AGENDA - cours, examens · introduction La cytochimie, la cytoenzymologie, l’immunocytochimie,l’immunofluorescence(directe ou indirecte), la microscopie confocale, la cytofluorimétrie

AGENDA

• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:

• II / techniques cytochimique

l’échantillon : fixation, inclusion, coupe, étalement, coloration. Congélation

Histochimie, immuno-histochimie, histo-enzymologie,

autohistoradiographie,

Revue

Introduction :

Cours de CytologieMETHODES CYTOCHIMIQUE

Avec le développement du microscope électronique au début des années 1940 et les techniques

associées de conservation et de coloration des cellules, la complexité interne de la cellule commença

à apparaître dans toute son ampleur.

Ainsi, l’avancement de nos connaissances sur la cellule au cours du 20e siècle est dû à 2 causes

principales :

•l’augmentation du pouvoir de résolution des appareils d’analyse, essentiellement ceux de la

microscopie électronique et de la diffraction des rayon X ;

•la convergence de la cytologie avec d’autres domaines de la recherche biologique, et plus

particulièrement la génétique, la physiologie et la biochimie.

introduction

La cytochimie, la cytoenzymologie, l’immunocytochimie, l’immunofluorescence (directe ou

indirecte), la microscopie confocale, la cytofluorimétrie complètent les données de la

morphologie.

L’utilisation de traceurs radioactifs que l’on suit dans l’espace et dans le temps

(autoradiographie) permet de compenser le caractère statique des documents

ultrastructuraux.


La cytochimie, autre branche récente de la biologie cellulaire, est née de la convergence des méthodes

et des disciplines consacrées à l’analyse chimique et physico-chimique de la matière vivante

Defintion :


I. Non-spécifiques:

II. spécifiques:

Utilisation de réactions chimiques qui vont permettre la mise en évidence de molécules particulières

dans la cellule.

détectent un ensemble de molécules aux propriétés chimiques communese.g.: ADN nucléaire

détectent une molécule particulière e.g.: tubuline

Technique cytologique/ histologiques

Pour une observation au microscope photonique, l’échantillon doit être de faible épaisseur

(2 à 10 m) afin de permettre le passage de la lumière.

Ainsi, lorsque le matériel biologique est massif (tissus animaux ou végétaux : foie, cerveau,

muscle, etc. ou tige, feuille, etc.), il faut préalablement le débiter en tranches fines et

régulières, que l’on appelle coupes histologiques

De plus, les cellules vivantes non pigmentées ne sont pas clairement visibles au microscope

à fond claire à cause de la faible différence de contraste entre les cellules et l’eau.

D’où la nécessité d’utiliser des colorants spécifiques pour une observation correcte


L’optique/ principe

Structure du microscope optique

Laser

Lampe UV

…

Absorbants

Diffusants

Dépolarisants

Fluorescents

…

Objectifs

Lentilles

…

Caméras

Photodiodes

…

Cours de Cytologie

Techniques de préparation des échantillons

Différents type de microscope optique: Une comparaison

Type de microscope Type de microscope

Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,

Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction

Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées

Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,

Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules

Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.

Définitions:

Colorant: produit susceptible de teindre une ou plusieurs strucutres de façon durable.

Colorations structurales: elles mettent en évidence les composants de certaines structures

tissulaires indépendamment du tissu lui-même:

fibres élastiques,

phloème lignifié,

structures kératinisées, chitinisées, etc…

Colorations vitales: Coloration s'opérant sur des tissus qui resteront

vivants durant l'étude. (opposées aux colorations non-vitales).

Coloration létale : la plupart des colorants agissent sur des cellules

mortes, tout simplement parce qu’ils nécessitent une fixation préalable.


Définitions:

Colorations histologiques: ce sont celles qui différencient finement tous les éléments d'un

tissu.

Cette coloration devient histochimique si elle est spécifique de tel ou tel composé défini.

Colorations cytologiques: ce sont celles qui permettent d'analyser les détails internes des

cellules.

