un

endothélium fonctionnel, il existe donc un besoin réel pour la création d’une prothèse vasculaire fonctionnelle

sur des vaisseaux de petit diamètre. Le cahier des charges pour le développement d'une telle prothèse

comporte plusieurs aspects : la création d’une paroi étanche et non thrombotique; l’intégration à l’hôte sans

réaction de rejet ou d’encapsulation; la présence de cellules autologues; une résistance mécanique

supraphysiologique et une compliance comparable à celle des vaisseaux natifs.

Les recherches portant sur les pathologies vasculaires comme l’athérosclérose, le choc septique ou le diabète

sont limitées par les contraintes expérimentales inhérentes aux modèles utilisés. En effet, d'un côté, les

vaisseaux humains explantés sont généralement pathologiques, ne sont disponibles qu’en quantité limitée et

les résultats sont variables d’un explant à l’autre. D’un autre côté, les cellules en culture sont peu

représentatives d’un contexte physiologique et ne permettent pas d’évaluer la capacité contractile des

vaisseaux, un paramètre crucial dans les processus pathologiques. Finalement, les modèles animaux, quant à

eux, récapitulent plus ou moins fidèlement les pathologies humaines.

Malgré le nombre grandissant de publications sur l’implication pathologique des MP sur la fonction vasculaire,

un nombre limité d’entre elles combinent l’étude des MP isolées de patients sur des vaisseaux humains.

54

La méthode d’auto-assemblage du LOEX permet de reconstruire un tel vaisseau à partir de cellules humaines.

Une des grandes forces de ce modèle est de ne contenir aucun matériel exogène, car la MEC utilisée est

sécrétée et organisée par les cellules en culture. Il est donc admissible que cette matrice soit parfaitement

intégrable chez l’hôte. De plus, ce vaisseau récapitule les trois tuniques vasculaires par l’utilisation des types

cellulaires spécialisés de chacune des tuniques. Les fibroblastes de l’adventice produisent une MEC

abondante et résistante. Par contre, il en est autrement pour les CML de la media, qui ont une capacité limitée

de production de matrice dans les conditions actuelles de culture in vitro. En effet, la technique d’auto-

assemblage pour la media ne parvient pas encore à recréer la résistance et l’élasticité retrouvée in vivo. De

plus, de nombreuses populations de CML, particulièrement celles provenant de veines adultes, forment un

feuillet impossible à manipuler sans l’endommager. Ce dernier aspect est particulièrement problématique dans

l’optique de développer une prothèse vasculaire autologue destinée à la greffe qui nécessitera la production

de media pour chaque patient, car les prélèvements de tissu vasculaire les moins invasifs sont ceux des

veines superficielles. De plus, le vaisseau reconstruit à partir de cellules humaines permettrait la réalisation

d’études pharmacologiques portant sur des pathologies vasculaires. Ce modèle dérivé de cellules humaines,

pathologiques ou non, pourrait avantageusement remplacer l’utilisation d’animaux ou de vaisseaux explantés.

Pour la création de ce modèle d’étude pharmacologique reposant sur l’utilisation de cellules précieuses

d’origine pathologique, il est prioritaire de pouvoir former des media à partir des cellules de chacun des

patients, même lorsque les CML sont capricieuses au niveau de leur capacité de sécrétion de MEC in vitro.

Notre hypothèse est que le modèle de vaisseau reconstruit permettra de décortiquer l’influence des MP sur

chacune des tuniques vasculaires et qu’une optimisation de ce modèle sera bénéfique pour rendre réalisable

l’ingénierie de substituts vasculaires à partir des cellules de chaque patient ainsi que pour améliorer ses

propriétés physiologiques.

Deux objectifs généraux ont donc été élaborés : 1) Évaluer l’influence des MP sur les substituts vasculaires

humains reconstruits par génie tissulaire. 2) Optimiser le modèle de media reconstruite par auto-assemblage

pour faciliter l’étude des propriétés physiologiques des vaisseaux sanguins humains.

Des objectifs spécifiques ont également été établis : 1a) Évaluer l’implication des différentes tuniques

vasculaires dans la réponse aux MP produites in vitro à partir de lymphocytes T.1b) Évaluer l’influence des MP

produites par les patients en choc septique sur la fonction vasculaire de la media artérielle dans le modèle

reconstruit par génie tissulaire. 2a) Utiliser un échafaudage de MEC reconstruit par auto-assemblage pour

produire des substituts vasculaires résistants et contractiles à partir de populations de CML produisant peu de

MEC. 2b) Induire l’alignement physiologique de la MEC de l’échafaudage de manière à le rendre plus résistant

et plus contractile.

55

Les MP dérivées des lymphocytes T sont augmentées dans la circulation de patients séropositifs et

diabétiques, mais leur influence sur la fonction vasculaire demeure méconnue. Dans le choc septique, le

niveau de MP circulantes est augmenté alors que la réponse de la media aux agonistes vasoconstricteurs est

diminuée. Toutefois, l’implication de cette relation demeure incertaine. Il devient donc à propos de déterminer

les effets des MP sur les vaisseaux humains. Le premier objectif était d’évaluer l’influence des MP sur la

fonction de certaines des tuniques vasculaires humaines. Nous avons choisi d'utiliser le vaisseau reconstruit

par génie tissulaire afin de déterminer l’interaction entre les MP et les cellules vasculaires humaines dans un

contexte tridimensionnel récapitulant l’architecture des vaisseaux natifs.

L’implication des différentes tuniques vasculaires dans la réponse aux MP produites in vitro à partir de

lymphocytes T a d’abord été évaluée (chapitre 2). Différentes constructions contenant soit la media ou

l’adventice ainsi que la combinaison de ces deux tuniques ont été incubées en présence de ces MP. La

réponse contractile des vaisseaux reconstruits a ensuite été évaluée en bains d’organes isolés, de même que

la modulation des sentiers moléculaires menant à cette contraction.

Étant donné l’augmentation des MP circulantes au cours du choc septique et l’implication critique de l’atteinte

vasculaire dans la survie des patients souffrant de cette pathologie létale et fulgurante, il était primordial de

démystifier l’influence de cette élévation du taux de MP sur la capacité contractile de la media humaine. Le

modèle reconstruit par ingénierie tissulaire à partir de cellules humaine a été utilisé afin d’évaluer l’implication

potentielle des MP sur la fonction vasculaire de la media au cours du choc septique (chapitre 3). L’influence de

ces MP isolées du plasma de patients sur la capacité contractile de cette tunique a donc été évaluée

directement par des essais de vasoconstriction en bains d’organes isolés. Le mécanisme moléculaire impliqué

dans cette interaction a également été investigué par l’analyse de la modulation des médiateurs vasoactifs et

inflammatoires dans la media humaine suite à son incubation en présence de ces MP.

La reconstruction de la media par auto-assemblage présente toutefois certaines difficultés reliées entre autres

à une production matricielle variable d’une lignée à l’autre. Le deuxième objectif était donc d’optimiser le

modèle de media reconstruite par auto-assemblage pour permettre la création de cette tunique contractile à

partir de n’importe quelle population de CML. Pour ce faire, un échafaudage de MEC reconstruit par auto-

assemblage a été développé (chapitre 4). Les paramètres qui devaient être améliorés étaient la résistance

mécanique, la contractilité ainsi que la reproductibilité pour différentes lignées, notamment celles produisant

peu de MEC. L’organisation tridimensionnelle des cellules et de la matrice dans la media est une propriété

physiologique importante pour la fonctionnalité de ce tissu. La suite des travaux d’optimisation de la media

s’est donc concentrée sur la création d’un alignement physiologique de la MEC de l’échafaudage pour

produire des media reconstruites plus résistantes et plus contractiles (chapitre 5). Les propriétés mécaniques

et contractiles de la media reconstruite en utilisant un échafaudage de MEC anisotropique ont été évaluées.

57

CHAPITRE 2

APPLICATIONS OF HUMAN TISSUE-ENGINEERED BLOOD VESSEL MODELS TO STUDY THE EFFECTS OF SHED MEMBRANE

MICROPARTICLES FROM T-LYMPHOCYTES ON VASCULAR FUNCTION

58

Applications of Human Tissue-Engineered Blood Vessel Models to Study the Effects of Shed

Membrane Microparticles from T-Lymphocytes on Vascular Function

Maria Pricci1, *; Jean-Michel Bourget2, *; Hubert Robitaille2; Chiara Porro1; Raffaella Soleti1; H. Ahmed

Mostefai1; François A. Auger2; M. Carmen Martinez1; Ramaroson Andriantsitohaina1; Lucie Germain2

1. INSERM 771; CNRS UMR 6214; Faculté de Médecine, Angers, France;

2. Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale (LOEX), Hôpital du Saint-Sacrement du Centre Hospitalier

Affilié Universitaire de Québec, and Department of Surgery, Laval University, Québec, Québec, Canada.

*These authors contributed equally to this work and should therefore be considered as equal first authors.

Avant-Propos

Ce chapitre présente la version manuscrite d’un article publié en 2009 dans la revue Tissue Engineering Part

A. (Jan;15(1):137-45) intitulé « Applications of Human Tissue-Engineered Blood Vessel Models to Study the

Effects of Shed Membrane Microparticles from T-Lymphocytes on Vascular Function » par Maria Pricci,

Jean-Michel Bourget, Hubert Robitaille, Chiara Porro, Raffaella Soleti, Hadj Ahmed Mostefai, François A.

Auger, Maria Carmen Martinez, Ramaroson Andriantsitohaina et Lucie Germain.

Cet article présente les résultats d’une collaboration entre les laboratoires des Dre Germain au Québec et

Dr Andriantsitohaina en France. Les nombreux échanges entre les deux laboratoires ont été favorisés par le

programme de stage FRSQ-INSERM. Les travaux présentés dans cet article ont été amorcés par Hubert

Robitaille et Maria Pricci. J’ai poursuivi ces travaux dans le cadre de 2 stages de 1 mois en France. Une

première version du manuscrit écrite par Pricci, Martinez et Andriantsitohaina a été modifiée pour tenir compte

des nouveaux résultats par Bourget, Germain et Andriantsitohaina. Porro, Soletti et Mostefai ont réalisé des

expériences supplémentaires pour répondre aux questions des arbitres et ont collaboré à la réalisation des

expériences par Bourget en France. Auger et Martinez ont révisé le manuscrit. Les auteurs Pricci et Bourget

sont tous les deux considérés comme premier auteur.

59

2.1. Résumé

Les microparticules (MP) sont des vésicules membranaires qui contiennent des récepteurs de surface et du

contenu cytoplasmique provenant de leur cellule d’origine. Dans certaines conditions pathologiques associées

à des dysfonctions vasculaires, une élévation du niveau de MP est observée.

L’objectif de cette étude était d’évaluer le rôle des MP circulantes dans la régulation de la vasomotricité des

équivalents vasculaires humains reconstruits par génie tissulaire (TEBV). Ces derniers comportaient soit

l’adventice (TEVA), la media (TEVM) ou les deux (TEVMA).

Les différents équivalents vasculaires ont été incubés avec ou sans les MP provenant de lymphocytes T

apoptotiques. La réponse contractile à l’histamine a été appréciée en présence ou en absence d’inhibiteurs de

la NO synthase inductible (iNOS) ou de la cyclo-oxygénase (COX-2), respectivement le 1400W et le NS398.

La production d’anions superoxydes (O2-) et de monoxyde d’azote (NO) a été quantifiée par résonance

paramagnétique électronique. L’expression de la iNOS et de la COX-2 a été évaluée par immunobuvardage

de type Western.

L’histamine induit une contraction dose-dépendante des trois constructions. La contraction met en jeu

différents mécanismes, y compris des facteurs de nature inconnue démasqués suite à l'inhibition de la iNOS et

des métabolites de la COX-2 dans le TEVM et le TEVA. Dans ce dernier, la contraction à l’histamine est

modulée par le NO issu de la iNOS. Les MP semblent potentialiser la contraction à l’histamine dans le TEVA

et n’affectent pas cette même réponse dans le TEVM et le TEVMA. Par ailleurs, les MP inhibent la libération

de facteurs contractiles dans le TEVM et non dans le TEVMA. Les effets des MP sont associés à une

augmentation de la production de NO probablement issue de la NO synthase neuronale et de l’O2-.

L’ensemble des résultats montre que les MP régulent la réactivité vasculaire en agissant de façon subtile sur

le NO, l’O2- et les métabolites de la COX-2 pour maintenir la contraction aux agonistes dans les trois

constructions.

Les équivalents vasculaires représentent un bon modèle en pharmacologie pour appréhender les effets des

MP et la contribution des différentes tuniques, adventice et media, dans les réponses. Les MP régulent la

contraction en agissant sur les produits de la COX-2, du NO et de l’O2- dans les trois constructions.

60

2.2. Abstract

Microparticles (MPs) are membrane vesicles harbouring cell surface proteins and containing cytoplasmic

components of the original cell. Elevated levels of circulating MPs have been detected in pathological states

associated with vascular dysfunction. We took advantage of the self-assembly method of tissue engineering to

produce in vitro three vascular constructs from human vascular smooth muscle cells and fibroblasts, in order to

investigate the role of the adventitia in the modulation of vascular tone by MPs comparing the contractile

response of each of these constructs to histamine. The first two were composed of either an adventitia (TEVA)

or a media (TEVM) solely, and the third one contained a media and an adventitia (TEVMA). In the three

constructs, the results show that histamine induces contraction that was not affected by blockade of inducible

NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) and that MPs treatment did not modify the contractile

response. MPs decreased both nitric oxide (NO) production and nuclear factor (NF)-κB expression but did not

affect O2- release in TEVA. MPs enhanced NF-κB expression although they did not affect iNOS and COX-2

expressions, NO and O2- release in TEVM. In TEVMA, MPs did not enhance NF-κB expression although

COX-2 expression was increased and O2- release reduced. Thus, MPs affected NO, O2

-, NF-κB and COX-2 in

subtle fashion in order to maintain the contractile response to histamine. The use of tissue-engineered

vascular constructs results in a better understanding of the effect of MPs on human adventitia and media.

Keywords: Tissue engineering; Histamine; Vascular tone; Contraction; Nitric oxide; Adventitia; Human vascular

smooth muscle cells; Fibroblasts.

61

2.3. Introduction

Inflammation has a pivotal role in the development of atherosclerosis and acute activation of the vascular wall

with consecutive local thrombosis and altered vasomotion. This process is orchestrated by the interactions

between inflammatory cells, such as platelets, T- and B- lymphocytes, and vascular cells, such as endothelial

cells and smooth muscle cells (SMCs). When they are activated by an agonist, shear stress,1,2 or apoptosis,3,4

these cells release vesicles shed from the blebbing plasma membrane called microparticles (MPs). Recently,

we reported that in vitro apoptotic T-lymphocyte-derived MPs, at concentrations that can be reached in

circulating blood under immunological dysfunction (e.g., HIV),4 impair endothelium-dependent relaxation in

conductance as well as small resistance arteries in response to agonist and shear stress, respectively.5

Interestingly, MPs treatment affects nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2) but not endothelium-derived

hyperpolarizing factor-mediated dilatation. Although these effects are linked to the decrease in expression of

endothelial NO synthase (eNOS), cyclooxygenase-1 (COX-1) expression is not modified. Also, we found that

T-lymphocyte-derived MPs can affect vascular contraction by acting directly on smooth muscle cells.6 These

MPs induce vascular hyporeactivity in response to vasoconstrictor agents in mouse aorta and this is reversed

by NO synthase plus cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors. The hyporeactivity induced by MPs is associated

with an increased production of NO and PGI2 resulting from upregulation of proinflammatory proteins

expression, inducible NO synthase (iNOS), and COX-2. These data provide a rationale to explain the

paracrine role of MPs as vectors of transcellular exchange of message in promoting vascular dysfunction

during inflammatory diseases.

It is well accepted that the media of a blood vessel is responsible for the control of vasomotor tone by

contracting and relaxing, in response to different hormonal factors released such as histamine and endothelin.

The adventitia, on the other hand, has long been thought to mainly serve as a structural support for the media,

its main contribution to vascular compliance being controlled by autonomous perivascular innervation.7,8

Interestingly, recent studies suggest that the adventitia influences vascular function.9-11 Nonetheless, whether

the adventitia can directly participate in the regulation of vasomotor tone of blood vessels in response to MPs

still remains to be demonstrated.

The lack of appropriate technical procedures to separate the adventitia tunica from the other components of a

native blood vessel have prevented direct investigations on the possible role of this layer in the regulation of

vasomotor tone. We have developed, using the self-assembly approach, a human tissue-engineered blood

vessel (TEBV) produced in vitro and composed of the three tunicae of native blood vessels.12 This process

consists of coaxing cells to secrete their own extracellular matrix by the addition of ascorbic acid in order to

obtain a living tissue sheet. Once formed, the living tissue sheets can be either rolled or stacked to create

three-dimensional organs such as blood vessels or skin substitutes.13-16 These tissue-engineered human

62

vascular constructs possess characteristics of native blood vessels such as agonist reactivity (bradykinin,

endothelin, histamine and UTP)14 and structure. Thus, they allow the study of different pharmacological

responses on human constructs.

In the present study, we took advantage of the self-assembly method to produce in vitro three independent

vascular constructs from vascular smooth muscle cells of human umbilical artery and fibroblasts from

saphenous vein. The first vascular construct was composed of only an adventitia (TEVA), a second vascular

construct contained only a media (TEVM) and the third one contained a media and an adventitia (TEVMA).

These three vascular models (TEVA, TEVM, and TEVMA) were reconstructed in vitro from cultured human

cells to investigate the role of the adventitia in the modulation of vascular tone by MPs comparing the response

of each of these vascular constructs to histamine.

2.4. Materials and Methods

2.4.1. Production of MPs

The human lymphoid CEM-T cell line (ATCC number CRL-2265) was cultured in free-serum X-vivo 15 medium

(Cambrex, Verviers, Belgium). MPs production was induced by treatment of 200x106 cells with actinomycin D

(0.5 µg/ml) (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) for 24 h. The cells supernatant was obtained after

two centrifugation steps: 750 x g for 15 min and then at 1500 x g for 5 min to remove cells and debris,

respectively. MPs from the supernatant were washed after 3 centrifugation steps (45 min at 14,000 x g) and

recovered in 400 µl NaCl 0.9%. Determination of MPs amount was carried out by measuring MPs-associated

proteins using the Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.4.2. Tissue culture

Human arterial SMCs were isolated by the explant method of Ross as described before17,18 from umbilical cord

obtained following informed consent of the mother. Briefly, arteries from umbilical cords were slit longitudinally

and the endothelium was removed by scrubbing with gauze. Strips of the media were dissected, cut in small

sections and placed in a gelatin-coated and prewetted petri dish, to allow their attachment to the plastic.

Explants were cultured in Dulbecco's modification of Eagle's medium-Ham's F12 modified medium (DMEM-

Ham ratio 3:1) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 20% fetal bovine serum (FBS) (HyClone, Logan, UT,

USA) and antibiotics (100 U/ml penicillin and 25 µg/ml gentamicin). After two weeks of culture, SMCs migrated

from the explants and proliferated. Two weeks later, the cells were trypsinized and plated at a density of 104

viable cells/cm2 in tissue culture flasks and maintained at 37°C in a humidified atmosphere (92% air and

8% CO2). Human fibroblasts were obtained from perivascular connective tissue of saphenous vein as

previously described by Laflamme et al..9 Briefly, fragments of perivascular connective tissue were cut into

63

smaller pieces and placed in a gelatin-coated, prewetted petri dish and cultured as the SMCs. The time

necessary for vascular fibroblasts to migrate out of the explants was 9 days.

2.4.3. Production of tissue-engineered vascular constructs

Tissue-engineered vascular constructs composed of both a media and an adventitia (TEVMA), only a media

(TEVM) or solely an adventitia (TEVA) were produced using the tissue engineering method previously

described.9,12 Briefly, human artery SMCs or vascular fibroblasts were cultured in DMEM-Ham’s (3:1)

supplemented with 30% FBS, 20 µg/ml Endothelial Cell Growth supplement (Calbiochem, EMD Biosciences,

LaJolla, CA), antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) to stimulate

extracellular matrix synthesis. After 10 to 15 days of culture, cells formed thick living tissue sheets, comprising

cells embedded in the extracellular matrix they secreted, which could be peeled off from the culture flask using

fine forceps. TEVM and TEVA constructs were obtained by wrapping a tissue sheet of arterial SMCs or

vascular fibroblasts around a tubular support (inside diameter of 4.5 mm) resulting in four-layer-thick

constructs. For the TEVMA constructs, two layers of arterial SMCs sheet and two layers of fibroblasts sheet

were wrapped over the tubular support to obtain a construct with the same number of layers (four) as the

TEVM and the TEVA constructs. These different constructs were maturated for 21 days in DMEM-Ham (3:1)

supplemented with 10% bovine serum (FetalClone II, HyClone), antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate.

2.4.4. Treatment of constructs with MPs

After 21 days of maturation, each construct was cut in two, while remaining on the tubular support, and each

half was incubated with either medium (DMEM-Ham’s supplemented with 10% bovine serum and antibiotics)

or the same medium plus MPs at a concentration of 10 µg/ml. After 24h of incubation at 37°C in a humidified

atmosphere (8% CO2), each half were cut into 4 mm-long rings. The concentration and the time used to treat

the 3 constructs corresponded to the maximal effectiveness of this type of MPs in inducing endothelial

dysfunction and vascular hyporeactivity in cultured cells in vitro and in aorta and small mesenteric arteries ex

vivo.5,6,19

2.4.5. Contraction experiments

Rings of TEVM, TEVA, and TEVMA were removed from their respective tubular support used for the culture

and rinsed in physiological salt solution (Krebs solution in mM): 119 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3,

1.2 MgSO4, 2.5 CaCl2, 10 glucose. Rings were separately mounted in isolated organ baths containing Krebs

solution maintained at 37°C and gassed with a mixture of 95% O2, 5% CO2 (pH 7.4). They were set up

between 2 L-shaped wires for isometric force measurements (Radnoti, Harvard Apparatus, Ville St-Laurent,

Quebec, Canada). After being mounted, each ring was equilibrated for 30 min before being passively stretched

with a preload of 500 mg. During the next 60 min, each tissue was rinsed 3 times and tension was readjusted

64

until a stable tension of 500 mg was observed. Tissues were challenged with increasing concentrations of

histamine from 10-8 to 10-4 M in absence or presence of either the iNOS inhibitor, compound 1400W (100 µM),

or the COX-2 inhibitor, NS398 (1 µM) (Calbiochem, Meudon, France) alone or in combination.

2.4.6. NO spin-trapping and Electron Paramagnetic Resonance (EPR)

studies

NO content were assayed, after formation of EPR-detectable [Fe(II)NO (diethyldithiocarbamate)2] ([Fe(II)-

NO(DETC)2]), in rings of TEVM, TEVA and TEVMA. Samples were placed in 24-well clusters filled with 250 µl

of Krebs solution and then treated with 250 µl of colloid ferrous-diethyldithiocarbamate Fe(DETC)2 (0.5 mM)

and incubated at 37°C for 1h. After the incubation, the samples were rapidly frozen and kept in liquid nitrogen

until EPR measurements. These studies were performed using a table-top x-band spectrometer Miniscope

(Magnettech, Berlin, Germany). Recording were made at 77°K, using a Dewar flask. Instrument settings were

10 mW of microwave power, 1 mT of amplitude modulation, 100 kHz of modulation frequency, 60 s of sweep

time and 5 scans. After EPR measurements, the rings were dried and weighted. The relative [Fe(II)-

NO(DETC)2] concentrations were determined by dividing the third component amplitude of the three-lines EPR

signal by the weight of the dried sample.

2.4.7. Superoxide anion spin-trapping

Rings of TEVM, TEVA and TEVMA were allowed to equilibrate in deferoxamine-chelated Krebs-HEPES

solution (pH 7,4) containing 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin (CMH) (500 µM)

(Noxygen, Elzach, Germany), deferoxamine (25 µM) and DETC (5 µM) (Sigma-Aldrich) under constant

temperature (37°C) for 60 min. The reaction was stopped by putting samples on ice. They were frozen in liquid

N2 and analyzed in a Dewar flask by EPR.

2.4.8. Western blotting

Western blot was performed as previously described.6,20 Protein extracts were prepared by homogenization of

rings of TEVM, TEVA and TEVMA in a lysis buffer containing (mM) (50 Tris, 250 NaCl, 8 MgCl2, 1 PMSF,

5 EDTA, 0.5 EGTA, 2 NaVO3, 10 µg/ml of aprotinin, leupeptin and pepstatine and 1% Triton X-100). Samples

were centrifuged at 14,000 x g for 10 min and the supernatants were transferred to microcentrifuge tubes and

maintained in an ice-bath for immediate use. Protein concentration was determined using the Bradford

method. Approximately 70 µg of total protein from supernatant fractions were separated on 8% SDS-PAGE

and transferred to nitrocellulose membranes to be probed with antibodies against iNOS, eNOS, neuronal NO

synthase (nNOS) and COX-2 (BD Transduction Laboratories, Montluçon, France), nuclear factor (NF)-κB p65

(Abcam, Cambridge, UK) and β-actin (Sigma-Aldrich).

65

2.4.9. Histology and immunodetection

TEVA, TEVM and TEVMA were formalin-fixed and embedded in paraffin. Four-micrometer sections were

stained with Masson’s trichrome solution. Indirect immunofluorescence detection was performed on frozen

sections following fixation 10 min in methanol at –20°C using a mouse monoclonal antibody against calponin

(Sigma-Aldrich) and Alexa Fluor 594-labeled-goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, Eugene, OR).

2.4.10. Data Analysis

Data are presented as mean + SEM, and n represents the number of rings or samples. Statistical analyses

were performed by Student's t-test, or two-way analysis of variance (ANOVA) for repeated measures with a

subsequent Bonferroni post hoc test. P < 0.05 was considered to be statistically significant.

Figure 2.1 - Histological and immunological staining of the constructs

Masson’s Trichrome staining (A, B, C) and immunofluorescence labeling of calponin (D, E, F) of cross section of TEVM (A, D), TEVA

(B, E) and TEVMA (C, F) tubular constructs.

66

2.5. Results

2.5.1. Human vascular constructs

We took advantage of the self-assembly approach to produce three vascular constructs: tissue-engineered

vascular media (TEVM, produced from SMCs), tissue-engineered vascular adventitia (TEVA, produced from

vein fibroblasts (VFs)), tissue-engineered vascular media and adventitia (TEVMA, produced from SMCs and

VFs). These three constructs were produced from human vascular cells and present a tubular shape. The

histological analysis with Masson’s trichrome staining shows that vascular fibroblasts or smooth muscle cells

have produced and organized a dense extracellular matrix in which they were embedded. The matrix was

slightly denser in the adventitia construct (TEVA, Fig. 2.1B) than in the media (TEVM, Fig. 2.1A). This

difference was also present in the construct containing both a media and an adventitia (TEVMA, Fig. 2.1C).

