AGENDA
• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE
• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:
• II / techniques cytochimique
l’échantillon : fixation, inclusion, coupe, étalement, coloration. Congélation
Histochimie, immuno-histochimie, histo-enzymologie,
autohistoradiographie,
Revue
Introduction :
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
Avec le développement du microscope électronique au début des années 1940 et les techniques
associées de conservation et de coloration des cellules, la complexité interne de la cellule commença
à apparaître dans toute son ampleur.
Ainsi, l’avancement de nos connaissances sur la cellule au cours du 20e siècle est dû à 2 causes
principales :
•l’augmentation du pouvoir de résolution des appareils d’analyse, essentiellement ceux de la
microscopie électronique et de la diffraction des rayon X ;
•la convergence de la cytologie avec d’autres domaines de la recherche biologique, et plus
particulièrement la génétique, la physiologie et la biochimie.
introduction
La cytochimie, la cytoenzymologie, l’immunocytochimie, l’immunofluorescence (directe ou
indirecte), la microscopie confocale, la cytofluorimétrie complètent les données de la
morphologie.
L’utilisation de traceurs radioactifs que l’on suit dans l’espace et dans le temps
(autoradiographie) permet de compenser le caractère statique des documents
ultrastructuraux.
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
La cytochimie, autre branche récente de la biologie cellulaire, est née de la convergence des méthodes
et des disciplines consacrées à l’analyse chimique et physico-chimique de la matière vivante
Defintion :
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
I. Non-spécifiques:
II. spécifiques:
Utilisation de réactions chimiques qui vont permettre la mise en évidence de molécules particulières
dans la cellule.
détectent un ensemble de molécules aux propriétés chimiques communese.g.: ADN nucléaire
détectent une molécule particulière e.g.: tubuline
Technique cytologique/ histologiques
Pour une observation au microscope photonique, l’échantillon doit être de faible épaisseur
(2 à 10 m) afin de permettre le passage de la lumière.
Ainsi, lorsque le matériel biologique est massif (tissus animaux ou végétaux : foie, cerveau,
muscle, etc. ou tige, feuille, etc.), il faut préalablement le débiter en tranches fines et
régulières, que l’on appelle coupes histologiques
De plus, les cellules vivantes non pigmentées ne sont pas clairement visibles au microscope
à fond claire à cause de la faible différence de contraste entre les cellules et l’eau.
D’où la nécessité d’utiliser des colorants spécifiques pour une observation correcte
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L’optique/ principe
Structure du microscope optique
Laser
Lampe UV
…
Absorbants
Diffusants
Dépolarisants
Fluorescents
…
Objectifs
Lentilles
…
Caméras
Photodiodes
…
Cours de Cytologie
Techniques de préparation des échantillons
Différents type de microscope optique: Une comparaison
Type de microscope Type de microscope
Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,
Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction
Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées
Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,
Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules
Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.
Définitions:
Colorant: produit susceptible de teindre une ou plusieurs strucutres de façon durable.
Colorations structurales: elles mettent en évidence les composants de certaines structures
tissulaires indépendamment du tissu lui-même:
fibres élastiques,
phloème lignifié,
structures kératinisées, chitinisées, etc…
Colorations vitales: Coloration s'opérant sur des tissus qui resteront
vivants durant l'étude. (opposées aux colorations non-vitales).
Coloration létale : la plupart des colorants agissent sur des cellules
mortes, tout simplement parce qu’ils nécessitent une fixation préalable.
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Définitions:
Colorations histologiques: ce sont celles qui différencient finement tous les éléments d'un
tissu.
Cette coloration devient histochimique si elle est spécifique de tel ou tel composé défini.
Colorations cytologiques: ce sont celles qui permettent d'analyser les détails internes des
cellules.
De telles colorations peuvent être cytochimiques si elles mettent en évidence des fonctions
chimiques déterminées.
