· Web viewEn outre, les rapports de monosaccharides ont été fortement influencées non seulement par les procédés d'extraction, mais aussi par l'irrigation, la pluie, la température,

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT

SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

……………………

UNIVERSITE D’ANTSIRANANA

……………………

Renforcement de la Recherche Scientifique pour la Gouvernance et le Développement humain Durable (G/DHD)

Accord de Coopération cadre entre le PNUD et l’UNESCO et les Universités dans le Domaine de la Gouvernance et du Développement Humain Durable (G/DHD)

RAPPORT DE STAGE DE THESE DOCTORALE

OPTION : NUTRITION ET SCIENCES DES ALIMENTS

Réalisé par

Encadreur Pédagogique : Pr MICHAUD Pilippe (Université de Blaise Pascal)

Encadreur Pédagogique : Pr ANDRIAMADIO Pascal (Université d’Antsiranana)

Encadreur Professionnel : Dr FENORADOSOA Taratra Andrée (Université d’Antsiranana)

Encadreur Professionnel : Dr DELATTRE Cédric (Université de Blaise Pascal)

PETERA Benjamin

VALORISATION DE PLANTES SUCCULANTES AU SERVICE DU DEVELOPPEMENT RURALE : Cas du genre Cereus triangularis

TABLE DES

MATIERES

Table des matières

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENT....................................................................................................................iii

LISTE DES FIGURES..............................................................................................................iv

LISTE DES TABLEAUX...........................................................................................................v

LISTE DES ABREVIATIONS.................................................................................................vi

GLOSSAIRE............................................................................................................................vii

1.INTRODUCTION GENERALE.............................................................................................1

2. MATÉRIELS ET MÉTHODES.............................................................................................3

2.1. Préparation préliminaire de la matière première fraiche et sèche........................................3

2.2. Extraction et purification.....................................................................................................3

2.2.1. Extraction..........................................................................................................................3

2.2.2. Purification........................................................................................................................4

2.3.Caractérisation chimique des polysacchariques extraient de Cladode de Cereus

triangularis.................................................................................................................................4

2.3.1. Composition centésimale..................................................................................................4

2.3.1.1. Dosage des oses neutres.................................................................................................4

2.3.1.2. Dosage des acides uroniques par metahydroxybiphenyl (mHBP).................................5

2.3.1.3. Dosage des protéines de polysaccharides de Cereus triangularis par la méthode de

Biuret...........................................................................................................................................7

2.4. Détermination des monosaccharides constitutifs de mucilage de Cereus triangularis.......8

2.5. Détermination de la masse molaire par chromatographie d’exclusion stérique couplée à la

diffusion de lumière (sec/malls) de polymère de Cereus triangularis.......................................8

2.6. Analyse spectroscopique de mucilage de Cereus triangularis..........................................10

2.6.1.Analyse de polysaccharides cladode de Cereus triangularus par spectroscopie

infrarouge..................................................................................................................................10

2.6.2. Analyse 1H-RMN de polysaccharides de Cereus triangularis.......................................11

2.7.Etude des proprietes antioxydantes du polysaccharides cereus triangularis......................11

2.7.1. Test anti-radicalaire par le dosage au 2,2’-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH)...........11

2.7.2. Test anti-radicalaire (Hydroxyl radical)..........................................................................12

2.7.3.Test anti-radicalaire (Superoxyde anion radical).............................................................12

2.7.4. Test antiradicalaire par dosage du pouvoir réducteur.....................................................13

3. RESULTATS ET DISCUSSIONS.......................................................................................14

i

Table des matières

3.1. Résultats d’extraction et de purification de polysaccharide Cereus triangularis..............14

3.2. Identification des polysaccharides.....................................................................................14

3.2.1. Dosages colorimétriques de polysaccharides de Cereus triangularis............................14

3.2.1.1. Dosage des oses neutres des polysaccharides de Cereus triangularis.........................14

3.2.1.2. Dosage des oses acides par metahydroxybiphenyl (mHBP)........................................16

2.2.1.3. Dosage des protéines de Cereus triangularis..............................................................17

2.2.1.4. Récapitulatif des dosages des éléments de polysaccharides de Cereus triangularis:..18

3.3. Monosaccharide composition estimé par GC / MS-EI......................................................18

3.4. Détermination des masses molaires en poids et en nombre de polysaccharides de Cereus

triangularis par (SEC/MALLS)................................................................................................19

3.5. Analyse infrarouge.............................................................................................................20

3.6. RMN..................................................................................................................................22

4.ETUDE DES PROPRIETES ANTIOXYDANTES DE POLYSACCHARIDE DE

CLADODE DE CEREUS TRIANGULARIS.............................................................................25

4.1. Activité de piégeage des radicaux DPPH..........................................................................25

4.2. Activité de piégeage les radicaux hydroxyles....................................................................27

4.3. Activité de piégeage contre le superoxyde anion..............................................................28

4.4. Pouvoir réducteur...............................................................................................................30

5. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES............................................................31

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES:.................................................................................32

ii

Remerciement

REMERCIEMENT

Le présent travail a été réalisé aux laboratoires GREENMADAG de la Faculté des

Sciences de l'Université d'Antsiranana, Laboratoire de l’Institut Pascal UMR CNRS 6602 de

l’Université Blaise Pascal et Laboratoire des Glucides FRE CNRS 3517 - Institut de Chimie

de Picardie FR 3085de l’Université de Picardie Jules Verne, France dans le cadre de

collaboration entre la Faculté des Sciences et l’Université Blaise Pascal France.

Je remercie tout d’abord le Professeur MANOROHANTA Cécile Marie Ange,

Président de l’Université d’Antsiranana et Professeur BERNARD Mathias, Président de

l’Université de Blaise Pascal de Clermont-Ferrand de m’avoir offert l’opportunité d’effectuer

cette recherche.

J’adresse mes profonds remerciements au PNUD, l’UNESCO et les Universités dans le

Domaine de la Gouvernance et du Développement Humain Durable (G/DHD) sans leurs

appuis financier ce travail n’aurait pu voir le jour.

Nos remerciements vont aussi à Monsieur le Docteur Briant KALL, le Doyen de la

Faculté des Sciences de l’Université d’Antsiranana.

Nous tenons à remercier aussi Monsieur MICHAUD Philippe, Professeur à

l’Université de Blaise Pascal, Responsable du Departement Genie Biologique de Polytech

Clermont Ferrand.

Nous exprimons nos vives reconnaissances à Monsieur ANDRIAMADIO Pascal,

Professeur à l’Université d’Antsiranana, Responsable de la formation doctorale de la Chimie

des Substances Naturelles et de l’Environnement.

J’exprime toute ma reconnaissance au Docteur FENORADOSOA Taratra Andrée pour

l’encadrement de cette recherche, ainsi que pour sa disponibilité, ses conseils et ses

encouragements.

Je tiens également à remercier chaleureusement le Docteur DELLATRE Cédric, Maître

de Conférences de l’Université Blaise Pascal France, co-encadreur de mon stage qui m’a

toujours soutenu et dirigé pendant plusieurs mois de travail.

Je remercie aussi toutes les personnes qui ont apporté des aides techniques et matériels

tout au long de ce travail. Enfin, mes remerciements s'adressent à tous ceux qui, de près ou de

loin, ont contribué à la réalisation de ce stage de thèse.

iii

Liste des tableauxListe des figures

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Schéma récapitulatif de la procédure d’extraction de polysaccharide de Cereus

triangularis sèche........................................................................................................................3

Figure 2 : Schéma récapitulatif de la procédure de purification de polysaccharides de Cereus

triangularis.................................................................................................................................4

Figure 3 : Représentation schématique du couplage SEC/MALLS/DRI (A) et de ladiffusion de

lumière dans une cellule de photoréception à 18 angles (B)......................................................9

Figure 4 : Courbe d’étalonnage en glucose (Dosage au résorcinol)...............................................15

Figure 5 : Courbe d’étalonnage en acide glucuronique..................................................................16

Figure 6 : Courbe d’étalonnage en SAB par la méthode de Biuret.................................................17

Figure 7 : : Spectre infrarouge de polysaccharides de Cladode de Cereus triangularis.................21

Figure 8A : Spectre 13C -RMN de polysaccharides de cladode de C. triangularis.......................22

Figure 8B : Spectre 1H-RMN de polysaccharide de Cereus triangularis.......................................23

Figure 9A : Spectre de corrélation hétéronucléaire entre 13C et 1H (HSQC) de polysaccharide de

Cereus triangularis...................................................................................................................23

Figure 9B: Spectre RMN-1H/ 1H de polysaccharide de Cereus triangularis..................................24

Figure 10A : Evolution des activités anti-radicalaires (radical DPPH) de polysaccharide de Cereus

triangularis...............................................................................................................................26

Figure 10B : Evolution des activités anti-radicalaires (radical Hydroxyl) de polysaccharide de

Cereus triangularis...................................................................................................................27

Figure 10C : : Evolution des activités anti-radicalaires (radical superoxyde anion) de

polysaccharide de Cereus triangularis.....................................................................................29

Figure 10D : Evolution du pouvoir réducteur des fractions de polysaccharide de Cereus

triangularis...............................................................................................................................30

iv

Liste des tableauxListe des figures

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Gamme étalon de glucose

Tableau 2 : Différentes concentrations de polysaccharides à doser.