De telles colorations peuvent être cytochimiques si elles mettent en évidence des fonctions

chimiques déterminées.


Méthodes cytochimiques

Méthodes cytochimiques

2 TYPES DE MÉTHODES:

Utilisation de réactions chimiques permettant de mettre en évidence des molécules particulières

dans la cellule

Méthodes non spécifiques

Méthodes spécifiques



Méthodes permettant de détecter un ensemble de molécules ayant certaines propriétés

chimiques communes.

Ex: ADN, sucres, protéines, lipides,…


Principe: transformation d’un composé soluble et incolore en un composé insoluble et coloré en présence

d’une activité enzymatique particulière (phosphatases, estérases, oxydases..)

Détection cytochimique de la phosphatase alcaline dans un

granulocyte neutrophile par la méthode du naphthol/diazonium


Méthode Acide Periodique-Schiff (APS)

Détection et localisation des polysaccharides

L’acide périodique est un oxydant qui scinde les liaisons 1–2 glycol et amino alcool des glucides et des glycoprotéines

et forme des poly-aldéhydes.

Ces aldéhydes sont ensuite combinées au réactif de Schiff (fuchsine acide) qui donne une couleur rouge pourpre aux

structures contenant les aldéhydes.

L’hématoxyline peut être ensuite utilisée pour colorer en bleu les noyaux des cellules.

PRINCIPE :

Tests cytochimiques des polysaccharides



Détection et localisation de l’ADN

Test de Feulgen

le réactif de Schiff (fuchsine décolorée par oxydation) se recolore en rouge en présence de

composés réducteurs.

PRINCIPE :

Dans tous les cas, seuls la chromatine des noyaux interphasiques et le chromosome des cellules en division sont colorés spécifiquement en rouge.

Coupe longitudinale de racine de pois ►

Montage de queue de triton en régénération.▼



Incorporation de précurseurs radioactifs

Incorporation de précurseurs radioactifs au moment de la synthèse des macromolécules

Leucine radioactive: détection et localisation de protéines en synthèse

Thymidine radioactive: détection et localisation d’ADN répliqué

Uridine radioactive: détection et localisation d’ARN en synthèse

Mannose ou fructose radioactifs: détection et localisation de molécules glycosylées


Méthodes de localisation des macromolécules

dans la cellule et le tissu

Méthodes spécifiques

Méthodes permettant de détecter une molécule particulière

3 exemples de méthodes:

Immunohistochimie (IHC)

Histoenzymologie

Hybridation in situ (HIS)



Mise en évidence sur des coupes tissulaires (en congélation ou après inclusion dans la paraffine) ou sur

des étalements cellulaires, de séquences d'ARN ou d'ADN

grâce à des sondes d'acides nucléiques complémentaires et couplées à un traceur radioactif (sondes

chaudes) ou à une enzyme (sondes froides) ou un fluorochrome (sondes fluorescentes).


Section de cerveau de souris : ►

Les points noirs indiquent l’expression d’un gène

dans des régions spécifiques


L'hybridation in situ classique a relativement peu d'indications car un grand nombre de copies de

l'acide nucléique doit être présent dans la cellule pour qu'une réaction positive soit obtenue.

Elle peut être utilisée pour mettre en évidence des acides nucléiques viraux (HPV, EBV) ou des ARN de

chaînes légères d'immunoglobulines.

Le terme in situ indique que la détection s'effectue au sein du chromosome en configuration native, à

la différence des techniques d'étude d'acides nucléiques extraits sur gels.



Appliquées sur des coupes de tissus puis visualisées par:

- adioautographie grâce aux nucléotides radioactifs incorporés dans la sonde

- immunohistochimie grâce à la présence de nucléotides couplés à la digoxigénine incorporés à la sonde,

alors détectée par un anticorps spécifique couplé à un marqueur (enzyme ou fluorochrome)


HIS ARNm OT/ IHC peptide VP ►


L'hybridation in situ fluorescente (FISH) peut se faire sur des suspensions cellulaires, des empreintes ou des coupes congelées ou

déparaffinées, et permet d’identifier dans chaque cellules la présence et le nombre de copies d’un segment chromosomique donné et en

utilisant des fluorochromes différents d’apprécier une éventuelle co-localisation.

