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Sciences fondamentales
Viabilit�e des protheses art�erielles modifi�eespar g�enie tissulaire
Natalio Garcıa-Honduvilla,1 Bel�en Domınguez,2 Gemma Pascual,2 Cristina Escudero,3
Francisco Minguela,4 Juan Manuel Bellon,1 Julia Buj�an,2 Madrid, Espagne
La recherche de substituts vasculaires de petit/moyen diametre est un souci continu pour leschirurgiens vasculaires. Des substituts modifi�es par g�enie tissulaire ont �et�e concus pour etreutilis�es en position art�erielle et �evalu�es dans un modele in vivo chez le chien. Trois groupesd’�etude ont �et�e �etablis : polyt�etrafluoro�ethylene expans�e commercialis�e (ePTFE ; controle,n¼ 24), ePTFE ensemenc�e avec des cellules endoth�eliales (protheses CE, n¼ 12), et ePTFEavec une matrice de fibroblaste ensemenc�ee avec des CE (protheses MF + CE, n¼ 12). Lesprotheses ont �et�e soumises a un circuit f�emoral ex vivo sp�ecialement concu et implant�ees auniveau de l’artere carotide pendant 60 jours. La viabilit�e des protheses a �et�e �evalu�ee. Le circuitex vivo a montr�e que la pr�esence d’une matrice de fibroblastes induisait plus qu’un doublementde la r�etention de cellules par comparaison aux protheses CE. On a observ�e une r�eductionsignificative de l’adh�erence des plaquettes aux protheses CE. Apres leur implantation in vivo, lesprotheses modifi�ees �etaient plus r�esistantes a l’occlusion que les protheses classiques. Lesprotheses MF + CE induisaient plus d’endoth�elialisation que celles ensemenc�ees avec des CEseules. La r�eponse d’hyperplasie intimale �etait r�eduite dans les substituts CE. Des diff�erencessignificatives en cellules apoptotiques existaient entre les protheses en ePTFE CE et controles.En conclusion, les substituts modifi�es par g�enie tissulaire ont une perm�eabilit�e am�elior�ee parrapport aux protheses en ePTFE. La prothese CE �etait la meilleure pour pr�evenir la rest�enose,un bon indicateur de l’efficacit�e a long terme des protheses.
INTRODUCTION
Les biomat�eriaux en polymere peuvent etre
employ�es comme substituts art�eriels chez les
DOI of original article: 10.1016/j.avsg.2007.12.007.1Department of Surgery, Faculty of Medicine, University of Alcal�a,
Alcal�a de Henares, and Networking Research Center on Biomaterialsand Nanomedicine (CIBER-BBN), Madrid, Espagne.
2Department of Medical Specialities, Faculty of Medicine, Universityof Alcal�a, Alcal�a de Henares, and CIBER-BBN, Madrid, Espagne.
3Service of Experimental Surgery, Puerta de Hierro Hospital, Ma-drid, Espagne.
4Service of Vascular Surgery, La Paz Hospital, Madrid, Espagne.
Correspondance : Julia Buj�an, MD, PhD, Department of MedicalSpecialities, Faculty of Medicine, University of Alcal�a, Ctra. Madrid-Barcelona Km 33,600, 28871 Alcal�a de Henares, Madrid, Espagne, E-mail: [email protected]
Ann Vasc Surg 2008; 22: 255-265DOI: 10.1016/j.acvfr.2008.05.003� Annals of Vascular Surgery Inc.�Edit�e par ELSEVIER MASSON SAS
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patients qui manquent de substituts autologues
pour un pontage, comme la veine saphene ou l’ar-
tere mammaire interne.1,2 Cependant, la throm-
bose et l’hyperplasie intimale continuent d’etre les
causes principales de l’�echec des pontages de petit et
de moyen calibre.3
L’hyperplasie intimale, processus par lequel une
nouvelle couche est form�ee appel�ee « myointima/
n�eointima, » a lieu en r�eponse au processus de
r�eparation l�esionnelle qui se produit dans la paroi
vasculaire. Ce processus est caract�eris�e par la pro-
lif�eration de cellules et par la synthese et le d�epot
de matrice extracellulaire. C’est la croissance exces-
sive de la matrice extracellulaire qui aboutit a la
st�enose, a la rest�enose, et/ou a l’occlusion.4
Cependant, dans les techniques de d�eveloppement
de protheses par g�enie tissulaire, les cellules mus-
culaires lisses jouent un role principal parce qu’elles
peuvent �egalement servir de squelette n�ecessaire a
l’ensemencement de cellules endoth�eliales (CE).
