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P 1
? 9
3 . .
I
0Ad -Z 1
'Nombre: C u i l l e r m o P l u l l i e r t C a r l i n .
Mat r i cu l a : 802221 15.
C a r r e r a : B i o l o g i a . &. /Area d e con c en t r a c i Ó n : B i o 1 og 1 a exp e r i men t a 1.
T r i m e s t r e : Décimo, 83-0.
H o r a s se-mana: 20. I
L u g a r donde se l l e v ó a cabo: D e p a r t a m e n t o de B i o q u i m i c a d e l a I
f a c u l t a d de M e d i c i n a de l a U n i v e r s i d a d N a c i o n a l Autónoma d e MCxico.
Fecha de i n i c i o : 31 de e n e r o d e 1983.
/ F e c h a de t e r m i n a c i ó n : 28 de o c t u b r e d e 1 9 8 3
i / N o m b r e d e l t u t o r , p u e s t o y a d s c r i p c i 6 n : D r . M a r i o C a l c a g n o M.,
p r o f e s o r de t i e m p o completo, t i t u l a r "A"; c o o r d i n a d o r d e I n v e s t i
I
I \
i 1
g a c i 6 n .
/ T í t u l o : Mecanismo c i n é t i c o d e l a G l u c o s a m i n a 6 - f o s f a t o i s o m e r a s a
(desaminasa) d e E s c h e r i c h i a c o l i .
.
,
-. P r o y e c t o f i n a l d e S e r v i c i o S o c i a l
q u e p r e s e n t a G u i l l e r m o M u l l i e r t C a r l i n .
Introducción.
En e l catabolismo de los aminoazúcares interviene l a glucosanina-
6-P isomerasa ~desaminasa~,~2-amino-2-desoxi-D-glucosa-6-fosfato c g
t o 1 isomerasa (desaminante) E.C.5.3.1.10.) (1);que se abreviará en
adelante como GlcNHZ6P isomerasa. Esta enzima cataliza l a reacción
reversible-que forma glucosamina-6P (GlcNH26P), a partir de fructosa
6-P .(Fru6P> y NH3.
<Fru6P)= 0.18 mM a 30 O C y pH 7.7, considerando l a concentración
del agua igual a l a unidad) (21, puede tener una función biosintéti
ca. La formación de aminoazúcares en microorganismos y animales se
realiza principalmente por l a transaminación entre l a glutamina .y
l a Fru6P ,catatizada por l a enzima glucosamina-6-P isomerasa forma-
deora de g1utaminaCE.C. 5.3.1.19.); pera, se mencionan en l a litera-
tura ta existencia de especies carentes de esta enzima, como dipte-
ros de los géneros Musca y Drosophila ( 3 , 4 ) y mutantes de E. coli
K ( 5 ) ; en los cuales l a formación de quitina o pared celular, res-
pectivamente, no manifiesta alteraciones. Esto hace de interés e l
estudio de l a reacción en e l sentido biosintético, (formación de
GLcNH26P a partir de Fru6P y NH3), aspecto a l cual se ha prestado
muy poca atención hasta e l momento.
Dado e l Carácter reversible de l a reacción (Keq=(GlcNH26P)/(NH3)
Se ha observado que esta enzima es regulada por N-acetil D-gluco - samina-6-P (GlcNAcóP, que l a activa (efecto K positivo) (6,7,8) y
por nucleótidos de adenina (AMP, ADP) que l a inhiben ( 9 1 , y mani-
fiesta una intensa cooperatividad homotrópica con respecto a ambos
sustratos arccares fosfato, no asi con respecto a l NH3(10). De a-
cuerdo a estas observaciones; se trata de un sistema alostérica re-
versible, funcional en ambos sentidos , l o que constituye un ejemplo único en e l metabolismo y adquiere especial interés desde e l punto
de vista regulatorio.
También si se considera l a reacciOn en si, se trata de una isome-
rización cetoaldólica que tiene lugar simultáneamente con una amina
ción-desaminación, (mecanismo de Amadori), Único ejemplo conocido
en biologia.
- .
3
.
Antecedent es.
En trabajos previos efectuados en e l laboratorio en e l cual se re alizard esta investigación (111, se ha demostrado l a existencia de un patr6n de velocidades iniciales en sentido biosintético de l a reac
ción, que corresponde a un mecanksmo secuencial, para e l cual se
pueden aplicar las siguientes ecuaciones de velocidad inicial y de
Ha 1 dane:
1
Vm(F)(N) VcKm F Km N
+(F) K m G+ (G) "b Km G Km F ; Keq- V-
Donde;
También se encontró un patrón de inhibición por'productos en e l
sentido catabólico (inhibición por Fru6P y Nil3), que puede d e s c r i birse mediante l a ecuación: 11
F=Fru6P, N=NH3, G=GlcNH26P, c=sentido catabólico,
b=sentido biosintético.