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Méthodes cytochimiques
Méthodes cytochimiques
2 TYPES DE MÉTHODES:
Utilisation de réactions chimiques permettant de mettre en évidence des molécules particulières
dans la cellule
Méthodes non spécifiques
Méthodes spécifiques
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Méthodes non spécifiques
Méthodes permettant de détecter un ensemble de molécules ayant certaines propriétés
chimiques communes.
Ex: ADN, sucres, protéines, lipides,…
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Principe: transformation d’un composé soluble et incolore en un composé insoluble et coloré en présence
d’une activité enzymatique particulière (phosphatases, estérases, oxydases..)
Détection cytochimique de la phosphatase alcaline dans un
granulocyte neutrophile par la méthode du naphthol/diazonium
Méthodes non spécifiques
Méthode Acide Periodique-Schiff (APS)
Détection et localisation des polysaccharides
L’acide périodique est un oxydant qui scinde les liaisons 1–2 glycol et amino alcool des glucides et des glycoprotéines
et forme des poly-aldéhydes.
Ces aldéhydes sont ensuite combinées au réactif de Schiff (fuchsine acide) qui donne une couleur rouge pourpre aux
structures contenant les aldéhydes.
L’hématoxyline peut être ensuite utilisée pour colorer en bleu les noyaux des cellules.
PRINCIPE :
Tests cytochimiques des polysaccharides
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Méthodes non spécifiques
Détection et localisation de l’ADN
Test de Feulgen
le réactif de Schiff (fuchsine décolorée par oxydation) se recolore en rouge en présence de
composés réducteurs.
PRINCIPE :
Dans tous les cas, seuls la chromatine des noyaux interphasiques et le chromosome des cellules en division sont colorés spécifiquement en rouge.
Coupe longitudinale de racine de pois ►
Montage de queue de triton en régénération.▼
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Méthodes non spécifiques
Incorporation de précurseurs radioactifs
Incorporation de précurseurs radioactifs au moment de la synthèse des macromolécules
Leucine radioactive: détection et localisation de protéines en synthèse
Thymidine radioactive: détection et localisation d’ADN répliqué
Uridine radioactive: détection et localisation d’ARN en synthèse
Mannose ou fructose radioactifs: détection et localisation de molécules glycosylées
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Méthodes de localisation des macromolécules
dans la cellule et le tissu
Méthodes spécifiques
Méthodes permettant de détecter une molécule particulière
3 exemples de méthodes:
Immunohistochimie (IHC)
Histoenzymologie
Hybridation in situ (HIS)
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Hybridation in situ (HIS)
Mise en évidence sur des coupes tissulaires (en congélation ou après inclusion dans la paraffine) ou sur
des étalements cellulaires, de séquences d'ARN ou d'ADN
grâce à des sondes d'acides nucléiques complémentaires et couplées à un traceur radioactif (sondes
chaudes) ou à une enzyme (sondes froides) ou un fluorochrome (sondes fluorescentes).
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Section de cerveau de souris : ►
Les points noirs indiquent l’expression d’un gène
dans des régions spécifiques
Hybridation in situ (HIS)
L'hybridation in situ classique a relativement peu d'indications car un grand nombre de copies de
l'acide nucléique doit être présent dans la cellule pour qu'une réaction positive soit obtenue.
Elle peut être utilisée pour mettre en évidence des acides nucléiques viraux (HPV, EBV) ou des ARN de
chaînes légères d'immunoglobulines.
Le terme in situ indique que la détection s'effectue au sein du chromosome en configuration native, à
la différence des techniques d'étude d'acides nucléiques extraits sur gels.
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Hybridation in situ (HIS)
Appliquées sur des coupes de tissus puis visualisées par:
- adioautographie grâce aux nucléotides radioactifs incorporés dans la sonde
- immunohistochimie grâce à la présence de nucléotides couplés à la digoxigénine incorporés à la sonde,
alors détectée par un anticorps spécifique couplé à un marqueur (enzyme ou fluorochrome)
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HIS ARNm OT/ IHC peptide VP ►
Hybridation in situ (HIS)
L'hybridation in situ fluorescente (FISH) peut se faire sur des suspensions cellulaires, des empreintes ou des coupes congelées ou
déparaffinées, et permet d’identifier dans chaque cellules la présence et le nombre de copies d’un segment chromosomique donné et en
utilisant des fluorochromes différents d’apprécier une éventuelle co-localisation.