Tableau 3 : Gamme étalon d’acide glucuronique



Tableau 6 : Différentes concentrations de polysaccharides à doser

Tableau 7 : Rendement de mucilage de cladode sèche de cereus triangularis

Tableau 8 : Différentes concentrations de polysaccharides à doser de Cereus triangularis

Tableau 9 : Différentes concentrations de polysaccharides à doser de Cereus triangularis

Tableau 10 : : Différentes concentrations de polysaccharides à doser de Cereus triangularis

Tableau 11 : Représente Récapitulatif des dosages des éléments de polysaccharides .

Tableau 12 : Récapitulatif des monosaccharides constitutifs de mucilage de Cereus triangularis

Tableau 13 : Résultats des masses molaires moyennes en poids et en nombre des

polysaccharides...

Tableau 14 : Résumé des spectres infrarouges de polysaccharides de Cereus triangularis. .

v

Liste des abréviations

LISTE DES ABREVIATIONS

1H-NMR : Résonance Magnétique Nucléaire Proton

Ara/Gal : Arabinogalactane

CE50 : Concentration efficace inhibitrice de 50 % des radicaux

cm-1 : nombre d'onde

DPPH : Radical 1,1-DiPhényl-2-PicrylHydrazyle

EtOH : Ethanol

g.mol -1 : Masse molaire

h : Heure

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène

Ip : Indice de polydispersité (Ip)

IR :Infrarouge

MetOH : Methanol

mL : Millilitre

Mn : Masses molaires moyennes en nombre

Mw : Masses molaires moyennes en poids

P/V : Poids par volume

ppm : Unité de δ (Parties Par Million, Parts par Million =1 0-6 , NMR)

SEC/MALLS: Chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de lumière

HPSEC : chromatographie d'exclusion de taille à haute pression

δ : Déplacement chimique (NMR)

SM : Solution mère

vi

Glossaire

GLOSSAIRE

Cladodes : Un cladode est un rameau spécialisé qui a l’apparence et la fonction d’une

feuille : large, plat et photosynthétique.ex : Les raquettes du figuier de barbarie (Opuntia

ficus-indica)

Mucilages : Les mucilages sont des substances végétales, constituées de polysaccharides, qui

gonflent au contact de l'eau en prenant une consistance visqueuse, parfois collante, semblable

à la gélatine

vii

http://fr.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9latine

http://fr.wikipedia.org/wiki/Polysaccharide

http://fr.wikipedia.org/wiki/V%C3%A9g%C3%A9tal

http://www.futura-sciences.com/magazines/nature/infos/dico/d/botanique-figuier-10378/

8

INTRODUCTION

GÉNÉRALE

Introduction générale

1. INTRODUCTION GENERALE

L’accroissement démographique de la population mondiale selon l’ONU est le

« principal facteur à l'origine de l'augmentation des besoins alimentaires ». Cependant, face à

cette augmentation de population, les malgaches n’arrivent plus à couvrir les besoins

énergétiques de la population. Par ailleurs, en matière de santé, à Madagascar, l’accès aux

soins essentiels est toujours limité, frein à un recul significatif de la mortalité infantile et

maternelle. Les maladies d’origine microbienne ou d’origine virale, les diarrhées, les

infections respiratoires aiguës, le paludisme, la rougeole en sont les principales causes, la

malnutrition étant très souvent une cause associée (DDSS/INSTAT, 2000). Ce sont des

problématiques qui doivent traiter rapidement par les scientifiques malgaches.

En termes de revenus, plus des deux tiers de la population vivent en dessous du seuil de

pauvreté, notamment dans les zones rurales.

Dans ce travail de recherche, nous avons choisi une thématique de recherche de

nouvelles plantes sources de métabolites primaires (Glucides, lipides et protéines) pour

améliorer l’alimentation de la population malgache et de métabolites secondaires valorisables

dans les domaines agro alimentaires, thérapeutiques pour l’amélioration de la santé et de la

source de revenus des villageois.

Les composants fonctionnels tels que les fibres alimentaires, colorants naturels,

minéraux et antioxydants sont quelques-uns des éléments nutritifs qui doivent être inclus dans

l'alimentation quotidienne. Plusieurs espèces végétales telles que le cactus pourraient

constituer une source prometteuse de ces composants (Sáenz, 2002). Il a été bien établi pour

longtemps que dans plusieurs pays, en raison de leurs prestations à haute valeur nutritive

famille des cactacées pourraient être utilisé pour l'alimentation humaine (Sáenz, 2002). En

fait, les composés obtenus à partir des fruits et raquettes contiennent une grande quantité

d'ingrédients, notamment des fibres et constituants antioxydants comprenant l'acide

ascorbique, la vitamine E, les caroténoïdes, les acides phénoliques et polysaccharides (Zhong,

et al., 2010; Panico et al., 2005). De nombreuses espèces de cactus sont de plus en plus dans

les zones arides et semi-arides, en plein essor et à haute température, peu d'eau et les sols

pauvre en élément fertile, conditions défavorables pour la production de nombreuses autres

cultures. D'une manière générale, cactus pourrait servir de sources de fruits et légumes,

1

Introduction générale

médicinales et cosmétiques, les fourrages et les couleurs naturelles (Yahia et al., 2009).

Cependant, beaucoup de ces applications sont encore très limitée à quelques espèces et dans

quelques pays, mais à la lumière de la désertification mondiale et l’insuffisance des sources

d'eau, ces plantes gagnent plus d'intérêts. Par conséquent, dans la dernière décennie, beaucoup

d'études sur le traitement de cactus ont développé une nouvelle valeur ajoutée à ces cultures.

En effet, comme mentionné par Sáenz (2002), cactus est une source de mucilage pour les

liants et des agents épaississants et pourrait être utilisé comme composé naturel dans les

aliments afin d'augmenter les prestations de santé. L'extraction du mucilage est caractéristique

de beaucoup de membres de la famille des cactacées (Nobel., 1992; Paulsen et Lund, 1979) et

la caractérisation chimique de ces polysaccharides à partir de fruits et de raquettes a été

étudiée dans divers ouvrages (Matsuhiro, et al., 2006; Habibi et al., 2004; Srivastava et

Pande, 1974; Amin Awad, et El-Sayed, 1970). Ces polysaccharides ont été décrits pour leur

impact sur la physiologie des plantes permettant la Cactaceae à retenir l'eau pour la croissance

dans des conditions de stress hydrique (Nobel et al., 1992; Saag et al., 1975). Par conséquent,

le mucilage est bien définie dans la littérature comme un polysaccharide complexe ayant une

forte capacité d'absorption de l'eau qui donne une source de potentiel pour l'industrie additif

alimentaire hydrocolloïde (Saenz et al., 2004). Parmi les différents cactus, Cereus sp. a été

considéré comme une source potentielle de l'industrie de la gomme hydrocolloïde. Cereus

triangularis est un cactus épiphyte de la zone tropicale sèche comme la région Nord de

Madagascar. Elle est une plante rampantes ou grimpante, semi-épiphyte (Bosser et al .,1984 ;

Rondon., 1998 ) et leur croissance nécessite un support naturel ou artificiel (arbres, poteaux

en bois ou en beton, etc). Elle s’accroche à ces derniers grâce à leur racine aérienne. Ses

longues tiges ont trois arêtes charnues vertes pouvant mesurées plus de 4 mètres et au bord

sont dentelées des fines épines se trouvant dans les aréoles (Mizrahi, Nerd & Nobel, 2010)

Son fleur est parfaite, blanche et parfumé. Les fruits de C. triangularis sont ovales charnue

comestible (Mizrahi, Nerd & Nobel, 2010). Pour autant que nous sachions, il n'existe pas

d'études dans la littérature concernant lesmucilage de des cladodes de Cereus triangularis.