Vol. 22, No. 2, 2008 Viabilit�e des substituts issus du g�enie tissulaire 279
Les avanc�ees r�ecentes dans notre connaissance de
la biologie de ce ph�enomene ont indiqu�e que l’en-
doth�elium joue un role important dans ces proce-
sus.5,6 Le probleme pourrait etre r�esolu si la
lumiere d’une prothese vasculaire pouvait etre
garnie de CE.7 La possibilit�e de recouvrir les pro-
theses vasculaires de petit calibre pour am�eliorer
leur perm�eabilit�e a long terme repr�esenterait une
avanc�ee capitale en chirurgie vasculaire. Les efforts
faits jusqu’ici dans cette direction ont inclus l’ense-
mencement de la surface proth�etique8 avec
diff�erents types de cellules tels que les CE,9 les
myofibroblastes, et les cellules m�esotheliales.10 En
effet, la greffe de CE sur les protheses vasculaires a
signifi�e une grande avance pour la technologie tis-
sulaire car elle peut th�eoriquement r�eduire l’�echec
de pontage en am�eliorant la perm�eabilit�e.11
A ce jour, la science m�edicale a combin�e la substi-
tution et la r�eg�en�eration pour se concentrer sur la
recherche d’un substitut vasculaire similaire en
structure et en fonction au vaisseau natif. L’utilisa-
tion de cellules vivantes, en manipulant l’environ-
nement extracellulaire, et la cr�eation de substituts
biologiques entrent dans le champ de la m�edecine
r�eparatrice, dont l’objectif est de cr�eer des substituts
biologiques qui r�etabliront des fonctions
normales.12
Un des secteurs d’activit�e intense dans la recher-
che en g�enie tissulaire a �et�e l’�elaboration d’une
m�ethode ad�equate pour cr�eer une construction
tissulaire tubulaire. Quelques auteurs ont pu cr�eer
des substituts modifi�es exclusivement avec des cel-
lules, bien que dans la plupart des �etudes un
mat�eriel normal ou synth�etique ait �et�e employ�ecomme squelette. Notre groupe de recherche a
essay�e d’am�eliorer les propri�et�es du polyt�etrafluo-
ro�ethylene expans�e (ePTFE) avant son implantation
in vivo,5,10 et nous avons maintenant des donn�ees
suffisantes pour passer a l’�evaluation du comporte-
ment apres implantation de plusieurs constructions
potentielles.
Le but de cette �etude �etait de pr�eparer des vais-
seaux en g�enie tissulaire pour une utilisation en
tant que substituts vasculaires. Les substituts
modifi�es ont �et�e �evalu�es en termes de leur capacit�eantithrombotique et leur capacit�e d’am�eliorer le
processus de cicatrisation ou l’hyperplasie intimale
dans un modele exp�erimental in vivo chez le chien.
MATERIELS ET METHODES
Trois groupes de protheses art�erielles ont �et�e�etudi�es: des protheses en ePTFE utilis�ees en pratique
clinique (controle, n¼ 24), des protheses pr�epar�ees
par ensemencement de CE sur une prothese en
ePTFE (CE, n¼ 12), et des protheses pr�epar�ees en
recouvrant une prothese en ePTFE avec une matrice
de fibroblastes ensemenc�ee avec des CE (MF + CE,
n¼ 12).
Obtention des cellules autologues
Les CE �etaient obtenues a partir de veines jugulaires
de chiens batards (15-25 kg). Une cervicotomie
verticale bilat�erale �etait faite pour exposer les deux
veines jugulaires, qui �etaient clamp�ees par deux
points s�epar�es de 8-10 cm. Apres que le segment de
veine ait �et�e pr�elev�e, les CE �etaient isol�ees par
canulation de la veine pour introduire de la
collag�enase de type I a 0,1%.
Les fibroblastes �etaient pr�elev�es au niveau de l’in-
cision cutan�ee. Les �echantillons �etaient coup�es en
petits explants et plac�es dans des fioles de culture.
Les cultures �etaient incub�ees dans du milieu
M-199 et de McCoy a 37 �C dans une atmosphere
a 5% de CO2 jusqu’a confluence.
Ensemencement cellulaire sur les
substituts art�eriels
La surface proth�etique �etait trait�ee avec une solu-
tion de fibronectine comme adh�esif (20 mg/mL.
Apres le traitement, les protheses vasculaires �etaient
ensemenc�ees avec des cellules de premier passage
(2 a 2,5� 105/puit) en quatre �etapes de 30 min a
37 �C dans un incubateur a CO2. Pendant chaque�etape, la prothese �etait tourn�ee de 90o dans la
chambre en verre de sorte que chaque fois un secteur
diff�erent de la prothese soit ensemenc�e. Apres cet
ensemencement statique, le biomat�eriau �etait per-
fus�e in vitro avec le milieu et incub�e avec une rota-
tion douce constante a six r�evolutions par heure,
jusqu’a ce qu’une monocouche se soit form�ee sur la
surface d’ePTFE. Dans le groupe de MF + CE, le
premier ensemencement �etait fait avec des fibro-
blastes ; une fois qu’une monocouche �etait form�ee,
les cellules �etaient fix�ees sur la surface proth�etique
par traitement avec du glyc�erol a 5% pendant 5 mn.