In order to further characterize the constructs, calponin, a SMC marker, was analyzed using indirect

immunofluorescence labeling. A strong labeling was present in the TEVM (Fig. 2.1D) and a portion of the

TEVMA (Fig. 2.1F) whereas the other moiety of TEVMA and TEVA (Fig. 2.1E) were not labeled. These results

confirm that VFs and SMCs present specific characteristics.

Figure 2.2 - Concentration-response curves to histamine of the vascular constructs

Concentration-response curves to histamine of the vascular constructs TEVA (A), TEVM (B), and TEVMA(C) incubated for 24 h in

absence (Control) or presence of microparticles (MPs) at 10 g/ml. Value are means ± SEM of 6 different experiments.

2.5.2. Contraction experiments

Histamine induced a concentration-dependent contraction in TEVA, TEVM and TEVMA not treated with MPs

(controls). Contractile response of TEVA (Fig. 2.2A) was much weaker (by about 10 times less) than that

obtained in TEVM (Fig. 2.2B) or TEVMA (Fig. 2.2C). MPs did not significantly affect response to histamine in

the 3 constructs (Fig. 2.2).

The involvement of iNOS and COX-2 was further investigated using the selective inhibitors of these enzymes,

1400W and NS398, respectively. In control TEVA, NS398 alone (Fig. 2.3A), 1400W alone (Fig. 2.3B) or in

67

combination (Fig. 2.3C) did not significantly modify the contraction induced by histamine. In TEVA treated with

MPs, NS398 (Fig. 2.3D) non-significantly shifted the histamine concentration-response curve to the right.

1400W (Fig. 2.3E) enhanced contraction to histamine but the difference was not statistically significant. Both

inhibitors (Fig. 2.3F) did not affect the contraction to histamine in MPs-treated TEVA although the response

appeared to be greater compared to control.

Figure 2.3 - Concentration-response curves to histamine of TEVA

Concentration-response curves to histamine of TEVA incubated for 24 h in absence (A, B, C) or presence of microparticles (MPs)

(D, E, F) at 10 g/ml. Before stimulation with histamine, TEVA have been incubated in absence or presence of the specific inhibitor of

COX-2 (NS398, 1 M) (A, D), of the specific inhibitor of iNOS (1400W, 100 M) (B, E) alone, or in combination (C, F). Values are

means ± SEM of 6 different experiments.

In control TEVM, the two inhibitors, 1400W and NS398, used alone or in combination failed to modify the

response to histamine (Fig. 2.4A, B, and C). In TEVM treated with MPs, either NS398 (Fig. 2.4C) or 1400W

(Fig. 2.4D) alone produced identical effects than those obtained in untreated TEVM. Concomitant treatment

with the two inhibitors (Fig. 2.4F) induced a non-significant increase of the contraction to histamine.

Both in control TEVMA and MPs-treated TEVMA, NS398 alone (Fig. 2.5A, D), 1400W alone (Fig. 2.5B, E) or in

combination (Fig. 2.5C, F) did not affect the response to histamine.

68

Figure 2.4 - Concentration-response curves to histamine of TEVM

Concentration-response curves to histamine of TEVM incubated for 24 h in absence (A, B, C) or presence of microparticles (MPs) (D,

E, F) at 10 g/ml. Before stimulation with histamine, TEVM have been incubated in absence or presence of the specific inhibitor of

COX-2 (NS398, 1 M) (A, D), of the specific inhibitor of iNOS (1400W, 100 M) (B, E) alone, or in combination (C, F). Values are

means ± SEM of 6 different experiments.

Figure 2.5 - Concentration-response curves to histamine of TEVMA

Concentration-response curves to histamine of TEVMA incubated for 24 h in absence (A, B, C) or presence of microparticles (MPs) (D,

E, F) at 10 g/ml. Before stimulation with histamine, the TEVMA have been incubated in absence or presence of the specific inhibitor

of COX-2 (NS398, 1 M) (A, D), of the specific inhibitor of iNOS (1400W, 100 M) (B, E) alone, or in combination (C, F). Values are

means ± SEM of 6 different experiments.

69

2.5.3. NO and O2- spin-trapping and Electron Paramagnetic Resonance

(EPR)

As illustrated on Figure 2.6A, MPs significantly decreased NO content in TEVA but not in TEVM or TEVMA.

With regard to O2-, MPs did not affect its release in TEVA and in TEVM but they significantly reduced these

species in TEVMA (Fig. 2.6B).

Figure 2.6 - Production of NO and ROS of the vascular constructs

Production of nitric oxide (A) and superoxide anion (B) in TEVA, TEVM, and TEVMA in absence (Control) or in presence of 10 µg/ml of

microparticles (MPs). Measured by EPR analysis using Fe2(II) diethyldithiocarbamate as a spin trap. * = P < 0.05 Values are means ±

SEM of 5 to 10 different experiments.

2.5.4. Western blot analysis

Western blot of NF-κB (Fig. 2.7A, D) showed that MPs affected differentially its expression in the three

constructs. Indeed, MPs significantly reduced NF-κB expression in TEVA whereas they markedly enhanced

the expression of the same protein in TEVM. Of note is the fact that MPs failed to alter NF-κB in TEVMA.

These data highlighted the interaction between the adventitia and the media with respect to NF-κB.

Interestingly, MPs did not modify COX-2 expression both in TEVA and TEVM (Fig. 2.7B), but they significantly

increased its expression in TEVMA. MPs did not modify the expression of iNOS in the three constructs

(Fig. 2.7C). eNOS was expressed at low levels in all constructs and its expression was not influenced by MPs

treatment. In contrast, nNOS was present in all 3 constructs. Following MPs treatment, nNOS expression was

not significantly modified both in TEVA and in TEVM. nNOS expression were 0.99 ± 0.37 and 1.17 ± 0.44 in

70

TEVA (n = 4) and 1.09 ± 0.44 and 1.45 ± 0.46 (n = 5) in TEVM in control and following MPs treatment

respectively expressed in arbitrary units by taking into account β-actin level.

Figure 2.7 - Western blot analysis of protein expression after MP treatment

Whole protein extract was separated on 8 percent SDS-PAGE and reveal using specific antibody raised against NF-κB (A), COX-2 (B),

iNOS (C). Band intensity was measured using a LAS3000 apparatus and normalised on β-Actin and compared with the same vessel

untreated as control. Control values are always 1.00. * = P < 0.05, values is mean ± SEM of 6 to 15 vessels.

2.6. Discussion

The role of each tunicae of blood vessel is difficult to assess on natural blood vessel since it is almost

impossible to mechanically separate a functional adventitia on which vasocontractile studies could be

performed. Thus, we took advantage of tissue engineering that allow the production of vascular constructs

comprising only one tunica (TEVM or TEVA) or two tunicae (TEVMA). The aim of the present study was to

investigate the role of the adventitia in the modulation of vascular tone by MPs comparing the response of

TEVA, TEVM, and TEVMA to histamine. The main results were that histamine was able to produce contraction

in the three constructs that was not affected by pharmacological blockade of iNOS and COX-2. MPs treatment

did not modify the response to histamine in the three constructs. MPs decreased both NF-κB expression and

NO production but did not affect O2- release in TEVA. In contrast, MPs enhanced NF-κB expression although

they did not affect iNOS and COX-2 expressions, NO and O2- release in TEVM. Finally, the ability of MPs in

enhancing NF-κB expression was abrogated in TEVMA although COX-2 expression was increased.

Interestingly, MPs reduced O2- release in TEVMA. Thus, MPs affected the release of NO, O2

-, NF-κB and

COX-2 expressions in subtle fashion in order to maintain the contractile response to histamine unchanged in

TEVA, TEVM and TEVMA.

71

TEVM, TEVA and TEVMA constructs were previously characterized by Laflamme et al..9 In addition to

histology confirmation of the origin of the explants, differences were observed in the time necessary for the

cells to migrate out of the explants, and in the expression of α-SM-actin. We extended this characterization in

the present study with the detection of calponin in the SMCs of the TEVM but not in the VFs of the TEVA. This

confirms the validity of these constructs as appropriate models of the media and the adventitia, respectively.

Laflamme et al.9 reported for the first time that a tissue-engineered vascular adventitia reconstructed with

vascular fibroblasts derived from human adventitia has the capacity of contracting and relaxing. Moreover, the

adventitia was able to modulate endothelin-induced vasoconstriction. Thus, the adventitia of a blood vessel

could play a greater role than expected in the modulation of blood vessel tone. The involvement of the

adventitia in regulation of vasomotor tone process may require the development of strategies allowing for the

administration of potentially active compounds not only targeting the media but also the outer layer of the

vessel wall. Moreover, our tissue-engineered vascular adventitia could also serve as a new model to study the

vascular function of the adventitia in various pathologies. Indeed, Kleschyov et al.21 have shown that the

adventitia is a powerful source of NO triggered by lipopolysaccharide in the rat aorta. This novel source of NO

has an important impact on vascular smooth muscle function and might be implicated in various inflammatory

diseases. In the present study, we extend previous findings by showing that TEVA also responded to

histamine although the contraction was weaker than that obtained in TEVM. The nature of the receptor

involved for this response was not determined but it probably belongs to H1 receptor subtypes found in

TEVM.14 In contrast to the response to endothelin, TEVA did not alter the response to histamine by the fact

that both the sensitivity and maximal contractile response to histamine were not significantly different in TEVM

and in TEVMA.

With regard to the effects of MPs, we recently reported the effect of T-lymphocytes MPs on mice aorta without

endothelium and in cultured human aortic smooth muscle cells. This type of MPs promotes vascular

hyporeactivity by inducing the production of vasodilatory mediators such as NO and PGI2. This effect resulted

in an upregulation of iNOS and COX-2 through NF-κB-dependent transcription via Fas/FasL pathway.6 In

contrast to this previous work, we found that MPs did not affect the response to histamine in the three

constructs (i.e. TEVA, TEVM and TEVMA) although they affect differentially the pathway linked to NF-κB

activation associated with iNOS and COX-2 expression and the resultant changes in both nitrosative and

oxidative stresses. With regard to TEVM, MPs were able to increase NF-κB expression but its increase did not

result in enhance nitrosative nor oxidative stresses.

Altogether, the effects of T-lymphocyte MPs are different depending on the vessel used (i.e. mice aorta and

human TEVM). These differences might be due either to species or to the phenotype of vessels. Further

72

studies will be necessary to distinguish among these possibilities. Nevertheless, our study shows that MPs can

also regulate the activation of NF-κB in human TEVM.

One of the important findings of the present manuscript was that MPs can act on TEVA in an opposite fashion

than on TEVM. Indeed, MPs reduced both NF-κB expression and NO production in TEVA. The reason and the

mechanism by which MPs produce such an effect were not directly tested. iNOS expression was not affected

by MPs treatment. eNOS was expressed at low levels in all constructs and its expression was not influenced

by MPs treatment. In contrast, nNOS was present in all 3 constructs. Following MPs treatment, nNOS

expression was not significantly modified both in TEVA and in TEVM. Thus, the lower level of NO found after

MPs treatment was not associated with reduced expression of either iNOS or nNOS. However, it cannot be

excluded that MPs rather reduced the activity of nNOS the regulation of which implied not only the calcium

signaling but also its association with regulatory proteins in the signaling complex; changes in intracellular

location of the enzyme and phosphorylation at the activator and inhibitory residues.22 Such an effect of the

same type of MPs has been reported on cultured endothelial cells with regard to eNOS.19 We found that MPs

reduced eNOS activity but not its expression via an increase of caveolin-1 expression and enhanced eNOS

phosphorylation on both activator and inhibitor sites, but the eNOS phosphorylation on the latter was higher

than in the former, resulting in a decreased of NO produced. Such an effect might occur in TEVA.

Nevertheless, the results underscore TEVA as one of the targets of MPs in which they can modulate vascular

function. The data also highlight an interaction between TEVA and TEVM inasmuch the ability of MPs in

enhancing NF-κB expression was abrogated in TEVMA. Beside, MPs reduced O2- release in TEVMA without

affecting the production of the same radical in TEVA and TEVM. Finally, COX-2 expression was increased in

TEVMA but not in the two other constructs. Recently, we found that MPs from preeclamptic, but not from

healthy pregnant women induced ex vivo vascular hyporeactivity to serotonin in human omental arteries and

mouse aortas.23 Preeclamptic MPs induced up-regulation of iNOS and COX-2 expressions, evoked NF-κB

activation, and enhanced oxidative and nitrosative stresses. Interestingly, the MPs originating most probably

from leukocytes were responsible for the COX-2 vasoconstrictor component of preeclamptic MPs, whereas

those of platelet origin were mainly involved in NO release. In the present study using TEVMA, we extend the

fact that T-lymphocyte MPs were able to enhance COX-2 expression although MPs did not affect contraction

to histamine in TEVMA despite the above changes. TEVA, TEVM or TEVMA are reconstructed from human

cells and they allow some experimental designs that otherwise could not be achieved, for example the

crosstalk between the adventitia and the media as reported in the present study and those from Laflamme et

al.9 with regard to endothelin.

73

2.7. Conclusion

In conclusion, results of this study obtained with a human tissue-engineered vascular adventitia reconstructed

with vascular fibroblasts suggest that the adventitia of a blood vessel could play a greater role than expected in

the modulation of vascular tone. The use of the three human vascular constructs also allows the study of the

interaction between vascular cells in response to vasoactive agents. Finally, they help for a better

understanding of the effect of MPs with respect to adventitia and media from human origin although some

differences are still present with regard to the phenotype of the media. Nevertheless, MPs regulate the

interplay between vasoconstrictor and vasodilator metabolites at least from COX-2 responsible for oxidative

and nitrosative stresses in human TEVA, TEVM and TEVMA.

2.8. Acknowledgements

We are grateful to the members of the LOEX and INSERM 771; CNRS UMR 6214 laboratories particularly to

Katleen Baker, Cindy Perron, Stéphanie Pouliot, Marie-Christine Fiola, Caroline Basoni, Charles Roberge and

Abdelali Agouni for their technical support. This work was supported by the Canadian Institutes for Health

Research (CIHR) and a France-Quebec Exchange Program from the Fonds de la Recherche en Santé du

Québec (FRSQ) and the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). J.-M.B. is

recipient of a studentship from FRSQ. L.G. is the holder of a Canadian Research Chair on Stem Cells and

Tissue Engineering from CIHR.

2.9. References

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74

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75

CHAPITRE 3

INTERLEUKIN-10 CONTROLS THE PROTECTIVE EFFECTS OF CIRCULATING MICROPARTICLES

FROM SEPTIC SHOCK PATIENTS ON TISSUE-ENGINEERED VASCULAR MEDIA

76

Interleukin-10 Controls the Protective Effects of Circulating Microparticles from Septic Shock Patients

on Tissue-Engineered Vascular Media

H. Ahmed Mostefai1, 2; Jean-Michel Bourget3; Ferhat Meziani2, 4, 5; M. Carmen Martinez1, 2;

Daniela Leonetti1, 2, 6; Alain Mercat2, 4, 5; Pierre Asfar2, 4, 5; Lucie Germain3; Ramaroson Andriantsitohaina1, 2, 6

1. LUNAM Université, INSERM UMR U1063, Université d’Angers, Angers, France;

2. SFR 4908, Université d’Angers, Angers, France;

3. Centre LOEX de l'Université Laval, Génie tissulaire et régénération: LOEX - Centre de recherche FRSQ du

Centre hospitalier affilié universitaire de Québec, and Département de Chirurgie, Faculté de Médecine,

Université Laval, Québec, QC, Canada;

4. LUNAM Université, UPRES EA 3859, Université d’Angers, Angers, France;

5. Département de Réanimation Médicale et de Médecine Hyperbare, Centre Hospitalo-Universitaire, Angers,

France;

6. Centre Hospitalo-Universitaire, Angers, France.

Avant-Propos

Ce chapitre présente la version manuscrite d’un article publié en 2013 dans la revue Clinical Science

(Jul 1;125(2):77-85) intitulé « Interleukin-10 Controls the Protective Effects of Circulating Microparticles from

Septic Shock Patients on Tissue-Engineered Vascular Media » par Hadj Ahmed Mostefai, Jean-Michel

Bourget, Ferhat Meziani, Maria Carmen Martinez, Daniela Leonetti, Alain Mercat, Pierre Asfar, Lucie Germain

et Ramaroson Andriantsitohaina.

Cet article présente les résultats d’une collaboration entre les laboratoires des Dre Germain au Québec et

Dr Andriantsitohaina en France. Les nombreux échanges entre les deux laboratoires ont été favorisés par le

programme de stage FRSQ-INSERM. Les expériences présentées dans cet article ont été réalisées et

analysées par Mostefai, Bourget, Martinez et Leonetti. Les vaisseaux reconstruits ont été fabriqués par

Bourget et les microparticules ont été isolées par Mostefai. Le manuscrit a été écrit par Martinez, Asfar,

Germain et Andriantsitohaina. Il a été révisé par Bourget et Germain. Meziani, Asfar et Mercat ont fourni les

microparticules de patients et recueilli les données cliniques. Leonetti a réalisé des expériences

supplémentaires pour les réponses aux questions des arbitres. Germain et Andriantsitohaina ont élaboré le

protocole expérimental.

77

3.1. Résumé

Le choc septique implique un débalancement des facteurs vasoconstricteurs et vasorelaxants qui cause un

état d’hypotension généralisé pouvant entraîner une dysfonction des organes et la mort du patient. Le taux de

microparticules (MP) retrouvé chez les patients en choc septique est plus élevé que chez les personnes

saines. Ces MP sont produites par les cellules activées et elles agissent comme des vecteurs de messages

intercellulaires pouvant influencer le tonus myogénique. Des résultats récents démontrent que cette

augmentation exerce un rôle protecteur sur la fonction vasculaire, chez les patients en choc septique, en

antagonisant l’hyporéactivité associée à cet état. La présente étude vise à déterminer les effets des MPs de

patients septiques (SMP) sur la réactivité vasculaire dans un modèle de media humaine reconstruite par génie

tissulaire.

Les media reconstruites à partir de cellules musculaires lisses de cordon ombilical ont été incubées avec des

SMP isolées du sang de 16 patients. La réactivité vasculaire, la production d’oxyde nitrique et d’anion

superoxyde ainsi que la quantification du niveau d’ARNm de différentes cytokines ont été évaluées.

Les SMP augmentent la contraction induite par l’histamine dans la media reconstruite. Cet effet n’était pas

associé avec une modification de facteurs inflammatoires. Par contre, l’ARN messager de l’interleukine-10

(IL-10) était augmenté. Nous avons ensuite déterminé si l’IL-10 était capable de bloquer l’hyporéactivité

associée à un traitement de la media aux lipopolysaccharides (LPS). Même si l’IL-10 seule ne modifie pas la

réponse contractile de la media, cette cytokine permet de rétablir la contraction dans les media traitées aux

LPS. Cet effet a été confirmé dans un modèle in vivo. L’injection de l’IL-10 chez la souris permet également de

bloquer l’hyporéactivité induite par les LPS, ce qui confirme le résultat trouvé à l’aide de la media humaine

reconstruite.

Ces résultats montrent une association entre la capacité des SMP à rétablir l’hyporéactivité induite par les LPS

et leur capacité à augmenter l’IL-10 dans une media humaine reconstruite par génie tissulaire. Ainsi, ces

résultats suggèrent un rôle protecteur des SMP, car elles tendent à restaurer la capacité contractile des

vaisseaux.

78

3.2. Abstract

During sepsis, inflammation can be orchestrated by the interaction between circulating and vascular cells, that

under activation, release microparticles (MPs). Recently, we reported that increased circulating microparticles

in septic patients play a pivotal role in ex vivo vascular function suggesting that they are protective against

vascular hyporeactivity. The present study was designed to investigate the effects of septic microparticles on

the contractile response of tissue-engineered vascular media (TEVM). TEVM that were composed of only a

media were produced by tissue engineering from human arterial smooth muscle cells isolated from umbilical

cord. TEVMs were incubated with microparticles isolated from 16 septic patients. Microparticles were extracted

from whole blood of septic subjects. TEVM were incubated for 24 h with microparticles and used for the study

of vascular contraction, direct measurements of nitric and superoxide anion production by electron

paramagnetic resonance and quantification of mRNA cytokine expressions. Septic microparticles increased

contraction induced by histamine in TEVM. This effect was not associated with inflammation, neither linked to

the activation of NF-κB pathway, nor to the increase of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2

expressions. In contrast, mRNA expression of interleukin-10 (IL-10) was enhanced. Then, we investigated the

effect of IL-10 on vascular hyporeactivity induced by lipopolysaccharide (LPS). Although IL-10 treatment did

not modify the contractile response in TEVM by itself, this interleukin restored contraction in LPS-treated

TEVM. In addition, IL-10 treatment both prevented vascular hyporeactivity induced by LPS injection in mice

and improved survival of LPS-injected mice. These findings show an association between the capacity of

septic microparticles to restore vascular hyporeactivity induced by LPS and their ability to increase IL-10 in the

tissue-engineered blood vessel model.

Keywords: Microparticle; sepsis; shock; nitric oxide; oxidative stress; inflammation.

79

3.3. Introduction

During severe sepsis, the cardiovascular system adopts a high cardiac output/low peripheral resistance

haemodynamic profile whose vascular component includes arterial dilatation [1, 2]. The increased cardiac

output and peripheral dilatation may improve tissue perfusion and probably contribute to protection against

multivisceral injury caused by sepsis. However, a prolonged or excessive drop in peripheral resistance may

also cause progressive hypotension refractory to catecholamines, and contribute to life-threatening

cardiovascular failure [3].

Recently, we reported that circulating levels of microparticles (MPs), membrane vesicles with procoagulant

and proinflammatory properties [for reviews see 4, 5], are elevated in patients with septic shock compared with

non-septic subjects [6]. Evidence of the physiological relevance of septic MPs in the regulation of vascular

contraction has been provided [6]. Surprisingly, septic MPs enhance, they do not reduce, the sensitivity of

contraction in response to serotonin (5-HT). This effect of MPs is linked neither to increased nitrosative nor

oxidative stress but is associated both with a mechanism sensitive to the thromboxane A2 receptor antagonist

and increased thromboxane A2 production. Thus, septic MPs may be protective in counteracting the drop in

peripheral resistance and progressive hypotension during severe sepsis under the experimental conditions

used [6]. These data confirm our previous studies, showing that contractile responses of small omental arteries

from septic patients are not significantly changed ex vivo despite the fact that they are removed from patients

whose peripheral resistance and blood pressure are dramatically reduced [7]. A hyperreactivity to agonists has

been shown in these arteries, which compensates for the increased production of nitric oxide (NO), in

conjunction with vasodilatory products from cyclooxygenase (COX) metabolites.

However, the cellular process and the mechanisms involved in the effect of MPs are not completely

understood. Moreover, the effect of septic MPs has been assessed ex vivo on mice aorta [6] but not on

vessels from human origin [8].

It is well accepted that the media of a blood vessel is responsible for the control of vasomotor tone by

contracting and relaxing in response to different hormonal factors released such as histamine and endothelin.

However, the study of vascular reactivity of media from native human vessels must take into account the

limited availability and intrinsic variability associated with individuals and therapies applied to patients from

whom the samples are taken. Interestingly, we have developed, using the self-assembly approach, a human

tissue-engineered blood vessel produced in vitro composed of the three tunicae of native blood vessels [9].

More simplified vascular constructs comprising solely one tunica, tissue-engineered vascular media (TEVM) or

tissue-engineered vascular adventitia (TEVA) can be produced from human smooth muscle cells or fibroblasts,

respectively. These tissue-engineered human vascular constructs possess characteristics of native blood

vessels such as agonist reactivity (bradykinin, endothelin, histamine and UTP) [9] and structure. Thus, they

80

allow the study of different pharmacological responses on human vascular constructs. Recently, we

demonstrated that apoptotic T lymphocyte MPs affect nitric oxide (NO), superoxide anions (O2-), nuclear factor

(NF)-κB and COX-2 in order to maintain the contractile response of human tissue-engineered vascular

constructs to histamine [8].

The aim of the present study was to investigate the effects of circulating MPs from patients with septic shock

on the regulation of vascular tone in response to histamine using TEVM. We took advantage of the self-

assembly method to produce human TEVM from vascular smooth muscle cells (SMCs) of human umbilical

artery. The cellular mechanism involved was further analyzed with respect to nitrosative and oxidative stresses

and the release of different cytokines.

Table 3.1 - Baseline characteristics of septic patients.

Sex ratio (M/W) 8/8

Age (years) 65 ± 13

Body mass index (kg/m2) 27 ± 8

Simplified Acute Physiology Score II 53 ± 16

SOFA 11 ± 3

Mean infusion rate of norepinephrine (mg/h) 2.6 ± 1.9

Mortality at 28 days 2/16

Total microparticles/µl plasma 12437 ± 3863

Platelet microparticles (%) 80 ±7

Leukocyte microparticles (%) 1 ± 0.2

Endothelial microparticles (%) 2.5 ± 0.5

Erythrocyte-derived microparticles (%) 2.2 ± 0.5

Source of infection

Pulmonary

Abdominal

Urinary tract

Soft and skin tissues

Unknown

6

5

2

2

1

Type of infection

Gram-positive

Gram-negative

Unknown

5

5

6

3.4. Materials and Methods

3.4.1. Patients and MP preparation

This study was approved by the Ethics committee of the Société de Réanimation de Langue Française. Septic

shock was defined according to standard criteria of American College of Chest Physicians/Society of Critical

Care Medicine/European Society of Intensive Care Medicine/American College of Chest Physicians/Surgical

Infection Society [9]. Baseline characteristic of patients with septic shock (n=16, male: 50%, female: 50%) are

81

shown in Table 3.1. Patients with preexistent chronic inflammatory disease, diabetes mellitus, obesity (Body

mass index > 35), and cancer or leuko-neutropenia were not included. Some patients had statin treatment and

three anti-coagulant medications. During hospitalization, all patients had heparin treatment. Also, the sources

of sepsis are shown in Table 3.1.

Peripheral blood (20 ml) from septic patients was collected during the early phase of septic shock (10 ± 4 h

after enrollment in the intensive care unit) from the arterial line and was processed for assay within 2 h.

Samples were centrifuged for 10 min at 170 g, and the plasma supernatant was then harvested and

centrifuged 20 min at 1,500 g to obtain platelet-free plasma (PFP). A portion (200 µl) of PFP were frozen and

stored at –80°C until subsequent use. As previously described [6], remaining PFP was subjected to three

series of centrifugations at 21,000 g for 45 min each, in order to eliminate plasma and to pellet MPs for in vitro

studies, and supernatant was replaced by 0.9 % saline. Finally, MP pellets were resuspended in 200 μl of

0.9 % saline and stored at 4°C until subsequent use. Levels of endotoxin were assessed in all MP

preparations with the Limulus amebocyte lysate kit QCL-1000 (Lonza, Verviers, Belgium) and were found to be

below the lower detection limit of the kit (<0.1 endotoxin U/ml). Membrane MP subpopulations were

discriminated in PFP according to the expression of membrane-specific antigens and samples were analyzed

by flow cytometry using a Cytomics FC 500 MPL (Beckman Coulter, Villepinte, France) with the MXP software

(Beckman Coulter). The total MPs concentration was determined by flow cytometry, as previously described

[6].