Elle est de plus en plus utilisée pour rechercher des anomalies variées chromosomiques (polysomies, monosomies) ou géniques (délétions

ou amplifications de certains gènes ; translocations), anomalies qui peuvent avoir dans certaines tumeurs une valeur diagnostique ou

pronostique.

Cette technique est un outil diagnostique de maniement encore difficile et onéreux.

Elle est actuellement plus sensible que celle utilisant des techniques chromogéniques (CISH


Hybridation in situ

fluorescente (FISH)

Cytogénétique moléculaire

Intérêt de la technique FISH

•On a recours à la FISH pour identifier des anomalies chromosomiques et d'autres changements

génétiques qui se produisent dans les cellules par le biais de sondes d'ADN spéciales marquées de

colorants fluorescents.


Hybridation in situ

fluorescente (FISH)

Cytogénétique moléculaire

•Cette méthode permet au pathologiste :

• d'obtenir des résultats similaires à ceux du caryotypage mais avec plus de

précision

• d'observer des copies additionnelles d'oncogènes qui peuvent se développer

dans certains types de cancer (l'oncogène HER2 par exemple)

HER2 et cancer du sein : le principe


Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la cancérogenèse du cancer du sein a

permis de déterminer des cibles thérapeutiques potentielles.

L'une de ces cibles est l'oncoprotéine HER2.

Il s'agit d'un récepteur membranaire appartenant à la famille des facteurs de croissance épidermique

de type tyrosine kinase.

Le gène qui pour cette protéine est amplifié dans 20 à 30 % des cancers du sein.

Cette amplification qui conduit à une surexpression de la protéine HER2

est associée à un pronostic clinique défavorable pour la patiente

HER2 et cancer du sein : le test

FISH (Fluorescent In Situ Hybridation):

Le principe du test FISH (Abbott, Vysis) est celui d'une hybridation de l'ADN du patient avec une

sonde ADN fluorescente reconnaissant le gène HER2 et une deuxième sonde ADN

• reconnaissant le centromère du chromosome 17 (le gène HER2 est situé sur le chromosome

17q21 q22).

• L'énumération des signaux émis par les 2 sondes (HER2 et centromère 17) s'effectue en

examinant les noyaux de la tumeur au microscope et permet d'obtenir un ratio du nombre de

copies du gène HER2 par rapport à celui du chromosome 17.

• Un ratio supérieur à 2 est considéré comme positif



Elle consiste à mettre en évidence divers antigènes (Ag) cellulaires ou extra-cellulaires

grâce à des anticorps (Ac) spécifiquement dirigés contre eux, sur des préparations

cytologiques (immunocytochimie) ou sur des des coupes de tissus congelés ou fixés et

inclus en paraffine.

Les Ag recherchés peuvent être des Ag membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires ou des

protéines de la matrice extra-cellulaire.



Les techniques directes utilisent des anticorps couplés à la fluorescéine et sont employées

surtout sur tissus congelés, pour le recherche de dépôts extra cellulaires.

Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l'Ac spécifique primaire est déposé

sur le tissu, puis il est révélé par un 2ème Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son

substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des

complexes Ag-Ac.


Système

Révélateur

Les marquages en immunofluorescence

Coupe semi-fine

Antigène

Anticorps secondaire

Anticorps primaire

Echantillon

fluorochromeTraceur

Epitope

Détection et localisation d’une molécule dans un tissu ou dans une cellule grâce à des anticorps spécifiques.