Elle est de plus en plus utilisée pour rechercher des anomalies variées chromosomiques (polysomies, monosomies) ou géniques (délétions
ou amplifications de certains gènes ; translocations), anomalies qui peuvent avoir dans certaines tumeurs une valeur diagnostique ou
pronostique.
Cette technique est un outil diagnostique de maniement encore difficile et onéreux.
Elle est actuellement plus sensible que celle utilisant des techniques chromogéniques (CISH
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Hybridation in situ
fluorescente (FISH)
Cytogénétique moléculaire
Intérêt de la technique FISH
•On a recours à la FISH pour identifier des anomalies chromosomiques et d'autres changements
génétiques qui se produisent dans les cellules par le biais de sondes d'ADN spéciales marquées de
colorants fluorescents.
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Hybridation in situ
fluorescente (FISH)
Cytogénétique moléculaire
•Cette méthode permet au pathologiste :
• d'obtenir des résultats similaires à ceux du caryotypage mais avec plus de
précision
• d'observer des copies additionnelles d'oncogènes qui peuvent se développer
dans certains types de cancer (l'oncogène HER2 par exemple)
HER2 et cancer du sein : le principe
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la cancérogenèse du cancer du sein a
permis de déterminer des cibles thérapeutiques potentielles.
L'une de ces cibles est l'oncoprotéine HER2.
Il s'agit d'un récepteur membranaire appartenant à la famille des facteurs de croissance épidermique
de type tyrosine kinase.
Le gène qui pour cette protéine est amplifié dans 20 à 30 % des cancers du sein.
Cette amplification qui conduit à une surexpression de la protéine HER2
est associée à un pronostic clinique défavorable pour la patiente
HER2 et cancer du sein : le test
FISH (Fluorescent In Situ Hybridation):
Le principe du test FISH (Abbott, Vysis) est celui d'une hybridation de l'ADN du patient avec une
sonde ADN fluorescente reconnaissant le gène HER2 et une deuxième sonde ADN
• reconnaissant le centromère du chromosome 17 (le gène HER2 est situé sur le chromosome
17q21 q22).
• L'énumération des signaux émis par les 2 sondes (HER2 et centromère 17) s'effectue en
examinant les noyaux de la tumeur au microscope et permet d'obtenir un ratio du nombre de
copies du gène HER2 par rapport à celui du chromosome 17.
• Un ratio supérieur à 2 est considéré comme positif
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Immunohistochimie (IHC)
Elle consiste à mettre en évidence divers antigènes (Ag) cellulaires ou extra-cellulaires
grâce à des anticorps (Ac) spécifiquement dirigés contre eux, sur des préparations
cytologiques (immunocytochimie) ou sur des des coupes de tissus congelés ou fixés et
inclus en paraffine.
Les Ag recherchés peuvent être des Ag membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires ou des
protéines de la matrice extra-cellulaire.
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Immunohistochimie (IHC)
Les techniques directes utilisent des anticorps couplés à la fluorescéine et sont employées
surtout sur tissus congelés, pour le recherche de dépôts extra cellulaires.
Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l'Ac spécifique primaire est déposé
sur le tissu, puis il est révélé par un 2ème Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son
substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des
complexes Ag-Ac.
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Système
Révélateur
Les marquages en immunofluorescence
Coupe semi-fine
Antigène
Anticorps secondaire
Anticorps primaire
Echantillon
fluorochromeTraceur
Epitope
Détection et localisation d’une molécule dans un tissu ou dans une cellule grâce à des anticorps spécifiques.
Observation du complexe immun antigène-anticorps en microscopie optique, à fluorescence ou électronique
Rappels sur les anticorps
Une molécule d’anticorps présente 4 chaînes polypeptidiques
• 2 chaînes légères identiques;
• 2 chaînes lourdes identiques;
•Le déterminant antigénique se fixe au site de liaison de l’anticorps grâce à des liaisons faibles, non covalentes.