C'est pourquoi l'objectif de la présente étude était de développer une méthode adéquate pour

l'extraction et la caractérisation de mucilage à partir des cladode de Cereus récoltés dans le

Nord de Madagascar. En outre, des tests biologiques antioxydant de ces polysaccharides ont

été étudiés pour trouver une autre source d'aliments fonctionnels.

2

Matériels et méthodes

MATERIELSET

METHODES

Dissolution de Cereus triangularis

Poudre fine sèche de Cereus triangularis

Macérât

FiltrâtImpuretésL’alcool


2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1. Préparation préliminaire de la matière première fraiche et sèche

Cladodes de Cereus triangularis ont été recueillis à Sakaramy dans la région Nord de

Madagascar en Décembre 2013, les Cladodes ont été lavés avec de l'eau, les couper en

morceaux et séché dans un étuve (JOUAN- N ° 78 120) à 40 °C jusqu'au poids constant. Les

matériaux secs ont été pulvérisés en poudre à l'aide d'un mélangeur mécanique à haute vitesse

(Blender 800 ES).

2.2. Extraction et purification

2.2.1. Extraction

L'extraction a été effectuée à température ambiante selon la procédure suivante: Une

poudre sèche de cladode a préparé préalablement a été dispersée dans de l'eau distillée (1/20

(p/v). Après agitation pendant 3 h, les mélanges ont été filtrés successivement travers d’une

passoire fine pour retirer les débris macroscopique insoluble et filtrés à travers des filtres en

verre fritté de porosité 1 (10-16 microns) (Figure 1).

Figure 1 : Schéma récapitulatif de la procédure d’extraction de polysaccharide de Cereus triangularis sèche.

Dissolution de Cereus triangularis 1/ 20 (p/v)Agitation 3h à 25 °C

Macération une nuit à froid

Filtration

http://www.linguee.fr/francais-anglais/traduction/a+pr%C3%A9par%C3%A9+pr%C3%A9alablement.html

FiltratL’alcool

Polysaccharides

Polysaccharides clarifiéL’alcool

Polysaccharides secsL’alcool


2.2.2. Purification

Les solutions claires ont été précipités avec 3 volumes d'éthanol (96%) et lavé avec de

l'acétone (Figure 2). Les polysaccharides précipités sont filtrés et stockés dans un

dessiccateur à la température ambiante avant de le peser.

Figure 2 : Schéma récapitulatif de la procédure de purification de

polysaccharides de Cereus triangularis.

2.3.Caractérisation chimique des polysacchariques extraient de Cladode de Cereus

triangularis.

2.3.1. Composition centésimale

L’appréciation de la quantité en oses neutres et en acides uroniques présents dans le

polysaccharide extrait de Cladode de Cereus triangularis repose sur 2 dosages

complémentaires :

- le dosage des sucres neutres par la méthode de Dubois (1956),

- le dosage des acides uroniques par la méthode de Blumenkrantz et Asboe-Hansen (1973).

2.3.1.1. Dosage des oses neutres

Principe :

En milieu sulfurique à chaud, les oses neutres produisent des dérivés du furfural (dérivés

aldéhydiques du furane) qui se condensent avec le résorcinol pour donner un complexe de

couleur brun jaune (Dubois., 1956).

4

SéchageDans un déssiicateur

Lavagepar Acétone

Précipitation3 volumes d’alcool


Mode opératoire :

A 200 µL d’échantillon, on ajoute 200 µL de la solution de résorcinol (6 mg/mL dans

de l’eau distillée) puis 1 mL d’acide sulfurique à 80 %. Après une incubation de 30 minutes à

90°C, le mélange est laissé 30 minutes à température ambiante à l’obscurité et l’absorbance

est mesurée à 450 nm. Une gamme étalon de glucose de 0 à 0,16 g/L et différentes

concentrations de polysaccharides à doser de 0,025 à 0,25 g/L sont préparés (Tableau 1 et 2).

Tableau 1 : Gamme étalon de glucose

SM [Glu] 2 g/Len µL 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Eau qsp 2 mL 2000 1980 1960 1940 1920 1900 1880 1860 1840

[Gal] g/L 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16

Abs 450 nm 0 0.043 0.097 0.196 0.249 0.257 0.309 0.362 0.408


SM [poly]5 mg/mL en µL

10 20 30 40 50 60 80 90

Eau qsp 1 mL 990 980 970 960 950 940 920 910

[poly] mg/mL 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.45

Abs 450 nm 0.112 0.230 0.248 0.387 0.617 0.708 0.907

2.3.1.2. Dosage des acides uroniques par metahydroxybiphenyl (mHBP)

La quantité d’acide uronique est déterminée par le dosage colorimétrique

(Blumenkrantz et Absoe-Hansen, 1973), modifié par Filisetti-Cozzi et Carpita (1991). Pour ce

dosage, on emploie le méta-hydroxybiphényl.

Principe :

Cette méthode permet de détecter les acides uroniques avec une faible interférence

des hexoses.

5


Elle est basée sur le même principe que les dosages au résorcinol, cette réaction fait

intervenir les dérivés glucidiques et un acide concentré, formant des complexes absorbant à

520 nm.

Mode opératoire :

A 200 µL d’échantillon sont additionnés 1 mL de tetraborate de sodium dans de

l’acide sulfurique concentré (0,95 g de tetraborate de sodium dans 2 mL d’eau et complété à

100 mL par de l’acide sulfurique concentré). Après une incubation 5 minutes à 100 °C, le

mélange est refroidi rapidement avant l’ajout de 20 µL de mHBP (0,15 g dans 500 mg de

soude qsp 100 mL d’eau). Une seconde incubation de 30 minutes à température ambiante est

faite avant la mesure d’absorbance à 520 nm.

La gamme étalon est réalisée avec une solution d’acide glucuronique (de 0,05 à 0,25 mg/mL)

(Table 3).


SM 0,5mg/mL (ac glu) en µL 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Eau qsp 1mL 1000 980 960 940 920 900 880 860 840 820 800

[acglu]

mg/mL0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1

Abs 520 nm 0 0.0240.22

90.250 0.287

0.31

00.420 0.514 0.618

0.71

10.740

On prépare différentes concentrations des polysaccharides à doser (Table 4)


SM [poly] 5 mg/mLen µL

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Eau qsp 1 mL 990 980 970 960 950 940 930 920 910

[poly] mg/mL 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

Abs 520nm 0.86 0.084 0.096 0.099 0.114 0.101 0.115 0.135 0.175

6


2.3.1.3. Dosage des protéines de polysaccharides de Cereus triangularis par la méthode

de Biuret par le méthode adaptée de Gornall, Bardawill et David (1949).

Principe :

La méthode de Biuret est utilisée pour réaliser le dosage des protéines dans les

différents échantillons.. La Biuret réagit en milieu alcalin avec le CuSO4 en donnant une

coloration violette dont le maximum d’absorption est à 540 nm.

Par suite de leur analogie de structure avec la Biuret, Les peptides et les protéines donnent la

même réaction. La zone d’utilisation est de 1 à 20 mg/mL.

Préparation de la gamme étalon en SAB :

A l'aide d'une solution étalon de protéines à 20 mg/mL dans l’eau physiologique en équivalent

albumine, réaliser une gamme large de solutions allant de 0 à 20 g/L sous un volume de 1 mL

(Table 5).