(NI (F)-(G)Keq 'b V- Vb(G>Keq Vb(G) (N)Keq
+ Km F + ( N I + K m N(FI + + (N)(F)
De acuerdo a estos resultados puede postularse un mecanismo de ti-
'cKm N
'bKm GKeq
'C v C
po secuencial ordenado, que se esquematiza de acuerdo a la notacion
de Cleland (12)
Los patrones de velocidades iniciales, en los cuales e l Km aparen- te para uno de los substratos biosintéticos (Fru6P o NH no depen-
de de l a concentración del otro,,nO puede interpretarse como un ar-
gumento a favor de un mecanismo de adición a l azar; ya que, esta su
posición s ó l o seria válida en condiciones de equilibrio rápido, pe-
ro no de estado estacionario ( 1 3 ) . En este último caso, e l patrón
3
-
particular observado, (con intersección de Las familias de rectas I
I en l a rama negativa del eje de Las abscisas), puede interpretarse
como una coincidencia fortuita de algunas Constantes del modelo c i
nético ( 1 1 ) . I - !
4
La confirmación del mecanismo que parece inferirse de estos res-
tados; requerirá de experimentos complementarios mediante e l USO de
inhibidores competitivos en ambos sentidos de l a reacción (14);expe
rimentos en equilibrio (apagamiento de fluorescencia por ligandos,
diálisis en equilibrio con sustrqtos marcados, etc.) y estudios c i -
nCticos con sustratos y productos alternativos.
m Objetivos.
1.- Purificación de l a enzima.
2.- Sintetizar los reactivos necesarios para e l estudio cinético,
que n o se puedan adquirir comercialmente.
3.- Estudios de l a inhibición por análogos estructurales de los
sustratos, en ambos sentidos de l a reacción (inhibidores competiti-
vos y sustratos alternativos).
4.- Estudios medinate procedimientos en equilibrio.
5.- Estudios complementarios.
Materiales y métodos.
La purificación de l a enzima s e llevó a cabo por un procedimiento
ya desarrollado en e l laboratorio (10). La sintesis de l a GlcNAc6P
se hizó de acuerdo a l procedimiento establecido por Leloir y Cardini
(6). La elaboración del 2-amino-2-desoxi glucitol-6-fosfato (GlcNHZ-
OH6P) fue a partir de l a GlcNH26P por reducción con KBH4 en una re-
lación de 1.5 moles por mol de Gl'cNH26P, en K2B407 20 mM pH 8.5 a
{temperatura ambiente. La mezcla s e ajustó a pH 6 y se pasó por una
.columna de Douex 50 H (9x150 mm) y se eluyó con H C L 0.05 n. Las +
fracciones que dieron positiva la reacción con l a ninhidrina (15)
se reunieron y se liofilizaron.
Todos los estudios cinéticos fueron realizados a 30 O C en una mez - cia de reacci6n de 200 ut, en presencia de 0.85 mM de GlcNAC6P; pa-
ra los estudios de inhibición se usó como amortiguador Tris-HCL pH
7.7, y para los estudios de variación del Km en función del pH se
utilizó e l mismo amortiguador por arriba de pH 7.2, y PIPES por a-
bajo del mismo valor; en ambos sentidos de l a reacción se desenca-
denó por l a adición de l a enzima.
1
En e l sentido catabólico, poniendo diferentes concentraciones de
5
GlcNH26P se incubó por un tiempo fijo llevando l a reacción a su
termino por l a adición de 2 m l de HCl 10 N. Las concentraciones de
Fru6P se determinaron por e l método de Roe (16) como l o describen
Davis y Gander (171, leyendo l a absorbancia a 512 nm.
En e l sentido de formación de G”lcNH26P, las medidas de velocidad
s e hicieron determinando l a cantidad de producto formado a tiempo
fijo utilizando l a rección de Elson-Morgan (18) como lo describen
Levy y McAllan (191, conteniendo la mezcla de reacción diferentes
concentraciones de los sustratos, Fru6P y NH4Cl. La reacción se d e
tuvo calentando por un minuto en baño de agua a ebullición. l a can-
tidad de GlcNH26P formada fue corregida por blancos correspondientes
para l a presencia de GlcNAc6P. En ambos sentidos de l a reacción e l
avance se conservó por debajo del 5% de conversión. Los datos se procesaron de acuerdo a Johansen y Lumry (20) y en
los estudios de inhibición presentados en dobles reciprocas, para
los estudios de variación del Km presentados en una grefica de Km
vs pH; luego siguiendo el análisis propuesto por Dixon (I), en una gráfica de pKm vs pH.