L’ensemencement avec les CE �etait ensuite fait.
Circuit Ex Vivo
Un circuit ex vivo f�emoro-atrial �etait install�e chez 12
chiens par canulation des arteres f�emorales et de
l’oreillette droite, abord�ee par sternotomie m�ediane.
Un tube de poly�ethylene (4 mm) �etait utilis�e pour
connecter chaque prothese, et les deux protheses�etaient reli�ees a l’oreillette droite des tubes de po-
ly�ethylene joints par un raccordement en Y. Chaque
chien recevait une prothese en ePTFE et une
280 Garcıa-Honduvilla et al. Annales de chirurgie vasculaire
prothese issue du g�enie tissulaire. Le flux sanguin�etait maintenu pendant 45 min.
Avant leur exposition au circuit ex vivo, toutes
les protheses ensemenc�ees �etaient examin�ees pour
s’assurer que leur surface �etait recouverte a 100%
de CE. Apres exposition au circuit ex vivo, la surface
proth�etique recouverte de CE �etait quantifi�e en sou-
mettant des coupes en microscopie �electronique a
balayage a une analyse planim�etrique avec un
analyseur Microm (Microm, Madrid, Espagne).
L’adh�erence des plaquettes aux protheses �etait
d�etermin�ee en marquant des plaquettes de l’animal�etudi�e avec de l’oxine d’In111 r�einject�ees au meme
animal. Les plaquettes �etaient incub�ees dans une
solution d’oxine d’In111 (100 mCi/mL) pendant
15 min a temp�erature ambiante. La thrombog�enicit�e�etait �etablie en d�eterminant la radioactivit�e comme
mesure indirecte des plaquettes d�epos�ees sur la
surface luminale.
Implantation des substituts issus du
g�enie tissulaire
Pour l’implantation des substituts issus du g�enie
tissulaire in vivo, diff�erents substituts ont �et�eemploy�es. Les protheses �etaient implant�ees au
niveau des 24 carotides de 12 chiens sous anesth�esie
g�en�erale. Les chiens recevaient 100 U/kg
d’h�eparine. Les deux carotides �etaient expos�ees
par une incision cervicale m�ediane. Un segment de
5 cm de chaque carotide �etait enlev�e et remplac�epar une prothese en ePTFE (gauche) et par une des
protheses modifi�ees (droite), en utilisant des sutures
en polypropylene 7-0 pour les anastomoses. Les
animaux �etaient mis en cage et maintenus dans des
conditions de lumiere et de temp�erature constantes
selon les directives de l’Union europ�eenne (CEE
2871-22A9) pendant 60 jours, jusqu’au pr�eleve-
ment des protheses.
Microscopie optique
Les sp�ecimens �etaient inclus en paraffine. Avec un
microtome Microm HM-325, des coupes successives
de 5 mm �etaient obtenues. Les colorations utilis�ees�etaient l’h�ematoxyline �eosine, le trichrome de
Masson, et le rouge sirius. A l’aide d’un analyseur
d’image automatis�e Microm, l’�epaisseur de la cou-
che n�eointimale (proximale/distale et moyenne) et
le pourcentage de collagene I et III (rouge sirius)�etaient mesur�es sur des coupes longitudinales
de5 mm de large (10/ groupe �etudi�e).
Microscopie �electronique a balayage
Des segments de protheses �etaient fix�es et le point
critique atteint dans un E-3000 appareil Polaron
(Cambridge, MA, Etats-Unis) aliment�e avec du
CO2. Les sp�ecimens entierement dess�ech�es �etaient
alors m�etallis�es avec de l’or palladium et examin�es
dans un microscope �electronique a balayage (DMS-
950 ; Zeiss, Thornwood, NY, Etats-Unis).
Immunohistochimie
Les protheses �etaient trait�ees comme d�ecrit pour la
microscopie optique. Les anticorps utilis�es �etaient
des anticorps de souris anti-CD34 (Biogenesis, San-
down, NH, Etats-Unis), anti-a-actine, et des anti-
corps de lapin anti-sulfate d’h�eparan (Perlecan ;
Sigma, St Louis, MO, Etats-Unis).
La r�eaction antigene/anticorps �etait visualis�ee
avec la m�ethode avidine-biotine marqu�ee a la phos-
phatase alcaline. Le marquage �etait d�etect�e avec un
photomicroscope. Dix coupes de tissu par groupe�etudi�e immunomarqu�ees avec chaque anticorps�etaient examin�ees et soumises a une analyse quan-
titative a l’aide d’un analyseur d’image Microm.