SM SAB 20mg/mL(µL)

0 200 400 600 800 1000

Eau physiologique(µL) 1000 800 600 400 200 0

[SAB] mg/mL 0 4 8 12 16 20

Abs 540 nm 0 0.065 0.157 0.238 0.287 0.301

Préparation de polysaccharides à doser :


SM [Poly] 10 mg/mL (µL)

400 800

Eau physiologique(µL)

600 200

[Poly] mg/mL 4 8

Abs 540nm 0.003 0.005

7


Mode opératoire :

Dans une tube essais de 5 mL, 1 mL d’échantillon à doser est ajouté 4 mL de réactif

de BIURET. Après un mélange soigneux au vortex, le mélange est incubé à température

ambiante pendant 30 minutes et lu à 540 nm.

2.4. Détermination des monosaccharides constitutifs de mucilage de Cereus triangularis

Dans les dernières décennies, beaucoup d'études ont été effectué sur l'analyse des

mucilages de Cactus. Une des recherches les plus importantes concerne la composition des

hydrates de carbone et la caractérisation des polysaccharides extraits de fruits et de raquettes

d’ Opuntia sp.

Néanmoins, aucuns études traitent les cladodes de Cereus triangularis. Dans le présent

travail, l'identification de la composition monosaccharide de mucilage extrait à la température

ambiante de cladodes de C. triangularis a été effectuée par chromatographie en phase

gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS) après hydrolyse acide.

2.5. Détermination de la masse molaire par chromatographie d’exclusion stérique

couplée à la diffusion de lumière (sec/malls) de polymère de Cereus triangularis

La diffusion de la lumière multi-angles (MALLS) est une technique particulièrement

adaptée pour la caractérisation des polymères en solution diluée. Elle permet d’accéder aux

masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) et renseigne également sur la

forme et la dimension des chaînes.

On définit la masse molaire moyenne en nombre par la relation suivante :

Mn = ∑ nx M x

∑ nx

X : degré de polymérisation

nX : nombre de macromolécules de degré de polymérisation

Mx : masse de macromolécules de degré de polymérisation

De même, on définit la masse molaire moyenne en poids par :

Mw= ∑ nx M 2

x

∑ nx M x

et indice de polydispersité (Ip) par :

8


I p= M w

M n

L'indice de polydispersité (Ip) représente la distribution de taille d'une population de

particules. Pour un polymère où toutes les macromolécules auraient même longueur (et donc

même masse molaire), Ip serait égal à 1. Dans l’analyse SEC/MALLS, les macromolécules en

sortie de colonne sont quantifiées par un détecteur réfractométrique différentiel (DRI) puis

analysées au travers d’un détecteur à diffusion de lumière multi-angles. Les molécules vont

diffuser la lumière d’une source laser de façon variable selon leurs conformations. Des

photodiodes placées à des angles caractéristiques permettent de recueillir le signal. Ce dernier

est analysé par un logiciel et permet ainsi d’accéder à la masse molaire de la molécule

analysée (Figure 3). Le principal intérêt du couplage SEC/MALLS/DRI réside dans le fait

que la seule connaissance de l’incrément d’indice de réfraction dn/dc permet d’obtenir une

distribution de masses molaires absolues par détection simultanée DRI et diffusion de la

lumière.

Columns

Solvent Pump Injector

RI ConcentrationSensitive detector

PC or Macintosh

Wasbe

DAWN BOSor miniDAWN

A B

Figure 3 : Représentation schématique du couplage SEC/MALLS/DRI (A) et de la

diffusion de lumière dans une cellule de photoréception à 18 angles (B).

Des masses moléculaires moyennes et les distributions de poids moléculaire des

polysaccharides provenant des cladodes de Cereus ont été déterminées par chromatographie

d'exclusion de taille à haute pression (HPSEC) couplé avec la diffusion de la lumière multi-

angles laser (MALLS) composé d’une membrane K5 (50 L) et de deux détecteurs: un laser

9


He-Ne (λ = 690 nm) et un indice de réfraction différentiel (DRI). Des colonnes Shodex

colonnes [OHpak SB-G colonne de garde, OHpak SB806, 804 et 803 colonnes de l'AC

(Shodex)] ont été élues avec NaNO3 0,1M à 0,7 mL / min. Le solvant a été filtré à travers d’un

filtre (Millipore) de 0,1 m, et puis filtré à travers d’une colonne en amont du filtre de 0,45

m. L'échantillon a été injecté à 5 g / L dans une boucle complète de 100 L. Les données

recueillies ont été analysées en utilisant le package logiciel Astra 4.50 et dn / dc de 0,15.

2.6. Analyse spectroscopique de mucilage de Cereus triangularis

2.6.1. Analyse de polysaccharides cladode de Cereus triangularus par spectroscopie

infrarouge

Les spectres infrarouges ont été réalisés à l'aide d'un spectromètre VERTEX 70 FT-IR.

Polysaccharides séchés des cladodes de Cereus triangularus ont été dispersés sur ATR A225

diamant. Les spectres IR (60 spectres) ont été enregistrés à température ambiante (référencé à

l'air) avec la gamme fréquences comprises entre 500-4000 cm-1. Les spectres ont été analysés

avec logiciel OPUS7.2.

2.6.2. Analyse 1H-RMN de polysaccharides de Cereus triangularis

Le polysaccharide séché de cladodes de Cereus triangularis a été dissous dans D2O

(99,9%) et lyophilisé pour remplacer les protons échangeables par du deutérium. Pour

l'analyse RMN, le polysaccharide est dissous dans de l'échange de D2O (40 g / L). Les

spectres de RMN des solutions ont été enregistrés à 60 °C en utilisant un spectromètre

Brucker Avance 600 MHz de 300 équipés de 13C/1H bidimensionnels. Les expériences de

RMN ont été enregistrées avec une largeur spectrale de 3000 Hz, avec un temps d'acquisition

de 1,36 s, une largeur d'impulsion de 7 ms, un temps de relaxation de 1 s et un nombre de

balayages 256. Un spectre RMN 2D a été appliqué à l'aide double quantique filtré

spectroscopie corrélation (DQF COSY), la cohérence quantique unique hétéro nucléaire

(HSQC).

2.7.ETUDE DES PROPRIETES ANTIOXYDANTES DU POLYSACCHARIDES

CEREUS TRIANGULARIS

Plusieurs méthodes ont été effectuées afin de déterminer les propriétés antioxydantes

des fractions de polysaccharides de Cereus triangularis cladodes.

10


2.7.1. Test anti-radicalaire par le dosage au 2,2’-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH)

adapté de Yamaguchi et al .(1998)

La mesure de l’activité anti-radicalaire des polysaccharides issus de Cereus

triangularis est réalisée par le dosage au 2,2’-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) selon un

protocole adapté de Yamaguchi et al.(1998).

Brièvement, les fractions sont dissoutes à différentes concentrations (de 0 à 10 g/L) dans l’eau

distillée. Un volume de 1 mL de chaque solution est mélangé avec 1 mL d’une solution de

DPPH (0,1 mM dans l’éthanol). Après homogénéisation au vortex, les mélanges sont incubés

à température ambiante (25°C) à l’abri de la lumière. Après 30 minutes d’incubation,

l’absorbance est lue à 517 nm.

Le pourcentage d’activité anti-radical DPPH est calculé selon l’équation suivante :

Inhibition du radical DPPH (%) = (1- (Aéchantillon/Atémoin)) x 100.

Avec : Aéchantillon=Absorbance à 517nm du mélange fraction + DPPH (0,1 mM dans l’éthanol)

et Atémoin=Absorbance à 517nm du mélange : 1mL d’eau distillée + 1mL de DPPH (0,1 mM

dans l’éthanol).

2.7.2. Test anti-radicalaire (Hydroxyl radical) adapté de Luo et al. (2010)

La mesure de l’activité anti-radicalaire (Hydroxyl radical) des polysaccharides issus de

Cereus triangularis est réalisée selon un protocole adapté par Delattre et al., (2014).

Brièvement, les fractions sont dissoutes à différentes concentrations (de 0 à 10 g/L)

dans l’eau distillée. Un volume de 0,2 mL de chaque solution est mélangé avec 0,2 mL d’une

solution de FeSO4 (5 mM dans l’eau distillée). Après homogénéisation au vortex, ajouter 0,2

mL de H2O2 (1% dans l’eau distillée) et vortexer. Les mélanges sont incubés à température

ambiante (25 °C). Après 60 minutes d’incubation, ajouter 1mL d’eau distillée, vortexer et lire

l’absorbance à 510 nm (=Aéchantillon).