3.4.2. Tissue culture

Human arterial SMCs were isolated by the explant method of Ross as described before [7] from umbilical cord

obtained following informed consent of the mother. Briefly, arteries from umbilical cords were slit longitudinally

and the endothelium was removed by scrubbing with gauze. Strips of the media were dissected, cut in small

sections and placed in a gelatin-coated and prewetted petri dish, to allow their attachment to the plastic.

Explants were cultured in Dulbecco's modification of Eagle's medium-Ham's F12 modified medium (DMEM-

Ham ratio 3:1) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 20% fetal bovine serum (FBS) (HyClone, Logan, UT) and

antibiotics (100 U/ml penicillin and 25 μg/ml gentamicin). After two weeks of culture, SMCs migrated from the

explants and proliferated. Two weeks later, the cells were trypsinized and plated at a density of 104 viable

cells/cm2 in tissue culture flasks and maintained at 37°C in a humidified atmosphere (8% CO2).

3.4.3. Production of tissue-engineered vascular constructs

Tissue-engineered vascular construct composed of only a media (TEVM) was produced using the tissue

engineering method previously described [10,11]. Briefly, human artery SMCs were cultured in DMEM-Ham’s

(3:1) supplemented with 30% FBS, 20 μg/ml Endothelial Cell Growth supplement (Calbiochem, EMD

82

Biosciences, La Jolla, CA), antibiotics and 50 μg/ml sodium ascorbate (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada)

to promote extracellular matrix assembly. After 10 to 15 days of culture, cells have formed thick living tissue

sheets, comprising cells embedded in the extracellular matrix they secreted. These sheets can be peeled off

from the culture flask, using fine forceps, to be rolled. TEVM construct was obtained by wrapping a tissue

sheet around a tubular support (diameter of 4.5 mm) resulting in a four-layer-thick media construct containing

contractile SMCs. This construct was maturated for 21 days in DMEM-Ham (3:1) supplemented with 10%

bovine serum (FetalClone II, HyClone), antibiotics and 50 μg/ml sodium ascorbate.

3.4.4. TEVM treatment with MPs and contraction experiments

After the 21 days maturation, TEVM were cut in two, while remaining on the tubular support, and each half

were incubated with either medium (DMEM-Ham’s supplemented with 10% bovine serum and antibiotics) or

the same medium plus MPs at the circulating levels of MPs detected in the blood of each patient (range: 1,417

- 48,190 MPs/µl of plasma), as previously described [6, 12]. It should be noted that independently of the

circulating level, all septic MPs displayed hyper-reactivity in aortic rings [6]. After 24 h of incubation at 37°C in

a humidified atmosphere (8% CO2), each half were cut into 4 mm-long rings and processed for assays as

described in the following sections.

Rings of TEVM were removed from their respective tubular support used for culture and rinsed in physiological

salt solution (Krebs solution in mM): 119 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 1.2 MgSO4, 2.5 CaCl2, and

10 glucose. Rings were separately mounted in isolated organ baths containing Krebs solution maintained at

37°C and gassed with a mixture of 95% O2, 5% CO2 (pH 7.4). They were set up between 2 L-shaped wires for

isometric force measurements (Radnoti, Harvard Apparatus, Montréal, Canada). After being mounted, each

ring was equilibrated for 30 min before being passively stretched with a preload of 500 mg. During the next 60

min, each tissue was rinsed 3 times and tension was readjusted until a stable tension of 500 mg was

observed. TEVM were challenged with increasing concentrations of histamine (Sigma-Aldrich) from

10 nM-100 μM in absence or presence of either the inducible NO synthase (iNOS) inhibitor, compound 1400W

(100 μM, Calbiochem, Meudon, France), or the COX-2 inhibitor, NS398 (1 μM, Calbiochem) alone or in

combination.

In another set of experiments, TEVM was incubated in presence or absence of lipopolysaccharide (LPS,

10 μg/mL, Sigma-Aldrich). To assess the effect of human recombinant interleukin-10 (IL-10), the same

experimental conditions were conducted in the presence of IL-10 (300 ng/mL, Peprotech, Rocky hill, NJ) alone

or in combination with LPS. After 24 h of incubation at 37°C in a humidified atmosphere (8% CO2), rings were

obtained for measurements of vascular reactivity as described above.

83

3.4.5. Mouse model of LPS-induced endotoxic shock and contraction

experiments

LPS (from Escherichia coli 055:B5; Sigma-Aldrich) was administrated at a dose of 150 mg/Kg i.p. Control mice

received equivalent volume of vehicle (0.9% NaCl solution). In the other two groups, each mouse was

administered (i.p.) 1 µg/mouse recombinant IL-10 (Peprotech) alone or 1 h prior to LPS treatment.

Segments of aortic rings (2 mm) with functional endothelium were mounted on a myograph filled with Krebs

solution, 4 hours after treating the mice with saline, LPS, IL-10 or combination of IL-10 and LPS. The integrity

of the endothelium was studied by using acetylcholine (1 µM) in the in aortas precontracted with U46619

(0.1 µM, Sigma-Aldrich). Concentration-response curves were constructed by cumulative application of

serotonin (5-HT, 3 nM-10 µM; Sigma Aldrich) to vessels with functional endothelium.

3.4.6. NO spin-trapping and Electron Paramagnetic Resonance (EPR)

studies

NO content was assayed, after formation of EPR-detectable [Fe(II)NO (diethyldithiocarbamate)2]

([Fe(II)-NO(DETC)2]) in rings of TEVM. Samples were placed in 24-well clusters filled with 250 μl of Krebs

solution and then treated with 250 μl of colloid Fe(DETC)2 (0.5 mM, Sigma-Aldrich) and incubated at 37°C for

1 h. After the incubation, the samples were rapidly frozen and kept in liquid nitrogen (N2) until EPR

measurements. These studies were performed using a table-top x-band spectrometer Miniscope (Magnettech,

Berlin, Germany). Recording were made at 77°K using a Dewar flask. Instrument settings were 10 mW of

microwave power, 1 mT of amplitude modulation, 100 kHz of modulation frequency, 60 s of sweep time and 5

scans. After EPR measurements, the rings were dried and weighted. The relative [Fe(II)-NO(DETC)2]

concentrations were determined by dividing the third component amplitude of the three-lines EPR signal by the

weight of the dried sample [6, 8, 12].

3.4.7. Superoxide anion spin-trapping

Rings of TEVM were allowed to equilibrate in deferoxamine-chelated Krebs-HEPES solution (pH 7.4)

containing 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl 2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin (CMH, 500 μM, Noxygen, Denzlingen,

Germany), deferoxamine (25 μM, Sigma-Aldrich) and DETC (5 μM, Sigma-Aldrich) under constant

temperature (37°C) for 60 min. The reaction was stopped by placing samples on ice. They were frozen in

liquid N2 and analyzed in a Dewar flask by EPR as previously described [6, 12].

3.4.8. Western blotting

Western blots were performed as previously described [6, 12]. Protein extracts were prepared by

homogenization of rings of TEVM in a lysis buffer containing (50 mM Tris, 250 mM NaCl, 8 mM MgCl2,

84

1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 2 mM NaVO3, 10 μg/ml each of aprotinin, leupeptin and pepstatine

and 1% Triton X-100). Samples were centrifuged at 14,000 g for 10 min and the supernatants were transferred

to microcentrifuge tubes and maintained in an ice-bath for immediate use. Protein concentration was

determined using the Bradford method. Approximately 70 μg of total protein from supernatant fractions were

separated on 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to nitrocellulose

membranes to be probed with antibodies against iNOS, neuronal NO synthase (nNOS), COX-1, COX-2

(BD Transduction Laboratories, Montluçon, France), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK), IκB subunit (PI-κB)

α-phosphorylated (US Biological, Swampscott, MA) and β-actin (Sigma-Aldrich).

3.4.9. Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

(qRT-PCR)

Rings of TEVM were frozen in liquid N2 and used to investigate the mRNA expression of 24 transcripts [CCR

(CC chemokine receptor) 3, CCR5, CCR6, CXCR (CXC chemokine receptor) 3, CXCR4, gp130, ICAM-1

(intercellular adhesion molecule-1), IKK (IκB kinase) α, IKKβ, IL-10, IL-17, IL-1α, IL-31, IL-6, IL-8, IFNβ

(interferon β), IRAK1 (IL-1-receptor associated kinase 1), IL-1β, MCP (monocyte chemoattractant protein), MIP

(macrophage inflammatory protein) 1α, MIP3α, MIP3β, SDF1 (stromal-cell-derived factor 1) and TNFα (tumour

necrosis factor α)] related to inflammation by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction

(qRT-PCR). qRT-PCR analyses were carried out by Service Commun de Cytométrie et d’Analyses

Nucléotidiques from Angers University, using a Chromo 4™ (Bio-Rad, Hercules, CA) and SYBR Green

detection. Primers were designed using Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/primer3) [13]. Quantifications

were realized according to the delta Ct method and the relative gene-expression levels were normalized using

the geometric mean of three housekeeping genes as previously described [14].

3.4.10. Data Analysis

Data are presented as mean + SEM, and n represents the number of rings or samples. Statistical analyses

were performed as appropriate by unpaired Student's t-test or two-way analysis of variance (ANOVA) for

repeated measures with a subsequent Bonferroni post hoc test. P < 0.05 was considered to be statistically

significant.

3.5. Results

3.5.1. MPs increased the contraction in response to histamine in TEVM

Histamine induced a concentration-dependent contraction in TEVM treated or not with MPs. Interestingly, the

contraction induced by histamine was significantly increased in TEVM treated with MPs from septic shock

patients (Figure 3.1A).

85

Figure 3.1 - Treatment with MPs increased the reactivity of TEVM to histamine

(A) Concentration–response curves of TEVM incubated for 24 h in the absence (CTL) or presence of MPs. Production of NO (B) and

O2- (C) in TEVM in the absence (CTL) or in the presence of MPs. *P<0.05 and ***P<0.001. Values are expressed as means ±

S.E.M. for 5–8 vessels.

Figure 3.2 - Treatment with MPs increased COX-1 expression

Western blot analysis of protein expression in TEVM after MP treatments. Whole protein extract was separated by SDS/PAGE

(8% gels), transferred on to nitrocellulose and probed using specific antibodies raised against NF-κB p65 (A), pIκB (B), iNOS (C),

nNOS (D), COX-2 (E) and COX-1 (F). Band intensities were normalized on β-actin and presented in arbitrary units (A.U.). *P<0.05.

Values are expressed as means ± S.E.M. for 6–10 vessels

86

TEVM treated or not with MPs, exhibited an EPR feature of signals derived from NO-Fe(DETC)2 following

incubation with Fe(DETC)2 (data not shown). As illustrated on Figure 3.1B, MPs significantly decreased NO

content in TEVM compared to control. Measurement of O2- production showed that MPs significantly reduced

its production in TEVM compared to control (Figure 3.1C). These results suggest that MPs from septic shock

patients enhanced histamine-induced contraction in TEVM and that this effect is associated with a decrease in

both NO and O2- productions. Next, we tested the hypothesis whether the ability of MPs from septic shock

patients to increase histamine-induced contraction was mediated by down regulation of inflammatory pathway

involving NF-κB, phosphorylated IκBα (pIκBα), iNOS or COX-2. Control TEVM expressed NF-κB, pIκBα, iNOS

and COX-2 (Figure 3.2A, B, C and E). Treatment of TEVM with MPs from septic shock patients did not modify

the expression of NF-κB, iNOS, COX-2 and the phosphorylation of IκBα. Besides, septic MPs did not affect the

expression of nNOS (Figure 3.2D) but they significantly increased the expression of COX-1 (Figure 3.2F).

Altogether, the ability of MPs from septic shock patients in potentiating the response to histamine was not

linked to vascular inflammation associated with increased NF-κB; IκBα phosphorylation, iNOS and COX-2

expressions. In contrast, the expression of COX-1 was increased in MP-treated TEVM.

3.5.2. MPs enhance interleukin-10 (IL-10) mRNA expression in TEVM

The possible regulation of tissue expression and release of inflammatory mediators by TEVM treated with MPs

from septic shock patients was further evaluated. Most of the inflammatory mediators were not affected by

septic MPs including IL-1α, IL-1β, IL-6, IKKβ and ICAM-1 as assessed by qRT-PCR (not shown). Surprisingly

among the 24 inflammatory-related transcripts tested (see the Materials and methods section), MPs from

septic shock patients drastically increased (~ 4,000 fold) the expression of IL-10 mRNA in TEVM when

compared to control untreated TEVM (Figure 3.3).

Figure 3.3 - Treatment with MPs increased mRNA expression of IL-10

qRT–PCR analyses were performed to determine the effect of MPs on mRNA for 37 transcripts related to inflammation in TEVM.

Expression of target transcripts was compared with the expression of 3 housekeeping genes. MPs increased mRNA expression of

IL-10 compared with untreated vessels (CTL). ***P<0.001. Results are given as means ± S.E.M. for 4–6 independent experiments.

87

Therefore, we tested the effect of IL-10 on the regulation of contraction in TEVM. First, we reproduced an in

vitro experimental model of endotoxic shock in TEVM using LPS treatment. As expected, LPS treatment

significantly reduced the contraction induced by histamine in TEVM when compared to control, highlighting

LPS-induced vascular hyporeactivity in this preparation (Figure 3.4A). In control TEVM, IL-10 treatment alone

did not significantly modify the response to histamine (Figure 3.4B). Interestingly, IL-10 significantly enhanced

histamine-induced contraction in LPS-treated TEVM towards that of control vessels (Figure 3.4C).

Figure 3.4 - IL-10 treatment restored LPS-induced hyporeactivity in TEVM

Concentration–response curves to histamine of TEVM rings treated with LPS alone (A), IL-10 alone (B) or in combination (C) compared

with control (CTL). *P<0.05. Values are expressed as means ± S.E.M. of 4–7 vessels.

Figure 3.5 - IL-10 treatment reversed LPS-induced increase of NO in TEVM

Quantification of the amplitude of NO-Fe(DETC)2 (A) and O2--CMH (B) signals in TEVM treated with LPS alone or in the presence of IL-

10. *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with LPS. Values are expressed as units/mg of dried vessel mass (n=4).

Altogether, these data show an association between the ability of septic MPs to enhance both the contraction

to histamine and the production of IL-10 in TEVM, and the capacity of this cytokine to correct vascular

hyporeactivity induced by LPS. Beside, LPS significantly increased NO production in TEVM that was

88

prevented upon IL-10 treatment (Figure 3.5A). LPS treatment did not induce a statistically significant increase

of O2- in TEVM compared to control (Figure 3.5B). Under these experimental conditions, O2

- levels decreased

in TEVM treated with both LPS and IL-10 compared to control. IL-10 had a significant effect on NO but no

effect on O2- in LPS-treated TEVM.

3.5.3. IL-10 treatment protects mice from LPS induced shock

We assessed the effect of LPS injection on survival of mice either alone or in combination with IL-10

(1 µg/mouse). Mice were subjected to i.p. injection of LPS (150 mg/kg) and survival was assessed during the

following 36 hours. All of LPS-treated mice died 30 hours after of LPS injection; however, 50% of IL-10 plus

LPS-injected mice survived at the same time (Figure 3.6A). Interestingly, IL-10 alone had no effect on survival.

3.5.4. IL-10 treatment prevented vascular hyporeactivity induced by LPS

injection in mice

Finally, it was important to test whether IL-10 prevents LPS-induced vascular hyporeactivity. Mice were

systemically injected with saline, IL-10, LPS or the combination of IL-10 and LPS, then, aortic rings from

treated animals were mounted on a myograph and mechanical activity in response to the vasoconstrictor

agonist serotonin was recorded. Vascular reactivity to serotonin was decreased in vessels from LPS-treated

mice compared with those taken from mice treated with saline or with IL-10 alone (Figure 3.6B, C).

Interestingly, IL-10 completely prevented the vascular hyporeactivity induced by LPS (Figure 3.6D).

Figure 3.6 - IL-10 treatment prevented LPS-induced death and hyporeactivity in aortic rings from mice

(A) Survival curves of mice during 36 h after IL-10, LPS or IL-10 plus LPS injection. *P<0.05. (B–D) Concentration–response curves to

5-HT of aortic rings from mice treated with LPS alone (A), IL-10 alone (B) or in combination (C) compared with control (CTL). *P<0.05.

Values are expressed as means ± S.E.M. for five mice for each group.

89

3.6. Discussion

The main results of the present study were that septic MPs were able to increase contraction induced by

histamine and reduce NO and O2- production in TEVM. These effects were not associated with the activation

of the NF-κB pathway, changes in nNOS, iNOS or COX-2 expressions. Interestingly, septic MPs enhanced

COX-1 expression.

One of the most important finding was the ability of septic MPs to dramatically increase the expression of IL-10

mRNA considering that recombinant IL-10 itself prevented the vascular hyporeactivity induced by LPS in

TEVM. These effects were linked to the capacity of IL-10 to reduce nitrosative stress in this model. Altogether,

these results strengthened both the relevance of MPs from septic shock patients in the regulation of vascular

contraction in human TEVM and the fact that these MPs enhanced the contraction in response to histamine.

Furthermore, they highlight an association between the ability of septic MPs to increase IL-10 from TEVM and

the capacity of IL-10 to normalize the vascular hyporeactivity induced by LPS in TEVM. Pathophysiological

relevance of these data is provided by the ability of IL-10 both to prevent vascular hyporeactivity induced by

LPS injection into mice and the improvement of survival upon LPS treatment.

In the present study, our expertise in the production of TEVM, exclusively composed of human cells embedded

in the extracellular matrix they secreted, was used to perform pharmacological studies. We have already

demonstrated that TEVM display fundamental histological, functional, and many pharmacological

characteristics of human artery from which they were originally isolated [15, 16]. Moreover, the use of tissue-

engineered constructs composed of an adventitia, a media or the combination of both lead to better

understandings of the effects of MPs from apoptotic T lymphocytes in the modulation of vascular tone [8]. In

the present study, only TEVM was used as it is accepted that the media of a blood vessel is responsible for the

control of vasomotor tone by contracting and relaxing in response to the release of different hormonal factors

such as histamine.

We recently found an increase in the number of circulating MPs in septic patients, and also, in the capacity of

these MPs to enhance the sensitivity of contraction in response to 5-HT without affecting endothelium-

dependent vasodilatation on mouse aorta [6] indicating that MPs are not involved in the reduction of the

vasoconstriction. Thus, septic MPs might participate as a protective mechanism counteracting vascular

hyporeactivity in this disease. Results obtained in the present study further support this conclusion. Actually,

MPs isolated from patients exhibiting the similar baseline characteristics of septic patients used in our previous

study [6], also increased the contraction induced by histamine in human TEVM. These data not only confirm

the validity of TEVM as a model to study the effect of MPs from septic patients on human media but they also

strengthened the fact that septic MPs are probably the biological vector that regulate contraction in an identical

manner to that observed in arteries taken from septic shock patients.

90

We showed here that septic MPs reduced oxidative stress in TEVM. In our previous study performed ex vivo

on mouse aorta, septic MPs did not affect O2- production although they significantly reduced the expression of

the NOX-4 subunit of NADPH oxidase [6]. Both studies are in accordance with the fact that septic MPs might

not be responsible for the increase in oxidative stress in the vessel wall during sepsis. Possible explanations

for the different results obtained in TEVM and mouse aorta could be due to species specific (human versus

mice), and/or specific to the origin of vessels (umbilical arteries versus aorta), however we cannot distinguish

among these possibilities. Nevertheless, only the media (TEVM) was used compared with aorta which is

composed of the three tunicae: adventitia, media and intima. This is of importance inasmuch as we recently

highlighted an interaction between engineered tissues composed of the adventitia (TEVA) and TEVM. Indeed,

the ability of T lymphocyte MPs to regulate O2- production is different depending on the constructs used TEVA,

TEVM or both [8].

Sepsis, like other inflammatory conditions, results in the synthesis of inflammatory mediators during the acute

phase, including NO from iNOS and COX-2 metabolites under the activation of NF-κB. Such an effect might

lead to intense vasodilatation, and subsequent potential hypotension such as that observed in severe sepsis.

Previously, Mortaza et al. [17] have shown that injection of MPs from septic rats induces iNOS and oxidative

stress in aorta and heart of rats receiving MPs. However, we have shown that injection of septic MP into mice

does not affect either aortic NF-κB, iNOS, COX-2 expressions or NO production [6]. Consistent with these

results, treatment of TEVM with septic MPs did not modify NF-κB, IκBα phosphorylation, iNOS and COX-2

expressions. Under these experimental conditions, septic MPs reduced NO content in TEVM. Moreover,

pharmacological blockade of either iNOS with compound W1400 or COX-2 with NS-398, alone or in

combination, did not modify the capacity of septic MPs to enhance the contraction to histamine in TEVM (data

not shown). Altogether, these data demonstrate once again that septic MPs are not the biological vectors that

trigger vascular inflammation linked to nitrosative stress and increased COX-2 metabolites during severe

sepsis.

However, one has to take into account that septic MPs increased COX-1 expression in TEVM. In our previous

study, MPs from septic shock patients increased sensitivity to vasoconstrictor as a consequence of increased

thromboxane A2 production from COX-1 [6] although no change in COX-1 expression was observed. Thus, it

might be possible that increased thromboxane A2 also occurs in TEVM treated with septic MPs. Further

studies are needed to determine whether the increase in COX-1 expression is associated with enhanced

release of thromboxane A2 in TEVM.

Finally, we analyzed the expression of different genes, in septic MP-treated TEVM, by qRT-PCR. Surprisingly,

among the 24 transcripts tested, septic MPs increased IL-10 mRNA expression by 4,000 folds in TEVM

compared to untreated TEVM control. Indeed, IL-10 is known to be an anti-inflammatory cytokine. Previous

91

studies suggest that IL-10 limits the increase in O2- and protects against endothelial dysfunction following LPS

treatment in vivo or during diabetes [18-20]. In several animal models of sepsis, neutralization of IL-10 results

in exaggerated pro-inflammatory cytokine expression and death, while administration of recombinant IL-10

confers significant therapeutic protection [21-23]. Here, as expected, LPS induced hyporeactivity in TEVM.

Interestingly, IL-10 treatment of TEVM completely restored vascular hyporeactivity induced by LPS and

improved survival in LPS-induced mortality in mice. The mechanisms associated with the prevention of

vascular hyporeactivity induced by LPS, in the presence of IL-10 were further studied in terms of NO

production. Indeed, it is accepted that LPS induces vascular hyporeactivity by increasing iNOS expression and

NO production [24]. In the present study, increased NO production in TEVM by LPS was completely prevented

by IL-10 treatment. Furthermore, IL-10 abrogated oxidative stress induced by LPS. Taken together, these

findings support the view that septic MPs are able to restore normal reactivity following administration of LPS

in vivo and provide evidence that IL-10 might be the mediator implicated in the protective effects of septic MPs

on vasomotor function during sepsis.

3.7. Conclusion

Results from our recent study and the present data strengthen the hypothesis that septic MPs might be the

vector able to counteract the increased production of NO and vasodilator COX metabolites observed in

vessels from septic shock patients through both their anti-inflammatory effects and increase of vasoconstrictor

metabolites. However, the link between the ability of septic MPs to increase IL-10 production (the present

study) and thromboxane A2 release (our former study) [6] needs to be validated. Nevertheless, the results

from both TEVM and mice aorta reinforce the fact that septic MPs may rather be protective against vascular

hyporeactivity in order to maintain a tonic pressor response in the early phase of septic shock. Finally, they

also confirm the usefulness of the TEVM model for a better understanding of the effect of septic MPs on

human media in order to unravel their mechanism of action.

LIMITS OF THE STUDY

We have used TEVM which are exclusively composed of human smooth muscle cells embedded in the

extracellular matrix they secreted. Although these engineered vessels have been largely used to perform

pharmacological studies [10, 11, 15, 16], they are not representative of the whole vessel. It should be noted

that both LPS-treated TEVM and aortic rings from mice treated with LPS display the same hyporeactivity, and

in both experimental conditions, IL-10 was able to restore contraction. Thus, it is plausible to postulate that IL-

10 acts on smooth muscle cells rather than other cell types of the vascular wall vessel. Nevertheless, one can

advanced the hypothesis that IL-10 release might participate in the vascular effects of septic MPs.

92

CLINICAL PERSPECTIVES

Septic MPs may, rather, be protective in counteracting the drop in peripheral resistance and progressive

hypotension during severe sepsis under the experimental conditions used. These results may also explain the

fact that increased levels of MPs may predict a more favorable outcome in severe sepsis in terms of mortality

rate and organ dysfunction.

More interestingly, these data bring experimental basis in support of the observation that administration of

recombinant IL-10 confers significant therapeutic protection to limits the increase oxidative stress,

inflammation and vascular dysfunction in septic patients.

3.8. Acknowledgements

This work was supported by institutional grants from Fonds Européen pour le Développement Régional

[n° 8891], INSERM and Université d’Angers and by grants from the Canadian Institutes of Health Research

(CIHR) to L.G. This work was also supported by Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) -

INSERM program for short-term exchanges. R.A. was supported by a Contrat d’Interface INSERM. H.A.M. is

recipient of a doctoral fellowship from Conseil Régional du Pays de la Loire and J.M.B. from FRSQ and CIHR

(Banting and Best doctoral fellowship). L.G. holds a Canadian Research Chair on Stem Cells and Tissue

Engineering from CIHR. D.L. was supported by the Centre Hospitalo-Universitaire, Angers, France.

The authors declare no conflict of interest.

3.9. References

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95

CHAPITRE 4

HUMAN FIBROBLAST-DERIVED ECM AS A SCAFFOLD FOR VASCULAR TISSUE ENGINEERING

96

Human Fibroblast-Derived ECM as a Scaffold for Vascular Tissue Engineering

Jean-Michel Bourget1; Robert Gauvin1,2; Danielle Larouche1; Amélie Lavoie1; Raymond Labbé1,3;

François A. Auger1; Lucie Germain1.

1. Centre LOEX de l'Université Laval, Génie tissulaire et régénération : LOEX - Centre de recherche FRQS

du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec, and Département de Chirurgie, Faculté de Médecine,

Université Laval, Québec, QC, Canada;

2. Current address: Defense R&D Canada, Valcartier, QC, Canada;

3. Service de chirurgie vasculaire, CHU de Québec, Québec, QC, Canada.

Avant-Propos

Ce chapitre présente la version manuscrite d’un article publié en 2012 dans la revue Biomaterials

(Dec;33(36):9205-13) intitulé « Human Fibroblast-Derived ECM as a Scaffold for Vascular Tissue

Engineering » par Jean-Michel Bourget, Robert Gauvin, Danielle Larouche, Amélie Lavoie, Raymond Labbé,

François A. Auger et Lucie Germain.