L�esions cellulaires
Les cellules endommag�ees �etaient d�etermin�ees avec
une version modifi�ee de la technique de marquage
du radical d�esoxyuridine triphosphate terminal
m�edi�ee par la d�esoxynucl�eotidyl transf�erase (TU-
NEL).13 La fragmentation de l’ADN �etait d�etect�ee
avec un kit (Calbiochem, San Diego, CA, Etats-
Unis). Dix coupes/prothese �etaient examin�ees en
microscopie optique (40x) et avec un analyseur
d’image Microm. Les cellules positives �etaient
compt�ees sur un champ microscopique choisi
al�eatoirement parmi quatre par section de tissu.
Analyse Statistique
Toutes les donn�ees sont exprim�ees en moyenne ±
d�eviation standard de la moyenne. L’analyse de
donn�ees a �et�e ex�ecut�ee avec le systeme Prism 4 de
GraphPad (San Diego, CA, Etats-Unis). Les donn�ees
d’analyse d’image ont �et�e soumises a une analyse
statistique descriptive. Les moyennes ont �et�ecompar�ees des groupes avec le test en U de Mann-
Whitney. Le seuil de significativit�e a �et�e plac�e a
p< 0,05.
RESULTATS
Circuit ex vivo
Avant l’exposition des protheses ensemenc�ees
(controle pr�e-implantation) au circuit ex vivo, le
pourcentage de la surface proth�etique couverte par
des CE �etait de 98,8 ± 1,3%. Apres 45 min
Vol. 22, No. 2, 2008 Viabilit�e des substituts issus du g�enie tissulaire 281
Fig. 1. a Proportion de CE restant sur les substituts avant
(controle pr�e-implantation) et apres (CE/CE + MF) le
circuit ex vivo. b Nombre de plaquettes (111In/cpm) re-
tenues par les diff�erents substituts (*p< 0,05). c Images
en microscopie �electronique a balayage des secteurs avec
cellules d�enud�ees (*) des protheses CE + MF avec
quelques plaquettes (/) adh�erant a l’endoth�elium
(�1000). d Groupe controle (PTFE) montrant une
grande quantit�e de plaquettes adh�erant a la prothese (/,
�500). e Substitut CE avec quelques plaquettes activ�ees
(/) adh�erant a l’endoth�elium (�1000) apres le circuit ex
vivo.
d’exposition au flux sanguin, environ 20% des CE
ensemenc�ees restaient sur la surface des protheses.
Cette proportion sur les protheses MF + CE
augmentait jusqu’a 45% (Fig. 1a). En pratique, les
traces laiss�ees quand les CE se d�eveloppaient a partir
de la matrice fibroblastique pouvaient etre vues, et
ces traces semblaient couvertes par des plaquettes
(Fig. 1c).
La meilleure performance ( p< 0,05) comme
enduit anti-plaquette �etait celle des protheses CE
(Fig. 1b). L’exposition de l’ePTFE au flux sanguin
montrait que ce mat�eriel est fortement thrombo-
gene (Fig. 1d). Les prothese CE ne montraient que
quelques plaquettes activ�ees adh�erant a l’en-
doth�elium ou a l’ePTFE d�enud�e (Fig. 1e), tandis que
dans le groupe de MF + CE les plaquettes appa-
raissaient dans les lacunes produites dans la matrice
de fibroblaste d�enud�ee des CE (Fig. 1c).
Viabilit�e in vivo des protheses
Huit des 24 protheses implant�ees se sont occluses,
dont deux issues du g�enie tissulaire et six du groupe
controle (ePTFE). L’occlusion des protheses
art�erielles �etait due a la thrombose.
Les protheses controles en ePTFE sur l’artere
carotide gauche �etaient fortement thrombogenes.
Le taux de thrombose �etait de 50% puisque six des
12 protheses se sont occluses. Les protheses per-
m�eables au moment du d�eces avaient une surface
luminale qui semblait endoth�elialis�ee avec de peti-
tes zones thrombogenes dans la zone de suture
(Fig. 2a). Dans la portion centrale de la greffe, les
zones endoth�elialis�ees alternaient avec des zones
pr�esentant des globules rouges, des d�epots de fi-
brine, et des globules blancs (Fig. 2b). L’ePTFE
montrait une infiltration discrete de cellules dans
son tiers luminal, un d�efaut de p�en�etration des cel-
lules dans le tiers moyen de la paroi, et la pr�esence
de cellules dans son tiers externe, a l’interface avec
l’adventice (Fig. 2c). La partie proximale des pro-
theses montrait moins d’hyperplasie intimale que
leur partie distale (Fig. 2d).