Le pourcentage d’activité anti-radical hydroxyl est calculé selon l’équation suivante :

Inhibition du radical hydroxyl (%) = ((Atémoin - Aéchantillon)/Atémoin) x 100.

Avec : Aéchantillon=Absorbance à 510nm de la fraction poly- ou oligosaccharides à doser et

Atémoin=Absorbance à 510nm du mélange ou l’échantillon à doser est remplacer par 0,2mL

d’eau distillée.

11


2.7.3.Test anti-radicalaire (Superoxyde anion radical) réalisée selon un protocole adapté

de (Elboutachfaiti et al., 2011)

La mesure de l’activité anti-radicalaire (Superoxyde anion radical) des

polysaccharides issus de Cereus triangularis est réalisée selon un protocole adapté de adapté

de (Elboutachfaiti et al., 2011).

Brièvement, les fractions sont dissoutes à différentes concentrations (de 0 à 10 g/L)

dans l’eau distillée. 0,420 mL d’échantillon est mélange avec 0,450 mL de tampon Tris-HCl

(pH 8,2; 50mM). Ce mélange est incubé 20 minutes à 25°C. Ajouter 30µL d’une solution de

pyrogallol (5 mM dans l’eau distillée) et vortexer. Après 5minutes d’incubation, ajouter

0,1mL d’acide ascorbique (5% dans l’eau) pour arrêter la réaction. Lire l’absorbance à

325nm.

Le pourcentage d’activité anti-radical superoxyde anion est calculé selon l’équation suivante :

Inhibition du radical superoxyde anion (%) = ((Atémoin - Aéchantillon)/Atémoin) x 100.

Avec : Aéchantillon=Absorbance à 325nm de la fraction poly- ou oligosaccharides à doser et

Atémoin=Absorbance à 325nm du mélange ou l’échantillon à doser est remplacer par 0,420mL

d’eau distillée.

2.7.4. Test antiradicalaire par dosage du pouvoir réducteur adapté de Yan et al. (2005)

Le dosage du pouvoir réducteur des polysaccharides issus de Cereus triangularis est

réalisée selon un protocole adapté de Yan et al. (2005) et Dorman et al., (2003).

Brièvement, les fractions sont dissoutes à différentes concentrations (de 0 à 10 g/L) dans l’eau

distillée. 0,100 mL d’échantillon est mélangé avec 0,250 mL de tampon Phosphate (0,2M, pH

6,6) et 0,250 mL de ferricyanide de potassium (1%, p/v dans l’eau distillée). Ce mélange est

incubé dans un bain marie à sec à 50°C pendant 20 minutes. Refroidir dans un bain de glace

pendant 5 minutes, puis ajouter 0,250 mL d’acide trichloro-acétique (10%, p/v dans l’eau

distillée), vortexer 1 minute. Le mélange est centrifugé à température ambiante pendant 10

minutes à 5000 rpm. 0,250 mL de surnageant est mélangé avec 0,250 mL d’eau distillée et

0,050 mL de FeCl3 (0,1%, p/v dans l’eau distillée).Vortexer le mélange. Après 5 minutes, lire

l’absorbance à 700 nm. L’augmentation de l’absorbance indique une augmentation du pouvoir

réducteur.Remarque : La vitamine C est utilisée comme témoin positif du pouvoir réducteur.

12


13

RESULTATS

ET

DISCUSSIONS

Résultats et discussions

3. RESULTATS ET DISCUSSIONS

3.1. Résultats d’extraction et de purification de polysaccharide cereus triangularis

L'extraction et la purification des polysaccharides de Cereus triangularis en utilisant

de l'éthanol et de l'acétone a permis d'éliminer la fraction de la chlorophylle présente dans les

cladodes. Ce procédé aboutit à l'extraction de mucilage d'une poudre jaune claire, similaire à

d'autres polysaccharides commercialisés et utilisés dans l'industrie alimentaire. Notons bien

que nous avons obtenu un rendement d'extraction de 24% de la masse de poudre de cladode

sèche (Tableau 7). Selon la littérature, la teneur en mucilage a été plus faible par rapport à

d'autres familles de Cactaceae comme par exemple Opuntia joconostle où il a été montré un

rendement d'extraction de 30% de poudre de cladode (Paiz et al., 2010). Néanmoins, la

quantité de mucilage (24%) de C. triangularis extrait à la température ambiante est plus

élevée que cladodes mucilage extrait de certaines variétés d'Opuntia sp. où il a été signalé une

plage de rendement d'extraction de 18 à 20% (Sepulveda et al., 2007).

Tableau 7 : Rendement de mucilage de cladode sèche de Cereus triangularis

Rendemant d’extraction (poids/poids) Couleur

24 % Jaune claire

3.2. Identification des polysaccharides

3.2.1. Dosages colorimétriques de polysaccharides de Cereus triangularis

3.2.1.1. Dosage des oses neutres des polysaccharides de Cereus triangularis

Selon le protocole de dosage d’oses neutres par le résorcinol (Dubois, 1956), la courbe

d’étalonnage en glucose est présentée dans la Figure 4.

14


0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.180

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

f(x) = 2.56256983240224 xR² = 0.99975401204595

[Glu] mg/mL

Abs

450

nm

Figure 4 : Courbe d’étalonnage en glucose (Dosage au résorcinol) (Dubois., 1956)

A partir de cette gamme d’étalonnage en glucose, nous avons dosé en équivalent

glucose, les concentrations en oses neutres des différentes solutions de polysaccharides à

doser de Cereus triangularis. Nos résultats sont résumés dans le Tableau 8.

Tableau 8: Différentes concentrations de polysaccharides à doser de Cereus triangularis

[poly] mg/mL 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,30 0,4 0,45

[oses neutres]

mg/mL0.046 0.089 0.096 0.151 0.240 0.243 0.276 0.354

[oses neutres]/

[poly] mg/mg0.936 0.897 0.645 0.755 0.963 0.813 0.690 0.786

La moyenne du rapport massique entre les concentrations des oses neutres et les

concentrations des polysaccharides est de 0,82 mg/mg. Donc la teneur en oses neutres

(équivalent glucose) est de 82%.

15


3.2.1.2. Dosage des oses acides par metahydroxybiphenyl (mHBP)

D’après la mesure des absorbances à 520 nm, on trace la gamme étalon à différentes

concentrations de l’acide glucuronique (Figure 5).

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

f(x) = 7.60368627450982 xR² = 0.997758496290838

[a. glu] mg/mL

Abs

520

nm

Figure 5 : Courbe d’étalonnage en acide glucuronique (Blumenkrantz et Absoe-Hansen,

1973), modifié par Filisetti-Cozzi et Carpita (1991)


[poly] mg/mL 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,30 0,35 0,4 0,45

[oses acides]

mg/mL0.011 0.011 0.012 0.013 0.014 0.013 0.015 0.017 0.023

[oses acides]/

[poly] mg/mg0.22 0.11 0.084 0.061 0.059 0.044 0.043 0.044 0.051

Conclusion :

En utilisant la méthode de dosage par mHBP, la moyenne des rapports massiques entre

les concentrations des oses acides et les concentrations des polysaccharides de Cereus

triangularis est de 0,08 mg/mg. Donc la teneur en oses acides pour cette méthode est de 8 %.

16


2.2.1.3. Dosage des protéines de Cereus triangularis

Après lecture des absorbances à 540 nm. On trace une gamme étalon à différentes

concentrations de SAB (Figure 6).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.0181785714285714 xR² = 0.998127651049633

[SAB]mg/mL

AB

S 54

0 nm

Figure 6 : Courbe d’étalonnage en SAB par la méthode de Biuret adaptée de Gornall, Bardawill et David (1949).


[poly] mg/mL 4 8

[SAB]mg/mL

0.16 0.27

[SAB]/ [poly] mg/mg

0.041 0.034

Conclusion :

L’absorbance à 540 nm de polysaccharides de Cereus triangularis à 10 mg/mL est de

Le rapport massique entre les protéines et les polysaccharides est de 0,038 mg/mg. Donc la

teneur en protéines de l’extrait polysaccharidique est de 3 %.