Les travaux présentés dans cet article ont été réalisés par Bourget et Gauvin sous la supervision des Drs

Germain et Auger. Le manuscrit a été écrit par Bourget et révisé par Gauvin, Larouche, Lavoie et Germain. Le

Dr Labbé a fourni les veines saphènes humaines desquelles proviennent certaines des populations de

fibroblastes et a révisé le manuscrit.

97

4.1. Résumé

Les substituts vasculaires reconstruits par génie tissulaire sont une approche prometteuse pour le

remplacement d’artères de petits diamètres comme l’artère coronaire. La technique d’auto-assemblage permet

de produire des substituts vivants à partir de cellules autologues, sans utiliser d’échafaudage préexistant.

Dans le but d’améliorer les propriétés mécaniques et de réduire le temps nécessaire à la production de ces

substituts, nous avons créé des échafaudages de matrice extracellulaire par auto-assemblage. Ceux-ci ont

ensuite été ensemencés avec des cellules musculaires lisses (CML) pour produire une media reconstruite

(TEVM de l’anglais tissue-engineered vascular media).

Pour fabriquer ces échafaudages, des fibroblastes dermiques ou de veine saphène ont été cultivés 3

semaines en présence d’acide ascorbique pour permettre la formation de feuillets cellulaires. Ceux-ci ont

ensuite été traités à l’eau déminéralisée stérile, pour produire un feuillet de matrice extracellulaire décellularisé

(dMS de l’anglais decellularized matrix scaffold). Les dMS ont été ensemencés avec des CML humaines, puis

roulés autour d’un mandrin cylindrique pour former une media reconstruite enrichie en matrice extracellulaire

(nTEVM de l’anglais new TEVM). Les propriétés mécaniques et la capacité contractile ont été comparées à la

technique standard de reconstruction de media par auto-assemblage (sTEVM de l’anglais standard TEVM).

Les nTEVM produits avec des CML vivantes sur les dMS de fibroblastes dermiques (nTEVM-DF de l’anglais

dermal fibroblasts) ou de veine saphène (nTEVM-SVF de l’anglais saphenous vein fibroblasts) se sont révélés

respectivement 5,6 et 3,8 fois plus résistants à la traction que les sTEVM. Leur capacité contractile était

améliorée et l’analyse histologique des constructions met en évidence une matrice extracellulaire dense et

cohésive pour les nTEVM. De plus, le temps requis pour produire un substitut, à partir de l’extraction des

cellules du patient, a été réduit de 2 semaines par rapport aux sTEVM.

Cette nouvelle technique de fabrication de substituts de media améliore les propriétés mécaniques et réduit le

temps de production sans introduire de matériel non biologique. De plus, elle permet de produire des

substituts de media à partir des cellules de n’importe quel patient, afin de leur fournir des prothèses

vasculaires.

98

4.1. Abstract

The self-assembly approach is based on the capability of mesenchymal cells to secrete and organize their own

extracellular matrix (ECM). This tissue engineering method allows for the fabrication of autologous living

tissues, such as tissue-engineered blood vessels (TEBV) and skin. However, the secretion of ECM by smooth

muscle cells (SMCs), required to produce the vascular media, may represent a long process in vitro. The aim

of this work was to reduce the time required to produce a tissue-engineered vascular media (TEVM) and

extend the production of TEVM with SMCs from all patients without compromising its mechanical and

functional properties. Therefore, we developed a decellularized matrix scaffold (dMS) produced from dermal

fibroblasts (DF) or saphenous vein fibroblasts (SVF), in which SMCs were seeded to produce a TEVM.

Mechanical and contractile properties of these TEVM (referred to as nTEVM) were compared to standard self-

assembled TEVM (sTEVM). This approach reduced the production time from 6 to 4 weeks. Moreover, nTEVM

were more resistant to tensile load than sTEVM and their vascular reactivity was also improved. This new

fabrication technique allows for the production of a vascular media using SMCs isolated from any patient,

regardless of their capacity to synthesize ECM. Moreover, these scaffolds can be stored to be available when

needed, in order to accelerate the production of the vascular substitute using autologous vascular cells.

Keywords: Tissue engineering; decellularization; blood vessel; smooth muscle cells; mechanical properties;

vasoconstriction.

99

4.2. Introduction

Cardiovascular diseases are responsible for approximately one third of annual fatalities in the USA [1].

Coronary artery bypass graft (CABG) procedures have been performed more than 160,000 times in 2009 with

a mean hospital charge of 117 thousand dollars per patient in the USA [1]. Even with the reduction of the

number of CABG procedure performed and lower associated mortality due to recent medical advance and

prevention, cardiovascular diseases are still a leading cause of death in industrialized countries [2]. The

current gold standard graft source for the CABG procedure is the use of an autologous vessel such as the

internal mammary artery (IMA) or the saphenous vein (SV), harvested from the patient and implanted as a

bypass graft for the coronary artery. Of these two vessels, the IMA is known to give the best outcomes, but is

limited in availability. On the other hand, the SV is often found to be a pathologic vessel at the time of the

procedure [3]. Synthetic materials such as Dacron or expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) are used for

prosthetic blood vessel fabrication and represent a valuable option for the replacement of larger vessels (> 5

mm). However prosthetic grafts have an unacceptably low patency rates for small vessel applications such as

coronary bypass or peripheral vascular repair below the knee [4, 5]. Although the number of treatment of

pathologic coronary vessels with less invasive procedures has been increasing over the last years, the CABG

will remain a significant intervention method [6].

Tissue-engineered blood vessels (TEBV) represent a promising technology to replace autograft or synthetic

prosthesis for blood vessel replacement [7]. They may be particularly suited to peripheral vascular repair below

the knee for which the intervention is less urgent. They can be produced using autologous cells isolated from a

patient thus representing an alternate source of vascular tissue [8]. Many experimental methods have been

used to produce tissue-engineered vascular substitutes using either synthetic material or allogeneic proteins.

They can be made using collagen [9] or fibrin gels [10-13], biodegradable polymer scaffolds like PGA [14-20],

or decellularized allogeneic or xenogeneic tissues [21-24]. Electrospinning of nanofibers [25-27] and freeze

drying [28-30] have also been used to produce scaffold for vascular tissue engineering. All types of constructs

can either be seeded with cells prior implantation or kept unseeded and colonized by the cells upon

implantation.

The method to produce engineered tubular constructs developed in this study is a technique inspired by the

previously described self-assembly approach of tissue engineering [31-34]. Briefly, this method uses the

capabilities of cells to produce their own extracellular matrix (ECM) in vitro, resulting in tissue sheets that can

be rolled around a cylindrical mandrel and cultured for an extended period to form a tubular construct. These

types of constructs are comprised exclusively of cells and the ECM they secreted in vitro. They are

biocompatible, can be made from autologous cells and present mechanical properties similar to native vessels

[34-39]. Engineered vessels produced using this method are currently used in clinical studies as arterio-

100

venous bypass for haemodialysis access (Lifeline™, Cytograft Tissue Engineering Inc., Novato, CA) [8, 40].

This group reported a 60% patency rate at 6 months for a cohort of 8 patients, with patent vessels extending to

20 months. This represents the first grafting of an autologous tissue-engineered blood vessel in a human

patient.

The current study relies on the combination of the self-assembly approach with a decellularization procedure

by osmotic shock resulting in human fibroblast-derived sheets of ECM. SMCs were seeded on these ECM

(decellularized sheet) to produce nTEVM. The mechanical and functional properties of these nTEVM were

characterized.

4.3. Materials and Methods

4.3.1. Cell isolation and culture

All protocols were approved by the institutional committee for the protection of human subjects (Comité

d’Éthique de la Recherche du Centre Hospitalier Affilié Universitaire de Québec). Human arterial SMCs were

isolated from an umbilical cord after informed consent was given, using the explant method previously

described [41, 42]. Briefly, arteries from umbilical cords were cut open longitudinally and the endothelium was

removed by gently scraping the surface with sterile gauze. Strips of the media were dissected, cut in small

sections and placed in a gelatin-coated (Fisher Scientific, Ottawa, Canada) 6-well plates (BD Bioscience,

Mississauga, Canada). Explants were cultured in Dulbecco-Vogt modified Eagle’s medium (DMEM, Invitrogen,

Burlington, Canada) and Ham’s F12 (Invitrogen) in a 3:1 ratio (DMEM-Ham), 20% fetal calf serum (FCS)

(HyClone, Logan, UT) and antibiotics (100 U/ml penicillin and 25 µg/ml gentamicin) until SMCs migrated out

from the explants and proliferated on the tissue culture substrate. Cells were trypsinized and plated at a

density of 104 cells/cm2 in tissue culture flasks. Human saphenous vein fibroblasts (SVF) were obtained as

previously described from the perivascular connective tissue of a saphenous from a 47 years old donor [43].

Briefly, fragments of perivascular connective tissue were cut into small pieces, placed in a gelatin-coated Petri

dish and cultured as described for the vascular media explants. Human dermal fibroblasts (DF) were obtained

from adult specimen obtained during reductive breast surgery of a healthy subject. Pieces of skin were

incubated in a thermolysin (500 µg/ml, Sigma-Aldrich, Oakville, Canada) solution containing HEPES buffer

(MD Biomedicals, Montreal, Canada) for 2 h at 37°C to dissociate the dermis and the epidermis. The dermis

was separated from the epidermis using forceps, cut into small pieces and incubated 20 h at 37°C in a

collagenase H solution (0.125 U/ml, Roche, Laval, Canada) to isolate the fibroblastic cells from the connective

tissue. Fibroblasts were then centrifuged, plated into culture flasks and cultured in DMEM containing 10% FCS

and antibiotics. All cells were grown under 8% CO2 at 37°C and media were changed 3 times a week.

101

4.3.2. Production of decellularized matrix scaffold

DF or SVF were cultured in DMEM-Ham supplemented with 10% FCS, antibiotics and 50 µg/ml of sodium

ascorbate to stimulate ECM assembly. After 21 days of culture, the resulting tissue sheets were rinsed 3 times

with deionised sterile water for 20 minutes and kept overnight in water at 4°C. The next day, water was

removed and tissue sheets were allowed to dry completely at room temperature for 8 hours to produce a

decellularized matrix scaffold (dMS) secreted either by DF (dMS DF) or SVF (dMS SVF). dMS were rinsed 3

times with PBS and stored in 10 ml of PBS containing antibiotics until further usage. Every dMS was used

within one month from preparation.

4.3.3. Production of tissue-engineered vascular media constructs

Tissue-engineered vascular media referred to as standard TEVM (sTEVM) were produced using the previously

described self-assembly method [34, 44]. Briefly, human umbilical artery SMCs were cultured in DMEM-Ham

(3:1) supplemented with 10% FCS, antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate. After 14 to 21 days in

culture (variable between cell populations used) the cells formed tissue sheets that began to contract and

detach from the side of the culture flask. This tissue sheet is composed of cells embedded in the ECM they

secreted and could be peeled off from the culture flask using fine forceps. sTEVM were obtained by wrapping

a tissue sheet of arterial SMCs around a cylindrical mandrel (diameter of 4.5 mm), resulting in a tubular

construct.

The TEVM referred to as new TEVM (nTEVM) were produced by manually seeding the same SMC strain at a

density of 104 cells by cm2 on dMS-SVF or dMS-DF. The seeded dMSs were cultured in the previously

described medium for one week prior to being rolled around a tubular mandrel to obtain the nTEVM. Finally,

sTEVM and nTEVM constructs were further cultured for 21 days in DMEM-Ham supplemented with 10%

FetalClone II serum (Hyclone), antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate to further improve tissue

assembly. Following the same culture protocol, similar tubular constructs were produced using unseeded dMS

in order to be used as negative controls and to assess the cell contribution to the functionality of the

engineered tissues.

4.3.4. Histology

Following the culture period on the cylindrical mandrel, biopsies of the constructs were fixed in formalin (VWR,

Montreal, QC, Canada) and embedded in paraffin. Five-micrometer thick sections were cut using a microtome

and stained with Masson’s trichrome [45, 46] using Weigert’s haematoxylin, fuchsin-ponceau and aniline blue

stains.

102

Figure 4.1 - Schematic view and timeline of the processes

Schematic view of the processes and timeline required for the production of the vascular constructs. (A) Human fibroblasts are isolated

either from skin or saphenous vein biopsies and smooth muscle cells are isolated from the media of an umbilical artery. (B) The tissue

sheets are peeled off from the flask and decellularized to produce a dMS or rolled to produce a sTEVM. (C) Production of the nTEVM;

the dMS are seeded with smooth muscle cells and the sheets are rolled around a tubular mandrel. (D) Timeline of the experiment

comparing the time required for nTEVM versus sTEVM fabrication, showing that the use of a dMS reduces the production of a vascular

construct by 1 to 2 weeks.

103

4.3.5. Immunofluorescence

Five-micrometer thick frozen sections were air-dried, fixed in methanol for 10 minutes at -20˚C, and rinsed with

PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich). Detection of smooth muscle markers was

performed using mouse anti-human α-SM-actin (1:100, Dako, Burlington, Canada) and mouse anti-human

calponin (1:400, Sigma-Aldrich) antibodies for 45 min at room temperature. Alexa Fluor 594-labeled goat anti-

mouse IgG (1:400; Molecular Probe, Burlington, Canada) was used as a secondary antibody. Nuclei were

counterstained with Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich) and immunostained tissues were observed using an

epifluorescence microscope apparatus (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canada).

4.3.6. Uniaxial Tensile Testing

The tissue-engineered vascular constructs were subjected to tensile ring testing [12, 47, 48] on an Instron

Electropuls mechanical tester (Instron Corporation, Norwood, MA). Each tubular construct (cell seeded, or

unseeded) was cut into five millimeter-long ring samples, which were mounted between two hooks adapted to

the mechanical tester. The hook-to-hook distance measured for the unloaded state was used as the gauge

length of the samples. The samples were preconditioned with three cyclic loading sequences estimated at

10% of failure strain prior to testing the tissue to failure (data not shown). The rings were loaded with a

displacement rate of 0.2 mm/s. The ultimate tensile strength (UTS) and the failure strain were defined by the

highest recorded stress and maximum deformation withstood by the samples prior to failure. The linear

modulus was defined as the slope of the linear portion of the stress-strain curve, comprised between 25-80%

of the UTS of the sample [47, 48]. The engineering stresses were calculated by dividing the recorded loads by

the cross-sectional area of the sample, measured on histological cross-sections of the vessels, and using

initial construct dimensions based on the diameter of the mandrel on which the tissues were rolled to obtain a

cylindrical conduit (4.5 mm). Engineering strain was used to measure the deformation of the vascular

constructs. Stress-strain curves were plotted and analyzed using a Matlab® script (The Mathworks, Natick,

MA) for the calculation of the tensile testing parameters [48].

4.3.7. Estimated Burst Pressure

The estimated burst pressure was calculated from UTS measurements by using the law of Laplace for a

pressurized thin-walled hollow cylinder:

104

where t is the thickness and ID is the initial internal diameter of the vascular constructs (4.5 mm) [35, 49]. The

geometry of the construct was based on measurements of tissue thickness taken on histological cross-

sections of the sample and ID was estimated at 4.5 mm, corresponding to the diameter of the tubular mandrel

used to roll the vascular constructs.

4.3.8. Contraction experiments

Ring sections (5 mm-long) were cut from the sTEVM and nTEVM constructs, removed from their tubular

support and rinsed in physiological salt solution (Krebs solution, in mM: 119 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4,

25 NaHCO3, 1.2 MgSO4, 2.5 CaCl2, 10 glucose) to remove serum proteins. Ring samples were mounted

between two anchors for isometric contractile force measurements (Radnoti, Harvard Apparatus, Montreal,

Canada) and submerged in isolated organ baths containing Krebs solution maintained at 37°C and

oxygenated with a mixture of 95% O2, 5% CO2 (pH 7.4). Each sample was allowed to equilibrate for 30

minutes in the organ bath and was passively stretched at a quasi-static strain rate until a preload of 500 mg

was recorded on the force transducer. During the following 60 minutes, solution in each organ bath was

changed 3 times and tension in the samples was adjusted until a stable load of 500 mg was obtained for each

sample. Each sample of the vascular constructs was challenged with increasing concentrations of histamine

from 10-8 to 10-4 M and the contractile capability of the tissues was recorded by the force transducer. Data

acquisition was done using a PowerLab (ADinstruments, Colorado Springs, CO) and LabChart 7 software

(ADinstruments).

4.3.9. Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard deviation, and n represents the number of rings or samples tested.

Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance (ANOVA) with a subsequent post hoc

Tukey test for mechanical properties, or two-way ANOVA with a subsequent Bonferoni post hoc test for

vasoactivity. * p < 0.05, ** p< 0.01, *** p < 0.001.

4.4. Results

4.4.1. Fabrication of the dMS and nTEVM

A tissue sheet containing exclusively self-assembled ECM and no viable cells, namely a dMS, was obtained

using a decellularization protocol. SMCs grown on these dMS retained their smooth muscle phenotype and

proliferated as they do on cell culture plastic (not shown). Note that nTEVM were obtained 1-2 weeks earlier

than sTEVM since rolling dMS seeded with SMCs can already be performed 7 days after seeding compared to

14-21 days necessary for sTEVM production (Figure 4.1).

105

Figure 4.2 - Masson’s trichrome staining of the vascular constructs

Self-assembled extracellular matrix scaffold (dMS), produced from (A, B) dermal fibroblast, or (C, D) saphenous vein fibroblasts, (B, D)

seeded, and (A, C) unseeded with SMCs, were compared to each other and to (E) sTEVM. (F,G) The unseeded dMS produced using

dermal fibroblasts were stained with α-SM-actin (F, red), and calponin (G, red) and nuclei were counterstained with Hoechst. The dMS

in A and C show a dense collagen structure (blue), without any visible cells remaining in the material. The nTEVM showed good cell

integration (red), into the dense extracellular matrix and a complete cohesion between layers (B and D) following the assembly

process. Similar results were obtained for sTEVM. (F,G) The unseeded dMS produced using dermal fibroblasts showed no visible cells

remaining after the lyophilisation procedure. Scale bar = 100 µm.

106

4.4.2. Histology

In order to compare the ECM structure and cell distribution of the different constructs, histological analysis was

conducted using Masson’s trichrome staining. Unseeded dMS stained strongly for collagen (blue) but no

apparent cell staining was found, indicating that the scaffold was effectively decellularized (Fig. 4.2A, C).

Nuclei were absent on histological sections and on Hoechst staining (Fig. 4.2F, G). Concentric layers of cell

sheets were found to be adherent to one another. Interestingly, decellularized tissues (Fig. 4.2A, C) were

thinner than their SMCs-seeded counterpart (Fig. 4.2B, D) suggesting that the addition of SMCs could have

led to matrix remodelling. The cell seeded nTEVM-DF (Fig. 4.2B) and nTEVM-SVF (Fig. 4.2D) constructs

showed a dense collagenous ECM in which cells were embedded. The sTEVM (Fig. 4.2E) construct was

similar to nTEVM showing that they have equivalent histological properties.

4.4.3. Immunofluorescence

In order to confirm contractile SMC phenotype in the different constructs, SMC proteins were labeled using

antibodies and fluorescent probes. Immunofluorescence labeling of constructs showed that cells contained in

both nTEVM (Fig. 4.3A-D) and sTEVM (Fig. 4.3E, F) expressed α-smooth muscle actin and calponin,

indicating the preservation of their contractile smooth muscle cell phenotype throughout the culture period.

Hoechst staining confirmed the absence of cell nuclei in decellularized dMS (Fig. 4.2F, G) and the uniform

distribution of SMCs in both nTEVM and sTEVM (Fig. 4.3A-F). These data confirm that SMCs continue to

express differentiation proteins after their incorporation within the fibroblast-derived matrix and following the

extended culture period, similar to sTEVM. This shows that the fibroblast derived matrix does not induce de-

differentiation of the SMCs during the culture period and suggests an expression of contractile SMC phenotype

in the vascular constructs.

4.4.4. Mechanical properties

Uniaxial tensile testing was performed to evaluate the mechanical strength of the engineered tissues. Every

sample submitted to tensile testing presented a stress-strain curve characteristic of a biological viscoelastic

material and central failure was obtained for every sample [48]. A difference was observed for the mechanical

properties of the cell seeded scaffolds when compared to their unseeded counterpart. Ultimate tensile strength

(Fig. 4.4A), modulus (Fig. 4.4B) and estimated burst pressure (Fig. 4.4D) were significantly superior for all the

cellularized nTEVM constructs. Moreover, scaffolds seeded with SMCs all presented superior properties when

compared to those of sTEVM, indicating that the use of a scaffold produced by fibroblast, either from dermal or

vascular sources, improves the strength of the engineered tissue. All the vascular constructs were able to

sustain between 20-30% strain prior to failure, indicating that both acellular and cell seeded constructs were

able to withstand a fair amount of deformation (Fig. 4.4C). Burst strength, which is based on the law of Laplace

107

and account for the geometric characteristics of the constructs, led to similar observations to those seen for

UTS and modulus, showing significantly higher values for the cell seeded scaffolds when compared to the

controls. No significant difference has been observed regarding the mechanical properties of tissues produced

using dermal versus vascular fibroblasts in the case of cell seeded scaffolds.

Figure 4.3 - Immunostaining of SMC markers

Vascular constructs were stained for SMC markers (A, C, E) α-SM-actin (red), and (B, D, F) calponin (red). nTEVM constructs

produced from (A, B) dermal fibroblast, or (C, D) saphenous vein fibroblasts seeded with SMCs stained positive for both of these

markers. (E, F) Similar results were obtained for the sTEVM. Scale bar = 100 µm.

108

Figure 4.4 - Mechanical properties of TEVM

Tissue-engineered vascular media (TEVM) reconstructed with the standard technique (sTEVM), or the present technique, where SMCs

were seeded on dMS produced using dermal (nTEVM DF) or saphenous vein fibroblast (nTEVM SVF), were subjected to tensile ring

tests. Unseeded dMS (DF and SVF) cultured and assembled into tubular constructs were used as controls. (A) The use of a

decellularized scaffold produced from either dermal fibroblasts or saphenous vein fibroblasts improved drastically the strength and

modulus of the cell seeded tissues. UTS of the nTEVM DF and SVF were respectively 5.6 and 3.8 fold higher than sTEVM, and (B) the

modulus of these constructs was also found to be improved by 3.4 and 3.3 folds when compared to the sTEVM. (C) Failure strain was

found to be similar for every type of constructs and the (D) estimated burst pressure results were similar to those obtained for UTS

measurements. The burst pressure of a native umbilical cord artery was added as control. Results are expressed as mean ± SD, n=6.

* = p < 0.05

109

4.4.5. Histamine contraction

To compare the contractile properties of the vascular constructs prepared by the two different methods, ring

sections were placed between two anchors in an isolated organ bath and submerged in Krebs solution.

Increasing the histamine concentration in the bath induced a dose-dependent contraction following a

characteristic sigmoid shape curve for both sTEVM and nTEVM (Fig. 4.5). Maximal contractile response to

histamine obtained for nTEVM-SVF, nTEVM-DF and sTEVM were 0.54 ± 0.08 g, 0.84 ± 0.07 g and 0.52 ±

0.04 g, respectively. Hence, the maximal recorded contraction was found to be significantly higher in nTEVM-

DF when compared with the two other constructs. Thus, the nTEVM produced with dMS-DF scaffold displayed

a more robust contraction to histamine than the sTEVM.

Figure 4.5 - Vasoreactivity of TEVM

Tissue samples were mounted in the chamber and were subjected to increasing doses of histamine in isolated organ baths. This

molecule, used as an agonist, is known to induce contraction of the smooth muscle cell layer of blood vessels. Contraction force

produced by the nTEVM from dermal fibroblasts (nTEVM DF) was higher than both sTEVM and nTEVM produced using saphenous

vein fibroblasts (nTEVM SVF). Results are expressed as mean ± SD, n=6. ** p < 0.01, *** p < 0.001

4.5. Discussion

A logistical aspect to consider when trying to translate a tissue engineering technology towards a clinical

application is the time required to produce the substitute that will be implanted. The method presented in this

paper combines the advantages of both scaffold-based tissue engineering and the self-assembly approach. It

enables the fabrication of a SMC-containing vascular media construct presenting vasoactive and mechanical

properties similar to or better than those of vascular construct fabricated using the previously reported method

[50], while reducing the production time by one to two weeks. Moreover, this technique can be used with

virtually almost any SMCs strains to colonize the decellularized tissue sheets without having to rely on ECM

110

synthesis capabilities, paving the way for quicker autologous vascular reconstruction after harvesting the

vascular biopsy.

A cell-sheet based TEBV model made of DF has proven to be efficient for hemodialysis access in clinical

studies [38]. This model recapitulates the adventitia layer of a blood vessel and does not include the media

layer. Although the engineered tissues can be remodeled after grafting with in-growth of host cells [20] this

process requires considerable time. Thus, it is likely that the addition of a media layer presenting vasoactive

properties before grafting will improve the functionality early after grafting. The media is known to contribute to

blood vessel physiological functions such as vasoreactivity, regulation of blood flow to organs and vascular

tone. Thus, it is relevant to include this layer in a vascular model for both in vitro studies and for grafting.

Moreover, SMCs are a plastic cell type that can undergo dedifferentiation to repair and remodel a blood vessel

after an injury, returning to a quiescent and contractile phenotype following the return to homeostasis [51]. This

phenotypic switch capability is of great interest for engineering blood vessels since injuries are likely to happen

within the duty cycle of a vascular graft. The involvement of SMCs could therefore be beneficial in the vascular

remodeling processes in tissue-engineered constructs [52]. In light of our study and due to its accessibility, DF-

derived matrix represents a good choice for the fabrication of a media scaffold with optimal mechanical

strength and vasoactive properties after the addition of SMCs and a 2-weeks maturation period.

Since the first publication of the self-assembly method to produce vascular constructs [34], many approaches

were attempted to enhance the mechanical properties and optimize the assembly method [35, 48, 53].

Decellularization of self-assembled ECM for vascular tissue engineering applications was originally developed

by our LOEX laboratory [34] and previously relied on the use of a fibroblast sheet, rolled on a mandrel and

lyophilized into a tubular structure, on which a SMC layer was rolled to produce a media. This construct has

been used as the inner lining for the fabrication of a TEBV, on which endothelial cells could later be seeded.