Cinq des six protheses ’EC carotidiennes droites�etaient viables et une �etait occluse. Des secteurs
d�enud�es �etaient pr�esents dans la couche de CE
(Fig. 3a). Dans certaines protheses, l’hyperplasie
consistait en une seule couche endoth�eliale et une
petite barriere de cellules adventitielles bien
pr�eserv�ees (Fig. 3b). L’int�erieur de l’ePTFE �etait
282 Garcıa-Honduvilla et al. Annales de chirurgie vasculaire
Fig. 2. a Aspect macroscopique de la prothese 60 jours
apres l’implant montrant une surface luminale (LS)
endoth�elialis�ee et une zone de suture (SZ) avec des sec-
teurs thrombog�eniques (/). b Image de microscopie
�electronique a balayage montrant une langue irr�eguliere
d’hyperplasie (IH) (�19). Des r�eseaux de fibrine et des
restes de globules blancs peuvent etre vus (/,�500). c
Hyperplasie intimale homogene (IH) dans la zone distale
de la prothese et couche adventitielle �epaisse (A, tri-
chrome m.o., �20). d La zone proximale de la prothese
montre moins de d�eveloppement d’hyperplasie intimale
(trichrome de Masson m.o. �40).
colonis�e par diff�erents types de cellules : cellules
g�eantes, cellules polymorphonucl�eaires, fibro-
blastes, cellules qui pourraient etre les restes des
cellules ensemenc�ees, et cellules viables occupant
des zones interstitielles.
Cinq des six substituts MF + EC modifi�es par
g�enie tissulaire �etaient perm�eables et une �etait oc-
cluse. Le comportement du groupe �etait semblable a
celui des protheses EC. La couche d’hyperplasie in-
timale provenant des extr�emit�es de l’artere rece-
veuse recouvrait l’ePTFE, qui pr�eservait toujours la
matrice de fibroblastes ((Fig. 3c,d). Pendant qu’elle
progressait vers le milieu du substitut, cette couche a
diminu�e d’�epaisseur jusqu’a devenir une fine cou-
che de cellules (Fig. 3e). Ces protheses avaient une
capsule fibreuse substantielle comprenant une bar-
riere form�ee de vaisseaux et une infiltration intense
par des cellules de r�eaction sur corps �etranger.
Quantification de l’�epaisseur de la
n�eointima
L’hyperplasie avait une pr�esentation uniforme dans
la plupart des substituts art�eriels utilis�es. Dans
chaque prothese, la couche myointimale venait de
l’artere receveuse et se d�eveloppait vers le milieu
du substitut, atteignant toujours une �epaisseur
maximum a l’extr�emit�e distale. Quand la r�eponse
hyperplasique des diff�erents substituts �etait
compar�ee, aucune diff�erence significative n’�etait
d�etect�ee avec le groupe controle. Dans les substituts
CE, la n�eointima �etait sensiblement plus mince
( p< 0,05) que dans des protheses MF + CE (Fig. 4a).
Quand nous avons compar�e les diff�erentes zones
proth�etiques parmi les groupes �etudi�es, les substi-
tuts MF + CE diff�eraient de maniere significative
des protheses CE en termes d’�epaisseur n�eointimale
dans la zone distale. Dans la meme zone, l’hyper-
plasie la plus faible �etait observ�ee dans le groupe CE.
Quand nous avons compar�e l’�epaisseur de la
n�eointima dans la zone m�ediale entre les controles
et MF + CE, les diff�erences �etaient �egalement
significatives (Fig. 4b).
Coloration au rouge sirius
La technique nous a permis d’�evaluer la pr�esence
des collagenes et leur maturit�e dans le processus
Vol. 22, No. 2, 2008 Viabilit�e des substituts issus du g�enie tissulaire 283
Fig. 3. a Microscopie �electronique a balayage de la
surface luminale d’une prothese CE avec des zones
d’endoth�elium (E) d�enud�ees (*) (�50). b Vue panora-
mique d’une prothese CE. Noter l’adventice vascularis�ee
(/) et le biomat�eriau (ePTFE) infiltr�e avec des cellules.
Zone manquant d’hyperplasie avec une monocouche
endoth�eliale (E, h�ematoxyline �eosine m.o. �10). c
Scanning electron microscopy of intimal hyperplasia (IH)
in the form of a tongue in the FM + EC constructs
(�100). Microscopie �electronique a balayage de l’hyper-
plasie intimale (IH) sous forme d’une langue dans les
protheses MF + CE (�100). L’�epaississement intimal di-
minue de l’extr�emit�e distale (d) vers le centre de la
prothese, atteignant une �epaisseur minimale a ce niveau
(e) (trichrome m.o. �20). A, adventice.
284 Garcıa-Honduvilla et al. Annales de chirurgie vasculaire
Fig. 4. a Valeurs moyennes de l’�epaisseur de la couche
intimale (mm) dans les diff�erentes protheses (proxi-
mal+distal+milieu). Des diff�erences significatives ont
seulement �emerg�e entre les groupes CE et MF + CE
(*p< 0,05). b �Epaisseurs de la n�eointima (mm)
enregistr�ees individuellement pour chacun des segments
(p) proximal, moyen (m), et distal (d) des protheses. Des
diff�erences significatives ont �emerg�e entre les portions
centrales des protheses controles et MF + CE et entre les
parties distales des protheses CE et MF + CE (*p< 0,05).
de r�eparation tissulaire. La r�eponse produite dans le
groupe controle �etait une encapsulation, une
r�eaction typique a n’importe quel mat�eriel �etranger.