17


2.2.1.4. Récapitulatif des dosages des éléments de polysaccharides de Cereus triangularis:

Les résultats des dosages colorimétriques effectués sur les polysaccharides purifiés

sont résumés dans le Tableau 11 suivant.

Tableau 11: Représente Récapitulatif des dosages des éléments de polysaccharides

Protéines Oses neutres Oses acides

Méthodes Biuret Résorcinol mHBP

Rapport massique(mg/mg)

0,03 0,82 0,08

% massique 3 % 82 % 8 %

L'analyse chimique a révélé que ces polysaccharides solubles dans l'eau extraites des

cladodes séchées de Cereus triangularis étaient composées de 82 % d'oses neutres et 8%

d'acides uroniques aussi bien que quantité importante de protéines estimée à 3%. Il est

important de souligner que la teneur en hydrates de carbone (90 %) est supérieure à la peau du

fruit (Cactaceae) de cereus sp. où Montoya-arroyo et al., (2014) ont montré 82% de quantité

de glucides.

3.3. Monosaccharide composition estimé par GC / MS-EI.

Dans ce présent travail, l'identification de la composition monosaccharide de mucilage

extrait à la température ambiante de cladode de C. triangularis a été étudiée par

chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC / MS) après

hydrolyse acide. Comme le montre le Tableau 12, il est composé de cinq majorité des

monosaccharides tels que : le galactose (55,4%), l’ arabinose (37,0%), le rhamnose (3,8%), le

glucose (1,7%) et de l'acide galacturonique (1,6%). Dans une moindre mesure, une faible

quantité de mannose (0,5%) a été identifié. La présence d'arabinose (37,0%) et le galactose

(55,4%) en grande quantité nous a permis de suggérer: que le polysaccharide extrait de C.

triangularis cladodes était un arabinogalactane avec un rapport Ara / Gal = 0,67. Cette

composition de monosaccharides a été conforme aux œuvres publiées. En effet, comme

indiqué dans la littérature, le type de mucilage des espèces de Cactaceae varie généralement

18


selon le nombre des monosaccharides constitutifs tels que le galactose, l'arabinose, le

rhamnose et de l'acide galacturonique (Sáenz et al., 2004). En outre, les rapports de

monosaccharides ont été fortement influencées non seulement par les procédés d'extraction,

mais aussi par l'irrigation, la pluie, la température, la nature du sol et de son taux d'humidité.

Par rapport à d'autres composition des monosaccharides decladodes de Cactus, Cereus

triangularis contient une quantité importante de galactose que les raquettes d’Opuntia ficus

indica (avec une quantité de 21% de galactose) et plus faible quantité d'arabinose, rhamnose

et de l'acide galacturonique que Opuntia ficus indica avec 42 %, 7%, 8%, respectivement,

puis un rapport Ara / Gal de 2 (Nobel et al., 1992). Enfin, il est à noter que les cladodes de

Cereus peruvianus, il a été décrit une structure de l'arabinogalactane avec un rapport Ara / Gal

0,23 (Tanaka et al., 2010).

Tableau 12 : Récapitulatif des monosaccharides constitutifs de mucilage de

Cereus triangularis

Monosaccharides (mol %)

Gal Ara Rha Glc GalA Man

55.40 37.00 3.81 1.69 1.63 0.47

Gal: Galactose; Ara: Arabinose; Glc: Glucose, Rha: Rhamnose, GalA: Acid galacturonique ,

Man: Mannose.

Toutes les analyses ont été effectuées en triple et les écarts-types relatifs sont à moins de 5%.

3.4. Détermination des masses molaires en poids et en nombre de polysaccharides

de Cereus triangularis par (SEC/MALLS)

Les masses molaires moyennes en poids et en nombre des polysaccharides pour

chaque fraction et les indices de polydispersités sont présentés dans les Tableaux 13.

19


Tableau 13 : Résultats des masses molaires moyennes en poids et en nombre des

polysaccharides.

Mw (g/mol)* Mn (g/mol)** Ip***

8,43x106 6,96x106 1,21

*Mw: poids moléculaire estimé par la SEC commerciaux.

** Mn: poids moléculaire moyen Nombre estimé par la SEC commerciaux.

*** Ip: indice de polydispersité estimée par la SEC commerciaux.

Le poids moléculaire (Mw) de polysaccharides extraits à partir des cladodes de Cereus

triangularis a été évaluée par analyse SEC-MALLS. Comme indiqué dans le Tableau 13, le

Mw du présent hydrocolloïde a été estimé à 8,43.106 g / mol avec un indice de polydispersité

faible de 1,21, qui a confirmé la présence de la structure moléculaire élevée en

polysaccharides homogènes. Les dernières années, les travaux décrits par Majdoub et al.,

(2001) ont estimé un poids moléculaire de 13106g / mol pour le mucilage extrait de genre

Opuntia. En outre, d'autres études ont montré une évolution dans Mw comme par exemple

autour de 4106 g / mol, comme indiqué par Trachtenberg et Mayer (1981), 3106 g / mol,

comme indiqué par Cardenas et al., (1997) et 2,3104g / mol, comme indiqué par Medina-

Torres et al., (2000). Dans la plupart des cas, la différence observée dans le poids moléculaire

du mucilage pourrait être due à: l'âge de cladodes, les méthodes d'extraction et de la

contamination de ces hydrocolloïdes avec d'autres composés naturels. En général, la masse

moléculaire élevée a été observée pour les polysaccharides purs, sans aucune contamination

par des protéines et des chercheurs attribuent les structures polysaccharidiques comme les

membres de la famille de la pectine avec une faible quantité d'acide galacturonique et de la

quantité élevée de sucres neutres comme le galactose, l'arabinose (Saenz et al, 2004).

3.5. Analyse infrarouge

La Figure 7 présente le spectre infrarouge du polysaccharide extraite par le cladode de

Cereus triangularis et le Tableau 14 répertorie les différentes bandes d'absorption et les

groupements fonctionnels correspondants.

20


Figure 7 : Spectre infrarouge de polysaccharides de Cladode de Cereus triangularis

Comme observé dans le spectre, des bandes caractéristiques ont été assignés. En fait,

la bande à 3200-3500 cm-1 est attribuée à la vibration d'élongation d’hydroxyle (OH) de

polysaccharides (Adel et al., 2010) alors que la bande large située à 3295 cm-1 qui résulte de

la présence de groupes hydroxyle (-OH) des groupes. La bande d'absorption observée à

environ de 2900 cm-1 a été attribuée à la vibration asymétrique de la fonction CH. Le faible

étirement bande de vibration autour à 2850 cm-1 pourrait être affecté au groupe méthoxy

(CH3-O). En outre, les pics à 1730 et de 1241 à 1243 cm-1 ont révélé la présence de groupes

acétyle, selon la littérature (Vinod et al, 2008 ; Brito et al., 2004). Les bandes d'absorption

autour de 1613 cm-1 et 1418 cm-1 sont typiques de groupes carboxylate (-COO-) à d’acides

uroniques (Brito et al., 2004) où la bande large situé 1613 cm-1 correspondaient surtout à la

vibration d'élongation de fonction C = O de la fonction carboxylique (Barka et al., 2013). Le

signal observé à1372 cm-1 peut être déterminé à la vibration de valence de carboxylate. Enfin,

le pic obtenu à 1033,99 cm-1 a donné de la présence de fonctions d'hydrates de carbone CO

(Edwards et al., 1998).

21


Tableau 1 : Résumé des spectres infrarouges de polysaccharides de Cereus triangularis.

Longueur d'onde (cm-1) Type de liaison

(υ= vibration d’élongation et δ = vibration de déformation)

3295 υ (O-H)

2900 υ (C-H) aliphatique

2850 (CH3-O) groupe méthoxy

1613 υ (C = O) fonction carboxylique

1418 (-COO-) sels des acides uroniques

1037,32 υ (C-O) fonctions d'hydrates de carbone

3.6. RMN

Le polysaccharide de cladodes de Cereus triangularis. On a analysé par 1H -RMN et

de 13C-RMN spectroscopie et les analyses spectrales de RMN 1D et 2D ont montré des

signaux spécifiques de mucilage (Figure 8 et 9).

60708090100110f1 (ppm)

60.7

261

.19

71.8

0

73.3

0

74.5

0

76.5

7

77.6

4

81.2

6

84.0

7

94.4

7

95.8

7

99.9

9

104.