Observation du complexe immun antigène-anticorps en microscopie optique, à fluorescence ou électronique

Rappels sur les anticorps

Une molécule d’anticorps présente 4 chaînes polypeptidiques

• 2 chaînes légères identiques;

• 2 chaînes lourdes identiques;

•Le déterminant antigénique se fixe au site de liaison de l’anticorps grâce à des liaisons faibles, non covalentes.

•La chaîne légère et la chaîne lourde de l’anticorps participent au site de liaison de l’anticorps.



Préparation des échantillons


3 étapes



Immunoréaction directe Immunoréaction indirecte

Possibilité d’amplifier le signal:Exemple: Peroxydase anti-peroxydase (PAP)



Intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence d'antigènes de différenciation cellulaire; mise en évidence de certains agents infectieux

Intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, ou de produits d'oncogènes

Intérêt thérapeutique : afin de déterminer le statut potentiellement hormono-sensible des cancers du sein, la mise en évidence par immunohistochimie des récepteurs nucléaires aux oestrogènes et à la progestérone a supplanté le dosage biochimique de ces récepteurs dans ces tumeurs.

L'immunohistochimie est très largement utilisée dans une majorité de laboratoires

d'anatomie pathologique avec de multiples indications parmi lesquelles :



hépatite virale B : Immuno-fluorescence utilisant un anticorps anti-HBs marqué à la fluorescéine :

les hépatocytes contenant l'antigène HBs en excès ont un cytoplasme vert positif



Immunofluorescence sur une biopsie rénale congelée

L’immunofluorescence directe est surtout utilisée pour mettre en évidence les dépôts

tissulaires d’immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et dans les

biopsies rénales congelées, observées grâce à un microscope à fluorescence



Mise en évidence immunohistochimique de l’insuline dans un îlot de

Langerhans (technique d’immunoperoxydase sur tissu pancréatique

fixé et déparaffiné)

Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l’Ac spécifique primaire est déposé

sur le tissu, puis il est révélé par un 2e Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son

substrat.

Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-

Ac


Intérêt à visé médicale

L’immunohistochimie est très largement utilisée avec de multiples indications parmi lesquelles :

• intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence

d’antigènes de différenciation cellulaire, mise en évidence de certains agents infectieux ;

• intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire,

ou de produits d’oncogènes ;

• intérêt thérapeutique : mise en évidence de cibles thérapeutiques, telles que les récepteurs

nucléaires aux estrogènes et la protéine Her2 dans les cancers du sein


◄ HIS radioactive- microscopie électronique

Double IHC fluo ►

Histoenzymologie

Certains enzymes peuvent être mis en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion

dans la paraffine.

La coupe est incubée dans un substrat spécifique de l'activité enzymatique recherchée.

La réaction libère un produit coloré ou colorable qui peut être visualisé au microscope optique.

L'application la plus courante est l'étude des biopsies musculaires pour myopathies.


A l’issue de la réaction enzymatique, le produit obtenu forme un précipité coloré visible au

microscope photonique et/ou électronique à tranmission.

Histoenzymologie Exemple: Infarctus du myocarde


• L'histoenzymologie révèle précocement les lésions d'infarctus et rend possible une étude

topographique des altérations tissulaires.

• La succinyl-déshydrogénase enzyme du cycle de KREBS de siège mitochondrialdisparaît

progressivement de la zone ischémique.

l'activité succino-deshydrogénase est mise en évidence par incubation des coupes fixées pendant 30

minutes à 37° C à pH 7,40 dans la solution suivante :

-Nitrobleu de Tétrazolium (chromogène)

-Succinate de Sodium (substrat)

-Tampon TRIS 0,1 M

Histoenzymologie Exemple: Infarctus du myocarde


L'activité succino-déshydrogénase se traduit par la transformation du

substrat fourni en excès (succinate de sodium) en fumarate, et le transfert

des hydrogènes vers le nitrobleu de tétrazolium qui vire du jaune d'or au

bleu et devient insoluble dans les zones saines.

L'infarctus se traduit par l'absence d'activité enzymatique

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