La
La
term
Resultados.
purificación de l a enzima se encuentra resumida en l a tabla 1.
pureza de los reactivos sintetizados en e l laboratorio se de-
nó por cromatografia en capa-fina; dando para ambos compuestos
una sola mancha, corriendolos en e l sistema cromatografico adecuado
y revelandolos con e l método apropiado.
E l estudio de l a inhibición de l a reacción por e l GlcNH20H6P (fig.
1,2 y 3 ) resultó un patrón de inhibición competitiva Dara los 3 s u s -
tratos; obteniendose una K i de 1.7’ uM para l a reacción en sentido ca - tabólico, y para e l sentido biosi’ntético una Ki de 22.65 UN varian-
do Fru6P y una Ki de 2.2 uM variando NH4Cl.
Los estudios mediante procedimientos en equilibrio, apagamiento
de fluorescencia de l a enzima, no se pudieron realizar por que des - de m i llegada a l Departamento de Bioquimica a l a fecha no se ha re - parado e l fluorómetro del mismo.
I
L o s estudios complementarios realizados fueron los de variación
del Km en función d e l pH. En l a f i g u r a 4 se muestra e l efecto del
( g r u p o a m i n o ) y o t r o s i t i o p a r a l a u n i ó n d e l f o s f a t c ; 1 ? 1 G l c N H 2 0 H
6P, o c u p a r í a t o d o e l s i t i o a c t i v o . A l e s t a r o c u p a d o e l s i t i o a c t i v o
( e n e l s i t i o q u e a c e p t a e l g r u p o a m i n o ) n o p u e d e e n t r a r a l s i t i o
e l NH3 o NH4, p o r l o q u e s e e n t i e n d e f á c i l m e n t e l a i n h i b i c i ó n com-
p e t i t i v a p r e v i s t a p a r a e l NH C l . S i n e m b a r g o , s i e l i n h i b i d o r s e
p u e d e u n i r a l s i t i o a c t i v o s o l a m e n t e p o r e l f o s f a t o , e s t a r i a o c u p a n
d o e l s i t i o d e u n i ó n d e l a F r u ó P l o q u e e x p l i c a r i a L a i n h i b i c i ó n
c o m p e t i t i v a p a r a l a F r u ó P , s i n d e s c a r t a r e l m e c a n i s m 2 s e c u e n c i a 1 o r
d e n a d o p o s t u l a d o .
+
4 /I
E n e l K m m i n i m o p a r a embos a z ú c a r e s (pH d e 7 . 7 1 , e l K m p a r a e l
NH4CL n o e s e l ó p t i m o . E l Km m i n i m o p a r a N H 4 C l
s u s f o r m a s i ó n i c a s ) s e e n c u e n t r a más c e r c a n o a 7 ( f i g s . 6 , 7 y 8 ) .
C o m p a r a n d o e s t e v a l o r p a r a e l Km m í n i m o p a r a l a F r u 6 * ( e n q u e s u
r a n g o d e K m m i n i m o n o e s t a n e s t r e c h o como p a r a l a G L c N H 2 6 P ) s e
p u e d e s u p o n e r q u e p a r a e l s e n t i d o c a t a b ó l i c o d e l a r e a c c i ó n (como
e s u n i r r e a c t a n t e ) s u P H ó p t i m o s i e s e t PH ó p t i m o p a r a l a G L C N H - 6 P ; s i m e m b a r g o , e l p H ó p t i m o p a r a e l s e n t i d o b i o s i n t t t i c o ( q u e e s
b i r r e a c t a n t e ) h a y q u e c o n s i d e r a r ambos p H e s de l o s s ~ s t r a t o s , t e -
n i e n d o un pH ó p t i m o p a r a l a r e a c c i ó n e n e s t e s e n t i d o a l r e d e d o r d e
7-2 .
( e n c ~ l q u i e r a d e
2
E l c a m b i o d e p e n d i e n t e q u e p r e s e n t a n l a p a r t e a ) y l a p a r t e b )
d e l a f i g u r a 5 , e n t r e 8 . 2 y 8 . 4 s u g u i e r e q u e h a y u n 3 r u p o SH e n e l
s i t i o a c t i v o d e l a e n z i m a p a r a ambos a z ú c a r e s p o r l o s v a l o r e s d e
p K a s q u e p r e s e n t a D i x o n ( 1 ) . . +
E l h e c h o d e q u e p e r m a n e z c a c o n s t a n t e e l pKm p a r a e l NH4 ( f i g . 1 1 )
a p a r t i r d e 7 . 6 , y q u e e l pKm p a r a e l NH3 v a r i e e n e s e r a n g o d e pH
s u g u i e r e q u e e l s u s t r a t o e s e l p r i m e r o ; e s t a s u g e r a n c i a s e p u e d e
v e r t a m b i e n e n l a f i g u r a 7 , e n l a q u e , e n l a p a r t e m i s a l c a l i n a ;
m a y o r c o n c e n t r a c i 6 n d e NH e l K m i s e v a h a c i e n d o c a d a v e z más a l t o . 3
C o n c t u s i o n e s .