35

107.

46

C-1 (Gal)C-4 (Gal)

C-5 (Gal)

C-3 (Gal)

C-2 (Gal)

C-1 (Ara)

C-6 (Gal)

C-3 (Ara)

C-4 (Ara)C-2 (Ara)

C-5 (Ara)

Figure 8A : Spectre 13C -RMN de polysaccharides de cladode de C. triangularis

22


2.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.05.15.25.35.45.5f1 (ppm)

3.61

3.64

3.65

3.71

3.74

3.88

4.02

4.06

4.09

4.56

5.01

5.12

(a)

HOD

(b)

(c)(d)

(e)(f)

(g)

(h)

(i)

(j)(k)

(b’)

Figure 8B: Spectre 1H-RMN de polysaccharide de Cereus triangularis

Figure 9A : Spectre de corrélation hétéronucléaire entre 13C et 1H (HSQC) de polysaccharide de Cereus triangularis.

23


Figure 9B: Spectre RMN-1H/ 1H de polysaccharide de Cereus triangularis

Le spectre 13C-RMN de polysaccharides de cladodes de C. triangularis (Figure 8A) a

révélé la présence des 6 signaux de carbone:104,35 ppm (C-1), 71,80 ppm (C-2), 73,3 ppm

(C-3), 77,64 ppm (C-4), 74,5 ppm (C-5) et 60,72 ppm (C-6). Par rapport au mucilage de

cactus dans la littérature (Habibi et al., 2004) ce signal de 13C spécifique pourrait être confiée

à des pics de résonance caractéristiques de linéaire épine dorsale de la chaîne de galactane

composé de (41)--D-Galp résidus. Comme d'autres signaux de 13C moins intenses ont été

identifiés à 107,46 , 81,26, 76,57, 84,07 et 61,19 ppm, ce qui correspond, respectivement, à

C-1, C-2, C-3, C-4 et C-5 d'un résidu de arabinosyle terminal T--L-Araf-(31) liée à

galactosyl résidus (Habibi et al., 2004; Vignon et al., 2004).

Grâce à une corrélation hétéronucléaire entre 13C et 1H (HSQC), nous pouvons facilement

identifier les protons correspondants (Figure 8B) des polysaccharides extraits de cladode C.

triangularis. Ainsi, les signaux des protons identifiés à: 4,56 ppm, 3,61 ppm, 3,71 ppm, 4,09

ppm, 3,64 ppm et 3,74 ppm ont été attribuées à H-1, H-2, H-3, H-4, H-5 et H-6,

respectivement, de (41)--D-Galp résidus liées à la chaîne principale linéaire du galactane.

En outre, d'autres signal observé à: 5,12 ppm, 4,06 ppm, 3,88 ppm, 4,02 ppm et 3,65 ppm, ont

été clairement attribuée à H-1, H-2, H-3, H-4 et H-5, respectivement du terminal arabinosyle

résidu T--L-Araf- (31) liée à galactosyl résidus. Remarque à mentionner que les analyses

RMN 2-D ont permis d'identifier les signaux faibles à 5,01 ppm et environ 108 ppm, ce qui

24


pourrait être attribué à H-1 et C-1 respectivement à partir d'une faible quantité de (51)--L-

Araf.

En conséquence, cette caractérisation RMN ont montré des pics de résonance caractéristiques

de la famille arabinogalactane comme déjà décrit par Habibi et al.,(2004) dans la

caractérisation de polysaccharide extrait de la peau de fruits de Opuntia ficus-indica.

4. ETUDE DES PROPRIETES ANTIOXYDANTES DE POLYSACCHARIDE DE

CLADODE DE CEREUS TRIANGULARIS

Dans le stress oxydatif humaine, nous devons parler d'espèces réactives de l'oxygène

(ROS) qui sont responsables de lésions des tissus cellulaires par les dommages oxydatifs des

macromolécules telles que les acides nucléiques, les lipides et les protéines (Delattre et al,

2014; Elboutachfaiti et al., 2011). En règle générale, la plupart des organismes sont en mesure

de se protéger contre les effets néfastes du stress d'oxydation. Même si, pour phénomène

oxydatif plus grave, les mécanismes de défense innés ne garantissent pas la protection de

corps humain. En effet, comme par exemple, il a été bien établi que l'oxygène provient des

radicaux libres tels qu'un radical anion superoxyde ou le radical hydroxyle pourrait jouer effet

significatif au cours du mécanisme de vieillissement et la carcinogenèse (Cuzzocrea & Reiter,

2001). Par conséquent, afin de protéger à la fois la nourriture et le corps humain contre les

dommages oxydatifs, antioxydants agents doivent être couramment utilisé. En règle générale,

les molécules synthétiques tels que le tert-butylhydroquinone (TBHQ), le butylhy-

droxyanisole (BHA), le gallate de propyle (PG) ou l'hydroxytoluène butylé (BHT) ont été

couramment utilisés comme anti-oxydant dans l'industrie alimentaire (Qi et al., 2005).

Néanmoins, aussi bien liés par Delattre et al. (2014), ces composés chimiques (BHA, BHT et

TBHQ) étaient de plus en plus limités par la législation alimentaire en raison de leur toxicité

et de l'impact lié à la cancérogenèse. C'est pourquoi, les recherches s’explorent sur les

antioxydants naturels comme polysaccharide de plantes est devenu l'un de la branche la plus

importante de l'industrie alimentaire et de la biomédecine (Elboutachfaiti et al., 2011). Dans

ce contexte, les propriétés anti-oxydantes de polysaccharides extraits des cladode de C.

triangularis ont été étudiées.

4.1. Activité de piégeage des radicaux DPPH

L'effet de balayage de polysaccharide de C. triangularis sur les radicaux DPPH a été

étudié. Le test DPPH est sans conteste la principale méthode utilisée pour évaluer le pouvoir

25


de piégeage des radicaux de polysaccharides naturels (Delattre et al, 2014; Elboutachfaiti et

al., 2011).

CE50 (polysaccharide)=

0

1020

30

4050

60

7080

90

100

0 2 4 6 8 10

Scav

engi

ng e

ffect

%

Concentration (g/L)

Figure 10A : Evolution des activités anti-radicalaires (radical DPPH) des fractions: (--) : Polysaccharide issus des cladodes de Cereus triangularis; (--):Vitamine C.

Comme observé sur la Figure 10 A, pour chaque concentration testée, la fraction de

polysaccharide extrait des cladodes de Cereus triangularis possédait une activité anti-

oxydante des radicaux DPPH. Cependant, on a constaté que pour toutes les concentrations

(0,01 à 8 g / L) présente une activité anti-radicaux DPPH cladodes de polysaccharides étaient

toujours inférieur à l'acide ascorbique et a atteint plus de 50% pour la plus forte concentration

de 4g / l. Quoi qu'il en soit, pour une concentration plus élevée (10 g / L), on a observé une

activité anti-radicaux DPPH presque similaire entre l'acide ascorbique et des polysaccharides

qui atteint une valeur de % fermé à 98%. Par conséquent, selon ce test in vitro, nous avons

estimés que avec de 3,5 g/L de la fraction polysaccharidique inhibe la moitié des radicaux

2,2’- diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH).

En règle générale, il a été bien décrit que l'effet de piégeage des radicaux DPPH des

polysaccharides antioxydants a été clairement corrélé à leur capacité de donneur d'hydrogène.

En outre, cette activité antiradicalaire de polysaccharides des cladodes de C. triangularis

contre radical DPPH pourraient être corrélées avec la présence de l'acide galacturonique. En

fait, comme décrit précédemment dans la littérature (Delattre et al., 2014), il a été confirmé

l'augmentation des propriétés anti-DPPH avec des polysaccharides oxydés. Ensuite, les

groupes carboxylate ont été décrits pour leur capacité à activer l'atome d'hydrogène de l'atome

de carbone anomère conduisant ainsi à augmenter leur capacité de donneur d'hydrogène.

26


4.2. Activité de piégeage les radicaux hydroxyles

Comme bien défini dans la littérature, les espèces réactives de l'oxygène tels que les

radicaux hydroxyle ont causé des dommages de la mort cellulaire et tissulaire faisant réagir

avec des biomolécules cellulaires tels que l'ADN, des protéines, des hydrates de carbone.