The current method is different in its aim and its nature since the fibroblastic sheets are decellularized and

recellularized before the rolling procedure. This type of scaffold relies on assembled collagen, produced and

processed by the cells, resulting in a completely biologic scaffold. The decellularization procedure, performed

prior to the manipulation of cell-sheets, gives a robust platform to the technique. Cells reseeded into the matrix

distribute evenly on the whole surface of the sheet, creating a uniform coverage of cells on the scaffold and

opening the possibility to add SMCs from any subjects on the scaffold. The improved mechanical properties of

nTEVM compared to sTEVM was expected considering that SMCs are seeded on an ECM produced by

fibroblasts and that standard tissue-engineered vascular adventitia (sTEVA produced with living fibroblasts in

ECM) are more resistant than sTEVM [48]. Fibroblasts secrete a dense and strong ECM compared to SMCs

[34]. This could also explain why the vasocontractile response of the nTEVM-DF was greater than the sTEVM

since it is not single cell contraction but the contraction of the tissue that is measured. Therefore, a loose ECM

will favor local deformations of collagen fibers whereas a dense and organized ECM from fibroblasts will

111

translate into tissue contraction. The amplitude of the contractile response for nTEVM and sTEVM is lower

than that of native umbilical vein due to the lower density of SMC in engineered tissues [36, 54].

A single step approach for self-assembled vascular construct containing a media and an adventitia composed

respectively of SMCs and DF has been previously reported by our group [48]. This single-step approach could

be compatible with the use of a dMS produced in a large Petri dish and reseeded with both DF and SMCs,

separated by a spacer. In the present study, we were able to reduce the time required to produce the media

layer. This critical aspect was optimised without impacting on the final construct quality. For the self-assembly

approach, the time aspect is especially important since tissue sheets require a considerable culture period to

get to their optimal performance. Here, the production time was reduced from 6 to 4 weeks without reducing

vasocontractile and mechanical properties of the vascular construct. This represents an important step for

clinical applications. Based on previous studies performed with engineered tissues produced using a similar

fabrication and assembly technique [34, 35, 44, 48, 50, 53], it is expected that the nTEVM will integrate the

recipient body and will adequately perform its function [38, 40]. In contrast to traditional synthetic prosthetic

grafts, in-growth of host cells was observed in decellularised vascular substitute after implantation in animal

models [20]. Animal studies will be conducted to verify this point and to study the structural integrity of the

nTEVM in vivo.

The major aspect of this nTEVM procedure is the ability to use cells from any patients to produce tissue for

surgery or regenerative purposes. Indeed, mechanical properties as well as vasoactive potential may vary

between cells from different donors [35]. The self-assembly approach relies on ECM production by the cells in

the engineered tissue and excellent outcomes have been achieved using mesenchymal cell types such as DF.

However, trying to engineer a smooth muscle tissue represents a greater challenge since SMCs produce less

ECM in vitro compared to DF and the ECM-secreting capability greatly varying between SMCs from various

donors. The self-assembly approach adapted to SMCs often leads to fragile tissue sheets that are difficult to

roll or stack. Thus, this variability in ECM production for SMCs from some subjects could make the production

of adequate vascular constructs more difficult. By using this dMS, available off the shelf, we were able to

produce a mechanically robust media substitute using SMCs from both venous (data not shown) and arterial

sources (present study), demonstrating the versatility of the technique and the possibility to use autologous

cells. Given that the self-assembly approach has been adapted for the production of numerous connective

tissues such as cornea [55-58], skin [59-61] or bladder [62-64], the decellularized ECM scaffolds presented

here have the potential to be used in combination with many other cell types to form different tissues.

Therefore, this new technique could facilitate the production and save crucial time between cell harvesting

from the patient biopsy and grafting of engineered tissues.

112

This biological vessel could present the advantage of high patency rates after seeding endothelial cells in the

lumen. However, the limitations of this method remain the time necessary to produce the autologous graft that

prevents its use for emergency surgeries. The cost of these vascular substitutes will be greater than synthetic

prosthesis but it is thought that the benefit of the expected long-term patency will be worthwhile in applications

such as below-knee vascular replacement.

4.6. Conclusion

This study highlights an approach to produce resistant vascular tissue-engineered constructs made using a

decellularized human scaffold and SMCs. This fabrication technique allowed for vasoactivity, improved the

mechanical properties and reduced the time required for the production of a TEVM, without introducing non-

human scaffold material into the final construct. Moreover, this method allows for the production of a TEVM

from SMCs isolated from any source, regardless of their capacity to synthesize ECM and could be adapted to

many tissue-engineered organs.

4.7. Acknowledgements

The authors thank Cindy Perron for outstanding technical assistance and Francis Bisson for help in manuscript

revision. This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research (CIHR) and the Fonds de

Recherche du Québec – Santé (FRQS). J-M.B. is recipient of a Frederick Banting and Charles Best Canada

Graduate Scholarships from the CIHR and R.G. holds a scientific fellowship from Defence Research and

Development Canada (DRDC) – Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

4.8. References

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117

CHAPITRE 5

MICROSTRUCTURED HUMAN FIBROBLAST-DERIVED ECM SCAFFOLD

FOR VASCULAR MEDIA FABRICATION

118

Microstructured Human Fibroblast-Derived ECM Scaffold for Vascular Media Fabrication

Jean-Michel Bourget1,2,3; Véronique Laterreur1,4; Robert Gauvin1,2,5; Maxime Guillemette1,6,7; Caroline Miville-

Godin3; Maxence Mounier3; Maxime Tondreau1,2; Catherine Tremblay1,4; Raymond Labbé2,8; Jean Ruel4;

François A. Auger1,2; Teodor Veres3; Lucie Germain1,2

1. Centre LOEX de l'université Laval, Centre de recherche FRQS du CHU de Québec;

2. Département de chirurgie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, Canada;

3. Life sciences division, National Research Council Canada, Boucherville, Canada;

4. Département de génie mécanique, Université Laval, Québec, Canada;

5. Current address : Centre québécois sur les matériaux fonctionnels, Québec, Canada;

6. Département de physique, Université Laval, Québec, Canada;

7. Current address : Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de l'Université Laval, Québec,

Canada;

8. Service de chirurgie vasculaire, CHU de Québec, Québec, Canada.

Avant-Propos

Ce chapitre présente la version manuscrite d’un article qui sera soumis à la revue Biomaterials intitulé

« Microstructured Human Fibroblast-Derived ECM Scaffold for Vascular Media Fabrication » par Jean-Michel

Bourget, Véronique Laterreur, Robert Gauvin, Maxime Guillemette, Caroline Miville-Godin, Maxence Mounier,

Maxime Tondreau, Catherine Tremblay, Raymond Labbé, Jean Ruel, François A. Auger, Teodor Veres et

Lucie Germain.

Les travaux présentés dans cet article ont été réalisé par Bourget et Laterreur, sous la supervision des Drs

Germain, Auger, Veres et Ruel. Le manuscrit a été écrit par Bourget et Gauvin et révisé par Laterreur,

Tremblay, Tondreau, Guillemette, Germain, Auger, Veres, Ruel et Labbé. Gauvin et Guillemette ont contribué

au design des expériences. Miville-Godin et Mounier ont contribué à la production des substrats

microstructurés.

119

5.1. Résumé

Le LOEX a développé la méthode d’auto-assemblage permettant de fabriquer des tissus sans biomatériaux,

en utilisant la capacité des cellules à produire leur propre matrice extracellulaire (MEC). Contrairement aux

fibroblastes, les cellules musculaires lisses (CML) de la media ne sont pas de bonnes productrices de MEC,

résultant en un tissu peu résistant. Nous avons récemment développé une nouvelle méthode pour pallier ce

problème. Les fibroblastes dermiques produisent de la MEC avant d’être lysés. Les CML sont ensuite

ensemencées dans cette MEC qui est roulée sur un mandrin pour former un tube, résultant en une media plus

résistante et plus contractile. Dans la présente étude, nous avons combiné cette approche avec l’alignement

des cellules et de la matrice par guidage topographique afin d’augmenter la résistance du substitut vasculaire.

Nous avons comparé la résistance à la traction et la capacité contractile des substituts produits avec les

différentes techniques. Lorsqu’on utilise un feuillet de MEC fibroblastique anisotropique comme échafaudage

pour l’ensemencement des CML, la résistance mécanique et la capacité contractile augmentent par rapport à

l’utilisation du même type de matrice, mais non alignée. Cette amélioration permettra la production d’une

media vasculaire plus résistante à partir des cellules du patient.

120

5.2. Abstract

There is a clinical and pharmacological need for a tissue-engineered small diameter blood vessel. It is possible

to use the extracellular matrix (ECM) produced by fibroblasts as a scaffold to support three-dimensional growth

of another cell type. It has previously been shown that more resistant tissue-engineered vascular media can be

produced when these scaffolds are used to culture smooth muscle cells (SMCs). The present study was

designed to develop an anisotropic fibroblastic ECM sheet that could recapitulate the physiologic architecture

after being assembled into a small diameter vascular conduit. Anisotropic ECM scaffolds were produced using

human dermal fibroblasts grown on a microfabricated substrate presenting a specific topography, allowing for

cell alignment and unidirectional ECM assembly. Following decellularization, scaffolds were seeded with

SMCs. These cells elongated and migrated with a specific angle relative to the direction of the aligned

fibroblastic ECM. They expressed SMC differentiation markers and the ECM stained for collagen I and III, as

well as for elastin. Seven days after SMCs seeding, the sheets were rolled around a mandrel to form a tissue

engineered vascular media. The resulting aligned media demonstrated an increase in mechanical resistance

and vascular reactivity in the circumferential direction as compared to unaligned constructs.

Keywords: Anisotropy; smooth muscle cells; vascular; tissue engineering; microfabrication; contact guidance;

photolithography.

121

5.3. Introduction

There is a clinical need for a small caliber (less than 6 mm) arterial conduit for coronary and peripheral artery

bypass grafts. The current gold standard is the use of autologous vessels, either the internal mammary artery

or the saphenous vein [1, 2]. The need for multiple graft surgeries in patient suffering from atherosclerosis

and/or diabetes, combined with the limited availability of these vessels, rapidly causes their shortage for a

patient. Moreover, they are likely to be found pathological, particularly in the elderly patient population [3-5].

Consequently, tissue engineering approaches have been developed to produce an alternative graft material for

these procedures [6-9]. This domain has moved forward in the last decade from bench to bedside with human

clinical trials of tissue-engineered vascular graft used as arteriovenous fistula for hemodialysis access by

Cytograft® [10] (registered with ClinicalTrials.gov NCT00850252) and recently by Humacyte® (NCT01840956)

[11]. The Cytograft’s Lifeline® device is an autologous TEBV produced by the self-assembly method [6, 12, 13]

and this fibroblastic vessel is devoid of smooth muscle cells (SMCs). The product tested by Humacyte® is

acellular, but is produced using allogenous aortic SMCs [14].

There are numerous scaffold-based approaches that have been developed in vitro to produce such small

diameter blood vessels. Those include natural scaffolds, synthetic scaffolds and decellularised matrix, which

have elegantly been reviewed elsewhere [15-19]. There are also scaffold free techniques such as the self-

assembly approach, also known as cell sheet engineering [6]. This method is based on the capability of

mesenchymal cells to produce, assemble and organize their own extracellular matrix (ECM). That ECM can

become a scaffold for 3D maturation of another cell type into tissue-like constructs following the in vitro culture

steps. The composition of this matrix will vary depending on the cell type and origin that is used, but as several

native connective tissues, it is composed mostly of type I collagen fibrils [20]. One of the most robust and

accessible cell types that can be used to produce these cell sheets is dermal fibroblast. Indeed, fibroblasts are

the cells responsible for the maintenance of ECM integrity in connective tissues throughout the human body.

Based on their tissue of origin, the protein and glycoprotein composition as well as properties (thickness,

mechanical resistance, opacity) of the engineered matrix will change [21, 22]. For vascular tissue engineering,

SMCs are an interesting source of cells since they are essential to normal artery structure and function.

However, they produce low amount of ECM in vitro when cultured in the presence of ascorbate, resulting in

weak and difficult to manipulate cell sheets.

The self-assembly approach is a versatile technique that has been adapted to numerous type of tissue

reconstructions using mostly dermal fibroblasts [6, 23, 24], but also corneal fibroblasts [25, 26], vesical

fibroblasts [27], adipose derived mesenchymal stem/stromal cells [28, 29], as well as SMCs from different

vascular origins [6, 22]. This technique leads to the production of a resistant and physiological ECM by

fibroblasts. Ultimate tensile strength (UTS) for dermal fibroblast constructs produced by self-assembly reported

122

in the literature reach up to 2.5 MPa [30], which compares favorably with other tissue engineering approaches

and scaffolds [15]. With this technique, cells are embedded in the ECM and distributed throughout the

thickness of the construct, producing non immunogenic vessels in the case where autologous cells are used.

On the other hand, it usually takes longer to produce constructs using this approach, since cells require a

certain amount of time to produce and assemble collagen and other proteins of the ECM. It may also be

necessary to culture the tissue sheets for an extended period of time until multiple sheets adhere to one

another and mature before grafting. Moreover, even if the technique has demonstrated to be applicable to

SMCs, some difficulties are to consider for this particular cell type. Their ability to produce enough collagen to

result in cell sheet formation cannot be achieved for all cell lines, especially when adult venous cells are used.

The vascular media is comprised of SMCs that bind to one another by numerous tight junctions. This layer is

very strong, even with its low collagen content compared with the surrounding adventitia [12]. Using the self-

assembly approach with this cell type, the resulting tissue may be difficult to manipulate, has low mechanical

resistance and the cohesion between the layers is sometimes deficient. Moreover, adult venous SMCs are the

more likely source of autologous SMCs [31] and those cells are often found to be inefficient for engineering

optimal tissues through self-assembly [22]. Despite those drawbacks, the use of SMCs for blood vessel

reconstruction is preferable for many reasons: SMCs are responsible for the vascular tone of blood vessels;

they modulate the lumen diameter by contracting and relaxing in response to various agonists in order to

maintain proper pressure and blood flow throughout the circulation system. This property is especially

important for a small diameter vascular graft, as being able to dilate or contract in response to local increases

in pressure or blood flow might have significant impact on vascular function. Elastin assembly is another major

concern for in vitro tissue-engineered blood vessel (TEBV) reconstruction, as this protein represents an

important constituent of the media layer and is produced by SMCs [32-34]. For these reasons it is important to

address the concern of SMC sheets formation.

Another utility for TEBV is to use them as models for pharmacological studies. For that purpose, the media is

of particular interest. This layer is the thicker tunica of elastic and muscular arteries. Therefore, a physiological

model of blood vessel for pharmacological or physiological studies cannot be complete without SMCs being an

important part of it. Moreover, the media layer is the site of many pathological process involved in

cardiovascular diseases principally linked to atherosclerosis.

This issue of producing SMC sheets by self-assembly has been the focus of a previous publication taking

advantage of the potential of dermal fibroblasts to produce an abundant and robust ECM to be used as a

scaffold for SMCs seeding [35]. A decellularized extracellular matrix scaffold (dMS) produced by self-assembly

was developed using dermal fibroblasts cultured in the presence of ascorbic acid. Those dMS were reseeded

with SMCs and rolled onto a mandrel in order to produce a vascular media. These constructs reached an UTS

123

of 3.1 MPa, as compared to 0.8 MPa for a tissue-engineered vascular media (TEVM) produced with the

standard self-assembly technique using umbilical artery SMCs.

Since the self-assembled model has proven its potential and versatility for multiple engineered tissues, it is a

priority to move forward with this approach, although it may be challenging to increase the UTS without

modifying the ECM integrity, plasticity and biocompatibility. An interesting way to do this is to get inspired by

the physiological organization of cells and ECM. In a multitude of tissues and organs, there is a preferential

alignment of cells and ECM that is crucial for their functionality. In the musculoskeletal system, many levels of

alignment are present; for example bones, tendons, ligaments and skeletal muscles all possess specific ECM

and/or cell alignment [36]. Vascular SMCs are mostly circumferentially aligned around the lumen of the vessel,

with some clusters of cells being in an oblique or helicoidal direction [37, 38]. This disposition of SMCs and

ECM components such as elastin and collagen maximises the mechanical resistance, the elasticity and the

contractile capability of this tunica. Such geometry has inspired tissue engineers to reproduce it in

reconstructed substitutes [39-41]. Using different techniques, research teams have tailored the alignment of

ECM, which dictated the orientation of cells [39, 42-44]. Inversely, if cells are precisely aligned, they will direct

the assembly of ECM in the same direction. This alignment leads to increased anisotropy, resulting in

physiological-like substitutes. Using the self-assembly approach, an interesting way to align cells and ECM is

to use a microstructured culture substrate giving topological cues to the cells, which are going to grow and

assemble their ECM following the axis of the microfabricated patterns. This technique has demonstrated its

ability to improve the mechanical resistance of SMC constructs [45]. Results previously showed that when

aligned, the UTS of the tissue-engineered media increased from 0.5 to 0.8 MPa. Nevertheless, a higher

resistance would be suitable for tissue-engineered vascular media.

In this study, we combined this capability to engineer microstructured self-assembled constructs with the

concept of scaffold made by self-assembly, to produce a vascular media of high circumferential resistance.

Therefore, we used the previously developed technique to produce an anisotropic dMS (adMS) that can guide

SMCs organization and lead to a more robust media substitute.

5.4. Materials and Methods

5.4.1. Cells isolation and culture

All protocols were approved by the institutional committee for the protection of human subjects (Comité

d’Éthique de la Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec). The human arterial SMCs were

isolated from the media layer of an umbilical cord artery using the explants method previously described [35,

46]. Briefly, the artery was open longitudinally and the endothelium was removed by gentle scraping with a

sterile gauze soaked in a phosphate buffered saline (PBS) solution. Using forceps, strips of the media layer

124

were dissected, cut into small pieces and allowed to adhere to a gelatine-coated (Fisher Scientific, Ottawa,

Canada) 6 well plates (BD Bioscience, Mississauga, Canada) containing culture medium : Dulbecco’s modified

Eagle medium (DMEM, Invitrogen, Burlington, Canada) and Ham’s F12 (Invitrogen) in a 3:1 ratio (DMEM-

Ham), 20% fetal calf serum (FCS) (HyClone, Logan, UT) and antibiotics (100 U/ml penicillin and 25 µg/ml

gentamicin). After about 2 weeks in culture, SMCs migrated out of the explants and were allowed to proliferate

for 2 more weeks. SMCs were detached from the tissue culture plastic using trypsin (Intergen, Toronto, ON,

Canada)/EDTA (TekniScience, Terrebonne, Canada) and further plated at a density of 104 cells/cm2 in tissue

culture flasks to allow for proliferation.

Human dermal fibroblasts (DF) were isolated from a 38 years old healthy donor following breast surgery. Cell

isolation was performed as described previously [47]. Briefly, after incubation of small skin sections (37°C, 2 h)

in a thermolysin (500 µg/ml, Sigma-Aldrich, Oakville, Canada)/HEPES buffer (pH 7.4, MP Biomedicals,

Montreal, Canada) solution, the dermis and epidermis were separated using fine forceps. The dermis was cut

into small sections and incubated (37°C, 20 h) in a collagenase H solution (0.125 U/ml, Roche, Laval, Canada)

to isolate fibroblasts from the surrounding connective tissue. After centrifugation at 300 x g for ten minutes,

fibroblasts were plated into culture flasks and cultured in DMEM with 10% FCS and antibiotics. All cell types

were grown in an incubator at 8% CO2, 95% relative humidity (RH), 37°C and the culture medium was

changed 3 times a week.

5.4.2. Production of aligned cell culture substrates

To produce the aligned cell culture substrates, a thermoplastic elastomer (TPE), Versaflex® CL30, styrene-

ethylene/butylene-styrene block copolymer (SEBS) (GLS Corp., McHenry, IL) was embossed with a hill and

valley pattern of 2 µm depth and 4 µm period, on a 100 cm2 square surface using a soft-lithography process.

The photolithography and hot embossing steps were performed as previously described [45, 48]. The pattern

was transferred from a photomask chrome on quartz, high resolution laser technology (Photo Sciences, Inc.,

Torrance, CA), to a SU-8-negative tone photo-epoxy GM 1040 (Gersteltec Sàrl, Pully, Switzerland) using the

Mask Aligner, EVG® 6200∞ Automated NIL System (EV Group, Schärding, Austria). Two steps of mold

replication were then performed, in a Polydimethylsiloxane, Sylgard® 184 silicone elastomer kit (Dow Corning

Corp., Midland, MI) and in Epoxy Conapoxy® FR1080 (Cytec Canada Inc., Niagara Falls, Canada). Finally, the

EVG 520HE Semi-automated Hot Embossing System (EV Group) was used to emboss the TPE. The

substrates were treated by plasma oxidation using a Plasmalab 80Plus compact plasma system (Oxford

Instruments, Bristol, UK) to favor cell attachment.

125

Figure 5.1 - Experimental design of the study

Dermal fibroblasts were seeded either on aligned or flat thermoplastic elastomers to produce decellularized matrix scaffold (dMS),

respectively anisotropic (adMS) and isotropic (idMS). They were allowed to grow and form ECM for 21 days before exposure to an

hypotonic solution to induce cell lysis. The dMSs were seeded with arterial smooth muscle cells (SMCs) and cultured for 7 days before

being rolled around a mandrel to form the idMS-TEVM and adMS-TEVM. As a control, SMCs were also seeded on tissue culture,

allowed to grow for 21 days before being rolled to form sTEVM constructs. Those constructs were cultured in vitro 21 days before

testing.

126

5.4.3. Production of the decellularized matrix scaffold

Production of dMS) was performed as described previously [35] with some modifications. Briefly, DFs were

cultured in culture plates (Nunc, Omnitray, Fisher Scientific). For adMS, microstructured SEBS culture

substrates were progressively layed down in order to avoid air bubble formation and thus, adhered

spontaneously to the culture plate. Control isotropic dMS (idMS) were grown directly on the tissue culture

plastic. DFs were seeded at a density of 104 cells/cm2 density in DMEM-Ham supplemented with 10% FCS,

antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate to stimulate ECM synthesis and assembly. After 3 weeks in

culture, tissue sheets were rinsed three times in deionized sterile water three times and stainless steel weights

were added on top of the tissue to avoid sheet detachment from the surface thru this processing. Tissue

sheets were then washed and kept in water overnight at 4°C. The next day, dMS were rinsed again three

times for 20 minutes each following the same procedure and then stored in PBS containing antibiotics until

further usage (less than 1 month) (Fig. 5.1).

5.4.4. Production of tissue-engineered vascular media constructs

The standard TEVM (sTEVM) were produced using the self-assembly technique previously described [6, 49].

The TEVM were engineered using anisotropic dMS (adMS-TEVM) and using isotropic dMS (idMS-TEVM)

using the method described previously for idMS [35]. Briefly, human SMCs isolated from umbilical artery were

seeded on idMS or adMS at a density of 104 cells/cm2 in DMEM-Ham (3:1) supplemented with 10% FCS,

antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate. After seven days, the stainless steel weights were removed and

the constructs were rolled around a cylindrical mandrel (4.5 mm in diameter). All the constructs (sTEVM, idMS-

TEVM and adMS-TEVM) were cultured for another three weeks in DMEM-Ham supplemented with 10%

FetalClone II serum (HyClone), antibiotics and 50 µg/ml of sodium ascorbate (Fig. 5.1).

5.4.5. Histology

After three weeks in culture, small rings taken from the different constructs were fixed in 3.7% formaldehyde

(VWR, Montreal, Canada) for 24 hours prior removing them from the mandrel and embedding them in paraffin.

Five-micrometer thick sections were cut using a microtome and stained with Masson’s trichrome [50, 51] using

Weigert’s haematoxylin, fuchsin-ponceau and aniline blue stains, or with Picrosirius Red [52-54] using Direct-

Red 80 (Sigma-Aldrich). Stained sections were visualized either under normal visible light or using the Circular

polarizer D (Carl Zeiss, Toronto, Canada).

5.4.6. Immunofluorescence

For transverse sections immunostaining, rings of construct were rinsed in PBS, embedded in optimal cutting

temperature® (OCT) compound (Tissue-Tek, Torrance, CA) and stored at -80°C. Five-micrometer thick frozen

127

sections were cut using a cryostat (Leica, Concord, Canada), air-dried, fixed in methanol for 10 minutes at -

20°C and rinsed with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich). Detection of smooth

muscle markers and ECM proteins was performed using mouse anti-human α-smooth muscle-actin (1:100,

Dako, Burlington, Canada), anti-human calponin (1:400, Sigma-Aldrich), anti-human desmin (1:400, Sigma-

Aldrich), anti-human collagen I (1:100, Cedarlane, Burlington, Canada), anti-human collagen III (1:200,

Cedarlane) and anti-human elastin (1:800, Abcam, Toronto, Canada) antibodies for one hour at room

temperature. Alexa Fluor 594-labeled goat anti-mouse IgG (1:400; Invitrogen) and Alexa Fluor 594-labeled

goat anti-rabbit IgG (1:800; Molecular Probe, Burlington, Canada) were used as secondary antibodies. Nuclei

were counterstained with Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich) and immunostained tissues were observed using an

epifluorescence microscope apparatus (Carl Zeiss). For whole mount immunostaining of engineered tissue,

tissue sheets were fixed using 3.7% formaldehyde and kept in PBS. Biopsies of approximately 20 mm2

(Fig. 5.9) or 1 cm2 (Fig. 5.4) were cut and processed for immunodetection using Phalloidin-TRITC (1:40,

Sigma), α-smooth muscle-actin, collagen I and Hoechst as described. For intracellular protein detection,

sections were permeabilized by adding 0.1% Triton X-100 (Bio-Rad, Mississauga, Canada) to the PBS

solution for antibody preparation and washing. Observations were performed using an inverted

epifluorescence microscope apparatus (Carl Zeiss).

5.4.7. Production of DsRed expressing SMCs

To visualize live SMCs on the dMS and on the microstructured culture substrates, the population of umbilical

artery SMCs was transduced using a 2nd generation retroviral vector to induce the expression of the DsRed

protein. Lentiviruses were generated as previously described [55] by co-transfecting the pLVTHM plasmid

(Addgene, Cambridge, MA) together with packaging plasmids (psPAX2 and pMD2.G, Addgene) into

HEK293FT (Invitrogen) cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). SMCs were transduced at five transducing

units per cell in presence of DEAE-dextran (10 µg/ml, Sigma-Aldrich) and six hours later, cells were replated

into a new flask. At confluence, SMCs expressing DsRed (DsRed-SMCs) were sorted using a fluorescence

activated cell sorter (FACSCalibur, BD Bioscience) and subsequent FACS analysis showed a 95% population

purity.

5.4.8. Time-lapse microscopy

DsRed-SMCs were cultured in 12-well plates either on aligned or unaligned SEBS. Immediately after seeding,

plates were placed in the time-lapse epifluorescence microscope apparatus (Carl Zeiss) equipped with a built

in incubator to maintain normal cell culture environment (37°C, 8% CO2, 95% RH). Pictures were automatically

taken from several fields at different times using a motorized microscope stage and definite focus module.