Les protheses cellulaires avaient un comportement
semblable ; l’encapsulation �etait maintenant une
capsule �epaisse de collagene mur fortement
organis�ee (type I) infiltrant le substitut. C’�etait
plus �evident pour les protheses MF + CE et sem-
blait li�e a la colonisation par les cellules (Fig. 5a).
Tous les groupes avaient un pourcentage statisti-
quement significatif de collagene mur/type non
mur, mais aucune diff�erence significative n’a �et�eobserv�ee quand un seul type de collagene �etait
compar�e (Tableau I).
Immunohistochimie
Pour confirmer la pr�esence de l’endoth�elium et la
pr�esence des microvaisseaux a l’int�erieur du substi-
tut dans les diff�erents groupes, nous avons utilis�e un
anticorps anti-CD34. Des diff�erences ont �et�ed�etect�ees au niveau de l’intima et a l’int�erieur
l’ePTFE, avec un marquage CD34 plus intense
dans le groupe des protheses CE (Fig. 5b), mais
ces diff�erences n’�etaient pas statistiquement si-
gnificatives. Ce marqueur indiquait que les cellules
ensemenc�ees se d�eveloppaient dans diff�erentes
couches de l’intima et �etaient capt�ees par les cellules
myointimales elles-memes. Les protheses MF + CE
avaient un marquage clair pour CD34, avec des
cordons cellulaires et la pr�esence de microvaisseaux
a l’int�erieur du substitut.
L’expression de l’a-actine identifie la
n�eoangiog�enese et les cellules musculaires lisses en
r�eg�en�eration. Son expression dans les protheses
controles a confirm�e ceci, particulierement dans
l’adventice, ou un marquage intense �etait d�etect�edans la microvascularisation. On a observ�e le
meme modele d’expression dans toutes les prothe-
ses, avec une expression confin�ee a la couche ad-
ventitielle et a quelques cellules a l’int�erieur de la
couche n�eointimale dans tous les groupes.
N�eanmoins, l’importance de l’expression diff�erait,
et les protheses MF + CE avaient l’expression la
plus intense due a un r�eseau angiog�enique �etendu
(Fig. 5c) et au plus grand nombre de cellules
myointimales avec ce ph�enotype ; mais ces
diff�erences n’�etaient pas statistiquement
significatives. Perlecan est un prot�eoglycan type
sulfate d’h�eparan qui est un composant important
de la paroi art�erielle, intens�ement exprim�e par les
CE des microvaisseaux. On a pu observer son ex-
pression par des fibroblastes dans quelques petites
colonies du groupe controle. L’expression de per-
lecan �etait limit�ee a la cellule, alors que les substituts
montraient un marquage pour l’anticorps au niveau
des cellules de l’adventice, identifiant clairement
des amas de collagene (Fig. 5d). Seulement quelques
cellules a l’int�erieur de l’ePTFE, particulierement
dans les substituts ensemenc�es, exprimaient le
ph�enotype perlecan. Le groupe montrant l’expres-
sion la plus faible de perlecan �etait le groupe
controle.
L�esions cellulaires
Quand les pourcentages des cellules endommag�ees�etaient compar�es, une diff�erence significative
( p< 0,05) a �emerg�e entre les groupes EC et con-
trole (Fig. 6).
Vol. 22, No. 2, 2008 Viabilit�e des substituts issus du g�enie tissulaire 285
Fig. 5. a Coloration pour le composant fibrillaire du col-
lagene. Le collagene I apparaıt en tant que des fibres
rouges intenses, et le collagene III se colore en jaune
verdatre. Collagene encapsulant le biomat�eriau. Groupe
controle (rouge sirius m.o. �16). b Cellules CD34+ (mar-
ron) des protheses CE (anticorps anti-CD34 m.o. �20). c
Expression de l’a-actine (/) dans les protheses MF + CE,
pr�edominant au niveau de la myointima (IH) et de l’ad-
ventice (a) (anticorps anti-a-actine m.o. �10). d Expres-
sion de perlecan (*) parmi les fibres de collagene de
l’adventice dans les protheses MF + CE (anticorps anti-
perlecan m.o. �40). vv, vasa vasorum.
Dans le groupe controle, un marquage faible �etait
not�e dans la n�eointima et les valeurs les plus �elev�ees
correspondaient a la zone biomat�eriau/adventice.