Radical hydroxyle est également connu comme initiateur principal de la peroxydation des

lipides. En conséquence, pour une meilleure protection de la vie des systèmes, l'élimination

des espèces radical hydroxyle est apparu comme essentiel (Delattre et al, 2014; Elboutachfaiti

et al.,2011).

Dans la présente étude, nous avons évalué le potentiel de piégeur de radicaux

hydroxyle de polysaccharides extraits des raquettes de de Cereus triangularis.

CE50 (polysaccharide)= 3,5 g/L

0

1020

304050

6070

8090

100

0 2 4 6 8 10

Scav

engi

ng e

ffect

%

Concentration (g/L)

Figure 10B : Evolution des activités anti-radicalaires (radical Hydroxyl) des fractions :

(--) : Polysaccharide issus de Cereus triangularis ; (--) : Vitamine C.

Comme observé sur la Figure 10B, tout effet de balayage contre le radical hydroxyle

était dépendant de la concentration et ensuite l'augmentation de la concentration croissante de

polysaccharides. Notons bien que cet effet de piégeage des radicaux a toujours été inférieur de

l'acide ascorbique. En effet, pour de faibles concentrations (0,01 à 2 g/L), l'effet a atteint

environ 5 à 40% de l'effet total estimé de balayage pour l'acide ascorbique. Cependant, pour

une concentration plus élevée de polysaccharides (> 6 g/L), l'effet de piégeage a atteint plus

de 60% de l'effet total de piégeage de l'acide ascorbique.

En outre, une CE50 de 3,2 g / L a été estimée pour les polysaccharides des cladodes de

27


C. triangularis. Puis, le polysaccharides des cladodes de C. triangularis sont apparus comme

un piégeur de radicaux hydroxyle inférieur par rapport à d'autres polysaccharides de Cactus

comme par exemple les polysaccharides extraits de fruits d'Opuntia ficus indica pelées où il a

été décrit une CE50 de l'ordre de 0,6 g / L en utilisant un protocole de test adapté (Zhong et

al, 2010). Cependant, ce résultat était compatible avec la gamme de concentration de

polysaccharide actif largement décrit dans la littérature sur les polysaccharides des végétaux

possédant un effet anti-radical hydroxyle. Ainsi, notre résultat concernant les cladodes de

Cereus semble intéressant, car l'aptitude des polysaccharides d'origine végétale dans la trempe

le radical hydroxyle réactif ont été décrits pour leur potentiel d'application dans la durée de

conservation des aliments (Delattre et al, 2014;Yuan et al., 2005).

4.3. Activité de piégeage contre le superoxyde anion

Superoxyde anion radical pourrait être généré par des processus biologiques in vivo et

pourrait générer la formation de H2O2 par des réactions de dismutation (Elboutachfaiti et al.,

2011). Espèces superoxydes radicalaires est bien connue pour être un précurseur de ROS

nocif pour les composés cellulaires. En effet, il a été l'un des précurseurs de l'oxygène singulet

et le radical hydroxyle et pourrait ensuite amorcer la réaction de peroxydation lipidique. Par

dosage in vitro en utilisant la procédure d'auto-oxydation du pyrogallol pour générer le

superoxyde anion radical (Wang et Luo, 2007), il a été possible de vérifier l’effet de piégeage

des radicaux superoxyde anion de la molécule naturelle tels que les polysaccharides. Dans ce

contexte, l'effet de piégeage des radicaux de superoxyde anion des polysaccharides de C.

triangularis sur les radicaux DPPH a été testé.

CE50 (polysaccharide)= ND (non déterminée)

28


Figure 10C: Evolution des activités anti-radicalaires (radical superoxyde anion)

des fractions: (--): Polysaccharide issus de cladode de Cereus triangularis;(-

-):Vitamine C.

Sur la Figure 10C a été représenté l'effet inhibiteur des solutions de polysaccharides

sur le radical superoxyde anion à toutes les concentrations testées. Il a été clairement observé

que cet effet de balayage augmente avec façon dépendante de la concentration. Par rapport à

l'acide ascorbique (utilisé comme étalon) cet effet est plus faible pour les polysaccharides

quelle que soit la concentration testée. L’effet de balayage polysaccharides et d'acide

ascorbique à la faible concentration de 0,5 mg/mL élimine 9 % et 93 % respectivement. En

revanche, pour une concentration élevée de 10 mg/mL, l'effet de piégeage est de 32% et 98%

de polysaccharides et d'acide ascorbique, respectivement.

Par conséquent, dans cette expérimentation, il n'a pas été possible d'estimer la CE50 de

polysaccharides des cladodes de C. triangularis anti- radical superoxyde anion pour tous les

concentrations polysaccharides testées, l'effet anti-radicalaire est inférieure à 50 %. Par

comparaison avec d'autres polysaccharides extraits de Cactus, les cladodes de C. triangularis

ne pourraient pas alors être considérés comme mieux antiradical superoxyde anion car par

exemple, dans le cas des polysaccharides extraits à partir de fruits d'Opuntia ficus indica

pelées il a été évalué une EC50 de l'ordre de 0,7 g/L (Zhong et al., 2010).

29

0

1020304050

60708090

100

0 2 4 6 8 10

Scav

engi

ng e

ffect

%

Concentration (g/L)


4.4. Pouvoir réducteur

En règle générale, afin d'évaluer la capacité d'antioxydant naturel il faut faire un don

d'électrons, un test de pouvoir réducteur pu être effectué (Dorman et al., 2003). Selon le mode

opératoire décrit par Yan et al., (2005), en raison de son pouvoir réducteur, une molécule anti-

oxydant permet la réduction de l'ion Fe3+ (à partir de ferricyanure de potassium) à l'ion Fe2+.

Par conséquent, en ajoutant FeCl3 dans le mélange, un complexe de couleur bleue spécifique a

été produit. Par conséquent, le pouvoir réducteur du composé naturel peut être estimé par la

mesure de la formation du complexe à 700 nm et ensuite une réduction de puissance plus

élevée est corrélée à une absorbance élevée à 700 nm. Dans le présent article, nous avons

évalué le pouvoir réducteur de polysaccharides extraits des cladodes de Cereus triangularis.

0

0.25

0.5

0 2 4 6 8 10

Abso

rban

ce (7

00 n

m)

Concentration (g/L)

Figure10D : Evolution du pouvoir réducteur des fractions : (--) : Polysaccharide

Cereus triangularis; (--) : Vitamine C

Comme représenté sur la Figure10D; l'absorbance à 700 nm de la solution de

polysaccharides a augmenté en augmentant la concentration. Cependant, en comparaison avec

l'acide ascorbique (utilisé comme témoin), le pouvoir réducteur de polysaccharides est très

faible. En fait, à la même concentration élevée (10g /L), l'absorbance de l'acide ascorbique et

les polysaccharides sont de 0,39 et 0,05 respectivement.

30

CONCLUSION GENERALEET

PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspective

5. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Un arabinogalactane de haut poids moléculaire avec un rapport Ara / Gal de 0,39 a été

extrait des cladodes de Cereus triangularis récoltées au Nord de Madagascar. Les analyses

RMN a montré que la structure de cet arabinogalactane pourrait être constituée d'une chaîne

principale de (41) -D-galactopyranosyle où certaines unités peuvent être ramifiés en

position 3 avec les résidus L-arabinofuranosyle. Nos résultats indiquent que cette forme de

mucilage de cladodes de Cereus triangularis a des activités antioxydants. Par conséquent, on

peut conclure que cette famille d'arabinogalactane pourrait être utilisée en tant que nouvelles

sources d'agents anti-oxydants naturels pour les industries alimentaires et pharmaceutiques.

Dans l’avenir, il pourrait être envisagé d’étudier le comportement rhéologique de

polysaccharides. Remarque à mentionner que les travaux sont en cours pour étudier activités

biologiques tels que antibactérienne, antivirale, et antipaludique de Cereus triangularis

polysaccharides arabinogalactanes.

31

REFERENCES

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Documents

· Web viewEn outre, les rapports de monosaccharides ont été fortement influencées non seulement par les procédés d'extraction, mais aussi par l'irrigation, la pluie, la température,