Culture medium was changed every three days and this has resulted in slight shift of the field frame. Image

recording and video processing were done using the Axiovision software (Carl Zeiss).

128

5.4.9. Cell alignment quantification

To quantify cell alignment, the freeware CellProfiler® (Broad Institute, MIT, Cambridge, MA) was used. For

time lapse images (Fig. 5.2 and 5.3), the orientation of a cell was defined as the orientation of its longest axis.

Data from five random fields, at different times, were compiled and processed using the MatLab® software

(MathWorks, Natick, MA). For whole mount sections (Fig. 5.4), the orientation of a cell was defined as the

orientation of longest axis of the nuclei. Data from all visible cells in six aligned and one control whole mount

biopsies of approximately 1 cm2 each, taken from independent samples, were compiled and processed using

the MatLab® software.

5.4.10. Uniaxial Tensile Testing

Mechanical properties of the vascular constructs were evaluated by tensile ring testing [56, 57] using an

Instron Electropuls mechanical tester (Instron Corporation, Norwood, MA). Five millimetre-long ring samples

were cut from the different constructs and mounted between hooks linked to a 50 N load cell. Each sample

was first subjected to 15 pre-conditioning cycles of an amplitude corresponding to 10% strain at 1 Hz. The

hooks were afterwards pulled apart at the constant speed of 0.2 mm/s until failure of the specimen.

UTS was considered as the maximum load recorded during the test, normalized by the initial cross-section of

the sample, which corresponds to twice the ring length times the tissue wall thickness. Strain of the specimen

was calculated as the change in the internal circumference of the sample divided by the initial internal

circumference, which was evaluated from the pin position at zero load. The elastic modulus was evaluated as

the slope in the linear region of the stress-strain curve, comprised between 25% and 80% of the UTS. Finally,

the burst pressure of each sample was estimated by combining the results of the ring tensile tests with the law

of Laplace. This law states that the circumferential stress, which may be evaluated using the tensile ring

tensile test results, is related to the internal pressure and the radius of a cylinder under pressure. Ultimately,

the burst pressure was estimated as the maximal load recorded during the test divided by the specimen length

and its internal diameter at failure [58].

5.4.11. Vasoreactivity

Contractile capabilities of the constructs were determined by recording their response to contracting agonists

histamine (Sigma-Aldrich) and U46619 (Sigma-Aldrich) as well as relaxing agonist sodium nitroprusside (SNP,

Sigma-Aldrich), as described previously [35, 59, 60]. Briefly, five millimetre-long ring sections were cut from the

different constructs, rinsed in physiological salt Krebs solution (119 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4,

25 mM NaHCO3, 1.2 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 10 mM glucose), mounted between two anchors for isometric

contractile force measurements (Radnoti, Harvard Apparatus, Montreal, Canada) and submerged in isolated

organ baths containing Krebs solution maintained at 37°C and oxygenated with a mixture of 95% O2, 5% CO2

129

(pH 7.4). After 30 minutes of equilibration, each ring was passively stretched until a stable preload of 500 mg

was obtained. Samples were challenged with increasing dose of 9,11-Dideoxy-11α,9α-

epoxymethanoprostaglandin F2α (U46619, 10-9 to 10-6 M). After multiple washes to retrieve the basal tension,

a second challenge with increasing dose of histamine (10-8 to 10-4 M) was performed while acquiring the

tension recorded by the force transducer. Finally, relaxation capability to nitric oxide (NO) was tested by

adding increasing doses of SNP (10-8 to 10-4 M) to the contracted samples. Data were acquired using a

PowerLab data acquisition system (ADinstruments, Colorado Springs, CO) and the LabChart 7 software

(ADinstruments). Dose-response curves were drawn and analysed using GraphPad Prism 5 (GraphPad

Software Inc., La Jolla, CA).

5.4.12. Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM) for mechanical testing and vasoconstriction

and mean ± standard deviation (SD) for angle shift analysis, and n represents the number of rings or samples

tested or the number of cell analyzed. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance

(ANOVA) with a subsequent post hoc Tukey test for mechanical properties, or two-way ANOVA with a

subsequent Bonferoni post hoc test for vasoactivity, using the GraphPad Prism 5 software. * p < 0.05, ** p<

0.01, *** p < 0.001.

5.5. Results

5.5.1. SMCs alignment on TPE

In order to evaluate SMCs alignment on the microstructured TPE, DsRed expressing SMCs were grown on top

of microstructured and flat TPE, imaged using automated time-lapse microscopy and quantified using the

CellProfiler® software. On aligned TPE, SMCs became elongated and aligned themselves following the axis of

the features embossed on the culture surface. The angle between the longest axis of the cells and the grooves

was calculated and reported on a 180° scale from -90 to +90. On aligned TPE, cells had a mean angle of -2 ±

16°, as compared to the control that showed no specific alignment (18 ± 48°, the “y” axis was arbitrary chosen

as the reference angle) (Fig. 5.2). Moreover, cell migration and division almost exclusively took place in the

direction of the micropatterned features.

5.5.2. adMS structure and SMCs alignment

In order to determine if SMCs would respond differentially to decellularized matrix scaffold produced by

fibroblasts in an aligned (adMS) or not (idMS) fashion, DsRed expressing SMCs were grown on top of adMS

or idMS and imaged as described in the Materials and methods section. On adMS, SMCs were mostly

elongated and aligned, in a direction parallel to each other but adopted an angle shift from the culture

130

substrate grooves indicating rotation from the ECM direction. The control condition (idMS) showed no specific

alignment (Fig. 5.3). To quantify cell alignment, whole mount sections were stained with Phalloidin-TRITC and

Hoechst for cytoskeleton and nuclei visualization respectively. Since it is easier to distinguish between cells

using nuclei than using cytosolic staining, nuclei staining was used to assess the orientation of the cells

because the nuclei was always elongated in the same direction as the whole cell. On adMS, clusters of SMCs

aligned locally with neighbor cells. This phenomenon was also observed with SMCs grown on idMS, but to a

lesser extent. Cell-clusters on adMS adopted an overall angle of 15.8 ± 36.4° from the direction of the grooves

used to produce the adMS (Fig. 5.4 A-C). The control condition (idMS) showed no specific alignment with a

mean angle of -6.0 ± 51.8° (the “x” axis was arbitrary chosen as the reference angle) (Fig. 5.4 D-F). Moreover,

cell morphology and phenotype on dMS were monitored by immunostaining of whole mount section of adMS

(Fig. 5.9A-D, I-L) and idMS (Fig. 5.9E-H, M-P). Tissues were stained with collagen I antibody (green, Fig. 5.9A,

E), α-smooth muscle actin (green, Fig. 5.9I, M) and labeled Phalloidin (Red, Fig. 5.9B, F, J, N) to visualise the

ECM, the SMCs phenotype and the cytoskeleton respectively.

Figure 5.2 - Cell alignment as a function of time on aligned and flat TPE

DsRed expressing SMCs were grown on top of either microstructured (A-D) or flat (E-H) TPE for 12 days and cell alignment and

movement were monitored by time lapse microscopy. The mean orientation of the major cell axis was plotted using Cell profiler 2.0 and

Matlab and is shown in the top right corner. The direction of the grooves on the TPE corresponds to 0° on the graph and is indicated by

the white arrow. Time frame are shown after 34 (A, E), 99 (B, F), 164 (C, G), and 273 (D, H) hours. Magnification 100X,

scale bar = 200µm.

5.5.3. ECM composition and SMC markers analysis in reconstructed media

Cross sections of TEVM were immunostained to visualize SMC differentiation markers and ECM proteins.

Staining for α-smooth muscle actin (αSMA, Fig. 5.5A-C), calponin (Fig. 5.5D-F) and desmin (Fig. 5.5G-I)

revealed the presence of SMCs expressing their differentiation markers in all the constructs. Staining of ECM

components collagen I (Fig. 5.5J-L), collagen III (Fig. 5.5M-O), and elastin (Fig. 5.5P-R) showed that they all

131

contained both collagen types but that elastin seemed more present in adMS-TEVM and idMS-TEVM

constructs.

Figure 5.3 - Cell alignment as a function of time on aligned and unaligned scaffolds

DsRed expressing SMCs were grown on top of either adMS (A-D) or idMS (E-H) for 6 days and cell alignment and movement were

monitored by time lapse microscopy. The mean orientation of the major cell axis was plotted using Cell profiler 2.0 and Matlab and is

shown in the top right corner. The direction of the grooves on the TPE used to produce the adMS corresponds to 0° on the graph and

is indicated by the white arrow. Time frame are shown after 33 (A, E), 66 (B, F), 99 (C, G) and 132 (D, H) hours. Magnification 50X,

scale bar = 500 µm.

5.5.4. Histological analysis of constructs ECM

The impact of dMS alignment on the resulting media constructs made from these scaffolds was analyzed on

cross sections after 21 days in culture. The Masson’s trichrome staining (Fig. 5.6A-C) showed that all

constructs were composed of a dense ECM in which cells were embedded. The comparison of the mean

thicknesses of the constructs revealed that sTEVM and adMS-TEVM were thinner than idMS-TEVM, having a

mean thickness of 124 ± 40 µm, 142 ± 20 µm and 255 ± 46 µm respectively. Staining of collagen fibers by

Picrosirius red was visualised under visible light (Fig. 5.6D-F) showing that the ECM of all constructs contained

collagen. When Picrosirius-stained tissues are visualized under polarized light, collagen fibers are highly

birefringent and stained from yellow to green to red depending on the thickness/maturity of the fibers [52]. The

reconstructed media made using dMS (Fig. 5.6H-I) were more birefringent than sTEVM (Fig. 5.6G), as shown

by the brighter red staining of those constructs, indicating that they contained more larger collagen fibers.

Higher birefringence of the construct was observed for adMS suggesting that alignment of the dMS led to the

presence of thicker and longer fibers. This could be attributable to improved compaction of the ECM in the

adMS-TEVM due to the higher level of organization in this type of construct.

132

.

Figure 5.4 - Visualization of cells cultured on aligned or control scaffolds

The adMS (A-C) and idMS (D-F) were stained for F-Actin (A-F) and nuclei (not shown) following SMCs seeding. The SMCs on adMS

are mostly aligned with an angle to the direction of the grooves (white arrow) used to produce the adMS (A-C). For SMCs seeded on

idMS (D-F), cells show some local alignment but overall no generalized direction is observed. Original magnification 50X.

133

Figure 5.5 - Immunostaining of SMC markers and ECM protein in TEVM

SMC markers α-SM-actin (A-C), calponin (D-F) and desmin (H-J) were present in the three types of construct. The ECM contains

collagen I (K-M), collagen III (N-P) and elastin (Q-S). The fluorescence intensity for elastin is higher in dMS-TEVM (R-S) compared to

sTEVM (Q). Scale bar = 100 µm, lumen facing downward.

134

Figure 5.6 - Histological staining of the TEVM

sTEVM (A, D, G), idMS-TEVM (B, E, H) and adMS-TEVM (C, F, I). Trichrome staining (A-C) shows that cells are distributed throughout

the construct and that the ECM is homogenous, showing no discrepancy. Construct thicknesses were measured on stained section

using the Axiovision software. Picrosirius red, a collagen specific staining viewed under visible light (D-F), shows that collagen is

abundant in the ECM of these constructs. Moreover, when visualized under cross-polarised light (G-I), this dye amplifies the

birefringence of collagen fibers and can be used to assess the content in collagen fibers. The adMS-TEVM contains the brightest

collagen fibers suggesting that they are thicker in this model. Magnification 200x, scale bar = 50 µm, lumen facing downward.

5.5.5. Vasoreactivity

To determine the contraction and relaxation capability of the constructs, ring sections were placed in isolated

organ baths and challenged with cumulative doses of contractile (U46619, histamine) and relaxing (sodium

nitroprusside, SNP) agents. Both contractile agonists induced contraction of the TEVM with a standard

sigmoidal dose-response curve (Fig. 5.7A-B). NO donor SNP induced a dose-dependent relaxation of the

precontracted TEVM (Fig. 5.7C). The variation in tension generated by adMS-TEVM in response to contractile

and relaxing agonists was greater than by idMS-TEVM. The mean maximal contraction to histamine of adMS-

TEVM was 0.62 g as compared to 0.26 g and 0.33 g for unaligned controls (idMS-TEVM and sTEVM

respectively).

135

Figure 5.7 - Vasoreactivity of TEVM

Vasoreactivity of tissue-engineered media to histamine (A), U46619 (B) and sodium nitroprusside (SNP) (C). The TEVM produced with

adMS (closed circle) were compared to idMS-TEVM (open circles) and unaligned sTEVM (open squares). Both contraction and

relaxation to agonists were exacerbated by the alignment of the dMS. Results are expressed as mean ± SEM, n = 4, * = adMS-TEVM

vs idMS-TEVM, # = adMS-TEVM vs sTEVM and $ = idMS-TEVM vs sTEVM. * = p < 0.05%; ** = p < 0.01%; *** = p < 0.001%.

136

Figure 5.8 - Mechanical properties of TEVM

Mechanical properties of TEVM produced with the standard technique (sTEVM) or the present technique where SMCs were seeded on

dMS from idMS or adMS, and subjected to tensile ring tests. The use of an adMS improved the strength and modulus of the cell

seeded tissues. (A) The representative stress-strain curves demonstrate a normal behavior for a viscoelastic tissue. (B) UTS of the

idMS-TEVM and adMS-TEVM were respectively 4.4 and 10 folds higher than sTEVM. (C) The modulus of these constructs was also

found to be improved by 3.4 and 4.1 folds when compared to the sTEVM. (D) Burst pressure estimated from UTS results showed that

the aligned nTEVM could sustain an internal pressure of 3400 mmHg. Results are expressed as mean ± SEM, n=4. *p < 0.05.

137

5.5.6. Mechanical properties

To assess the maximal resistance that a construct can support in the circumferential direction, failure strength

was evaluated by uniaxial ring testing. Every sample displayed a stress-strain curve (Fig. 5.8A) characteristic

of viscoelastic materials presenting a toe-region followed by a linear portion of the curve, increasing until

failure of the sample. The UTS (Fig. 5.8B) of adMS-TEVM was on average 5.7 MPa, as compared to 2.5 MPa

and 0.56 MPa for unaligned controls idMS-TEVM and sTEVM respectively. The elastic modulus (Fig. 5.8C),

which corresponds to the slope of the stress-strain curve in the linear region, was higher for adMS-TEVM than

for sTEVM. The estimation of the burst pressure (Fig. 5.8D) showed that the adMS-TEVM vessel could sustain

a luminal pressure of 3400 mmHg as compared to 1400 mmHg and 150 mmHg for idMS-TEVM and sTEVM,

respectively. These estimations using the Laplace’s law were shown to estimate accurately the actual burst

pressure tested in vitro [58].

5.6. Discussion

The development of a TEBV for small diameter arterial replacement is critical since autologous vessels, which

are the gold standard for this procedure, are limited in availability. The two TEBVs currently in clinical trials are

composed of autologous skin fibroblast (Cytograft®) or are decellularized (Humacyte®). Therefore, both of

these devices lack the presence of autologous SMCs, an important component of native arteries. Thus, TEBVs

could be further optimised as a mean to edge closer to the patency rate of the current gold standard.

In the present study, our aim was to maximize the mechanical resistance and contractility of our TEVM by

creating an aligned scaffold made by self-assembly. Our working hypothesis was that the alignment of the

ECM fibers in the scaffolds will direct SMCs elongation, migration and division upon cell seeding in vitro.

Moreover, the preferential alignment of the ECM will lead to a construct that can sustain higher mechanical

loads, be more contractile and thus, improve functionality. As expected, the adMS was able to induce SMCs

alignment. We managed to optimize the physiological properties of our TEVM by controlling ECM fibres and

cells alignment in the circumferential direction. Indeed, the mechanical resistance and vascular reactivity were

exacerbated in this direction.

As compared to the standard self-assembly approach for vascular media reconstruction, the use of a dMS

presented many advantages. This substrate combines the rapidity and versatility of scaffold based approaches

with the high mechanical resistance, biocompatibility and integrability of the self-assembly approach.

Moreover, in this study we showed that it is possible to maximize the strength of the construct in the

circumferential axis by guiding the assembly of collagen fibres in the desired direction.

138

To produce an aligned self-assembled scaffold, the use of surface topography was the best available option

since this method does not rely on an exogenous scaffolding material [48]. This technique offers the possibility

to create complex patterns of cells and ECM by changing the embossed topography.

Beside the clinical need for a TEBV, there is a second avenue for vascular substitutes in the development of

new drugs for vascular treatment. The media layer is a central nexus for vascular physiology and pathological

processes. Atherosclerosis is the main cause of cardiovascular system failure and this pathological process

occurs in the media. The self-assembled vascular media developed by our group [6] presents contractile

properties that allow their use as a model of vascular reactivity to drugs [49, 59, 61-64]. In the present study,

this property is exacerbated by the circumferential orientation of cells and ECM. This is interesting since

improving the contractility could lead to a decrease in the variability between vessels. Aside of contractile

capability, the possibility of producing TEVM from any SMCs populations is interesting in a pharmacological

perspective since the self-assembly approach is limited when it comes to cells producing a lower amount of

ECM, as cells isolated from pathological tissues for example.

Even if vascular substitutes without media have shown promising results, it is suitable to include that layer into

a state of the art TEBV [65]. The media layer is responsible for the vasoreactivity of the vessel, an important

property to preserve vessel patency and to maintain vascular tone. This capacity to react to vascular agonists

is crucial for the development of an in vitro physiological model for pharmacological studies [62]. Moreover, the

phenotypic plasticity of SMCs gives them the capability to repair and remodel the vessel in case of an injury

[66]. These two properties of SMCs make their use in a TEBV desirable for grafting into patients [67].

Some previous studies have focused on the optimisation of circumferential orientation of cell and ECM in

vascular constructs using different techniques, including electrospinning [68, 69], electromagnetic field [70, 71],

gel compaction [72-74], mechanical strain [7, 30] and microstructured cultured plates [41, 45]. Tissue

engineering applications of these approaches have been reviewed previously [39] and include cornea [75, 76]

and neurons [77]. They mostly rely on a well-known cellular behavior described by Harrison in 1914 [78] and

called contact or topographic guidance [79-81]. This is the phenomenon by which cells elongate and migrate in

the same axis as the ECM fibers, or in a more general manner, the same axis as the physical structure they

are attached to. In the present study, the microembossed pattern of hill and valley act as the guide for

fibroblast cell elongation and alignment, as well as collagen fibrils formation. The dimensions of the groves

were determined to optimize cell alignment [48]. Large groves (20-50 µm) have been shown to induce cell

alignment, but the underlying mechanism is most likely to be different [41, 82]. Sub-cellular groves of 2 µm

width and 2 µm deep, such as those used in the present study, will favor cell movement and elongation in the

chosen direction, since it is easier for cells to move their filopodia and pseudopodia in that direction. Indeed, in

absence of any chemotaxis gradient, mesenchymal cells will move by creating focal adhesions in random

139

directions and the strongest foci will be conserved, creating a star shaped cell. The presence of significant gap

in the perpendicular direction to the gratings creates regions of low attachment that are disadvantaged as

compared to feature directions. The adMS produced from fibroblast grown on these culture substrates present

an ECM that is highly anisotropic [45].

This study is of particular interest because a self-assembled ECM scaffold was structured to induce the

alignment of second cell type. Therefore, it becomes possible to seed SMCs in this highly resistant scaffold

and give them the cues to become aligned before being rolled into tubular structures. In addition to the

previous study concerning the alignment of SMCs in a precise angle from the aligned layer of living SMCs and

ECM, this study reveal that the first cell layer was not necessary for the alignment with a particular angle, the

ECM was sufficient. However, the mechanisms involved in SMC-ECM signaling remains to be identified. This

anisotropy gives an optimal circumferential resistance to the resulting TEVM, without introducing non-human

material into the construct.

Nevertheless, there are still some improvements that could be made to the scaffold. In terms of host response

to the allogeneic material, there is a low chance of immune response to the matrix itself, but there is concern

about the remaining fibroblastic cellular material that could be left behind following the cell lysis. The technique

employed is very mild and aim at keeping the extracellular matrix as intact as possible in order to be

recognized by the new cell type as its own ECM. The drawback of using such a gentle decellularization

process is that cell debris could remain in the dMS. On the other hand, having autologous SMCs seeded in the

construct for weeks to months before implantation will generate protease and DNase that could degrade the

remaining allogeneic fibroblast cell debris. This hypothesis will need to be tested in vitro. Moreover, the cell

population chosen for dMS fabrication was derived from healthy adult skin. We know that fibroblast cell

populations derived from newborn or juvenile skin biopsies leads to better outcomes in terms of tissue

thickness and mechanical resistance. Therefore, by screening different cell populations for ECM synthesis

capability, it will be possible to obtain thicker dMS and reduce production time.

5.7. Conclusion

This study focuses on the development of a microstructured ECM scaffold produced by fibroblasts using

contact guidance to engineer a resistant and contractile construct made from SMCs. The physiological

alignment of cells and ECM observed in the final engineered media improved the mechanical resistance as

well as the functionality (contractility) of the engineered vessel. We showed that this human fibroblast-derived

scaffold can be tuned as desired to induce anisotropy in the construct, making it more versatile in order to

apply it to other organs.

140

5.8. Acknowledgements

The authors thank Amélie Lavoie, Danielle Larouche, Karine Vallières and Jahdonna Isaac for manuscript

revision and technical assistance. We also thank Sébastien Larochelle, Mathieu Blais and Prof. Véronique

Moulin for help with FACS analysis and for providing DsRed-retroviral vector. This work was supported by the

Canadian Institutes for Health Research (CIHR), the Fonds de Recherche du Québec en Santé (FRQS) and

ThéCell Network: Réseau de thérapie cellulaire et tissulaire du FRQS. J-M.B. is recipient of a Frederick

Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarships from the CIHR. V.L., M.Y.T. and C.T. received

scholarships from the Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies (V.L.), FRQS (M.Y.T.) and

Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (C.T.). R.G. holds a scientific

fellowship from Defence Research and Development Canada (DRDC) and NSERC.

141

5.9. Supplementary Materials

Figure 5.9 - Visualization of cells and ECM structure on aligned and control scaffolds.

The adMS (A-D, I-L) and idMS (E-H, M-P) cultured with SMCs were stained for collagen I (A, E, green), α-

smooth muscle actin (αSMA, I, M, green), F-Actin (B, F, J, N, red) and nuclei (C, G, K, O, blue). Both types of

dMS contain collagen I (A, E) and allow for expression of α-SMA (I, M, G) by SMCs. The actin cytoskeleton (B,

J) and the nuclei (C, K) of SMCs on adMS are uniformly aligned in the same direction. For SMCs seeded on

idMS, actin cytoskeleton (F, N) and the nuclei (G, O) show some local alignment but overall no generalised

direction is observed. The collagen I staining (A, E) seem to be mostly intracellular, indicating that the pro-

collagen present in the SMCs blinded the visualization of the ECM backbone. Unseeded controls showed no

apparent staining for nuclei or F-actin (Data not shown). Magnification 200X, scale bar = 100µm.

142

5.10. References

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[82] Thakar RG, Ho F, Huang NF, Liepmann D, Li S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem Biophys Res Commun. 2003;307:883-90.

147

CHAPITRE 6

DISCUSSION ET CONCLUSION

148

6.1. Génie Tissulaire Cardiovasculaire

Le génie tissulaire est un domaine de recherche multidisciplinaire qui fait appel à des notions de biologie, de

chimie et d’ingénierie dans le but de reproduire des tissus ou des organes fonctionnels in vitro. Ce concept

récent [Langer et al., 1993] a rapidement évolué en deux décennies de recherches et développements. Au

niveau cardiovasculaire, le premier modèle de vaisseau reconstruit, proposé par Weinberg et Bell [Weinberg

et al., 1986], était fabriqué à partir d’un gel de collagène et présentait une résistance mécanique relativement

faible, même lorsqu’un treillis de Dacron était ajouté. Les modèles actuels récapitulent certaines des fonctions

de base des artères soit la résistance à une pression intraluminale et la compliance. Deux compagnies

(Cytograft®, Humacyte®) réalisent actuellement les tous premiers essais cliniques avec des modèles

vasculaires reconstruits par génie tissulaire. La prothèse vasculaire testée par Cytograft® est produite par la

technique d’auto-assemblage à partir de fibroblastes dermiques. Celle de Humacyte® est produite à l’aide d’un

échafaudage de biomatériaux biodégradables ensemencé avec des CML allogéniques in vitro et cultivé pour

une longue période en présence d’acide ascorbique, ce qui permet la dégradation du biomatériau, puis son

remplacement par de la matrice produite par les cellules. La prothèse finale obtenue contient donc également

une matrice assemblée par les cellules, similaire à celle produite dans le modèle d’auto-assemblage. La

prothèse est ensuite décellularisée avant d’être implantée chez le patient. Ces deux modèles ne contiennent

donc pas de CML vivantes, ne permettant pas de récapituler la capacité contractile des vaisseaux à

l’implantation.

L’approche d’auto-assemblage développée au LOEX permet de fabriquer des vaisseaux reconstruits sans

utiliser de biomatériaux exogènes [L'Heureux et al., 1998]. En effet, en présence d’acide ascorbique, les

cellules mésenchymateuses sont capables de produire leur propre MEC et ainsi de se construire un

environnement tridimensionnel adapté à leurs besoins. La matrice produite par les cellules in vitro est

semblable à celle du tissu d’origine en terme de composition et de structure [Lake et al., 2013]. Étant donné

que cette matrice est semblable à celle du tissu natif, la séquence d’évènements qui se déroule après

l’implantation du substitut in vivo est considérablement modifiée par rapport à l’implantation d’une construction

contenant un biomatériau classique. En effet, la MEC produite et assemblée in vitro par les cellules est

reconnue par l’organisme comme un tissu normal ou cicatriciel. Elle est ainsi ignorée par les mécanismes de

remodelages plutôt que d’être dégradée ou encapsulée, comme c’est le cas pour les biomatériaux

biodégradables et synthétiques respectivement. Ce point est crucial au niveau des substituts vasculaires, car

les processus de dégradation et de remodelage entraînent une période de résistance mécanique réduite à

moyen terme qui peut entraîner une rupture de la prothèse et le décès du patient. L’optimisation des

propriétés mécaniques de la prothèse avant sa translation clinique est donc primordiale.

149

Toutefois, cette translation clinique est un objectif à long terme qui requiert beaucoup d’investissements en

temps et en argent. Alternativement, ces substituts reconstruits à partir de cellules humaines peuvent être

utilisés comme modèles d’étude in vitro. En effet, les vaisseaux humains sont difficiles à obtenir en quantité

suffisante pour effectuer des études pharmacologiques ou physiologiques. De plus, ces vaisseaux explantés

sont le plus souvent pathologiques. Par conséquent, les modèles animaux sont largement utilisés mais, en

plus des considérations éthiques inhérentes à leur utilisation en recherche, la transposition des résultats vers

l’humain n’est pas toujours exacte. De son côté, le vaisseau reconstruit permet d’isoler facilement les

différentes tuniques des vaisseaux sanguins. Pour faire de même avec des vaisseaux natifs, il est nécessaire

de séparer mécaniquement l’adventice de la media ou de briser l’endothélium en le grattant. Ces procédures,

peu reproductibles, endommagent les tuniques et enclenchent des mécanismes de réparation qui peuvent

amener des biais dans les résultats observés.