Les protheses CE montraient des valeurs plus�elev�ees que le groupe controle dans les secteurs
n�eointimal et adventitiel. Dans les protheses
MF + CE, les cellules positives avaient une dis-
tribution diff�erente, avec des cellules plus marqu�ees
dans l’intima et peu de cellules a l’int�erieur de la
prothese (Fig. 6). L’intensit�e plus grande du
marquage d�etect�e dans les protheses CE �etait due a
un plus grand nombre de cellules positives a
l’int�erieur du substitut (Fig. 6) et dans l’adventice.
DISCUSSION
En d�epit de nombreux efforts faits pour am�eliorer les
protheses de petit calibre, aujourd’hui il n’y a rien
sur le march�e qui �equivaille la performance d’une
286 Garcıa-Honduvilla et al. Annales de chirurgie vasculaire
Fig. 6. Diff�erences dans les proportions de cellules TU-
NEL+ parmi les trois groupes �etudi�es (*p< 0,05) et des
pourcentages de cellules endommag�ees dans la n�eointima,
le biomat�eriau, et les couches adventitielles pour les trois
groupes �etudi�es (*p< 0,05).
veine autogene comme substitut art�eriel. Dans le
meilleur des cas, les arteres « cr�e�ees » par le g�enie tis-
sulaire devraient montrer des propri�et�es biologiques
et biom�ecaniques semblables aux arteres, pour
augmenter les chances d’une bonne perm�eabilit�e.14
Dans notre �etude, nous avons pu confirmer que les�equivalents d’artere sont plus efficaces une fois
implant�es que les protheses vasculaires synth�etiques.
L’endoth�elialisation des protheses semble donc etre
un facteur d�eterminant de la viabilit�e.15 Une des
propri�et�es int�eressantes de l’ePTFE comme prothese
vasculaire est son hydrophobicit�e. Cette propri�et�e li-
mite cependant l’adh�erence des CE.16 L’endoth�elium
Tableau I. Pourcentage du collagene I et du
collagene III dans les diff�erents groupes de
protheses implant�ees apres 60 jours
d’implantation
% Collagene I(mature)
% Collagene III(immature)
Controle 57,72 ± 4,69* 16,48 ± 8,57
CE 49,36 ± 9,77* 15,55 ± 7,01
CE + MF 65,23 ± 5,02* 21,63 ± 8,85
*p< 0,05 vs. collagene III.
joue un role important dans le d�eveloppement de
l’hyperplasie intimale, une r�eponse qui, avec la
thrombose, constitue la cause principale de l’�echec
d’une prothese vasculaire. Dans les protheses, les CE
veineuses s’adaptaient parfaitement a la nouvelle
situation et restaient stables et fonctionnelles.
A deux mois, la r�eparation, ou l’hyperplasie inti-
male devrait en etre a l’�etape ou les r�eponses pro-
lif�eratives et s�ecr�etrices de cellules sont stables et
provoquent un tissu cicatriciel. Ainsi, nous avons
choisi cette dur�ee pour les �etudes d’implantation.
Beaucoup de facteurs semblent contribuer a pro-
duire ce nouveau tissu, y compris des facteurs hu-
moraux et biom�ecaniques.17 Dans notre �etude, la
r�eponse de l’intima �etait �evidente dans tous les
substituts. Des diff�erences significatives ont pu etre
observ�ees entre les deux types de substituts avec
cellules, les protheses CE d�eveloppant moins de
rest�enoses que des protheses MF + CE et restant de
ce fait perm�eables plus longtemps.
Le comportement hyperplasique observ�e pour
ces substituts n’est pas �etonnant si nous consid�erons
que les CE ensemenc�ees sur l’ePTFE �etaient des cel-
lules veineuses en position art�erielle, capables de
former des jonctions stables avec la mol�ecule homo-
dim�erique d’adh�erence plaquettes/CE (PECAM-1)
Vol. 22, No. 2, 2008 Viabilit�e des substituts issus du g�enie tissulaire 287
et de former des couches multiples.18 Cependant, il
est �egalement n�ecessaire de consid�erer que notre
animal d’exp�erience, le chien, endoth�elialise rapi-
dement et que les humains ont des taux lents
d’endoth�elialisation. Il est donc n�ecessaire d’etre
prudent en extrapolant ces r�esultats a la clinique.19
Plusieurs m�ethodes concues pour augmenter
l’adh�erence des CE ont �et�e examin�ees, comme le
changement des propri�et�es physico-chimiques ou�electriques des prostheses20 et l’enduction de la
surface luminale avec de la fibrine21 ou l’utilisation
de cellules musculaires lisses comme substrat pour
ensemencer les CE.22 Pour am�eliorer l’adh�erence
des CE, nous avons examin�e l’utilisation d’une
matrice de cellules avec des caract�eristiques sem-
blables a celles de la matrice sous-endoth�eliale des
arteres natives. Nous avons observ�e une adh�erence
significativement am�elior�ee des cellules dans des
conditions d’�ecoulement physiologiques quand
elles �etaient ensemenc�ees sur une matrice de
fibroblastes.