•La chaîne légère et la chaîne lourde de l’anticorps participent au site de liaison de l’anticorps.
Rappels sur les anticorps
Rappels sur les anticorps
Préparation des échantillons
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3 étapes
Immunohistochimie (IHC)
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Immunoréaction directe Immunoréaction indirecte
Possibilité d’amplifier le signal:Exemple: Peroxydase anti-peroxydase (PAP)
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Immunohistochimie (IHC)
Intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence d'antigènes de différenciation cellulaire; mise en évidence de certains agents infectieux
Intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, ou de produits d'oncogènes
Intérêt thérapeutique : afin de déterminer le statut potentiellement hormono-sensible des cancers du sein, la mise en évidence par immunohistochimie des récepteurs nucléaires aux oestrogènes et à la progestérone a supplanté le dosage biochimique de ces récepteurs dans ces tumeurs.
L'immunohistochimie est très largement utilisée dans une majorité de laboratoires
d'anatomie pathologique avec de multiples indications parmi lesquelles :
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Immunohistochimie (IHC)
hépatite virale B : Immuno-fluorescence utilisant un anticorps anti-HBs marqué à la fluorescéine :
les hépatocytes contenant l'antigène HBs en excès ont un cytoplasme vert positif
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Immunohistochimie (IHC)
Immunofluorescence sur une biopsie rénale congelée
L’immunofluorescence directe est surtout utilisée pour mettre en évidence les dépôts
tissulaires d’immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et dans les
biopsies rénales congelées, observées grâce à un microscope à fluorescence
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Immunohistochimie (IHC)
Mise en évidence immunohistochimique de l’insuline dans un îlot de
Langerhans (technique d’immunoperoxydase sur tissu pancréatique
fixé et déparaffiné)
Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l’Ac spécifique primaire est déposé
sur le tissu, puis il est révélé par un 2e Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son
substrat.
Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-
Ac
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Intérêt à visé médicale
L’immunohistochimie est très largement utilisée avec de multiples indications parmi lesquelles :
• intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence
d’antigènes de différenciation cellulaire, mise en évidence de certains agents infectieux ;
• intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire,
ou de produits d’oncogènes ;
• intérêt thérapeutique : mise en évidence de cibles thérapeutiques, telles que les récepteurs
nucléaires aux estrogènes et la protéine Her2 dans les cancers du sein
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◄ HIS radioactive- microscopie électronique
Double IHC fluo ►
Histoenzymologie
Certains enzymes peuvent être mis en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion
dans la paraffine.
La coupe est incubée dans un substrat spécifique de l'activité enzymatique recherchée.
La réaction libère un produit coloré ou colorable qui peut être visualisé au microscope optique.
L'application la plus courante est l'étude des biopsies musculaires pour myopathies.
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
A l’issue de la réaction enzymatique, le produit obtenu forme un précipité coloré visible au
microscope photonique et/ou électronique à tranmission.
Histoenzymologie Exemple: Infarctus du myocarde
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
• L'histoenzymologie révèle précocement les lésions d'infarctus et rend possible une étude
topographique des altérations tissulaires.
• La succinyl-déshydrogénase enzyme du cycle de KREBS de siège mitochondrialdisparaît
progressivement de la zone ischémique.
l'activité succino-deshydrogénase est mise en évidence par incubation des coupes fixées pendant 30
minutes à 37° C à pH 7,40 dans la solution suivante :
-Nitrobleu de Tétrazolium (chromogène)
-Succinate de Sodium (substrat)
-Tampon TRIS 0,1 M
Histoenzymologie Exemple: Infarctus du myocarde
Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE
L'activité succino-déshydrogénase se traduit par la transformation du
substrat fourni en excès (succinate de sodium) en fumarate, et le transfert
des hydrogènes vers le nitrobleu de tétrazolium qui vire du jaune d'or au
bleu et devient insoluble dans les zones saines.
L'infarctus se traduit par l'absence d'activité enzymatique