Pour être utilisé comme modèle vasculaire humain pour des études pharmacologiques, le vaisseau reconstruit

idéal doit posséder plusieurs caractéristiques : 1) Vasoréactivité (contraction et relaxation); 2) Co-culture de

différents types cellulaires (CE, CML, fibroblastes, cellules immunitaires); 3) Orientation physiologique des

cellules et de la MEC en fonction des tuniques; 4) Reproductibilité, versatilité (propriétés similaires d’une

population à l’autre, utilisation de populations normales ou pathologiques); 5) Résistance mécanique

physiologique ou supraphysiologique (pour faciliter la manipulation); 6) Temps de production acceptable. La

media reconstruite par auto-assemblage présente plusieurs de ces caractéristiques (1, 2, 3) alors que certains

aspects restent à améliorer (4, 5, 6).

Les travaux présentés dans le présent ouvrage visaient donc à optimiser le vaisseau reconstruit par auto-

assemblage pour faciliter son utilisation, principalement comme modèle d’étude vasculaire. L’influence des MP

sur les substituts vasculaires humains reconstruits par génie tissulaire selon la méthode actuelle d’auto-

assemblage a d’abord été évaluée. Suite à ces travaux, les lacunes du modèle de media reconstruite ont été

identifiées et ce dernier a été optimisé pour permettre l’étude des propriétés physiologiques des vaisseaux

sanguins humains à partir de toutes les populations de cellules.

6.2. Le vaisseau reconstruit par auto-assemblage comme modèle

d’étude des microparticules

Les MP sont désormais reconnues comme modulateur de la fonction vasculaire en situation physiologique,

mais surtout en condition pathologique. Les MP sont présentes dans la circulation et portent des récepteurs

transmembranaires ainsi que du contenu cytoplasmique provenant de la cellule d’origine qui permettent

l’identification de leur provenance. Elles peuvent interagir avec des cellules cibles via divers mécanismes

impliquant ou non leurs récepteurs de surface [Burger et al., 2013]. Dans de nombreuses pathologies, le taux

des différents types de MP (plaquettaires, endothéliales, lymphocytaires, etc.) est modifié ou déséquilibré. Par

150

conséquent, leur utilisation comme marqueur diagnostique circulant d’une atteinte tissulaire plus profonde a

été proposée [Martinez et al., 2011b]. Par contre, leur implication pathologique ainsi que leurs rôles en

condition non pathologique restent nébuleux. Les travaux des chapitres 2 et 3 ont présenté l’utilisation du

modèle de vaisseau reconstruit par auto-assemblage pour décortiquer l’influence des MP sur la fonction

vasculaire.

6.2.1. Les microparticules lymphocytaires

Dans le chapitre 2, le rôle des MP lymphocytaires sur la fonction vasculaire a été étudié. Le taux de ces MP

est augmenté dans certaines pathologies telles que le diabète et le syndrome d’immunodéficience acquise

(SIDA). Par contre, le rôle ou l’effet de cette modulation sur la fonction vasculaire demeure peu documenté.

L’objectif du projet était d’évaluer le rôle de l’adventice dans la modulation du tonus myogénique par les MP

lymphocytaires. Les MP ont été produites in vitro suite au traitement d’une lignée de lymphocytes T avec

l’actinomycine D. Trois types de vaisseaux (media, adventice, media plus adventice) ont été incubés avec ces

MP, puis différents paramètres de la fonction vasculaire ont été mesurés. Les résultats obtenus montrent que

la capacité contractile des trois constructions n’est pas modifiée suite à l’incubation en présence de ces MP.

L’ajout d’inhibiteurs de la iNOS (1400W) et de la COX-2 (NS-398), ensemble ou séparément, n’influence pas

le niveau de contraction à l’histamine. Par contre, certains des intervenants clés dans la contraction (NO, O2-,

COX-2, NF-κB) sont modulés différemment entre les constructions en réponse au traitement par les MP

lymphocytaires. Ces résultats suggèrent que ces MP influencent la balance des facteurs vasocontractiles et

vasorelaxants de manière à conserver la contraction globale inchangée. Ils montrent également que les MP

peuvent agir de manière opposée sur l’adventice et sur la media et que l’adventice pourrait jouer un rôle

important dans la modulation du tonus myogénique en présence des MP.

D’autres travaux se sont intéressés aux MP lymphocytaires. Ceux de Martin et al., réalisés sur des aortes de

souris ex vivo, démontrent que ces MP exercent une action dépendante de l’endothélium. En effet, une

incubation de 24 heures avec les MP lymphocytaires entraînait une réduction maximale de la relaxation

dépendante de l’endothélium induite par l’acétylcholine. Alternativement, des résultats concordants ont été

obtenus avec des MP produites in vitro à partir de lymphocytes isolés du sérum de patients diabétiques et

sidéens. En effet, ces MP sont en mesure de réduire l’expression de la eNOS dans une culture de CE de

veine ombilicale [Martin et al., 2004]. Dans une autre étude, Tesse et al. ont évalué l’effet des MP

lymphocytaires sur la media de souris et sur des CML humaines en culture. In vivo, les résultats montrent une

hyporéactivité de la media via une augmentation de la production de NO et de PGI2. Cette augmentation est

attribuable à une surexpression de iNOS et de COX-2 via la voie Fas impliquant le facteur de transcription

NF-κB, principalement au niveau de la media. In vitro, les CML humaines démontraient également une

activation de la voie NF-κB [Tesse et al., 2005]. Les résultats obtenus sur des vaisseaux animaux et sur des

151

cellules humaines en culture diffèrent donc de ceux obtenus avec les reconstructions par génie tissulaire à

partir de cellules humaines. Ces disparités pourraient être attribuables à des différences inter-espèces ou à

des variations au niveau du phénotype des CML de la media reconstruite.

Les travaux présentés dans le chapitre 2 ont étudié les MP d’origine humaine dans un modèle tridimensionnel

de vaisseau reconstruit à partir de cellules humaines. L’aspect intra-espèce est important, car les différences

inter-espèces, par exemple au niveau des récepteurs transmembranaires des MP, pourraient interférer dans

l’interaction MP-cellule cible. Cette situation pourrait se produire dans le cas de l’injection de MP d’origine

humaine chez des modèles animaux comme le rat ou la souris par exemple.

Malgré qu’une interaction entre la media et l’adventice ainsi qu’un rôle de l’adventice dans la réponse aux MP

aient été identifiés dans cette étude, le mécanisme impliqué dans cette interaction n’est toujours pas élucidé.

Des études plus approfondies seraient nécessaires afin de comprendre les processus en jeu. Celles-ci

pourraient inclure une analyse de l’expression de cytokines par qRT-PCR ou de leur sécrétion dans le milieu

par dot blot ou ELISA (de l’anglais enzyme-linked immunosorbent assay). De plus, l’utilisation de plusieurs

populations de CML et de fibroblastes permettrait de déterminer si les effets observés sont propres à la

population étudiée. Finalement, les MP produites avec l’actinomycine D pourraient être comparées à celles

provenant de la même lignée de lymphocytes T, mais générées par une stimulation différente

(phytohémagglutinine, phorbol-12-myristate-13-acetate et actinomycine D).

6.2.2. Les microparticules de patients en choc septique

Malgré qu’une corrélation positive ait été établie entre la survie des patients en choc septique et

l’augmentation du niveau de MP dans cette pathologie [Soriano et al., 2005], l’influence de cette augmentation

sur la fonction vasculaire des vaisseaux humains n’a pas été élucidée. Dans le chapitre 3, la combinaison des

MP isolées du sérum de patients en choc septique et de la media reconstruite à partir de cellules humaines a

permis d’identifier un mécanisme de réponse de cette tunique aux MP dans cette condition pathologique

mortelle. Dans ces travaux, des MP humaines ont été isolées du plasma de patients en choc septique (SMP)

admis à l’unité de réanimation du CHU d’Angers. La media reconstruite a été incubée en présence de ces

SMP à la concentration circulante retrouvée chez les patients afin d'évaluer les modifications induites par ces

MP sur la vasoréactivité de la media. Les résultats montrent que les SMP sont en mesure d’augmenter la

réponse contractile de la media reconstruite à l’histamine. Cette augmentation est attribuable à une diminution

de la production de NO et d’O2- par les CML. De plus, le niveau de l’ARN messager de l’interleukine-10 (IL-10)

augmente significativement dans les CML de la media reconstruite suite à son incubation en présence des

SMP. Un modèle de choc endotoxinique a ensuite été mis au point pour déterminer si l’IL-10 peut antagoniser

l’hypotension associée au choc. La media reconstruite incubée en présence de lipopolysaccharides (LPS)

montre une contraction à l’histamine réduite via une augmentation de la production de NO, ce qui récapitule

152

adéquatement un choc endotoxinique dans un modèle de vaisseau humain reconstruit in vitro. L’ajout de l’IL-

10 durant cette période d’incubation bloque l’hyporéactivité de la media en antagonisant ainsi l’augmentation

du NO. Ces résultats ont été confirmés in vivo, chez la souris. Dans ce modèle animal, l’IL-10 prévient non

seulement l’hyporéactivité vasculaire, mais elle augmente également la survie des animaux injectés aux LPS.

Ces résultats sont prometteurs pour l’évaluation de cette cytokine comme traitement immunomodulateur et

pourront contribuer à l’augmentation du taux de survie des patients à cette condition pathologique

actuellement associée à une mortalité d’environ 50% [Galley et al., 1996]. Comme le choc septique entraîne

un état inflammatoire aigu, systémique et incontrôlable causant une hypotension généralisée, l’augmentation

de cette cytokine anti-inflammatoire et immunomodulatrice au niveau de la media sera vraisemblablement

bénéfique pour la fonction vasculaire. Ces résultats pourraient également expliquer le fait qu’un niveau plus

élevé de MP est un pronostique favorable lors du choc septique [Soriano et al., 2005]. De plus, ils supportent

l’observation que l’administration d’IL-10 recombinante aux personnes saines chez qui un choc endotoxinique

a été induit, via l’injection de LPS intraveineux, est bénéfique pour limiter le stress oxydatif, l’inflammation et la

dysfonction vasculaire [Kumar et al., 2005].

Une étude précédente, réalisée par Mostefai et al., a montré que l’injection de SMP humaines chez la souris

augmente la sensibilité de l’aorte à la sérotonine. Chez les souris traitées avec les LPS, les SMP préviennent

l’hyporéactivité causée par les LPS. Cet effet des SMP est réduit en présence d’un inhibiteur non sélectif de la

COX-2 (indométacine) et est aboli en présence d’un antagoniste du thromboxane A2 (SQ-29548) indiquant

que le mécanisme passe par une augmentation de la sécrétion de ce facteur [Mostefai et al., 2008b]. Ces

résultats concordent avec ceux rapportés au chapitre 3 pour la media humaine reconstruite et démontrent un

rôle protecteur des SMP sur la fonction vasculaire dans le choc septique. Toutefois, le lien entre le

thromboxane A2 et l’IL-10 reste à préciser dans cette situation. Une relation étroite existe en effet entre ces

deux molécules, car cette cytokine anti-inflammatoire régule le niveau d’expression de COX-2, une des

enzymes responsables de la synthèse des thromboxanes [Sikka et al., 2013].

Dans les travaux présentés au chapitre 3, l’influence des SMP humaines a été étudiée sur la media isolée

pour plusieurs raisons. D’abord, cette tunique est impliquée directement dans le processus d’hypotension

généralisée associé au choc septique. De son côté, l’endothélium est un acteur de premier plan dans la

réponse vasculaire aux SMP ainsi que dans le choc septique. Il influence notamment l’état de contraction de la

media dans cette condition pathologique. Toutefois, l’effet des SMP sur les vaisseaux complets murins, faisant

par conséquent intervenir principalement l’endothélium, a déjà été bien documenté par le groupe du

Dr Andriantsitohaina [Mostefai et al., 2008b, Mastronardi et al., 2011b]. Dans notre étude, la plasticité du

vaisseau reconstruit à partir de cellules humaines a donc été mise à profit pour étudier les effets des MP

spécifiques à la media.

153

Il serait intéressant de poursuivre l’étude des SMP sur les vaisseaux reconstruits humains en complexifiant le

modèle par l’ajout progressif de l’endothélium, puis de l’adventice. Dans un premier temps, il serait primordial

d’étudier l’interaction entre l’endothélium et la media au niveau de la modulation du tonus vasculaire dans le

vaisseau reconstruit par auto-assemblage en déterminant, par exemple, si les CE expriment les récepteurs

appropriés à leurs fonctions, si une lame élastique est présente et si des jonctions ouvertes se forment entre

les CE et les CML. Le niveau d’expression de joueurs clés dans la contraction comme les COX et les NOS

dans les deux types cellulaires, devrait également être déterminé. Dans un deuxième temps, il serait possible

d’interpréter les résultats d’une incubation de ce modèle humain avec les SMP. Ce projet présente cependant

plusieurs contraintes expérimentales liées au phénotype des CML et des CE. En effet, lorsque la media est

détachée de son support solide (le mandrin central), la chute de la tension dans la construction engendre la

perte progressive de la capacité contractile de cette tunique. Cet effet est vraisemblablement attribuable à un

processus analogue à celui identifié par le Dr Grenier au niveau des feuillets de CML [Grenier et al., 2006].

L’achat récent de bioréacteurs (Tissue Growth Technology, TGT) permettant de pressuriser l’intérieur du

vaisseau pourrait résoudre ce problème. Par contre, lors des 24 heures d’incubation en présence des SMP, il

risque d’être difficile de maintenir la pression à l’intérieur du vaisseau tout en conservant un volume de milieu

minimal pour limiter la consommation des SMP. Avant l’acquisition de ces bioréacteurs, une approche plus

simple fut testée pour répondre à la problématique de perte de la contraction de la media lors de

l’ensemencement des CE. Elle consiste à créer un vaisseau inversé dans lequel les cellules endothéliales sont

ensemencées à l’extérieur de la media. Comme ils demeurent sur le mandrin, ces vaisseaux conservent leur

capacité contractile et pourraient donc servir de modèle pour la suite des expériences faisant intervenir les

MP, l’endothélium et la media, dans un vaisseau reconstruit. Pour ce qui est des CE, la capacité de

l’endothélium à produire du NO est une caractéristique essentielle à leur fonction, car cette molécule agit à la

fois comme vasodilatateur et comme anticoagulant. Lors d’essais préliminaires de vasorelaxation

dépendantes de l’endothélium à l’aide de l’acétylcholine, aucune réponse n’a été obtenue. La sensibilité des

vaisseaux au NO a été vérifiée par une vasorelaxation au SNP indépendante de l’endothélium. C’est donc soit

l’endothélium qui ne produit pas assez de NO en présence d’acétylcholine, soit le NO est produit, mais il

n’atteint pas la media. La fonctionnalité limitée de cet endothélium pourrait être attribuable à l’absence des

forces de cisaillement, au temps de maturation limitée, à l’architecture inversée ou à l’origine veineuse des CE

utilisées. À notre connaissance, une seule étude rapporte une relaxation dépendante de l’endothélium sur un

vaisseau comportant un endothélium reconstruit (veine de cordon ombilical cryopréservée puis

endothélialisée), mais celle-ci est loin d’être convaincante [Hoenicka et al., 2007]. L’endothélium reconstruit

n’est peut-être pas suffisamment mature in vitro pour jouer son rôle de modulateur de la contraction. Cette

réactivité sub-optimale de l’endothélium pourrait être caractérisée par l’analyse de la présence du récepteur à

l’acéthylcholine, la présence de la eNOS, la capacité à produire du NO ou encore, le dosage du NO par

résonance paramagnétique électronique. Des cellules en passage faible (P0) pourraient être comparées à des

154

cellules cultivées sur plusieurs passages pour déterminer si ces facteurs sont perdus en culture. De plus, il

serait intéressant de déterminer si l’endothélium reconstruit sur la media est en mesure de produire du NO

suite à une stimulation à l’acétylcholine. Il serait possible de visualiser le NO grâce à la microscopie en temps

réel en présence d’une molécule fluorescente qui réagit avec le NO, le DAF-FM (4-amino-5-methylamino-2',7'-

difluorofluorescein) ou de quantifier la production du NO à l’aide de la résonance paramagnétique

électronique. Le conditionnement du tampon Krebs par des cellules endothéliales immobilisées sur des billes

[Gryglewski et al., 1986], utilisé lors de la vasoconstriction, permettrait de concentrer les métabolites issues

des cellules endothéliales et ainsi d'étudier leurs effets sur la media reconstruite [Gryglewski et al., 1988,

Moncada et al., 1991]. Finalement, les forces de cisaillement sont connues pour leur influence sur les CE,

notamment au niveau de la production de NO [Yang et al., 2013]. En effet, les zones de bifurcations

anatomiques dans le système artériel sont souvent la source de la dysfonction endothéliale, une condition

entraînant une altération de la vasorelaxation dépendante de l'endothélium. Ainsi, la culture en bioréacteur

des vaisseaux reconstruits comportant un endothélium pourrait fournir la stimulation nécessaire à la

fonctionnalisation des CE tout en conservant les propriétés contractiles des CML de la media, grâce à

l’application de forces de cisaillement et d’une pression intraluminale physiologique.

L’ajout de l’adventice dans le modèle précédent permettrait de voir si comme dans l’article sur les MP

lymphocytaires présenté au chapitre 2, cette tunique joue un rôle de modulateur dans la réponse. Cet aspect

ne présente pas de difficulté particulière au niveau de la reconstruction. Par contre, l’interaction moléculaire

entre les deux, ou même les trois, tuniques devrait être mieux documentée dans ce modèle de vaisseau

reconstruit avant d’entreprendre des études utilisant des MP de patients afin d’identifier les modulations

attribuables aux MP.

Dans les chapitres 2 et 3, la media seule a été incubée en présence des MP. Alors que les SMP humaines

potentialisent la contraction de la media à l’histamine, les MP lymphocytaires ne la modifient pas. Comme les

SMP sont isolées du plasma (chapitre 3), elles proviennent de diverses origines cellulaires, ce qui complexifie

l’analyse de leurs rôles et effets particuliers. Les MP produites in vitro (chapitre 2) proviennent d’un seul type

cellulaire, elles sont donc plus uniformes. En comparant les résultats des deux études, l’augmentation de la

contraction observée en présence des SMP n’est donc probablement pas attribuable aux MP d’origine

lymphocytaire présentes dans le mélange des MP étudiées. Pour déterminer quels types de MP sont

responsables de l’augmentation de la contraction, il serait intéressant de produire des MP à partir des

différents types cellulaires présents dans le sérum des patients en choc septique et de les combiner dans des

proportions retrouvées dans cette pathologie. L’incubation de la media reconstruite avec différents mélanges

de MP permettrait de déterminer quel type ou quelle combinaison de MP est responsable de l’augmentation

de la contraction de la media. Par ailleurs, il serait pertinent de déterminer si les MP de patients non septiques

peuvent influencer la contraction des vaisseaux humains reconstruits et d'évaluer si les résultats concordent

155

avec ceux du modèle animal dans lequel ces MP ne causent pas d’augmentation de la contraction [Mostefai et

al., 2008b].

6.2.3. Directions futures pour la recherche sur les microparticules

L’ajout de l’endothélium et l’optimisation de sa fonctionnalité représentent donc une étape importante, tant au

niveau de la finalité clinique que pour les études futures sur les MP. Cette optimisation doit tenir compte de la

préservation de la capacité contractile de la media. Il serait également intéressant d’inclure des cellules

immunitaires dans la paroi vasculaire comme les monocytes pour déterminer s’ils sont en mesure d’intervenir

dans la réponse aux MP.

La suite des travaux devrait s’orienter sur l’identification des mécanismes d’action des SMP. Ceux-ci

pourraient être étudiés in vitro suite à l’ajout d’inhibiteurs de certains récepteurs qui pourraient bloquer

l’interaction entre les MP et les CML. D’autre part, les outils d’imagerie en temps réel disponible au laboratoire

permettraient de visualiser les MP, soit avec des traceurs fluorescents ou par l’utilisation de la microscopie à

contraste interférentiel (DIC de l’anglais differential interference contrast). De plus, les MP présentent un

potentiel intéressant pour l’utilisation comme vecteur de médicament permettant une relâche ciblée à un

organe particulier. Finalement, l’utilisation des MP comme marqueur diagnostique devrait prendre de l’ampleur

au cours des prochaines années. Leurs implications pathologiques sont donc importantes à étudier pour bien

saisir leurs fonctions bénéfiques ou délétères et mener à des diagnostics plus précis et plus fiables.

L’utilisation du vaisseau reconstruit par auto-assemblage comme modèle pharmacologique offre de

nombreuses possibilités d’innovation. En effet, ces vaisseaux pourraient être reconstruits à partir de cellules

de patients présentant des prédispositions au développement des plaques d’athérome. De plus, l’utilisation de

la technologie d’interférence à l'acide ribonucléique (ARN) pour produire des populations de CML exprimant

des niveaux réduits de protéines d’intérêt permettrait de récapituler certaines pathologies vasculaires ou

d’étudier des cibles thérapeutiques potentielles.

Les problèmes techniques rencontrés au cours de ces travaux, notamment au niveau de capacité à produire

des feuillets avec certaines populations de CML, amènent à réfléchir sur l’amélioration du modèle de media

reconstruite sans toutefois négliger les avantages de la technique d’auto-assemblage. Les points à optimiser

étaient la résistance mécanique, la contractilité, la rapidité de production et la reproductibilité avec la majorité

des populations de CML. En effet, il est difficile d'obtenir des media de qualité à partir de certaines populations

de CML, particulièrement celles provenant d’explants de veine saphène.

156

6.3. Optimisation du substitut vasculaire à des fins

pharmacologique et clinique

6.3.1. Développement d’un échafaudage de MEC

Les chapitres 4 et 5 visaient l’optimisation du modèle de media humaine pour améliorer la résistance

mécanique et la contractilité ainsi que pour permettre la reconstruction de vaisseaux avec les CML de

n’importe quel patient. Pour ce faire, un échafaudage de MEC produit par auto-assemblage a été développé.

La capacité des fibroblastes dermiques à sécréter beaucoup de MEC a été mise à contribution pour fournir un

environnement tridimensionnel aux CML et pour permettre la manipulation du feuillet produit avec des

populations de CML produisant peu de MEC. L’utilisation de cet échafaudage confère à la media reconstruite

de nombreux avantages par rapport au modèle classique. Elle devient plus contractile, plus résistante, plus

facilement manipulable et le temps de production à partir de l’extraction des cellules du patient est réduit. De

plus, cet échafaudage permet de reconstruire des media avec des CML isolées de veines saphènes avec un

taux de succès plus important (résultats non montrés).

La MEC produite par auto-assemblage qui constitue cet échafaudage est fondamentalement différente des

autres biomatériaux utilisés en génie tissulaire. Les travaux présentés au chapitre 4 démontrent que cette

matrice peut être utilisée de manière analogue à ces biomatériaux pour soutenir la croissance de cellules

produisant peu de MEC. Malgré le faible recul sur cette nouvelle approche, l’échafaudage de MEC produit in

vitro représente vraisemblablement le meilleur biomatériau possible au point de vue de sa composition et de

sa structure. Il peut être produit à partir de fibroblastes allogéniques, pour une approche plus standardisée et

plus commercialement viable, ou de fibroblastes autologues, pour un risque de rejet nul et une approbation

plus facile de la part des organismes de réglementation.

La décellularisation d’une matrice fibroblastique a d’abord été proposée par L’Heureux et al. [L'Heureux et al.,

1998]. Dans ces travaux, un vaisseau de fibroblastes dermiques est traité dans l’eau apyrogène stérile pour

induire une lyse des cellules. La matrice est ensuite déshydratée, puis congelée avant d’être utilisée comme

membrane interne entre les CE et les CML. Elle sert dans ce cas de barrière acellulaire réduisant

potentiellement la resténose et supportant la croissance des CE à sa surface. Dans les chapitres 4 et 5, la

matrice décellularisée est utilisée comme un échafaudage pour supporter la culture d’un autre type cellulaire,

les CML, à l’intérieur de la matrice.

L’équipe de Dr Guérin au Centre universitaire d’ophtalmologie (CUO-recherche), en collaboration avec le

Dr Germain, utilise l’échafaudage de MEC reconstruit par auto-assemblage pour des études fondamentales

sur la cornée [Lake et al., 2013]. L’utilisation de la MEC produite par les fibroblastes de la cornée (kératocytes)

a permis d’étudier le rôle de l’intégrine α5β1 dans la cicatrisation de ce tissu. La composition de la MEC a

157

également été déterminée par spectroscopie de masse dans cette étude. Dans l’équipe du Dr Auger, les

travaux de maîtrise de Chanel Beaudoin-Cloutier ont repris l’utilisation du feuillet de matrice produit in vitro

puis décellularisé pour la reconstruction de la peau. Ces travaux proposent de produire un échafaudage de

MEC épais à partir d’un empilement de trois feuillets de fibroblastes dermiques allogéniques qui supportera

l’ensemencement de fibroblastes, puis de kératinocytes autologues à sa surface, fournissant l’environnement

nécessaire à la récapitulation partielle de la niche des cellules souches épidermiques. Il est ainsi possible de

réduire de manière considérable le temps nécessaire entre le prélèvement de la biopsie et la disponibilité

d’une peau reconstruite autologue pour la greffe chez les grands brûlés (travaux en cours).

Cet échafaudage de MEC offre donc de nombreuses possibilités pour plusieurs tissus. Nous avons voulu aller

encore plus loin et améliorer sa structure dans l’optique de le rendre plus physiologique et plus résistant.

L’induction d’un assemblage anisotropique de la MEC, en s’inspirant des tissus physiologiques, permet de

recréer l’architecture circonférentielle de la media.

6.3.2. Alignement de l’échafaudage

Les travaux présentés au chapitre 5 ont montré que l’architecture d’un échafaudage produit par auto-

assemblage peut être modulée en ensemençant les fibroblastes sur une surface de culture microstructurée.

En effet, la culture sur une surface en créneaux et en sillons de l’ordre du micron permet l’alignement des

cellules et l’assemblage anisotropique de la MEC [Guillemette et al., 2009]. Suite à sa décellularisation,

l’utilisation de l’échafaudage anisotropique pour la reconstruction de la media avec un alignement

circonférentiel permet d’accroître la contraction et la résistance mécanique. Il confère également une

architecture plus physiologique au substitut vasculaire final.