Quand des CE sont transplant�ees sur l’ePTFE, le
biomat�eriau devient colonis�e par des globules blancs
et des fibroblastes. Nous avons �egalement d�etect�edes cellules CD34 et des CE avec des signes �evidents
de d�eg�en�erescence, mais le modele g�en�eral de colo-
nisation �etait semblable a celui des controles. Les
diff�erences les plus �evidentes ont �et�e d�etect�ees
avec les protheses MF + CE, qui avaient une moin-
dre colonisation cellulaire, des cellules d’aspect
d�eg�en�eratif qui pourraient etre des restes de fibro-
blastes, et des cellules inflammatoires du cot�e ad-
ventitiel. En effet, le meilleur comportement �etait
celui des protheses CE.
Notre �evaluation de l’a-actine, qui s’exprime en
r�eg�en�erant les cellules musculaires lisses, a indiqu�ela pr�esence de ces cellules dans toutes les couches
des protheses, except�e la couche endoth�eliale. Ceci
est bien connu et utilis�e pour distinguer les CE
CD34+/a-actine - de leurs pr�ecurseurs immatures
qui expriment les deux marqueurs.23
Le collagene favorise la migration et la contrac-
tion des cellules et agit avec l’environnement extra-
cellulaire par la commande de la diff�erentiation des
cellules musculaires lisses et l’expression de l’int�e-
grine. Juste apres des l�esions de la paroi vasculaire,
le contenu en collagene monte et son architecture
change graduellement.24
Dans les protheses CE, la couche n�eointimale
montrait une distribution �egale du collagene de
type I et III. Comme celles-ci montraient �egalement
les proportions les plus �elev�ees de cellules apoptoti-
ques indiquant un remodelage, il semble que l’hy-
perplasie d�evelopp�ee sur la surface luminale est
diff�erenci�ee, en termes de cellules musculaires lisses
avec un ph�enotype contractile et une matrice de col-
lagene organis�ee et mature Cette n�eointima peut
etre d�ecrite comme une « myointima mature. »
La couche externe de la paroi, l’adventice, joue un
role consid�er�e de plus en plus important dans les
processus l�esion/r�eparation vasculaires.25 Dans les
protheses en ePTFE cliniques, l’encapsulation ex-
terne du biomat�eriau peut meme etre accompagn�ee
d’adh�erences fermes aux tissus adjacents, entraınant
un effet de constriction sur le biomat�eriau.26 Nos
protheses ont induit le d�eveloppement d’une capsule
adventitielle, bien que nous ayons not�e que les
substituts MF + CE avaient une meilleure capacit�en�eoangiog�enique que les autres protheses.
En ce qui concerne la participation de l’adventice
dans la rest�enose, quelques auteurs arguent du
fait que les myofibroblastes contribuent au
d�eveloppement de la n�eointima.27 Ainsi, une rela-
tion inverse et28 directe entre la teneur en collagene
de l’adventice et le degr�e de rest�enose a �et�e d�ecrite.
En conclusion, la r�eponse adventitielle observ�ee
ici a montr�e un role int�eressant du perlecan. Les
prot�eoglycans sont des mol�ecules complexes qui
affectent consid�erablement les propri�et�es de la
paroi art�erielle, y compris sa perm�eabilit�e, las
visco�elasticit�e, l’h�emostase, la thrombose, et l’orga-
nisation de la matrice extracellulaire.29 On pense
que le perlecan peut avoir un effet inhibiteur
sur les cellules musculaires lisses,30 un effet anti-
thrombotique,31 et un effet sur la n�eoangiog�enese,32
jouant un role important dans la r�eparation
art�erielle. Dans les constructions cellulaires, il est
apparu non seulement dans les cellules musculaires
lisses de l’adventice mais �egalement dans de gros
amas de cellules dans la matrice extracellulaire,
refl�etant une couche externe active des
constructions.
Des proc�edures de g�enie tissulaire concues pour
am�eliorer le processus de r�eparation par
r�eg�en�eration tissulaire ont essay�e de r�eduire le
plus possible les r�eponses immunitaires et inflam-
matoires du receveur, nous rapprochant du « substi-
tut vasculaire efficace ». En effet, les substituts
examin�es ici �etaient plus efficaces pour �eviter l’oc-
clusion. Par ailleurs, la r�eduction de l’hyperplasie
intimale �etait significative pour les protheses CE
compar�ees aux autres groupes. Nos deux protheses
ont donc montr�e une perm�eabilit�e initiale am�elior�ee
par rapport a l’ePTFE. La prothese CE �etait la meil-
leure pour pr�evenir la rest�enose, un bon indicateur
de l’efficacit�e a long terme d’une prothese.
Cette �etude a �et�e financ�ee par le Fondo de Investigacion Sanitaria
(FIS-SAF-92-8875).
288 Garcıa-Honduvilla et al. Annales de chirurgie vasculaire
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