Los e x p e r i m e n t o s d e i n h i b i c i ó n r e a l i z a d o s n o d e s c a r t a n e l m d c a n i s - mo s e c u e n c i a 1 o r d e n a d o p o s t u l a d o . A ú n q u e ambos a z ú c a r e s t e n g a n u n
pH ó p t i m o s e m e j a n t e , e l h e c h o d e q u e e l a m o n i o t e n g a un pH d i f e r e n
t e ; h a c e q u e l a r e a c i ó n e n s e n t i d o c a t a b ó l i c o t e n g a u n pH ó p t i m a
e n t r e 7 . 6 y 7 . 8 , y q u e l a r e a c c i ó n e n s e n t i d o b i o s i i t 6 t i c o t e n g a
u n pH ó p t i m o a l r e d e d o r d e 7 . 2 . P o r l o s e s p e r i m e n t o s r e a l i z a d o s , l a
-
+ 4' f o r m a i 6 n i c a q u e s i r v e d e s u s t r a t o e s e l an
I
19
pH sobre e l Km para ambos azúcares, teniendo un minimo Óptirnri para
ambos entre 7.6 y 7.8. En e l análisis propuesto por Dixon(1) (fig.
5 ) es importante señalar e l cambio de pendiente de O a -1; para la
parte a ) en 8.2 y para l a parte bl en 8.4 . Conrespecto a l a variación del Km del NH4Cl en l a figura 6 se ve
que en e l rango en e l que para los azúcares se hace mínimo, para e s
te sustrato se hace máximo y permanece constante entre 20 y 22 mM.
Considerando l a disosioción que presenta e l NH4Cl en NH4 y C l ;
y a su vez e l NH4 puede estar en esta forma iónica o sin protonar,
NH3; cualquiera de las formas en que sepresente puede ser e l sus-
trato de l a enzima. En las figuras 7 y 8 se muestra la variación
del Km para NH3 y NH4 respectivamente. Para deducir cual es l a foc
ma idnica del sustrato, siguiendo e l análisis propuesto por Dixon,
en las figuras 9, 1 0 y 11; se muestra l a variación d e l pKm en fun-
cidn del pH; para NH4Cl, NH3, NH4. Es importante notar que ppra las
posibles formas del sustrato hay una diferencia significativa en su
comportamiento; para e l NH3 (fig. I O ) es una linea con pendiente de
-1, y para e l NH4 presenta una quebradura alrededor de 7.6 (pH),
permaneciendo constante hasta el valor de 8.8 .
- - +
+
+
+
+
Discusión.
EL patr6n de inhibición competitiva con respecto a l GlcNH OH6P
para e l sentido catabólico, por l a K i de 1.7 uM (fig. 1); se dedu - 2
ce que l a forma abierta de l a GlcNH26P es l a forma que s
sustrato a la enzima. Como análogo del producto (hacia e
tido de l a reacción) se esperaria un patrón de inhibición
ducto,para e l mecanismo secuencia1 ordenado planteado en
cedentes, como e l que predice Rudolph (21); en e l que e l
rve de
otro se'
por pro-
los ante-
producto
( o su análogo) presentarian una inhibición competitiva para e l NH4Cl
figura 2, no se obtiene un patrón de inhibición no competitiva para
l a Fru6P; sino competitivo.
y una inhibición no competitiva para l a Fru6P. Como es claro en l a I
i
1 I
S i consideramos que un inhibido-r competitivo es aquel que se une
a l sitio activo de l a enzima(sitio a l que se une e l sustrato), e l
sitio activo de l a GlcNH26P tendria un sitio para l a unión del NH
20
Resumen.
Se purificó l a glucosamina 6-fosfato isomerasa Cdeaminasa1,CE.C.
5.3.1.10). Los patrones de inhibición por GlcNH20H6P resultaron de
tipo competitivo para los tres sustratos; l o que no apoya e l meca-
nismo cinético postulado. Para cada sentido de l a reacción hay un
diferente; en el sentido catabólico de 7 .6 a 7.8, y en e l pH óptimo
sentido b
! e l e l NH4 +
osintético de 7.2 . La orma iónica que sirve de sustrato
I
L i t e r a t u r a c i t a d a .
Pi
1 .- 2.-
3.-
4.-
5.-
6,-
7.- 8.-
9. -
10.-
11 .- 12.-
13.-
14.-
15.-
16.-
17.- 18.-
19.-
20.-
21 * -
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