D’autres méthodes ont été proposées pour aligner la matrice extracellulaire dans un vaisseau reconstruit par

auto-assemblage. D’abord, les travaux de Dr Guillaume Grenier démontrent qu’une contrainte uniaxiale

statique imposée sur un feuillet de CML ou de fibroblastes induit la réorganisation du tissu après 7 jours et

permet une augmentation de la résistance mécanique du feuillet. La contraction de la media reconstruite avec

ce feuillet est également augmentée [Grenier et al., 2005]. Ensuite, les travaux de Dr Robert Gauvin se sont

intéressés à l’imposition d’une contrainte uniaxiale dynamique. Le feuillet de fibroblaste étiré à 10% de sa

longueur de manière statique ou dynamique (1 Hz, 72 heures) devient plus résistant dans la direction

d’imposition de la déformation, particulièrement en condition dynamique [Gauvin et al., 2011b]. Toutefois, le

désavantage de ces deux méthodes est que la MEC est produite de manière aléatoire par les cellules avant

d’être réarrangée en réponse à la contrainte imposée. De plus, ces méthodes complexifient la production de

substituts, car elles nécessitent le détachement du feuillet de son support de culture, puis sa manipulation

pour la mise sous tension ou sous contrainte. Enfin, dans ces deux études, la constriction uniaxiale du tissu se

fait en fixant deux des quatre côtés du feuillet, entraînant une déformation non uniforme de celui-ci, qui adopte

158

alors une forme de sablier. Cette déformation intrinsèque à la réorganisation de la MEC entraîne une perte

importante de la surface de tissu utilisable pour produire le substitut vasculaire. Malgré ces contraintes, ces

travaux démontrent qu’il est possible d’améliorer les substituts reconstruits par auto-assemblage en les

rendant anisotropiques. Les travaux de Dr Maxime Guillemette proposent une approche alternative pour

aligner la MEC et les cellules dans les vaisseaux reconstruits par auto-assemblage. La culture des cellules sur

une surface microstructurée permet d’aligner la matrice et les cellules dès le départ : la méthode est simple au

point de vue de la culture des cellules, l’alignement est uniforme et toute la surface est utilisable [Guillemette

et al., 2009]. Ces travaux ont montré une amélioration de la transparence des cornées reconstruites à partir de

kératocytes ainsi qu’une augmentation de la résistance mécanique de la media reconstruite et du feuillet de

fibroblastes dermiques après alignement. En collaboration avec Dr Guillemette, nous avons également

démontré que la contraction de la media augmente suivant son alignement circonférentiel (résultats non

publiés). Les travaux présentés au chapitre 5 se sont donc inspirés des résultats précédents pour développer

un échafaudage de MEC produite in vitro par les fibroblastes dermiques selon une architecture déterminée

pour la reconstruction de la media. La technique du Dr Guillemette a été choisie en raison de sa simplicité et

de son efficacité. En effet, elle n’implique ni le détachement du feuillet, ni sa manipulation subséquente. De

plus, la matrice est directement assemblée de manière orientée.

L’utilisation d’un échafaudage de MEC aligné pour la reconstruction de la media présente plusieurs avantages.

L’alignement circonférentiel des cellules augmente la résistance mécanique et la contraction sans augmenter

la rigidité de la construction. Cet alignement permet de minimiser la dépense d’énergie nécessaire à la

contraction maximale, car les cellules contractent la matrice dans une orientation majoritairement

circonférentielle.

De plus, l’utilisation de ce nouveau modèle de media permettra de faciliter l’étude des MP sur la fonction de

cette tunique. En effet, des niveaux de contraction plus grands et plus constants permettent de constater plus

facilement les variations métaboliques dues au traitement. Bien que la capacité contractile de différentes

populations de CML soit variable même avec un échafaudage, l’utilisation de celui-ci permet de reconstruire

des media facilement manipulables avec toutes les populations de CML testées (résultats non montrés) et

ainsi de pouvoir analyser en vasoconstriction des populations qui produisent peu de MEC.

6.3.3. Directions futures pour la recherche sur les échafaudages alignés

La suite de ces travaux pourrait comporter deux volets principaux : l’utilisation du modèle de vaisseau

reconstruit avec échafaudage pour effectuer des études pharmacologiques et la production d’un substitut

artériel autologue de manière standardisée et répétable.

159

Toutefois, plusieurs améliorations pourraient encore être apportées au modèle pour diminuer le temps de

production et augmenter la sécurité pour le receveur. D’abord, le temps entre l’ensemencement des CML et le

roulage a été arbitrairement fixé à une semaine pour permettre une certaine prolifération et migration

cellulaire. Les expériences de microscopie en temps réel démontrent que les CML s’alignent au moment de

l’adhésion au dMS. Ainsi, il serait possible de réduire cette maturation jusqu’à aussi peu que 24 heures en

ensemençant une quantité plus grande de CML. Le nombre de cellules a également été fixé de manière

arbitraire et pourrait être optimisé afin de favoriser le développement d’une media contenant une plus grande

quantité de CML.

Ensuite, au niveau du processus de décellularisation, les tests de viabilité du tissu se sont limités à une

observation de l’absence d’activité mitochondriale par un test au sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) (non montré), à l’absence de noyau et d’actine filamenteuse

dans les dMS en immunofluorescence et à l’absence de cellules GFP positives suite à la décellularisation d’un

feuillet produit par des fibroblastes transgéniques exprimant la GFP (non montré). Bien que les résultats

obtenus soient clairs, une analyse plus approfondie de la possibilité qu’une cellule survive au processus de

décellularisation sera nécessaire préalablement à l’implantation chez le patient. De plus, la présence de débris

cellulaires produits lors de la lyse des fibroblastes dans les dMS pourrait engendrer une réaction immunitaire

ou inflammatoire. Une évaluation de l’ADN résiduel grâce au PicoGreen®, un composé fluorescent qui se lie à

l’ADN double brin, permettrait de quantifier le niveau de cet élément potentiellement immunogène. Une

optimisation de la technique de décellularisation pour retirer la majorité des débris cellulaires et de l’ADN

génomique retenus dans la MEC serait donc appropriée. Par exemple, l’ajout d’un traitement à la DNase

pourrait diminuer la quantité d’ADN restant dans l’échafaudage. L’utilisation de détergents non ioniques

comme le désoxycholate de sodium aiderait également à l’élimination des débris, mais risque d’endommager

les composantes plus fragiles de la MEC. Finalement, l’utilisation d’une approche dynamique serait une

méthode à privilégier afin d’améliorer l’efficacité de la décellularisation sans modifier les produits utilisés. En

effet, placer les tissus sur une plaque agitatrice permettrait de créer une circulation du liquide afin de déloger

les débris cellulaires accrochés à la matrice. D’un autre côté, la colonisation du dMS par les CML autologues

pour une période de quatre semaines avant l’implantation pourrait réduire l’impact de la présence des débris

cellulaires. En effet, ces débris seront potentiellement dégradés par les protéases, RNases et autres enzymes

sécrétées par les CML avant l’implantation. Cet effet est difficile à évaluer puisque ces débris sont difficilement

discernables de ceux dérivés d’une potentielle apoptose des CML autologues. De plus, le modèle n’a pas

encore été testé chez l’animal. L’approche pour ces tests serait d’isoler des CML de rats pour les ensemencer

dans un dMS humain avant d’implanter le modèle chez un rat syngénique. Cependant, les CML de rats

ensemencées dans une matrice d’origine cellulaire humaine pourraient avoir tendance à dégrader cette

matrice et à diminuer la résistance mécanique de la construction. L’utilisation de dMS d’origine animale

160

pourrait potentiellement donner de meilleurs résultats, mais le substitut produit deviendrait alors peu

représentatif du produit final. C’est pourquoi le modèle idéal serait un dMS humain ensemencé de CML

humaines, puis roulé autour d’un mandrin. Ce modèle pourrait être greffé sur l’aorte de rats athymiques en

position infrarénale.

D’autre part, la population de fibroblastes dermiques utilisée pour la fabrication des dMS était une population

cellulaire commune du laboratoire isolée d’une femme de 38 ans suite à une réduction mammaire. Les

résultats préliminaires du laboratoire de Dre Germain montrent que les substituts reconstruits à partir de

fibroblastes de nouveau-nés (prépuce) sont plus épais que ceux reconstruits à partir de fibroblastes adultes. Il

sera donc facile d’optimiser l’échafaudage en testant différentes populations pour comparer leur résistance

mécanique. L’utilisation de cellules allogéniques permet de choisir la meilleure population, d'en faire une

banque de cellules et de l’utiliser pour un grand nombre de patients.

Au niveau fondamental, le mécanisme de pivotement des cellules de la deuxième couche reste toujours

indéterminé. Ce phénomène intriguant a été rapporté par Dr Guillemette et concerne le comportement des

cellules à la surface d’un feuillet composé de cellules vivantes et de MEC [Guillemette et al., 2009]. Plutôt que

de s’orienter dans la direction de la MEC du feuillet, ces cellules ont tendance à s’aligner en respectant un

certain angle par rapport à la direction de celles présentes dans la couche sous-jacente. Cet angle est

différent en fonction du type cellulaire étudié. Par contre, les mécanismes cellulaires impliqués n’ont pas été

identifiés. Dans le but d’élucider ce phénomène, certaines expériences ont été entamées au cours de mon

doctorat, particulièrement au niveau de la cornée. Les transcriptomes des kératocytes et des fibroblastes

dermiques cultivés sur des substrats microstructurés ou contrôles ont été comparés. L’analyse des résultats

des puces à ADN est en cours. Pour déterminer si le pivotement est induit par la matrice ou par les cellules,

nous avons produit des feuillets à partir de fibroblastes dermiques, de kératocytes ou de CML. Ces feuillets

ont été décellularisés ou non, à différents temps (7, 15 ou 21 jours), puis des CML-DsRed ont été

ensemencées sur le dessus. Les résultats préliminaires obtenus suggèrent que la matrice seule est capable

d’induire un pivotement des cellules. Ce résultat concorde avec ce qui a été observé au chapitre 5.

La portée de ces travaux est substantielle au niveau du développement de prothèses vasculaires par génie

tissulaire, elle permettra de produire des vaisseaux de remplacement pour tous les patients et ce, de manière

plus standardisée et plus rapide que la technique d’auto-assemblage standard. Ces prothèses seront de plus

en plus en demande car, malgré la régression de la mortalité associée aux MCV, le vieillissement de la

population risque d’amener une demande importante pour ce type de technologie dans un avenir rapproché.

De plus, l’utilisation de cet échafaudage permettra de mettre au point un modèle de media pathologique pour

la réalisation d’étude pharmacologique visant le développement de médicaments pour contrer l’initiation et la

161

progression de l’athérosclérose. Enfin, des architectures plus complexes pourraient également être produites

pour recréer des tissus comme les feuillets de valves cardiaques, par exemple.

En terminant, l’échafaudage acellulaire développé au cours de ces travaux possède une valeur commerciale

non-négligeable. En effet, étant donné que cette nouvelle approche permettrait une utilisation allogénique de

cette matrice produite in vitro par auto-assemblage, d’une manière qui peut être entièrement contrôlée et

standardisée, sa rentabilité serait plus intéressante qu’une approche entièrement autologue. Cet échafaudage

serait, par conséquent, un produit commercialisable au même titre que d’autres biomatériaux.

6.4. Conclusion Générale

Les travaux présentés dans cet ouvrage ont permis de décortiquer l’influence des MP sur certaines des

tuniques vasculaires et de définir quelques-uns des mécanismes de signalisation impliqués. Notamment, la

portée de l’augmentation des MP au cours du choc septique sur la capacité contractile de la media vasculaire

a été établie dans un modèle humain. En effet, la combinaison des MP isolées du sérum de patients en choc

septique et des vaisseaux reconstruits par auto-assemblage à partir de cellules humaines a permis de

démontrer que ces MP protègent la fonction vasculaire en potentialisant la réponse contractile de la media aux

agonistes vasoconstricteurs comme l’histamine. De plus, ce modèle d’étude in vitro complètement humain a

permis d’isoler la media des autres composantes de la paroi vasculaire pour ainsi démontrer que les MP de

patients en choc septique entraînent l’augmentation de l’IL-10 dans cette tunique. Cette augmentation

explique vraisemblablement l’observation clinique que le niveau de MP circulantes retrouvé in vivo corrèle

positivement avec le pronostique de survie des patients [Soriano et al., 2005]. Finalement, ces études

pourraient avoir des retombées importantes sur la survie des patients en choc septique, une condition aux

conséquences funestes pour un patient sur deux. En effet, les résultats obtenus pourraient conduire à

l’utilisation clinique d’une thérapie immunomodulatrice impliquant cette cytokine et permettre d’offrir de

nouvelles avenues pour la prise en charge des patients.

D’autre part, l’échafaudage de MEC produite par auto-assemblage développé lors de cette formation doctorale

offre des possibilités considérables dans la reconstruction de différents tissus. Il s’agit de la première

publication faisant état de l’utilisation de la MEC, produite par des cellules in vitro, comme biomatériau pour la

reconstruction d’un tissu par génie tissulaire. Cette approche est versatile et peut s’appliquer à de nombreux

tissus reconstruits. En effet, elle est déjà à l’étude pour son application au modèle de peau reconstruite. Elle

combine l’exceptionnelle MEC produite par auto-assemblage à la rapidité de production des substituts basés

sur l’utilisation des biomatériaux classiques. L’utilisation d’une surface de culture microstructurée permet de

modéliser l’échafaudage de MEC pour y intégrer l’architecture physiologique souhaitée. Il est ainsi possible de

produire des tissus répondant à des besoins physiologiques précis. Ces travaux renforcent l’utilisation de la

media reconstruite comme modèle d’études pharmacologiques en permettant de reconstruire des vaisseaux à

162

partir de cellules vasculaires provenant de vaisseaux pathologiques. De plus, cet échafaudage rend réalisable

la création d’une prothèse vasculaire autologue à partir des cellules de n’importe quel patient. Celle-ci contient

des cellules vasculaires vivantes et vasoactives qui favoriseront la réparation de la paroi vasculaire et son

adaptation aux conditions hémodynamiques. Par conséquent, ces prothèses représentent une avancée

importante dans l’amélioration du substitut vasculaire reconstruit par auto-assemblage à visée clinique.

163

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181

ANNEXES -

CONTRIBUTIONS À DES TRAVAUX SOUMIS OU PUBLIÉS

Annexe 1 : J-M. Bourget, M. Guillemette, F.A. Auger, T. Veres, L. Germain. Alignment of cells and ECM within tissue-engineered substitutes. In the book: Advances in Biomaterials Science and Applications in Biomedicine, InTech, ISBN 980-953-307-856-9, avril 2013. Annexe 2 : J-M. Bourget, V. Laterreur, M. Guillemette, R. Gauvin, C. Miville-Godin, M. Mounier, J. Ruel, F.A. Auger,

T. Veres, L. Germain. Recent advances in the development of tissue-engineered vascular media made by self-assembly. Proceeding of the 3rd International Conference on Tissue Engineering, Leiria, Portugal, 6-8 juin 2013,

Procedia Engineering, 2013 59:201-05. Annexe 3 : R. Gauvin, M. Guillemette, T. Galbraith, J-M. Bourget, D. Larouche, H. Marcoux, D. Aubé, C. Hayward,

F.A. Auger, L. Germain. Mechanical properties of tissue-engineered vascular constructs produced using arterial or venous cells.

Tissue Eng. Part A, 2011 17(15-16):2049-59. PMID: 21457095 Annexe 4 : S. Proulx, J-M. Bourget, N. Gagnon, S. Martel, A. Deschambeault, P. Carrier, C.J. Giasson, F.A. Auger, I.

Brunette, L. Germain. Optimization of the culture conditions for porcine corneal endothelial cells. Mol Vis. 2007 13:524-33. PMID: 17438517 Annexe 5 : F. Bisson, C. Paquet, J-M. Bourget, K. Zaniolo, P.J. Rochette, O. Damour, F. Boudreau, F.A. Auger, S.L.

Guérin, L. Germain. Contribution of the transcription factor Sp1 to the preservation of telomerase activity in human skin keratinocytes cultured with a feeder layer.

En révision dans la revue Journal of Cellular Physiology. Annexe 6 : J. Dubé, J-M. Bourget, R. Gauvin, H. Lafrance, C.J. Roberge, F.A. Auger, L. Germain. Progress in

developing a living human tissue-engineered tri-leaflet heart valve assembled from tissue produced by the self-assembly approach.

Acta Biomaterialia, 2014, sous presse, 2014 May 6. PMID: 24813743. Annexe 7 : C. Tremblay, J. Ruel, J-M. Bourget, V. Laterreur, K. Vallières, M. Tondreau, D. Lacroix, L. Germain,

Ph.D., and F.A. Auger. A New Construction Technique for Tissue-Engineered Heart Valves using the Self-Assembly Method.

Tissue Eng. Part C, 2014, sous presse. 2014 Apr 3 PMID: 24576074

Annexe 8 : V. Laterreur, J. Ruel, F.A. Auger, K. Vallières, C. Tremblay, D. Lacroix, M. Tondreau, J-M. Bourget, L. Germain. Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterisation of tissue-engineered vascular substitutes.

Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials 2014 34:253-63. PMID: 24631624 Annexe 9 : R. Guidoin, R. Zegdi, J. Lin, J-M. Bourget, O. Rochette-Drouin, T. How, X. Guan, B. Li, P. Bruneval, L.

Germain, L. Wang, Z. Zhang, Y. Douville. Valve crimping: the inescapable step in percutaneous cardiac surgery made safer. En révision dans la revue Journal of Healthcare Engineering.

Annexe 10 : M.Y. Tondreau, V. Laterreur, K. Vallières, J-M. Bourget, C. Tremblay, D. Lacroix, L. Germain, J. Ruel,

F.A. Auger. A tissue-engineered fibroblast-derived acellular scaffold for vascular applications. Soumis à la revue Biomaterials.

182

Annexe 1

Abstract (non publié)

Tissue engineering is an emerging field aiming at creating in vitro tissues and organs substitutes that will be ultimately grafted on patients. Trying to engineer more physiologic substitutes is one of the main challenges of this field. An important aspect of the physiology of a tissue is its tridimensional geometry that relies on cell and extracellular matrix orientation within the construct. In order to recreate a desired geometry, tissue engineers have developed new approaches combining traditional tissue engineering with nano-microstructured materials. We have chosen to describe five different techniques that are of major importance in the field as well of summarising some of the evidence based findings that have been publish. Those cell/extracellular matrix alignment techniques include collagen gel compaction, electromagnetic field, electrospinning of fiber, microstructured culture plate and mechanical strain.

Chapitre 14 du livre Advances in Biomaterials Science and Biomedical Applications, édité par R. Pignatello.

Ma participation la réalisation de ce chapitre de livre inclus la revue de littérature, la rédaction du manuscrit (en

collaboration avec Guillemette) et la production des figures.

183

Annexe 2

Cet article est une courte revue sur les nouveaux modèles de vaisseaux reconstruits par génie tissulaire au

LOEX et leur utilisation pharmacologique. Cet article était demandé dans le cadre d’une présentation orale lors

du congrès 3rd International Conference on Tissue Engineering, Leiria, Portugal, en juin 2013.

Dans cet article de revue, ma contribution consiste en la rédaction du manuscrit, la production des figures et la

présentation de la conférence sur l’alignement de l’échafaudage de la matrice extracellulaire reconstruit par

auto-assemblage pour l’ingénierie de la media.

184

Annexe 3

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Robert Gauvin au LOEX, consiste à la réalisation

de manipulations pour répondre aux questions des arbitres et à la révision du manuscrit.

185

Annexe 4

Ma participation à ces travaux, réalisés principalement par Stéphanie Proulx et moi au LOEX (au cours d’un

stage de premier cycle dans le laboratoire de Dr Germain sous la supervision de Dr Proulx, automne 2005),

consiste à la réalisation d’une partie des manipulations et l’analyses des données.

186

Annexe 5

Contribution of the transcription factor Sp1 to the preservation of Telomerase Activity in Human Skin

Keratinocytes Cultured with a Feeder Layer

Francis Bisson1,2, Claudie Paquet1,2, Jean-Michel Bourget1,2, Karine Zaniolo2,3, Patrick J. Rochette1,2,3,4, Odile

Damour5, François Boudreau6, François A. Auger1,2, Sylvain L. Guérin1,2,3,4* and Lucie Germain1,2,3,7*.

1. Centre LOEX de l'Université Laval;

2. Médecine Régénératrice - Centre de recherche FRQS du CHU de Québec;

3. CUO-Recherche, Québec, Canada;

4. Département d'ophtalmologie et ORL - chirurgie cervico-faciale, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, Qc, Canada;

5. Banque de Tissus et Cellules HCL, Laboratoire des Substituts Cutanés (LSC) CNRS UPR-412, Hôpital Edouard Herriot, Lyon, France;

6. Département d’Anatomie et de Biologie Cellulaire, Faculté de Médecine, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada;

7. Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada.

* Equal senior authors

Abstract

The growth of primary keratinocytes is improved by culturing them with a feeder layer. The aim of this study was to assess whether the feeder layer increases the lifespan of cultured epithelial cells by maintaining or improving telomerase activity and expression. The addition of an irradiated fibroblast feeder layer of either human or mouse origin (3T3) helped maintain telomerase activity as well as expression of the transcription factor Sp1 in cultured keratinocytes. In contrast, senescence occurred earlier, together with a reduction of Sp1 expression and telomerase activity, in keratinocytes cultured without a feeder layer. Telomerase activity was consistently higher in keratinocytes grown on all three feeder layers tested relative to cells grown without it. While Sp1 was highly expressed in actively proliferating keratinocytes, c-Myc was barely detectable by both gene profiling on microarrays and Western blot analyses. Suppression of Sp1 expression by RNAi also reduced telomerase activity in keratinocytes suggesting that Sp1 is required for telomerase gene expression in these cells. Therefore, the results of the present study suggest that the beneficial influence of the feeder layer relies on its ability to preserve telomerase activity in cultured human keratinocytes through the maintenance of stable levels of Sp1 expression.

En révision, Journal of cell physiology, décembre 2013

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Francis Bisson et Claudie Paquet au LOEX (au

cours d’un stage de premier cycle dans le laboratoire de Dr Germain, été 2006), consiste à la réalisation d’une

partie des manipulations, l’analyses des données et la révision du manuscrit.

187

Annexe 6

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Jean Dubé au LOEX en collaboration avec

Edwards Lifesciences® LLC, consiste à l’analyse des données et à la rédaction du manuscrit, en collaboration

avec Dr Gauvin.

188

Annexe 7

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Catherine Tremblay au LOEX, consiste à la

réalisation d’une partie des manipulations (colorations picrosirius red), des discussions sur l’élaboration du

protocole expérimental et sur les différents problèmes rencontrés ainsi que la révision du manuscrit.

189

Annexe 8

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Véronique Laterreur au LOEX, consiste à des

discussions sur l’élaboration du protocole expérimental et sur les différents problèmes rencontrés ainsi que la

révision du manuscrit.

190

Annexe 9

Valve crimping: the inescapable step in percutaneous cardiac surgery made safer

Robert Guidoin1, Rachid Zegdi2, Jing Lin3, Jean-Michel Bourget4, Olivier Rochette-Drouin4, Thien How5,

Xiaoning Guan3, Bin Li1, Patrick Bruneval2, Lucie Germain4, Lu Wang3, Ze Zhang1, Yvan Douville1.

1. Department of Surgery, Laval University and Research Centre, St. François d'Assise Hospital, CHU, Quebec (QC), Canada;

2. Services de Chirurgie Cardiovasculaire et de Pathologie, Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France;

3. Key Laboratory of Textile Science and Technology of the Ministry of Education, College of Textile, Donghua University, Shanghai, P.R. China;

4. Department of Surgery, Laval University and LOEX, CHU, Quebec (QC), Canada;

5. Institute of Ageing and Chronic Disease, University of Liverpool, Liverpool UK;

6. Departments of Pathology, Hôpital Européen George Pompidou, Université Paris Descartes, Paris, France.

Abstract

Percutaneous deployment of heart valves represents the breakthrough of the last decades in the armamentarium of cardiac surgeons. Prior to deployment, the devices must be crimped and loaded into sheaths of diameters that can be as low as 6 mm for a valve 23 mm in diameter. This procedure should be accomplished without any alteration or damage to the components of the valve in order to ensure the long-term durability and functionality. The potential benefits of a polyester fabric cuff to prevent the contact between the pericardium tissue and the Nitinol stent were examined in gross observation, micro CT scan and analysed histologically. This fabric cuff was shown to make the procedure much safer that it was anticipated. Therefore, it is recommended that appropriate design features should be incorporated into percutaneous valves to ensure that the handling procedures at implantation are harmless to the device.

Soumis à la revue Journal of Healthcare Engineering, en révision.

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Robert Guidoin au CHU consiste à la réalisation

d’une partie des manipulations (Observation des lames d’histologies avec Dr Guidoin) pour répondre aux

questions des arbitres ainsi que la révision du manuscrit.

191

Annexe 10

A tissue-engineered fibroblast-derived acellular scaffold for vascular applications

Maxime Y. Tondreaua, Véronique Laterreura,b, Karine Vallièresa, Jean-Michel Bourgeta, Catherine

Tremblaya,b, Dan Lacroixa, Lucie Germaina, Jean Ruelb, Francois A. Augera.

a Centre LOEX de l'Université Laval, Génie tissulaire et régénération: LOEX – Centre de recherche FRQS du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec, and Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université Laval, Québec, QC, Canada;

b Department of Mechanical Engineering, Université Laval, Québec, QC, Canada.

Abstract

There is a clinical need for tissue-engineered small-diameter (<6 mm) vascular grafts because clinical

applications are limited by the limited availability of suitable autologous or synthetic grafts. This study presents

the use of the self-assembly approach to produce an allogeneic and fibroblast-derived vascular scaffold

available off-the-self. Briefly, fibroblast cellular sheets were produced by culturing the cells in presence of

ascorbic acid for 3 weeks. The sheets were then rolled around a 4.7-mm mandrel and allowed to fuse during a

4-week maturation phase. The vessels were then decellularized by immersion in deionized water and the

resulting scaffolds were preserved at 4°C. Some of the vessels were then endothelialized and perfused for 1

week within a bioreactor. The decellularization and endothelialization processes did not influence the

mechanical strength of the tissue. We estimate that stored fibroblast-derived vascular scaffolds could be used

to deliver readily implantable grafts within 3 weeks, greatly accelerating the clinical availability of completely

biological vascular grafts.

Soumis à Biomaterials, Janvier 2014

Ma participation à ces travaux, principalement réalisés par Maxime Y. Tondreau au LOEX, consiste en des

discussions sur l’élaboration du protocole expérimental et sur les différents problèmes rencontrés ainsi que la

révision du manuscrit. De plus, j’ai optimisé l’utilisation des bioréacteurs utilisés dans cette étude.